JPH06273418A - 保存安定剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ロイペプチン、アンチパイン、ペプスタチ
ン、キモスタチン等のペプチド性プロテア−ゼインヒビ
タ−を有効成分として含む抗原又は抗体の保存安定剤で
ある。又、抗原又は抗体にロイペプチン、アンチパイ
ン、ペプスタチン、キモスタチン等のペプチド性プロテ
ア−ゼインヒビタ−を共存させて保存することを特徴と
する抗原又は抗体の保存方法である。 【効果】 抗原の保存安定剤として、ペプチド性プロテ
ア−ゼインヒビタ−を用いることで、長期間溶液状態で
抗原を保存しても抗原の特異性は低下せず且つ抗体との
親和性も低下しない。同様にこのペプチド性プロテア−
ゼインヒビタ−は抗体の保存安定剤としても有効であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗原又は抗体の保存安
定剤及びそれを用いた保存方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】臨床検査の分野では、近年種々の疾患を
正確迅速且つ簡便に診断することが重要視されている。
そして、この診断のためには、極めて特異性が高い、感
度が高い等の利点から抗原抗体反応が臨床検査で広く用
いられている。

【０００３】しかし従来、抗原あるいは抗体の特異性又
は親和力、結合力を長期間安定的に維持することが困難
であった。そのため、長期間保存した抗原又は抗体を臨
床検査に用いると、正確に診断できず問題となってい
た。そこで抗原あるいは抗体を凍結乾燥したり、共有結
合法や架橋法で不溶性担体に固定化する方法によって、
安定化させる努力が試みられてきた。

【０００４】しかしながら、抗原抗体反応は溶液反応で
ある関係上、凍結乾燥しても使用時には蒸留水、緩衝液
等の溶液で復元しなければならず、溶液状態における長
期間の保存安定性には問題があった。

【０００５】また、不溶性担体に抗原あるいは抗体を固
定化する方法においても、同様に溶液状態における長期
間の保存安定性が問題であった。即ち、抗原又は抗体を
共有結合法、架橋法、あるいは包括法にて不溶性担体に
固定化することが試みられているが、保存安定性の観点
から不溶性担体と抗原又は抗体の選択が重要となり、該
不溶性担体のスクリ−ニングや固定化方法等に大変な労
力を費やさなければならなかった。更に、例えば「アフ
ィニティクロマトとアフィニティラベル」（５〜１０
頁、昭和５５年、共立出版株式会社発行）に示されてい
るように、抗原又は抗体を不溶性担体に結合した後の抗
原又は抗体の特異性或は親和力、結合力が減少すること
もしばしばみられ、抗原あるいは抗体の固定化だけでは
十分に解決できなかった。

【０００６】ところで、従来から抗原又は抗体の安定化
剤として塩類、糖類、水溶性高分子等が知られている
が、糖類、水溶性高分子は凍結又は凍結乾燥時の安定化
剤であり、塩類は蛋白質の３次構造の安定化作用を示す
だけであり、いづれも長期保存に対する安定効果はな
い。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、溶液
状態で存在する抗原又は抗体の特異性或は親和力、結合
力を減少させず、長期間安定的に保存できる技術を開発
することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、抗原又は
抗体を溶液状態で長期間安定的に保存するために、鋭意
研究を重ねた結果、抗原又は抗体にペプチド性のプロテ
ア−ゼインヒビタ−の添加が有効であることを見いだし
本発明を完成するに至った。

【０００９】即ち、本発明は、ペプチド性プロテア−ゼ
インヒビタ−を有効成分として含む抗原又は抗体の保存
安定剤である。他の発明は、抗原又は抗体にペプチド性
プロテア−ゼインヒビタ−を共存させて保存することを
特徴とする抗原又は抗体の保存方法である。

【００１０】本発明において用いられるペプチド性プロ
テア−ゼインヒビタ−とは、プロテア−ゼと結合して該
プロテア−ゼの活性を阻害するオリゴペプチドを言う
（出典：生化学辞典、東京化学同人発行）。該ペプチド
性プロテア−ゼインヒビタ−が抗原又は抗体に対して、
長期の保存安定効果があることは全く知られていない。

【００１１】該ペプチド性プロテア−ゼインヒビタ−と
しては、例えばロイペプチン、アンチパイン、ペプスタ
チン、キモスタチン等が具体的に挙げられる。

【００１２】尚、プロテア−ゼインヒビタ−としては、
例えば大豆トリプシンインヒビタ−、オボインヒビタ−
等の蛋白質性インヒビタ−；パラメルクリ安息香酸、ジ
イソプロピルフルオロリン酸等の有機化合物性インヒビ
タ−などの非ペプチド性プロテアーゼインヒビターが知
られているが、これらのインヒビタ−では保存安定効果
は発現しない。

【００１３】本発明の保存安定剤は、該ペプチド性プロ
テア−ゼインヒビタ−を有効成分として含んでいれば良
く、その形態、濃度等については特に制限されるもので
はない。

【００１４】例えば、固体（粉体）状の保存安定剤とす
る場合は、基本的には上記ペプチド性プロテア−ゼイン
ヒビターが１種類あるいは２種類以上含有されていれば
よい。 必要に応じて更に抗原又は抗体の安定化のため
に、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、グルタミン酸ナ
トリウム等の塩類、凍結乾燥した牛血清アルブミン、ウ
サギＩｇＧ等の蛋白質類、グルコ−ス、デキストラン等
の糖類、ポリエチレングリコ−ル、ポリビニルピロリド
ン等の水溶性高分子等の公知の安定化剤を含有させても
よい。これらの配合比は特に限定されない。

【００１５】溶液状の保存安定剤とする場合は、蒸留
水、イオン交換水等の水、リン酸緩衝液、グリシン緩衝
液等の緩衝液あるいはメタノ−ル、エタノ−ル等の水溶
性有機溶媒等に１種類あるいは２種類以上の上記ペプチ
ド性プロテア−ゼインヒビタ−を溶解して含有させる。
この場合も上記種々の安定化剤を必要に応じて添加する
ことができる。該液体中のペプチド性プロテア−ゼイン
ヒビタ−の濃度については、溶解していれば良く何ら制
限されない。

【００１６】以下、ペプチド性プロテア−ゼインヒビタ
−を用いて抗原又は抗体を溶液状態で保存する方法につ
いて説明するが、他の安定化剤を含む固体状保存安定剤
の場合、溶液状保存安定剤の場合もこれに準ずる。、抗
原又は抗体は、通常、水または上述の緩衝液に溶解す
る。この抗原溶液又は抗体溶液中に、一般にペプチド性
プロテア−ゼインヒビタ−の濃度が０．０１〜１０ｍＭ
の範囲になるように添加する。これより多すぎると該溶
液に溶解しにくく、少なすぎると抗原又は抗体の保存安
定性が悪いことがある。又、ペプチド性プロテア−ゼイ
ンヒビタ−は、抗原又は抗体１ｇに対して０．０２〜２
０ｇの添加が好ましく、これより少ないと添加した効果
がなく、多すぎると抗原抗体反応を阻害する場合もあ
る。

【００１７】このようなペプチド性プロテア−ゼインヒ
ビタ−の至適濃度は抗原又は抗体の濃度、種類等によっ
て異なる。例えば、蒸留水、イオン交換水等の水あるい
はリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グリシン緩衝液等
の緩衝液１０００ｍｌに抗原又は抗体が１ｇ溶解してい
たとき、ペプチド性プロテア−ゼインヒビタ−の１つで
あるペプスタチンを加える場合、水又は緩衝液を基準に
した至適添加量は０．００７〜７ｇであり、抗原又は抗
体を基準にした至適添加量は０．０２〜２０ｇであるこ
とから、この場合のペプスタチンの水又は緩衝液及び抗
原又は抗体から見た至適添加量は０．０２〜７ｇとな
る。

【００１８】かかる条件を満たしていればペプチド性プ
ロテア−ゼインヒビタ−の添加は１種類でも２種類以上
でも良く、その添加方法についても何ら制限されない。

【００１９】例えば、抗原又は抗体が溶解している水溶
液にペプチド性プロテア−ゼインヒビタ−を添加する方
法、抗原又は抗体が溶解している水溶液にペプチド性プ
ロテア−ゼインヒビタ−を添加した後凍結乾燥し次いで
水溶液に復元する方法、凍結乾燥した抗原又は抗体を復
元するための水溶液にペプチド性プロテア−ゼインヒビ
タ−を添加する方法等が挙げられる。

【００２０】また、抗原又は抗体の保存時にペプチド性
プロテア−ゼインヒビタ−の他に、例えば塩化ナトリウ
ム、塩化カリウム、塩化マグネシウム等の塩類、グルコ
−ス、サッカロ−ス、デキストラン等の糖類、あるいは
ポリエチレングリコ−ル、ポリビニルアルコ−ル、ポリ
ビニルピロリドン等の水溶性高分子などの公知の抗原又
は抗体の安定化剤を含有させてもよい。

【００２１】本発明の保存安定化剤、及び保存方法は、
固定化されていない抗原又は抗体にだけでなく、公知の
方法で不溶性担体に担持された抗原にも抗体にもその効
果を発揮する。

【００２２】抗原は、抗体を産生させて体液性免疫や細
胞性免疫を誘発する物質であれば特に制限されず、例え
ば蛋白質、糖蛋白質、脂質蛋白質、脂質、核酸等が挙げ
られるが、特に疎水性に富んだ抗原に対して、ペプチド
性プロテア−ゼインヒビタ−を添加したときの長期間の
保存安定性により大きな効果をもたらす。

【００２３】抗体は、抗原と特異的に結合する活性を持
つものであれば特に制限されずＩｇＧ，ＩｇＭ，Ｉｇ
Ａ，ＩｇＤ，ＩｇＥ等が挙げられる。

【００２４】

【作用】ペプチド性プロテア−ゼインヒビタ−が抗原又
は抗体の保存安定剤として有効である理由は明確ではな
い。しかし、例えばセリンプロテア−ゼのインヒビタ−
として知られるジイソプロピルフルオロフォスフェ−
ト、フェニルメタンスルフォニルフルオリド等の有機化
合物性インヒビタ−は保存安定性の効果がみられなかっ
たのに対して、同じくセリンプロテア−ゼのペプチド性
プロテア−ゼインヒビタ−であるロイペプチンは抗原又
は抗体の保存安定剤として有効であったことから、プロ
テア−ゼインヒビタ−としての働きではなく、抗原又は
抗体とプロテア−ゼインヒビタ−との相互作用と推測さ
れる。

【００２５】

【発明の効果】抗原の保存安定剤として、ペプチド性プ
ロテア−ゼインヒビタ−を用いることで、長期間溶液状
態で抗原を保存しても抗原の特異性は低下せず且つ抗体
との親和性も低下しない。同様にこのペプチド性プロテ
ア−ゼインヒビタ−は抗体の保存安定剤としても有効で
ある。

【００２６】

【実施例】本発明を以下に示す実施例により具体的に説
明するが、本発明は、その実施例により何ら限定される
ものではない。

【００２７】実施例１ 抗原の保存安定性を評価するために、抗原と反応する抗
体を感作した粒子にて凝集反応の抑制試験を実施した。

【００２８】梅毒の病原菌であるトレポネ−マ・パリダ
ム１×１０⁹個を１ｍｌの０．１５Ｍ塩化ナトリウム水
溶液に分散させた。次いで、このトレポネ−マ・パリダ
ムを超音波破砕器により２００Ｗで３０分間破砕し、
０．２２μｍの限外濾過膜（ミリポア社製）で濾過した
後、２８０ｎｍに於ける吸光度を測定し、該溶液中の蛋
白質濃度を求めたところ５ｍｇ／ｍｌであった。該溶液
１ｍｌにペプスタチンＡ（シグマ社製）を０．０００１
ｇ添加し、よく攪拌した後、この超音波破砕によって得
られた蛋白質の活性（抗体価）を以下に示すように測定
した。

【００２９】被検液として梅毒患者血清を用い、該血清
の１０倍希釈液を原液として、倍数希釈法に従って０．
１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液（以下標準液と略す）を用
いて希釈を行い、各希釈液をマイクロタイタ−プレ−ト
のウェル中に２５μｌずつ加えた。同様にして、該血清
の１０倍希釈液を原液として、倍数希釈法に従って前記
ペプスタチンＡを添加した蛋白質溶液（以下ペプスタチ
ンＡ抗原液と略す）を用いて希釈を行い、各希釈液を該
ウェル中に２５μｌずつ加えた。次いで、能書に従って
復元したイムノティクルスＴＰの感作粒子（徳山曹達株
式会社製；梅毒病原菌由来の蛋白質（抗原）が担持され
た粒子）を各ウェルに２５μｌずつ滴下した。１分間の
攪拌の後、室温で放置した。３０分後、粒子の凝集状態
を観察し、被検液で粒子リングが明らかに大きく、且つ
リング内に凝集粒子が一様に広がっているのが認められ
るウェルに於ける希釈液の最高希釈倍数を求め活性を評
価した。

【００３０】上記標準液、ペプスタチンＡ抗原液を各々
室温で１年間放置した後、同様に蛋白質の活性（抗体
価）を測定した。先の調製直後の活性と比較することに
より蛋白質（抗原）が良好に保存されているか否か判断
した。

【００３１】通常の凝集反応は、梅毒病原菌由来の蛋白
質（抗原）が担持されたイムノティクルスＴＰの感作粒
子に梅毒患者血清中の梅毒病原菌に対する抗体が反応し
て凝集し、陽性を示す。これに対し、抗原を含む液（抗
原液）を梅毒患者血清の希釈液として用いた場合、該血
清中の梅毒病原菌に対する抗体が、予め抗原液中の抗原
に因って吸収されるので、反応に関与するフリーの抗体
が存在しなくなり、結局イムノティクルスＴＰの感作粒
子とは反応せず陰性を示す。一方、抗原液中の抗原が保
存中になんらかの原因で劣化し抗原能力が低下すると、
この液を梅毒患者血清の希釈液として用いた場合、該血
清中の梅毒病原菌に対する抗体が抗原液中の抗原に因っ
て吸収されなくなり一部フリーの抗体が系中に残存する
ので、残存抗体とイムノティクルスＴＰの感作粒子とが
反応して凝集反応を起こし、陽性を示す。

【００３２】従って、抗原液中の抗原の特異性や抗体と
の親和力、結合力が変化すると、抗体を吸収する能力が
変化することから活性が変化するので、調製直後と所定
期間保存後の抗原の活性を比較すれば抗原の保存安定性
がわかる。

【００３３】更に同様にして、被検液として健常者血清
を用い、調製直後および１年間保存後の活性を評価し
た。表１にこれらの結果を示した。

【００３４】

【表１】

【００３５】比較例１ 実施例１でトレポネ−マ・パリダムを超音波破砕した
後、ペプスタチンＡを添加しなかったこと以外はすべて
同様に行った。活性の評価のための梅毒患者血清及び健
常者血清は、実施例１で用いたものを使用した。表２に
これらの結果を示す。

【００３６】表１の結果から、ペプスタチンＡを添加し
た抗原は、梅毒患者血清中の抗体を吸収する能力が１年
間変化していないことがわかる。これに対し、表２の結
果から、ペプスタチンＡを添加していない抗原は、１年
間で抗体を吸収する能力が減少、即ち抗原の特異性が変
化、又は抗原と抗体の親和力、結合力が減少して劣化し
ていることがわかる。

【００３７】

【表２】

【００３８】比較例２ 実施例１でトレポネ−マ・パリダムを超音波破砕した
後、ペプスタチンＡの代わりにタンパク質性プロテア−
ゼインヒビタ−である大豆トリプシンインヒビタ−を
０．０００１ｇ添加したこと以外はすべて同様に行っ
た。活性の評価のための梅毒患者血清及び健常者血清
は、実施例１で用いたものを使用した。表３にこれらの
結果を示す。表３の結果から、ペプチド性プロテアーゼ
インヒビター以外のプロテアーゼインヒビターを添加し
ても、１年間で抗体を吸収する能力が減少して劣化して
いることがわかる。

【００３９】

【表３】

【００４０】実施例２ 抗体の保存安定性を評価するために、抗体と反応する抗
原を感作した粒子にて凝集反応の抑制試験を実施した。

【００４１】市販の抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原溶液
（ミドリ十字社製、蛋白質濃度１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌに
アンチパイン（シグマ社製）を０．００５ｇ添加し、凍
結乾燥した後、０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶液
状態に復元した。この復元した蛋白質溶液の保存安定性
を、以下に示す方法で測定した活性を比較することによ
り調べた。。

【００４２】被検液としてＢ型肝炎患者血清を用い、該
血清を原液として、倍数希釈法に従って０．１５Ｍ塩化
ナトリウム水溶液（以下標準液と略す）を用いて希釈を
行い、各希釈液をマイクロタイタ−プレ−トのウェル中
に２５μｌずつ加えた。同様にして、該血清を原液とし
て、倍数希釈法に従って前記アンチパインを添加した蛋
白質溶液（以下アンチパイン抗体液と略す）を用いて希
釈を行い、各希釈液を該ウェル中に２５μｌずつ加え
た。次いで、能書に従って復元したアンティヘブセルネ
オ（国際試薬株式会社製）の感作粒子を各ウェルに２５
μｌずつ滴下した。１分間の攪拌の後、室温で放置し
た。２時間後、粒子の凝集状態を観察し、被検液で粒子
リングが明らかに大きく、且つリング内に凝集粒子が一
様に広がっているのが認められるウェルに於ける希釈液
の最高希釈倍数を求め活性を評価した。 上記標準液、
アンチパイン抗体液を各々室温で１年間放置した後、同
様に蛋白質の活性（抗原価）を測定した。

【００４３】更に同様にして、被検液として健常者血清
を用い、調製直後および１年間保存後の活性を評価し
た。表４にこれらの結果を示した。

【００４４】

【表４】

【００４５】比較例３ 実施例２でアンチパインを添加しなかったこと以外はす
べて同様に行った。活性の評価のためのＢ型肝炎患者血
清及び健常者血清は、実施例２で用いたものを使用し
た。表５にこれらの結果を示す。

【００４６】

【表５】

【００４７】比較例４ 実施例２でアンチパインの代わりにタンパク質性プロテ
ア−ゼインヒビタ−であるオボインヒビタ−を０．００
５ｇ添加したこと以外はすべて同様に行った。活性の評
価のためのＢ型肝炎患者血清及び健常者血清は、実施例
２で用いたものを使用した。表６にこれらの結果を示
す。

【００４８】

【表６】

【００４９】実施例３ 抗原の保存安定性を評価するために、抗原と反応する抗
体を感作した粒子にて凝集反応の抑制試験を実施した。

【００５０】特開平３−６７１７２に従って調製した成
人Ｔ細胞白血病ウイルス由来の抗原溶液（蛋白質濃度１
ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌにロイペプチン（シグマ社製）０．
００２５ｇ、及びアンチパイン（シグマ社製）０．００
２５ｇを添加し、よく攪拌した後、該ロイペプチン及び
アンチパインを添加した蛋白質溶液の活性を以下に示す
ように測定した。

【００５１】被検液として成人Ｔ細胞白血病患者血清を
用い、該血清を原液として、倍数希釈法に従って０．１
５Ｍ塩化ナトリウム水溶液（以下標準液と略す）を用い
て希釈を行い、各希釈液をマイクロタイタ−プレ−トの
ウェル中に２５μｌずつ加えた。同様にして、該血清を
原液として、倍数希釈法に従って前記ロイペプチン及び
アンチパインを添加した蛋白質溶液（以下インヒビタ−
含有抗原液と略す）を用いて希釈を行い、各希釈液を該
ウェル中に２５μｌずつ加えた。次いで、能書に従って
復元したセロディアＨＴＬＶ−Ｉ（富士レビオ株式会社
製）の感作粒子を各ウェルに２５μｌずつ滴下した。１
分間の攪拌の後、室温で放置した。２時間後、粒子の凝
集状態を観察し、被検液で粒子リングが明らかに大き
く、且つリング内に凝集粒子が一様に広がっているのが
認められるウェルに於ける希釈液の最高希釈倍数を求め
活性を評価した。

【００５２】上記標準液、インヒビター含有抗原液を各
々室温で１年間放置した後、同様に蛋白質の活性（抗体
価）を測定した。

【００５３】更に同様にして、被検液として健常者血清
を用い、調製直後および１年間保存後の活性を評価し
た。表７にこれらの結果を示した。

【００５４】

【表７】

【００５５】比較例５ 実施例３でロイペプチン及びアンチパインを添加しなか
ったこと以外はすべて同様に行った。活性の評価のため
の成人Ｔ細胞白血病患者血清及び健常者血清は、実施例
３で用いたものを使用した。表８にこれらの結果を示
す。

【００５６】

【表８】

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ペプチド性プロテア−ゼインヒビタ−を
   有効成分として含む抗原又は抗体の保存安定剤。
2. 【請求項２】 抗原又は抗体にペプチド性プロテア−ゼ
   インヒビタ−を共存させて保存することを特徴とする抗
   原又は抗体の保存方法。