ES2468441T3 - Compuestos heteroc�clicos antivirales que tienen grupos fosfonato - Google Patents

Abstract

Un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en:**Fórmula**

Description

Compuestos heteroc�clicos antivirales que tienen grupos fosfonato

Campo de la invención

La invención se refiere en general a compuestos con una actividad inhibidora del VHC

Antecedentes de la invención

La mejora del suministro de fármacos y otros agentes a las células y tejidos objetivos ha sido el enfoque de una investigación considerable durante muchos años. Aunque se han hecho muchos intentos por desarrollar métodos efectivos para importar moléculas biol�gicamente activas hacia dentro de las células, tanto in vivo como in vitro, ninguno ha sido enteramente satisfactorio. La optimización de la asociación del fármaco inhibidor con su objetivo intracelular, mientras que se minimice la redistribución intercelular del fármaco, por ejemplo, hacia las células vecinas, con frecuencia es difícil o ineficiente.

La mayoría de los agentes actualmente administrados a un paciente parenteralmente no est�n dirigidos, lo cual da como resultado el suministro sist�mico del agente a las células y a los tejidos del cuerpo donde no es necesario, y con frecuencia donde es indeseable. Esto puede dar como resultado efectos secundarios adversos del fármaco, y con frecuencia esto limita la dosis de un fármaco (por ejemplo, glucocorticoides y otros fármacos anti-inflamatorios) que se puede administrar. En comparación, aunque la administración oral de los fármacos se reconoce en general como un método conveniente y económico de administración, la administración oral puede dar como resultado cualquiera de: (a) la absorción del fármaco a través de las barreras celulares y de los tejidos, por ejemplo la barrera hematoencef�lica, epitelial, y de la membrana celular, dando como resultado una distribución sist�mica indeseable,

o (b) la residencia temporal del fármaco dentro del tracto gastrointestinal. De conformidad con lo anterior, una meta importante ha sido desarrollar métodos para dirigir específicamente los agentes hacia las células y tejidos. Los beneficios de este tratamiento incluyen evitar los efectos fisiológicos generales del suministro inapropiado de tales agentes a otras células y tejidos, tales como las células no infectadas.

La hepatitis C es reconocida como una enfermedad viral crónica del hígado, la cual se caracteriza por enfermedad hepática. Aunque se utilizan ampliamente fármacos que se dirigen al hígado, y han mostrado efectividad, su toxicidad y otros efectos secundarios han limitado su utilidad.

Los métodos de ensayo capaces de determinar la presencia, ausencia, o las cantidades del VHC son de utilidad práctica en la búsqueda de inhibidores, as� como para diagnosticar la presencia del VHC.

Los inhibidores del VHC son útiles para limitar el establecimiento y el progreso de la infección por VHC, as� como en los ensayos de diagnóstico para VHC.

Existe una necesidad de agentes terapéuticos para VHC, es decir, fármacos, que tengan mejores propiedades inhibidoras y farmacocin�ticas, incluyendo una mejor actividad contra el desarrollo de resistencia viral, mejor biodisponibilidad oral, mayor potencia, y vida media efectiva prolongada in vivo. Los nuevos inhibidores del VHC deben tener menos efectos secundarios, programas de dosificación menos complicados, y deben ser oralmente activos. En particular, existe una necesidad de un régimen de dosificación menos oneroso, tal como una píldora, una vez al día.

Se han descrito inhibidores de la proteasa NS3 del VHC en los documentos WO 02/060926, WO 03/064416 y WO 03/064455. En Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2003) 13: 2745-2748 se describen inhibidores dipept�dicos de fenetilamida de la proteasa NS3 del VHC.

Breve descripción de la invención

La dirección intracelular se puede lograr mediante métodos y composiciones que permitan la acumulación o retención de los agentes biol�gicamente activos dentro de las células. La presente invención proporciona composiciones y métodos para la inhibición del VHC, o de actividad terapéutica contra VHC.

La presente invención se refiere en general a la acumulación o retención de los compuestos terapéuticos dentro de las células. La invención se refiere más particularmente a la obtención de altas concentraciones de moléculas de fosfonato en las células hepáticas. Esta dirección efectiva puede ser aplicable a varias formulaciones y procedimientos terapéuticos.

Las composiciones de la invención incluyen compuestos anti-virales que tienen normalmente cuando menos un grupo fosfonato. De acuerdo con lo anterior, en una modalidad, la invención proporciona un compuesto de la invención que est� enlazado con uno o más grupos fosfonato.

La presente invención proporciona un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en:

10 La presente invención también proporciona una composición farmacéutica, la cual comprende un compuesto descrito anteriormente, y cuando menos un vehículo farmac�uticamente aceptable.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para utilizarse en el tratamiento de 15 trastornos asociados con VHC.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica, la cual contiene adicionalmente un análogo de nucle�sido.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica, la cual contiene adicionalmente un 5 interfer�n, o un interfer�n pegilado.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica, en donde el análogo de nucle�sido mencionado se selecciona a partir de ribavirina, viramidina, levovirina, un L-nucle�sido, e isatoribina, y el interfer�n es interfer�n-α o interfer�n pegilado.

La presente invención también proporciona un método para el tratamiento de los trastornos asociados con hepatitis C, comprendiendo este método administrar a un individuo una composición farmacéutica, la cual comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de los compuestos, incluyendo los enanti�meros de los mismos, descritos anteriormente.

15 La presente invención también proporciona una composición farmacéutica, la cual comprende una cantidad efectiva de un compuesto o conjugado de la invención, o una sal farmac�uticamente aceptable o solvato del mismo, en combinación con un excipiente farmac�uticamente aceptable.

La presente invención también pertenece a compuestos para su uso en un método para aumentar la acumulación celular y la retención de un compuesto de fármaco, mejorando de esta manera su valor terapéutico y de diagnóstico, el cual comprende enlazar el compuesto a uno o más grupos fosfonato.

La presente invención también proporciona un método para inhibir VHC, el cual comprende administrar a un

25 mamífero afligido con una condición asociada con la actividad del VHC, una cantidad de un compuesto de la invención, efectiva para inhibir VHC.

La presente invención también proporciona un compuesto de la invención para utilizarse en terapia m�dica (de preferencia para utilizarse en la inhibición del VHC o en el tratamiento de una condición asociada con la actividad del VHC), as� como el uso de un compuesto de la invención, para la fabricación de un medicamento útil para inhibir VHC

o para el tratamiento de una condición asociada con la actividad del VHC en un mamífero.

La presente invención también proporciona procesos e intermediarios novedosos dados a conocer en la presente, los cuales son útiles para la preparación de los compuestos, incluyendo sus enanti�meros, de la invención. Algunos

35 de los compuestos de la invención son útiles para preparar otros compuestos de la invención.

En otro aspecto, la invención proporciona compuestos para su uso en un método para inhibir la actividad del VHC en una muestra, el cual comprende tratar la muestra con un compuesto o conjugado de la invención.

Descripci�n detallada de la invención

Ahora se har� referencia con detalle a ciertas modalidades de la invención, cuyos ejemplos se ilustran en las estructuras y fórmulas acompañantes.

45 Composiciones de la invención.

"Heterociclo" como se utiliza en la presente, incluye, a manera de ejemplo y no de limitación, los heterociclos descritos en Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W. A. Benjamin, Nueva York, 1968), en particular los Capítulos 1, 3, 4, 6, 7, y 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, Nueva York, 1950 hasta el presente), en particular los Volúmenes 13, 14, 16, 19, y 28; y "J. Am. Chem. Soc.", 82: 5566 (1960).

Los ejemplos de los heterociclos incluyen, a manera de ejemplo y no de limitación, piridilo, tiazolilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidro-tiofenilo oxidado con azufre, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo,

55 benzofuranilo, tianaftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo, pirrolinilo, tetrahidro-furanilo, tetrahidro-quinolinilo, tetrahidro-isoquinolinilo, decahidroquinolinilo, octahidro-isoquinolinilo, azocinilo, triazinilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, tienilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, fenoxatiinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, 1H-indazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo, pteridinilo, 4aH-carbazolilo, carbazolilo, μ-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, furazanilo, fenoxazinilo, isocromanilo, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, quinuclidinilo, morfolinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, benzisoxazolilo, oxindolilo, benzoxazolinilo, e isatino�lo.

65 A manera de ejemplo y no de limitación, los heterociclos enlazados con carbono se enlazan en la posición 2, 3, 4, 5,

o 6 de una piridina; en la posición 3, 4, 5, o 6 de una piridazina; en la posición 2, 4, 5, o 6 de una pirimidina; en la posición 2, 3, 5, o 6 de una pirazina; en la posición 2, 3, 4, o 5 de un furano, tetrahidro-furano, tiofurano, tiofeno, pirrol, o tetrahidropirrol; en la posición 2, 4, o 5 de un oxazol, imidazol, o tiazol; en la posición 3, 4, o 5 de un isoxazol, pirazol, o isotiazol; en la posición 2 o 3 de una aziridina; en la posición 2, 3, o 4 de una azetidina; en la posición 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 de una quinolina; o en la posición 1, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 de una isoquinolina. Todavía más

5 normalmente, los heterociclos enlazados con carbono incluyen 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 5-piridilo, 6-piridilo, 3piridazinilo, 4-piridazinilo, 5-piridazinilo, 6-piridazinilo, 2-pirimidinilo, 4-pirimidinilo, 5-pirimidinilo, 6-pirimidinilo, 2pirazinilo, 3-pirazinilo, 5-pirazinilo, 6-pirazinilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, o 5-tiazolilo.

A manera de ejemplo y no de limitación, los heterociclos enlazados con nitrógeno se enlazan en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, 1H-indazol; en la posición 2 de un isoindol, o isoindolina; en la posición 4 de una morfolina; y en la posición 9 de un carbazol, o μ-carbolina. Todavía más normalmente, los heterociclos enlazados con nitrógeno incluyen 1-aziridilo, 1-azetedilo, 1-pirrolilo, 1-imidazolilo, 1-pirazolilo, y 1-piperidinilo.

15 El término "pro-fármaco", como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier compuesto que, cuando se administra a un sistema biológico, genera la sustancia de fármaco, es decir, el principio activo, como resultado de las reacciones químicas espontáneas, las reacciones químicas catalizadas por enzimas, fot�lisis, y/o las reacciones químicas metabólicas. Por consiguiente, un pro-fármaco es un análogo covalentemente modificado o una forma latente de un compuesto terapéuticamente activo.

"Fracción de pro-fármaco" se refiere a un grupo funcional l�bil que se separa del compuesto inhibidor activo durante el metabolismo, sist�micamente, dentro de una célula, mediante hidrólisis, disociaci�n enzim�tica, o mediante algún otro proceso (Bundgaard, Hans, "Design and Application of Prodrugs" en A Textbook of Drug Design and

25 Development (1991), P. Krogsgaard-Larsen y H. Bundgaard, Editores, Harwood Academic Publishers, páginas 113191). Las enzimas que son capaces de tener un mecanismo de activación enzim�tica con los compuestos de prof�rmaco de fosfonato de la invención incluyen, pero no se limitan a, amidasas, esterasas, enzimas microbianas, fosfolipasas, colinesterasas, y fosfasas. Las fracciones de pro-fármaco pueden servir para mejorar la solubilidad, la absorción, y la lipofilicidad, con el fin de optimizar el suministro, la biodisponibilidad, y la eficacia del fármaco. Una fracción de pro-fármaco puede incluir un metabolito activo o el fármaco mismo.

Las fracciones de pro-fármaco de ejemplo incluyen los aciloxi-metil-ésteres hidrol�ticamente sensibles o l�biles CH2OC(=O)R9, y los carbonatos de aciloxi-metilo -CH2OC(=O)OR9, en donde R9 es alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono sustituido, arilo de 6 a 20 átomos de carbono, o arilo de 6 a 20 átomos

35 de carbono sustituido. El aciloxi-alquil-éster se utilizó primero como una estrategia de pro-fármaco para los ácidos carbox�licos, y luego fue aplicado a los fosfatos y fosfonatos por Farquhar y colaboradores (1983), J. Pharm. Sci., 72: 324; también las Patentes de los Estados Unidos de Norteam�rica Números 4816570, 4968788, 5663159, y 5792756. Subsecuentemente, se utilizó el aciloxi-alquil-éster para suministrar ácidos fosf�nicos a través de las membranas celulares, y con el objeto de mejorar la biodisponibilidad oral. Una variante cercana del aciloxi-alquil�ster, el alcoxi-carboniloxi-alquil-éster (carbonato), también puede mejorar la biodisponibilidad oral como una fracción de pro-fármaco en los compuestos de las combinaciones de la invención. Un aciloxi-metil-éster de ejemplo es el pivaloiloxi-metoxilo (POM) -CH2OC(=O)C (CH3)3. Una fracción de pro-fármaco de carbonato de aciloxi-metilo de ejemplo es el carbonato de pivaloiloxi-metilo (POC) -CH2OC(=O) OC(CH3)3.

45 El grupo fosfonato puede ser una fracción de pro-fármaco de fosfonato. La fracción de pro-fármaco puede ser sensible a la hidrólisis, tal como, pero no limitándose a, un carbonato de pivaloiloxi-metilo (POC) o un grupo pivaloiloxi-metoxilo. De una manera alternativa, la fracción de pro-fármaco puede ser sensible a la disociaci�n enzim�ticamente potenciada, tal como un éster de lactato o un grupo éster de fosfonamidato.

Se reporta que los aril-ésteres de los grupos fosforosos, en especial los fenil-ésteres, mejoran la biodisponibilidad oral (De Lombaert y colaboradores (1994), J. Med. Chem., 37: 498). También se han descrito los fenil-ésteres que contienen un éster carbox�lico orto para el fosfato (Khamnei y Torrence, (1996), J. Med. Chem., 39: 4109-4115). Se reporta que los bencil-ésteres generan el ácido fosf�nico progenitor. En algunos casos, los sustituyentes en la posición orto o para pueden acelerar la hidrólisis. Los análogos de bencilo con un fenol acilado o con un fenol 55 alquilado, pueden generar el compuesto fen�lico a través de la acción de las enzimas, por ejemplo las esterasas, oxidasas, etc., el cual a su vez sufre disociaci�n en el enlace benc�lico C-O para generar el ácido fosf�rico y el intermediario de quinona-metida. Los ejemplos de esta clase de pro-fármacos son descritos por Mitchell y colaboradores (1992), J. Chem. Soc. Perkin Trans. II 2345; Glazier, Publicación Internacional Número WO 91/19721. Se han descrito todavía otros pro-fármacos benc�licos que contienen un grupo que contiene éster carbox�lico unido al metileno benc�lico (Glazier, Publicación Internacional Número WO 91/19721). Se reporta que los pro-fármacos que contienen tio son útiles para el suministro intracelular de los fármacos de fosfonato. Estas proteínas contienen un grupo tioetilo, en donde el grupo tiol se esterifica con un grupo acilo, o bien se combina con otro grupo tiol para formar un disulfuro. La desesterificaci�n o reducción del disulfuro genera el intermediario tio libre, el cual subsecuentemente se descompone hasta el ácido fosf�rico y el episulfuro (Puech y colaboradores (1993), Antiviral 65 Res., 22: 155-174; Benzaria y colaboradores (1996), J. Med. Chem., 39: 4958). Los ésteres de fosfonato cíclicos también se han descrito como pro-fármacos de los compuestos que contienen fósforo (Erion y colaboradores,

Patente de los Estados Unidos de Norteam�rica Número 6,312,662).

"Grupo protector" se refiere a una fracción de un compuesto que enmascara o altera las propiedades de un grupo funcional, o las propiedades del compuesto como un todo. Los grupos protectores químicos y las estrategias para la

5 protección/desprotecci�n, son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Protective Groups in Organic Chemistry, Theodora W. Greene, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1991. Los grupos protectores se utilizan con frecuencia para enmascarar la reactividad de ciertos grupos funcionales, con el fin de asistir en la eficiencia de las reacciones químicas deseadas, por ejemplo, hacer y romper enlaces químicos en una forma ordenada y planeada. La protección de los grupos funcionales de un compuesto altera otras propiedades físicas además de la reactividad del grupo funcional protegido, tales como la polaridad, la lipofilicidad (hidrofobicidad), y otras propiedades que se pueden medir mediante herramientas analíticas comunes. Los intermediarios químicamente protegidos pueden ser ellos mismos biol�gicamente activos o inactivos.

Los compuestos protegidos pueden también exhibir propiedades alteradas, y en algunos casos optimizadas, in vitro

15 e in vivo, tales como el paso a través de las membranas celulares y la resistencia a la degradación enzim�tica o al secuestramiento. En este papel, los compuestos protegidos con efectos terapéuticos pretendidos, pueden ser referidos como pro-fármacos. Otra función de un grupo protector es convertir el fármaco progenitor en un prof�rmaco, mediante lo cual, se libera el fármaco progenitor después de la conversión del pro-fármaco in vivo. Debido a que los pro-fármacos pueden ser absorbidos más efectivamente que el fármaco progenitor, los pro-fármacos pueden poseer una mayor potencia in vivo que el fármaco progenitor. Los grupos protectores se remueven ya sea in vitro, en el caso de los intermediarios químicos, o bien in vivo, en el caso de los pro-fármacos. Con los intermediarios químicos, no es particularmente importante que los productos resultantes después de la desprotecci�n, por ejemplo los alcoholes, sean fisiológicamente aceptables, aunque en general es más deseable que los productos sean farmacol�gicamente inocuos.

25 Cualquier referencia a cualquiera de los compuestos de la invención también incluye una referencia a una sal fisiológicamente aceptable del mismo. Los ejemplos de las sales fisiológicamente aceptables de los compuestos de la invención incluyen las sales derivadas a partir de una base apropiada, tal como un metal alcalino (por ejemplo, sodio), un metal alcalinot�rreo (por ejemplo, magnesio), amonio, y NX4+ (en donde X es alquilo de 1 a 4 átomos de carbono). Las sales fisiológicamente aceptables de un átomo de hidrógeno o de un grupo amino incluyen las sales de los ácidos carbox�licos orgánicos, tales como los ácidos acético, benzoico, l�ctico, fum�rico, tartárico, maleico, mal�nico, m�lico, iseti�nico, lactobi�nico, y succ�nico; de los ácidos sulf�nicos orgánicos, tales como los ácidos metansulf�nico, etansulf�nico, bencensulf�nico, y p-toluensulf�nico; y de los ácidos inorgánicos, tales como los ácidos clorhídrico, sulfúrico, fosf�rico, y sulf�mico. Las sales fisiológicamente aceptables de un compuesto de un

35 grupo hidroxilo incluyen el ani�n de dicho compuesto en combinación con un cati�n adecuado, tal como Na+ y NX4+ (en donde X se selecciona independientemente a partir de H o un grupo alquilo de 1 a 4 átomos de carbono).

Para uso terapéutico, las sales de los ingredientes activos de los compuestos de la invención ser�n fisiológicamente aceptables, es decir, ser�n las sales derivadas a partir de un ácido o base fisiológicamente aceptable. Sin embargo, las sales de ácidos o bases que no sean fisiológicamente aceptables también pueden encontrar uso, por ejemplo, en la preparación o purificación de un compuesto fisiológicamente aceptable. Todas las sales, ya sean derivadas o no a partir de un ácido o base fisiológicamente aceptable, est�n dentro del alcance de la presente invención.

"Alquilo" es un hidrocarburo de 1 a 18 átomos de carbono que contiene átomos de carbono normales, secundarios,

45 terciarios, o cíclicos. Los ejemplos son metilo (Me, -CH3), etilo (Et, -CH2CH3), 1-propilo (n-Pr, n-propilo, -CH2CH2CH3), 2-propilo (i-Pr, i-propilo, -CH(CH3)2), 1-butilo (n-Bu, n-butilo, -CH2CH2CH2CH3), 2-metil-1-propilo (i-Bu, i-butilo, -CH2CH(CH3)2), 2-butilo (s-Bu, s-butilo, -CH(CH3)CH2CH3), 2-metil-2-propilo (t-Bu, t-butilo, -C(CH3)3), 1pentilo (n-pentilo, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-pentilo (-CH(CH3)CH2CH2 CH3), 3-pentilo (-CH(CH2CH3)2), 2-metil-2-butilo (-C(CH3)2CH2CH3), 3-metil-2-butilo (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-metil-1-butilo (-CH2CH2CH (CH3)2), 2-metil-1-butilo (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-hexilo (-CH2CH2 CH2CH2CH2CH3), 2-hexilo (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-hexilo (-CH (CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-metil-2-pentilo (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-metil-2-pentilo (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4metil-2-pentilo (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-metil-3-pentilo (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metil-3-pentilo (CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-dimetil-2-butilo (-C(CH3)2CH (CH3)2), 3,3-dimetil-2-butilo (-CH(CH3)C(CH3)3.

55 "Alquenilo" es un hidrocarburo de 2 a 18 átomos de carbono que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios, o cíclicos, con cuando menos un sitio de insaturaci�n, es decir, un doble enlace sp2 de carbono-carbono. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, etileno o vinilo (-CH=CH2), alilo (-CH2CH=CH2), ciclopentenilo (-C5H7), y 5-hexenilo (-CH2CH2CH2CH2CH=CH2).

"Alquinilo" es un hidrocarburo de 2 a 18 átomos de carbono que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios, o cíclicos, con cuando menos un sitio de insaturaci�n, es decir, un triple enlace sp de carbono-carbono. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, acetileno (-C!CH) y propargilo (-CH2C!CH).

"Alquileno" se refiere a un radical de hidrocarburo saturado, de cadena ramificada o recta, o cíclico, de 1 a 18

65 átomos de carbono, y que tiene dos centros de radicales monovalentes derivados mediante la remoción de dos átomos de hidrógeno a partir de los mismos o dos diferentes átomos de carbono de un alcano progenitor. Los

radicales de alquileno t�picos incluyen, pero no se limitan a, metileno (-CH2-), 1,2-etilo (-CH2CH2-), 1,3-propilo (-CH2CH2CH2-), 1,4-butilo (-CH2CH2CH2CH2-), y similares.

"Alquenileno" se refiere a un radical de hidrocarburo insaturado, de cadena ramificada o recta, o cíclico, de 2 a 18 átomos de carbono, y que tiene dos centros de radicales monovalentes derivados mediante la remoción de dos átomos de hidrógeno a partir de los mismos o dos diferentes átomos de carbono de un alqueno progenitor. Los radicales de alquenileno t�picos incluyen, pero no se limitan a, 1,2-etileno (-CH=CH-).

"Alquinileno" se refiere a un radical de hidrocarburo insaturado, de cadena ramificada o recta, o cíclico, de 2 a 18 átomos de carbono, y que tiene dos centros de radicales monovalentes derivados mediante la remoción de dos átomos de hidrógeno a partir de los mismos o dos diferentes átomos de carbono de un alquino progenitor. Los radicales de alquinileno t�picos incluyen, pero no se limitan a, acetileno (-C!C-), propargilo (-CH2C!C-), y 4-pentinilo (-CH2CH2CH2C!CH-).

"Arilo" significa un radical de hidrocarburo aromático monovalente de 6 a 20 átomos de carbono derivado mediante la remoción de un átomo de hidrógeno a partir de un solo átomo de carbono de un sistema de anillo aromático progenitor. Los grupos arilo t�picos incluyen, pero no se limitan a, los radicales derivados a partir de benceno, benceno sustituido, naftaleno, antraceno, bifenilo, y similares.

"Aril-alquilo" se refiere a un radical de alquilo acíclico en donde uno de los átomos de hidrógeno enlazados a un átomo de carbono, normalmente un átomo de carbono terminal o sp3, es reemplazado con un radical de arilo. Los grupos aril-alquilo t�picos incluyen, pero no se limitan a, bencilo, 2-fenil-etan-1-ilo, naftil-metilo, 2-naftil-etan-1-ilo, naftobencilo, 2-nafto-fenil-etan-1-ilo, y similares. El grupo aril-alquilo comprende de 6 a 20 átomos de carbono, por ejemplo, la fracción de alquilo, incluyendo los grupos alcanilo, alquenilo, o alquinilo, del grupo aril-alquilo, es de 1 a 6 átomos de carbono, y la fracción de arilo es de 5 a 14 átomos de carbono.

"Alquilo sustituido", "arilo sustituido", y "arilalquilo sustituido" significan alquilo, arilo, y aril-alquilo, respectivamente, en donde uno o más átomos de hidrógeno son cada uno independientemente reemplazados con un sustituyente que no es hidrógeno. Los sustituyentes t�picos incluyen, pero no se limitan a, -X, -R, -O-, -OR, -SR, -S-, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, NC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NRR, -S(=O)2O-, -S(=O)2OH, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)O2RR, -P(=O)O2RR, -P(=O)(O-)2, -P(=O)(OH)2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(S)R, -C(O)OR, -C(O)O-, -C(S)OR, -C(O)SR, -C(S)SR, -C(O)NRR, -C(S)NRR, -C(NR)NRR, en donde cada X es independientemente un halógeno: F, Cl, Br, o I; y cada R es independientemente -H, alquilo, arilo, heterociclo, un grupo protector, o una fracción de pro-fármaco. Los grupos alquileno, alquenileno, y alquinileno pueden estar también similarmente sustituidos.

"Heterociclo", como se utiliza en la presente, incluye, a manera de ejemplo y no de limitación, los heterociclos descritos en Paquette, Leo A.; Principles of Modern Heterocyclic Chemistry (W. A. Benjamin, Nueva York, 1968), en particular los Capítulos 1, 3, 4, 6, 7, y 9; The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A Series of Monographs" (John Wiley & Sons, Nueva York, 1950 hasta el presente), en particular los Volúmenes 13, 14, 16, 19, y 28; y J. Am. Chem. Soc. (1960) 82: 5566. En una modalidad específica de la invención, "heterociclo" incluye un "carbociclo" como se define en la presente, en donde uno o más (por ejemplo, 1,2, 3, o 4) átomos de carbono han sido reemplazados con un hetero�tomo (por ejemplo, O, N, o S).

Los ejemplos de los heterociclos incluyen, a manera de ejemplo y no de limitación, piridilo, dihidro-piridilo, tetrahidropiridilo (piperidilo), tiazolilo, tetrahidro-tiofenilo, tetrahidro-tiofenilo oxidado con azufre, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, benzofuranilo, tianaftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo, pirrolinilo, tetrahidro-furanilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidro-isoquinolinilo, decahidro-quinolinilo, octahidro-isoquinolinilo, azocinilo, triazinilo, 6H-1,2,5tiadiazinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, tienilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzo-furanilo, cromenilo, xantenilo, fenoxantinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, 1H-indazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo, pteridinilo, 4aH-carbazolilo, carbazolilo, �-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, furazanilo, fenoxazinilo, isocromanilo, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, quinuclidinilo, morfolinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, benzisoxazolilo, oxindolilo, benzoxazolinilo, isatino�lo, y bistetrahidro-furanilo:

A manera de ejemplo y no de limitación, los heterociclos enlazados con carbono se enlazan en la posición 2, 3, 4, 5,

o 6 de una piridina, en la posición 3, 4, 5, o 6 de una piridazina; en la posición 2, 4, 5, o 6 de una pirimidina; en la 5

posici�n 2, 3, 5, o 6 de una pirazina; en la posición 2, 3, 4, o 5 de un furano, tetrahidro-furano, tiofurano, tiofeno, pirrol, o tetrahidropirrol; en la posición 2, 4, o 5 de un oxazol, imidazol, o tiazol; en la posición 3, 4, o 5 de un isoxazol, pirazol, o isotiazol; en la posición 2 o 3 de una aziridina; en la posición 2, 3, o 4 de una azetidina; en la posición 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 de una quinolina; o en la posición 1, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 de una isoquinolina. Todavía más normalmente, los heterociclos enlazados con carbono incluyen 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 5-piridilo, 6-piridilo, 3piridazinilo, 4-piridazinilo, 5-piridazinilo, 6-piridazinilo, 2-pirimidinilo, 4-pirimidinilo, 5-pirimidinilo, 6-pirimidinilo, 2pirazinilo, 3-pirazinilo, 5-pirazinilo, 6-pirazinilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, o 5-tiazolilo.

A manera de ejemplo y no de limitación, los heterociclos enlazados con nitrógeno se enlazan en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, 1H-indazol; en la posición 2 de un isoindol, o isoindolina; en la posición 4 de una morfolina; y en la posición 9 de un carbazol, o �-carbolina. Todavía más normalmente, los heterociclos enlazados con nitrógeno incluyen 1-aziridilo, 1-azetedilo, 1-pirrolilo, 1-imidazolilo, 1-pirazolilo, y 1-piperidinilo.

"Carbociclo" se refiere a un anillo saturado, insaturado, o aromático, que tiene de 3 a 7 átomos de carbono como un monociclo, de 7 a 12 átomos de carbono como un biciclo, y hasta aproximadamente 20 átomos de carbono como un policiclo. Los carbociclos monoc�clicos tienen de 3 a 6 átomos del anillo, y todavía más normalmente 5 o 6 átomos del anillo. Los carbociclos bic�clicos tienen de 7 a 12 átomos del anillo, por ejemplo configurados como un sistema bic�clico [4,5], [5,5], [5,6], o [6,6], o 9 o 10 átomos del anillo configurados como un sistema bic�clico [5,6] o [6,6]. Los ejemplos de los carbociclos monoc�clicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopent-1-enilo, 1ciclopent-2-enilo, 1-ciclopent-3-enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-1-enilo, 1-ciclohex-2-enilo, 1-ciclohex-3-enilo, fenilo, espirilo, y naftilo.

"Enlazador" o "enlace" se refiere a una fracción química que comprende un enlace covalente o una cadena o grupo de átomos que une covalentemente un grupo fosfonato a un fármaco. Los enlazadores incluyen las porciones de sustituyentes A1 y A3, que incluyen fracciones tales como: unidades de repetición de alquiloxilo (por ejemplo, polietilenoxilo, PEG, polimetilenoxilo), y alquil-amino (por ejemplo, polietilenamino, JeffamineMR); y éster de di�cido y amidas, incluyendo succinato, succinamida, diglicolato, malonato, y caproamida.

El término "quiral" se refiere a las moléculas que tienen la propiedad de no-superimponibilidad del componente de imagen de espejo, mientras que el término "aquiral" se refiere a las moléculas que se pueden superponer sobre su componente de imagen de espejo.

El término "estereois�meros" se refiere a los compuestos que tienen una constitución química idéntica, pero que difieren con respecto a la configuración de los átomos o grupos en el espacio.

"Diaestere�mero" se refiere a un estereois�mero con dos o más centros de quiralidad, y cuyas moléculas no son imágenes de espejo unas de otras. Los diaestere�meros tienen diferentes propiedades físicas, por ejemplo, puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales, y reactividades. Las mezclas de diaestere�meros pueden separarse bajo procedimientos analíticos de alta resolución, tales como electroforesis y cromatograf�a.

"Enanti�meros" se refieren a dos estereois�meros de un compuesto que son imágenes de espejo que no se pueden superponer, uno del otro.

El término "tratamiento" o "tratar", hasta el grado en que se refiera a una enfermedad o condición, incluye impedir que se presente la enfermedad o condición, inhibir la enfermedad o condición, eliminar la enfermedad o condición, y/o aliviar uno o más síntomas de la enfermedad o condición.

Las definiciones y convenciones estereoqu�micas utilizadas en la presente en general se encuentran en S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nueva York; y Eliel E. y Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. Muchos compuestos orgánicos existen en formas �pticamente activas, es decir, tienen la capacidad para rotar el plano de la luz polarizada en el plano. En la descripción de un compuesto �pticamente activo, los prefijos D y L o R y S se utilizan para denotar la configuración absoluta de la molécula alrededor de sus centros quirales. Los prefijos d y 1 o (+) y (-) se emplean para designar el signo de rotación de la luz polarizada en el plano por el compuesto, significando (-) o 1 que el compuesto es levógiro. Un compuesto con un prefijo (-) o d es dextrógiro. Para una estructura química dada, estos estereois�meros son idénticos, excepto que son imágenes de espejo uno del otro. Un estereois�mero específico también puede ser referido como un enanti�mero, y una mezcla de estos isómeros con frecuencia se denomina como una mezcla enantiom�rica. Una mezcla de enanti�meros 50:50 es referida como una mezcla rac�mica o un racemato, lo cual puede ocurrir cuando no ha habido estereo-selección o estereo-especificidad en una reacción o proceso químico. Los términos "mezcla rac�mica" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantiom�ricas, desprovistas de actividad óptica.

Grupos protectores

En el contexto de la presente invención, los grupos protectores incluyen las fracciones de pro-fármaco y los grupos protectores químicos.

Los grupos protectores est�n disponibles, son comúnmente conocidos y usados, y se utilizan opcionalmente para prevenir las reacciones secundarias con el grupo protegido durante los procedimientos sintéticos, es decir, las rutas

o los métodos para preparar los compuestos de la invención. Para la mayor parte, la decisión sobre cuáles grupos proteger, cuándo hacerlo, y la naturaleza del grupo protector químico "PG", dependerán de la química de la reacción contra la que se vayan a proteger (por ejemplo, condiciones ácidas, básicas, oxidativas, reductivas, u otras condiciones), y de la dirección pretendida de la síntesis. Los grupos PG no necesitan ser, y en general no son iguales si el compuesto est� sustituido con múltiples grupos protectores. En general, los grupos protectores se utilizarán para proteger a los grupos funcionales, tales como los grupos carboxilo, hidroxilo, tio, o amino, y por lo tanto, para prevenir las reacciones secundarias, o para facilitar de otra manera la eficiencia sintética. El orden de desprotecci�n para producir grupos desprotegidos libres, depende de la dirección pretendida de la síntesis, y de las condiciones de reacción que se vayan a encontrar, y puede presentarse en cualquier orden, como sea determinado por el experto.

Diferentes grupos funcionales de los compuestos de la invención se pueden proteger. Por ejemplo, los grupos protectores para los grupos -OH (ya sean hidroxilo, ácido carbox�lico, ácido fosf�nico, u otras funciones) incluyen a los "grupos formadores de éter o de éster". Los grupos formadores de éter o de éster son capaces de funcionar como grupos protectores químicos en los esquemas sintéticos estipulados en la presente. Sin embargo, algunos grupos protectores de hidroxilo y tio no son grupos formadores de éter ni de éster, como ser� entendido por los expertos en este campo, y se incluyen con las amidas, discutidas más adelante.

Un número muy grande de grupos protectores de hidroxilo y grupos formadores de amida, y las reacciones de disociaci�n química correspondientes, se describen en Protective Groups in Organic Synthesis, Theodora W. Greene (John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1991, ISBN 0-471-62301-6) ("Greene"). Ver también Kocienski, Philip J.; Protecting Groups (Georg Thieme Verlag Stuttgart, Nueva York, 1994). En particular el Capítulo 1, Protecting Groups: An Overview, páginas 1-20, Capítulo 2, Hydroxyl Protecting Groups, páginas 21-94, Capítulo 3, Diol Protecting Groups, páginas 95-117, Capítulo 4, Carboxyl Protecting Groups, páginas 118-154, Capítulo 5, Carbonyl Protecting Groups, páginas 155-184. Para los grupos protectores para ácido carbox�lico, ácido fosf�nico, fosfonato, ácido sulf�nico, y otros grupos protectores para ácidos, ver Greene como se estipula más adelante. Estos grupos incluyen, a manera de ejemplo y no de limitación, ésteres, amidas, hidrazidas, y similares.

Compuestos Inhibidores del VHC

Los compuestos de la invención incluyen aquéllos con una actividad inhibidora del VHC. Los compuestos de la invención tienen opcionalmente uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, o 4) grupos fosfonato, los cuales pueden ser una fracción de pro-fármaco.

El término "compuesto inhibidor del VHC" incluye los compuestos que inhiben VHC.

Normalmente, los compuestos de la invención tienen un peso molecular de aproximadamente 400 amu a aproximadamente 10,000 amu; en una modalidad específica de la invención, los compuestos tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 5,000 amu; en otra modalidad específica de la invención, los compuestos tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 2,500 amu; en otra modalidad específica de la invención, los compuestos tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 1,000 amu; en otra modalidad específica de la invención, los compuestos tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 800 amu; en otra modalidad específica de la invención, los compuestos tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 600 amu; y en otra modalidad específica de la invención, los compuestos tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 600 amu y un peso molecular mayor de aproximadamente 400 amu.

Los compuestos de la invención también tienen normalmente un logD (polaridad) menor de aproximadamente 5. En una modalidad, la invención proporciona compuestos que tienen un logD menor de aproximadamente 4; en otra modalidad, la invención proporciona compuestos que tienen un logD menor de aproximadamente 3; en otra modalidad, la invención proporciona compuestos que tienen un logD mayor de aproximadamente -5; en otra modalidad, la invención proporciona compuestos que tienen un logD mayor de aproximadamente -3; y en otra modalidad, la invención proporciona compuestos que tienen un logD mayor de aproximadamente 0 y menor de aproximadamente 3.

n una modalidad de la invención, el compuesto est� en una forma aislada y purificada. En general, el término "aislado y purificado" significa que el compuesto est� sustancialmente libre de materiales biológicos (por ejemplo, sangre, tejido, células, etc.). En una modalidad específica de la invención, el término significa que el compuesto o conjugado de la invención est� cuando menos aproximadamente el 50 % en peso libre de materiales biológicos; en otra modalidad específica, el término significa que el compuesto o el conjugado de la invención est� cuando menos

aproximadamente el 75 % en peso libre de materiales biológicos; en otra modalidad específica, el término significa que el compuesto o el conjugado de la invención est� cuando menos aproximadamente el 90 % en peso libre de materiales biológicos; en otra modalidad específica, el término significa que el compuesto o el conjugado de la invención est� cuando menos aproximadamente el 98 % en peso libre de materiales biológicos; y en otra modalidad, el término significa que el compuesto o el conjugado de la invención est� cuando menos aproximadamente el 99 % en peso libre de materiales biológicos. En otra modalidad específica, la invención proporciona un compuesto o conjugado de la invención que se ha preparado sintéticamente (por ejemplo, ex vivo).

Acumulaci�n celular

En una modalidad, la invención proporciona compuestos capaces de acumularse en las PBMC (células mononucleares de sangre periférica) humanas. Las células mononucleares de sangre periférica se refieren a las células sanguíneas que tienen linfocitos y monocitos redondos. Fisiológicamente, las células mononucleares de sangre periférica son componentes críticos del mecanismo contra la infección. Las células mononucleares de sangre periférica se pueden aislar a partir de la sangre entera heparinizada de los donadores normales sanos o de recubrimientos esponjosos, mediante centrifugaci�n de gradiente de densidad estándar, y se cosechan de la interfasa, se lavan (por ejemplo, con suero regulado con fosfato), y se almacenan en un medio de congelación. Las células mononucleares de sangre periférica se pueden cultivar en placas de múltiples pozos. En diferentes tiempos del cultivo, el sobrenadante se puede remover para la evaluación, o bien las células se pueden cosechar y analizar (Smith R. y colaboradores (2003), Blood, 102(7): 2532-2540). Los compuestos de esta modalidad pueden comprender además un fosfonato o un pro-fármaco de fosfonato. Más normalmente, el fosfonato o el pro-fármaco de fosfonato puede tener la estructura A3, como se describe en la presente.

Normalmente, los compuestos de la invención demuestran una mejor vida media intracelular de los compuestos o metabolitos intracelulares de los compuestos en las células mononucleares de sangre periférica humanas, al compararse con los análogos de los compuestos que no tengan el fosfonato o el pro-fármaco de fosfonato. Normalmente, la vida media se mejora por cuando menos aproximadamente el 50 %, más normalmente por cuando menos en el intervalo del 50 al 100 %, todavía más normalmente por cuando menos aproximadamente el 100 %, y todavía muy normalmente por más de aproximadamente el 100 %.

En una modalidad de la invención, la vida media intracelular de un metabolito del compuesto en las células mononucleares de sangre periférica se mejora cuando se compara con un análogo del compuesto que no tenga el fosfonato o el pro-fármaco de fosfonato. En estas modalidades, el metabolito se puede generar intracelularmente, por ejemplo, se puede generar dentro de las células mononucleares de sangre periférica humanas. El metabolito puede ser un producto de la disociaci�n de un pro-fármaco de fosfonato dentro de las células mononucleares de sangre periférica humanas. El pro-fármaco de fosfonato se puede disociar para formar un metabolito que tenga cuando menos una carga negativa a un pH fisiológico. El pro-fármaco de fosfonato se puede disociar enzim�ticamente dentro de las células mononucleares de sangre periférica humanas para formar un fosfonato que tenga cuando menos un átomo de hidrógeno activo de la forma P-OH.

Estereois�meros

Los compuestos de la invención pueden tener centros quirales, por ejemplo, átomos de carbono o de fósforo quirales. Los compuestos de la invención, por lo tanto, incluyen las mezclas rac�micas de todos los estereois�meros, incluyendo enanti�meros, diaestere�meros, y atropis�meros. En adición, los compuestos de la invención incluyen a los isómeros ópticos enriquecidos o resueltos en cualquiera o todos los átomos quirales asimétricos. En otras palabras, los centros quirales aparentes a partir de las ilustraciones, se proporcionan como los isómeros quirales o las mezclas rac�micas. Tanto las mezclas rac�micas y diaestereom�ricas, as� como los isómeros ópticos individuales aislados o sintetizados, sustancialmente libres de sus componentes enantiom�ricos o diaestereom�ricos, est�n todos dentro del alcance de la invención. Las mezclas rac�micas se separan en sus isómeros individuales sustancialmente puros �pticamente a través de técnicas bien conocidas, tales como, por ejemplo, la separación de las sales diaestereom�ricas formadas con adyuvantes �pticamente activos, por ejemplo ácidos o bases, seguido por la conversión de regreso hasta las sustancias �pticamente activas. En la mayoría de los casos, el isómero óptico deseado se sintetiza por medio de reacciones estereoespec�ficas, empezando con el estereois�mero apropiado del material de partida deseado.

Los compuestos de la invención también pueden existir como isómeros tautom�ricos en ciertos casos. Aunque solamente se puede ilustrar una estructura de resonancia deslocalizada, todas estas formas son contempladas dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, pueden existir los taut�meros de eno-amina para los sistemas de purina, pirimidina, imidazol, guanidina, amidina, y tetrazol, y todas sus posibles formas tautom�ricas est�n dentro del alcance de la invención.

Sales e hidratos

Las composiciones de esta invención opcionalmente comprenden las sales de los compuestos en la presente, en especial las sales no tóxicas farmac�uticamente aceptables que contienen, por ejemplo, Na+, Li+, K+, Ca+2, y Mg+2.

Estas sales pueden incluir aquéllas derivadas mediante la combinación de los cationes apropiados, tales como los iones de metales alcalinos y alcalinot�rreos, o los iones de amonio y de amino cuaternario con una fracción de ani�n de ácido, normalmente un ácido carbox�lico. Se prefieren las sales monovalentes si se desea una sal soluble en agua.

Las sales de metales normalmente se preparan mediante la reacción del hidróxido de metal con un compuesto de esta invención. Los ejemplos de las sales de metales que se preparan de esta manera son las sales que contienen Li+, Na+, y K+. Se puede precipitar una sal de metal menos soluble a partir de la solución de una sal más soluble, mediante la adición de un compuesto de metal adecuado.

En adición, se pueden formar sales a partir de la adición de ácido con ciertos ácidos orgánicos e inorgánicos, por ejemplo, HCl, HBr, H2SO4, H3PO4, o ácidos sulf�nicos orgánicos, a los centros básicos, normalmente las aminas, o a los grupos ácidos. Finalmente, se debe entender que las composiciones de la presente comprenden a los compuestos de la invención en su forma no ionizada, as� como zwiteri�nica, y combinaciones con cantidades estequiom�tricas de agua como en los hidratos.

Tambi�n se incluyen dentro del alcance de esta invención las sales de los compuestos progenitores con uno o más amino�cidos. Son adecuados cualesquiera de los amino�cidos descritos anteriormente, en especial los amino�cidos que se presentan naturalmente encontrados como componentes de proteína, aunque el amino�cido normalmente es uno que tenga una cadena lateral con un grupo básico o ácido, por ejemplo lisina, arginina, o ácido glut�mico, o un grupo neutro, tal como glicina, serina, treonina, alanina, isoleucina, o leucina.

M�todos de Inhibición del VHC

Otro aspecto de la invención se refiere a los métodos para inhibir la actividad del VHC, los cuales comprenden el paso de tratar una muestra de la que se sospeche que contiene VHC, con una composición de la invención.

Las composiciones de la invención pueden actuar como inhibidores del VHC, como intermediarios para tales inhibidores, o pueden tener otras utilidades, como se describen más adelante. Los inhibidores en general se enlazarán con localizaciones sobre la superficie o en una cavidad del hígado. Las composiciones que se enlacen en el hígado, pueden enlazarse con diferentes grados de reversibilidad. Estos compuestos que se enlazan de una manera sustancialmente irreversible, son candidatos ideales para utilizarse en este método de la invención. Una vez marcadas, las composiciones de enlace sustancialmente irreversible, son útiles como sondas para la detección del VHC. De conformidad con lo anterior, la invención se refiere a métodos para detectar NS3 en una muestra de la que se sospeche que contiene VHC, los cuales comprenden los pasos de: tratar una muestra de la que se sospeche que contiene VHC, con una composición que comprenda un compuesto de la invención enlazado a una marca; y observar el efecto de la muestra sobre la actividad de la marca. Las marcas adecuadas son bien conocidas en el campo del diagnóstico, e incluyen radicales libres estables, fluor�foros, radiois�topos, enzimas, grupos quimiluminiscentes, y crom�genos. Los compuestos de la presente se marcan de una forma convencional utilizando grupos funcionales, tales como hidroxilo o amino.

Dentro del contexto de la invención, las muestras de las que se sospecha que contienen VHC incluyen materiales naturales o hechos por el hombre, tales como organismos vivos; cultivos de tejido o celulares; muestras biológicas, tales como muestras de material biológico (sangre, suero, orina, fluido cerebroespinal, lágrimas, esputo, saliva, muestras de tejido, y similares); muestras de laboratorio; muestras de alimento, agua, o de aire; muestras de bioproductos, tales como extractos de células, en particular células recombinantes que sintetizan una glicoprote�na deseada; y similares. Normalmente, se sospechar� que la muestra contiene VHC. Las muestras pueden estar contenidas en cualquier medio, incluyendo agua y mezclas de disolvente orgánico/agua. Las muestras incluyen organismos vivos, tales como seres humanos, y materiales hechos por el hombre, tales como cultivos celulares.

El paso de tratamiento de la invención comprende agregar la composición de la invención a la muestra, o comprende agregar un precursor de la composición a la muestra. El paso de adición comprende cualquier método de administración, como se describe anteriormente.

Si se desea, la actividad del VHC después de la aplicación de la composición, se puede observar mediante cualquier método, incluyendo los métodos directos e indirectos de detección de la actividad del VHC. Se contemplan los métodos cuantitativo, cualitativo, y semi-cuantitativo para determinar la actividad del VHC. Normalmente, se aplica uno de los métodos de rastreo descritos anteriormente; sin embargo, también es aplicable cualquier otro método, tal como la observación de las propiedades fisiológicas de un organismo vivo.

Muchos organismos contienen VHC. Los compuestos de esta invención son útiles en el tratamiento o en la profilaxis de las condiciones asociadas con la activación del VHC en animales o en el hombre.

Sin embargo, en el rastreo de los compuestos capaces de inhibir VHC, se debe tener en mente que los resultados de los ensayos enzim�ticos pueden no correlacionarse con los ensayos de cultivo celular. Por consiguiente, un ensayo basado en células debe ser la herramienta primaria del rastreo.

Cribados de Inhibidores del VHC

Las composiciones de la invención se criban para determinar su actividad inhibidora contra VHC, mediante cualquiera de las técnicas convencionales para evaluar la actividad enzim�tica. Dentro del contexto de la invención, normalmente primero se rastrean las composiciones para determinar la inhibición del VHC in vitro, y luego se rastrean las composiciones que muestren una actividad inhibidora, para determinar su actividad in vivo. Para utilizarse in vivo, se prefieren las composiciones que tengan una Ki (constante de inhibición) in vitro de menos de aproximadamente 5 x 10-6 M, normalmente menos de aproximadamente 1 x 10-7 M, y de preferencia menos de aproximadamente 5 x 10-8 M. Se han descrito con detalle los cribados in vitro útiles.

Formulaciones farmacéuticas

Los compuestos de esta invención se formulan con vehículos y excipientes convencionales, los cuales se seleccionarán de acuerdo con la práctica ordinaria. Las tabletas contendrán excipientes, derrapantes, rellenos, aglutinantes, y similares. Las formulaciones acuosas se preparan en una forma estéril, y cuando se pretenden para suministrarte mediante una administración diferente de la oral, en general ser�n isot�nicas. Todas las formulaciones contendrán opcionalmente excipientes, tales como aquéllos estipulados en el Handbook of Pharmaceutical Excipients (1986). Los excipientes incluyen ácido asc�rbico y otros antioxidantes, agentes quelantes tales como EDTA, carbohidratos, tales como dextrina, hidroxi-alquil-celulosa, hidroxi-alquil-metil-celulosa, ácido esteárico, y similares. El pH de las formulaciones est� en el intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 11, pero ordinariamente es de aproximadamente 7 a 10.

Aunque es posible que los ingredientes activos se administren solos, puede ser preferible presentarlos como formulaciones farmacéuticas. Las formulaciones de la invención, tanto para uso veterinario como humano, comprenden cuando menos un principio activo, como se define anteriormente, junto con uno o más vehículos aceptables para el mismo, y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. Los vehículos deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación, y fisiológicamente inocuos para el receptor de los mismos.

Las formulaciones incluyen aquéllas adecuadas para las vías de administración anteriores. Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en una forma de dosificación unitaria, y se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Las técnicas y formulaciones en general se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA). Estos métodos incluyen el paso de poner en asociación el principio activo con el vehículo, el cual constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan poniendo en asociación de una manera uniforme e íntima el principio activo con los vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos, o ambos, y entonces, si es necesario, se configura el producto.

Las formulaciones de la presente invención, adecuadas para administración oral, se pueden presentar como unidades separadas, tales como cápsulas, pastillas, o tabletas, cada una conteniendo una cantidad previamente determinada del principio activo; como un polvo o gránulos; como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua, o como una emulsión líquida de agua en aceite. El principio activo también se puede administrar como un bolo, electuario, o pasta.

Una tableta se hace mediante compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Las tabletas comprimidas se pueden preparar mediante compresión, en una máquina adecuada, del principio activo en una forma de flujo libre, tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, conservador, agente de actividad superficial, o agente dispersante. Las tabletas moldeadas se pueden hacer mediante moldeo, en una máquina adecuada, de una mezcla del principio activo en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Las tabletas opcionalmente se pueden recubrir o marcar, y opcionalmente se formulan para proporcionar la liberación lenta o controlada del principio activo a partir de las mismas.

Para administrarse a los ojos o a otros tejidos externos, por ejemplo a la boca y a la piel, las formulaciones de preferencia se aplican como un ungüento o crema típica que contenga a los ingredientes activos en una cantidad, por ejemplo, del 0,075 al 20 % en peso/peso (incluyendo los ingredientes activos en un intervalo de entre el 0,1 % y el 20 % en incrementos del 0,1 % en peso/peso, tal como el 0,6 % en peso/ peso, el 0,7 % en peso/peso, etc.), de preferencia del 0,2 al 15 % en peso/peso, y muy preferiblemente del 0,5 al 10 % en peso/peso. Cuando se formulan en un ungüento, los ingredientes activos se pueden emplear con una base de ungüento paraf�nica o miscible con agua. De una manera alternativa, los ingredientes activos se pueden formular en una crema con una base de crema de aceite en agua.

Si se desea, la fase acuosa de la base de crema puede incluir, por ejemplo, cuando menos el 30 % en peso/peso de un alcohol polih�drico, es decir, un alcohol que tenga dos o más grupos hidroxilo, tal como propilenglicol, butano-1,3diol, manitol, sorbitol, glicerol, y polietilenglicol (incluyendo PEG 400), y mezclas de los mismos. Las formulaciones típicas pueden incluir deseablemente un compuesto que mejore la absorción o penetraci�n del principio activo a

trav�s de la piel o de otras áreas afectadas. Los ejemplos de los mejoradores de la penetraci�n d�rmica incluyen sulf�xido de dimetilo y análogos relacionados.

La fase oleosa de las emulsiones de esta invención puede estar constituida de ingredientes conocidos, de una manera conocida. Aunque la fase puede comprender meramente un emulsionante (de otra manera conocido como un emulgente), deseablemente comprende una mezcla de cuando menos un emulsionante con una grasa o un aceite, o con tanto una grasa como un aceite. De preferencia, se incluye un emulsionante hidrof�lico junto con un emulsionante lipof�lico que actúe como un estabilizante. También se prefiere incluir tanto un aceite como una grasa. Juntos, los emulsionantes con o sin estabilizantes, forman la denominada cera emulsionante, y la cera junto con el aceite y la grasa forman la denominada base de ungüento emulsionante, la cual forma la fase oleosa dispersada de las formulaciones de crema.

Los emulgentes y los estabilizantes de emulsión adecuados para utilizarse en la formulación de la invención incluyen Tween� 60, Span� 80, alcohol cetoestear�lico, alcohol benc�lico, alcohol mirist�lico, mono-estearato de glicerilo, y lauril-sulfato de sodio.

La elección de los aceites o grasas adecuados para la formulación se basa en lograr las propiedades cosm�ticas deseadas. La crema de preferencia debe ser un producto no graso, que no manche, y lavable, con una consistencia adecuada para evitar la fuga desde los tubos u otros contenedores. Se pueden utilizar alquil-ésteres mono-o dib�sicos de cadena recta o ramificada, tales como di-isoadipato, estearato de isocetilo, di�ster de propilenglicol de ácidos grasos de coco, miristato de isopropilo, oleato de decilo, palmitato de isopropilo, estearato de butilo, palmitato de 2-etil-hexilo, o una mezcla de ésteres de cadena ramificada conocidos como Crodamol CAP, siendo los ésteres preferidos los tres últimos. éstos se pueden utilizar solos o en combinación, dependiendo de las propiedades requeridas. De una manera alternativa, se utilizan lípidos de alto punto de fusión, tales como parafina blanda blanca y/o parafina líquida, u otros aceites minerales.

Las formulaciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención comprenden uno o más compuestos de la invención, junto con uno o más vehículos o excipientes farmac�uticamente aceptables, y opcionalmente otros agentes terapéuticos. Las formulaciones farmacéuticas que contengan al principio activo pueden estar en cualquier forma adecuada para el método de administración pretendido. Cuando se utilizan para uso oral, por ejemplo, se pueden preparar tabletas, trociscos, grageas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas, jarabes o el�xires. Las composiciones pretendidas para uso oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas, y estas composiciones pueden contener uno o más agentes, incluyendo agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes, y agentes conservadores, con el objeto de proporcionar una preparación agradable al paladar. Son aceptables las tabletas que contengan al principio activo mezclado con un excipiente no tóxico farmac�uticamente aceptable, que sea adecuado para la fabricación de las tabletas. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio o de sodio, lactosa, monohidrato de lactosa, croscarmelosa de sodio, povidona, fosfato de calcio o de sodio; agentes de granulación y desintegrantes, tales como almidón de maíz, o ácido alg�nico; agentes aglutinantes, tales como celulosa, celulosa microcristalina, almidón, gelatina, o acacia; y agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, ácido esteárico, o talco. Las tabletas pueden no estar recubiertas, o pueden recubrirse mediante técnicas conocidas, incluyendo microencapsulaci�n para demorar la desintegración y adsorción en el tracto gastrointestinal, y de esta manera proporcionar una acción sostenida durante un período más largo. Por ejemplo, se puede emplear un material de demora de tiempo, tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, solo o con una cera.

Las formulaciones para uso oral también se pueden presentar como cápsulas de gelatina dura, en donde se mezcla el principio activo con un diluyente sólido inerte, por ejemplo fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina blanda, en donde se mezcla el principio activo con agua o con un medio oleoso, tal como aceite de cacahuate, parafina líquida, o aceite de oliva.

Las suspensiones acuosas de la invención contienen a los materiales activos mezclados con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Estos excipientes incluyen un agente de suspensión, tal como carboximetil-celulosa de sodio, metil-celulosa, hidroxi-propil-metil-celulosa, alginato de sodio, polivinil-pirrolidona, goma de tragacanto y goma de acacia, y agentes dispersantes o humectantes, tales como fosfatida que se presenta naturalmente (por ejemplo, lecitina), un producto de condensación de un óxido de alquileno con un ácido graso (por ejemplo, estearato de polioxietileno), un producto de condensación de óxido de etileno con un alcohol alif�tico de cadena larga (por ejemplo, hepta-decaetilen-oxi-cetanol), un producto de condensación de óxido de etileno con un éster parcial derivado de un ácido graso y un anh�drido de hexitol (por ejemplo, mono-oleato de sorbit�n de polioxietileno). La suspensión acuosa también puede contener uno o más conservadores, tales como p-hidroxibenzoato de etilo o de propilo normal, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes, y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.

Las suspensiones en aceite se pueden formular mediante la suspensión del principio activo en un aceite vegetal, tal como aceite de araqu�s, aceite de oliva, aceite de ajonjol�, o aceite de coco, o en un aceite mineral, tal como parafina líquida. Las suspensiones orales pueden contener un agente espesante, tal como cera de abejas, parafina dura, o alcohol cet�lico. Se pueden agregar agentes edulcorantes, tales como los estipulados anteriormente, y agentes saborizantes, para proporcionar una preparación oral agradable al paladar. Estas composiciones se pueden conservar mediante la adición de un antioxidante, tal como ácido asc�rbico.

5 Los polvos y gránulos dispersables de la invención, adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua, proporcionan el principio activo mezclado con un agente de dispersi�n o humectante, un agente de suspensión, y uno o más conservadores. Los agentes de dispersi�n o humectantes y agentes de suspensión adecuados est�n ejemplificados por los dados a conocer anteriormente. También puede haber excipientes adicionales presentes, por ejemplo agentes edulcorantes, saborizantes, y colorantes.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden estar en la forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, tal como aceite de oliva o aceite de araqu�s, un aceite mineral, tal como parafina líquida, o una mezcla de los mismos. Los agentes emulsionantes adecuados incluyen las gomas que se presentan naturalmente, tales como goma de acacia y goma de tragacanto, fosfatidas que se presentan

15 naturalmente, tales como lecitina de semilla de soya, ésteres o ésteres parciales derivados a partir de ácidos grasos y anh�dridos de hexitol, tales como mono-oleato de sorbit�n, y los productos de la condensación de estos ésteres parciales con óxido de etileno, tales como mono-oleato de sorbit�n de polioxietileno. La emulsión también puede contener agentes edulcorantes y saborizantes. Los jarabes y el�xires se pueden formular con agentes edulcorantes, tales como glicerol, sorbitol, o sacarosa. Estas formulaciones también pueden contener un demulcente, un conservador, un saborizante, o un agente colorante.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden estar en la forma de una preparación inyectable estéril, tal como una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión se puede formular de acuerdo con la técnica conocida, utilizando agentes de dispersi�n o humectantes y agentes de suspensión adecuados, los cuales

25 se han mencionado anteriormente. La preparación inyectable estéril puede ser también una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, tal como una solución en 1,3butano-diol, o se puede preparar como un polvo liofilizado. Entre los vehículos y solventes aceptables que se pueden emplear son agua, solución de Ringer, y solución isot�nica de cloruro de sodio. En adición, convencionalmente se pueden emplear aceites fijos estériles como un medio disolvente o de suspensión. Para este propósito, se puede emplear cualquier aceite fijo blando, incluyendo mono-o di-glic�ridos sintéticos. En adición, de la misma manera se pueden utilizar ácidos grasos, tales como ácido oleico, en la preparación de inyectables.

La cantidad de principio activo que se puede combinar con el material portador para producir una sola forma de dosificación variar� dependiendo del huésped tratado y del modo de administración particular. Por ejemplo, una

35 formulación de liberación en tiempo pretendida para administración oral a seres humanos puede contener de aproximadamente 1 a 1000 miligramos del material activo combinado con una cantidad apropiada y conveniente de material portador, la cual puede variar desde aproximadamente el 5 a aproximadamente el 95 % de las composiciones totales (peso:peso). La composición farmacéutica se puede preparar para proporcionar cantidades fácilmente mensurables para la administración. Por ejemplo, una solución acuosa pretendida para infusión intravenosa puede contener de aproximadamente 3 a 500 microgramos del principio activo por mililitro de solución, con el objeto de que se pueda presentar la infusión de un volumen adecuado a una velocidad de aproximadamente 30 ml/h.

Las formulaciones adecuadas para administrarse a los ojos incluyen gotas para los ojos, en donde el principio activo

45 se disuelve o se suspende en un vehículo adecuado, en especial un disolvente acuoso para el principio activo. El principio activo de preferencia est� presente en estas formulaciones en una concentración del 0,5 al 20 %, convenientemente del 0,5 al 10 %, y en particular de aproximadamente el 15 % en peso/peso.

Las formulaciones adecuadas para administración típica en la boca incluyen grageas que comprenden al principio activo en una base saborizada, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden al principio activo en una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia; y enjuagues bucales que comprenden al principio activo en un vehículo líquido adecuado.

Las formulaciones para administración rectal se pueden presentar como un supositorio con una base adecuada que 55 comprenda, por ejemplo, manteca de cacao o un salicilato.

Las formulaciones adecuadas para administración intra-pulmonar o nasal, tienen un tamaño de partículas, por ejemplo, en el intervalo de 0,1 a 500 micras (incluyendo tamaños de partículas en el intervalo de entre 0,1 y 500 micras en incrementos de micras, tales como 0,5, 1, 30 micras, 35 micras, etc.), las cuales se administran mediante inhalaci�n rápida a través del pasaje nasal o mediante inhalaci�n a través de la boca, para llegar a los sacos alveolares. Las formulaciones adecuadas incluyen soluciones acuosas u oleosas del principio activo. Las formulaciones adecuadas para la administración de aerosol o de polvo seco se pueden preparar de acuerdo con los métodos convencionales, y se pueden suministrar con otros agentes terapéuticos, tales como los compuestos utilizados hasta ahora en el tratamiento o la profilaxis de las condiciones asociadas con la actividad del VHC.

65 Las formulaciones adecuadas para administración vaginal se pueden presentar como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas, o formulaciones en aerosol que contengan, en adición al principio activo, vehículos tales como los que se conocen en la técnica como apropiados.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones para inyección estériles acuosas y

5 no acuosas, las cuales pueden contener antioxidantes, reguladores del pH, bacteriost�ticos y solutos que hagan a la formulación isot�nica con la sangre del receptor pretendido; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas, las cuales pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes.

Las formulaciones se presentan en recipientes de dosis unitaria o de múltiples dosis, por ejemplo ampolletas y frascos sellados, y se pueden almacenar en una condición secada por congelación (liofilizada), requiriendo solamente la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo agua para inyección, inmediatamente antes de usarse. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporánea se preparan a partir de polvos estériles, gránulos, y tabletas de la clase previamente descrita. Las formulaciones de dosificación unitaria preferidas son aquéllas que contienen una dosis diaria o una sub-dosis unitaria diaria, como se menciona anteriormente en la presente, o una

15 fracción apropiada de la misma, del principio activo.

Se debe entender que, en adición a los ingredientes particularmente mencionados anteriormente, las formulaciones de esta invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica, teniendo consideración del tipo de formulación en cuestión, por ejemplo aquéllas adecuadas para administración oral pueden incluir agentes saborizantes.

La invención proporciona además composiciones veterinarias que comprenden cuando menos un principio activo, como se define anteriormente, junto con un vehículo veterinario para el mismo.

25 Los vehículos veterinarios son materiales útiles para el propósito de administrar la composición, y pueden ser materiales sólidos, líquidos, o gaseosos, los cuales de otra manera sean inertes o aceptables en la técnica veterinaria, y sean compatibles con el principio activo. Estas composiciones veterinarias se pueden administrar oralmente, parenteralmente, o por cualquier otra vía deseada.

Los compuestos de la invención también se pueden formular para proporcionar la liberación controlada del principio activo, con el fin de permitir una dosificación menos frecuente, o con el objeto de mejorar el perfil farmacocin�tico o de toxicidad del principio activo. De conformidad con lo anterior, la invención también proporciona composiciones que comprenden uno o más compuestos de la invención, formulados para su liberación sostenida o controlada.

35 La dosis efectiva del principio activo depende cuando menos de la naturaleza de la condición que se est� tratando, de la toxicidad, de si el compuesto se est� utilizando profil�cticamente (dosis más bajas), del método de suministro, y de la formulación farmacéutica, y ser� determinada por el cl�nico empleando estudios de escala de dosis convencionales. Se puede esperar que sea de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 100 miligramos/ kilogramo de peso corporal al día. Normalmente, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 miligramos/kilogramo de peso corporal al día. Más normalmente, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 miligramos/kilogramo de peso corporal al día. Más normalmente, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,5 miligramos/kilogramo de peso corporal al día. Por ejemplo, la dosis candidata diaria para un ser humano adulto de aproximadamente 70 kilogramos de peso corporal estar� en el intervalo de 1 miligramo a 1000 mg, de preferencia entre 5 miligramos y 500 mg, y puede tomar la forma de dosis individuales o múltiples.

45 Vías de administración

Uno o más compuestos de la invención (referidos en la presente como los ingredientes activos) se administran por cualquier vía apropiada para la condición que se vaya a tratar. Las vías adecuadas incluyen oral, rectal, nasal, típica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal, y parenteral (incluyendo subcutánea, intra-muscular, intravenosa, intrad�rmica, intratecal, y epidural), y similares. Se apreciar� que la vía preferida puede variar, por ejemplo, con la condición del receptor. Una ventaja de los compuestos de esta invención es que son oralmente biodisponibles y se pueden dosificar oralmente.

55 Terapia de combinación

Los ingredientes activos de la invención también se utilizan en combinación con otros ingredientes activos. Estas combinaciones se seleccionan basándose en la condición que se vaya a tratar, las reactividades cruzadas de los ingredientes, y las propiedades farmacol�gicas de la combinación.

Tambi�n es posible combinar cualquier compuesto de la invención con uno o más ingredientes activos diferentes en una forma de dosificación unitaria para administración simultánea o en secuencia a un paciente. La terapia de combinación se puede administrar como un régimen simultáneo o en secuencia. Cuando se administra en secuencia, la combinación se puede administrar en dos o más administraciones.

65 La terapia de combinación puede proporcionar "sinergismo" y un "efecto sin�rgico", es decir, el efecto que se logra cuando los ingredientes activos utilizados juntos, es mayor que la suma de los efectos que resultan de utilizar los

compuestos por separado. Se puede obtener un efecto sin�rgico cuando los ingredientes activos: (1) se co-formulan y administran o suministran de una manera simultánea en una formulación combinada; (2) se suministran mediante la administración alternada o en paralelo como formulaciones separadas; o (3) se suministran mediante algún otro régimen. Cuando se suministran en una terapia alternada, se puede obtener un efecto sin�rgico cuando los compuestos se administran o se suministran en secuencia, por ejemplo en tabletas, píldoras o cápsulas separadas,

o mediante diferentes inyecciones en jeringas separadas. En general, durante la terapia alternada, se administra una dosificación efectiva de cada principio activo en secuencia, es decir, en serie, mientras que en la terapia de combinación, se administran juntas dosificaciones efectivas de dos o más ingredientes activos.

Metabolitos de los compuestos de la invención

Tambi�n son de relevancia los productos metabólicos in vivo de los compuestos descritos en la presente. Estos productos pueden resultar, por ejemplo, de la oxidación, reducción, hidrólisis, amidaci�n, esterificaci�n, y similares, del compuesto administrado, primordialmente debido a los procesos enzim�ticos. De conformidad con lo anterior, la invención incluye los compuestos producidos mediante un proceso que comprende poner en contacto un compuesto de esta invención con un mamífero durante un período de tiempo suficiente para proporcionar un producto metabólico del mismo. Estos productos normalmente se identifican mediante la preparación de un compuesto de la invención radiomarcado (por ejemplo, C14 oH3), administrarlo parenteralmente en una dosis detectable (por ejemplo, mayor de aproximadamente 0,5 miligramos/kilogramo) a un animal, tal como una rata, ratón, cobayo, mono, o al hombre, dando suficiente tiempo para que ocurra el metabolismo (normalmente de aproximadamente 30 segundos a 30 horas), y aislar sus productos de conversión de la orina, sangre, o de otras muestras biológicas. Estos productos se aíslan fácilmente, debido a que est�n marcados (otros se aíslan mediante el uso de anticuerpos capaces de enlazarse con los ep�topos sobrevivientes en el metabolito). Las estructuras del metabolito se determinan de una forma convencional, por ejemplo, mediante análisis de MS o RMN. En general, el análisis de los metabolitos se hace de la misma manera que los estudios de metabolismo de fármacos convencionales bien conocidos por los expertos en este campo. Los productos de la conversión, siempre que no se encuentren de otra manera in vivo, son útiles en los ensayos de diagnóstico para la dosificación terapéutica de los compuestos de la invención, inclusive cuando no posean una actividad inhibidora del VHC por s� mismos.

Se conocen las recetas y los métodos para determinar la estabilidad de los compuestos en las secreciones gastrointestinales subrogadas. Los compuestos se definen en la presente como estables en el tracto gastrointestinal, en donde se desprotegen menos de aproximadamente el 50 % molar de los grupos protegidos en el jugo intestinal o gástrico subrogado después de la incubaci�n durante 1 hora a 37 �C. Simplemente debido a que los compuestos son estables en el tracto gastrointestinal, esto no significa que no puedan hidrolizarse in vivo. Los pro-fármacos de fosfonato de la invención normalmente ser�n estables en el sistema digestivo, pero se hidrolizan sustancialmente hasta el fármaco progenitor en el lumen digestivo, en el hígado, o en otro órgano metabólico, o dentro de las células en general.

M�todos de ejemplo para hacer los compuestos de la invención

La invención también se refiere a los métodos para hacer las composiciones de la invención. Las composiciones se preparan mediante cualquiera de las técnicas aplicables de síntesis orgánica. Muchas de estas técnicas son bien conocidas en la materia. Sin embargo, muchas de las técnicas conocidas se elaboran en Compendium of Organic Synthetic Methods (John Wiley & Sons, Nueva York), Volumen 1, Ian T. Harrison y Shuyen Harrison, 1971; Volumen 2, Ian T. Harrison y Shuyen Harrison, 1974; Volumen 3, Louis S. Hegedus y Leroy Wade, 1977; Volumen 4, Leroy G. Wade, Jr., 1980; Volumen 5, Leroy G. Wade, Jr., 1984; y Volumen 6, Michael B. Smith; as� como March, J., Advanced Organic Chemistry, Tercera Edición, (John Wiley & Sons, Nueva York, 1985), Comprehensive Organic Synthesis. Selectivity, Strategy & Efficiency in Modern Organic Chemistry. En 9 Volúmenes, Barry M. Trost, Editor en Jefe (Pergamon Press, Nueva York, 1993 en impresión).

M�s adelante se proporciona un número de métodos de ejemplo para la preparación de las composiciones de la invención. Estos métodos pretenden ilustrar la naturaleza de estas preparaciones, y no pretenden limitar el alcance de los métodos aplicables.

En general, las condiciones de reacción, tales como la temperatura, el tiempo de reacción, los solventes, los procedimientos para el procesamiento, y similares, ser�n aquéllos comunes en la técnica para la reacción particular que se vaya a llevar a cabo. El material de referencia citado, junto con el material citado en el mismo, contiene descripciones detalladas de tales condiciones. Normalmente, las temperaturas ser�n de -100 �C a 200 �C, los solventes ser�n apr�ticos o pr�ticos, y los tiempos de reacción ser�n de 10 segundos a 10 días. El procesamiento normalmente consiste en apagar cualesquiera reactivos sin reaccionar, seguido por la división entre un sistema en capas de agua/orgánico (extracción), y separar la capa que contenga el producto.

Las reacciones de oxidación y reducción normalmente se llevan a cabo a temperaturas cercanas a la temperatura ambiente (aproximadamente 20 �C), aunque para las reducciones de hidruro de metal, con frecuencia la temperatura se reduce hasta de 0 �C a -100 �C; los solventes son normalmente apr�ticos para las reducciones, y pueden ser pr�ticos o apr�ticos para las oxidaciones. Los tiempos de reacción se ajustan para lograr las conversiones

deseadas.

Las reacciones de condensación normalmente se llevan a cabo a temperaturas cercanas a la temperatura ambiente, aunque para las condensaciones cin�ticamente controladas, no equilibrantes, también son comunes las temperaturas reducidas (de 0 �C a -100 �C). Los solventes pueden ser pr�ticos (comunes en las reacciones equilibrantes) o apr�ticos (comunes en las reacciones cin�ticamente controladas).

Las técnicas sintéticas convencionales, tales como la remoción azeotr�pica de los subproductos de la reacción, y el uso de condiciones de reacción anhidras (por ejemplo, medios ambientes de gas inerte), son comunes en este campo, y se aplicarán cuando sean aplicables.

Los términos "tratado", "tratar", "tratamiento", y similares, cuando se utilicen en relación con una operación sintética química, significan poner en contacto, mezclar, hacer reaccionar, permitir que reaccione, llevar hasta el contacto, y otros términos comunes en la materia para indicar que una o más entidades químicas se tratan de tal manera que se convierten en una o más entidades químicas diferentes. Esto significa que "tratar el compuesto uno con el compuesto dos" es sinónimo de "permitir que el compuesto uno reaccione con el compuesto dos", "poner en contacto el compuesto uno con el compuesto dos", "hacer reaccionar el compuesto uno con el compuesto dos", y otras expresiones comunes en el ámbito de la síntesis orgánica para indicar razonablemente que el compuesto uno "se trat�", "se hizo reaccionar", "se permitió reaccionar", etc., con el compuesto dos. Por ejemplo, tratar indica la manera razonable y usual en la que se permite que reaccionen los productos químicos orgánicos. A menos que se indique de otra manera, se pretenden concentraciones normales (de 0,01 M a 10 M, normalmente de 0,1 M a 1 M), temperaturas normales (de -100 �C a 250 �C, normalmente de -78 �C a 150 �C, más normalmente de -78 �C a 100 �C, y todavía muy normalmente de 0 �C a 100 �C), recipientes de reacción normales (normalmente de vidrio, plástico, metal), solventes, presiones, atmósferas normales (normalmente aire para reacciones insensibles al oxígeno y al agua, o nitrógeno o argón para las sensibles al oxígeno y al agua), etc. En la selección de las condiciones y aparatos para el "tratamiento" en un proceso dado, se utiliza el conocimiento de reacciones similares conocidas en la técnica de la síntesis orgánica. En particular, un experto ordinario en el campo de la síntesis orgánica selecciona las condiciones y aparatos razonablemente esperados para llevar a cabo con éxito las reacciones químicas de los procesos descritos, basándose en el conocimiento en la materia.

Las modificaciones de cada uno de los esquemas de ejemplo y en los ejemplos (referidos posteriormente en la presente como "esquemas de ejemplo") conducen a diferentes análogos de los materiales de ejemplo específicos producidos. Las citas anteriormente mencionadas que describen los métodos adecuados de síntesis orgánica, son aplicables a tales modificaciones.

En cada uno de los esquemas de ejemplo, puede ser conveniente separar los productos de reacción unos de otros y/o de los materiales de partida. Los productos deseados de cada paso o serie de pasos se separan y/o se purifican (posteriormente en la presente, se separan) hasta el grado de homogeneidad deseado, mediante las técnicas comunes en este campo. Normalmente, estas separaciones involucran extracción en múltiples fases, cristalización a partir de un disolvente o mezcla de solventes, destilación, sublimación, o cromatograf�a. La cromatograf�a puede involucrar cualquier número de métodos, incluyendo, por ejemplo: en fase inversa y en fase normal; por exclusión de tamaños; de intercambio de iones; los métodos y aparatos de cromatograf�a de líquidos a presión alta, media, y baja; analítica a pequeña escala; de lecho en movimiento simulado (SMB), y cromatograf�a de capa delgada o gruesa de preparación, as� como las técnicas de cromatograf�a de capa delgada a pequeña escala y por evaporación instantánea.

Otra clase de métodos de separación involucra el tratamiento de una mezcla con un reactivo seleccionado para enlazarse con, o para hacer de otra manera separable, un producto deseado, un material de partida sin reaccionar, un subproducto de reacción, o similares. Estos reactivos incluyen adsorbentes o absorbentes, tales como carbón activado, tamices moleculares, medios de intercambio de iones, o similares. De una manera alternativa, los reactivos pueden ser ácidos en el caso de un material básico, bases en el caso de un material ácido, reactivos de enlace tales como anticuerpos, proteínas de enlace, quelantes selectivos tales como �teres de corona, reactivos de extracción de iones de líquido/líquido (LIX), o similares.

La selección de los métodos de separación apropiados depende de la naturaleza de los materiales involucrados. Por ejemplo, el punto de ebullición, y el peso molecular en la destilación y sublimación, la presencia o ausencia de grupos funcionales polares en la cromatograf�a, la estabilidad de los materiales en medios ácidos y básicos en la extracción en múltiples fases, y similares. Un experto en la materia aplicar� las técnicas que tengan más probabilidades de lograr la separación deseada.

Se puede obtener un solo estereois�mero, por ejemplo un enanti�mero, sustancialmente libre de su estereois�mero, mediante la resolución de la mezcla rac�mica empleando un método tal como la formación de diaestere�meros utilizando agentes de resolución �pticamente activos (Stereochemistry of Carbon Compounds, (1962) por E. L. Eliel, McGraw Hill; Lochmuller, C. H. (1973), J. Chromatogr., 113: (3) 283-302). Las mezclas rac�micas de los compuestos quirales de la invención se pueden separar y aislar mediante cualquier método adecuado, incluyendo: (1) formación de sales diaestereom�ricas iónicas con compuestos quirales, y separación mediante cristalización fraccionaria u otros métodos, (2) formación de compuestos diaestereom�ricos con reactivos de derivación quiral, separación de los diaestere�meros, y conversión hasta los estereois�meros puros, y (3) separación de los estereois�meros sustancialmente puros o enriquecidos directamente bajo condiciones quirales.

5 De acuerdo con el método (1), se pueden formar sales diaestereom�ricas mediante la reacción de bases quirales enantiom�ricamente puras, tales como brucina, quinina, efedrina, estricnina, α-metil-�-fenil-etil-amina (anfetamina), y similares, con compuestos asimétricos que tengan funcionalidad ácida, tales como ácido carbox�lico y ácido sulf�nico. Las sales diaestereom�ricas se pueden inducir para separarse mediante cristalización fraccionaria o cromatograf�a iónica. Para la separación de los isómeros ópticos de los compuestos de amino, la adición de los

10 ácidos carbox�licos o sulf�nicos quirales, tales como ácido canforsulf�nico, ácido tartárico, ácido mand�lico, o ácido l�ctico, puede dar como resultado la formación de las sales diaestereom�ricas

De una manera alternativa, mediante el método (2), el sustrato que se va a resolver se hace reaccionar con un enanti�mero de un compuesto quiral para formar un par diaestereom�rico (Eliel, E. y Wilen, S. (1994) 15 Stereochemistry of Organic Compounds, John Wiley & Sons, Inc., página 322). Los compuestos diaestereom�ricos se pueden formar mediante la reacción de los compuestos asimétricos con reactivos de derivación quiral enantiom�ricamente puros, tales como derivados de mentilo, seguido por la separación de los diaestere�meros y la hidrólisis para proporcionar el xanteno enantiom�ricamente enriquecido libre. Un método para determinar la pureza óptica involucra hacer ésteres quirales, tales como un mentil-éster, por ejemplo, cloroformato de (-)mentilo, en la 20 presencia de una base, o éster de Mosher, acetato de α-metoxi-α-(trifluoro-metil)-fenilo (Jacob III. (1982), J. Org. Chem., 47: 4165), de la mezcla rac�mica, y analizar el espectro de resonancia magnética nuclear con el objeto de determinar la presencia de los dos diaestere�meros atropisom�ricos. Los diaestere�meros estables de los compuestos atropisom�ricos se pueden separar y aislar mediante cromatograf�a en fase normal y en fase inversa, siguiendo los métodos para la separación de las naftil-isoquinolinas atropisom�ricas (Hoye, T., Publicación

25 Internacional Número WO 96/15111). Mediante el método (3), una mezcla rac�mica de dos enanti�meros se puede separar mediante cromatograf�a utilizando una fase estacionaria quiral (Chiral Liquid Chromatography (1989), W. J. Lough, Editor Chapman and Hall, Nueva York; Okamoto, (1990), J. of Chromatogr., 513: 375-378). Los enanti�meros enriquecidos o purificados se pueden distinguir mediante los métodos empleados para distinguir otras moléculas quirales con átomos de carbono asimétricos, tales como rotación óptica y dicro�smo circular.

30 Esquemas y ejemplos

Los aspectos generales de estos métodos de ejemplo se describen en seguida y en los Ejemplos. Cada uno de los productos de los siguientes procesos opcionalmente se separa, se aísla, y/o se purifica antes de su uso en los

35 procesos subsecuentes.

En la presente se proporciona un número de métodos de ejemplo para la preparación de los compuestos de la invención, por ejemplo, en los Ejemplos que se encuentran más adelante en la presente. Estos métodos pretenden ilustrar la naturaleza de tales preparaciones, y no pretenden limitar el alcance de los métodos aplicables. Ciertos

40 compuestos de la invención se pueden utilizar como intermediarios para la preparación de otros compuestos de la invención. Por ejemplo, en seguida se ilustra la interconversi�n de diferentes compuestos de fosfonato de la invención.

Ejemplos

Preparaci�n de intermediarios P1:

1. Síntesis y resolución de la sal del ácido dibenzoil-l-tartárico de (1S,2R)-1-amino-2-etenil-ciclopropan-1fosfonato de dietilo.

55 Una solución de (N-benciliden-amino-metil)-fosfonato de dietilo (50 g, 196 mmol), trans-1,4-dibromo-2-buteno (50 g, 235 mmol), y cloruro de bencil-trietil-amonio (4,5 g, 19,6 mmol) en diclorometano (1,0 l), se agit� a temperatura

ambiente utilizando un agitador mecánico, cuando se agregó monohidrato de hidróxido de cesio (82 g, 490 mmol). La mezcla resultante se agit� durante 18 horas, después de lo cual, se agregó otra porción de monohidrato de hidróxido de cesio (82 g, 490 mmol). La mezcla resultante se agit� durante 24 horas. Entonces las sales se filtraron a través de un coj�n de Celite 521, y el filtrado se dej� agitándose con HCl acuoso 1 N a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla resultante se filtr� a través de un coj�n de Celite 521, y las dos fases del filtrado se separaron. La fracción orgánica se extrajo con HCl acuoso 1 N (250 ml, 1 x). Las fracciones acuosas se lavaron con dicloro-metano (250 ml, 1 x), y las fracciones acuosas combinadas se agitaron con acetato de etilo (500 ml), mientras se agregaban con precaución 84 gramos (1 mol) de NaHCO3, seguidos por un exceso de NaCl hasta saturarse. Después de que la mezcla resultante se filtr� a través de un coj�n de Celite 521 para remover el exceso de NaCl y algo de alquitrán negro, se separaron dos capas, y la fracción acuosa se extrajo adicionalmente con acetato de etilo (250 ml, 2 x). Los extractos orgánicos se lavaron con una solución saturada de NaCl (250 ml, 1 x), se combinaron, se secaron (MgSO4), y se concentraron, para obtener aproximadamente 16,5 a 17 gramos de la amina cruda.

La amina cruda se purificó parcialmente mediante cromatograf�a en columna utilizando de 165 a 170 gramos de gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo (100 %, aproximadamente 500 ml), seguido por metanol al 5 % en acetato de etilo (aproximadamente 1200 ml). Las fracciones que contenían al producto se reservaron y se concentraron, lo cual dio como resultado de 11,5 a 12 gramos de la amina parcialmente purificada.

A esta amina se le agregó una solución de 18,8 a 19,6 gramos (1 equivalente molar) del ácido dibenzoil-L-tartárico en 151,5 a 158 ml de acetonitrilo (5 veces la cantidad de la sal). La mezcla se calentó hasta que se convirtió en una solución, y se enfri� lentamente a temperatura ambiente, para obtener sólidos. Después de pasar la noche, los sólidos se recolectaron mediante filtración, y se lavaron con acetonitrilo. Los sólidos se recristalizaron a partir de la misma cantidad de acetonitrilo, nuevamente a temperatura ambiente, para proporcionar de 10,5 a 11,5 gramos de la sal �pticamente pura: �H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 8,14 (a, 2H), 8,11 (d, J = 1,2 Hz, 2H), 7,64 (tt, J = 7,5 y 1,2 Hz, 2H), 7,51 (t a, J = 7,5 Hz, 4H), 5,94 (s, 2H), 5,82 (dt, J = 17,1 y 9,9 Hz, 1H), 5,32 (dd, J = 17,1 y 1,2 Hz, 1H), 5,13 (dd, J = 10,5 y 1,2 Hz, 1H), 4,11-4,26 (m, 4H), 2,11 (m, 1H), 1,33-1,47 (m, 2H), 1,37 (dt, J = 10,2 y 7,2 Hz, 6H); 31P RMN (75 MHz, CD3OD) δ 22,55.

Anal�tica: La pureza óptica de la amina se puede determinar mediante 31P RMN de la amida de Mosher en DMSOd6. El material recristalizado (25 miligramos) se disolvió en una mezcla de NaHCO3 acuoso saturado (5 ml) y NaCl acuoso saturado (5 ml), y la amina libre se extrajo con diclorometano (10 ml, 2 x). Los extractos se lavaron una vez con una mezcla de NaHCO3 acuoso saturado (5 ml) y NaCl acuoso saturado (5 ml), se secaron (MgSO4), y se concentraron. A una solución del residuo y N,N-dimetil-amino-piridina (aproximadamente 3,5 miligramos) en piridina (0,1 ml), se le agregó cloruro de (R)-(-)-α-metoxi-α-(trifluoro-metil)-fenil-acetilo a temperatura ambiente. Después de agitar durante 1,5 horas, la piridina se evapor�, y el residuo se disolvió en HCl 0,5 N (10 ml) y acetato de etilo (10 ml). Después de la separación de las dos fracciones, la fracción orgánica se lav� con agua (10 ml, 1 x) y NaHCO3 acuoso saturado (10 ml, 1 x), se secó (MgSO4), y se concentr�. En la 31P RMN del residuo en DMSO-d6, la amida deseada aparece en 23,00 ppm, mientras que la amida indeseada viene en 22,79 ppm.

2. Preparación de los intermediarios de ácido fosf�nico P1:

La amina 1 (9,0 g, 41,1 mmol) se disolvió en dioxano (100 ml). Se agregó una solución de Na2CO3 (13,1 g, 123,3 mmol) en H2O (50 ml), a la mezcla de reacción, y se agit� durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de que se agregó cloroformato de bencilo (8,4 g, 49,3 mmol), la solución de la reacción se agit� a temperatura ambiente durante la noche. La fase orgánica se diluyó con EtOAc, y se extrajo con H2O y salmuera. La fase orgánica se secó sobre MgSO4. La concentración del filtrado a partir de la remoción por filtración al vacío del MgSO4 produjo un aceite, a partir del cual se aisl� el 2 mediante cromatograf�a en columna (SiO2, EtOAc al 20 % en hexano) como un aceite transparente (11,6 g, 80 %). 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,33 (s, 5H), 6,05 (dt, J = 9,9, 17,1 Hz, 1H), 5,65 (d, J = 23,7 Hz, 1H), 5,31 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,06 (m, 3H), 4,06 (m, 4H), 2,09 (m, 1H), 1,73 (m, 2H), 1,15 (dt, J = 8,1, 26,4 Hz, 6H) 31P RMN (121,4 MHz, CDCl3) δ 23,7.

El Intermediario 2 (11,6 g, 32,9 mmol) y NaI (24,5 g, 164,3 mmol) se disolvieron en piridina (110 ml). La solución de la reacción se calentó a 115 �C durante 10 horas. Después de enfriarse de regreso a temperatura ambiente, la solución de la reacción se concentr� para remover la piridina. Se agregó H2O (50 ml) al material crudo. La fase

acuosa se lav� con dietil-éter (100 ml, 2 x). Entonces la fase acuosa se ajust� a un pH = 2 mediante la adición de HCl 1 M (acuoso). El Producto 3 (7,5 g, 23,0 mmol) se aisl� mediante extracción con diclorometano y se utilizó para el siguiente paso sin mayor purificación.1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8,63 (a, 1H), 7,33 (s, 5H), 5,95 (dt, J = 9,9, 17,1 Hz, 1H), 5,65 (d, J = 23,7 Hz, 1H), 5,31

5 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,06 (m, 3H), 4,06 (m, 2H), 2,09 (m, 1H), 1,73 (m, 2H), 1,23 (dt, J = 8,1, 26,4 Hz, 3H) 31P NMR (121,4 MHz), CDCl3) δ 24,6 LC/MS = 326 (M++1), 348 (M++Na)

3. Preparación de los intermediarios de ácido fosf�nico p1:

A. Preparación del etil-éster del ácido (1-benciloxi-carbonil-amino-2-vinil-ciclopropil)-metil-fosf�nico:

15 El Intermediario del mono-etil-éster del ácido (1-benciloxi-carbonil-amino-2-vinil-ciclopropil)-fosf�nico (415 mg, 1,28 mmol) se disolvió en tolueno (8 ml). Esta solución se enfri� a 0 �C y se agregó (COCl)2 (222 μl, 2,56 mmol) en una forma por goteo. Entonces se agregó dimetil-formamida (44 μl, 0,56 mmol). La reacción se ejecut� durante 2 horas a 0 �C y se determin� que estaba completa mediante 31P RMN. 31P NMR (121,4 MHz, CDCl3) δ = 39,0, 38,5, 37,4, 36,5, 17,0, 16,2, 16,0, 15,4.

20 La reacción se concentr� hasta obtener un aceite naranja-amarillo, y luego se puso bajo un alto vacío durante 1 hora. El residuo resultante se disolvió en tetrahidrofurano (6,4 ml) y esta solución se enfri� a -78 �C. se agregó por goteo una solución 1,4 M de metil-litio en dietil-éter (1,37 ml, 1,92 milimoles ). Después de 40 minutos, se agregó por goteo más metil-litio (456 μl, 0,64 mmol). Después de 10 minutos, la reacción se apagó a -78 �C mediante la adición

25 de NH4Cl(ac.) saturado. La fase orgánica se diluyó con EtOAc, y se extrajo con NH4Cl(ac.) saturado y salmuera. La fase orgánica se secó sobre MgSO4. La concentración del filtrado a partir de la remoción mediante filtración al vacío del MgSO4 produjo un aceite color naranja, a partir del cual se aisl� el producto mediante cromatograf�a en columna (SiO2, EtOAc al 100 %) como un aceite transparente (214 mg, 52 % en dos pasos). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,33 (s, 5H), 6,09 (dt, J = 9,9, 17,1 Hz, 1H), 5,65 (d, J = 23,7 Hz, 1H), 5,31 (d, J = 17,1

30 Hz, 1H), 5,06 (m, 3H), 4,06 (m, 2H), 2,09 (m, 1H), 1,73 (m, 2H), 1,40 (d, 3H), 1,13 (dt, J = 8,1, 26,4 Hz, 3H) 31P NMR (121,4 MHz, CDCl3) δ 53,7,50,8 LC/MS = 324 (M++1), 346 (M++Na)

B. Preparación del etil-éster del ácido (1-benciloxi-carbonil-amino-2-vinil-ciclopropil)-sec-butil-fosf�nico:

El intermediario de ácido fosf�nico 3 (415 mg, 1,28 mmol) se disolvió en tolueno (8 ml). Esta solución se enfri� a 0 �C y se agregó por goteo (COCl)2 (222 μl, 2,56 mmol). Entonces se agregó dimetil-formamida (44 μl, 0,56 mmol). La reacción se ejecut� durante 2 horas a 0 �C y se determin� que estaba completa mediante 31P RMN.

40 31P NMR (121,4 MHz, CDCl3) δ = 39,0, 38,5, 37,4, 36,5, 17,0, 16,2, 16,0, 15,4.

La reacción se concentr� hasta obtener un aceite color naranja-amarillo, y luego se puso bajo un alto vacío durante 1 hora. El residuo resultante se disolvió en tetrahidrofurano (6,4 ml) y esta solución se enfri� a -78 �C. Se agregó por goteo una solución 1,4 M de sec-butil-litio en ciclohexano (1,37 ml, 1,92 mmol). Después de 40 minutos, se agregó 45 por goteo más sec-butil-litio en ciclohexano (456 μl, 0,64 milimoles ). Después de 10 minutos, la reacción se apagó a -78 �C mediante la adición de NH4Cl(ac.) saturado. La fase orgánica se diluyó con EtOAc, y se extrajo con NH4Cl(ac.) saturado y salmuera. La fase orgánica se secó sobre MgSO4. La concentración del filtrado a partir de la remoción por filtración al vacío del MgSO4 produjo un aceite color naranja, a partir del cual se aisl� el producto mediante cromatograf�a en columna (SiO2, EtOAc al 60 % en hexano), como un aceite transparente (146 mg, 31% en 2

pasos). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,33 (s, 5H), 6,07 (dt, J = 9,9, 17,1 Hz, 1H), 5,55 (d, J = 23,7 Hz, 1H), 5,31 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,06 (m, 3H), 4,06 (m, 2H), 2,09 (m, 1H), 1,65-1,83 (m, 3H), 1,58 (m, 1H) 1,41 (m, 1H), 1,03-1,32 (m, 6H), 0,97 (dt, J = 8,1, 26,4 Hz, 3H) 31P NMR (121,4 MHz, CDCl3) δ 54,9, 54,3, 50,8, 50,0 LC/MS = 366 (M++1), 388 (M++Na)

C. Preparación del etil-éster del ácido (1-benciloxi-carbonil-amino-2-vinil-ciclopropil)-isopropil-fosf�nico:

El intermediario de ácido fosf�nico 3 (415 mg, 1,28 mmol) se disolvió en tolueno (8 ml). Esta solución se enfri� a 0 �C y se agregó por goteo (COCl)2 (222 μl, 2,56 mmol). Entonces se agregó dimetil-formamida (44 μl, 0,56 mmol). La reacción se ejecut� durante 2 horas a 0 �C y se determin� que estaba completa mediante 31P RMN.

15 31P NMR (121,4 MHz, CDCl3) δ 39,0, 38,5, 37,4, 36,5, 17,0, 16,2, 16,0, 15,4.

La reacción se concentr� hasta obtener un aceite color naranja-amarillo, y luego se puso bajo un alto vacío durante 1 hora. El residuo resultante se disolvió en tetrahidrofurano (6,4 ml) y esta solución se enfri� a -78 �C. Se agregó por goteo una solución 0,7 M de isopropil-litio en pentano (2,74 ml, 1,92 mmol). Después de 10 minutos, la reacción se

20 apagó a -78 �C mediante la adición de NH4Cl(ac.) saturado. La fase orgánica se diluyó con EtOAc, y se extrajo con NH4Cl(ac.) saturado y salmuera. La fase orgánica se secó sobre MgSO4. La concentración del filtrado a partir de la remoción mediante filtración al vacío del MgSO4 produjo un aceite color naranja, a partir del cual se aisl� el producto mediante cromatograf�a en columna (SiO2, EtOAc al 100 %) como un aceite transparente (200 mg, 45 % en 2 pasos).

25 1H NMR (300 MHz, CD3CN) δ = 7,38 (s, 5H), 6,69 (m, 1H), 6,12 (m, 1H), 5,35 (m, 1H), 5,06 (m, 4H), 4,06 (m, 2H), 2,09 (m, 1H), 1,55 (m, 1H) 1,41 (m, 1H), 1,02-1,35 (m, 9H) 31P NMR (121,4 MHz, CD3CN) δ 56,0, 53,8 LC/MS = 352 (M++1), 374 (M++Na)

D. Preparación del etil-éster del ácido (1-benciloxi-carbonil-amino-2-vinil-ciclopropil)-vinil-fosf�nico.

El intermediario de ácido fosf�nico 3 (415 mg, 1,28 mmol) se disolvió en tolueno (8 ml). Esta solución se enfri� a 0 �C y se agregó por goteo (COCl)2 (222 μl, 2,56 mmol). Entonces se agregó dimetil-formamida (44 μl, 0,56 mmol). 35 La reacción se ejecut� durante 2 horas a 0 �C y se determin� que estaba completa mediante 31P RMN. 31P NMR (121,4 MHz, CDCl3) δ = 39,0, 38,5, 37,4, 36,5, 17,0, 16,2, 16,0, 15,4.

La reacción se concentr� hasta obtener un aceite color naranja-amarillo, y luego se puso bajo un alto vacío durante 1 hora. El residuo resultante se disolvió en tetrahidrofurano (6,4 ml) y esta solución se enfri� a -78 �C. Se agregó por 40 goteo una solución 1,0 M de bromuro de vinil-magnesio en tetrahidrofurano (2,6 ml, 2,6 mmol). Después de 40 minutos, la reacción se apagó a -78 �C mediante la adición de NH4Cl(ac.) saturado. La fase orgánica se diluyó con EtOAc y se extrajo con NH4Cl(ac.) saturado y salmuera. La fase orgánica se secó sobre MgSO4. La concentración del filtrado a partir de la remoción mediante filtración al vacío del MgSO4 produjo un aceite color naranja, a partir del cual se aisl� el producto mediante cromatograf�a en columna (SiO2, EtOAc al 100 %) como un aceite transparente

45 (214 mg, 40 % en 2 pasos). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,33 (s, 5H), 6,09-6,15 (m, 2H), 5,55 (m, 1H), 5,31 (m, 1H), 5,05 (m, 4H), 4,06 (m, 2H), 2,09 (m, 1H), 1,73 (m, 1H), 1,60 (m, 1H), 1,43 (m, 1H), 1,13 (dt, J =8,1, 26, 4 Hz, 3H) 31P NMR (121,4 MHz, CDCl3) δ 36,5, 34,6 LC/MS = 336 (M++1), 358 (M++Na)

E. Preparación del etil-éster del ácido (1-benciloxi-carbonil-amino-2-vinil-ciclopropil)-etil-fosf�nico:

5 El Intermediario de ácido fosf�nico 3 (208 mg, 0,64 mmol) se disolvió en tolueno (8 ml). Esta solución se enfri� a 0 �C y se agregó por goteo (COCl)2 (111 μl, 1,28 mmol). Entonces se agregó dimetil-formamida (22 μl, 0,28 mmol). La reacción se ejecut� durante 2 horas a 0 �C y se determin� que estaba completa mediante 31P RMN. 31P NMR (121,4 MHz, CDCl3) δ = 39,0, 38,5, 37,4, 36,5, 17,0, 16,2, 16,0, 15,4.

10 La reacción se concentr� hasta obtener un aceite color naranja-amarillo, y luego se puso bajo un alto vacío durante 1 hora. El residuo resultante se disolvió en tetrahidrofurano (6,4 ml) y esta solución se enfri� a -78 �C. Se agregó por goteo una solución 1,7 M de EtLi en dibutil-éter (566 μl, 0,96 mmol). Después de 40 minutos, se agregó por goteo más EtLi (189 μl, 0,32 mmol). Después de 10 minutos, la reacción se apagó a -78 �C mediante la adición de

15 NH4Cl(ac.) saturado. La fase orgánica se diluyó con EtOAc y se extrajo con NH4Cl(ac.) saturado y salmuera. La fase orgánica se secó sobre MgSO4. La concentración del filtrado a partir de la remoción mediante filtración al vacío del MgSO4 produjo un aceite color naranja, a partir del cual se aisl� el producto deseado mediante cromatograf�a en columna (SiO2, EtOAc al 100 %) como un aceite transparente (67 mg, 31 % en 2 pasos). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,33 (s, 5H), 6,09 (dt, J = 9,9, 17,1 Hz, 1H Diastereomter 1), 5,94 (dt, J = 9,9, 17,1 Hz,

20 1H Diastereomer 2), 5,65 (d, J = 23,7 Hz, 1H), 5,31 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,06 (m, 3H), 4,06 (m, 2H), 2,09 (m, 1H), 1,73 (m, 2H), 1:50 (m, 2H), 1,25 (m, 4H), 1,13 (dt, J = 8,1, 26,4 Hz, 3H) 31P NMR (121,4 MHz, CDCl3) δ 54,0, 53,6, 51,3, 50,8 LC/MS = 338 (M++1), 360 (M++Na)

25 F. Preparación del etil-éster del ácido (1-benciloxi-carbonil-amino-2-vinil-ciclopropil)-butil-fosf�nico:

P El Intermediario de ácido fosf�nico 3 (386 mg, 1,19 mmol) se disolvió en tolueno (14,9 ml). Esta solución se enfri�

30 a 0 �C, y se agregó por goteo (COCl)2 (155 μl, 1,78 mmol). Entonces se agregó dimetil-formamida (20 μl, 0,26 mmol). La reacción se ejecut� durante 2 horas a 0 �C y se determin� que estaba completa mediante 31P RMN. 31P RMN (121,4 MHz, CDCl3) δ 39,0, 38,5, 37,4, 36,6, 17,0, 16,2, 16,1, 15,4.

La reacción se concentr� hasta obtener un aceite color naranja-amarillo, y luego se puso bajo un alto vacío durante

35 1 hora. El residuo resultante se disolvió en tetrahidrofurano (11,9 ml) y esta solución se enfri� a -78 �C. Se agregó por goteo una solución 2 M de n-BuLi en pentano (595 μl, 1,19 mmol). Después de 40 minutos, se agregó por goteo más n-BuLi (520 μl, 1,04 mmol). Después de 10 minutos, la reacción se apagó a -78 �C mediante la adición de NH4Cl(ac.) saturado. La fase orgánica se diluyó con EtOAc y se extrajo con NH4Cl(ac.) saturado y salmuera. La fase orgánica se secó sobre MgSO4. La concentración del filtrado a partir de la remoción mediante filtración al vacío del

40 MgSO4 proporcion� un aceite color naranja, a partir del cual se aisl� el producto mediante cromatograf�a en columna (SiO2, 7/3 de EtOAc:hexano) como un aceite transparente (243 mg, 56 % en 2 pasos). �H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,35 (s, 5H), 6,12 (dt, J = 9,9, 16,8 Hz, 1H Diaestere�mero 1), 5,96 (dt, J = 10,2, 16,8 Hz, 1H Diaestere�mero 2), 5,33 (m, 2H), 5,09 (m, 3H), 4,11 (m, 2H), 2,01 (d a, J = 6,6 Hz, 1H), 1,50-1,90 (m, 6H), 1,37 (d a, J = 5,1 Hz, 2H), 1,26 (cuarteto, J = 6,2 Hz, 3H), 0,9 (m, 3H).

45 31P RMN (121,4 MHz, CDCl3) δ 52,8, 52,4, 50,2, 49,7. LC/MS = 366 (M++1), 388 (M++Na).

G. Preparación del etil-éster del ácido (1-benciloxi-carbonil-amino-2-vinil-ciclopropil)-fenil-fosf�nico:

5 El Intermediario de ácido fosf�nico 3 (451 mg, 1,39 mmol) se disolvió en tolueno (17,4 ml). Esta solución se enfri� a 0 �C y se agregó por goteo (COCl)2 (1,21 ml, 13,87 mmol). Entonces se agregó dimetil-formamida (24 μl, 0,306 mmol). The La reacción se ejecut� durante 2 horas a 0 �C, y luego durante 18 horas a temperatura ambiente. Se determin� que la reacción estaba completa mediante 31P RMN. 31P NMR (121,4 MHz, CDCl3) δ 39,3, 38,8, 37,6, 36,8, 17,2, 16,4, 16,3, 15,6.

10 La reacción se concentr� hasta obtener un aceite color naranja-amarillo, y luego se puso bajo un alto vacío durante 1 hora. El residuo resultante se disolvió en tetrahidrofurano (13,9 ml) y esta solución se enfri� a -78 �C. Se agregó por goteo una solución 1,8 M de PhLi en Et2O (1,2 ml, 2,17 mmol). Después de 30 minutos, la reacción se apagó a 78 �C mediante la adición de NH4Cl(ac.) saturado. La fase orgánica se diluyó con EtOAc y se extrajo con NH4Cl(ac.)

15 saturado y salmuera. La fase orgánica se secó sobre MgSO4, la cual subsecuentemente se removió mediante filtración al vacío. La concentración del filtrado produjo un aceite color naranja, a partir del cual se aisl� el producto deseado mediante cromatograf�a en columna (SiO2, 7/3 de EtOAc:hexano) como un aceite transparente (243 mg, 56 % en 2 pasos), en una pureza del 73 % mediante 31P RMN. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ = 7,75 (m, 2H), 7,56 (m, 1H), 7,20-7,44 (m, 7H), 6,18 (m, 1H), 5,39 (d, J = 17,1 Hz, 1H),

20 4,80-5,30 (m, 4H), 4,0-4,3 (m, 2H), 1,91 (m, 1H), 1,69 (m, 1H), 1,2-1,4 (m, 4H) 31P NMR (121,4 MHz, CDCl3) δ 37,8, 37,4, 36,2, 36,0, 35,0, 34,7, 33,4, 33,3 LC/MS = 386 (M++1), 408 (M++Na)

4. Preparación de intermediarios de dip�ptido:

A. Síntesis del intermediario de dip�ptido de fenil-quinolina:

30 Paso 1. La quinolina (7,6 g, 30,1 mmol), el metil-éster de N-t-Boc-cis-4-hidroxi-L-prolina (8,9 g, 36,3 mmol), y trifenilfosfina (17,4 g, 66,3 mmol), se disolvieron en tetrahidrofurano (250 ml). Después de enfriar la solución de la reacción a 0 �C, se agregó DIAD (13,4 g, 66,3 mmol) en 15 minutos. La solución de la reacción se agit� a temperatura ambiente durante 12 horas, y se diluyó con EtOAc (700 ml), y se lav� con NaHCO3(ac.), H2O, y salmuera. La fase orgánica se secó sobre MgSO4. Después de la concentración, el material crudo se cristaliz� para remover la mayor

35 parte del óxido de trifenil-fosfina mediante la utilización de EtOAc (100 ml) y hexano (50 ml), y se aisl� el producto deseado mediante cromatograf�a en columna (SiO2, EtOAc al 70 % en hexano) como un aceite (11,9 g, 85 %). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8,03 (m, 2H), 7,50 (m, 5H), 7,18 (m, 1H), 6,97 (m, 1H), 5,15 (m, 1H), 4,99 (m, 2H), 4,06 (s, 3H), 3,99 (m, 1H), 3,75 (s, 3H), 2,79 (dd, J= 8,7, 14,3 Hz, 1H), 2,45 (ddd, J= 3,3, 10,7, 13,8 Hz, 1H), 1,15 (s, 9H) LC/MS = 479 (M++1), 501 (M++ Na)

Paso 2. El producto de la reacción anterior (9,6 g, 20,8 mmol) se disolvió en diclorometano (20 ml). A la solución de la reacción se le agregó lentamente HCl 4,0 M en dioxano (50 ml), y la solución de la reacción se dej� agitándose a 5 temperatura ambiente durante 5 horas. Después de la concentración bajo un alto vacío durante 30 minutos, el material crudo se disolvió en dimetil-formamida (70 ml). Se agregaron el 3 (6,1 g, 25,0 mmol), HATU (11,9 g, 31,2 mmol), y N-metil-morfolina (10,5 g, 104,0 mmol) a la solución de la reacción. La solución de la reacción se agit� a temperatura ambiente durante la noche, y se diluyó con EtOAc (500 ml), y se lav� con NH4Cl(ac.), NaHCO3(ac.), y salmuera. La fase orgánica se secó sobre MgSO4. Después de la concentración, se aisl� el producto deseado

10 (10,0 g, 80 %) mediante cromatograf�a en columna (SiO2, EtOAc al 90 % en hexano), como un sólido. 1H NMR (300 MHz, CD3OD) δμ 8,33 (d, J= 9,6 Hz, 1H), 8,09 (m, 2H),7,74 (m, 3H), 7,65 (m 1H), 7,52 (m 1H), 7,24 (dd, J = 2,1, 9,6 Hz, 1H), 5,91 (m, 1H), 5,04 (m, 1H), 4,81 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 4,76 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 4,46 (m, 1H), 4,23 (m, 1H), 4,06 (s, 3H), 3,99 (m, 1H), 3,75 (s, 3H), 2,99 (dd, J = 9,0, 14,7 Hz, 1H), 2,53 (ddd, J = 3,3, 10,5, 13,8 Hz, 1H), 1,42-1,78(m, 8H), 1,05 (s, 9H)

15 LC/MS = 604 (M++1), 626(M++ Na)

Paso 3. El metil-éster (9,2 g, 15,3 mmol) se disolvió en tetrahidrofurano (30 ml), MeOH (10 ml), y H2O (10 ml). A la

20 solución de la reacción se le agregó LiOH (1,8 g, 76,5 mmol), y la solución de la reacción se dej� agitándose a temperatura ambiente durante 7 horas. Después de que se agregó EtOAc (150 ml) para diluir la solución de la reacción, la fase acuosa se ajust� a un pH = 2 mediante la adición de HCl(ac.) 1 M. El ácido dipept�dico (8,6 g, 95 %) se aisl� mediante extracción con EtOAc (100 ml, dos veces), y se utilizó para el siguiente paso sin mayor purificación.

25 1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 8,38 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 8,11 (m, 2H),7,76 (m, 3H), 7,65 (m 1H), 7,55 (m 1H), 7,24 (dd, J = 2,1, 9,6 Hz, 1H), 5,89 (m, 1H), 5,04 (m, 1H), 4,81 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 4,76 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 4,46 (m, 1H), 4,23 (m, 1H), 4,06 (s, 3H), 3,99 (m, 1H), 2,99 (dd, J = 9,0, 14,7 Hz, 1H), 2,53 (ddd, J = 3,3, 10,5, 13,8 Hz, 1H), 1,421,78(m, 8H), 1,05 (s, 9H) LC/MS = 590 (M++1), 612 (M++ Na)

B. Síntesis del ácido 1-(2-ciclopentiloxi-carbonil-amino-3,3-dimetil-butiril)-4-[2-(2-isopropil-amino-tiazol-4-il)7-metoxi-quinolin-4-iloxi]-pirrolidin-2-carbox�lico:

Paso 1. A una solución de la hidroxi-tiazol-quinolina (20,0 g, 63,5 mmol) en tetrahidrofurano (400 ml) se le agregó el metil-éster de cis-Boc-hidroxi-prolina (18,7 g, 76,2 mmol), y trifenil-fosfina (36,6 g, 139,7 mmol). La solución se enfri� a 0 �C, y se agregó lentamente DIAD (27 ml, 139,7 mmol). La solución se dej� calentar a temperatura ambiente durante un período de 1 hora, y se agit� durante la noche. El disolvente se removió bajo presión reducida, y la mezcla de reacción cruda se disolvió en acetato de etilo, y se extrajo con agua seguida por salmuera. Los orgánicos se secaron sobre MgSO4, se filtraron, y el disolvente se removió bajo presión reducida. El material crudo se eluy� a través de un tapón de sílice utilizando un gradiente rápido (del 25 % al 100 %) de acetato de etilo/hexano, para proporcionar 32,5 gramos del producto deseado como un sólido amarillo que tenía una contaminación del 10 % al 15 % de óxido de trifenil-fosfina. �H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 7,98, (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,46 (m, 2H), 7,37 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,09 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 5,26 (m, 1H), 4,96 (m, 1H), 4,62 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 5,57 (t, J= 15 Hz, 1H), 3,97-3,84 (s a, 5H), 3,76-3,66 (s a, 5H), 2,77 (m, 1H), 2,42 (m, 1H), 2,03 (s, 1H), 1,43 (s, 9H), 1,33 (d, J = 6,4 Hz, 6H). LC/MS: 543 (M+ + 1).

Paso 2. A una solución del metil-éster (30,0 g, 55 mmol) en cloruro de metileno (150 ml) a 0 �C, se le agregó HCl 4 N en dioxano (150 ml). Se agit� desde frío hasta la temperatura ambiente durante 1 hora. A medida que procedía la reacción, el producto se precipit� de la solución. Los sólidos se filtraron y se lavaron repetidamente con dietil-éter, para proporcionar la sal de HCl de la amina (20,67 g, 78 %) como un sólido amarillo cristalino. �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 8,45 (d, J= 9,2 Hz, 1H), 8,35 (s, 1H), 7,85 (s, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,45 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 6,02 (m, 1H), 4,22 (m, 1H), 4,07 (s, 3H), 4,02 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 3,98 (s, 1H), 3,92 (s, 3H), 3,66 (s, 1H), 3,03 (m, 1H), 2,82 (m, 1H), 1,36 (d, J = 6,4 Hz, 6H), 1,33 (d, J = 6,4 Hz, 6H). LC/MS: 443 (M+ + 1).

A una solución de la sal de HCl-amina (20,96 g, 43,8 mmol) en dimetil-formamida (300 ml) a temperatura ambiente, se le agregaron ciclopentil-carbamato-terleucina-ácido carbox�lico (13,0 g, 52,6 mmol), y HATU (25,0 g, 65,7 mmol). La reacción se agit� durante 10 minutos a temperatura ambiente, y luego se agregó base de Hunig (45 ml, 262 mmol) durante 5 minutos. La reacción se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora, monitoreando mediante LCMS. Se removió el disolvente bajo presión reducida, y se diluyó con acetato de etilo. Se extrajo la mezcla de reacción con NaHCO3 saturado, seguido por agua y salmuera. Los orgánicos se secaron sobre MgSO4, los sólidos se filtraron, y el disolvente se removió bajo presión reducida. El material crudo se eluy� a través de un tapón de sílice para remover el exceso de sales, remover el disolvente, y recristalizar el producto con acetato de etilo y hexano, para proporcionar el metil-éster dipept�dico (23,5 g, 81 %) como un sólido cristalino amarillo. �H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 7,98 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 7,67 (s, 1H), 7,51 (s, 1H), 7,27 (s, 1H), 7,16 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 5,62 (m, 1H), 5,54 (m, 1H), 5,27 (d, J = 9,7 Hz, 1H), 4,81-4,71 (s a, 2H), 4,49 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 4,28 (d, J = 10 Hz, 1H), 4,14 (m, 1H), 4,04 (s, 3H), 3,78 (s, 3H), 3,60 (m, 1H), 2,76 (m, 2H), 2,51 (m, 2H) 1,63-1,50 (m, 10H) 1,26 (d, J = 6,4 Hz, 6H), 1,07 (s, 9H). LC/MS: 668 (M+ + 1).

Paso 3. A una solución del metil-éster (21,0 g, 31,5 mmol) en tetrahidrofurano (300 ml) y metanol (15 ml), se le agregó polvo de hidróxido de litio (4,5 g, 187 mmol) en agua (150 ml). La reacción se agit� a temperatura ambiente durante la noche. Los solventes orgánicos se removieron bajo presión reducida, y se ajust� el pH a 2-3 con HCl al 10 % en agua. La solución se extrajo con acetato de etilo, 250 ml, dos veces. Los orgánicos se combinaron y se secaron sobre MgSO4, se filtraron, y el disolvente se removió bajo presión reducida, para proporcionar el ácido carbox�lico dipept�dico (19,3 g, 94 %) como un sólido amarillo. �H RMN (300 MHz, CD3OD: δ 8,29 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 8,17 (s, 1H), 7,72 (s, 2H), 7,33 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 5,77 (s, 1H), 4,80 (t, J = 9,1 Hz, 1H), 4,77 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,44 (m, 1H), 4,19-4,04 (s a, 6H), 2,96 (m, 1H), 2,50 (m, 1H), 1,62-1,50 (s a, 8H), 1,35 (d, J = 6,7 Hz, 6H), 1,05 (s, 9H). LC/MS: 655 (M+ + 1).

10 Paso 1. Una solución del etil-éster del ácido (1-benciloxi-carbonil-amino-2-vinil-ciclopropil)-metil-fosf�nico (100 mg, 0,308 mmol) en ACN (7,7 ml) se enfri� a 0 �C, y se agregó por goteo TMSI (200 μl, 1,54 mmol). La reacción se calentó a temperatura ambiente, y se agit� durante 1 hora. Luego la reacción se enfri� a 0 �C, y se agregó por goteo TMSI adicional (110 μl, 0,77 mmol). La reacción se calentó a temperatura ambiente, y se agit� durante 30 minutos. La reacción se enfri� de regreso a 0 �C, y se agregó por goteo 2,6-lutidina (360 μl, 3,1 mmol). ésta fue seguida por

15 la adición de Et3N (1 ml, 7,2 mmol) y MeOH (4 ml). Entonces la reacción se concentr� al vacío, y el intermediario crudo se utilizó directamente en la siguiente reacción.

Paso 2. Una solución del dip�ptido (81 mg, 0,123 mmol) en tetrahidrofurano (2 ml) se enfri� a -30 �C. A esta solución se le agregó Et3N (34 μl, 0,246 mmol), seguido por ClCO2Et (18 μl, 0,185 mmol). La reacción se agit� a una 20 temperatura de entre 20 �C y -30 �C durante 30 minutos. Se agregaron a la reacción Et3N adicional (34 μl, 0,246 mmol) y ClCO2Et (18 μl, 0,185 mmol). La reacción se agit� durante 30 minutos adicionales a una temperatura de entre -20 �C y -30 �C. Se agregó por goteo una solución del producto crudo del paso 1 en CH2Cl2 (2 ml) a -30 �C, y la reacción se calentó a temperatura ambiente y se agit� durante 2 horas. La reacción se apagó mediante la adición de NH4Cl(ac.) saturado. La fase orgánica se diluyó con EtOAc, y se extrajo con NH4Cl(ac.) saturado, H2O, y

25 salmuera. La fase orgánica se secó entonces sobre Na2SO4, el cual subsecuentemente se removió mediante filtración al vacío. El filtrado se concentr� al vacío, y el residuo se disolvió en MeOH (1,5 ml). El compuesto 1 se aisl� a partir de esta solución mediante HPLC en fase inversa como un sólido amarillo (37 mg, 37 %).1H NMR (300 MHz, CD3CN) δ = 8,50 (m, 1H), 8,11 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,75 (s,1H), 7,38 (s,1H), 7,21 (dd, J = 2,1, 9,3 Hz, 1H), 7,00 (m, 1H), 6,03 (m, 1H), 5,97 (dt, J = 6,9, 17,1 Hz, 1H), 5,67 (s, 1H), 5,14 (d, J = 17,1 Hz,

30 1H), 5,01 (d, J = 11,4 Hz, 1H), 4,63 (m, 2H), 4,44 (s, 1H), 4,17 (m, 2H), 4,08 (s, 1H), 4,04 (s, 3H), 2,74 (dd, J = 7,2,14,1 Hz, 1H), 2,43 (ddd, J = 3,3, 10,5, 13,8 Hz, 1H), 2,08 (m, 1H), 1,24-1,75 (m, 19H), 1,15 (m, 1H), 1,04 (s, 9H) 31P NMR (121,4 MHz, CD3CN) δ 46,6 LC/MS = 797 (M++1), 819 (M++Na)

35 Ejemplo 2: Preparación del compuesto 2.

Paso 1. Una solución del etil-éster del ácido (1-benciloxi-carbonil-amino-2-vinil-ciclopropil)-sec-butil-fosf�nico

40 (112 mg, 0,308 mmol) en ACN (7,7 ml) se enfri� a 0 �C, y se agregó por goteo TMSI (220 μl, 1,54 mmol). La reacción se calentó a temperatura ambiente, y se agit� durante 1 hora. Luego la reacción se enfri� a 0 �C, y se agregó por goteo TMSI adicional (110 μl, 0,77 mmol). La reacción se calentó a temperatura ambiente, y se agit� durante 30 minutos. La reacción se enfri� de regreso a 0 �C, y se agregó por goteo 2,6-lutidina (360 μl, 3,1 mmol). ésta fue seguida por la adición de Et3N (1 ml, 7,2 mmol) y MeOH (4 ml). Entonces la reacción se concentr� al vacío, y el

producto crudo se utilizó directamente en la siguiente reacción. Paso 2. Una solución del dip�ptido (81 mg, 0,123 mmol) en tetrahidrofurano (2 ml) se enfri� a -30 �C. A esta solución se le agregó Et3N (34 μl, 0,246 mmol), seguido por ClCO2Et (18 μl, 0,185 mmol). La reacción se agit� a una temperatura de entre -20 �C y -30 �C durante 30 minutos. Se agregaron a la reacción Et3N adicional (34 μl, 0,246 mmol) y ClCO2Et (18 μl, 0,185 mmol). La reacción se agit� durante 30 minutos adicionales a una temperatura de -20 �C y -30 �C. Se agregó por goteo una solución del producto crudo del paso 1 en CH2Cl2 (2 ml) a -30 �C, y la reacción se calentó a temperatura ambiente, y se agit� durante 2 horas. La reacción se apagó mediante la adición de NH4Cl(ac.) saturado. La fase orgánica se diluyó con EtOAc, y se extrajo con NH4Cl(ac.) saturado, H2O, y salmuera. Luego se secó la fase orgánica sobre Na2SO4, que subsecuentemente se removió mediante filtración al vacío. El filtrado se concentr� al vacío, y el residuo se disolvió en MeOH (1,5 ml). El compuesto 2 se aisl� a partir de esta solución mediante HPLC en fase inversa como un sólido amarillo (42 mg, 41 %).1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 8,27 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 8,18 (s, 1H), 7,75 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,39 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 7,31 (dd, J = 2,1, 9,3 Hz, 1H), 6,01 (dt, J = 6,9, 17,1 Hz, 1H), 5,77 (s, 1H), 5,26 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,08 (d, J = 11,4 Hz, 1H), 4,63 (m, 2H), 4,44 (s, 1H), 4,17 (m, 2H), 4,08 (s, 1H), 4,04 (s, 3H), 2,76 (dd, J = 7,2, 14,1 Hz, 1H), 2,43 (ddd, J = 3,3, 10,5, 13,8 Hz, 1H), 2,08 (m, 1H), 1,96 (m, 2H), 1,60-1,82 (m, 9H), 1,34 (d, J = 6,3 Hz, 6H), 1,22 (m, 6H), 1,04 (s, 9H), 0,99 (m, 3H)31P NMR (121,4 MHz, CD3OD) δ 52,4,52,2 LC/MS = 839 (M++1), 861 (M++Na)

Ejemplo 3: Preparación del compuesto 3.

Paso 1. Una solución del etil-éster del ácido (1-benciloxi-carbonil-amino-2-vinil-ciclopropil)-isopropil-fosf�nico (108 mg, 0,308 mmol) en ACN (7,7 ml) se enfri� a 0 �C, y se agregó por goteo TMSI (220 μl, 1,54 mmol). La reacción se calentó a temperatura ambiente, y se agit� durante 1 hora. Luego la reacción se enfri� a 0 �C, y se agregó por goteo TMSI adicional (110 μl, 0,77 mmol). La reacción se calentó a temperatura ambiente, y se agit� durante 30 minutos. La reacción se enfri� de regreso a 0 �C, y se agregó por goteo 2,6-lutidina (360 μl, 3,1 mmol). ésta fue seguida por la adición de Et3N (1 ml, 7,2 mmol) y MeOH (4 ml). Entonces la reacción se concentr� al vacío, y el producto crudo se utilizó directamente en la siguiente reacción. Paso 2. Una solución del 6 (81 mg, 0,123 mmol) en tetrahidrofurano (2 ml) se enfri� a -30 �C. A esta solución se le agregó Et3N (34 μl, 0,246 mmol), seguido por ClCO2Et (18 μl, 0,185 mmol). La reacción se agit� a una temperatura de entre -20 �C y -30 �C durante 30 minutos. A la reacción se le agregaron Et3N adicional (34 μl, 0,246 mmol) y ClCO2Et (18 μl, 0,185 mmol). La reacción se agito durante 30 minutos adicionales a una temperatura de entre -20 �C y -30 �C. Se agregó por goteo una solución del producto crudo del paso 1 en CH2Cl2 (2 ml) a -30 �C, y la reacción se calentó a temperatura ambiente y se agit� durante 2 horas. La reacción se apagó mediante la adición de NH4Cl(ac.) saturado. La fase orgánica se diluyó con EtOAc, y se extrajo con NH4Cl(ac.) saturado, H2O, y salmuera. Entonces la fase orgánica se secó sobre Na2SO4, que subsecuentemente se removió mediante filtración al vacío. El filtrado se concentr� al vacío, y el residuo se disolvió en MeOH (1,5 ml). El compuesto 3 se aisl� a partir de esta solución mediante HPLC en fase inversa como un sólido amarillo (40 mg, 40 %).1H NMR (300 MHz, CD3CN) δ 8,27 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 8,11 (m, 1H), 8,05 (s, 1H), 7,75 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,53 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 7,31 (dd, J = 2,1, 9,3 Hz, 1H), 6,75 (m, 1H), 6,06 (dt, J = 6,9, 17,1 Hz, 1H), 5,77 (m, 2H), 5,26 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,08 (d, J = 11,4 Hz, 1H), 4,63 (m, 2H), 4,17 (m, 2H), 4,08 (s, 1H), 4,04 (s, 3H), 2,74 (dd, J = 7,2, 14,1 Hz, 1H), 2,53 (ddd, J = 3,3, 10,5, 13,8 Hz, 1H), 2,21(m, 1H), 2,08 (m, 1H), 1,42-1,78 (m, 8H), 1,34 (d, J = 6,3 Hz, 6H), 1,34 (m, 2H) 1,15 (m, 5H), 1,04 (s, 9H), 0,99-1,03 (m, 3H)31P NMR (121,4 MHz, CD3CN) δ 50,6 LC/MS = 825 (M++1), 847 (M++Na)

Ejemplo 4: Preparación del compuesto 4.

Paso 1. Una solución del etil-éster del ácido (1-benciloxi-carbonil-amino-2-vinil-ciclopropil)-vinil-fosf�nico (103 mg, 0,308 mmol) en ACN (07,7 ml) se enfri� a 0 �C, y se agregó por goteo TMSI (220 μl, 1,54 mmol). La reacción se calentó a temperatura ambiente, y se agit� durante 1 hora. Entonces la reacción se enfri� a 0 �C, y se agregó por goteo TMSI adicional (110 μl, 0,77 mmol). La reacción se calentó a temperatura ambiente, y se agit� durante 30 minutos. La reacción se enfri� de regreso a 0 �C, y se agregó por goteo 2,6-lutidina (360 μl, 3,1 mmol). ésta fue seguida por adición de Et3N (1 ml, 7,2 mmol) y MeOH (4 ml). Entonces la reacción se concentr� al vacío, y el producto crudo se utilizó directamente en la siguiente reacción. Paso 2. Una solución del dip�ptido (81 mg, 0,123 mmol) en tetrahidrofurano (2 ml) se enfri� a -30 �C. A esta solución se le agregó Et3N (34 μl, 0,246 mmol), seguido por ClCO2Et (18 μl, 0,185 mmol). La reacción se agit� a una temperatura de entre -20 �C y -30 �C durante 30 minutos. Se agregaron a la reacción Et3N adicional (34 μl, 0,246 mmol) y ClCO2Et (18 μl, 0,185 mmol). La reacción se agit� durante 30 minutos adicionales a una temperatura de entre -20 �C y -30 �C. Se agregó por goteo una solución del producto crudo del paso 1 en CH2Cl2 (2 ml), a -30 �C, y la reacción se calentó a temperatura ambiente, y se agit� durante 2 horas. La reacción se apagó mediante la adición de NH4Cl(ac.) saturado. La fase orgánica se diluyó con Et2O, y se extrajo con NH4Cl(ac.) saturado, H2O, y salmuera. La fase orgánica se secó entonces sobre Na2SO4, que subsecuentemente se removió mediante filtración al vacío. El filtrado se concentr� al vacío, y el residuo se disolvió en MeOH (1,5 ml). El compuesto 4 se aisl� a partir de esta solución mediante HPLC en fase inversa como un sólido amarillo (45 mg, 45 %).1H NMR (300 MHz, CD3CN) δ 8,25 (a, 1H), 8,20 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,39 (s, 1H), 7,23 (dd, J = 2,1, 9,3 Hz, 1H), 6,84 (a, 1H), 6,35 (m, 2H), 5,97 (m, 3H), 5,77 (m, 1H), 5,61 (s, 1H), 5,26 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,08 (d, J = 11,4 Hz, 1H), 4,63 (m, 2H), 4,44 (s, 1H), 4,17 (m, 2H), 4,08 (s, 1H), 4,04 (s, 3H), 2,74 (dd, J = 7,2, 14,1 Hz, 1H), 2,43 (ddd, J = 3,3, 10,5, 13,8 Hz, 1H), 1,41-1,78(m, 8H), 1,34 (d, J = 6,3 Hz, 6H), 1,34 (m, 2H), 1,15 (m, 1H), 1,04 (s, 9H)31P NMR (121,4 MHz, CD3CN) δ 30,2 LC/MS = 809 (M++1), 831 (M++Na)

Ejemplo 5: Preparación del compuesto 5.

Paso 1. Una solución del etil-éster del ácido (1-benciloxi-carbonil-amino-2-vinil-ciclopropil)-metil-fosf�nico (100 mg, 0,308 mmol) en ACN (7,7 ml) se enfri� a 0 �C, y se agregó por goteo TMSI (220 μl, 1,54 mmol). La reacción se calentó a temperatura ambiente, y se agit� durante 1 hora. Entonces la reacción se enfri� a 0 �C, y se agregó por goteo TMSI adicional (110 μl, 0,77 mmol). La reacción se calentó a temperatura ambiente, y se agit� durante 30 minutos. La reacción se enfri� de regreso a 0 �C, y se agregó por goteo 2,6-lutidina (360 μl, 3,1 mmol). ésta fue seguida por la adición de Et3N (1 ml, 7,2 mmol) y MeOH (4 ml). Luego la reacción se concentr� al vacío, y el producto crudo se utilizó directamente en la siguiente reacción. Paso 2. Una solución del 15 (72 mg, 0,123 mmol) en tetrahidrofurano (2 ml) se enfri� a -30 �C. A esta solución se le agregó Et3N (34 μl, 0,246 mmol), seguido por ClCO2Et (18 μl, 0,185 mmol). La reacción se agit� a una temperatura de entre -20 �C y -30 �C durante 30 minutos. A la reacción se le agregaron Et3N adicional (34 μl, 0,246 mmol) y ClCO2Et (18 μl, 0,185 mmol). La reacción se agit� durante 30 minutos adicionales a una temperatura de entre -20 �C y -30 �C. Se agregó por goteo una solución del producto crudo del paso 1 en CH2Cl2 (2 ml) a -30 �C, y la reacción se calentó a temperatura ambiente, y se agit� durante 2 horas. La reacción se apagó mediante la adición de NH4Cl(ac.)

saturado. La fase orgánica se diluyó con EtOAc, y se extrajo con NH4Cl(ac.) saturado, H2O, y salmuera. Entonces la fase orgánica se secó sobre Na2SO4, que subsecuentemente se removió mediante filtración al vacío. El filtrado se concentr� al vacío, y el residuo se disolvió en MeOH (1,5 ml). El compuesto 5 se aisl� a partir de esta solución mediante HPLC en fase inversa como un sólido amarillo (35 mg, 38 %).1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 8,25 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 8,16 (m, 2H),7,68 (m, 3H), 7,49 (m 1H), 7,39 (m 1H), 7,24 (dd, J = 2,1, 9,3 Hz, 1H), 6,45 (m, 1H), 5,97 (m, 2H), 5,69 (s, 1H), 5,26 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,08 (d, J = 11,4 Hz, 1H), 4,63 (m, 2H), 4,24 (m, 1H), 4,08 (m, 1H), 4,04 (s, 3H), 2,76 (dd, J = 7,2, 14,1 Hz, 1H), 2,43 (ddd, J = 3,3, 10,5, 13,8 Hz, 1H), 1,42-1,78(m, 8H), 1,34 (d, J = 6,3 Hz, 3H), 1,34 (m, 1H), 1,15 (m, 1H), 1,04 (s, 9H)31P NMR (121,4 MHz, CD3OD) δ 41,2 LC/MS = 733 (M++1), 755 (M++Na)

Ejemplo 6: Preparación del Compuesto 6.

Paso 1. Una solución del etil-éster del ácido (1-benciloxi-carbonil-amino-2-vinil-ciclopropil)-etil-fosf�nico (104 mg, 0,308 mmol) en ACN (7,7 ml) se enfri� a 0 �C, y se agregó por goteo TMSI (220 μl, 1. 54 mmol). La reacción se calentó a temperatura ambiente, y se agit� durante 1 hora. Entonces la reacción se enfri� a 0 �C, y se agregó por goteo TMSI adicional (110 μl, 0,77 mmol). La reacción se calentó a temperatura ambiente, y se agit� durante 30 minutos. La reacción se enfri� de regreso a 0 �C, y se agregó por goteo 2,6-lutidina (360 μl, 3,1 mmol). ésta fue seguida por adición de Et3N (1 ml, 7,2 mmol) y MeOH (4 ml). Entonces la reacción se concentr� al vacío, y el material crudo se utilizó directamente en la siguiente reacción.

Paso 2. Una solución del dip�ptido (81 mg, 0,123 mmol) en tetrahidrofurano (2 ml) se enfri� a -30 �C. A esta solución se le agregó Et3N (34 μl, 0,246 mmol), seguido por ClCO2Et (18 μl, 0,185 mmol). La reacción se agit� a una temperatura de entre -20 �C y -30 �C durante 30 minutos. Se agregaron a la reacción Et3N adicional (34 μl, 0,246 mmol) y ClCO2Et (18 μl, 0,185 mmol). La reacción se agit� durante 30 minutos adicionales a una temperatura de entre -20 �C y -30 �C. Se agregó por goteo una solución del producto crudo del paso 1 en CH2Cl2 (2 ml), a -30 �C, y la reacción se calentó a temperatura ambiente. La reacción se apagó mediante la adición de NH4Cl(ac.) saturado. La fase orgánica se diluyó con EtOAc, y se extrajo con NH4Cl(ac.) saturado, H2O, y salmuera. La fase orgánica se secó entonces sobre Na2SO4, que subsecuentemente se removió mediante filtración al vacío. El filtrado se concentr� al vacío, y el residuo se disolvió en MeOH (1,5 ml). El compuesto 6 se aisl� a partir de esta solución mediante HPLC de fase inversa como un sólido amarillo (37 mg, 37 %).

1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8,27 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 8,18 (s, 1H), 7,75 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,73 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 7,31 (dd, J = 2,1, 9,3 Hz, 1H), 5,97 (dt, J = 6,9, 17,1 Hz, 1H), 5,77 (s, 1H), 5,26 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,08 (d, J = 11,4 Hz, 1H), 4,63 (m, 2H), 4,44 (s, 1H), 4,17 (m, 2H), 4,08 (s, 1H), 4,04 (s, 3H), 2,74 (dd, J = 7,2, 14,1 Hz, 1H), 2,43 (ddd, J = 3,3, 10,5, 13,8 Hz, 1H), 2,08 (m, 1H), 1,84 (m, 2H), 1,54 (m, 8H), 1,34 (d, J = 6,3 Hz, 6H), 1,34 (m, 2H), 1,15 (dt, J = 7,8, 18,3 Hz, 3H), 1,04 (s, 9H) 31P NMR (121,4 MHz, CDCl3) δ 50,6 LC/MS = 811 (M++1), 834 (M++Na)

Ejemplo 7: Preparación del compuesto 7.

Paso 1. Una solución del etil-éster del ácido (1-benciloxi-carbonil-amino-2-vinil-ciclopropil)-butil-fosf�nico (364 mg, 0,996 mmol) en ACN (25 ml) se enfri� a 0 �C, y se agregó por goteo TMSI (220 μl, 1,54 mmol). La reacción se calentó a temperatura ambiente, y se agit� durante 1 hora. Entonces la reacción se enfri� a 0 �C, y se agregó por goteo TMSI adicional (711 μl, 4,98 mmol). La reacción se calentó a temperatura ambiente, y se agit� durante 1 hora. La reacción se enfri� de regreso a 0 �C, y se agregó por goteo 2,6-lutidina (1 ml, 10,1 mmol). ésta fue seguida por la adición de Et3N (1 ml, 7,2 mmol) y MeOH (4 ml). La reacción se calentó a temperatura ambiente, y luego se concentr� al vacío. Las mezclas crudas se utilizaron directamente en la siguiente reacción.

Paso 2. Una solución del dip�ptido de partida (100 mg, 0,153 mmol) en tetrahidrofurano (2 ml) se enfri� a -30 �C. A esta solución se le agregó Et3N (32 μl, 0,230 mmol), seguido por ClCO2Et (22 μl, 0,23 mmol). La reacción se agit� a una temperatura de entre -20 �C y -30 �C durante 30 minutos. Se agregaron a la reacción Et3N adicional (32 μl, 0,23 mmol) y ClCO2Et (22 μl, 0,23 mmol). La reacción se agit� durante 30 minutos adicionales a una temperatura de entre -20 �C y -30 �C. Se agregó por goteo una solución del producto crudo del paso 1 en CH2Cl2 (2 ml) a -30 �C, y la reacción se calentó a temperatura ambiente. La reacción se apagó mediante la adición de NH4Cl(ac.) saturado. La fase orgánica se diluyó con EtOAc, y se extrajo con NH4Cl(ac.) saturado, H2O, y salmuera. Entonces la fase orgánica se secó sobre Na2SO4, que subsecuentemente se removió mediante filtración al vacío. El filtrado se concentr� al vacío, y el residuo se disolvió en MeOH (1,5 ml). Se aisl� una mezcla de los productos del acoplamiento mediante HPLC de fase inversa. Esta reacción se acoplamiento se repitió una vez más a la misma escala, y las mezclas aisladas de los productos de ambas reacciones se combinaron.

La mezcla de productos del acoplamiento se disolvió en ACN (5,4 ml), y luego se agregó 2,6-lutidina (149 μl, 1,29 mmol). Esta solución se enfri� a 0 �C, y se agregó por goteo TMSI (184 μl, 1,29 mmol). La reacción se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora, y luego se enfri� a 0 �C. Se agregaron 2,6-lutidina adicional (125 μl, 0,645 mmol) y TMSI (92 μl, 0,645 mmol), y la reacción se calentó a temperatura ambiente. Entonces la reacción se enfri� a 0 �C, y se agregó por goteo Et3N (1,5 ml, 20,4 mmol), seguido por MeOH (5 ml). La reacción se evapor� al vacío, y luego se disolvió en MeOH (1,5 ml). El compuesto 7 se aisl� a partir de esta solución mediante HPLC de fase inversa como un sólido amarillo (86 mg, 33 % en dos pasos).

1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8,26 (d, J = 9 Hz, 1H), 8,15 (s, 1H), 7,70 (d, J = 2,1 Hz, 2H), 7,24 (dd, J = 2,1, 9 Hz, 1H), 5,93 (dt, J = 9,6, 19,5 Hz, 1H), 5,71 (s, 1H), 5,11 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 4,95 (d, J = 12,3 Hz, 1H), 4,70 (d, J = 12,3 Hz, 1H), 4,62 (dd, J = 7,2, 9,3 Hz, 1H), 4,51 (s, 1H), 4,21 (s, 1H), 4,14 (q, J = 6,6 Hz, 1H), 4,07 (dd, J = 2,4, 9,9 Hz, 1H), 4,02 (s, 3H), 2,82 (dd, J = 7,5, 14,4 Hz, 1H), 2,45 (ddd, J = 3,9, 10,2, 14,1 Hz, 1H), 1,98 (m, 1H), 1,40-1,80 (m, 13H), 1,34 (d, J = 6,3 Hz, 6H), 1,14-1,32 (m, 3H), 1,01 (s, 9H), 0,86 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 31P NMR (121,4 MHz, CDCl3) δ 43,1 LC/MS = 839 (M++1), 861 (M++Na)

Ejemplo 8: Preparación del Compuesto 8.

Paso 1. Una solución del etil-éster del ácido (1-benciloxi-carbonil-amino-2-vinil-ciclopropil)-fenil-fosf�nico (150 mg, 0,389 mmol) en ACN (10 ml) se enfri� a 0 �C, y se agregó por goteo PMSI (278 μl, 1,95 mmol). La reacción se calentó a temperatura ambiente, y se agit� durante 1 hora. La reacción se enfri� de regreso a 0 �C, y se agregaron por goteo Et3N (1,5 ml, 20,4 mmol) y MeOH (5 ml). Entonces la reacción se concentr� al vacío, y el producto crudo se utilizó directamente en la siguiente reacción.

Paso 2. Una solución del dip�ptido (50 mg, 0,076 mmol) en tetrahidrofurano (2 ml) se enfri� a -30 �C. A esta solución se le agregó Et3N (16 μl, 0,114 mmol), seguido por ClCO2Et (15 μl, 0,114 mmol). La reacción se agit� a una temperatura de entre -20 �C y -30 �C durante 30 minutos. Se agregaron a la reacción Et3N adicional (16 μl, 0,114 mmol) y ClCO2Et (15 μl, 0,114 mmol). La reacción se agit� durante 30 minutos adicionales a una temperatura de entre -20 �C y -30 �C. Se agregó por goteo una solución del producto crudo del paso 1 en CH2Cl2 (2 ml) a -30 �C, y la reacción se calentó a temperatura ambiente. La reacción se apagó mediante la adición de NH4Cl(ac.) saturado. La fase orgánica se diluyó con EtOAc, y se extrajo con NH4Cl(ac.) saturado, dH2O, y salmuera. La fase orgánica se secó entonces sobre Na2SO4, que subsecuentemente se removió mediante filtración al vacío. El filtrado se concentr� al vacío, y el residuo se disolvió en MeOH (1,5 ml). El compuesto 8 se aisl� a partir de esta solución mediante HPLC de fase inversa como un sólido amarillo (17 mg, 25 %).

1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8,22 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 8,18 (s, 1H), 7,89 (dd, J = 6,9, 11,7 Hz, 2H), 7,74 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,72 (s, 1H), 7,53 (m, 3H), 7,30 (dd, J = 2,1, 9 Hz, 1H), 6,14 (dt, J = 10,2, 19,5 Hz, 1H), 5,71 (s, 1H),), 5,22 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,02 (d, J = 10,2 Hz, 1H), 4,55 (m, 2H), 4,40 (s, 1H), 4,18 (quint., J = 6,6 Hz, 1H), 4,11 (s, 1H), 4,04 (m, 4H), 5,60 (dd, J = 6,9, 14,1 Hz, 1H), 2,23 (ddd, J = 3,6, 10,2, 13,8 Hz, 1H), 2,12 (m, 1H), 1,72 (m, 1H), 1,401,66 (m, 9H), 1,34 (d, J = 6,3 Hz, 6H), 1,03 (s, 9H) 31P NMR (121,4 MHz, CDCl3) δ 34,0 LC/MS = 859 (M++1), 881 (M++Na)

Ejemplo 9: Preparación del Compuesto 9.

Paso 1. Un matraz de fondo redondo de 100 ml se cargó con LDA (8,5 ml de una solución 1,8 M, 15,3 mmol) en tetrahidrofurano (35 ml) bajo argón. El matraz se enfri� a -78 �C, y se agregó el imino-fosfonato (1,96 g, 7,67 mmol). La mezcla se agit� durante 10 minutos, y luego se agregó 1,2-dibromo-etano (3,95 ml, 46 mmol). La reacción se agit� a -78 �C durante 6 horas, luego se calentó a temperatura ambiente, y se agit� durante 12 horas. Entonces la mezcla se concentr� y se apagó con una solución saturada de cloruro de amonio. La mezcla se extrajo con éter, se lav� con agua, y luego se concentr� para proporcionar 1,86 gramos del producto de la alquilaci�n, el cual contenía aproximadamente el 50 % de impurezas del imino-fosfonato sin reaccionar. Luego se absorbió la imina en diclorometano (25 ml) y HCl 1 M (25 ml). La mezcla se agit� a temperatura ambiente durante 3 horas. Entonces se separaron las capas, y la capa orgánica se lav� con agua. Las capas acuosas se combinaron y se concentraron para remover el agua y proporcionar la sal de HCl deseada (1,27 g que contiene aproximadamente el 50 % de impurezas del amino-fosfonato insustituido).

Paso 2. En un matraz de fondo redondo de 50 ml, se colocó el ácido carbox�lico del dip�ptido (1,13 g, 1,96 mmol), el amino-fosfonato del paso 1 (0,436 g, 1,90 mmol), y HATU (1,04 g, 2,74 mmol) en dicloro-metano (20 ml). La reacción se agit� a temperatura ambiente, y se agregó NMM (0,65 ml, 5,88 mmol). La mezcla se agit� durante 12 horas, y luego se agregó agua. Las capas se separaron, y la capa orgánica se lav� con una solución saturada de bicarbonato de sodio, y luego se secó y se concentr�. La mezcla cruda se purificó mediante cromatograf�a en columna por evaporación instantánea (EtOAc/hexano), para proporcionar el producto deseado, el cual también contenía una impureza del producto de amino-fosfonato insustituido. Esta impureza se removió llevando a cabo la cromatograf�a por evaporación instantánea, utilizando el 24 % de CH2Cl2/38 % de EtOAc (38 % de acetona como eluyente, para proporcionar el producto deseado en un rendimiento del 30 %.

Paso 3. El fosfonato de dietilo del paso 2 (27 mg, 0,036 mmol) se destil� azeotr�picamente con tolueno tres veces, y luego se absorbió en acetonitrilo (2 ml). Entonces se agregó TMSI (0,02 ml, 0,144 mmol), y la reacción se agit� a

temperatura ambiente durante 1 hora. Luego se agregaron otros 0,02 ml de TMSI, y la reacción se agit� durante 1 hora adicional. Luego la mezcla se concentr� y se destil� azeotr�picamente tres veces con tolueno. La mezcla de reacción cruda se absorbió entonces en dicloro-metano (1 mililitro) y anh�drido de Boc (40 mg, 0,180 mmol), y se agregó trietil-amina (0,035 ml, 0,252 mmol). La mezcla se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora, y luego se

5 concentr�. La reacción se purificó mediante HPLC, para proporcionar el compuesto 9 deseado (8 mg, 31 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 1,05 (s, 9H), 1,19 (s, 9H), 1,28 (m, 3H), 2,5 (m, 1H), 2,8 (m, 1H), 4,07 (s, 3H), 4,12 (m, 2H), 4,7 (m, 2H), 5,82 (s, 1H), 7,38 (m, 1H), 7,5 (m, 1H), 7,65 (s, 1H), 7,75 (m, 3H), 8,08 (m, 2H), 8,38 (d, 1H).

Paso 1. En un matraz de fondo redondo de dos cuellos, de 1 litro, se colocaron imino-fosfonato (10 g, 39,2 mmol),

1,4-dibromo-buteno (20 g, 96 mmol), y cloruro de bencil-trietil-amonio (892 mg, 3,92 mmol) en dicloro-metano 15 (400 ml). La reacción se agit� a temperatura ambiente durante 2 días hasta completarse, como fue observado

mediante TLC. Luego la reacción se filtr�, se concentr�, y se purificó mediante cromatograf�a por evaporación

instant�nea, para proporcionar el producto de alquilaci�n deseado (5,4 g, 17,6 mmol). Este producto de la alquilaci�n

(1,50 g, 4,88 mmol) se absorbió entonces en dicloro-metano (30 ml), y se agregó HCl 1 M (30 ml). La reacción se

agit� a temperatura ambiente durante 3 horas. Luego se agregó éter (60 ml), y se separaron las capas. La capa 20 orgánica se extrajo con agua, y los extractos acuosos se combinaron y se concentraron para proporcionar la sal de

amino-fosfonato deseada (1,07 g, 4,46 mmol).

25 Paso 2. En un matraz de fondo redondo de 50 ml, se colocaron ácido carbox�lico del dip�ptido (1,2 g, 2,08 mmol), amino-fosfonato (0,455 g, 2,08 mmol), y HATU (1,011 g, 2,91 mmol) en dicloro-metano (30 ml). La reacción se agit� a temperatura ambiente, y se agregó NMM (1,2 ml, 10,4 mmol). La mezcla se agit� durante 12 horas, y luego se agregó agua. Las capas se separaron, y la capa orgánica se lav� con una solución saturada de bicarbonato de sodio, y luego se secó y se concentr�. La mezcla cruda se purificó mediante cromatograf�a en columna por

30 evaporación instantánea (EtOAc/hexano) para proporcionar el producto deseado.

Paso 3. El fosfonato de dietilo (41 mg, 0,052 mmol) se destil� azeotr�picamente con tolueno, y luego se absorbió en

35 acetonitrilo (2 ml). Entonces se agregó TMSI (0,03 ml, 0,21 mmol). y la reacción se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego la mezcla se concentr� y se destil� azeotr�picamente tres veces con tolueno. La mezcla de reacción cruda se absorbió entonces en dicloro-metano (1 mililitro) y anh�drido de Boc (57 mg, 0,26 mmol), y se

agreg� trietil-amina (0,050 ml, 0,37 mmol). La mezcla se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora, y luego se concentr�. La reacción se purificó mediante HPLC, para proporcionar el compuesto 10 deseado (14 mg, 0,019 mmol). �H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 0,94 (s, 9H), 1,08 (m, 9H), 2,42 (m, 1H), 2,68 (m, 1H), 3,95 (s, 3H), 4,03 (m, 2H), 4,59 (m, 2H), 4,98 (d, 1H), 5,19 (d, 1H), 5,74 (s a, 1H), 5,9 (m, 1H), 7,1 (m, 1H), 7,28 (m, 1H), 7,43 (d, 1H), 7,54 (s, 1H), 7,64 (m, 3H), 7,98 (m, 2H), 8,28 (d, 1H).

Paso 1. La quinolina (2,33 g, 10 mmol) y el bencil-éster de Boc-cis-hidroxi-prolina (3,6 g, 11 mmol) se absorbieron en tetrahidrofurano (100 ml). A esta mezcla se le agregaron DIAD (4,3 ml, 22 mmol), y trifenil-fosfina (5,8 g, 22 mmol). La reacción se agit� a temperatura ambiente durante la noche, y luego se concentr� y se purificó mediante cromatograf�a por evaporación instantánea para proporcionar el producto de Mitsunobu (1,66 g, 30 %). Esta Boc-amina (3,1 mmol) se absorbió en dicloro-metano (30 ml), y se trat� con ácido trifluoro-acético (30 ml). La reacción se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora, se concentr�, y se destil� azeotr�picamente con tolueno (50 ml, tres veces). El residuo se absorbió entonces en dicloro-metano. Se agregaron HATU (1,65 g, 4,35 mmol), NMM (1,02 ml, 9,3 mmol), y el ácido carbox�lico P3 (0,83 g, 3,41 mmol), y la reacción se agit� a temperatura ambiente durante 15 horas. Entonces la mezcla se concentr� y se purificó por medio de cromatograf�a por evaporación instantánea para proporcionar el dip�ptido (1,71 g, 83 %). Luego se absorbió el bencil-éster en metanol y acetato de etilo (10 ml de cada uno). Se agregó paladio sobre carbón (250 miligramos) y la mezcla se agit� bajo un globo de hidrógeno durante 1,5 horas. Entonces la mezcla se filtr� y se concentr� para proporcionar el ácido carbox�lico 32 deseado (1,2 g, 81 %).

Paso 2. El ácido carbox�lico de dip�ptido 32 (2 g, 3,5 mmol) se absorbió en tetrahidrofurano (35 ml) y se enfri� a 40 �C. Se agregaron trietil-amina (0,98 ml, 7,0 mmol) y cloroformato de etilo (0,67 ml, 7,0 mmol). La reacción se monitore� mediante LC/MS para determinar la desaparición del material de partida. Entonces se agregó el aminofosfonato 33 (844 mg, 3,85 mmol) en tetrahidrofurano (10 ml), y la reacción se calentó a temperatura ambiente. La reacción se apagó con NH4Cl saturado, y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se secó, se concentr�, y se purificó mediante cromatograf�a por evaporación instantánea, para proporcionar el trip�ptido (2,1 g, 78 %). El metil�ster se absorbió en tetrahidrofurano (30 ml), MeOH (10 ml), y agua (10 ml), y se enfri� a 0 �C. Se agregó NaOH (54 ml de una solución 1 M), y la mezcla se monitore� para determinar la desaparición del material de partida. Luego la reacción se diluyó con agua, y el pH se ajust� a 2 utilizando HCl 1 M. Entonces la mezcla se extrajo con EtOAc, y se concentr� para proporcionar el ácido carbox�lico (2,0 g, 98 %). El ácido carbox�lico (2 g, 2,6 mmol) se absorbió en tetrahidrofurano a 0 �C, y se agregaron trietil-amina (0,4 ml, 2,9 mmol) y cloroformato de isobutilo (0,38 ml, 2,9 mmol). La reacción se agit� durante 40 minutos. Se agregó diazometano (5,2 mmol), y la reacción se calentó a temperatura ambiente, y se agit� durante 2 horas. La mezcla se extrajo con EtOAc, se lav� con NaHCO3 y salmuera, luego se secó, se concentr�, y se purificó mediante cromatograf�a por evaporación instantánea, para proporcionar la diazocetona (1,12 g, 43 %). La diazocetona (500 mg, 0,64 mmol) se absorbió en tetrahidrofurano (10 ml), y se enfri� a 0 �C. Se agregó HBr (0,41 ml de HBr al 48 %), y la reacción se monitore� mediante LC/MS. Después de 1 hora, la mezcla se extrajo con EtOAc, se lav� con NaHCO3, se secó y se concentr�, para proporcionar el intermediario de αbromo-cetona (490 mg, 92 %).

Paso 3. La α-bromo-cetona (173 mg, 0,2 mmol) se absorbió en isopropanol (3 ml), y se agregó tiourea (32 mg, 0,42 mmol). La reacción se calentó a 75 �C durante 1 hora, se enfri�, y se concentr�. El residuo se absorbió en 5 acetato de etilo, se lav� con NaHCO3 saturado y salmuera, y luego se concentr� para proporcionar el amino-tiazol (141 mg, 84 %). Este fosfonato de dietilo se absorbió entonces en CH3CN (5 ml), y se agregó 2,6-lutidina (58 mg, 0,55 mmol). Se agregó TMSI (0,078 ml, 0,55 mmol), y la reacción se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora. Entonces la reacción se apagó con TEA, seguida por metanol. Luego la mezcla se concentr� y se purificó mediante HPLC para proporcionar el compuesto 11 (48,8 mg, 71 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD ) δ 1,02 (s, 9H), 1,26-1,48 (m,

10 15H), 2,06 (m, 1H), 2,52 (m, 1H), 2,77 (m, 1H), 3,35 (s, 1H), 4,10 (m, 1H), 4,43 (s, 1H), 4,91 (m, 1H), 5,27 (m, 1H), 5,67 (s, 1H), 5,95 (m, 1H), 6,72 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 7,30 (d, 1H, J = 9,3 Hz), 7,61 (s, 1H), 7,68 (s, 1H), 8,14 (s, 1H), 8,23 (d, 1H, J = 9,6 Hz). 31P RMN (300 MHz) ∀ 20,42. LC/MS: 757 (M+1).

El intermediario de α-bromo-cetona del Ejemplo 11 (173 mg, 0,2 mmol) se absorbió en isopropanol (3 ml), y se agregó acetil-tiourea (49 mg, 0,42 mmol). La reacción se calentó a 75 �C durante 1 hora, se enfri�, y se concentr�. El 20 residuo se absorbió en acetato de etilo, se lav� con NaHCO3 saturado y salmuera, y luego se concentr� para proporcionar el acetil-amino-tiazol (160 mg, 90 %). Este intermediario de fosfonato de dietilo (80 miligramos) se absorbió entonces en CH3CN (5 ml), y se agregó 2,6-lutidina (58 mg, 0,55 mmol). Se agregó TMSI (0,078 ml, 0,55 mmol), y la reacción se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora. Entonces la reacción se apagó con TEA, seguida por metanol. Luego la mezcla se concentr� y se purificó mediante HPLC, para proporcionar el compuesto 12

25 (45,9 mg, 64 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 1,02 (m, 11H), 1,25-1,72 (m, 15H), 2,08 (m, 1H), 2,35 (s, 3H), 2,58 (m, 1H), 2,83 (m, 1H), 3,2 (m, 4H), 4,15 (m, 1H), 4,42 (s, 1H), 4,68 (m, 1H), 5,08 (d, 1H J = 9,9 Hz), 5,23 (d, 1H, J = 17 Hz), 5,81 (s, 1H), 5,98 (m, 1H), 7,33 (d, 1H, J = 7,2 Hz), 7,64 (s, 1H), 7,83 (s, 1H), 8,30 (d, 1H, J = 9,4 Hz), 8,63 (s, 1H). 31P RMN (300 MHz) δ 20,30. LC/MS: 799 (M+1).

5 El intermediario de fosfonato de dietilo del Ejemplo 12 (80 mg, 0,09 mmol) se absorbió en piridina (5 ml), y se agregó NaI (67 mg, 0,45 mmol). La reacción se calentó a 95 �C hasta completarse después de 8 horas. Luego la reacción se concentr�, y el residuo se absorbió en EtOAc. Los orgánicos se lavaron con HCl 1 M, se secaron, se concentraron, y se purificaron mediante HPLC, para proporcionar el compuesto 13 (36 mg, 48 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 1,05 (m, 9H), 1,26-1,61 (m, 14H), 2,11 (m, 1H), 2,32 (s, 3H), 2,50 (m, 1H), 2,77 (m, 1H), 3,10 (s, 1H), 3,98-4,18 (m,

10 6H), 4,41 (s, 1H), 4,66 (m, 2H), 5,08 (d, 1H, J = 11,7 Hz), 5,26 (d, 1H, J = 17,4 Hz), 5,80 (s, 1H), 5,97 (m, 1H), 7,35 (dd, 1H, J = 9,6 Hz, 2 Hz), 7,64 (d, 1H, J = 2 Hz), 7,86 (s, 1H), 8,30 (d, 1H, 9,3 Hz), 8,63 (s, 1H). 31P RMN (300 MHz) δ 21,54. LC/MS: 827 (M+1).

El intermediario de amino-tiazol del Ejemplo 11 (152 mg, 0,19 mmol) se absorbió en dicloro-metano (3 ml), y se enfri� a 0 �C. Se agregaron trietil-amina (21 mg, 0,21 mmol) y cloruro de isobutirilo (22 mg, 0,21 mmol). La reacción se calentó a temperatura ambiente, y se agit� durante 1 hora. La reacción se diluyó con dicloro-metano, se lav� con 20 NaHCO3 y salmuera, se concentr�, y se purificó mediante cromatograf�a por evaporación instantánea, para proporcionar el producto deseado (67 mg, 52 %). El fosfonato de dietilo (77 mg, 0,087 mmol) se absorbió en CH3CN. Se agregaron 2,6-lutidina (56 mg, 0,52 mmol) y TMSI (105 mg, 0,52 mmol). La reacción se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora, y luego se apagó con trietil-amina y metanol. La mezcla se concentr� entonces y se purificó mediante HPLC para proporcionar el compuesto 14 deseado (38,9 mg, 54 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD) δ

25 1,02 (s, 11H), 1,20-1,73 (m, 16H), 2,08 (m, 1H), 2,58 (m, 1H), 2,82 (m, 2H), 3,37 (m, 1H), 4,18 (m, 1H), 4,43 (s, 1H), 4,67 (m, 2H), 5,07 (d, 1H, J = 9,9 Hz), 5,23 (d, 1H, J = 18,2 Hz), 5,81 (s, 1H), 5,99 (m, 1H), 7,35 (dd, 1H, J = 9,4 Hz, 2,3 Hz), 7,64 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 7,85 (s, 1H), 8,3 (d, 1H, J = 9,5 Hz), 8,63 (s, 1H). 31P RMN (300 MHz) δ 20,39. LC/MS: 827 (M+1).

5 La 1-acetil-guanidina (92 mg, 0,91 mmol) se absorbió en dimetil-formamida (1 mililitro). Se agregó la bromo-cetona del Ejemplo 11 (254 mg, 0,30 mmol) en dimetil-formamida (1 mililitro). Esta reacción se agit� entonces a temperatura ambiente durante 5 días, y luego se concentr� y se purificó mediante cromatograf�a por evaporación instantánea (MeOH:EtOAc) para proporcionar el acetil-amida-imidazol (146 mg, 57 %). Este fosfonato de dietilo (131 mg, 0,16 mmol) se absorbió entonces en CH3CN (9 ml). Se agregaron 2,6-lutidina (0,1 ml, 0,94 mmol) y TMSI (0,13 ml,

10 0,94 mmol), y la reacción se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora. Entonces la reacción se apagó con trietilamina, seguida por metanol, y luego se concentr� y se purificó mediante HPLC para proporcionar el di�cido 15 deseado (19,5 mg, 16 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 1,02 (s, 12H), 1,22-1,78 (m, 14H), 2,08 (m, 1H), 2,25 (s, 3H), 2,56 (m, 1H), 2,78 (m, 1H), 4,02-4,09 (m, 6H), 4,45 (s, 1H), 4,65 (m, 2H), 5,07 (d, IH, J = 10,6 Hz), 5,25 (d, 1H, J = 17,2 Hz), 5,5.72 (s, 1H), 5,95 (m, 1H), 7,30 (d, 1H, J = 9,3 Hz), 7,49 (d, 1H, J = 1,9 Hz), 7,65 (s, 1H), 8,23 (d, 1H, J

15 = 9,2 Hz), 8,29 (s, 1H). 31P RMN δ 20,67. LC/MS: 782.

20 El fosfonato de dietilo del Ejemplo 15 (95 mg, 0,11 mmol) se absorbió en piridina (5 ml), y se agregó en NaI (85 mg, 0,57 mmol). La reacción se calentó a 95 �C hasta completarse después de 8 horas. Entonces la reacción se concentr�, y el residuo se absorbió en EtOAc. Los orgánicos se lavaron con HCl 1 M, se secaron, se concentraron, y se purificaron mediante HPLC, para proporcionar el mono�cido 16 (17,5 mg, 19 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 1,05 (s, 12H), 1,26-1,62 (m, 15H), 2,11 (m, 1H), 2,24 (s, 3H), 2,43 (m, 1H), 2,74 (m, 1H), 3,98-4,19 (m, 8H), 4,45 (s,

25 1H), 4,65 (m, 2H), 5,09 (d, 1H, J = 11,7 Hz), 5,26 (d, 1H, J = 16 Hz), 5,71 (s, 1H), 5,98 (m, 1H), 7,28 (dd, 1H, J = 9,3 Hz, 2,4 Hz), 7,49 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 7,66 (s, 1H), 8,23 (d, 1H, J = 9 Hz), 8,32 (s, 1H). 31P RMN (300 MHz) δ 21,66. LC/MS: 810 (M+1).

5 El fosfonato de dietilo del Ejemplo 14 (100 mg, 0,11 mmol) se absorbió en piridina (5 ml), y se agregó NaI (85 mg, 0,57milimoles). La reacción se calentó a 95 �C hasta completarse después de 8 horas. La reacción se concentr�, y el residuo se absorbió en EtOAc. Los orgánicos se lavaron con HCl 1 M, se secaron, se concentraron, y se purificaron mediante HPLC, para proporcionar el mono�cido 17 (28 mg, 29 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 1,05 (m, 12H), 1,15-1,61 (m, 17H), 2,11 (m, 1H), 2,51 (m, 1H), 2,82 (m, 2H), 3,31 (m, 1H), 4,06-4,17 (m, 7H), 4,41 (s, 1H), 4,64 (m,

10 2H), 5,09 (d, 1H, J = 9,9 Hz), 5,25 (d, 1H, J = 17 Hz), 5,8 (s, 1H), 5,97 (m, 1H), 7,35 (dd, 1H, J = 9,3 Hz, 2,1 Hz), 7,63 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 7,87 (s, 1H), 8,32 (d, 1H, J = 9,3 Hz), 8,63 (s, 1H). 31P δ 21,58. LC/MS: 855 (M+1).

La α-bromo-cetona del Ejemplo 11 (135 mg, 0,16 mmol) se absorbió en isopropanol (3 ml), y se agregó la metiltiourea (29 mg, 0,32 mmol). La reacción se calentó a 75 �C durante 1 hora, se enfri�, y se concentr�. El residuo se absorbió en acetato de etilo, se lav� con NaHCO3 saturado y salmuera, y luego se concentr� para proporcionar el 20 metil-amina-tiazol (121 mg, 90 %). Este fosfonato de dietilo (100 miligramos) se absorbió entonces en CH3CN (5 ml), y se agregó 2,6-lutidina (78 mg, 0,73 mmol). Se agregó TMSI (0,1 ml, 0,73 mmol), y la reacción se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego la reacción se apagó con trietil-amina, seguida por metanol. Entonces la mezcla se concentr� y se purificó mediante HPLC para proporcionar el di�cido 18 (60,5 mg, 65 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 1,02 (s, 9H), 1,29-1,65 (m, 10H), 2,08 (m, 1H), 2,53 (m, 1H), 2,75 (m, 1H), 3,13 (s, 3H), 4,08-4,16

25 (m, 5H), 4,45 (s, 1H), 4,67 (m, 2H), 5,08 (d, 1H, J = 10,4 Hz), 5,25 (d, 1H, J = 17 Hz), 5,78 (s, 1H), 5,97 (m, 1H), 7,32 (dd, 1H, J = 9,2 Hz, 2,4 Hz), 7,75 (s, 1H), 8,20 (s, 1H), 8,26 (d, 1H, J = 9,2 Hz). 31P RMN (300 MHz) δ 20,65. LC/MS: 771 (M+1).

5 La α-bromo-cetona (135 mg, 0,16 mmol) se absorbió en isopropanol (3 ml), y se agregó tioformamida (20 mg, 0,32 mmol). La reacción se calentó a 79 �C durante 1 hora, se enfri�, y se concentr�. El residuo se absorbió en acetato de etilo, se lav� con NaHCO3 saturado y salmuera, y luego se concentr� para proporcionar el tiazol (115 mg, 89 %). Este fosfonato de dietilo (100 miligramos) se absorbió entonces en CH3CN (5 ml), y se agregó 2,6-lutidina (80 mg, 0,75 mmol). Se agregó TMSI (0,1 ml, 0,75 mmol), y la reacción se agit� a temperatura ambiente durante 1

10 hora. Entonces la reacción se apagó con trietil-amina, seguida por metanol. Luego la mezcla se concentr� y se purificó mediante HPLC, para proporcionar el compuesto 19 (42 mg, 45 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 1,02 (s, 10H), 1,04-1,61 (m, 10H), 2,07 (m, 1H), 2,55 (m, 1H), 2,80 (m, 1H), 4,06-4,15 (m, 6H), 4,40 (s, 1H), 4,70 (m, 2H), 5,08 (d, 1H, J = 11,9 Hz), 5,25 (d, 1H, J = 17,2 Hz), 5,84 (m, 1H), 5,97 (m, 1H), 7,37 (dd, 1H, J = 9,3 Hz, 2,3 Hz), 7,73 (d, IH, J = 2,2 Hz), 7,97 (s, 1H), 8,33 (d, 1H, J = 9,3 Hz), 9,13 (d, 1H, J = 1,8 Hz), 9,36 (d, 1H, J = 1,5 Hz). 31P

15 RMN (300 MHz) δ 20,66. LC/MS: 742 (M+l).

20 La α-bromo-cetona (149 mg, 0,18 mmol) se absorbió en isopropanol (3 ml), y se agregó N,N-dimetil-tiourea (37 mg, 0,36 mmol). La reacción se calentó a 75 �C durante 1 hora, se enfri�, y se concentr�. El residuo se absorbió en acetato de etilo, se lav� con NaHCO3 saturado y salmuera, y luego se concentr� para proporcionar el dimetil-aminotiazol (135 mg, 90 %). Este fosfonato de dietilo (115 miligramos) se absorbió entonces en CH3CN (5 ml), y se agregó 2,6-lutidina (88 mg, 0,82 mmol). Se agregó TMSI (0,12 ml, 0,82 mmol), y la reacción se agit� a temperatura

25 ambiente durante 1 hora. Entonces la reacción se apagó con trietil-amina, seguida por metanol. Luego la mezcla se concentr� y se purificó mediante HPLC para proporcionar el di�cido 20 (53 mg, 49 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 1,03 (s, 9H), 1,32-1,60 (m, 9H), 2,07 (m, 1H), 2,57 (m, 1H), 2,80 (m, 1H), 4,11-4,17 (m, 5H), 4,60 (m, 1H), 4,67 (m, 2H), 5,06-5,31 (m, 2H), 5,80 (m, 1H), 5,97 (m, 1H), 7,31 (dd, 1H, J = 9 Hz, 2,2 Hz), 7,74 (s, 1H), 7,79 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 8,24 (s, 1H). 31P RMN (300 MHz) δ 20,49. LC/MS: 785 (M+1).

La sal de tartrato de dibenzo�lo (4,053 g, 7,80 mmol) del amino-fosfonato se disolvió en una mezcla de una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (45 ml) y salmuera (45 ml). Después de que se extrajo la amina libre con dicloro-metano (45 ml, dos veces), los extractos se lavaron con una mezcla de una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (45 ml) y salmuera (45 ml), seguida por salmuera (30 ml), se secó (MgSO4), y se concentr� para obtener 1,63 gramos (recuperación del 95 %) de la amina libre.

Una solución de2,80 gramos (4,75 mmol) del reactivo de dip�ptido, y 0,65 ml (5,91 mmol) de N-metil-morfolina en tetrahidrofurano (50 ml), se agit� en un baño de hielo-sal a medida que se agregaban por goteo 0,70 ml, 5,40 mmol) de cloroformato de isobutilo. Después de 30 minutos, se agregó mediante una c�nula una solución de 1,25 gramos (5,70 mmol) de la amina libre en tetrahidrofurano (5 ml). La mezcla resultante se agit� en el baño de hielo-sal durante 1 hora, y se almacen� en un congelador durante la noche. La mezcla resultante se concentr�, y el residuo se disolvió en ácido cítrico al 5 % (50 ml), antes de extraer el producto con acetato de etilo (70 ml, dos veces). Los extractos se lavaron con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (50 ml), se secaron (MgSO4), y se concentraron. El producto se purificó mediante cromatograf�a utilizando una columna de 120 gramos de gel de sílice, empleando una combi-flash mediante eluci�n en gradiente con acetato de etilo-hexano (1:1) hasta acetato de etilo (100 %), para obtener 2,08 gramos (56 %): �H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 8,01-8,09 (m, 3H), 7,46-7,56 (m, 3H), 7,44 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,36 (a, 1H), 7,08 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,06 (s, 1H), 5,99 (dt, J = 16,8 y 9,9 Hz, 1H), 5,26-5,42 (m, 2H), 5,08-5,15 (m, 1H), 4,88-5,03 (m, 2H), 4,76 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 4,47 (br d, J = 11,4 Hz, 1H), 4,39 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 4,00-4,21 (m, 5H), 3,96 (s, 3H), 2,94 (dt, J = 14,1 y 5,7 Hz, 1H), 2,37-2,47 (m, 1H), 1,50-2,10 (m, 5H), 1,34-1,44 (m, 1H), 1,20-1,34 (m, 10H), 0,98-1,07 (m, 1H), 1,04 (s, 9H); 31P RMN (75 MHz, CDCl3) δ 22,74; LC/MS: 791 (M+ + 1).

Ver el Ejemplo 17.

1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 8,36 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 8,06-8,11 (m, 2H), 7,70-7,82 (m, 3H), 7,66 (s, 1H), 7,54 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,39 (dd, J = 9,3 and 2,1 Hz, 1H), 5,98 (dt, J = 17,1 and 9,9 Hz, 1H), 5,83 (a, 1H), 5,25 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,08 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 4,62-4,72 (m, 2H), 4,45 (a, 1H), 4,17 (s, 1H), 4,06-4,20 (m, 3H), 4,06 (s, 3H), 2,73-2,83 (m, 1H), 2,43-2,54 (m, 1H), 2,05-2,17 (m, 1H), 1,31-1,70 (m, 12H), 1,28 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 1,01-1,08 (m, 2H), 1,05 (s, 9H); 31P NMR (75 MHz, CD3OD) δ 21,30; LC/MS: 763 (M+ + 1).

A una solución del fosfonato de dietilo (3,60 g, 4,55 mmol) en 30 ml de CH3CN a 0 �C, se le agregaron yodo-trimetilsilano (3,24 ml, 22,78 mmol) y 2,6-lutidina. La mezcla de reacción se agit� a 0 �C durante 1 hora, se concentr�, y se co-evapor� con tolueno. El residuo se trat� con metanol, y se evapor�. El producto crudo se purificó mediante Gilson (ácido trifluoro-acético al 0,1 %/CH3CN/H2O), para dar el ácido fosf�nico 23 (1,68 g, 50%) como un sólido blanco: 1H RMN (CD3OD) δ 8,40 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 8,10 (m, 2H), 7,75 (m, 3H), 7,68 (s, 1H), 7,58 (s, 1H), 7,40 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 6,00 (m, 1H), 5,80 (s, amplia, 1H), 5,25 (d, J = 14,4 Hz, 1H), 5,08 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,70 (d, J = 10,2 Hz, 2H), 4,50 (s, amplia, 1H), 4,20 (s, 1H), 4,05 (s, 3H), 2,80 (m, 1H), 2,55 (m, 1H), 2,10 (m, 1H), 1,80-1,40 (m, 12H), 1,00 (m, 9H); 31P RMN (CD3OD) δ 20,10.

El ácido carbox�lico (2,24 g, 3,42 mmol) se absorbió en tetrahidrofurano anhidro (30 ml) en un matraz de fondo

10 redondo, y se enfri� a -30 �C. Se agregaron cloroformato de etilo (0,65 ml, 6,84 mmol) y trietil-amina (1,4 ml, 10,26 mmol), y la reacción se agit� manteniéndose la temperatura entre -20 �C y -30 �C durante 30 minutos. La desaparición del material de partida se monitore� mediante LC/MS. El amino-fosfonato B (0,93 g, 4,25 mmol) se agregó en tetrahidrofurano (5 ml), y la reacción se calentó a temperatura ambiente, y se agit� durante 1 hora. La reacción se apagó entonces con una solución saturada de NH4Cl, y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica

15 se secó, se concentr�, y se purificó mediante cromatograf�a por evaporación instantánea, para proporcionar el trip�ptido (1,4 g, 48 %). 1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 1,05 (s, 9H), 1,33 (m, 15H), 1,50-1,62 (m, 8H), 2,15 (m, 1H), 2,46 (m, 1H), 2,75 (m, 1H), 4,04-4,24 (m, 1H), 4,42 (m, 1H), 4,63 (m, 2H), 5,13 (dd, 1H, J=10,5 Hz, 1,5 Hz), 5,30 (dd, 1H, J=17 Hz, 1,5 Hz), 5,77 (m,1H), 5,95 (m, 1H), 7,31 (dd, 1H, J=9 Hz, 2,2 Hz), 7,75 (m, 2H), 8,18 (s, 1H), 8,27 (d, 1H, J=9,3 Hz), 8,54 (s, 1H). 31P NMR (CD3OD, 300 MHz) δ 23,39. LC/MS: 856 (M+1).

20 A una solución del trip�ptido (50 mg, 0,059 mmol) en 1 mililitro de piridina, se le agregó una porción de Nal (45 mg, 0,029 mmol). La mezcla de la solución se agit� a 95 �C durante 1 hora. Entonces se agregó la segunda porción de NaI (45 mg, 0,029 mmol), y la mezcla de reacción se agit� a 95 �C durante otras 6 horas. La mezcla se concentr� al vacío utilizando una bomba de alto vacío a 40 �C, y se agregaron 3 gotas de una solución 1 M de HCl. La mezcla

25 cruda se disolvió en 1 mililitro de MeOH. La mezcla se concentr� al vacío, se disolvió en 1 mililitro de MeOH, y se purificó mediante HPLC de fase inversa (eluido con del 10 % al 75 % de H2O/CH3CN) para dar el 24 como un sólido amarillo (18 mg, 37 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 8,27 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 8,18 (s, 1H), 7,75 (s, 2H), 7,33 (dd, J = 9,2, 2,7 Hz, 1H), 6,05-5,90 (m, 1H), 5,76 (s a, 1H), 5,25 (d, J = 18 Hz, 1H), 5,08 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 4,73-4,60 (m, 2H), 4,50-4,40 (m, 1H), 4,25-4,05 (m, 4H), 4,04 (s, 3H), 2,82-2,75 (m, 1H), 2,58-2,40 (m, 1H), 2,20-2,00 (m, 1H),

30 1,70-1,40 (m, 9H), 1,34 (d, J = 6,4 Hz, 6H), 1,28 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1,05 (s, 9H), 0,97 (s, 1H). 31P RMN (300 MHz, CD3OD): δ 21,3. LC/MS: 827 (M+ + 1).

Ejemplo 25: Preparación del compuesto 25.

35 El fosfonato de dietilo del Ejemplo 24 (380 mg, 0,45 mmol) se absorbió en acetonitrilo (5 ml), y se trat� con TMSI (0,32 ml, 2,23 mmol). La reacción se agit� a temperatura ambiente durante 20 minutos, y se monitore� mediante LC/MS. Luego se agregó 2,6-lutidina (1,5 ml), seguida por metanol (2 ml). La mezcla se concentr� y se evapor� con tolueno (20mililitros, tres veces). El residuo se purificó entonces mediante HPLC, para proporcionar el di�cido 25 (240 mg, 67 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 1,04 (s, 9H), 1,34 (d, 6H, J = 6,3 Hz), 1,37-1,62 (m, 11H), 2,05 (m, 1H), 2,53 (m, 1H), 2,77 (m, 1H), 4,04 (s, 3H), 4,09-4,19 (m, 3H), 4,46 (m, 1H), 4,65 (m, 2H), 5,05 (dd, 1H, J = 10,2 Hz, 1,5 Hz), 5,21 (dd, 1H, J = 17 Hz, J = 1,5 Hz), 5,76 (m, 1H), 6,00 (m, 1H), 7,30 (dd, 1H, J = 9 Hz, 2,2 Hz), 7,74 (m, 1H), 8,19 (s, 1H), 8,26 (d, 1H, J = 9,6 Hz). 31P RMN (300 MHz, CD3OD) δ 20,03. LC/MS: 799 (M+1).

Ejemplo 26: Preparación del compuesto 26.

10 El precursor de mono-ácido del compuesto 22 (200 mg, 0,262 mmol) se suspendió en 6 ml de dimetil-formamida bajo N2. Se agregaron Cs2CO3 (427 mg, 1,31 mmol), seguido por carbonato de cloro-metil-isopropilo (199 mg, 1,31 mmol), y yoduro de tetrabutil-amonio (TBAI) (9,6 mg, 0,026 mmol). La solución se calentó a 55 �C durante 2 horas. La solución se concentr� y se purificó empleando una HPLC Gilson de Fase Inversa, para dar el compuesto 26 (30 mg, 13 %) como un sólido amarillo claro. �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 8,10 (m, 3H), 7,59 (m, 3H), 7,40 (s,

15 1H), 7,21 (s, 1H), 7,10 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,80 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,90 (m, 1H), 5,60 (m, 3H), 5,30 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 5,18 (d, J = 9,0 Hz, 1H) 4,78 (m, 3H), 4,58 (m, 2H), 4,30 (m, 3H), 4,20 (q, 2H), 4,05 (m, 2H), 3,98 (s, 3H), 2,70 (m, 1H), 2,40 (m, 1H), 2,20 (m, 1H), 1,62 (m, 2H) 1,50 (m, 2H) 1,40 (t, 3H), 1,3-1,2 (m, 6H), 1,05 (s, 9H). 31P (75 MHz, CD3OD): δ 22,843, 22,717 (diaestere�meros).

20 Ejemplo 27: Preparación del compuesto 27.

El di�cido del compuesto 23 (22,8 mg, 0,03 mmol) se suspendió en 1 mililitro de dimetil-formamida bajo N2. Se agregaron Cs2CO3 (17 mg, 0,05 mmol), yoduro de tetrabutil-amonio (TBAI) (5 mg, 0,015 mmol), y (2-bromo-etil)25 benceno (7 μl, 0,05 mmol), y la solución se agit� a temperatura ambiente. Después de 1 hora, se agregó (2-bromoetil)-benceno (35 μl, 0,25 mmol), y la solución se calentó a 70 �C durante 8 horas. La reacción se enfri� a temperatura ambiente, y se purificó utilizando una HPLC Gilson de Fase Inversa, para dar el compuesto 27 (2,2 mg, 8 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 8,40 (d, J-9,0 Hz, 1H) 8,10 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,78 (m, 3H) 7,62 (s, 1H), 7,50 (s, 1H), 7,40 (d, J = 9,0 Hz, 1H) 7,23 (s, 1H), 7,20 (m 1H), 5,90 (m, 1H), 5,80 (s, 1H) 5,60 (m, 3H), 5,30 (t, 1H), 5,18

30 (d, J = 9,0 Hz, 1H) 4,78 (m, 2H), 4,58 (s, 1H), 4,30 (m, 3H), 4,20 (m, 3H), 4,05 (s, 3H), 2,92 (q, 2H), 2,70-2,6 (m, 1H), 2,43-2,40 (m, 1H), 2,18-2,05 (m, 1H), 1,62 (m, 2H, 1,50 (m, 2H), 1,40 (t, 3H), 1,3-1,2 (m, 6H), 1,05 (s, 9H). 31P (75 MHz, CD3OD): δ 20,702 (s, 1P).

El mono-ácido (200 mg, 0,24 mmol) se suspendió en 8 ml de dimetil-formamida bajo N2. Se agregaron Cs2CO3 (394 mg, 1,21 mmol), seguido por cloroformato de cloro-metil-etilo (8) (167 mg, 1,21 mmol), y yoduro de tetrabutilamonio (TBAI) (8,8 mg, 0,024 mmol). La solución se calentó a 55 �C durante 2 horas. La solución se concentr� y se purificó utilizando una HPLC Gilson de Fase Inversa, para dar el compuesto 28 (32,5 mg, 15 %). �H RMN (300 MHz,

5 CD3OD): δ 8,10 (d, J = 9,5 Hz, 2H), 7,42 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,38 (s, 1H), 7,10 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,78 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,90 (m, 1H), 5,60 (m, 2H), 5,45 (s, 1H) 5,30 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 5,18 (d, J = 9,0 Hz, 1H) 4,78 (s, 1H), 4,58 (m, 1H), 4,30 (m, 1H), 4,20 (q, 2H), 4,05 (m, 2H), 3,98 (s, 3H), 2,70 (m, 1H), 2,40 (m, 1H), 2,20 (m, 1H), 1,62 (m, 2H), 1,50 (m, 2H) 1,40 (t, 3H), 1,3-1,2 (m, 9H), 1,05 (s, 9H). 31P (75 MHz, CD3OD): δ 22,813, 22,697 (diaestere�meros).

10 Ejemplo 29: Preparación del compuesto 29.

El mono-ácido (220 mg, 0,26 mmol) se suspendió en 7 ml de dimetil-formamida. Se agregaron Cs2CO3 (433 mg,

15 1,33 mmol), seguido por el metil-éster de cloro-metil-éster del ácido carbónico (184 mg, 1,33 mmol), y yoduro de tetrabutil-amonio (TBAI) (9,6 mg, 0,026 mmol). La solución se calentó a 55 �C durante 2 horas, y se agit� durante 8 horas a temperatura ambiente. La solución se purificó utilizando una HPLC Gilson de Fase Inversa, para dar el compuesto 29 (9 mg, 4 %). �H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 8,00 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 7,42 (d, J = 8,8 Hz, 3H), 7,10 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,10-5,82 (m, 1H), 5,63 (t, 2H), 5,45 (s, 1H) 5,30 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 5,20 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 5,00 (s,

20 1H), 4,70 (m, 1H) 4,43 (m, 1H), 4,20 (q, 2H), 4,05 (m, 2H), 3,98 (s, 3H), 2,90 (m, 1H), 2,40 (m, 1H), 2,10 (m, 1H), 1,39 (d, J = 8,8 Hz, 6H), 1,30 (t, 3H), 1,05 (s, 9H). 31P (75 MHz, CD3OD): δ 22,466, 22,059 (diaestere�meros).

El di�cido (220 mg, 0,27 mmol) se suspendió en 6 ml de piridina, y se agregó isopropanol (49 mg, 0,83 mmol). La solución se calentó a 55 �C, y se agregó DCC (11 mg, 0,54 mmol). Después de 2 horas, no hubo formación de producto, y la solución se calentó a 80 �C. Después de 1 hora, se agregó DCC (28 mg, 0,13 mmol) con agitaci�n 30 continua a 80 �C. Después de 10 horas, se agregó DCC (28 mg, 0,13 mmol). Después de 3 horas, la solución se concentr� y se purificó utilizando una HPLC Gilson de Fase Inversa, para dar el compuesto 30 (60 mg, 27 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 8,21 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 8,10 (s, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,21 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 7,10 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,80 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 6,20-6,10 (m, 1H), 5,60 (s, 1H), 5,20 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 4,98 (d, J = 9,0 Hz, 1H) 4,61-4,25 (m, 3H), 4,20 (d, 1H), 4,18 (m, 2H), 4,05 (s, 3H), 3,42 (m, 2H), 3,22 (m, 2H), 2,80 (m, 1H), 2,60 (m,

35 1H), 2,10 (m, 1H), 1,9 (m, 2H), 1,39 (d, J = 8,8 Hz, 6H), 1,30 (t, 3H), 1,05 (s, 9H). 31P (75 MHz, CD3OD): δ 15,575.

A un matraz de fondo redondo se le agregó el di�cido (112 mg, 0,14 mmol) en piridina (2 ml). Se agregaron trifluoroetanol (0,081 ml, 1,12 mmol) y DCC (0,7 ml, 0,7 mmol), y la reacción se calentó a 70 �C. La reacción se monitore� mediante LC/MS, y se detuvo cuando la proporción del mono-trifluoro-etilo al bis-trifluoro-etilo fue de aproximadamente 1:1. La reacción se apagó con agua, se extrajo con acetato de etilo, se lav� con HCl 0,5 M, y con una solución saturada de bicarbonato de sodio. Entonces la capa orgánica se secó, se concentr�, y se purificó mediante HPLC, para proporcionar el producto de mono-TFE 31 (16,5 mg, rendimiento del 12 %), y el producto de bis-TFE 32 (20 mg, rendimiento del 16 %).

31: �H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 0,97-1,83 (m, 22H), 1,83-1,87 (m, 4H), 2,06 (m, 1H), 2,51 (m, 1H), 2,77 (m, 1H), 3,45 (m, 1H), 4,04-4,19 (m, 7H), 4,29 (m, 1H), 4,50 (s a, 2H), 4,67 (m, 2H), 5,03 (d, 1H, J = 10,2 Hz), 5,18 (d, 1H, J = 17,4 Hz), 5,75 (s, 1H), 5,99 (m, 1H), 7,31 (d, 1H, J = 9 Hz), 7,73 (s, 2H), 8,20 (s, 1H), 8,27 (d, 1H. J = 9,6 Hz). 31P RMN (300 MHz) δ 18,89.

32: �H RMN (300 MHz) δ 1,03 (s, 9H), 1,48 (d, 9H, J = 6,3 Hz), 1,47-1,80 (m, 17H), 2,14 (m, 1H), 2,48 (m, 1H), 2,91 (m, 1H), 3,75 (m, 1H), 3,94 (s, 4H), 4,24-4,45 (m, 7H), 4,71 (m, 1H), 4,98 (m, 1H), 5,09 (d, 1H, J = 7,2 Hz), 5,20-5,41 (m, 5H), 5,85 (m, 1H), 7,02 (dd, 1H, J = 9 Hz, 2,1 Hz), 7,38 (s, 1H), 7,46 (s, 1H), 7,55 (s, 1H), 7,99 (d, 1H, J = 8,4 Hz). 31P RMN δ 26,07.

Una mezcla de 24,5 miligramos (33,3 micromoles) de la mezcla diaestereom�rica del di�cido, 6,1 miligramos (16,5 micromoles) de yoduro de tetra-n-butil-amonio, 16,2 miligramos (49,7 micromoles) de carbonato de cesio en 1 mililitro de dimetil-formamida, se agit� a temperatura ambiente, a medida que se agregaban 5 μl (51,6 micromoles) de bromuro de ciclopropil-metilo. Después de que la mezcla se agit� a temperatura ambiente durante 18 horas, y a 70 �C durante 4 horas, se agregaron 5 μl más (51,6 micromoles) del bromuro, y la mezcla se agit� a 70 �C durante 20 horas. Se agregaron 12,0 miligramos adicionales (36,8 micromoles) de carbonato de cesio, y la mezcla se agit� a 70 �C durante 3,5 horas, antes de agregar 12 μl (123,7 micromoles) del bromuro, y se agitaron a 70 �C durante 1,5 horas. Después de una adición más de 10 μl (103,1 micromoles) del bromuro, y de agitar la mezcla a 70 �C durante 1,5 horas, la mezcla se filtr�. El producto del filtrado se purificó mediante HPLC, y se obtuvieron 6,2 miligramos (24 %) del compuesto 33 después de la liofilización como una mezcla de dos diaestere�meros: �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 8,37 (br d, J = 9,3 Hz, 1H), 8,08-8,11 (m, 2H), 7,71-7,81 (m, 3H), 7,67 (s, 1H), 7,54 (br d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,40 (br d, J = 9,0 Hz, 1H), 5,90-6,04 (m, 1H), 5,83 (a, 1H), 5,27 (t, J = 17,5 Hz, 1H), 5,06 (d, J = 10,2 Hz, 1H), 4,624,71 (m, 2H), 4,46 (a, 1H), 4,18 (s, 1H), 4,04-4,12 (a, 1H), 4,06 (s, 3H), 3,78-3,95 (m, 2H), 2,75-2,83 (m, 1H), 2,462,57 (m, 1H), 1,98-2,15 (m, 1H), 1,28-1,68 (m, 10H), 1,05-1,20 (m, 1H), 1,05 y 1,03 (dos s, 9H), 0,46-0,55 (m, 2H), 0,26-0,32 (m, 2H); 31P RMN (75 MHz, CD3OD) δ 20,41, 20,55; LC/MS: 789 (M+ + 1).

5 Una solución de 1,028 gramos (1,29 mmol) del di�cido, 118,2 miligramos (0,32 mmol), y 2,7 ml (19,4 mmol) de trietilamina en 20 ml de N-metil-pirrolidona (20 ml), se agit� a temperatura ambiente, a medida que se agregaban 2,054 gramos (14,8 mmol) del etil-éster de cloro-metil-éster del ácido carbónico. La mezcla se agit� a 50 �C durante 22 horas, y se enfri� a temperatura ambiente antes de la filtración a través de un filtro de membrana. El filtrado se purificó mediante HPLC de preparación, y las fracciones que contenían al producto puro se secaron por congelación

10 para obtener 284 miligramos (22 %) del compuesto 34: �H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 7,99 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 7,46 (s, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,37 (a, 1H), 7,31 (a, 1H), 7,02 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 5,94 (dt, J = 17,1 y 9,7 Hz, 1H), 5,60-5,74 (m, 4H), 5,15-5,44 (m, 5H), 5,00 (a, 1H), 4,65 (t, J = 7,1 Hz, 1H), 4,35-4,44 (m, 2H), 4,13-4,26 (m, 4H), 3,96-4,05 (m, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,66-3,77 (m, 1H), 2,81-2,90 (m, 1H), 2,40-2,49 (m, 1H), 2,00-2,21 (m, 1H), 1,47-1,88 (m, 10H), 1,35 (d, J = 6,3 Hz, 6H), 1,20-1,38 (m, 6H), 1,04 (s, 9H); 31P RMN (75 MHz, CDCl3) δ 22,32 (#0,1P), 21,78 (#0,9P);

15 LC/MS: 1003 (M+ + 1).

20 El di�cido (150 mg, 0,187 mmol) se suspendió en 3 ml de dimetil-formamida. Se agregaron carbonato de butil-clorometilo (311 mg, 1,87 mmol), trietil-amina (390 μl, 2,80 mmol), y yoduro de tetrabutil-amonio (TBAI) (17 mg, 0,05 mmol). La solución se calentó a 50 �C durante 6 horas, y a 70 �C durante 3 horas. La solución se enfri� a temperatura ambiente, se purificó utilizando una HPLC Gilson de Fase Inversa para dar el compuesto 35 como un

25 sólido amarillo claro (45 mg, 23 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 8,07 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,50 (s, 1H), 7,43 (s, 1H), 7,36 (s, 1H), 7,06 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 6,00-5,84 (m, 1H), 5,68 (dd, 4H), 5,5 (s, 1H), 5,36 (d, J = 9,8 Hz, 1H), 5,18 (d, J = 10 Hz, 1H), 4,79 (s, 1H), 4,56-4,47 (m, 1H), 4,29 (s, 1H), 4,15-4,13 (m, 2H), 3,95 (s, 3H), 2,71-2,66 (m, 1H), 2,40-2,32 (m, 1H), 2,25-2,20 (m, 1H), 1,64-1,54 (m, 7H), 1,33-1,31 (m, 8H), 1,06 (s, 9H), 0,93-0,87 (m, 6H). 31P (75 MHz, CD3OD): δ 23,245, 22,280.

5 El di�cido (150 mg, 0,187 mmol) se suspendió en 3 ml de dimetil-formamida. Se agregaron carbonato de cloro-metilisobutilo (311 mg, 1,87 mmol), trietil-amina (390 μl, 2,80 mmol), y yoduro de tetrabutil-amonio (TBAI) (17 mg, 0,05 mmol). La solución se calentó a 70 �C durante 5 horas. La solución se enfri� a temperatura ambiente, se purificó utilizando una HPLC Gilson de Fase Inversa para dar el compuesto 36 (30 mg, 15 %) como un sólido amarillo claro. �H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 8,02 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,43 (s, 1H), 7,34 (s, 1H), 7,06 (d, J = 9,7 Hz,

10 1H), 5,97-5,88 (m, 1H), 5,70-5,62 (m, 4H), 5,5 (s, 1H), 5,39 (d, J = 9,8 Hz, 1H), 5,18 (d, J = 10 Hz, 1H), 4,79 (s, 1H), 4,56 (m, 1H), 4,29 (s, 1H), 4,17 (m, 2H), 3,95 (s, 3H), 3,80 (m, 2H) 2,90 (m, 1H), 2,43 (m, 1H), 2,18 (m, 1H), 1,64 (m, 7H), 1,33 (m, 8H), (1,06) (s, 9H), 0,88 (m, 6H). 31P (75 MHz, CD3OD): δ 22,406, 21,777.

El di�cido (150 mg, 0,187 mmol) se suspendió en 3 ml de dimetil-formamida. Se agregaron carbonato de cloro-metilciclopropil-metilo (307 mg, 1,87 mmol), trietil-amina (390 μl, 2,80 mmol), y yoduro de tetrabutil-amonio (TBAI) (17 mg, 20 0,05 mmol). La solución se calentó a 70 �C durante 5 horas. La solución se enfri� a temperatura ambiente, se purificó utilizando una HPLC Gilson de Fase Inversa para dar el compuesto 37 (35 mg, 18 %) como un sólido amarillo claro. �H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 8,00 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,43 (s, 1H), 7,34 (s, 1H), 7,06 (d, J = 9,7 Hz, 1H), 5,97-5,88 (m, 1H), 5,70-5,62 (m, 4H), 5,50 (s, 1H), 5,26 (d, J = 9,8 Hz, 1H), 4,98 (s, 1H), 4,67 (t, 1H), 4,42 (m, 2H), 4,17 (m, 2H), 3,95 (s, 3H), 2,90 (m, 1H), 2,47 (m, 1H), 2,18 (m, 1H), 1,64 (m, 7H), 1,35 (d, 6H), 1,09 (s, 9H),

25 0,59 (t, 2H). 0,29 (m, 2H). 31P (75 MHz, CD3OD): δ 21,772.

5 El di�cido (150 mg, 0,187 mmol) se suspendió en 3 ml de dimetil-formamida. Se agregaron benzoato de cloro-metilo (319 mg, 1,87 mmol), trietil-amina (390 μl, 2,80 mmol), y yoduro de tetrabutil-amonio (TBAI) (17 mg, 0,05 mmol). La solución se calentó a 70 �C durante 5 horas. La solución se enfri� a temperatura ambiente, se purificó utilizando una HPLC Gilson de Fase Inversa para dar el compuesto 38 (60 mg, 30 %) como un sólido amarillo claro. �H RMN (300 MHz, CDCI3): δ 8,01 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 7,95 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,48 (dd, 2H), 7,06(d, J=9,7 Hz, 1H), 5,99 (m, 3H),

10 5,40(s, 1H), 5,15 (d, J=10 Hz, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,56 (t, 1H), 4,47 (d, 2H), 4,27 (s, 1H), 3,94 (s, 3H), 2,58 (m, 1H), 2,37 (m, 1H), 2,24 (m, 1H), 1,64 (m, 6H), 1,29 (d, 6H), 1,04 (s, 9H). 31P (75 MHz, CD3OD): δ 23,662, 22,873.

El ácido fosf�nico (83 mg, 0,102 mmol) se suspendió en 1,5 ml de dimetil-formamida. Se agregaron cloroformato de cloro-etilo (142 mg, 1,02 mmol), trietil-amina (213 μl, 1,53 mmol), y yoduro de tetrabutil-amonio (TBAI) (9 mg, 0,02 mmol). La solución se calentó a 70 �C durante 2 horas. La solución se enfri� a temperatura ambiente, se

20 purificó utilizando una HPLC Gilson de Fase Inversa para dar el compuesto 39. �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 8,03 (d, J=8,8 Hz, 1H), 7,43 (s, 2H) 7,33 (s, 1H), 7,03 (d, J=9,2 Hz, 1H), 5,98 (m, 1H), 5,95 (m, 1H), 5,60 (d, 2H), 5,44 (s, 1H), 5,33 (dd, 1H), 5,17 (t, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,52 (d, J=9,4, 1H), 4,56 (t, 1H), 4,47 (d, 2H), 4,27 (s, 1H), 4,24 (m, 3H), 3,94 (s, 3H), 2,66 (m, 1H), 2,58 (m, 1H), 2,37 (m, 1H), 2,14 (m, 1H), 1,64 (m, 6H), 1,33 (d, 6H), 1,20 (t, 3H), 1,29 (d, 6H), 1,04 (s, 9H). 31P (75 MHz, CD3OD): δ 53,082, 57,428.

30 El ácido difosf�nico (63 mg, 0,079 mmol) se suspendió en 1 mililitro de dimetil-formamida. Se agregaron carbonato de butil-cloro-metilo (131 mg, 0,79 mmol), trietil-amina (165 μl, 1,18 mmol), y yoduro de tetrabutil-amonio (TBAI) (7 mg, 0,01 mmol). La solución se calentó a 70 �C durante 2 horas. La solución se enfri� a temperatura ambiente, se purificó utilizando una HPLC Gilson de Fase Inversa para dar el compuesto 40. �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 8,06 (d, J=9,2 Hz, 1H), 7,48 (d, J=6,4 Hz, 1H) 7,43 (s, 1H), 7,35 (s, 1H), 7,04 (d, J=8,5 Hz, 1H), 5,98 (m, 1H), 5,95 (m,

35 1H), 5,60 (d, 2H), 5,44 (s, 1H), 5,33 (dd, 1H), 5,17 (t, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,52 (d, J=9,4, 1H), 4,56 (t, 1H), 4,47 (d, 2H), 4,27 (s, 1H), 4,24 (m, 3H), 3,94 (s, 3H), 2,66 (m, 1H), 2,58 (m, 1H), 2,37 (m, 1H), 2,14 (m, 1H), 1,64 (m, 6H), 1,33 (d, 6H), 1,20 (t, 3H), 1,29 (d, 6H), 1,04 (s, 9H). 31P (75 MHz, CD3OD): δ 53,060, 57,414.

5 El ácido difosf�nico (65 mg, 0,08 mmol) se suspendió en 1,5 ml de dimetil-formamida. Se agregaron benzoato de cloro-metilo (113 mg, 0,81 mmol), trietil-amina (167 μl, 1,20 mmol), y yoduro de tetrabutil-amonio (TBAI) (7 mg, 0,02 mmol). La solución se calentó a 70 �C durante 3 horas. La solución se enfri� a temperatura ambiente, se purificó utilizando una HPLC Gilson de Fase Inversa para dar el compuesto 41 (20 mg, 27 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 8,08 (dd, 2H), 7,63 (d, J=7,3 Hz, 1H), 7,48 (d, J=6,4 Hz, 1H) 7,42 (s, 1H), 7,35 (s, 1H), 7,04 (d, J=9,1 Hz,

10 1H), 5,98 (m, 1H), 5,95 (m, 1H), 5,60 (d, 2H), 5,44 (s, 1H), 5,33 (d, 1H), 5,18 (d, J=9,1 Hz, 1H), 5,14 (d, J=9,1, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,52 (d, J=9,4, 1H), 4,56 (d, 1H), 4,27 (s, 1H), 3,94 (s, 3H), 2,66 (m, 1H), 2,58 (m, 1H), 2,37 (m, 1H), 2,14 (m, 1H), 1,64 (m, 6H), 1,33 (d, 6H), 1,04 (s, 9H). 31P (75 MHz, CD3OD): δ 52,994, 57,542.

A una solución del di�cido (0,448 g, 6,10 mmol) en 6 ml de CH2Cl2 a 0 �C, se le agregó cloruro de oxalilo (0,55 ml, 0,122 moles), y una cantidad catalítica de dimetil-formamida (150 μl). La mezcla de reacción se agit� a 0 �C durante 20 1 hora, y se calentó a temperatura ambiente durante 1 hora. El disolvente se removió en un evaporador giratorio, se co-evapor� con tolueno, y se secó al vacío para dar un sólido amarillo pálido, el cual se disolvió en 8 ml de CH2Cl2, y se enfri� a -15 �C. Se agregaron trietil-amina (0,43 ml, 30,50 mmol) y fenol (0,574 g, 61,00 mmol). La mezcla de reacción se agit� a -15 �C durante 1 hora, y se calentó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se vertió en NH4Cl acuoso, y se extrajo con CH2Cl2 (tres veces). Las capas orgánicas se lavaron con H2O,

25 se secaron con Na2SO4, se filtraron, y se concentraron. El producto crudo se purificó mediante cromatograf�a en columna sobre gel de sílice (3% de MeOH/CH2Cl2), para dar el fosfonato de difenilo 42 (0,360 g, 67 %, mezcla diaestereom�rica de 1:1) como un sólido grisáceo: �H RMN (CDCl3) δ 8,06 (m, 3H), 7,50 (m, 5H), 7,30-7,03 (m, 11H), 5,93 (m, 1H), 5,36 (m, 2H), 5,02 (m, 1H), 4,80 (m, 1H), 4,50-4,30 (m, 2H), 4,00 (s, 3H), 2,95 (m, 1H), 2,45 (m, 1H), 2,20 (m, 1H), 1,82-1,50 (m, 12H), 1,00 (s, 9H); 31P RMN (CDCI3) δ 16,18, 15,49.

30 LC/MS: 888 (M+ + 1).

Ejemplo 43: Preparación del compuesto 43.

A una solución de fosfonato de difenilo 42 (25 mg, 0,028 mmol) en 3 ml de solventes (1:1 de CH3CN/H2O) a temperatura ambiente, se le agregó LiOH (10 mg, 0,42 mmol). La mezcla de reacción se agit� a temperatura ambiente durante la noche, se acidific� con HCl 6 N, y se concentr�. El producto crudo se purificó mediante HPLC Gilson (0,1 % de TFA/CH3CN/H2O), para dar el fosfonato de mono-fenilo 43 (13 mg, 60 %) como un sólido blanco: �H RMN (CD3OD) δ 8,37 (m, 1H), 8,09 (m, 2H), 7,78 (m, 3H), 7,63 (m, 1H), 7,54 (m, 1H), 7,40 (m, 1H), 7,24 (m, 4H), 7,05 (m, 1H), 6,01 (m, 1H), 5,80 (m, 1H), 5,25 (m, 1H), 5,02 (m, 1H), 4,70 (m, 2H), 4,50 (m, 1H), 4,05 (m, 3H), 2,76 (m, 1H), 2,45 (m, 1H), 2,15 (m, 1H), 1,70-1,30 (m, 12H), 1,00 (m, 9H); 31P RMN (CD3OD) δ 16,69. LC/MS: 811 (M+ + 1).

A una solución del di�cido (0,15 g, 0,20 mmol) en 2 ml de CH2Cl2 a 0 �C, se le agregaron cloruro de oxalilo (0,36 ml, 4,00 mmol), y una cantidad catalítica de dimetil-formamida (70 μl). La mezcla de reacción se agit� a 0 �C durante 1 hora, y se calentó a temperatura ambiente durante 1 hora. El disolvente se removió en un evaporador giratorio, se co-evapor� con tolueno, y se secó al vacío para dar un sólido amarillo pálido, el cual se disolvió en 8 ml de CH2Cl2, y se enfri� a 0 �C. Se agregaron trietil-amina (0,14 ml, 1,00 mmol) y metanol (1,00 ml). La mezcla de reacción se agit� a -15 �C durante 0,5 horas, y se calentó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reacción se vertió en NH4Cl acuoso, y se extrajo con EtOAc (tres veces). Las capas orgánicas se lavaron con H2O, se secaron con Na2SO4, se filtraron, y se concentraron. El producto crudo se purificó mediante cromatograf�a en columna sobre gel de sílice (3 % de MeOH/CH2Cl2), para dar el fosfonato de dimetilo 44 (0,132 g, 85 %) como un sólido blanco: �H RMN (CDCl3) δ 8,05 (m, 2H), 7,50 (m, 5H), 7,02 (m, 2H), 6,00 (m, 1H), 5,36 (m, 2H), 5,10-4,90 (m, 2H), 4,70 (m, 1H), 4,50-4,30 (m, 1H), 3,98 (s, 3H), 3,70 (m, 6H), 3,00 (m, 2H), 2,45 (m, 1H), 2,00 (m, 1H), 1,80-1,40 (m, 12H), 1,00 (s, 9H); 31P RMN (CDCl3) δ 25,67. LC/MS: 863 (M+ + 1).

Ejemplo 45: Preparación del compuesto 45.

A una solución del fosfonato de dimetilo 44 (0,11 g, 0,14 mmol) en 3 ml de solventes (1:1 de CH3CN/H2O) a temperatura ambiente, se le agregó NaOH (0,11 g, 2,80 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 50 �C, y se agit� durante la noche, se acidific� con HCl 6 N, y se concentr�. El producto crudo se purificó mediante HPLC Gilson (0,1 % de TFA/CH3CN/H2O), para dar el fosfonato de monometilo 45 (70 mg, 68 %) como un sólido blanco: �H RMN (CD3OD) δ 8,37 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 8,10 (m, 2H), 7,78 (m, 3H), 7,66 (s, 1H), 7,50 (m, 1H), 7,37 (m, 1H), 6,00 (m, 1H), 5,80 (s, amplia, 1H), 5,20 (m, 1H), 5,08 (m, 1H), 4,70 (m, 2H), 4,47 (m, 1H), 4,18 (m, 1H), 4,00 (s, 3H), 3,70 (m, 3H), 2,80 (m, 1H), 2,45 (m, 1H), 2,05 (m, 1H), 1,60-1,30 (m, 12 H), 1,00 (s, 9H); 31P RMN (CD3OD) δ 22,49. LC/MS: 749 (M+ + 1).

Ejemplo 46: Preparación del compuesto 46.

Una solución del fosfonato de mono-metilo 45 (50 mg, 0,07 mmol) en 0,3 ml de CH3CN, se trat� con NaOH 1,0 N (0,14 ml, 0,14 mmol), y se agit� a temperatura ambiente durante 0,5 horas y se liofilizó. La sal de sodio se suspendió en 1,0 ml de N-metil-pirrolidinona, y se calentó a 70 �C. Se agregaron trietil-amina (37 μl, 0,27 mmol) y POCCl. La mezcla de reacción se agit� a 70 �C durante 2 horas, se enfri� a temperatura ambiente, y se concentr�. El producto crudo se purificó mediante Gilson (CH3CN/H2O) para dar el fosfonato de monometil-mono-POC 46 (8mg, 13%, mezcla diaestereom�rica de 1:1) como un sólido blanco: �H RMN (CDCl3) δ 8,10 (m, 2H), 7,58-7,23 (m, 5H), 7,06 (m, 2H), 6,00 (m, 1H), 5,65 (m, 2H), 5,30 (m, 2H), 5,17 (m, 1H), 5,00 (s, amplia, 1H), 4,90-4,60 (m, 2H), 4,40 (m, 1H), 4,00 (s, 3H), 3,80 (m, 3H), 2,95 (m, 1H), 2,40 (m, 1H), 2,05 (m, 1H), 1,80-1,40 (m, 12H), 1,20 (m, 6H), 1,00 (s, 9H); 31P RMN (CDCl3) δ 23,83, 23,23. LC/MS: 865 (M+ + 1).

A una solución del di�cido (0,50 g, 0,68 mmol) en 10 ml de CH2Cl2 a 0 �C, se le agregaron cloruro de oxalilo

10 (1,22 ml, 13,60 mmol), y una cantidad catalítica de dimetil-formamida (180 μl). La mezcla de reacción se agit� a 0 �C durante 0,5 horas, y se calentó a temperatura ambiente durante 0,5 horas. El disolvente se removió en un evaporador giratorio, se co-evapor� con tolueno, y se secó al vacío para dar el dicloridato como un sólido amarillo pálido, el cual se disolvió en 5 ml de CH2Cl2, y se enfri� a -15 �C. Se agregaron trietil-amina (0,47 ml, 3,40 mmol) y fenol (0,64 g, 6,80 mmol). La mezcla de reacción se agit� a-15 �C durante 0,5 horas, y se calentó a temperatura

15 ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se vertió en NH4Cl acuoso, y se extrajo con EtOAc (tres veces). Las capas orgánicas se lavaron con H2O, se secaron con Na2SO4, se filtraron, y se concentraron. El producto crudo se purificó mediante cromatograf�a en columna sobre gel de sílice (3 % de MeOH/CH2Cl2), para dar el fosfonato de difenilo 47 (0,392 g, 65 %) como un sólido blanco: �H RMN (CDCl3) δ 8,06 (m, 3H), 7,50 (m, 3H), 7,30-7,03 (m, 13H), 5,93 (m, 1H), 5,36 (m, 2H), 5,02 (m, 1H), 4,80 (m, 1H), 4,50-4,30 (m, 2H), 4,00 (s, 3H), 2,95 (m, 1H), 2,45 (m, 1H),

20 2,20 (m, 1H), 1,82-1,50 (m, 12H), 1,00 (s, 9H); 31P RMN (CDCI3) δ 16,10. LC/MS: 888 (M+ + 1).

Ejemplo 48: Preparación del compuesto 48.

A una solución del fosfonato de difenilo (0,392 g, 0,44 mmol) en 6 ml de solventes (1:1 de CH3CN/H2O) a

25 temperatura ambiente, se le agregó LiOH (0,11 g, 4,40 mmol). La mezcla de reacción se agit� a temperatura ambiente durante la noche, se acidific� con HCl 6 N, y se concentr�. El producto crudo se purificó mediante HPLC Gilson (0,1 % de TFA/CH3CN/H2O), para dar el fosfonato de mono-fenilo 48 (0,197 g, 55 %) como un sólido blanco: �H RMN (CD3OD) δ 8,37 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 8,09 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 7,78 (m, 3H), 7,63 (s, 1H), 7,50 (m, 1H), 7,40 (m, 1H), 7,24 (m, 4H), 7,05 (m, 1H), 6,01 (m, 1H), 5,80 (m, 1H), 5,25 (m, 1H), 5,02 (m, 1H), 4,70 (m, 2H), 4,50 (m,

30 1H), 4,20 (s, 1H), 4,05 (s, 3H), 2,86 (m, 1H), 2,45 (m, 1H), 2,15 (m, 1H), 1,70-1,30 (m, 12H), 1,00 (s, 9H); 31P RMN (CD3OD) δ 17,08. LC/MS: 811 (M+ + 1).

Ejemplo 49: Preparación del compuesto 49.

35 A una solución del fosfonato de monofenilo 48 (85 mg, 0,10 mmol), y (S)-(-)-lactato de etilo en 1 mililitro de dimetilformamida, se le agregaron PyBOP (0,273 g, 0,52 mmol), trietil-amina (73 μl, 0,52 mmol), y DMAP (3 miligramos). La mezcla de reacción se agit� a temperatura ambiente durante 4 horas, y el disolvente se removió en un evaporador giratorio. La mezcla de reacción se vertió en NH4Cl acuoso, y se extrajo con EtOAc (tres veces). El producto se dividió entre EtOAc (tres veces) y salmuera, y la capa orgánica se concentr�. El producto crudo se purificó mediante

40 una Gilson (CH3CN/H2O), para dar el mono-lactato 49 (60 mg, 63 %, mezcla diaestereom�rica de 1:4, GS 331031) como un sólido grisáceo: �H RMN (CDCl3) δ 8,06 (m, 3H), 7,50 (m, 4H), 7,30 (m, 4H), 7,06 (m, 3H), 5,93 (m, 1H), 5,36 (m, 2H), 5,02 (m, 2H), 4,80 (m, 1H), 4,50-4,30 (m, 2H), 4,08-3,95 (m, 5H), 2,98 (m, 1H), 2,45 (m, 1H), 2,20 (m, 1H), 1,82-1,50 (m, 15H), 1,30-1,00 (m, 12H); 31P RMN (CDCl3) δ 19,72, 19,48. LC/MS: 911 (M+ + 1).

45 A una solución del di�cido (0,10 g, 0,14 mmol) en 1 mililitro de CH2Cl2 a 0 �C, se le agregaron cloruro de oxalilo (0,25 ml, 2,80 mmol), y una cantidad catalítica de dimetil-formamida (50 μl). La mezcla de reacción se agit� a 0 �C durante 0,5 horas, y se calentó a temperatura ambiente durante 0,5 horas. El disolvente se removió en un evaporador giratorio, se co-evapor� con tolueno, y se secó al vacío, para dar el dicloridato como un sólido amarillo pálido, el cual se disolvió en 1,0 ml de CH2Cl2, y se enfri� a -15 �C. Se agregaron trietil-amina (95 μl, 0,40 mmol) y 2etoxi-fenol (0,188 g, 1,40 mmol). La mezcla de reacción se agit� a -15 �C durante 0,5 horas, y se calentó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se vertió en NH4Cl acuoso, y se extrajo con 15 % de MeOH/CH2Cl2 (tres veces). Las capas orgánicas se lavaron con H2O, y se concentraron. El producto crudo se purificó mediante una Gilson (0,1 % de TFA/MeCN/H2O) para dar el mono-ácido de 2-etoxi-fenilo 50 (23 mg, 20 %) como un sólido blanco; �H RMN (CD3OD) δ 8,37 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 8,09 (d, J = 6,3 Hz, 2H), 7,78 (m, 2H), 7,63 (s, 1H), 7,50 (m, 1H), 7,40 (m, 2H), 7,00-6,75 (m, 4H), 6,00 (m, 1H), 5,80 (s, amplia, 1H), 5,25 (m, 1H), 5,02 (m, 1H), 4,70 (m, 2H), 4,50 (m, 1H), 4,05 (m, 5H), 2,70 (m, 1H), 2,55 (m, 1H), 2,20 (m, 1H), 1,70-1,30 (m, 15H), 1,00 (s, 9H); 31P RMN (CD3OD) δ 16,68. LC/MS: 855 (M+ + 1).

Ejemplos 51 y 52: Preparación de los compuestos 51 y 52.

A una solución del di�cido (0,30 g, 0,41 mmol) en 3 ml de CH2Cl2 a 0 �C, se le agregaron cloruro de oxalilo (0,74 ml, 8,20 mmol), y una cantidad catalítica de dimetil-formamida (100 μl). La mezcla de reacción se agit� a 0 �C durante 0,5 horas, y se calentó a temperatura ambiente durante 0,5 horas. El disolvente se removió en un evaporador giratorio, se co-evapor� con tolueno, y se secó al vacío, para dar el dicloridato como un sólido amarillo pálido, el cual se disolvió en 2,0 ml de CH2Cl2, se enfri� a 0 �C, y se trat� lentamente con piridina (67 μl, 0,82 mmol). La solución fría anterior se agregó entonces lentamente a una solución a -78 �C del diol (0,23 g, 1,23 mmol) y trietil-amina (0,40 ml, 2,87 mmol) en 1,0 ml de CH2Cl2, seguido por la adición de DMAP (10 miligramos). La mezcla de reacción se agit� a -78 �C durante 0,5 horas, se calentó a 0 �C durante 1 hora, y luego se calentó a temperatura ambiente y se agit� durante la noche. La mezcla de reacción se vertió en NH4Cl acuoso, y se extrajo con CH2Cl2 (tres veces). Las capas orgánicas se lavaron con salmuera, se secaron con Na2SO4, se filtraron, y se concentraron. El producto crudo se purificó mediante cromatograf�a en columna sobre gel de sílice (2 % de MeOH/CH2Cl2), para dar el isómero A, compuesto 51 (50 mg, 14 %), y el isómero B, compuesto 52 (50 mg, 14 %). �H RMN (CD3OD) para el compuesto

51: δ 8,10 (m, 3H), 7,57 (m, 4H), 7,38 (m, 4H), 7,23 (s, 1H), 7,05 (m, 1H), 6,70 (m, 1H), 5,95 (m, 2H), 5,57 (s, amplia, 1H), 5,30 (m, 1H), 5,10 (m, 1H), 4,85 (m, 1H), 4,70 (m, 1H), 4,60 (m, 2H), 4,30 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 4,00 (m, 4H), 2,75 (m, 1H), 2,30 (m, 2H), 2,10 (m, 1H), 1,60 (m, 12H), 1,00 (s, 9H); 31P RMN (CD3OD) δ 15,98. LC/MS: 885 (M+ + 1). �H RMN (CD3OD) para el compuesto 52: δ 8,10 (m, 3H), 7,57 (m, 4H), 7,38 (m, 4H), 7,23 (s, 1H), 7,05 (m, 1H), 6,70 (m, 1H), 5,95 (m, 1H), 5,58 (m, 2H), 5,30 (m, 1H), 5,10 (m, 1H), 4,70 (m, 1H), 4,60 (m, 2H), 4,30 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 4,00 (m, 4H), 2,70 (m, 1H), 2,50-2,08 (m, 3H), 1,60 (m, 12H), 1,00 (s, 9H); 31P RMN (CD3OD) δ 23,19. LC/MS: 885 (M+ + 1).

5 Una solución del di�cido (0,20 g, 0,27 mmol) en 1,0 ml de CH3CN, se trat� con NaOH 1,0 N (0,55 ml, 0,55 mmol), y se agit� a temperatura ambiente durante 0,5 horas, y se liofilizó. La sal de sodio se suspendió en 2,0 ml de N-metilpirrolidinona, y se calentó a 70 �C. Se agregaron trietil-amina (0,15 ml, 1,08 mmol) y POCCl (0,415 g, 2,70 mmol). La mezcla de reacción se agit� a 70 �C durante 2 hora, se enfri� a temperatura ambiente, y se concentr�. El producto crudo se purificó mediante una Gilson (0,1 % de TFA/CH3CN/H2O), para dar el compuesto de fosfonato de bis-POC

10 53 (50 mg, 19 %). �H RMN (CDCl3) para el fosfonato de bis-POC: δ 8,05 (m, 3H), 7,50 (m, 4H), 7,30 (m, 1H), 7,03 (m, 1H), 5,97 (m, 1H), 5,65 (m, 4H), 5,40-5,20 (m, 3H), 5,00 (m, 1H), 4,85 (m, 1H), 4,65 (m, 1H), 4,40 (m, 1H), 4,00 (m, 4H), 2,85 (m, 1H), 2,45 (m, 1H), 2,17 (m, 1H), 1,80-1,50 (m, 12H), 1,25 (m, 12H), 1,03 (s, 9H); 31P RMN (CDCl3) δ 21,60.

15 Ejemplo 54: Preparación del compuesto 54.

A partir de la mezcla de reacción mencionada para el Ejemplo 53, se aisl� el fosfonato de mono-POC mediante una Gilson (0,1 % de TFA/CH3CN/H2O), para dar el 54. LC/MS: 967 (M+ + 1). �H RMN (CD3OD) para el fosfonato de mono-POC: δ 8,40 (m, 1H), 8,05 (m, 2H), 7,75 (m, 3H),

20 7,65 (s, 1H), 7,55 (m, 1H), 7,40 (m, 1H), 6,00 (m, 1H), 5,82 (s, amplia, 1H), 5,60 (m, 1H), 5,20-5,00 (m, 2H), 4,954,50 (m, 4H), 4,20-4,00 (m, 4H), 2,80 (m, 1H), 2,60 (m, 1H), 2,10 (m, 1H), 1,65 (m, 12H), 1,2 (m, 6H), 1,00 (s, 9H); 31P RMN (CD3OD) δ 17,59. LC/MS: 851 (M+ + 1).

25 Ejemplo 55: Preparación del compuesto 55.

Una solución del di�cido (0,15 g, 0,19 mmol) en 1,0 ml de CH3CN, se trat� con NaOH 1,0 N (0,38 ml, 0,38 mmol), y

30 se agit� a temperatura ambiente durante 0,5 horas, y se liofilizó. La sal de sodio se suspendió en 1,5 ml de N-metilpirrolidinona, y se calentó a 70 �C. Se agregaron trietil-amina (0,10 ml, 0,76 mmol) y POCCl (0,286 g, 1,90 mmol). La mezcla de reacción se agit� a 70 �C durante 2 horas, se enfri� a temperatura ambiente, y se concentr�. El producto crudo se purificó mediante una Gilson (0,1 % de TFA/CH3CN/H2O), para dar el fosfonato de bis-POC 55 (35 mg, 18 %) como un sólido amarillo pálido: �H RMN (CDCl3) δ 8,00 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 7,50-7,40 (m, 3H), 7,05 (m, 1H),

35 6,00 (m, 1H), 5,70 (m, 4H), 5,45-5,20 (m, 3H), 4,90 (m, 2H), 4,63 (m, 1H), 4,40 (m, 2H), 4,00 (m, 4H), 3,90 (m, 1H), 2,90 (m, 1H), 2,45 (m, 1H), 2,20 (m, 1H), 1,80 (m, 12H), 1,40 (m, 18H), 1,00 (s, 9H); 31P RMN (CDCl3) δ 21,55. LC/MS: 1032 (M+ + 1).

5 El di�cido (50 mg, 0,06 mmol) en 1,0 ml de N-metil-pirrolidinona, se trat� con carbonato de cesio (82 mg, 0,25 mmol), y se calentó a 70 �C. Se agregó POCCl (48 mg, 0,31 mmol). La mezcla de reacción se agit� a 70 �C durante 2 horas, se enfri� a temperatura ambiente, y se concentr�. El producto crudo se purificó mediante una Gilson (0,1 % de TFA/CH3CN/H2O), para dar el fosfonato de mono-POC 56 (11 mg, 19 %, GS 330334), como un sólido amarillo pálido: �H RMN (CD3OD) δ 8,30 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 8,20 (s, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,35 (m, 1H), 6,00 (m,

10 1H), 5,80 (m, 1H), 5,60 (m, 2H), 5,30 (m, 1H), 5,10 (m, 1H), 4,85 (m, 1H), 4,60 (m, 3H), 4,20 (m, 2H), 4,00 (s, 3H), 2,80 -2,60 (m, 2H), 2,10 (m, 1H), 1,60 (m, 12H), 1,40-1,20 (m, 12H), 1,00 (s, 9H); 31P RMN (CD3OD) δ 18,70. LC/MS: 915 (M+ +1).

A una solución del di�cido (0,26 g, 0,36 mmol) en 3 ml de CH2Cl2 a 0 �C, se le agregaron cloruro de oxalilo (0,65 ml, 7,20 mmol), y una cantidad catalítica de dimetil-formamida (100 μl). La mezcla de reacción se agit� a 0 �C durante 20 0,5 horas, y se calentó a temperatura ambiente durante 0,5 horas. El disolvente se removió en un evaporador giratorio, se co-evapor� con tolueno, y se secó al vacío, para dar el dicloridato como un sólido amarillo pálido, el cual se disolvió en 3 ml de CH2Cl2, y se enfri� a -15 �C. Se agregaron trietil-amina (0,50 ml, 3,60 mmol) y fenol (0,338 g, 3,60 mmol). La mezcla de reacción se agit� a -15 �C durante 0,5 horas, y se calentó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se vertió en NH4Cl acuoso, se extrajo con EtOAc (tres veces), y se concentr�, para

25 dar el fosfonato de difenilo como el producto crudo, el cual se llev� adelante para la reacción del siguiente paso sin purificación.

A una solución del fosfonato de difenilo crudo en 4 ml de solventes (1:1 de CH3CN/H2O) a temperatura ambiente, se le agregó NaOH (0,143 g, 3,60 mmol). La mezcla de reacción se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora, se 30 acidific� con HCl 6 N, y se concentr�. El producto crudo se purificó mediante una HPLC Gilson (0,1 % de TFA/CH3CN/H2O), para dar el fosfonato de mono-fenilo 57 (0,129 g, 45 %) como un sólido amarillo pálido: �H RMN (CD3OD) δ 8,40 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 8,10 (m, 2H), 7,80 (m, 3H), 7,60 (s, 1H), 7,55 (s, amplia, 1H), 7,40 (m, 1H), 7,20 (m, 4H), 7,00 (m, 1H), 5,80 (s, 1H), 4,80 (m, 1H), 4,67 (m, 1H), 4,55 (s, amplia, 1H), 4,40 (m, 1H), 4,20 (s, 1H), 4,00 (s, 3H), 2,70 (m, 1H), 2,43 (m, 1H), 1,90-1,60 (m, 14H), 1,00 (s, 9H), 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 3H); 31P RMN (CD3OD) δ

35 17,67. LC/MS: 801 (M+ + 1).

Ejemplo 58: Preparación del compuesto 58.

A una solución del fosfonato de mono-fenilo (0,10 g, 0,12 mmol) y (S)-(-)-lactato de etilo (0,148 g, 1,20 mmol) en 1 mililitro de dimetil-formamida, se le agregaron PyBop (0,325 g, 0,60 mmol), trietil-amina (87 μl, 0,60 mmol), y DMAP (3 miligramos). La mezcla de reacción se agit� a temperatura ambiente durante 3 horas, y el disolvente se removió en un evaporador giratorio. La mezcla de reacción se vertió en NH4Cl acuoso, y se extrajo con EtOAc (tres veces). La capa orgánica se lav� con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtr�, y se concentr�. El producto crudo se purificó mediante cromatograf�a en columna sobre gel de sílice (3 % de MeOH/CH2Cl2), para dar el mono-lactato 58 (28 mg, 25 %) como un sólido grisáceo: �H RMN (CDCl3) δ 8,10 (m, 2H), 7,50 (m, 3H), 7,40-7,00 (m, 9H), 5,40 (m, 2H), 5,00 (s, 1H), 4,90 (m, 1H), 4,70 (m, 2H), 4,40 (m, 2H), 4,10 (m, 1H), 4,00 (m, 4H), 2,65-2,40 (m, 2H), 2,00-1,50 (m, 14H), 1,30 (m, 4H), 1,10-0,97 (m, 12H); 31P RMN (CDCl3) δ 22,38. LC/MS: 901 (M+ + 1).

A una solución del fosfonato de mono-fenilo del Ejemplo 57 (30 mg, 0,04 mmol), y clorhidrato de isopropil-éster de Lalanina (50 mg, 0,30 mmol) en 0,5 ml de dimetil-formamida, se le agregaron PyBop (84 mg, 0,19 mmol), trietil-amina (52 μl, 0,37 mmol), y DMAP (3 miligramos). La mezcla de reacción se agit� a temperatura ambiente durante 4 horas, y el disolvente se removió en un evaporador giratorio. El residuo se disolvió en EtOAc, y se vertió en NH4Cl acuoso. El producto se extrajo con EtOAc (tres veces), y se concentr�. El producto crudo se purificó mediante una Gilson (CH3CN/H2O), para dar el mono-fosfoamidato 59 (5 mg, 15 %) como un sólido blanco: �H RMN (CDCl3) δ 8,05 (m, 3H), 7,50 (m, 4H), 7,24 (m, 4H), 7,06 (m, 3H), 5,40 (m, 2H), 5,00-4,80 (m, 2H), 4,40 (m, 2H), 4,10-3,90 (m, 4H), 3,45 (m, 1H), 2,80 (m, 1H), 2,50 (m, 1H), 1,90-1,45 (m, 14H), 1,30 (m, 6H), 1,10 (m, 3H), 1,05 (s, 9H), 0,96 (m, 3H); 31P RMN (CDCl3) δ 25,48. LC/MS: 914 (M+ + 1).

Una solución del ácido fosf�nico (10 mg, 0,001 mmol) en 0,2 ml de CH3CN, se trat� con NaOH 1,0 N (50 μl, 0,004 mmol), y se agit� a temperatura ambiente durante 0,5 horas, y se liofilizó. La sal de sodio se suspendió en 0,3 ml de N-metil-pirrolidinona, y se calentó a 70 �C. Se agregaron trietil-amina (7 μl, 0,004 mmol) y POCCl (19 mg, 0,01 mmol). La mezcla de reacción se agit� a 60 �C durante 1 hora, se enfri� a temperatura ambiente, y se concentr�. El producto crudo se purificó mediante una Gilson (0,1 % de TFA/CH3CN/H2O), para dar el fosfinato de POC 60 (4,5 mg, 39 %, mezcla diaestereom�rica de 1:1), como un sólido amarillo pálido: �H RMN (CD3OD) δ 8,25 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 8,20 (s, 1H), 7,76 (s, 2H), 7,30 (m, 1H), 6,00 (m, 1H), 5,80-5,60 (m, 2H), 5,30 (m, 1H), 5,17 (m, 1H), 4,60 (m, 2H), 4,45 (m, 1H), 4,20 (m, 2H), 4,00 (s, 3H), 2,78 (m, 1H), 2,40 (m, 1H), 2,17 (m, 1H), 1,60 (m, 12H), 1,30 (m, 14H), 1,02 (m, 12H); 31P RMN (CDCl3) δ 57,17, 52,94. LC/MS: 913 (M+ + 1).

5 A una solución del precursor de di�cido fosf�nico (200 mg, 0,250 mmol) en 3 ml de piridina, se le agregó el metaciano-fenol (350 mg, 2,5 mmol). La mezcla de la solución se calentó a 60 �C en un baño de aceite durante 10 minutos. A la solución de ácido se le agregó diciclohexil-carbodi-imida (310 mg, 1,50 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 60 �C durante 2 horas utilizando un baño de aceite. Entonces la mezcla de reacción se enfri� a temperatura ambiente, y el disolvente se removió bajo presión reducida. La mezcla cruda se disolvió en acetato de

10 etilo, y se extrajo con bicarbonato de sodio saturado seguido por salmuera. Los orgánicos se separaron y se secaron sobre MgSO4, se filtraron, y el disolvente se removió bajo presión reducida. La mezcla cruda se purificó mediante cromatograf�a en gel de sílice (eluida con del 0 % al 10 % de metanol/dicloro-metano). El material purificado se volvió a purificar entonces mediante HPLC de preparación en fase inversa (ACN/agua), para proporcionar el 61 como un sólido amarillo (42 mg, 17 %). 1H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 8,85 (s, 1H), 8,18 (d, J=9,1 Hz, 1H), 7,91 (s,

15 1H), 7,78 (s, 1H), 7,28 (s a, 10H), 5,92 (m, 2H), 5,37 (d, J= 17,1, 1H), 5,13 (m, 2H), 4,85-4,40 (s a, 3H), 4,14 (d, J=9,2 Hz 1H), 4,02 (s, 3H), 2,98 (m, 1H), 2,77 (m, 1H), 2,23 (q, J=8,7 Hz, 1H), 1,85-1,63 (s a, 7H), 1,48 (d, J=6,4 Hz, 6H), 1,35 (m, 5H), 0,94 (s, 9H). 31P RMN (300 MHz, CDCl3): δ ppm: 17,76 (s, 1P). LC/MS: 1001 (M++1).

A una solución del precursor de di�cido fosf�nico (100 mg, 0,125 mmol) en 1,5 ml de piridina, se le agregó el meta

cloro-fenol (160 mg, 1,25 mmol). La mezcla de la solución se calentó a 60 �C en un baño de aceite durante 10 25 minutos. A la solución de ácido se le agregó diciclohexil-carbodi-imida (154 mg, 0,75 mmol). La mezcla de reacción

se calentó a 60 �C durante 2 horas utilizando un baño de aceite. La mezcla de reacción se enfri� a temperatura

ambiente, y el disolvente se removió bajo presión reducida. La mezcla cruda se disolvió en acetato de etilo, y se

extrajo con bicarbonato de sodio saturado seguido por salmuera. Los orgánicos se separaron y se secaron sobre

MgSO4, se filtraron, y el disolvente se removió bajo presión reducida. La mezcla cruda se purificó mediante 30 cromatograf�a en gel de sílice (eluida con del 0 % al 10 % de metanol/dicloro-metano). El material purificado se

volvi� a purificar entonces mediante HPLC de preparación en fase inversa (ACN/agua), para proporcionar el 62

como un sólido amarillo (15 mg, 12 %). 1Η RMN (300 MHz, CDCl3): δ 8,84 (s, 1H), 8,21 (d, J=9,1 Hz, 1H), 7,91 (s,

1H), 7,77 (d, J= 10,7 Hz, 1H), 7,52-7,45 (s a, 10H), 7,23 (m, 1H), 5,78 (m, 2H), 5,37 (d, J=16,8, 1H), 5,19 (d, J=9,2

Hz, 1H), 5,11 (d, J= 11 Hz, 1H), 4,82 (t, J=9,6 Hz, 1H), 4,68 (m, 1H), 4,20 (m, 1H), 4,01 (s, 3H), 3,92 (d, J= 11 Hz), 35 3,58 (m, 2H), 3,01 (m, 1H), 2,60 (m, 1H), 2,22 (q, J=8,3 Hz, 1H), 1,88 (m, 1H), 1,67-1,26 (s a, 13H), 0,94 (s, 9H). 31P

RMN (300 MHz, CDCl3): δ ppm: 16,78 (s, 1P). LC/MS: 1019 (M+ + 1).

5 A una solución del compuesto 62 (50 mg, 0,049 mmol) en 3 ml de ACN a 0 �C, se le agregó 1 mililitro de NaOH 1,0 M en agua. La mezcla de la solución se dej� llegar hasta la temperatura ambiente, y se agit� durante 2 horas. La mezcla de reacción se ajust� a un pH = 2 con HCl al 10 % en agua. La mezcla cruda se diluyó con acetato de etilo, y se extrajo con HCl al 10 % en agua, seguido por salmuera. Los orgánicos se separaron y se secaron sobre MgSO4, se filtraron, y el disolvente se removió bajo presión reducida. La mezcla cruda se purificó mediante HPLC de

10 preparación en fase inversa (ACN/agua), para proporcionar el 63 como un sólido amarillo (13 mg, 30 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 8,12 (m, 2H), 7,58-7,36 (s a, 4H), 7,19-6,94 (s a, 5H), 6,77 (m, 1H), 6,11 (m, 1H), 5,46 (m 1H), 5,22 (d, J=19 Hz, 1H), 4,99 (d, J= 11,9 Hz, 1H), 4,75-4,44 (s a, 3H), 4,28-3,92 (s a, 7H), 3,16 (m, 1H), 2,62 (m, 1H), 2,35 (m, 1H), 2,08 (m, 1H), 1,90-1,30 (s a, 21H), 1,04 (s, 9H), 0,97 (m, 2H). 31P RMN (300 MHz, CD3OD): δ ppm: 13,75 (s, 1P). LC/MS: 909 (M+ + 1).

20 A una solución del 61 (50 mg, 0,049 mmol) en 3 ml de ACN a 0 �C, se le agregó 1 mililitro de NaOH 1,0 M en agua. La mezcla de la solución se dej� llegar hasta la temperatura ambiente, y se agit� durante 2 horas. La mezcla de reacción se ajust� a un pH = 2 con HCl al 10 % en agua. La mezcla cruda se diluyó en acetato de etilo, y se extrajo con HCl al 10 % en agua, seguido por salmuera. Los orgánicos se separaron y se secaron sobre MgSO4, se filtraron, y el disolvente se removió bajo presión reducida. La mezcla cruda se purificó mediante HPLC de preparación en fase

25 inversa (ACN/agua), para proporcionar el 64 como un sólido amarillo (6 mg, 13 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 8,25 (d, J=9,1 Hz, 1H), 8,06 (m, 2H), 7,73-7,24 (s a, 5H), 6,77 (d, J= 7,9 Hz, 1H), 6,01 (m, 1H), 5,65 (m, 1H), 5,20 (d, J=17,7 Hz, 1H), 4,94 (m, 2H), 4,63-4,23 (s a, 3H), 4,12-3,98 (s a, 7H), 3,64 (s, 1H), 2,65-2,12 (s a, 3H), 1,92-0,99 (s a, 15H). 31P RMN (300 MHz, CD3OD): δ ppm:14,45 (s, 1P). LC/MS: 900 (M+ + 1).

5 A una solución del ácido carbox�lico del dip�ptido de amino-tiazol-quinolina (150 mg, 0,229 mmol) en 10 ml de tetrahidrofurano a -50 �C durante 1 hora, se le agregó trietil-amina (81 μl, 0,572 mmol), seguida por cloro-formato de etilo (32 μl, 0,240 mmol). Después de 1 hora, se agregó difenil-fosfonato de amino-vinil-ciclopropilo, y la reacción se calentó a temperatura ambiente lentamente, y se agit� durante la noche. El disolvente se removió bajo presión reducida, y se diluyó con acetato de etilo. La mezcla cruda se extrajo con acetato de etilo y HCl al 10 %, seguido por

10 salmuera. Las capas se separaron, y los orgánicos se secaron sobre MgSO4, se filtraron, y se evaporaron. Luego el material crudo se purificó en HPLC de preparación en fase inversa (ACN/agua), para proporcionar el 65 como un sólido amarillo (65 mg, 30 %). �H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 8,84 (s, 1H), 8,16 (d, J=9,2 Hz, 1H), 7,90 (s, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,63 (s, 1H) 7,33-7,14 (s a, 10H), 5,95 (m, 1H), 5,86 (s, 1H), 5,35 (d, J= 16,4, 1H), 5,13 (m, 2H), 4,87 (t, J= 10,5 Hz, 1H), 4,68 (d, J= 12,8 Hz, 1H), 4,35 (s, 1H), 4,13 (d, J= 9,1 Hz, 1H), 4,01 (s, 3H), 3,92 (d, J= 10,1 Hz, 1H),

15 3,58 (t, J= 6,7 Hz, 1H), 2,98 (m, 1H), 2,63 (m, 1H), 2,27 (q, J=8,7 Hz, 1H), 1,87 (m, 1H), 1,64-1,26 (s a, 8H), 0,93 (s, 9H). 31P RMN (300 MHz, CDCl3): δ ppm: 16,13 (s, 1P). LC/MS: 951 (M+ + 1).

A una solución del 65 (36 mg, 0,038 mmol) en 5 ml de ACN a 0 �C, se le agregaron 0,54 ml de NaOH 1,0 M en agua. La mezcla de la solución se dej� llegar hasta la temperatura ambiente, y se agit� durante 2 horas. La mezcla de 25 reacción se ajust� a un pH = 2 con HCl al 10 % en agua. La mezcla cruda se diluyó en acetato de etilo, y se extrajo con HCl al 10 % en agua, seguido por salmuera. Los orgánicos se separaron y se secaron sobre MgSO4, se filtraron, y el disolvente se removió bajo presión reducida. La mezcla cruda se purificó mediante HPLC de preparación en fase inversa (ACN/agua), para proporcionar el 66 como un sólido amarillo (13 mg, 39 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ ppm: 8,29 (d, J=9,1 Hz, 1H), 8,16 (s, 1H), 7,74 (m, 2H), 7,33-7,10 (s a, 8H), 6,01 (m, 1H) 5,74 (s, 1H), 5,29 (d, J=

30 17,4 Hz, 1H), 5,07 (d, J= 10,4 Hz, 1H), 4,68 (m, 2H), 4,48 (s, 1H), 4,17-4,04 (s a, 7H), 4,13 (d, J= 9,1 Hz, 1H), 2,70 (m, 1H), 2,51 (m, 1H), 2,19 (m, 1H), 1,63-1,33 (s a, 13H), 1,03 (s, 9H), 0,99 (s, 1H). 31P RMN (300 MHz, CD3OD): δ ppm: 17,57 (s, 1P). LC/MS: 875 (M+ + 1).

Ejemplo 67: Preparación del compuesto 67.

Una solución de 125,2 miligramos (164,1 micromoles) del mono-ácido, y 20 μl (258,3 micromoles) de dimetil

5 formamida en dicloro-metano (1,5 ml), se agit� en un baño a 0 �C, a medida que se agregaban por goteo 145 μl (1,66 mmol) de cloruro de oxalilo. Después de agitar durante 30 minutos a 0 �C, la solución se diluyó con tolueno, y se concentr�. El residuo se secó al vacío durante 30 minutos, se disolvió en acetonitrilo (1,5 ml), y se agit� a 0 �C, a medida que se agregaban 99,8 miligramos (823,7 micromoles) de ciclopropil-sulfonamida y 0,13 ml (869,3 micromoles) de DBU. Después de 1 hora a 0 �C, se agregaron 67 μl (869,7 micromoles) de ácido trifluoro-acético a

10 0 �C, y la mezcla se filtr� a través de un filtro de membrana. El filtrado se purificó mediante HPLC de preparación, seguida por cromatograf�a en gel de sílice, utilizando una columna de 12 g, para obtener 64,8 miligramos (46 %) del compuesto 67: �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 8,19-8,26 (m, 1H), 8,05-8,12 (m, 2H), 7,59-7,67 (a, 3H), 7,42-7,48 (a, 2H), 7,23 (br d, J = 9,3 Hz, 1H), 5,95-6,15 (m, 1H), 5,71 (a, 1H), 54,97-5,33 (m, 2H), 4,53-4,67 (m, 2H), 4,25 (a, 1H), 4,02-4,21 (m, 3H), 4,00 (s, 3H), 2,7-2,9 (m, 1H), 2,45-2,7 (m, 2H), 1,27-2,04 (m, 13H), 1,24 (t, J = 6,3 Hz, 3H), 1,5 (s,

15 9H), 0,94-1,00 (m, 1H), 0,79-0,89 (m, 2H); 31P RMN (75 MHz, CD3OD) δ 17,21, 14,83 (#0,9P); LC/MS: 866 (M+ + 1).

Una suspensión de 102,4 miligramos (139,4 micromoles) del di�cido, y 25 μl (323 micromoles) de dimetil-formamida

20 en dicloro-metano (1,5 ml), se agit� a 0 �C, a medida que se agregaban 0,25 ml (2,87 mmol) de cloruro de oxalilo. Después de que se agit� la mezcla durante 30 minutos a 0 �C, y durante 1 hora a temperatura ambiente, se diluyó con tolueno (1 mililitro), y se concentr�. El residuo se disolvió en acetonitrilo, se diluyó con tolueno, y se concentr�. Después de que se secó el residuo al vacío durante 30 minutos, el residuo se disolvió en acetonitrilo (1 mililitro), y se agit� a 0 �C, a medida que se agregaban 17 miligramos (140,3 micromoles) de ciclopropil-sulfonamida. Después de

25 30 minutos, se agregaron 0,1 ml (668,7 micromoles) de DBU. Después de 1,5 horas a 0 �C, se agregaron varias gotas de agua a la mezcla, seguidas por 50 μl (649 micromoles) de ácido trifluoro-acético. La mezcla se filtr� a través de un filtro de membrana, y el filtrado se purificó mediante HPLC de preparación, para obtener 15,0 miligramos (13 %) del compuesto 68: �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 8,38 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 8,07-8,12 (m, 2H), 7,71-7,82 (m, 3H), 7,66 (s, 1H), 7,55 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,38 (dd, J = 9,3 y 2,1 Hz, 1H), 5,98 (dt, J = 17,1 y 10,0 Hz,

30 1H), 5,84 (a, 1H), 5,17 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,02 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 4,65-4,73 (m, 2H), 4,51 (a, 1H), 4,20 (s, 1H), 4,07-4,18 (m, 1H), 4,06 (s, 3H), 3,39-3,52 (m, 1H), 2,77-3,03 (m, 2H), 2,46-2,70 (m, 1H), 1,98-2,13 (m, 1H), 1,32-1,98 (m, 10H), 0,96-1,26 (m, 3H), 1,05 (s, 9H); 31P RMN (75 MHz, CD3OD) δ 12,81; LC/MS: 838 (M+ + 1).

Ejemplo 69: Preparación del compuesto 69.

A una solución del ácido del trip�ptido (75 mg, 0,0983 mmol) en 2 ml de tetrahidrofurano, se le agregó CDI (40 mg,

5 0,246 mmol). La mezcla de la solución se puso a reflujo durante 2 horas. A la mezcla enfriada se le agregó el fosforamidato (49 mg, 0,392 mmol), seguido por DBU (103 μl, 0,69 mmol), y se puso a reflujo durante 2 horas. La mezcla se concentr� al vacío, se disolvió en 1 mililitro de MeOH, y se purificó mediante HPLC en fase inversa (eluida con del 10 % al 75 % de H2O/CH3CN), para dar el 69 como un sólido amarillo (24 mg, 28 %). �H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 8,60-8,45 (m, 1H), 8,10 (d, 1H), 7,83 (s, 1H), 7,65 (s, 1H), 7,60-7,45 (m, 1H), 7,18 (d, 1H), 5,85-5,70 (m,

10 2H), 5,55-5,30 (m, 2H), 5,25 (d, J=18 Hz, 1H), 5,11 (d, J=11,9 Hz, 1H), 4,73-4,50 (m, 3H), 4,22 (d, 1H), 4,10-4,00 (m, 1H), 4,02 (s, 3H), 3,85-3,70 (m, 6H), 3,60-3,50 (m, 1H), 2,78-2,58 (m, 2H), 2,15-2,05 (m, 1H), 2,00-1,85 (m, 1H), 1,80-1,40 (m, 9H), 1,43 (d, J=6,4 Hz, 6H), 1,05 (s, 9H). 31P RMN (300 MHz, CDCl3): δ 0,44. LC/MS: 871 (M+ + 1).

A una solución de ácido (150 mg, 0,197 mmol) en 3 ml de tetrahidrofurano, se le agregó CDI (80 mg, 0,49 mmol). La

mezcla de la solución se puso a reflujo durante 2 horas. A la solución enfriada, se le agregó el fosforamidato 20 (121 mg, 0,79 mmol), seguido por DBU (200 μl, 1,38 mmol), y se puso a reflujo durante 4 horas. La mezcla se

concentr� al vacío, se disolvió en 1 mililitro de MeOH, y se purificó mediante HPLC de fase inversa (eluida con el

10 % al 75 % de H2O/CH3CN), para dar el 70 como un sólido amarillo (60 mg, 34 %). �H RMN (300 MHz, CDCI3): δ

8,70 (s a, 1H), 8,50 (d, 1H), 8,10 (d, 1H), 7,90 (s, 1H), 7,67 (s, 1H), 7,42-7,33 (m, 1H), 7,21 (d, 1H), 5,85-5,70 (m,

2H), 5,50-5,40 (d, 1H), 5,25 (d, J=18 Hz, 1H), 5,11 (d, J=11,9 Hz, 1H), 4,65-4,55 (m, 3H), 4,30-4,00 (m, 10H), 4,02 25 (s, 3H), 3,65-3,50 (m, 2H), 2,75-2,65 (m, 2H), 2,15-2,05 (m, 1H), 2,02-1,95 (m, 1H), 1,80-1,40 (m, 6H), 1,42 (d, 6H),

1,40-1,25 (m, 6H), 1,05 (s, 9H). 31P RMN (300 MHz, CDCI3): δ -2,7. LC/MS: 899 (M+ + 1).

5 A una solución de ácido (200 mg, 0,262 mmol) en 3 ml de tetrahidrofurano, se le agregó CDI (85 mg, 0,52 mmol). La mezcla de la solución se puso a reflujo durante 2 horas. A la mezcla enfriada, se le agregó el fosforamidato (142 mg, 0,79 mmol), seguido por DBU (275 μl, 1,83 mmol), y se puso a reflujo durante 4 horas. La mezcla se concentr� al vacío, se disolvió en 1 mililitro de MeOH, y se purificó mediante HPLC de fase inversa (eluida con el 10 % al 95 % de H2O/CH3CN), para dar el 71 como un sólido amarillo (100 mg, 41 %). �H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 8,48-8,27 (m,

10 1H), 8,20-8,00 (m, 1H), 7,70-7,60 (m, 1H), 7,58 (s, 1H), 7,15 (d, 1H), 5,90-5,70 (m, 1H), 5,60 (s a, 1H), 5,50-5,05 (m, 3H), 4,85-4,55 (m, 3H), 4,35-4,25 (m, 1H), 4,20-3,95 (m, 2H), 4,02 (s, 3H), 3,80-3,50 (m, 2H), 2,75-2,60 (m, 2H), 1,80-1,50 (m, 8H), 1,42 (d, 6H), 1,35-1,20 (m, 12H), 1,05 (s, 9H). 31P RMN (300 MHz, CDCl3): δ -4,9 y -5,2. LC/MS: 926 (M+).

15 Ejemplo 72: Preparación del compuesto 72.

A una solución del ácido (200 mg, 0,262 mmol) en 2 ml de DCM, se le agregó CDI (88 mg, 0,524 mmol). La mezcla

20 de la solución se puso a reflujo durante 2 horas. A la mezcla enfriada se le agregó el fosforamidato recién hecho (2,62 mmol), seguido por DBU (195 μl, 1,31 mmol), y se puso a reflujo durante 2 horas. La mezcla se concentr� al vacío, se disolvió en 1 mililitro de MeOH, y se purificó mediante HPLC de fase inversa (eluida con del 10 % al 75 % de H2O/CH3CN), para dar el 72 como un sólido amarillo (9 mg, 4 %). �H RMN (300 MHz, CDCI3): δ 11,2 (s a, 1H), 8,62 (s a, 1H), 8,41 (d, 1H), 8,09 (d, 1H), 7,90 (s a, 1H), 7,64 (s, 1H), 7,63-7,50 (m, 1H), 7,21 (d, 1H), 5,93-5,63 (m,

25 2H), 5,30 (d, J=18 Hz, 1H), 5,15 (d, J=11,9 Hz, 1H), 4,65-4,55 (m, 2H), 4,22 (d, 1H), 4,10-4,00 (m, 1H), 4,02 (s, 3H), 3,60-3,00 (m, 8H), 2,78-2,58 (m, 2H), 2,10-2,03 (m, 1H), 2,00-1,95 (m, 1H), 1,80-1,60 (m, 6H), 1,65-1,15 (m, 4H), 1,43 (d, J=6,4 Hz, 6H), 1,05 (s, 9H). 31P RMN (300 MHz, CDCI3): δ 49,8. LC/MS: 839 (M+ + 1).

5 A una solución del ácido (270 mg, 0,367 mmol) en 4 ml de DCM, se le agregó CDI (120 mg, 0,734 mmol). La mezcla de la solución se puso a reflujo durante 2 horas. A la mezcla enfriada se le agregó el fosforamidato (185 mg, 1,47 mmol), seguido por DBU (385 μl, 2,57 mmol), y se puso a reflujo durante 2 horas. La mezcla se concentr� al vacío, se disolvió en 1 mililitro de MeOH, y se purificó mediante HPLC de fase inversa (eluida con del 10 % al 95 % de H2O/CH3CN), para dar el 73 como un sólido blanco (120 mg, 39 %). �H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 8,65 (d, 1H),

10 8,40 (s, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,35-7,20 (m, 3H), 5,85-5,75 (m, 5H), 5,43 (s a, 2H), 5,28 (d, J=17,1 Hz, 1H), 5,14 (d, J=11,9 Hz, 1H), 4,95-4,87 (m, 1H), 4,43 (t, 1H), 4,35-4,18 (m, 2H), 4,02-3,90 (m, 1H), 3,90-3,75 (m, 6H), 2,95-2,80 (m, 6H), 2,45-2,35 (m, 2H), 2,17-2,07 (m, 1H), 2,02-1,96 (m, 1H), 1,85-1,75 (m, 6H), 1,75-1,55 (m, 8H), 1,55-1,43 (m, 3H), 1,02 (s, 9H). 31P RMN (300 MHz, CD3OD): δ 0,58. LC/MS: 844 (M+ + 1).

15 Ejemplo 74: Preparación del compuesto 74.

A una solución del ácido (200 mg, 0,287 mmol) en 2 ml de DCM, se le agregó CDI (93 mg, 0,574 mmol). La mezcla

20 de la solución se puso a reflujo durante 1 hora 30 minutos. A la mezcla enfriada se le agregó el fosforamidato (72 mg, 0,392 mmol), seguido por DBU (245 μl, 1,43 mmol), y se puso a reflujo durante 2 horas. La mezcla se concentr� al vacío, se disolvió en 1 mililitro de MeOH, y se purificó mediante HPLC de fase inversa (eluida con del 10 % al 75 % de H2O/CH3CN), para dar el 74 como un sólido blanco (103 mg, 45 %). �H RMN (300 MHz, CDCI3): δ 8,50 (d, 1H), 8,18 (d, 1H), 7,90 (s a, 2H), 7,80 (s, 1H), 7,75 (s a, 1H), 7,42 (s a, 3H), 7,19 (d, 1H), 7,07 (s a, 1H), 5,74

25 (qu, 1H), 5,58 (s a, 1H), 5,45 (d, 1H), 5,25 (d, J=18 Hz, 1H), 5,15 (d, J=11,9 Hz, 1H), 4,90-4,80 (m, 1H), 4,75-4,60 (m, 2H), 4,25 (d, 1H), 4,15-4,05 (m, 1H), 4,00 (s, 3H), 3,95-3,75 (m, 6H), 2,85-2,75 (m, 1H), 2,73-2,60 (m, 1H), 2,202,10 (m, 1H), 2,00-1,90 (m, 1H), 1,80-1,50 (m, 8H), 1,50-1,40 (m, 1H), 1,05 (s, 9H). 31P RMN (300 MHz, CDCI3): δ 0,4. LC/MS: 807 (M+ + 1).

5 A una solución del 69 (47 mg, 0,054 mmol) en 1 mililitro de piridina, se le agregó una porción de NaI (40 mg, 0,270 mmol). La mezcla de la solución se agit� a 95 �C durante 1 hora. Luego se agregó la segunda porción de NaI (40 mg, 0,270 mmol), y la mezcla de reacción se agit� a 95 �C durante otra hora. La mezcla se concentr� al vacío utilizando una bomba de alto vacío a 40 �C, y se agregaron tres gotas de una solución 1 M de HCl. La mezcla cruda se disolvió en 1 mililitro de MeOH. La mezcla se concentr� al vacío, se disolvió en 1 mililitro de MeOH, y se purificó

10 mediante HPLC de fase inversa (eluida con del 10 % al 75 % de H2O/CH3CN), para dar el 75 como un sólido amarillo (27 mg, 58 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 9,23 (s, 1H), 8,25 (d, 1H), 8,20 (s, 1H), 7,77 (s, 2H), 7,35 (dd, 1H), 5,85-5,76 (m, 2H), 5,27 (d, J=18 Hz, 1H), 5,09 (d, J=11,9 Hz, 1H), 4,65-4,50 (m, 3H), 4,15-4,05 (m, 3H), 4,104,00 (m, 1H), 4,05 (s, 3H), 3,70-3,60 (m, 3H), 2,80-2,70 (m, 1H), 2,55-2,40 (m, 1H), 2,20-2,10 (m, 1H), 1,90-1,80 (m, 1H), 1,75-1,43 (m, 6H), 1,50-1,30 (m, 3H), 1,35 (d, J=6,4 Hz, 6H), 1,05 (s, 9H). 31P RMN (300 MHz, CDCI3): δ 2,78.

15 LC/MS: 856 (M++ 1).

20 A una solución del 70 (7 mg, 0,008 mmol) en 0,5 ml de piridina, se le agregó una porción de NaI (6 mg, 0,039 mmol). La mezcla de la solución se agito a 95 �C durante 1 hora. Entonces se agregó la segunda porción de NaI (6 mg, 0,039 mmol), y la mezcla de reacción se agit� a 95 �C durante la noche. La mezcla se concentr� al vacío utilizando una bomba de alto vacío a 40 �C, y se agregaron tres gotas de una solución 1 M de HCl. La mezcla cruda se disolvió

25 en 1 mililitro de MeOH. La mezcla se concentr� al vacío, se disolvió en 1 mililitro de MeOH, y se purificó mediante HPLC de fase inversa (eluida con del 10 % al 75 % de H2O/CH3CN), para dar el 76 como un sólido amarillo (2 mg, 29 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 9,20 (s a, 1H), 8,25 (d, 1H), 8,20 (s, 1H), 7,78 (s, 1H), 7,35 (d, 1H), 5,85-5,78 (m, 2H), 5,27 (d, J=18 Hz, 1H), 5,09 (d, J=11,9 Hz, 1H), 4,70-4,50 (m, 4H), 4,30-4,10 (m, 4H), 4,10-3,95 (m, 3H), 4,04 (s, 3H), 2,80-2,70 (m, 1H), 2,60-2,40 (m, 1H), 2,10-2,05 (m, 1H), 1,90-1,80 (m, 1H), 1,75-1,45 (m, 6H), 1,45-1,18

30 (m, 5H), 1,38 (d, 6H), 1,05 (s, 9H). 31P RMN (300 MHz, CDCl3): δ -4,5. LC/MS: 871 (M+ + 1).

Paso 1. Al metil-éster (1,3 g, 2,39 mmol) disuelto en 45 ml de una mezcla en solución de 3/2/1 de THF/MeOH/H2O, se le agregó LiOH (500 mg, 11,95 mmol). La mezcla se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego la reacción se acidific� a un pH de 4 utilizando una solución al 37 % de HCl en H2O, y se extrajo tres veces con diclorometano. La fase orgánica se evapor� al vacío, y se destil� azeotr�picamente tres veces con tolueno, para dar el intermediario de ácido. Al ácido (2,39 mmol) en 40 ml de tetrahidrofurano a -40 �C, se le agregó trietil-amina (500 μl, 3,58 mmol), seguida por cloroformato de etilo (345 μl, 3,58 mmol). La solución se agit� durante 30 minutos a -40 �C, y se agregó un equivalente más de trietil-amina (333 μl, 2,39 mmol) y cloroformato de etilo (228 μl, 2,39 mmol). La mezcla se agit� durante otros 30 minutos, y se agregó una solución de amino-fosfono (915 mg, 3,58 mmol) con trietil-amina (500 μl, 3,58 mmol) en 10 ml de tetrahidrofurano. El disolvente se evapor� al vacío, y la mezcla se purificó mediante cromatograf�a en gel de sílice utilizando SiO2 (eluida con del 0 % al 100 % de EtOAc/hexano), para dar el intermediario de fosfonato P1 como un sólido color naranja oscuro (870 mg, 50 %). LC/MS: 730 (M+ + 1). Paso 2. Al fosfonato P1 (450 mg, 0,617 mmol) disuelto en 10 ml de dicloro-metano, se le agregaron 5 ml de ácido trifluoro-acético. La mezcla de reacción se agit� durante 30 minutos, y el disolvente se concentr� al vacío utilizando una bomba de alto vacío a 30 �C, y se destil� azeotr�picamente tres veces con tolueno, para dar la amina libre. A la amina (0,617 miligramos) en 30 ml de tetrahidrofurano, se le agregó NMM (200 μl, 1,85 mmol), seguido por HATU (350 mg, 0,92 mmol) y ácido (200 mg, 0,74 mmol). La solución se agit� durante 6 horas, se apagó con una solución saturada de NH4Cl en H2O, se extrajo con dicloro-metano, y se evapor� al vacío. El producto crudo se disolvió en 100 ml de EtOAc, y se lav� con una solución saturada de NaHCO3 en H2O tres veces. El EtOAc se removió al vacío, y el producto crudo se purificó mediante cromatograf�a en gel de sílice utilizando SiO2 (eluida con del 0 % al 100 % de EtOAc/hexano), para dar el intermediario de fosfonato P3 como un sólido color naranja oscuro (510 mg, 94 %). 1H-RMN (300 MHz, CD3OD): δ 8,24 (d, 1H), 7,95 (s a, 1H), 7,65-7,58 (m, 2H), 7,25 (dd, 1H), 6,00-5,90 (m, 2H), 5,67 (s a, 1H), 5,32 (dd, 1H), 5,15 (dd, 1H), 5,05-4,90 (m, 1H), 4,70-4,50 (m, 1H), 4,33-3,90 (m, 8H), 2,85-2,65 (m, 1H), 2,35-2,45 (m, 1H), 2,25-2,00 (m, 3H), 1,80-1,65 (m, 1H), 1,65-1,15 (m, 16H), 1,22 (s, 9H). 31P RMN (300 MHz, CD3OD): δ 23,5 y 23,2 (ambos diaestere�meros). LC/MS: 883 (M+ + 1).

Paso 3. Al intermediario de fosfonato P3 (200 mg, 0,227 mmol) y catalizador G1 Grubb (56 mg, 0,068 mmol) bajo argón, se les agregaron 24 ml de dicloro-metano desgasificado. La reacción se puso a reflujo durante 3 horas. La mezcla se concentr� al vacío, se secó, se cargó sobre SiO2, y se purificó mediante cromatograf�a en gel de sílice utilizando SiO2 (eluida con del 0 % al 100 % de EtOAc/hexano), para dar el producto ciclado como un sólido color naranja oscuro (64 mg, 32 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 8,73 (s, 1H), 8,33 (d, 1H), 7,75 (s, 2H), 7,25 (dd, 1H), 5,82 (s a, 1H), 5,70 (q, 1H), 5,35 (t, 1H), 4,62 (t, 1H), 4,38-4,03 (m, 7H), 4,04 (s, 3H), 3,00-2,82 (m, 1H), 2,82-2,72 (m, 1H), 2,62-2,50 (m, 1H), 2,35-2,20 (m, 1H), 1,90-1,70 (m, 2H), 1,62-1,38 (m, 8H), 1,40-1,25 (m, 16H), 1,08 (s, 9H).

LC/MS: 855 (M+ + 1).

Paso 4. A una solución de ciclopentanol (3 equivalentes) en 10 ml de tetrahidrofurano, se le agregó una solución de fosgeno al 20 % en tolueno (5 equivalentes). La mezcla de reacción se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora. 2/3 partes de la mezcla se concentraron al vacío a 40 �C, y se disolvieron en 2 ml de dicloro-metano. Este proceso se repitió tres veces.

A una solución del producto ciclado (120 mg, 0,140 mmol) en 2 ml de dicloro-metano a 0 �C, se le agregó TMSI (160 μl, 1,12 mmol). La mezcla de la solución se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla se concentr� al vacío utilizando una bomba de alto vacío a 30 �C, y se destil� azeotr�picamente tres veces con tolueno. La mezcla cruda se disolvió en 1 mililitro de dicloro-metano. Se agregó una tercera parte de la trietil-amina (52 μl, 0,373 mmol), seguida por la adición lenta del cloroformato preparado anteriormente. Luego se agregó el resto de trietil-amina (104 μl, 0,746 mmol) a la mezcla. La mezcla de reacción se apagó mediante la adición de una solución de 1 M de HCl en agua hasta que se alcanzó un pH de 3. La mezcla se extrajo con dicloro-metano, se concentr� al vacío, se disolvió en 1 mililitro de MeOH, y se purificó mediante HPLC de fase inversa (eluida con del 0 % al 60 % de H2O/CH3CN), para dar el fosfonato de dietilo 77 como un sólido amarillo (3 mg, 3 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 8,31 (d, J=9,1 Hz, 1H), 8,16 (s, 1H), 7,76-7,72 (m, 2H), 7,33 (bdd, 1H), 5,84 (s a, 1H), 5,70-5,60 (m, 1H), 5,38-5,25 (m, 1H), 4,80-4,68 (m, 1H), 4,38-4,10 (m, 2H), 4,04 (s, 3H), 2,85-2,73 (m, 1H), 2,73-2,50 (m, 1H), 1,65-1,30 (m, 9H), 1,34 (d, J=6,4 Hz, 6H). 31P RMN (300 MHz, CD3OD): δ 21,2. LC/MS: 812 (M+ + 1).

Paso 1. Al ácido de partida (1,2 g, 3,36 mmol) disuelto en 30 ml de dimetil-formamida, se le agregaron la amina (880 mg, 4,03 mmol), TBTU (2,16 g, 6,72 mmol), y DIPEA (1,14 ml, 10,08 mmol). La mezcla se agit� a temperatura ambiente durante 4 horas, se apagó con una solución saturada de NH4Cl en H2O, se extrajo con dicloro-metano, y se evapor� al vacío. El producto crudo se disolvió en 100 ml de EtOAc, y se lav� con una solución saturada de NaHCO3 en H2O tres veces. El EtOAc se removió al vacío, y el producto crudo se purificó mediante cromatograf�a en gel de sílice utilizando SiO2 (eluida con del 0 % al 100 % de EtOAc/hexano), para dar el producto crudo como un sólido amarillo (950 mg, 51 %). 1H-RMN (300 MHz, CDCl3): δ 7,55 (s, 1H), 6,03-5,88 (m, 1H), 5,43 (t, 1H), 5,33-5,20 (m, 1H), 5,13-4,98 (m, 2H), 4,62-4,45 (m, 2H), 4,30-3,93 (m, 7H), 3,62-3,50 (m, 1H), 3,45-3,33 (m, 1H), 2,50-2,20 (m, 2H), 1,90-1,50 (m, HH), 1,38-1,20 (m, 9H), 1,02 (s, 9H). LC/MS: 558 (M+ + 1).

Paso 2. Al material crudo obtenido anteriormente (130 mg, 0,233 mmol) disuelto en 5 ml de tetrahidrofurano, se le agregó DSC (120 mg, 0,466 mmol), seguido por NaH (dispersi�n al 60 % en aceite mineral) (18 mg, 0,466 mmol). La reacción se puso a reflujo durante 6 horas, se apagó con 30 ml de una solución 1 M de HCl en agua, se extrajo con EtOAc, y se secó utilizando sulfato de magnesio anhidro. La fase orgánica se concentr� al vacío, se disolvió en 1,5 ml de dicloro-metano, y se agregó a un matraz de microondas. A la solución se le agregó 2-piperidin-1-il-fenilamina (82 mg, 0,466 mmol). El matraz de microondas se selló y se puso en el aparato de microondas. La reacción se calentó a 65 �C durante 1 hora. La reacción se purificó mediante cromatograf�a en gel de sílice utilizando SiO2 (eluida con del 0 % al 100 % de EtOAc/hexano), para dar el carbamato como un sólido amarillo (146 mg, 83 %).

Paso 3. A una solución del carbamato (146 mg, 0,192 mmol) en 5 ml de CH3CN a 0 �C, se le agregó TMSI (220 μl, 1,15 mmol), seguido por 2,6-lutidina (178 μl, 1,53 mmol). La mezcla de la solución se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla se concentr� al vacío utilizando una bomba de alto vacío a 30 �C, y se destil� azeotr�picamente tres veces con tolueno. La mezcla de reacción se apagó entonces con MeOH. El MeOH se 5 evapor� al vacío. La mezcla cruda se disolvió en 1 mililitro de MeOH, y se purificó mediante HPLC de fase inversa (eluida con del 10 % al 75 % de H2O/CH3CN), para dar el 78 como un sólido blanco (45 mg, 33 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 7,62-7,58 (m, 2H), 7,40-7,22 (m, 3H), 6,05-5,90 (m, 1H), 5,43 (s a, 1H), 5,25 (dd, J=17, 1,5 Hz, 1H), 5,06 (dd, J=10,4, 1,8 Hz, 1H), 4,51 (bt, 1H), 4,35 (bd, 1H), 4,25 (s, 1H), 4,00-3,95 (m, 1H), 2,55-2,43 (m, 1H), 2,382,24 (m, 1H), 2,10-2,00 (m, 1H), 1,99-1,83 (m, 5H), 1,80-1,60 (m, 9H), 1,60-1,40 (m, 5H), 1,06 (s, 9H), 1,05 (s, 9H).

10 31P RMN (300 MHz, CD3OD): δ 20,7. LC/MS: 704 (M+ + 1).

15 Paso 1. Al ácido de prolina (905 mg, 3,92 mmol) disuelto en 40 ml de dimetil-formamida, se le agregaron el aminofosfonato de dietilo (1,03 g, 4,7 mmol), TBTU (2,2 g, 6,86 mmol), y DIPEA (1,8 ml, 15,68 mmol). La mezcla se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora, se apagó con una solución saturada de NH4Cl en H2O, se extrajo con diclorometano, y se evapor� al vacío. El producto crudo se disolvió en 100 ml de EtOAc, y se lav� con una solución saturada de NaHCO3 en H2O tres veces. El EtOAc se removió al vacío, y el producto crudo se purificó mediante

20 cromatograf�a en gel de sílice utilizando SiO2 (eluida con del 0 % al 100 % de EtOAc/hexano), para dar el intermediario P1 como un sólido amarillo (470 mg, 28 %). Al fosfonato P1 (470 mg, 0,73 mmol) disuelto en 10 ml de dicloro-metano, se le agregaron 5 ml de ácido trifluoro-acético. La mezcla de reacción se agit� durante 30 minutos, y el disolvente se concentr� al vacío utilizando una bomba de alto vacío a 30 �C, y se destil� azeotr�picamente tres veces con tolueno, para dar la amina libre. A la amina (0,73 mmol) en 30 ml de tetrahidrofurano, se le agregó NMM

25 (240 μl, 2,19 mmol), seguida por HATU (415 mg, 1,095 mmol), y ácido carbox�lico (275 mg, 1,22 mmol). La solución se agit� durante 6 horas, se apagó con una solución saturada de NH4Cl en H2O, se extrajo con dicloro-metano, y se evapor� al vacío. El producto crudo se disolvió en 100 ml de EtOAc, y se lav� con una solución saturada de NaHCO3 en H2O tres veces. El EtOAc se removió bajo vacío, y el producto crudo se purificó mediante cromatograf�a en gel de sílice utilizando SiO2 (eluida con del 0 % al 100 % de EtOAc/hexano), para dar el intermediario de trip�ptido como un

30 sólido color naranja oscuro (187 mg, 43 %).

Paso 2. Al intermediario de trip�ptido (137 mg, 0,234 mmol) y el catalizador G1 Grubb (56 mg, 0,058 mmol) bajo argón, se les agregaron 25 ml de dicloro-metano desgasificado. La reacción se puso a reflujo durante 3 horas. La mezcla se concentr� al vacío, se secó, se cargó sobre SiO2, y se purificó mediante cromatograf�a en gel de sílice utilizando SiO2 (eluida con del 0 % al 100 % de EtOAc/hexano), para dar el producto macroc�clico como un sólido amarillo (93 mg, 71 %).

Paso 3. Al producto macroc�clico (110 mg, 0,197 mmol) disuelto en 5 ml de tetrahidrofurano, se le agregó DSC (101 mg, 0,394 mmol), seguido por NaH (dispersi�n al 60 % en aceite mineral) (15 mg, 0,394 mmol). La reacción se puso a reflujo durante 6 horas, se apagó con 30 ml de una solución 1 M de HCl en agua, se extrajo con EtOAc, y se secó utilizando sulfato de magnesio anhidro. La fase orgánica se concentr� al vacío, se disolvió en 1,5 ml de diclorometano, y se agregó a un matraz de microondas. A la solución se le agregó 2-piperidin-1-il-fenil-amina (69 mg, 0,394 mmol). El matraz de microondas se selló y se puso en el aparato de microondas. La reacción se calentó a 65 �C durante 1 hora. La reacción se purificó mediante cromatograf�a en gel de sílice utilizando SiO2 (eluida con del 0 % al 100 % de EtOAc/hexano), para dar el carbamato como un sólido amarillo (50 mg, 33 %). �H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 8,10-7,90 (m, 2H), 7,18-7,06 (m, 2H), 7,05-6,96 (m, 1H), 6,80 (s a, 1H), 5,75-5,60 (m, 1H), 5,50-5,33 (m, 2H), 4,63-4,40 (m, 2H), 4,22-4,07 (m, 4H), 4,05-3,93 (m, 2H), 2,59-2,40 (m, 3H), 2,20-1,80 (m, 5H), 1,80-1,50 (m, 10H), 1,38 (s, 9H), 1,28 (t, 6H), 1,60-1,40 (m, 8H). LC/MS: 761 (M+ + 1).

Paso 4. A una solución del carbamato (70 mg, 0,092 mmol) en 3 ml de CH3CN a 0 �C, se le agregó TMSI (105 μl, 0,736 mmol). La mezcla de la solución se agit� a temperatura ambiente durante 3/4 de hora. La mezcla se concentr� al vacío utilizando una bomba de alto vacío a 30 �C, y se destil� azeotr�picamente tres veces con tolueno. La mezcla cruda se disolvió en 1 mililitro de dicloro-metano. Se agregó una tercera parte de la trietil-amina (38 μl, 0,276 mmol), seguida por la adición lenta del cloroformato. Luego se agregó a la mezcla el resto de la trietil-amina (76 μl, 0,552 mmol). La mezcla de reacción se apagó mediante la adición de dos gotas de una solución 1 M de HCl. La mezcla se concentr� al vacío, se disolvió en 1 mililitro de MeOH, y se purificó mediante HPLC de fase inversa (eluida con del 10 % al 75 % de H2O/CH3CN), para dar el 69 como un sólido blanco (32 mg, 49 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 7,73 (d, J=7,9 Hz, 1H), 7,50-7,38 (m, 3H), 5,65-5,58 (m, 1H), 5,51 (s a, 1H), 5,30 (bt, 1H), 4,85 (s a, 1H), 4,62-4,50 (m, 2H), 4,30-4,22 (m, 1H), 4,00-3,90 (m, 1H), 3,65-3,50 (m, 4H), 2,50-2,40 (m, 3H), 2,22-2,10 (m, 1H), 2,08-1,98 (m, 5H), 1,98-1,78 (m, 5H), 1,80-1,60 (m, 6H), 1,70-1,60 (m, 6H), 1,60-1,40 (m, 8H). 31P RMN (300 MHz, CD3OD): δ 21,3. LC/MS: 716 (M+ + 1).

Ejemplo 80: Preparación del compuesto 80.

A una solución del trip�ptido de N-Boc obtenido para el Ejemplo 79 (125 mg, 0,164 mmol) en 3 ml de dicloro-metano, se le agregaron 3 ml de ácido trifluoro-acético. La mezcla de la solución se agit� a temperatura ambiente durante 3/4 hora. La mezcla se concentr� al vacío utilizando una bomba de alto vacío a 40 �C, y se destil� azeotr�picamente tres veces con tolueno. La mezcla cruda se disolvió en 1 mililitro de dicloro-metano. Se agregó una tercera parte de la trietil-amina (38 μl, 0,276 mmol), seguida por la adición lenta del cloroformato. Luego se agregó a la mezcla el resto de la trietil-amina (76 μl, 0,552 mmol). La mezcla de reacción se apagó mediante la adición de 2 gotas de una solución 1 M de HCl. La mezcla se concentr� al vacío, se disolvió en 1 mililitro de MeOH, y se purificó mediante HPLC de fase inversa (eluida con del 10 % al 95 % de H2O/CH3CN), para dar el 80 como un sólido blanco (42 mg, 33 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 8,66 (s, 1H), 7,75 (s a, 1H), 7,40 (s a, 1H), 7,22 (s a, 2H), 5,67 (q, J=9,5 Hz, 1H), 5,47 (s a, 1H), 5,37 (t, J=10,0 Hz, 1H), 4,55-4,45 (m, 2H), 4,30-4,00 (m, 5H), 3,95 (dd, J=3,9 Hz, 1H), 3,30-3,00 (m, 2H), 2,85-2,75 (m, 1H), 2,50-2,40 (m, 2H), 2,00-1,80 (m, 5H), 1,75-1,40 (m, 15H), 1,33 (t, J=7,0 Hz, 3H), 1,26 (t, J=7,1 Hz, 3H). 31P RMN (300 MHz, CD3OD): δ 23,8. LC/MS: 772 (M+ + 1).

Ejemplo 81: Preparación del compuesto 81.

Paso 1. Al alcohol macroc�clico (300 mg, 0,538 mmol) disuelto en 20 ml de tetrahidrofurano, se le agregó DSC

5 (275 mg, 1,076 mmol), seguido por NaH (dispersi�n al 60 % en aceite mineral) (15 mg, 1,345 mmol). La reacción se puso a reflujo durante 6 horas, se apagó con 30 ml de una solución 1 M de HCl en agua, se extrajo con EtOAc, y se secó utilizando sulfato de magnesio anhidro. La fase orgánica se concentr� al vacío, se disolvió en 3 ml de diclorometano, y se agregó a un matraz de microondas. A la solución se le agregó 2-piperidin-1-il-5-trifluoro-metil-fenilamina (394 mg, 1,61 mmol). El matraz de microondas se selló y se puso en el aparato de microondas. La reacción

10 se calentó a 65 �C durante 7 horas. La reacción se purificó mediante cromatograf�a en gel de sílice utilizando SiO2 (eluida con del 0 % al 100 % de EtOAc/hexano), para dar el producto deseado como un sólido amarillo (350 mg, 79 %).

Paso 2. A una solución del carbamato (350 mg, 0,423 mmol) en 3 ml de dicloro-metano, se le agregaron 3 ml de

15 ácido trifluoro-acético. La mezcla de la solución se agit� a temperatura ambiente durante 3/4 de hora. La mezcla se concentr� al vacío utilizando una bomba de alto vacío a 40 �C, y se destil� azeotr�picamente tres veces con tolueno. La mezcla cruda se disolvió en 1 mililitro de dicloro-metano. Se agregó una tercera parte de la trietil-amina (200 μl, 1,4 mmol), seguida por la adición lenta del cloroformato. Luego se agregó a la mezcla el resto de la trietil-amina (400 μl, 2,8 mmol). La mezcla de reacción se apagó después de 2 horas mediante la adición de una solución

20 saturada de NaHCO3 en agua. La mezcla se extrajo con dicloro-metano, se concentr�, y se purificó mediante cromatograf�a en fase normal utilizando SiO2, para dar el producto deseado como un sólido blanco (270 mg, 76 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 8,64 (s, 1H), 8,26 (s, 1H), 7,33 (s, 2H), 5,65 (q, J=10,1 Hz, 1H), 5,44 (s a, 1H), 5,34 (t, J=9,7 Hz, 1H), 4,77 (s a, 1H), 4,55-4,45 (m, 2H), 4,30-4,00 (m, 5H), 3,93 (dd, J=11,3, 3,3 Hz, 1H), 3,00-2,75 (m, 5H), 2,50-2,40 (m, 1H), 2,40-2,20 (m, 2H), 1,90-1,70 (m, 5H), 1,70-1,38 (m, 13H), 1,34 (t, J=7,1 Hz, 3H), 1,26 (t, J=7,0 Hz,

25 3H). 31P RMN (300 MHz, CD3OD): δ 23,7. LC/MS: 840 (M+ + 1).

Paso 3. A una solución del carbamato (120 mg, 0,143 mmol) en 2 ml de piridina, se le agregó una porción de NaI 30 (110 mg, 0,71 mmol). La mezcla de la solución se agit� a 95 �C durante 1 hora. Entonces se agregó la segunda porción de NaI (110 mg, 0,71 mmol), y la mezcla de reacción se agit� a 95 �C durante otras 6 horas. La mezcla se concentr� al vacío utilizando una bomba de alto vacío a 40 �C, y se agregaron tres gotas de una solución 1 M de HCl. La mezcla cruda se disolvió en 1 mililitro de MeOH. La mezcla se concentr� al vacío, se disolvió en 1 mililitro de MeOH, y se purificó mediante HPLC de fase inversa (eluida con del 10 % al 95 % de H2O/CH3CN), para dar el 81

5 como un sólido blanco (20 mg, 17 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 8,26 (s, 1H), 7,33 (s, 2H), 5,65 (q, J=9,5 Hz, 1H), 5,45 (s a, 1H), 5,34 (t, J=10,1 Hz, 1H), 4,76 (s a, 1H), 4,60-4,50 (m, 2H), 4,30-4,15 (m, 2H), 4,10-4,00 (m, 1H), 3,92 (dd, J=11,9, 3,6 Hz, 1H), 2,95-2,80 (m, 4H), 2,80-2,60 (m, 1H), 2,50-2,40 (m, 1H), 2,40-2,30 (m, 1H), 2,25-2,15 (m, 1H), 1,95-1,70 (m, 5H), 1,65-1,30 (m, 16H), 1,27 (t, J=7,0 Hz, 3H). 31P RMN (300 MHz, CD3OD): δ 22,4. LC/MS: 812 (M+ + 1).

15 A una solución del fosfonato de dietilo (150 mg, 0,179 mmol) en 3 ml de CH3CN a 0 �C, se le agregó TMSI (125 μl, 1,07 mmol). La mezcla de la solución se agit� a temperatura ambiente durante 3/4 de hora. La mezcla se concentr� al vacío utilizando una bomba de alto vacío a 30 �C, y se destil� azeotr�picamente tres veces con tolueno. La mezcla cruda se disolvió en 1 mililitro de MeOH, se evapor�, y se disolvió en 1 mililitro de MeOH, y se purificó mediante HPLC de fase inversa (eluida con del 10 % al 95 % de H2O/CH3CN), para dar el 82 como un sólido blanco (20 mg,

20 14 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 8,25 (s, 1H), 7,35 (s, 2H), 5,62 (q, J=9,8 Hz, 1H), 5,46 (s a, 1H), 5,30 (t, J=9,1 Hz, 1H), 4,76 (s a, 1H), 4,65-4,50 (m, 2H), 4,25 (bd, J=8,3 Hz, 1H), 3,92 (dd, J=11,6, 3,1 Hz, 1H), 3,00-2,80 (m, 4H), 2,55-2,35 (m, 3H), 2,30-2,10 (m, 1H), 2,10-1,90 (m, 1H), 1,85-1,70 (m, 5H), 1,65-1,10 (m, 17H). 31P RMN (300 MHz, CD3OD): δ 21,5. LC/MS: 784 (M+ + 1).

25 Ejemplo 83: Preparación del compuesto 83.

Paso 1. A una solución del fosfonato de dietilo macroc�clico (240 mg, 0,281 mmol) en 3 ml de dicloro-metano, se le

30 agregaron 3 ml de ácido trifluoro-acético. La mezcla de la solución se agit� a temperatura ambiente durante 3/4 hora. La mezcla se concentr� al vacío utilizando una bomba de alto vacío a 40 �C, y se destil� azeotr�picamente tres veces con tolueno. La mezcla cruda se disolvió en 1 mililitro de dicloro-metano. Se agregó una tercera parte de la trietil-amina (131 μl, 0,94 mmol), seguida por la adición lenta del cloroformato. Luego se agregó a la mezcla el resto de la trietil-amina (262 μl, 1,87 mmol). La mezcla de reacción se apagó después de 2 horas mediante la adición de

35 una solución saturada de NaHCO3 en agua. La mezcla se extrajo con dicloro-metano, se concentr�, se disolvió con 1 mililitro de MeOH, y se purificó mediante HPLC de fase inversa (eluida con del 10 % al 75 % de H2O/CH3CN), para dar el producto deseado como un sólido amarillo (77 mg, 32 %). LC/MS: 840 (M+ -1).

Paso 2. A una solución del intermediario obtenido anteriormente (62 mg, 0,072 mmol) en 1 mililitro de piridina, se le agregó una porción de NaI (55 mg, 0,036 mmol). La mezcla de la solución se agit� a 95 �C durante 1 hora. Entonces

5 se agregó la segunda porción de NaI (55 mg, 0,036 mmol), y la mezcla de reacción se agit� a 95 �C durante otras 6 horas. La mezcla se concentr� al vacío utilizando una bomba de alto vacío a 40 �C, y se agregaron tres gotas de una solución 1 M de HCl. La mezcla cruda se disolvió en 1 mililitro de MeOH. La mezcla se concentr� al vacío, se disolvió en 1 mililitro de MeOH, y se purificó mediante HPLC de fase inversa (eluida con del 10 % al 75 % de H2O/CH3CN), para dar el 83 como un sólido amarillo (33 mg, 55 %). LC/MS: 838 (M).

15 Paso 1. El metil-éster de Boc-amino-prolina (20 g, 81,5 mmol) se disolvió en dicloro-metano (100 ml) en un matraz de fondo redondo. Se agregó ácido trifluoro-acético (200 ml), y la reacción se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego la mezcla se concentr� y se destil� azeotr�picamente con tolueno (100 ml, dos veces). La mezcla cruda se absorbió entonces en dicloro-metano (600 ml). Se agregaron HATU (46,5 g, 122 mmol), NMM (28,9 g, 285 mmol), y ácido (23,8 g, 97,8 mmol). La mezcla de reacción se agit� a temperatura ambiente durante 15 horas.

20 La reacción se apagó con agua, se diluyó con dicloro-metano, se lav� con NaHCO3 saturado, y NH4Cl saturado. Entonces la capa orgánica se secó, se concentr�, y se purificó mediante cromatograf�a por evaporación instantánea, para proporcionar el producto de acoplamiento (21,6 g, 73 %). Este metil-éster (21,6 g, 58,3 mmol) se absorbió entonces en tetrahidrofurano (100 ml), MeOH (100 ml), y agua (100 ml). Se agregó LiOH (12,2 g, 292 mmol), y la mezcla se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego la reacción se diluyó con agua, y el pH se ajust� a 3

25 utilizando HCl 1 N. Luego la mezcla se extrajo con EtOAc, se secó, y se concentr�, para proporcionar el ácido carbox�lico (20,2 g, 97 %).

30 Paso 2. El ácido carbox�lico (7 g, 19,6 mmol), y el amino-fosfonato (5,6 g, 25,5 mmol) se absorbieron en dimetilformamida (200 ml). Se agregaron TBTU (12,6 g, 39 mmol), y DIEA (10,1 g, 78,4 mmol), y la reacción se agit� a temperatura ambiente, y se monitore� mediante LC/MS hasta terminar. Luego la mezcla se apagó con agua, se diluyó con dicloro-metano, y se lav� con NaHCO3. La capa orgánica se lav� adicionalmente con NH4Cl, HCl 1 M, y salmuera, luego se secó, se concentr�, y se purificó mediante cromatograf�a por evaporación instantánea

35 (hexano/acetato de etilo/metanol), para proporcionar el trip�ptido (4,3 g, 39 %).

Paso 3. El alcohol (200 mg, 0,36 mmol) se absorbió en tetrahidrofurano (5 ml). Se agregaron NaH (43 mg, 1,08 mmol), y disuccinimida-carbonilo (276 mg, 1,08 mmol). La reacción se puso a reflujo durante 6 horas hasta terminar, mediante análisis de LC/MS. Se agregaron acetato de etilo y HCl 1 M. La capa orgánica se separ� y se lav� con salmuera, se secó, y se concentr�. El residuo se absorbió en dicloro-metano (1 mililitro), y se agregó la anilina (175 mg, 0,72 mmol). La mezcla se calentó en el reactor de microondas a 65 �C durante 1 hora. Entonces la reacción se concentr� y se purificó mediante cromatograf�a por evaporación instantánea, para proporcionar el carbamato deseado (30 miligramos). Este fosfonato de dietilo se absorbió entonces en acetonitrilo (1 mililitro), y se agregó 2,6-lutidina (11,6 mg, 0,11 mmol). La mezcla se enfri� a 0 �C, y luego se agregó TMSI (22 mg, 0,11 mmol). La reacción se calentó a temperatura ambiente, y se agito durante 2 horas. Luego la reacción se apagó con trietilamina, luego metanol, y se concentr�. El residuo se purificó mediante HPLC (acetonitrilo:agua), para proporcionar el ácido 85 deseado (1,6 miligramos). 1Η RMN (300 MHz, CD3OD ) δ 1,05 (m, 12H), 1,35-1,83 (m, 19H), 2,11 (m, 1H), 2,32 (m, 1H), 2,48 (m, 1H), 2,89 (m, 2H), 3,95 (m, 1H), 4,38 (m, 1H), 4,53 (m, 1H), 5,08 (m, 1H), 5,25 (m, 1H), 5,41 (m, 1H), 5,98 (m, 1H), 7,37 (s, 2H), 8,23 (s, 1H). 31P RMN (300 MHz) δ 20,08. LC/MS: 772 (M+1).

Ejemplo 102: Preparación del compuesto 102.

Paso 1. A una solución del metil-éster de cis-hidroxi-prolina (20 g, 81 mmol) en dicloro-metano (200 ml) se le agregó ácido trifluoro-acético (40 ml). La reacción se agit� durante 2 horas con monitoreo mediante LC/MS. Se separ� el disolvente y se co-evapor� con tolueno dos veces, y luego con cloroformo tres veces. Se removió el exceso de ácido trifluoro-acético mediante la colocación de la mezcla de reacción bajo un alto vacío durante 5 horas, lo cual proporcion� la sal de ácido trifluoro-acético (aproximadamente 21 gramos) como un aceite viscoso color naranja. LC/MS: 260 (M+ + 1).

A una solución de la sal de ácido trifluoro-acético (10,0 g, 40,7 mmol) en dimetil-formamida (125 ml) se le agregó el ácido ciclopentiloxi-carbonil-terleucin-carbox�lico (12 g, 48 mmol), y HATU (23 g, 61 mmol). La mezcla de reacción se enfri� a 0 �C, y se agregó lentamente base de Hunig (28 ml, 163 mmol) durante 5 minutos. La reacción se dej� calentar a temperatura ambiente, y se agit� durante 1 hora. Se removió el disolvente bajo presión reducida, y se diluyó con acetato de etilo. Los orgánicos se extrajeron con bicarbonato de sodio saturado, agua, y salmuera. La purificación del producto sobre gel de sílice (del 10 al 100 % de acetato de etilo/hexano) proporcion� el dip�ptido (14,2 g, 94 %) como un sólido blanco. �H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 5,51 (d, J= 8,7 Hz, 1H), 5,02 (m, 1H), 4,68 (m, 1H), 4,56 (m, 1H), 4,44 (d, J= 9,1 Hz, 1H), 3,96-3,91 (s a, 4H), 3,83 (m, 1H), 2,47 (m, 2H), 1,89-1,47 (s a, 10H), 1,09 (s, 9H). LC/MS: 371 (M+ + 1).

Paso 2. A una solución del metil-éster (15,2 g, 41 mmol) en 200 ml de tetrahidrofurano, y 20 ml de metanol, se le agregó hidróxido de litio (4 g, 167 mmol) en 120 ml de agua. La mezcla de reacción se agit� a temperatura ambiente durante la noche. Los orgánicos se removieron bajo presión reducida, y el pH se ajust� a 2-3 utilizando HCl al 10 %. La solución ácida se extrajo con acetato de etilo, se secó sobre MgSO4, se filtr�, y se removió el disolvente bajo presión reducida, para proporcionar el ácido (14,6 g, 100 %) como un sólido blanco. El producto se utilizó como estaba para la siguiente reacción. �H RMN (300 MHz, CDCI3): δ 5,51 (d, J= 8,7 Hz, 1H), 5,02 (m, 1H), 4,68 (m, 1H), 4,56 (m, 1H), 4,44 (d, J= 9,1 Hz, 1H), 3,96-3,91 (m, 1H), 3,83 (m, 1H), 2,47 (m, 2H), 1,89-1,47 (s a, 10H), 1,09 (s, 9H). LC/MS: 357 (M+ + 1).

Paso 3. A una solución del ácido (2,0 g, 5,61 mmol) en dimetil-formamida (20 ml) se le agregaron fosfonato de vinilciclopropil-amino-dietilo rac�mico (1,20 g, 5,1 mmol) y HATU (2,32 g, 6,12 mmol). La reacción se enfri� a 0 �C durante 10 minutos, y luego se agregó base de Hunig (3,1 ml, 17,8 mmol) durante 5 minutos. La reacción se dej� calentar a temperatura ambiente, y se continu� la agitaci�n durante 1 hora. El disolvente se removió bajo presión reducida, y se diluyó con acetato de etilo. Los orgánicos se extrajeron con bicarbonato saturado, agua, y luego salmuera. Los orgánicos se secaron sobre MgSO4, se filtraron, y el disolvente se removió bajo presión reducida. Se purificó sobre sílice (del 0 al 5 % de metanol/dicloro-metano), para proporcionar el trip�ptido (694 mg, 23 %) como un sólido blanco. �H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 5,99 (m, 1H), 5,37-5,02 (s a, 5H), 4,66 (m, 1H), 4,52 (m, 1H), 4,364,01 (s a, 6H), 3,94 (m, 1H), 3,83 (m, 1H), 2,47 (m, 2H), 2,01-1,47 (bs; 10H), 1,36 (m, 7H),1,04 (s, 9H). LC/MS: 558 (M+ + 1).

Paso 4. A una solución del precursor de trip�ptido de hidroxi-prolina (200 mg, 0,359 mmol) en 4 ml de dimetilformamida a temperatura ambiente, se le agregaron 4-bromo-.ftalimida (97 mg, 0,430 mmol) y trifenil-fosfina (206 mg, 0,789 mmol). Se sonic� hasta disolverse, y se agregó DIAD (152 μl, 0,789 mmol). Se agit� a temperatura ambiente durante la noche. Se removió el disolvente bajo presión reducida, y se extrajo con acetato de etilo y agua. Las capas se separaron y se secaron sobre MgSO4, se filtraron, y se separaron. Se purificó utilizando cromatograf�a en gel de sílice (eluyendo con del 10 al 100 % de acetato de etilo en hexano). Se purificó adicional en HPLC de fase inversa (ACN/agua), para proporcionar el 102 como un sólido blanco (98 mg, 36 %). �H RMN (300 MHz, CDCI3): δ 7,95 (s, 1H), 7,88 (d, J=7,9 Hz, 1H), 7,71 (d, J= 7,7 Hz, 1H), 7,65 (s, 1H), 7,43 (s, 1H), 6,03 (m, 1H), 5,37 (d, J= 15,5 1H), 5,31-5,07 (s a, 5H), 4,91 (m, 1H), 4,77 (m, 1H), 4,23-4,03 (s a, 7H), 3,81 (t, J= 7,9 Hz, 1H), 2,75 (m, 2H), 2,01 (m, 1H), 1,68-1,50 (s a, 8H), 1,30 (q, J= 7,0 Hz, 6H), 1,10 (s, 1H), 0,99 (s, 9H). 31P RMN (300 MHz, CDCl3): δ 22,92 (s, 1P), 22,75 (s, 1P). LC/MS: 766 (M+ + 1).

Ejemplo 103. Preparación del compuesto 103.

Una solución del 102 (85 mg, 0,111 mmol) en 2 ml de piperidina, se calentó a 80 �C durante la noche, en un recipiente a presión. El disolvente se removió bajo presión reducida, y se purificó en HPLC de preparación en fase inversa (ACN/agua), para proporcionar el 103 (48,5 mg, 53 %) como un sólido blanco. �H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 7,71 (s, 1H), 7,48 (m, 2H), 7,29 (m, 1H), 7,01 (m, 1H), 6,11 (m, 1H), 5,30-5,15 (s a, 2H), 4,97 (d, J= 11,3 Hz, 2H), 4,62 (s, 2H), 4,15 (m, 1H), 3,98-3,71 (s a, 3H), 3,16-3,05 (s a, 3H), 2,40-2,20 (s a, 2H), 2,15-1,15 (s a, 8H), 1,02 (s, 9H). 31P RMN (300 MHz, CDCI3): δ 15,86 (s, 1P), 14,91 (s, 1P). LC/MS: 824 (M+ + 1).

Ejemplo 104: Preparación del compuesto 104.

A una solución del trip�ptido de hidroxi-prolina (50 mg, 0,08 mmol) en 1 mililitro de dimetil-formamida a temperatura ambiente, se le agregaron ftalimida (16 mg, 0,107 mmol) y trifenil-fosfina (46 mg, 0,176 mmol). Se sonic� hasta disolverse, y se agregó DIAD (34 μl, 0,176 mmol). Se agit� a temperatura ambiente durante la noche. Se removió el disolvente bajo presión reducida, y se extrajo con acetato de etilo y agua. Las capas se separaron y se secaron

sobre MgSO4, se filtraron, y se separaron. Se purificó utilizando cromatograf�a en gel de sílice (eluyendo con del 10 al 100 % de acetato de etilo en hexano). Se purificó adicionalmente en HPLC de fase inversa (ACN/agua), para proporcionar el 104 como un sólido blanco (37,4 mg, 69 %). �H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 7,85 (m, 2H), 7,74 (m, 2H), 7,43 (s, 1H), 7,27 (s, 1H), 6,08 (m, 1H), 5,31-5,12 (s a, 3H), 4,89 (m, 1H), 4,26-4,08 (s a, 3H), 3,88 (m, 1H), 2,76 (m, 2H), 1,96 (m, 1H), 1,87-1,25 (s a, 10H), 1,10 (s, 1H), 1,00 (s, 9H). 31P RMN (300 MHz, CDCl3): δ ppm: 22,95 (s, 1P), 22,76 (s, 1P). LC/MS: 687 (M+ + 1).

Ejemplo 105: Preparación del compuesto 105.

A una solución del 104 (30 mg, 0,04 mmol) en 1,0 ml de acetonitrilo, se le agregó 2,6-lutidina (25 μl, 7 equivalentes), y la solución se enfri� a 0 �C con agitaci�n. Se agregó lentamente TMSI (20 μl, 5 equivalentes), y la mezcla de reacción se dej� calentar a temperatura ambiente en el transcurso de 1 hora. La reacción se monitore� mediante LC/MS. La reacción se apagó con 1,0 ml de metanol, y se agit� durante 30 minutos. Los solventes se separaron y se diluyeron con acetonitrilo. Se purificó en HPLC de preparación en fase inversa (ACN/agua), para proporcionar el 105 como un sólido blanco (6 mg, 24 %). �H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 7,88 (m, 4H), 7,57 (s, 1H), 7,53 (d, J= 5,5 Hz, 1H), 6,70 (m, 1H), 6,08 (m, 2H), 5,27-4,77 (s a, 5H), 4,28 (m, 2H), 4,07-3,89 (s a, 3H), 2,82 (m, 2H), 2,42 (m, 2H) 2,03 (m, 1H), 1,68-1,24 (s a, 10H), 1,03 (s, 9H). 31P RMN (300 MHz, CDCl3): δ ppm: 18,82 (s, 1P), 18,48 (s, 1P). LC/MS: 631 (M+ + 1).

Descripci�n del ensayo biológico

Evaluaci�n de los inhibidores de proteasa:

Potencia enzim�tica de NS3:

Se forma un complejo de la proteasa NS3 purificada con el p�ptido NS4A, y luego se incuba con diluciones en serie del compuesto (sulf�xido de dimetilo utilizado como disolvente). Las reacciones se inician mediante la adición de un sustrato pept�dico de doble marca, y se mide el aumento cinético resultante en la fluorescencia. Se lleva a cabo la regresión no lineal de los datos de velocidad para calcular las IC50s. La actividad se prueba inicialmente contra la proteasa del genotipo 1b. Dependiendo de la potencia obtenida contra el genotipo 1b, se pueden probar genotipos adicionales (1a, 2a, 3) y/o enzimas resistentes al inhibidor de proteasa (mutantes D168Y, D168V, � A156T). Se utiliza BILN-2061 como un control durante todos los ensayos.

Potencia y Citotoxicidad del Replic�n:

Las células Huh-luc (que replican establemente el replic�n I389luc-ubi-neo/NS3-3’/ET genotipo 1b de Bartenschlager) se tratan con diluciones en serie del compuesto (se utiliza sulf�xido de dimetilo como disolvente) durante 72 horas. Se mide el número de copias del replic�n mediante bioluminiscencia, y se lleva a cabo la regresión no lineal para calcular las EC50s. Se ensayan placas paralelas tratadas con las mismas diluciones de fármaco para probar la fitotoxicidad, utilizando el ensayo de viabilidad celular Promega CellTiter-Glo. Dependiendo de la potencia alcanzada contra el replic�n 1b, los compuestos se pueden probar contra un replic�n genotipo 1a y/o replicones resistentes al inhibidor que codifiquen las mutaciones D168Y o A156T. Se utiliza BILN-2061 como un control durante todos los ensayos.

Efecto de las proteínas de suero sobre la potencia del replic�n:

Se conducen ensayos de replic�n en un medio de cultivo celular normal (DMEM + suero bovino fetal al 10 %) complementado con concentraciones fisiológicas de albúmina de suero humana (40 miligramos/mililitro), o glicoprote�na de α-ácido (1 miligramo/mililitro). Se comparan las EC50s en la presencia de las proteínas de suero humanas, con las EC50s en el medio normal para determinar el cambio de veces en la potencia.

Selectividad enzim�tica:

Se mide la inhibición de las proteasas de mamífero, incluyendo Elastasa Pancreática Porcina, Elastasa de Leucocitos Humanos, Proteasa 3, y Catepsina D, a la Km para los sustratos respectivos para cada enzima. Se compara la IC50 para cada enzima con la IC50 obtenida con la proteasa NS3 1b, para calcular la selectividad. Los compuestos representativos de la invención han mostrado actividad.

Citotoxicidad de células MT-4:

Las células MT4 se tratan con diluciones en serie de los compuestos durante un período de 5 días. Se mide la viabilidad celular al final del período de tratamiento, utilizando el ensayo Promega CellTiter Glo, y se lleva a cabo la regresión no lineal para calcular la EC50.

Concentraci�n del compuesto asociada con las células a la EC50:

Se incuban cultivos de células Huh-luc con el compuesto en concentraciones iguales a la EC50. En múltiples puntos del tiempo (de 0 a 72 horas), las células se lavan dos veces con el medio frío, y se extrae una muestra del medio con acetonitrilo al 85 % en cada punto del tiempo. Las células y los extractos de medio se analizan mediante LC/MS/MS para determinar la concentración molar de los compuestos en cada fracción. Los compuestos representativos de la invención han mostrado actividad.

Solubilidad y estabilidad:

La solubilidad se determina tomando una alícuota de solución de suministro de sulf�xido de dimetilo 10 mM, y preparando el compuesto en una concentración final de 100 ∃M en las soluciones de medio de prueba (suero regulado con fosfato, pH de 7,4, y HCl 0,1 N, pH de 1,5), con una concentración total de sulf�xido de dimetilo del 1 %. La solución de medio de prueba se incuba a temperatura ambiente con agitaci�n durante 1 hora. Luego la solución se centrifuga, y los sobrenadantes recuperados se ensayan mediante la HPLC/UV. La solubilidad se calcular� comparando la cantidad de compuesto detectada en la solución de prueba definida con la cantidad detectada en sulf�xido de dimetilo en la misma concentración. También se determinar� la estabilidad de los compuestos después de 1 hora de incubaci�n con suero regulado con fosfato a 37 �C.

Estabilidad en hepatocitos humanos, de perro y de rata, crioconservados:

Cada compuesto se incuba durante hasta 1 hora en suspensiones de hepatocitos (100 μl, 80,000 células por pozo) a 37 �C. Los hepatocitos crioconservados se reconstituyen en el medio de incubaci�n sin suero. La suspensión se transfiere a placas de 96 pozos (50 μl/pozo). Los compuestos se diluyen a 2 ∃M en el medio de incubaci�n, y luego se agregan a las suspensiones de hepatocitos para iniciar la incubaci�n. Se toman muestras a los 0, 10, 30, y 60 minutos después del inicio de la incubaci�n, y la reacción se apagar� con una mezcla consistente en ácido f�rmico al 0,3 % en acetonitrilo al 90 %/agua al 10 %. Se analiza la concentración del compuesto de cada muestra utilizando LC/MS/MS. Se determina la vida media de desaparición del compuesto en la suspensión de hepatocitos, ajustando los datos de concentración-tiempo con una ecuación exponencial monofásica. Los datos también se escalarán hacia arriba para representar la eliminación hepática intrínseca y/o la eliminación hepática total.

Estabilidad en la fracción hepática S9 de humano, perro y rata:

Cada compuesto se incuba durante hasta 1 hora en una suspensión de S9 (500 μl, 3 miligramos de proteína/mililitro) a 37 �C (n = 3). Los compuestos se agregan a la suspensión de S9 para iniciar la incubaci�n. Se toman muestras a los 0, 10, 30, y 60 minutos después de iniciarse la incubaci�n. Se analiza la concentración del compuesto en cada muestra utilizando LC/MS/MS. Se determina la vida media de desaparición del compuesto en la suspensión de S9 ajustando los datos de concentración-tiempo con una ecuación exponencial monofásica.

Permeabilidad a Caco-2:

Los compuestos se ensayan por medio de un servicio por contrato (Absorption Systems, Exton, PA). Se proporcionan los compuestos al contratista de una manera ciega. Se medir� la permeabilidad tanto hacia adelante (de A a B) como en reversa (de B a A). Se cultivan monocapas de Caco-2 hasta la confluencia sobre membranas de policarbonato microporosas, recubiertas con col�geno, en placas Costar Transwell� de 12 pozos. Los compuestos se dosifican sobre el lado apical para la permeabilidad hacia adelante (de A a B), y se dosifican sobre el lado basolateral para la permeabilidad en reversa (de B a A). Las células se incuban a 37 �C con CO2 al 5 %, en una incubadora humidificada. Al principio de la incubaci�n, y 1 hora y 2 horas después de la incubaci�n, se toma una alícuota de 200 μl de la cámara receptora, y es reemplazada con regulador de ensayo fresco. Se determina la concentración del compuesto en cada muestra con LC/MS/MS. Se calcula la permeabilidad aparente, Papp.

Enlace de proteína de plasma:

El enlace de proteína de plasma se mide mediante di�lisis en equilibrio. Cada compuesto se salpica en el plasma de control en una concentración final de 2 ∃M. El plasma salpicado y el regulador de fosfato se colocan sobre los lados opuestos de las celdas de di�lisis ensambladas, las cuales entonces se hacen girar lentamente en un baño de agua a 37 �C. Al final de la incubaci�n, se determina la concentración del compuesto en plasma y en regulador de fosfato. Se calcula el porcentaje no enlazado utilizando la siguiente ecuación:

En donde Cf y Cb son las concentraciones libres y enlazadas, determinadas como las concentraciones de regulador posterior a la di�lisis y de plasma, respectivamente.

Perfilaci�n de CYP450:

Cada compuesto se incuba con cada una de 5 enzimas CYP450 humanas recombinantes, incluyendo CYP1A2, CYP2C9, CYP3A4, CYP2D6, y CYP2C19, en la presencia y en ausencia de NADPH. Se tomarán muestras en serie de la muestra de incubaci�n al principio de la incubaci�n, y a los 5, 15, 30, 45, y 60 minutos después de iniciarse la incubaci�n. Se determina la concentración del compuesto en la mezcla de incubaci�n mediante LC/MS/MS. Se calcula el porcentaje del compuesto restante después de la incubaci�n en cada punto del tiempo mediante la comparación con el muestreo al principio de la incubaci�n.

Estabilidad en plasma de rata, perro, mono y humano:

Los compuestos se incubar�n durante hasta 2 horas en plasma (de rata, perro, mono, o humano) a 37 �C. Se agregan los compuestos al plasma en concentraciones finales de 1 y 10 microgramos/mililitro. Se toman alícuotas a los 0, 5, 15, 30, 60, y 120 minutos después de agregar el compuesto. Se mide la concentración de los compuestos y de los metabolitos mayores en cada punto del tiempo mediante LC/MS/MS.

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en:

   y

   y una sal no tóxica, farmac�uticamente aceptable del mismo.

2. 2.

   Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la reivindicación 1 y al menos un vehículo farmac�uticamente aceptable.

3. 3.

   La composición farmacéutica de acuerdo la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de trastornos asociados con el VHC.

4. 4.

   La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 2, que contiene adicionalmente un análogo de nucle�sido.

5. 5.

   La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 2, que contiene adicionalmente un interfer�n o un interfer�n pegilado.

6. 6.

   La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4, en la que dicho análogo de nucle�sido se selecciona entre ribavirina, viramidina, levovirina, un L-nuecle�sido e isatoribina, y dicho interfer�n es α-interfer�n o interfer�n pegilado.

7. 7.

   Un compuesto de la reivindicación 1 para su uso en un método para tratar la hepatitis C o un trastorno asociado con la hepatitis C.