ES2377535T3 - Anticuerpos anti-NGF humanizados - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti-NGF humanizado, o un fragmento del mismo que mantiene la actividad de unión a NGF, que comprende una región VH que tiene la secuencia de la SEC ID Nº : 17 y una región VL que tiene la secuencia de la SEC ID Nº : 18.

Description

Anticuerpos anti-NGF humanizados

Antecedentes

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-NGF humanizados.

La aplicación terapéutica y de diagnóstico de anticuerpos monoclonales de origen animal en seres humanos tiene contraindicaciones fundamentales, especialmente para regimenes terapéuticos que necesitan administraciones repetidas. En particular, los anticuerpos monoclonales murinos tienen una semivida relativamente corta y, cuando se usan en seres humanos, carecen de algunas características funcionales fundamentales de las inmunoglobulinas, tales como citotoxicidad dependiente del complemento y citotoxicidad mediada por células.

Además, los anticuerpos monoclonales de origen no humano contienen secuencias de aminoácidos inmunogénicas si se inyectan en pacientes. Numerosos estudios han demostrado que después de la inyección de un anticuerpo exógeno, los sujetos desarrollan una reacción inmune más bien fuerte contra el propio anticuerpo (conocida como reacción HAMA -siglas en inglés de anticuerpos humanos anti-ratón), eliminando completamente su utilidad terapéutica, con la formación de complejos inmunes, la alteración de la farmacocinética, la producción de reacciones alérgicas, etc. Además, considerando el número creciente de anticuerpos monoclonales diferentes desarrollados en ratones o en otros mamíferos (y, por lo tanto, antigénicos para seres humanos) para la terapia de diferentes patologías, los tratamientos, también para terapias no correlacionadas, pueden ser ineficaces o incluso peligrosos debido a la reactividad cruzada. Aunque la producción de los denominados anticuerpos quiméricos (regiones murinas variables unidas a regiones constantes de origen humano) ha producido algún resultado positivo, sigue habiendo un problema de inmunogenicidad significativo.

Los anticuerpos humanizados tienen al menos tres ventajas potenciales con respecto a los anticuerpos de origen animal en el campo del uso terapéutico en seres humanos. En primer lugar, la región efectora, al ser humana, puede interaccionar mejor con las otras partes del sistema inmune humano, destruyendo las células diana más eficazmente por medio de citotoxicidad dependiente del complemento o citotoxicidad dependiente de anticuerpos mediada por células. Además, el sistema inmune humano no reconoce la región marco o la región constante (C) del anticuerpo humanizado como exógena, y por lo tanto la respuesta de anticuerpos contra el anticuerpo humanizado se minimiza, tanto en relación con la respuesta contra un anticuerpo murino (totalmente extraño) como en relación con la respuesta inducida por un anticuerpo quimérico (parcialmente extraño).

Se ha notificado que los anticuerpos murinos inyectados en seres humanos tienen una semivida mucho más corta que los anticuerpos normales (Shaw et al., 1987). Los anticuerpos humanizados tienen una semivida muy similar a la de los anticuerpos humanos naturales, lo que permite una administración menos frecuente y dosis menores.

El principio básico de la humanización se configura transfiriendo la especificidad del reconocimiento de antígeno, es decir, los dominios de CDR, en el contexto de una inmunoglobulina humana ("CDR grafting", Winter y Milstein, 1991). Se han presentado varios ejemplos de anticuerpos humanizados, producidos con la intención de solucionar el problema de la inmunogenicidad (Maeda et al.,1991; Singer et al., 1993; Tempest et al., 1994; Kettleborough et al., 1991; Hsiao et al., 1994; Baca et al., 1997; Leger et al., 1997; Ellis et al., 1995; Sato et al., 1994; Jones et al., 1986; Benhar et al., 1994; Sha y Xiang, 1994; Shearman et al., 1991; Rosok et al., 1996; Gussow & Seemann,1991; Couto et al., 1994; Kashmiri et al., 1995; Baker et al., 1994; Riechmann et al., 1988; Gorman et al., 1991; Verhoeyen et al., 1988; Foote & Winter, 1992; Lewis & Crowe, 1991; Co et al.,1991; Co et al., 1991; Verhoeyen et al., 1991; Eigenbrot et al., 1994; Hamilton et al., 1997; Tempest et al., 1995; Verhoeyen et al., 1993; Cook et al.,, 1996; Poul et al., 1995; Co et al., 1992; Graziano et al.,1995; Presta et al., 1993; Hakimi et al., 1993; Roguska et al., 1996; Adair et al., 1994; Sato et al., 1993; Tempest et al., 1991; Sato et al., 1996; Kolbinger et al., 1993; Zhu y Carter, 1995; Sims et al., 1993; Routledge et al., 1991; Roguska et al., 1994; Queen et al., 1989; Carter et al., 1992).

La transcripción de un anticuerpo desde animal (generalmente murino) a humanizado implica el compromiso entre requisitos opuestos, cuya solución varía de un caso a otro. Para minimizar la inmunogenicidad, la inmunoglobulina deberá mantener tanta cantidad de secuencia humana aceptora como sea posible. En cualquier caso, para conservar las propiedades de unión originales, la región marco de la inmunoglobulina debe contener un número suficiente de mutaciones en la secuencia humana aceptora como para garantizar que la conformación de las regiones CDR es tan similar como sea posible a la de la inmunoglobulina murina donadora. Como consecuencia de estas consideraciones opuestas, para muchos anticuerpos humanizados se ha notificado una pérdida significativa en afinidad de unión con respecto a los anticuerpos murinos correspondientes (Jones et al., 1986; Shearman et al., 1991; Kettleborough, 1991; Gorman et al., 1991; Riechmann et al., 1988).

Actualmente, el método más común para la producción de inmunoglobulinas humanizadas se basa en el uso de secuencias genómicas sintéticas apropiadas, así como ADNc (Reichmann et al., 1988).

La solicitud de patente EP 592106 describe un método para la humanización de anticuerpos procedentes de roedores. El método se basa en la identificación de los restos de aminoácido expuestos en la superficie de la estructura tridimensional del anticuerpo a humanizar, en la identificación de los restos de aminoácido en las mismas posiciones en el anticuerpo humano correspondiente, y en el reemplazo de los restos identificados en la secuencia del anticuerpo de roedor por los identificados en el anticuerpo humano.

El documento WO 01/10203 describe animales transgénicos no humanos como sistemas modelo para patologías humanas, en particular ratones transgénicos que producen anticuerpo anti-NGF (Factor de Crecimiento Nervioso) y que pueden imitar diferentes patologías tales como síndromes neurodegenerativos.

El documento WO 02/096458 describe métodos para usar anticuerpos anti-NGF en el tratamiento de diversos trastornos relacionados con NGF, incluyendo asma, artritis y psoriasis.

Descripción de la invención

Los presentes inventores establecen un método para obtener formas humanizadas optimizadas de inmunoglobulinas que son sustancialmente no inmunogénicas en seres humanos, con una estrategia que se basa sistemáticamente en datos estructurales, obtenidos experimentalmente, procedentes de estudios cristalográficos. El método permite obtener anticuerpos en una forma adaptada a la formulación terapéutica y a otras aplicaciones médicas y de diagnóstico.

El método se basa completamente en datos estructurales para realizar las primeras etapas del diseño (en general más sujetas a error) de humanización. Las inmunoglobulinas humanizadas tienen dos pares de heterodímeros entre la cadena ligera y pesada, llevando al menos una de las cadenas una o más CDR de origen animal, unidas funcionalmente a segmentos de regiones de la región marco de origen humano. Por ejemplo, CDR de origen animal, junto con restos de aminoácido, asociados naturalmente, también de origen animal, se introducen en regiones marco de origen humano, para producir inmunoglobulinas humanizadas capaces de unirse a los antígenos respectivos, con afinidades comparables a las afinidades de las inmunoglobulinas originales de origen animal.

Usando este método, los inventores obtuvieron anticuerpos humanizados adecuados para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. En particular, se han obtenido inmunoglobulinas humanizadas, derivadas de anticuerpos anti-NGF capaces de unirse con alta especificidad a NGF, neutralizando la interacción entre el ligando y los receptores.

Por consiguiente, la invención proporciona un anticuerpo anti-NGF humanizado, o un fragmento del mismo que mantiene la actividad de unión a NGF, que comprende una región VH que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 17 y una región VL que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 18. Dichos anticuerpos son útiles para el tratamiento de tumores que dependen de NGF/TrkA, del dolor crónico y de formas de inflamación. En particular, los anticuerpos anti-NGF humanizados encuentran una aplicación terapéutica específica en patologías inducidas por el virus VIH, induciendo la apoptosis de células inmunes, tales como macrófagos dependientes de NGF infectados por VIH.

Los presentes inventores establecen un método para la humanización de las regiones variables VH y VL de un anticuerpo animal de secuencia conocida, que comprende las etapas de:

a) si no está disponible, obtención de la estructura cristalográfica de las regiones VH y VL del anticuerpo animal; b) preselección de una serie de 0 a n aceptores de regiones marco posibles de anticuerpos de origen humano o humanizados, cuya estructura se determinó experimentalmente con una resolución no menor de3 Å, basándose en el máximo nivel de homología e identidad con la secuencia primaria de la región marco del anticuerpo animal; c) realización de una comparación estructural entre las regiones variables VH y VL del anticuerpo animal y las regiones VH y VL obtenidas en b), respectivamente, y cálculo para cada comparación del RMS (error cuadrático medio), para identificar la región VH y la región VL de origen humano con el RMS menor; d) inserción en la posición apropiada de las secuencias de las regiones CDR del anticuerpo animal en las secuencias humanas identificadas en c); e) si es necesario, retromutación de uno o más restos de aminoácido de las regiones VH y VL humanas identificadas en c).

Preferentemente, las modificaciones del anticuerpo se realizan con técnicas de ADN recombinante.

En una realización preferida, el anticuerpo animal es un anticuerpo anti-NGF, preferentemente es el anticuerpo alfa D11, y las secuencias humanizadas esencialmente tienen las siguientes secuencias de VH: VH de D11 alfa Hum, EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTNNNVNWVQAPGKGLEWVGGV WAGGATDYNSALKSRFTISRD-NSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGYSS STLYAMDAWGQGTLVTVSS, (SEC ID Nº: 17) y VL: Vk de D11 alfa Hum, DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYNALAWYQQKPGKAPKLLIYNTDTL HTGVPSRFSGSGSG-TDYTLTISSLQPEDFATYFCQHYFHYPRTFGQGTKVEIK (SEC ID Nº: 18).

Las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invención (o fragmentos derivados que mantienen actividades de unión y otros compuestos que pueden obtenerse a partir de las mismas) pueden producirse por medio de técnicas de ADN recombinante conocidas. En función del uso posterior de las inmunoglobulinas humanizadas, pueden usarse animales transgénicos o células transfectadas para su expresión, preferentemente células eucariotas inmortalizadas (tales como células de mieloma o hibridoma), pero también células hospedadoras procariotas, células de insecto o vegetales. Los polinucleótidos codificantes de las secuencias resultantes de las inmunoglobulinas humanizadas también pueden obtenerse por síntesis.

Las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invención pueden usarse solas o en combinación con otros agentes terapéuticos. En el caso del uso como agentes antitumorales, se preferirá un agente quimioterapéutico, que puede variar dependiendo de la aplicación farmacológica (tal como antraciclina, paclitaxel, cisplatino, gemcitabina, antiinflamatorios no esteroideso y corticosteroides o inmunosupresores), así como con todos los fármacos aplicados actualmente en la terapia de cada patología específica. Las inmunoglobulinas humanizadas o sus complejos pueden prepararse en forma de dosificaciones farmacológicamente aceptables, que varían dependiendo del tipo de administración.

Definiciones

La expresión “sustancialmente idéntico”, dentro del contexto de dos polinucleótidos o polipéptidos (respectivamente secuencias de ADN codificante de inmunoglobulinas humanizadas o secuencias de aminoácidos de inmunoglobulinas humanizadas, o partes de las mismas), se refiere a dos o más secuencias que tienen un mínimo de identidad del 80% (preferentemente del 90-95% o mayor) en los restos de nucleótido o aminoácido, cuando se comparan y alinean con la correspondencia máxima. Generalmente, la “identidad sustancial” se verifica en regiones que tienen una longitud de al menos 50 restos, más preferentemente en una región de al menos 100 restos o, en condiciones óptimas, en más de 150 restos o en las secuencias completas. Como se describe más adelante, dos secuencias cualesquiera de anticuerpos pueden alinearse sólo de una manera, usando el esquema de numeración de Kabat. Por consiguiente, para los anticuerpos, el porcentaje de identidad tiene un significado único y bien definido. Los aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas maduras se denominan Hx y Lx, siendo x el número que indica la posición del aminoácido de acuerdo con el esquema de numeración de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda MD, 1987, 1991). Kabat ha determinado una lista de secuencias de aminoácidos de anticuerpos para cada subgrupo así como una lista de los aminoácidos más frecuentes en cada posición en cada subgrupo para generar una secuencia consenso. Kabat usa un método para asignar un número a cada aminoácido de cada secuencia de la lista y este método para asignar el número de cada resto se ha convertido en un método estándar en este campo. El esquema de Kabat puede extenderse a otros anticuerpos no presentes en su estudio, alineando el anticuerpo en cuestión con una de las secuencias consenso identificadas por Kabat, basándose en los aminoácidos conservados. El uso del sistema de numeración de Kabat permite identificar fácilmente los aminoácidos en posiciones equivalentes en diferentes anticuerpos. Por ejemplo, un aminoácido en la posición L10 en un anticuerpo de origen humano ocupa la posición equivalente de un aminoácido en la posición L10 en un anticuerpo de origen murino.

Es bien sabido que la unidad estructural básica de un anticuerpo comprende un tetrámero. Cada tetrámero está constituido por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, de las que cada una está compuesta por una cadena ligera (25 KDa) y por una cadena pesada (50-75 KDa). La región amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100-110 o más aminoácidos, que están implicados en el reconocimiento del antígeno. La región carboxi-terminal de cada cadena comprende la región constante que media la función efectora. Las regiones variables de cada par de cadenas pesada y ligera forma el sitio de unión del anticuerpo. Por lo tanto, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión.

Las cadenas ligeras se clasifican como K o A. Las cadenas pesadas se clasifican como y, !, a, s y definen el isotipo del anticuerpo como, respectivamente, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Dentro de la cadena ligera y de la cadena pesada, las regiones variables y constantes están unidas por una región “J” de aproximadamente 12 aminoácidos o más, mientras que únicamente las cadenas pesadas incluyen una región “D” de aproximadamente 10 aminoácidos (Paul, 1993).

Las regiones variables de cada par de cadenas ligera y pesada forman el sitio de unión del anticuerpo. Se caracterizan por la misma estructura general constituida por regiones relativamente conservadas denominadas regiones marco (FR) unidas por tres regiones hipervariables denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR) (Kabat et al., 1987; Chothia y Lesk, 1987). Las CDR de las dos cadenas de cada par se alinean por las regiones marco, adquiriendo la función de unión a un epítopo específico. Empezando desde la región amino-terminal hacia la región carboxi-terminal, los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada comprenden una alternancia de regiones FR y CDR: FR, CDR, FR, CDR, FR, CDR, FR; por consiguiente, tanto la cadena pesada como la cadena ligera se caracterizan por tres CDR, respectivamente CDRH1, CDRH2, CDRH3 y CDRL1, CDRL2, CDRL3. La asignación de aminoácidos a cada región se realizó de acuerdo con las definiciones de Kabat (1987 y 1991) y/o Chothia y Lesk (1987), Chothia et al. (1989).

Preferentemente, los análogos de las inmunoglobulinas humanizadas ejemplificadas difieren de las inmunoglobulinas originales debido a sustituciones de aminoácidos conservativas. Para clasificar las sustituciones de aminoácidos como conservativas o no conservativas, los aminoácidos pueden agruparse como se indica a continuación:

Grupo I (cadenas laterales hidrófobas): M, A, V, L, I; Grupo II (cadenas laterales hidrófilas neutras): C, S, T, N, Q; Grupo III (cadenas laterales ácidas): D, E; Grupo IV (cadenas laterales básicas): K, R; Grupo V (restos que influyen en la orientación de la cadena principal): G, P; Grupo VI (cadenas laterales aromáticas): F, Y, W. Las sustituciones de aminoácidos conservativas se refieren a sustituciones entre aminoácidos de la misma clase, mientras que las sustituciones de aminoácidos no conservativas implican un intercambio entre miembros de clases diferentes.

El término “epítopo” incluye todos los determinantes proteicos capaces de unirse a una inmunoglobulina de una forma específica. En general, los epítopos se forman por series de superficies de macromoléculas químicamente activas, tales como cadenas laterales de aminoácidos o azúcares, y generalmente tienen características químicofísicas y conformacionales específicas.

El término “inmunoglobulina” se refiere a proteínas que consisten en uno o más polipéptidos codificados por genes de las inmunoglobulinas. Las inmunoglobulinas pueden existir en una diversidad de formas, además de la forma de anticuerpo tetramérica: por ejemplo, incluyen fragmentos Fv, Fab y F(ab’) así como anticuerpos híbridos bifuncionales (Lanzavecchia et al., 1987) y fragmentos Fv monocatenarios (Hood et al., 1984; Harlow y Lane, 1988; Hunkapiller y Hood, 1986).

Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos cuyos genes para las cadenas ligera y pesada se han modificado por ingeniería genética empezando a partir de regiones de genes de inmunoglobulinas que pertenecen a diferentes especies. Por ejemplo, pueden unirse segmentos variables (V) de los genes de un anticuerpo monoclonal de ratón a segmentos constantes (C) de un anticuerpo de origen humano. Por lo tanto, un anticuerpo quimérico terapéutico es una proteína híbrida que consiste en el dominio V que reconoce el antígeno procedente de un anticuerpo de ratón y en el dominio efector C procedente de un anticuerpo humano (aunque pueden usarse otras combinaciones de especies de mamífero).

La expresión “región marco” se refiere a las partes de las regiones variables de la cadena ligera y pesada de las inmunoglobulinas que están relativamente conservadas (que no pertenecen a las CDR) entre diferentes inmunoglobulinas dentro de una especie, de acuerdo con la definición de Kabat. Por lo tanto, una región marco humana es una región marco que es sustancialmente idéntica (al menos en un 85% o más) a la región marco que se encuentra naturalmente en los anticuerpos humanos.

La expresión “inmunoglobulina humanizada” se refiere a una inmunoglobulina que comprende una región marco humana y al menos una CDR que procede de un anticuerpo no humano y en la que cada región constante presente es sustancialmente idéntica a una región de inmunoglobulina humana (idéntica en al menos un 85%, preferentemente en al menos un 90-95%). Por lo tanto, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada excepto la CDR son sustancialmente idénticas a las regiones correspondientes de una o más secuencias de inmunoglobulinas humanas naturales. Por ejemplo, los anticuerpos quiméricos, constituidos por regiones variables de ratón y regiones constantes de origen humano, no se incluyen entre las inmunoglobulinas humanizadas.

Descripción detallada de la invención

El método se basa en la comparación estructural de alta resolución para la humanización de anticuerpos de interés terapéutico in vivo. Además, se proporcionan inmunoglobulinas humanizadas, capaces de reaccionar específicamente con los antígenos respectivos (es decir, neurotrofina NGF). Las inmunoglobulinas humanizadas tienen una región marco de origen humano y tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) derivadas de la inmunoglobulina original (es decir, aD11, una inmunoglobulina de rata, reactiva específicamente con NGF). Por lo tanto, las inmunoglobulinas de la presente invención, que pueden producirse fácilmente a gran escala, encuentran aplicación terapéutica no sólo en la terapia de formas tumorales dependientes de NGF/TrkA, sino también en el tratamiento del dolor crónico y formas inflamatorias.

La presente invención usa los segmentos recombinantes de ADN que codifican las regiones CDR de la cadena ligera y pesada, capaces de unirse a un epítopo de interés en NGF como en el caso de los anticuerpos monoclonales de rata aD11. Los segmentos de ADN codificantes de estas regiones se unen a los segmentos de ADN que codifican regiones marco apropiadas de origen humano. Las secuencias de ADN que codifican las cadenas polipeptídicas que comprenden las CDR de la cadena ligera y pesada del anticuerpo monoclonal aD11 se incluyen en la Figura 4A y 4B respectivamente. Debido a la degeneración del código genético y a las sustituciones de aminoácidos no críticos, las secuencias de ADN pueden modificarse fácilmente.

Además, los segmentos de ADN típicamente incluyen una secuencia de control adicional para la expresión, unida operativamente a las secuencias codificantes de inmunoglobulinas humanizadas, y que comprende regiones de

promotores heterólogos o asociados de forma natural. Preferentemente, las secuencias de control de la expresión son sistemas con promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células hospedadoras eucariotas, pero también pueden usarse secuencias de control procariotas. Una vez que se ha incorporado el vector en el hospedador apropiado, el hospedador se mantiene en condiciones adecuadas para asegurar un alto nivel de expresión. A continuación se realiza una purificación adicional de las cadenas ligera y pesada individualmente en forma de dímeros, de anticuerpos intactos o de otras formas de inmunoglobulinas.

Las secuencias de ADN codificante para la región constante humana pueden aislarse por medio de procedimientos bien conocidos a partir de una diversidad de células humanas, pero preferentemente a partir de células B inmortalizadas. Las CDR presentes en las inmunoglobulinas de la presente invención proceden de forma similar del anticuerpo monoclonal aD11 capaz de unirse a NGF y productos en rata. Pueden obtenerse células hospedadoras adecuadas para la expresión y secreción de inmunoglobulinas a partir de muchas fuentes tales como la Colección Americana de Cultivos Tipo (Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, Quinta edición (1985) Rockville, Maryland, Estados Unidos). Las CDR incorporadas en los anticuerpos humanizados tienen secuencias correspondientes a las de las CDR de aD11 y pueden incluir secuencias de nucleótidos degeneradas que codifican las secuencias de aminoácidos correspondientes de los propios anticuerpos. En general, el procedimiento de diseño de humanización es cíclico e iterativo y comprende: el análisis de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo murino; el modelado de la región Fv correspondiente; el análisis y selección de la secuencia de aminoácidos de la región marco aceptora del anticuerpo humano; la identificación de supuestas retromutaciones en la región marco seleccionada; el diseño y la construcción real del anticuerpo humanizado; la verificación, por medio de ensayos in vitro y/o in vivo, de la afinidad y especificidad mantenidas de la unión.

Si estas actividades se ven influenciadas negativamente por la región marco humana, será necesario cambiar la selección de la región marco de los anticuerpos humanos aceptores, o introducir mutaciones de compensación.

Aunque la elección de la región marco humana esté configurada como la fase más crítica del ciclo, hasta la fecha no se han establecido reglas generales. Esto depende del hecho de que las ventajas de las diversas elecciones (en términos de inmunogenicidad en el paciente) no se hayan estudiado de forma precisa desde el punto de vista clínico. Por lo tanto, para realizar la elección correcta de la región marco, sólo se dispone de una serie de estrategias, que deben combinarse con los resultados obtenidos previamente.

En particular, es posible usar regiones marco fijas (normalmente NEW para la cadena pesada y REI para la cadena ligera, ya que sus estructuras están disponibles desde hace mucho tiempo).

Otra estrategia permite el uso de las regiones marco consideradas más homólogas en términos de secuencia con el anticuerpo a humanizar. Hay muchas bases de datos para buscar anticuerpos humanos homólogos: la elección generalmente tiene en cuenta la longitud de las CDR, la identidad a nivel de restos canónicos y de los restos a nivel de la interfaz, además de un mayor porcentaje de identidad entre las secuencias del donante y del aceptor. Como comparación entre estos dos métodos, véase Graziano et al. (1995).

Además, de acuerdo con una variante de la segunda estrategia, la cadena ligera y la cadena pesada pueden elegirse de dos anticuerpos humanos diferentes caracterizados por una mayor homología de secuencia. Esta estrategia se propuso por Riechmann et al. (1988) y por Shearman et al. (1991). A este respecto, en general, las cadenas ligera y pesada que proceden del mismo anticuerpo tienen una mayor probabilidad de asociarse correctamente, formando un sitio de unión funcional, con respecto a las cadenas ligera y pesada que proceden de anticuerpos diferentes, aunque el hecho de que la interfaz entre las dos cadenas esté bastante conservada puede asegurar igualmente una interacción correcta. Como comparación entre estos dos métodos, véase Roguska et al. (1996 y 1996).

La limitación de la estrategia a una región marco que procede de un anticuerpo humano particular puede implicar el riesgo de incurrir en mutaciones somáticas que producen epítopos inmunogénicos aunque las regiones marco sean de origen humano. Una estrategia alternativa es usar regiones marco basadas en secuencias consenso humanas, en las que se han eliminado mutaciones somáticas idiosincráticas. Las dos estrategias se han comparado: en un caso, no se detectaron diferencias en la avidez de la unión (Kolbinger et al., 1993), y en el otro caso, sin embargo, la unión resultó superior en el caso de regiones marco individuales (Sato et al., 1994).

En cualquier caso, las propias secuencias consenso son artificiales y, por lo tanto, aunque no tengan restos idiosincráticos, pueden crear motivos no naturales que son inmunogénicos. La alternativa (Rosok et al., 1996) es usar secuencias humanas de línea germinal recogidas en la base de datos V-BASE.

La yuxtaposición no natural de las regiones CDR murinas con las regiones variables de la región marco de origen humano puede dar lugar a límites conformacionales no representados en la naturaleza que, a menos que se corrijan mediante la sustitución de restos de aminoácido particulares, determinan la pérdida de afinidad de unión. La selección de los restos de aminoácido a sustituir se determina parcialmente por medio de la creación de modelos por

ordenador. Se dispone de hardware y software para producir imágenes tridimensionales de moléculas de inmunoglobulina. En general, los modelos moleculares se producen a partir de estructuras cristalográficas ya resueltas de dominios o cadenas de inmunoglobulinas. Las cadenas a modelar se comparan basándose en la similitud de aminoácidos con cadenas o dominios de estructuras tridimensionales resueltas y las cadenas o los dominios que muestran la mayor similitud en términos de secuencia se seleccionan como puntos de partida en la construcción del modelo molecular. Sin embargo, la predicción de la estructura del anticuerpo no siempre es precisa. En particular, la tercera región CDR es difícil de modelar y siempre representa un punto de incertidumbre en la predicción estructural de un anticuerpo (Chothia et al., 1987). Por esta razón, por norma, los anticuerpos humanizados, como una primera aproximación, tienen bastante menos afinidad de unión y/o especificidad hacia el antígeno que el anticuerpo monoclonal de partida. Esto requiere muchos ciclos sucesivos de mutaciones puntuales con la intención de reconstituir las propiedades del anticuerpo de partida, con un procedimiento de ensayo y error que no puede racionalizarse completamente.

Considerando el número creciente de estructuras de rayos X de alta resolución de anticuerpos humanos y humanizados disponibles, la intención era evitar las incertidumbres y ambigüedades derivadas del uso de la creación de modelos por ordenador, obteniendo datos estructurales de alta resolución para los fragmentos Fab de los dos anticuerpos de la invención por medio de cristalografía de rayos X. Para este fin, los dos anticuerpos se purificaron a partir de hibridomas, tratados proteolíticamente con papaína (una proteasa que corta a nivel de la unión entre el dominio CH1 y CH2 de la cadena pesada), que da lugar a los fragmentos Fab. Como resultado de la purificación adicional, los dos fragmentos Fab se cristalizaron y a partir de dos bases de datos (de baja y alta resolución), fue posible resolver las estructuras con el método de Sustitución Molecular y posteriormente refinarlas. La estrategia propuesta por la invención, basada en datos estructurales obtenidos experimentalmente, proporciona un punto de partida mucho más sólido y racional, tanto en la fase crítica de la selección de la región marco del anticuerpo humano aceptor, como para la identificación de supuestas retromutaciones en las regiones marco seleccionadas dentro del proceso de humanización de los dos anticuerpos neutralizantes.

Entre los diversos criterios presentados que pueden guiar la selección de la región marco del anticuerpo humano, el usado fue el grado de identidad entre el anticuerpo de origen murino y humano en la secuencia primaria, para extender y completar sus resultados con un análisis basado en el alineamiento estructural. Un análisis comparado de las estructuras correspondientes asociado con el criterio original asegura una comparación mucho más precisa y, por consiguiente, una mayor probabilidad de que el anticuerpo humanizado resultante pueda conservar las características de afinidad y especificidad del anticuerpo murino original. Por consiguiente, la estrategia empleada combina la información procedente del análisis y comparación de las secuencias de aminoácidos, tanto en términos del grado de identidad como del nivel de homología, con la comparación de las estructuras tridimensionales respectivas.

En particular, la información procedente del alineamiento óptimo de las estructuras primarias tiene un papel doble. En primer lugar, este análisis permite reducir el número de estructuras terciarias posibles a comparar, limitándose a las caracterizadas por un alto grado de homología e identidad. Entre estas secuencias caracterizadas por un alineamiento óptimo a nivel de la estructura primaria y para las que se dispone de datos estructurales, se realizó una selección adicional, que se concentra sólo en las estructuras resueltas con alta resolución o, de otra manera, conuna resolución comparable a la de las estructuras obtenidas por nosotros (es decir, no mayores de 2,5 Å). Esta estrategia asegura un alineamiento mucho más preciso de las estructuras terciarias y una estimación mucho más significativa de las diferencias estructurales, expresadas en RMS (desviación del valor cuadrático medio: raíz cuadrada de la desviación cuadrática media; Carugo y Pongor, 2001 y 2003). Los datos de baja resolución proporcionan una información más bien indicativa, y definitivamente menos precisa sobre la posición relativa real de cada átomo individual en el espacio.

Para evaluar el grado de superposición de cada estructura individual, de origen humano o modificada por ingeniería genética, se calculó la RMS entre átomos de carbono alfa que constituyen los esqueletos de aminoácidosrespectivos, sin considerar los pares de átomos con una RMS superior a 2 Å. A partir de este análisis, se obtiene una información que, por lo tanto, debe tener en cuenta no sólo la diversidad entre las estructuras (expresada por el valor de RMS), sino también el porcentaje de átomos de carbono alfa realmente empleados para calcular cada RMS.

Estos datos de similitud a nivel de la estructura terciaria se asociaron con el análisis comparativo de las secuencias primarias tanto en términos de identidad como en términos de homología.

Por lo tanto, se deduce que la selección de la región marco óptima para la humanización se configura como un problema de tres variables, que por lo tanto puede representarse en el espacio, cuando se asocia el nivel de homología y el grado de identidad con el alineamiento estructural. Este tipo de análisis después se realizó también reduciendo las regiones en cuestión en los dos tipos de alineamiento a las regiones de los marcos respectivos. Comparando las distribuciones de los anticuerpos considerados en el espacio de las tres variables analizadas (respectivamente, valor de RMS, porcentajes de átomos sobre los que se calculó la RMS e índice de similitud entre las estructuras primarias, es decir porcentaje de identidad global, de homología global, de identidad a nivel de la región marco, y de homología a nivel de la región marco) con la posición óptima en el espacio de las tres variables que ocuparía cada anticuerpo si fuera de origen humano, es posible identificar claramente el anticuerpo de origen humano que se aproxima más a esta posición ideal a nivel de la estructura primaria y terciaria. Para racionalizar este resultado, en cada uno de los cuatro análisis se calculan las desviaciones desde la posición óptima hipotética para cada posición de los anticuerpos humanizados o de origen humano considerados.

5 Basándose en este método de selección, es posible elegir la región marco aceptora en el posterior proceso de injerto de CDR para la humanización de un anticuerpo dado.

En general, es necesario minimizar las sustituciones de restos de aminoácido de origen humano con restos de origen murino, ya que la introducción de restos murinos aumenta el riesgo de que el anticuerpo induzca una 10 respuesta HAMA en el paciente humano. Por otra parte, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) contienen los restos con la mayor probabilidad de interacción con el antígeno y, por esta razón, tienen que mantenerse en el anticuerpo humanizado. Se definen por medio de la secuencia de acuerdo con Kabat o por medio de la estructura de acuerdo con Chothia. La ventaja de usar el segundo sistema para definirlos es que, en general, las CDR son más cortas y, por lo tanto, el anticuerpo humanizado se constituye por una menor fracción de

15 fragmentos xenogénicos. En cualquier caso, se ha demostrado que generalmente siguiendo las definiciones de Kabat es posible reducir espectacularmente el número de ciclos necesarios para la humanización. Una vez definidas las CDR, es necesario identificar las clases canónicas (definidas por Chothia y Lesk) a las que pertenecen y posteriormente mantener los restos canónicos en los anticuerpos humanizados.

20 También es esencial analizar los restos que medían la interacción entre la cadena ligera y la cadena pesada de los dominios variables (Tabla 1), manteniendo cualquier resto poco habitual en el anticuerpo humanizado (Singer et al., 1993; Daugherty et al.; 1991; De Martino et al., 1991).

Además, los aminoácidos adicionales a mantener se seleccionan basándose en su posible influencia sobre la

25 conformación de las CDR y/o sobre la interacción con el antígeno. Cuando el aminoácido difiere entre la región marco de origen animal y la región marco aceptora equivalente de origen humano, el aminoácido de la región marco aceptora debe sustituirse por el resto murino equivalente, si es razonable esperar que el aminoácido esté en contacto directo no covalente con el antígeno, o esté adyacente a una región CDR, o en cualquier caso interaccionacon una región CDR (está situado dentro de una distancia de 4-6 Å de una región CDR).

30 TABLA 1

Restos que medían la interacción entre la cadena ligera y la cadena pesada de los dominios variables CADENA VARIABLE LIGERA L CADENA VARIABLE PESADA H

Posición de Kabat

Ratón Humano Posición de Kabat Ratón Humano

34

H678 N420 A408Y147E114 A531 N147D66 35 H1001 N636 S402E184 S527H340G167 A143

36

Y1653F198L96 Y748 F80 37 V2336 I200 V1037I477L27

38

Q1865H47 Q799 H22 39 Q2518K67 Q1539R16

44 (A)

P1767V132 I40 P839L5 45 (A) L2636P16 L1531 P24

46

L1381 R374P97 L760 V37 47 W2518L64Y50 W1534Y21

87

Y1457F448 Y795 F41 91 Y2149F479 Y1429F116

89

Q1170L206 F144 Q687M107 93 A2202 T222 V102 A1346T90V71

91

W376 S374 G356 Y295 H182 Y404R115S105 A84 95 Y399G375S340 D340 R226 D268 G266 R109E100

96 (A)

L537 Y380 W285 L134Y215F78 W73 171 100k (A) F1285M450 F540M109L33

98 (A)

F1724 F654 103 (A) W1469 W323

En particular, un análisis adicional implica otros restos que definen la denominada zona Vernier, una zona que estabiliza la estructura de las CDR; es importante mantener las características de esta región.

Otros restos candidatos para la mutación son aminoácidos de la región marco aceptora que son poco habituales para una inmunoglobulina humana en esa posición. Estos restos pueden sustituirse con aminoácidos que proceden de la posición equivalente de inmunoglobulinas humanas más típicas o, como alternativa, pueden introducirse restos que proceden de la posición equivalente de la región marco donadora en la región marco aceptora cuando dichos aminoácidos son típicos para las inmunoglobulinas humanas en esas posiciones particulares.

Además, de nuevo basándose en las secuencias consenso de inmunoglobulinas humanas, se introducen mutaciones en la forma humanizada que insertan restos conservados en el humano en lugar de los restos poco habituales presentes tanto en la región marco donadora como en la región marco aceptora.

Después se modifican los pares respectivos de estructuras cristalográficas, realizando primero el injerto de las CDR de origen animal en las regiones marco humanas. Después se introducen todas las mutaciones y retromutaciones descritas anteriormente. Las estructuras modificadas después se ensamblan en inmunoglobulinas compuestas. Los modelos resultantes se refinan minimizando la energía mecánica (en términos de ángulos de torsión y ángulos y distancias de unión) usando el campo de fuerzas.

Para todas las demás regiones, diferentes de las sustituciones de aminoácidos específicas analizadas anteriormente, las regiones marco de las inmunoglobulinas inmunizadas normalmente son sustancialmente idénticas a las regiones marco de los anticuerpos humanos de los que proceden. En cualquier caso, en estas proteínas modificadas por ingeniería genética obtenidas por injerto, las regiones marco pueden variar con respecto a la secuencia nativa a nivel de la estructura primaria debido a muchas sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos, terminales o intermedias, y otros cambios. Naturalmente, la mayoría de los restos en la región marco aportan una contribución muy pequeña o incluso inexistente a la especificidad o afinidad de un anticuerpo. Por lo tanto, muchas sustituciones conservativas individuales en los restos de la región marco pueden tolerarse sin variaciones apreciables de la especificidad o afinidad en la inmunoglobulina humanizada resultante. En general, sin embargo, dichas sustituciones no son deseables. Es posible obtener modificaciones en la secuencia de nucleótidos con una diversidad de técnicas empleadas generalmente, tales como mutagénesis dirigida (Gillman & Smith, 1979; Roberts et al., 1987).

Pueden producirse fragmentos polipeptídicos alternativos que comprenden sólo parte de la estructura primaria del anticuerpo, reteniendo dichos fragmentos una o más actividades peculiares de las inmunoglobulinas (es decir, la actividad de unión). Estos fragmentos polipeptídicos pueden producirse por medio de digestión proteolítica a partir de anticuerpos intactos o insertando codones de terminación en las posiciones deseadas en los vehículos que llevan las secuencias de ADN codificantes de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera por medio de mutagénesis dirigida (en particular, después de la región CH1 para producir fragmentos Fab o después de la región de bisagra para producir fragmentos (Fab')2). Pueden obtenerse anticuerpos en forma de scFv uniendo las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera por medio de un enlazador (Huston et al., 1988; Bird et al., 1988). Los fragmentos Fv o Fab pueden expresarse en E. coli (Buchner y Rudolph, 1991; Skerra et al., 1991) o también en células eucariotas, preferentemente procedentes de mamífero. Considerando que, al igual que muchos otros genes, los genes de la superfamilia de las inmunoglobulinas contienen regiones funcionales distintas, cada una caracterizada por una o más actividades biológicas específicas, los genes pueden fusionarse a regiones funcionales procedentes de otros genes (por ejemplo, enzimas) para producir proteínas de fusión (por ejemplo, inmunotoxinas) que disponen de nuevas propiedades.

La expresión de secuencias de inmunoglobulina humanizadas en bacterias puede usarse para seleccionar secuencias de inmunoglobulinas humanizadas caracterizadas por una mayor afinidad, mutagenizando las regiones CDR y produciendo bibliotecas de fagos para la presentación en fagos. Usando estas bibliotecas, es posible realizar una selección para buscar variantes a nivel de las CDR de las inmunoglobulinas humanizadas que tienen una mayor afinidad y/o especificidad de unión por los antígenos. Se han presentado ampliamente métodos para obtener bibliotecas de presentación en fagos que llevan secuencias de las regiones variables de inmunoglobulinas (Cesareni, 1992; Swimmer et al., 1992; Gram et al., 1992; Clackson et al., 1991; Scott & Smith, 1990; Garrard et al, 1991). Las secuencias resultantes de las variantes de inmunoglobulinas humanizadas, cuyas CDR se remodelaron de esta manera, posteriormente se expresan en un hospedador que es adecuado para asegurar una alta expresión de las mismas.

Como se ha indicado anteriormente, las secuencias de ADN se expresan en las células hospedadoras después de unirse operativamente (es decir, colocarse de tal forma que se asegure su funcionalidad) a secuencias de control de la expresión. Estos vehículos típicamente pueden replicarse en el organismo hospedador como episomas o como una parte integral del ADN cromosómico. Comúnmente, los vehículos de expresión contienen un marcador de selección que permite identificar las células que se han transformado con las secuencias de ADN de interés.

Para la producción de las inmunoglobulinas humanizadas de la invención en forma recombinante de scFv o en forma de Fab, se prefieren los sistemas procariotas. E. coli es uno de los hospedadores procariotas que es particularmente útil para clonar las secuencias de ADN de la presente invención. Además, se dispone de un gran número de promotores bien caracterizados, por ejemplo, el operón lac o trp, o la 1-lactamasa o el fago A. Típicamente, estos promotores controlan la expresión y llevan sitios de unión para el ribosoma, para el inicio y terminación correctos de la transcripción y traducción. Es posible aumentar la semivida de las inmunoglobulinas humanizadas de la invención producidas en sistemas procariotas por conjugación por polietilenglicol (PEG).

Para la expresión pueden usarse otros organismos unicelulares, tales como levaduras. El hospedador de elección es Saccharomyces, usando vehículos adecuados que disponen de secuencias de control de la expresión, terminación y origen de replicación.

También pueden usarse cultivos de células de insecto para producir las inmunoglobulinas humanizadas de la invención, típicamente usando células de Drosophila S2 transfectadas de forma estable o células de Spodoptera frugiperda con el sistema de expresión basado en el Baculovirus (Putlitz et al., 1990).

Pueden usarse plantas y cultivos de células vegetales para la expresión de las inmunoglobulinas humanizadas de la invención. (Larrick& Fry, 1991; Benvenuto et al., 1991; Durin et al., 1990; Hiatt et al., 1989).

Sin embargo, en todos estos casos es imposible obtener el tipo correcto de glicosilación necesaria para asegurar la función efectora en la activación del sistema inmune humano. Para este fin, es posible usar cultivos de tejidos de células de mamífero para expresar los polipéptidos de la presente invención en forma integral de IgG1, que han resultado ser el isotipo más eficaz entre inmunoglobulinas séricas en la inducción de la respuesta inmune (Winnacker, 1987). Debe subrayarse que, considerando que el isotipo determina el potencial lítico de un anticuerpo, generalmente se usa el isotipo IgG1 con fines terapéuticos (ya que induce la respuesta inmune, tanto mediada por células como mediada por el sistema del complemento), mientras que la IgG4 se usa para aplicaciones de diagnóstico (Riechmann et al., 1988). En particular, se prefieren las células de mamífero, considerando el gran número de líneas de células hospedadoras desarrolladas para la secreción de inmunoglobulinas intactas, entre ellas las líneas celulares CHO, varias líneas de COS, las células HeLa, líneas celulares de mieloma (NS0, SP/2, YB/0 e P3X63.Ag8.653), células B transformadas o hibridoma. Los vehículos de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, un potenciador (Queen et al., 1986) y las secuencias necesarias para la unión al ribosoma, corte y empalme del ARN y poliadenilación, y secuencias para la terminación de la transcripción. Las secuencias de control de la expresión de elección son promotores que proceden de genes de inmunoglobulinas y de virus, tales como SV40, Adenovirus, Virus del Papiloma Bovino, Citomegalovirus y similares. En general, el vector de expresión incluye un marcador de selección, tal como la resistencia a neomicina.

Para la expresión de anticuerpos humanizados, es preferible cultivar las líneas celulares de mamífero con un medio sin suero. Por ejemplo, la línea celular HUDREG-55 puede cultivarse fácilmente en Medio Sin Suero y Medio de Hibridoma Sin Proteína con el Nº de Cat. S-2897 de Sigma (St. Louis, Mo.).

Los genes que codifican las inmunoglobulinas humanizadas de la invención pueden usarse para generar animales transgénicos no humanos que expresan las inmunoglobulinas humanizadas de interés, típicamente en un fluido corporal recuperable tal como leche o suero. Dichos transgenes comprenden la secuencia polinucleotídica que codifica las inmunoglobulinas humanizadas unida operativamente a un promotor, normalmente con una secuencia potenciadora, tal como la de la inmunoglobulina de roedor o el promotor/potenciador del gen de caseína (Buhler et al., 1990; Meade et al., 1990). Los transgenes pueden transferirse a las células o embriones por medio de construcciones de recombinación homóloga. Entre los animales no humanos usados: ratón, rata, oveja, vaca y cabra (documento (WO91/08216).

Una vez que se expresan como anticuerpos intactos, sus dímeros, las cadenas ligera y pesada individuales o en otras formas, las inmunoglobulinas de la presente invención pueden purificarse siguiendo procedimientos convencionales tales como precipitación con sulfato amónico, columnas de afinidad o cromatografía en columna (Scopes, 1982). Para aplicaciones farmacéuticas, se necesitan inmunoglobulinas sustancialmente puras, con una homogeneidad mínima comprendida entre el 90 y el 95%, pero preferentemente entre el 98 y 99% o incluso superior. Una vez purificadas, parcialmente o hasta la homogeneidad deseada, las proteínas pueden usarse para uso terapéutico (también en forma extracorpórea), para uso de diagnóstico (formando imágenes para el diagnóstico de tumores o de la Enfermedad de Alzheimer) o para crear y realizar ensayos bioquímicos, tinciones inmunofluorescentes y similares (véase, en general, Lefkovits y Pernis, 1979 y 1981).

Los anticuerpos y las composiciones farmacéuticas de esta invención son particularmente útiles para la administración siguiendo cualquier metodología eficaz para tratar los anticuerpos a nivel del tejido implicado en la patología. Esto incluye (pero sin limitación): la administración intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, subcutánea, intratraqueal, oral, entérica, parenteral, intranasal o dérmica. Los anticuerpos de la presente invención típicamente pueden administrarse para aplicación local por inyección (intraperitoneal o intracraneal -típicamente en un ventrículo cerebral -o intrapericárdica o intrabursal) de formulaciones líquidas o por ingestión de formulaciones sólidas (en forma de píldoras, comprimidos, cápsulas) o de formulaciones líquidas (en forma de emulsiones y soluciones). Las composiciones para administración parenteral comúnmente comprenden una solución de inmunoglobulina disuelta en una solución compatible, preferentemente acuosa. La concentración del anticuerpo en estas formulaciones puede variar de menos del 0,005% al 15-20% y se selecciona principalmente de acuerdo con los volúmenes del líquido, su viscosidad, etc., y de acuerdo con el modo de administración particular seleccionado.

Como alternativa, los anticuerpos pueden prepararse para administración en forma sólida. Los anticuerpos pueden combinarse con diferentes sustancias inertes o excipientes, que pueden incluir ligandos tales como celulosa microcristalina, gelatina o goma arábiga; recipientes tales como lactosa o almidón; agentes tales como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; lubricantes tales como estearato de magnesio, dióxido de silicio coloidal; edulcorantes tales como sacarosa o sacarina; o saporíferos tales como menta y salicilato de metilo. Otros sistemas de administración farmacéutica incluyen hidrogel, hidroximetilcelulosa, liposomas, microcápsulas, microemulsiones, microesferas, etc. Las inyecciones locales directamente en los tejidos afectados por enfermedades tales como tumores es un método preferentemente para la administración de los anticuerpos de la presente invención.

Los anticuerpos de la invención pueden congelarse o liofilizarse y reconstituirse inmediatamente antes del uso en un tampón adecuado. Considerando que la liofilización y reconstitución pueden determinar una pérdida variable en la actividad de un anticuerpo (para inmunoglobulinas convencionales, los anticuerpos de clase IgM tienden a tener una mayor pérdida de actividad que los anticuerpos de clase IgG), los niveles de administración tienen que calibrarse para compensar este hecho.

Gracias a su alta capacidad de bloqueo, las composiciones que contienen los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos para prevenir o reducir el componente inflamatorio asociado con situaciones patológicas o dolor crónico, en particular dolor visceral crónico (asociado con trastornos fisiológicos tales como dismenorrea, dispepsia, reflujo gastrointestinal, pancreatitis, visceralgia o síndrome del intestino irritable).

En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen anticuerpos de la presente invención se administran a pacientes que aún no sufren una patología particular para aumentar su resistencia.

Los anticuerpos de la presente invención también proporcionan un método para reducir el volumen de tumores de próstata o páncreas y para prevenir el crecimiento adicional del tumor o reducir la velocidad de crecimiento del tumor. Este efecto puede mediarse por los anticuerpos humanizados de la presente invención porque son extremadamente eficaces en la neutralización da la interacción entre NGF y TrkA, necesaria para mantener el crecimiento y la progresión del tumor de forma autocrina o paracrina.

Su administración en el sitio del tumor preferentemente se realiza mediante inyección directa y localizada en el tejido

o cerca del sitio del tumor. Para la administración sistémica, las dosis varían de 0,05 mg/kg al día a 500 mg/kg al día, aunque se prefieren dosificaciones en la región inferior del intervalo porque son más fáciles de administrar. Las dosificaciones pueden calibrarse, por ejemplo, para garantizar un nivel particular en el plasma del anticuerpo (en el intervalo de aproximadamente 5-30 mg/ml, preferentemente entre 10-15 mg/ml) y mantener este nivel durante un periodo de tiempo dado hasta que se consiguen los resultados clínicos. Los anticuerpos humanizados se eliminarían mucho más lentamente y requerirían menores dosificaciones para mantener un nivel eficaz en el plasma; además, considerando la alta afinidad, la administración es menos frecuente y menos grande que con los anticuerpos que tienen menor afinidad. La dosificación terapéuticamente eficaz de cada anticuerpo puede determinarse durante el tratamiento, basándose en la reducción del volumen del tumor o en la velocidad de crecimiento del tumor o, idealmente, en la desaparición total del estado patológico canceroso. Los métodos eficaces para medir o evaluar el estadio de tumores pancreáticos o prostáticos se basan en la medición del antígeno prostático específico (PSA) en sangre, en la medición del tiempo de supervivencia para tumores pancreáticos, o en la medición de la ralentización o inhibición de la difusión para metástasis en el caso de los dos tumores.

Para inyección directa a nivel del sitio del tumor, la dosificación depende de diferentes factores que incluyen el tipo, estadio y volumen del tumor, junto con muchas otras variables. Dependiendo del volumen del tumor, las dosis terapéuticas típicas pueden variar de inyecciones de 0,01 mg/mm a inyecciones de 10 mg/mm que pueden administrarse con la frecuencia necesaria. Otro método para evaluar la eficacia de un tratamiento particular es evaluar la inhibición del receptor TrkA, por ejemplo, midiendo su actividad por medio de ensayos ELISA (Angeles et al., 1996).

Los anticuerpos pueden estar marcados y no marcados. Los anticuerpos no marcados pueden usarse en combinación con otros anticuerpos marcados (anticuerpos secundarios), que son reactivos contra anticuerpos humanizados o humanos (por ejemplo, anticuerpos específicos para las regiones constantes de inmunoglobulinas humanas). Como alternativa, los anticuerpos pueden marcarse directamente. Pueden usarse una amplia diversidad de marcadores, por ejemplo radionúclidos, fluoróforos, colorantes, enzimas, sustratos enzimáticos, factores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, ligandos (en particular hapténicos), etc. En el sector se dispone de numerosos tipos de ensayos inmunológicos.

El anticuerpo puede conjugarse con un agente que sea detectable o marcarse de manera isotópica (usando radioisótopos de yodo, indio, tecnecio) o de una manera paramagnética (átomos o iones paramagnéticos, tales como elementos de transición, actínidos y tierras raras; en particular manganeso II, cobre II y cobalto II) como se describe por Goding (1986) y Paik et al. (1982). Los procedimientos de formación de imágenes implican la inyección intravenosa, intraperitoneal o subcutánea (en regiones de drenaje linfático para identificar metástasis de ganglios linfáticos) y usan detectores de emisiones de radionúclidos (tales como contadores de centelleo 1) en el caso de inmunoescintografía; si en su lugar se usa un marcador paramagnético, se usa un espectrómetro de RMN (Resonancia Magnética Nuclear).

La invención se describirá a continuación en sus realizaciones no limitantes, haciendo referencia a las siguientes figuras:

Figura 1: A) Análisis por medio de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE 12%) y tinción con Azul de Coomassie del resultado de la purificación del fragmento Fab del anticuerpo aD11 (pocillo 1: muestra de anticuerpo aD11 digerida proteolíticamente con papaína; pocillo 2: fragmento Fab del anticuerpo aD11 purificado y concentrado; pocillo 3: pesos moleculares; B) cristal típico del fragmento Fab del anticuerpo aD11; C) espectro de difracción de alta resolución obtenido con un cristal del fragmento Fab del anticuerpo aD11; D) Diagrama de Ramachandran de los ángulos de torsión de la cadena principal de los dominios pesado y ligero del fragmento Fab del anticuerpo aD11.

Figura 2: A) B) C) D) Distribuciones de los anticuerpos humanizados o de origen humano (nombrados usando los códigos PDB de sus estructuras cristalográficas) de acuerdo con las tres variables analizadas; E) F) Desviaciones de los anticuerpos humanizados o de origen humano del valor óptimo hipotético de aD11 (calculado considerando tanto el grado de identidad total y de homología -en azul -como el nivel de la región marco -en magenta -) G) Alineamiento estructural con el fragmento Fv de aD11 de las regiones respectivas de los anticuerpos humanizados o de origen humano, seleccionado de acuerdo con el grado de identidad y homología con los anticuerpos murinos y con el grado de resolución de datos estructurales disponibles; H) I) alineamiento estructural con el fragmento Fv de aD11 (mostrado en cian) de la región respectiva del anticuerpo humanizado seleccionado 1JPS (mostrado en rojo) en H); del modelo de los anticuerpos resultantes después del injerto de CDR (mostrado en amarillo a nivel de la región marco, en blanco a nivel de la CDR) en I); L) modelo del fragmento Fv del anticuerpo humanizado aD11 obtenido como resultado de la identificación de supuestas retromutaciones en la región marco elegida (los restos de origen humano se muestran en cian y los restos de origen murino se muestran en morado).

Figura 3: Alineamiento de las estructuras primarias de las regiones variables de la cadena pesada (A) y de la cadena ligera (B) respectivamente de aD11 (SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4), del anticuerpo humanizado seleccionado para la humanización (1JPS; SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20), de la forma humanizada de aD11 después del injerto de CDR en la región marco de 1AD0 y de las retromutaciones y mutaciones descritas (aD11 Hum; SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18). Las CDR se destacan en la secuencia de la forma humanizada de las dos cadenas de aD11 por caracteres subrayados.

Figura 4: A) secuencia de nucleótidos del ADNc de la región variable de al cadena ligera de la forma de rata de aD11 (SEC ID Nº: 3); B) secuencia de nucleótidos del ADNc de la región variable de la cadena pesada de la forma murina de aD11 (SEC ID Nº:1); C) y E) secuencia de los oligonucleótidos trazados para obtener la forma humanizada de la región variable de la cadena ligera de aD11 (SEC ID Nº: 18): L1S: SEC ID Nº: 11; L2AS: SEC ID Nº: 12; L3S: SEC ID Nº: 13; L4AS: SEC ID Nº: 14; L5S: SEC ID Nº: 15; L6AS: SEC ID Nº: 16, por medio de solapamiento-ensamblaje. Técnica de PCR, mostrada junto con la correspondiente traducción de la secuencia de aminoácidos; D y F) secuencia de los oligonucleótidos trazados para obtener la forma humanizada de la región variable de la cadena pesada de aD11 (SEC ID Nº: 17): H1S: SEC ID Nº: 5; H2AS: SEC ID Nº: 6; H3S: SEC ID Nº: 7; H4AS: SEC ID Nº: 8; H5S: SEC ID Nº: 9; H6AS: SEC ID Nº: 10, por medio de la técnica de PCR de solapamiento-ensamblaje, mostrada junto con la correspondiente traducción en la secuencia de aminoácidos.

Figura 5: Mapas de los plásmidos usados para clonar las secuencias de las regiones variables humanizadas del anticuerpo obtenido por PCR de solapamiento-ensamblaje. A) pVLexpress para el dominio variable de la cadena ligera, B) pVHexpress para el dominio variable de la cadena pesada, C) plásmido resultante de la clonación en pVLexpress de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado, D) construcciones alternativas obtenidas como resultado de la clonación en pVHexpress de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado: 1) para la expresión en inmunoglobulina intacta de forma IgG1, 2) para expresión en forma de fragmento Fab, 3) para expresión en forma de inmunotoxina.

Figura 6: Ensayo de la actividad de unión del anticuerpo aD11 en forma humanizada por medio de ensayo ELISA, realizado por inmovilización en NGF plástico.

Resultados

Estructuras de rayos x del fragmento Fab del anticuerpo monoclonal aD11

El anticuerpo monoclonal se obtuvo y purificó de acuerdo con procedimientos convencionales. La inmunoglobulina IgG2a aD11 se expresó en el sobrenadante por medio de cultivo de células de hibridoma y se concentró por precipitación con sulfato amónico al 29% seguido de diálisis en PBS. La inmunoglobulina se purificó por cromatografía de afinidad usando una columna de Proteína G Sepharose (Pharmacia).

Después de la diálisis en tampón fosfato 10 mM pH 7, EDTA 20 mM usando membranas Spectra-Por 12/14K (Spectrum) a 4º C, la muestra se concentró por medio de unidades de ultrafiltración Centricon 50KDa (Amicon) y se incubó con Cys 13 mM y se trató con papaína inmovilizada (Pierce) (con una relación de enzima:sustrato de 1:15) durante 5 h a 37 ºC.

5 En términos de la purificación del fragmento Fab del anticuerpo aD11, la muestra tratada con papaína se dializó frente a tampón fosfato 10 mM pH 7,8; los fragmentos Fc se eliminaron mediante una columna de DEAE-Sephacel (Pharmacia) equilibrada con este mismo tampón. El fragmento Fab de aD11 se recogió en el volumen excluido, mientras que los fragmentos Fc y una fracción de lgG2a no digerida se eluyeron con tampón fosfato 250 mM pH 6,8.

10 El fragmento Fab se separó de la IgG2a no digerida por medio de un gel de filtración en una columna Superdex G75 (Pharmacia) equilibrada con tampón fosfato 10 mM pH 7,8, NaCI 150 mM. La homogeneidad y la pureza de las fracciones se controlaron por separación electroforética en gel de poliacrilamida al 12% seguido de tinción con Coomassie (Figura 2A). La concentración de la proteína purificada se determinó por medio del ensayo de Lowry (Bio-Rad). A partir de 11 sobrenadantes de hibridoma, fue posible obtener hasta 6 mg de Fab aD11 (excediendo la

15 pureza del 99%). El fragmento Fab del anticuerpo aD11 purificado en fosfato Na 10 mM pH 7,8 y NaCl 50 mM se concentró a 5-10 mg/ml por medio de una unidad de ultrafiltración Centricon 30 KDa (Amicon). Los experimentos de cristalización se realizaron siguiendo el método de gota colgante a 16 ºC siguiendo una estrategia de combinación factorial (Jancarik & Kim, 1991) usando el Kit Crystal Screen I y II (Hampton Research -Laguna Niguel, CA, Estados Unidos) y el Kit Screening (Jena BioSciences).

20 Se añadieron gotas de 2 !l de la muestra proteica concentrada a un volumen igual de la solución que contenía el agente de precipitación y se equilibró por difusión con una solución en el depósito (0,7 ml) en placas Linbro de 24 pocillos.

25 En términos del fragmento Fab del anticuerpo aD11, los resultados iniciales más prometedores, obtenidos usando volúmenes iguales de proteína y de agente de precipitación que contenía PEG4000 al 20%, NaCl 0,6 M, MES 100 mM pH 6,5 (número de Kit 4, solución C2), requirieron un largo proceso de optimización, modificando la composición del agente de precipitación a PEG4000, NaCl 0,6 M, BTP 100 mM pH 5,5 y las relaciones entre proteína y solución de precipitación (1,5:1) hasta que se obtuvieron cristales que crecían en aproximadamente una semana, de forma

30 similar a lo que se muestra en la Figura 1B.

Se recogió una serie inicial de datos de baja resolución en la línea de difracción de XRD1 del sincrotrón ELETTRA (Trieste, Italia) y después una segunda serie de datos más completa a mayor resolución en la línea de difracción ID14-EH1 del sincrotrón ESRF (Grenoble, Francia). Los cristales se congelaron bajo un flujo de nitrógeno líquido con

35 el sistema de refrigeración de Oxford Cryosystems (Oxford, Reino Unido). En la Figura 1B se muestra un espectro de difracción de alta resolución representativo para la proteína. Todos los datos de difracción de rayos X se procesaron, indexaron, integraron y posteriormente se aumentaron a escala usando los programas DENZO y SCALEPACK (Otwinowski & Minor, 1997) respectivamente, mientras que para la reducción de los datos se usó el paquete CCP4 (Collaborative Computational Project, Número 4, 1994).

40 La siguiente tabla resume los parámetros estadísticos para recoger y procesar los datos de alta y baja resolución de los cristales del fragmento Fab del anticuerpo aD11:

Fuente de rayos X ELETTRA ESRF Longitud de onda (Å) 1,000 0,934 Detector marCCD marCCD

Grupo espacial P1 C2 Parámetros de la celda unitaria a (Å) 42,685 114,801

b (Å) 50,626 69,354 c(Å) 102,697 64,104 a (º) 81,977 90 1 (º) 89,116 117,02 y (º) 85,957 90 Mosaicidad (º) 0,44 0,40 Intervalo de resolución (A) 47,6-2,57 17,0-1,70

(2,8-2,7) (1,75-1,70)

Nº de mediciones 124456 492594

Nº de reflejos observados con I ; 0 74241 399184

Nº de reflejos únicos con I ; 0 23413(2162) 47951 (3198)

Completitud (%) 98,2 (92,4) 97,2 (78,4)

Redundancia 5,7 (5,2) 6,7 (7,5)

<I/G > de los datos medidos 29,6 (6,7) 9,5(2,1)

Rsym (%) 11,0(33,5) 5,8 (27,8)

Donde los valores entre paréntesis se refieren a la cubierta con la mayor resolución.

Considerando el alto número de estructuras disponibles de fragmentos Fab, el método más conveniente para determinar la estructura de las proteínas fue Sustitución Molecular. En la búsqueda en el Banco de Datos de Proteínas (Berman et al, 2000) de estructuras homologas, los criterios de selección dieron prioridad a la combinación 5 entre resolución comparable y máximo nivel de identidad de secuencia. Sobres estas bases, se seleccionaron para aD11:1ClC: la estructura del complejo de fragmentos Fab idiotipo-antiidiotipo* FabD1.3-FabE225 (Bentley et al,1990), resuelta a una resolución de 2,5 Å y proporcionada con una identidad de secuencia respectivamente del 82 y 82,65% para la cadena pesada y ligera. La determinación de las estructuras se obtuvo por el método de Sustitución Molecular usando el AMoReprogram (Navaza, 1994), usando los modelos respectivos por separado los dominios

10 constantes y dominios variables, considerando la variabilidad extrema del ángulo formado por el eje de seudosimetría binaria entre las regiones variable y constante.

La solución obtenida en la determinación de la estructura del fragmento Fab de aD11 después del refinado con cuerpo rígido para el grupo espacial C2 se muestra en la siguiente tabla: 15

Pico

a 1 y x y z Cr Rf Cl Cp

V

151,0 155,4 43,0 0,1424 0,0005 0,449

C

17,8 63,7 73,2 0,3625 0,9532 0,1991 55,0 38,9 49,7 35,9

Donde V = dominio variable C = dominio constante a, 1, y = �?ngulos eulerianos (º). x, y, z = Translación (fraccionaria). Cf = Correlación de las amplitudes (x100). Rf = Factor R cristalográfico (x 100). CI = Correlación de las intensidades (x100). Cp= Correlación de la función de Patterson truncada (x100).

El posterior refinado de las estructuras se obtuvo por medio de un procedimiento cíclico, que comprendía dos fases alternas: construcción manual del modelo usando el software interactivo para gráficos informáticos “O” (Kleywegt y Jones, 1994); refinado posicional y refinado de factores térmicos isotrópicos B usando protocolos automáticos del kit

20 CNS, Cristalografía y RMN (Brünger et al., 1998). El procedimiento después de algunas fases de refinado con cuerpo rígido, contempló diferentes ciclos de refinado. Una vez completada la inserción de todas las mutaciones y deleciones para completar los modelos, se realizó la localización de las moléculas de agua y cualquier ión y ligando. Al final, manteniendo el modelo tan próximo como fuera posible a los valores ideales en términos de estereoquímica, se optimizaron el peso posicional wa y el peso del factor térmico B r-weight.

25 Los parámetros estadísticos y los parámetros finales que describen la calidad del modelo obtenido para el fragmento Fab del anticuerpo aD11 se resumen en la siguiente tabla:

Número de átomos de proteína 3229 Número de átomos de disolvente 403 Número de iones cloruro 1 Intervalo de Resolución (Å) 30-1,70 Factor R final 19,54% Factor Rlibre final (calculado sobre el 10% de los datos) 24,22%

Desviaciones de Rms Distancias de unión (Å) 0,0096 �?ngulo de unión (º) 1,6571 �?ngulo Diédrico (º) 27,40 �?ngulos incorrectos (º) 1,048 Factor Térmico Isotrópico Medio (A2) Proteína completa 25,58 Cadena ligera 24,14 Cadena pesada 22,99 Moléculas de agua 38,80 Iones (cloruro) 20,58

Además, el modelo se examinó por análisis geométrico final con el kit PROCHECK (Laskowski et al., 1993) como se muestra en la tabla y en el diagrama de Ramachandran respectivo (Figuras 1D).

5 Uso de las estructuras de rayos x del fragmento Fab del anticuerpo monoclonal aD11 en la selección de una región marco de origen humano

En la selección de regiones marco de anticuerpos humanos, se siguió la estrategia descrita anteriormente, que combina el grado de identidad entre el anticuerpo de origen murino y humano a nivel de la secuencia primaria con el

10 grado de similitud estructural de los esqueletos de los polipéptidos.

En particular, se seleccionó una serie de posibles regiones marco aceptoras de origen humano o anticuerpos humanizados basándose en el máximo nivel de homología y de identidad de las estructuras primarias mediante una búsqueda en la base de datos BLAST. Esta selección se realizó para los dos anticuerpos bloqueantes considerando

15 las regiones variables enteras de los anticuerpos y estrechando la búsqueda a las regiones marco.

Dentro de cada grupo de anticuerpos seleccionados, sólo se consideraron aquellos para los que se disponía de datos estructurales con alta resolución o, de otra manera, con una resolución comparable a la de las estructurasobtenidas por nosotros (es decir no mayor de 2,5 Å), realizando una búsqueda en PDB (siglas en inglés de Banco de

20 Datos de Proteínas). Los esqueletos de aminoácidos respectivos después se superpusieron usando el software “superimpose” (Diederichs, 1995).

La Figura 2G muestra el resultado del alineamiento entre la región Fv de aD11 y las estructuras terciarias de los esqueletos de átomos de carbono alfa de los anticuerpos humanizados o de origen humano, seleccionados

25 basándose en el alineamiento óptimo de las estructuras primarias con el anticuerpo a humanizar y en la alta resolución de los datos estructurales disponibles.

Para evaluar el grado de superposición de cada estructura individual, de origen humano u obtenida por ingeniería genética, con aD11, se calculó la RMS entre átomos de carbono alfa que constituían los esqueletos de aminoácidos

30 respectivos, sin considerar pares de átomos con una RMS superior a 2 Å.

La selección de la región marco óptima para la humanización se configura como un problema de tres variables, que por lo tanto puede representarse en el espacio, cuando se asocia el nivel de homología y el grado de identidad con el alineamiento estructural. Este tipo de análisis después se realizó reduciendo también las regiones en cuestión en

35 los dos tipos de alineamiento a las regiones de los marcos respectivos.

Como se muestra en la Figura 2, las distribuciones de los anticuerpos considerados en el espacio de las tres variables analizadas (respectivamente, valor de RMS, porcentajes de átomos sobre los que se calculó la RMS y un índice de similitud entre estructuras primarias, es decir, porcentaje de identidad global -A-, de homología global -C-,

40 de identidad a nivel de la región marco -B-, de homología a nivel de la región marco -D-) son mutuamente coherentes y sistemáticos para los dos casos considerados.

Además, comparando estas distribuciones con la posición óptima en el espacio de las tres variables que ocuparía cada anticuerpo si fuera de origen humano, es posible identificar claramente el anticuerpo de origen humano que se

45 aproxima más a esta posición ideal a nivel de la estructura primaria y terciaria. Para racionalizar, en el caso de los dos anticuerpos, este resultado, en cada uno de los cuatro análisis se calcularon las desviaciones de la posición óptima hipotética para cada posición de los anticuerpos humanizados o de origen humano considerados (Figura 2E y 2F para aD11). En este caso, también, los resultados son coherentes y confirman las indicaciones previas.

50 Basándose en este método de selección, se seleccionaron dos anticuerpos humanizados diferentes como regiones marco aceptoras en el proceso posterior de injerto de CDR para la humanización de los dos anticuerpos que neutralizaban la interacción NGF/TrkA. En particular, la Figura 2H muestra el alineamiento estructural a nivel de la región Fv de los dos anticuerpos bloqueantes con el anticuerpo humanizado seleccionado respectivo, es decir, usando los códigos PDB, 1JPS para aD11. La Figura 2I compara la misma región del anticuerpo murino con el

55 modelo del mismo anticuerpo después del injerto de CDR.

Una vez definidas las CDR, se identificaron las clases canónicas (definidas por Chothia y Lesk) a las que pertenecen y posteriormente se mantuvieron los restos canónicos en el anticuerpo humanizado: para el anticuerpo, se destacaron con caracteres subrayados en la Figura 3.

Con respecto al análisis posterior de las retromutaciones a introducir, para mantener los restos que median la interacción entre la cadena ligera y la cadena pesada de los dominios variables, se insertaron las siguientes retromutaciones para mantener la interfaz entre los dos dominios:

L34, L46, L92 y H35 para aD11.

Además, para mantener las características de la zona Vernier, se realizaron las siguientes retromutaciones:

H71 para aD11 (que, en cualquier caso, considera sustituciones de restos de aminoácidos representados en secuencias consenso humanas).

Posteriormente, después de la comparación con las secuencias consenso principales de inmunoglobulinas humanas, se realizaron las siguientes retromutaciones:

L56 para aD11

Además, de nuevo basándose en las secuencias consenso de inmunoglobulinas humanas, en la forma humanizada de aD11 se introdujo la siguiente mutación con restos de inserto conservados en el humano en lugar de los restos poco habituales presentes tanto en las regiones marco donadoras como en las regiones marco aceptoras.

H67 (V�F).

El par de estructuras cristalográficas se modificó, realizando primero el injerto de las CDR de origen animal en las regiones marco humanizadas. Después, se introdujeron todas las mutaciones y retromutaciones descritas anteriormente. Después se ensamblaron las estructuras modificadas en inmunoglobulinas compuestas. Los modelos resultantes se refinaron minimizando la energía mecánica (en términos de ángulos de torsión y ángulos y distancias de unión) usando el campo de fuerzas.

Humanización del anticuerpo monoclonal aD11

Después de seleccionar el anticuerpo humanizado donante de la región marco para conseguir el injerto de CDR de aD11, se diseñan las regiones variables respectivas que combinan las CDR murinas de aD11 con la región marco del anticuerpo humanizado modificado de acuerdo con las mutaciones indicadas anteriormente. Sustancialmente, la región variable humanizada puede obtenerse por un procedimiento basado en el método de PCR de solapamientoensamblaje, usando oligonucleótidos de aproximadamente 80 bases, que alternan filamentos con sentido y antisentido con superpuestos consecutivos durante una longitud de 20 bases de tal forma que se permite la formación de moléculas de filamento parcialmente dobles como resultado de la hibridación (Figura 4B). Después de rellenar las discontinuidades por medio de la Vent polimerasa, el filamento doble se amplifica por PCR usando como cebadores dos oligonucleótidos cortos que llevan las secuencias en el extremo 5’ del propio filamento doble junto con sitios de restricción adecuados para la posterior clonación direccional (respectivamente ApaLI/Bgll I para la clonación del dominio variable de la cadena ligera y BssHII/BstEII para la clonación del dominio variable de la cadena pesada), después de la digestión con enzimas de restricción respectivas, en el plásmido pVLexpress para el dominio variable de la cadena ligera (Figura 5A) y en el plásmido pVHexpress para el dominio variable de la cadena pesada (Figura 5B). Estos vehículos permiten expresar en fusión con las secuencias clonadas los dominios constantes de origen humano, respectivamente, CK y CH1, CH2 y CH3. Usando estos vectores, por lo tanto, es posible expresar el anticuerpo en forma de moléculas de IgG1 (Figura 5C y 5D1) en líneas celulares humanas tales como las indicadas anteriormente. Para obtener el anticuerpo humanizado en forma de fragmentos Fab, es suficiente actuar únicamente sobre el vehículo en el que se clona la cadena pesada. En particular, es posible sustituir la parte constante entera con el único dominio CH1 amplificado por PCR usando cebadores específicos que disponen de sitios de restricción en los extremos para la clonación direccional Sacll-Xbal (como se muestra en la Figura 5D2).

Expresión y ensayo de unión del anticuerpo aD11 humanizado

Se cotransfectaron 250.000 células COS con 1 !g de ADN plasmídico codificante de VH en VK del anticuerpo humanizado (un total de 2 !g) por medio de FuGENE de acuerdo con el protocolo recomendado (Roche). Las construcciones se usaron para obtener los anticuerpos humanizados en forma de lgG1.

En paralelo a las cotransfecciones de las construcciones descritas anteriormente, se cotransfectaron las formas quiméricas correspondientes para el anticuerpo, es decir:

la VH de rata se clona en fusión con la Cy de origen humano en pcDNAI y la Vk de rata se clona en fusión con la Cy de pcDNAI de origen humano. Después de 72 horas desde la transfección, se recogió el sobrenadante que contenía las inmunoglobulinas expresadas por las células hospedadoras y se concentró usando Centriprep 50 (Amicon).

La capacidad de reconocer los ligandos respectivos del anticuerpo humanizado se verificó por medio de un ensayo ELISA y se comparó con formas quiméricas respectivas. Los resultados se muestran en la Figura 6.

Para la inmovilización en placas Maxi sorb de 96 pocillos de plástico, éstas se incubaron a 4 ºC durante una noche con una solución que contenía los ligandos del anticuerpo (el NGF murino purificado a partir de glándulas submandibulares) a una concentración de 10 !g/ml en tampón carbonato sódico 0,1 M pH 9,6.

Después de una hora de bloqueo con PBS que contenía leche al 3% (MPBS) a temperatura ambiente, los sobrenadantes concentrados se incubaron con diluciones en serie (1:2,1:20; 1:200) y en paralelo también con el sobrenadante de células COS no transfectadas (control negativo).

Después de la incubación con el anticuerpo primario (que reconoce la región constante Cy de origen humano) y con el anticuerpo secundario (anti-conejo conjugado con peroxidasa), es posible detectar la actividad de unión como la densidad óptica a 450 nm (DO450) por medio de incubación con el substrato TMB (TECNA). Como control positivo se incluyó el anticuerpo monoclonal a una concentración de 500 ng/ml.

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Listado de secuencias

<110> LAY LINE GENOMICS SPA SCUOLA INTERNAZIONALE SUPERIORE Dl STUDI AVANZATI -S.I.S.S.A. 5 <120> Anticuerpos anti-NGF humanizados

<130> N108279

<150> EP 04806887.8 10 <151 >

<150> PCT/IT2004/000722 <151 >2004-12-23

15 <150> RM2003000601

<151 >

<160> 40 20 <170> Patentln versión 3.1

<210> 1 <211 >369

<212> ADN 25 <213> Mus musculus

<400> 1

<210> 2

<211 > 122

<212> PRT

<213> Mus musculus

35 <400>2 <210> 3 <211 >321

<212> ADN

<213> Rattus sp.

<400>3

<210> 4

<211> 107

<212> PRT 15 <213> Rattus sp.

<400> 4

<210> 5 <211 >81

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400>5

<210> 6

<211> 81

<212> ADN

<213> Homo sapiens

15 <400>6

<210> 7 20 <211 >81

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 7 25

<210> 8

<211> 84

<212> ADN

<213> Homo sapiens <400>8

<210> 9 10 <211> 84

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400>9 15

<210> 10

<211> 81 20 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11 <211 >78

<212> ADN 30 <213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211 >78 35 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13 <211 >78

<212> ADN 45 <213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 78

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 75

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16 <211 >75

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 19

<213> Homo sapiens

<210> 20

<211>

107 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20 <212> ADN

<213> Mus musculus

gtctcctca 369

15 <210> 22

<211> 124

<212> PRT

<213> Mus musculus

20 <400> 22 5

<210> 23

<211> 318

<212>

ADN 10 <213> Mus musculus

<400> 23

<210> 24

<211> 106

<212>

PRT 20 <213> Mus musculus

<400> 24

<210> 25

<211> 81

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 81

<212> ADN

<213> Homo sapiens 15

<400> 26

20 <210> 27 <211 >81

<212> ADN

<213> Homo sapiens

25 <400> 27

<210> 28

<211> 81

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 28

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<210> 30

<211> 81 20 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 30

<212> ADN 30 <213> Homo sapiens

<400> 31

<210> 32 <211 >78

<212> ADN

<213> Homo sapiens 40

<400> 32

45 <210> 33

<211> 78

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 33

5 <210> 34

<211> 75

<212> ADN

<213> Homo sapiens

10 <400> 34

<210> 35 15 <211> 78

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<210> 36

<211 >75 25 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 36

30 <210> 37

<211 > 124

<212> PRT

<213> Homo sapiens

35 <400> 37 <210> 38

<213> Homo sapiens

<400>

38 10

<210> 39

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39

<210> 40

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un anticuerpo anti-NGF humanizado, o un fragmento del mismo que mantiene la actividad de unión a NGF, que comprende una región VH que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 17 y una región VL que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 18.

2. 2.

   El fragmento de acuerdo con la reivindicación 1, que es un fragmento Fab, un fragmento (Fab’)2, un fragmento Fv

   o un fragmento Fv monocatenario (scFv).

3. 3.

   Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-NGF humanizado o un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

4. 4.

   La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3 para uso en el tratamiento profiláctico y/o terapéutico para prevenir o reducir el componente inflamatorio asociado con situaciones patológicas o dolor crónico.

5. 5.

   La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3 para uso en el tratamiento de un tumor de próstata o páncreas o patologías inducidas por VIH.

6. 6.

   La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3 para uso en combinación con otro agente terapéutico, que incluye antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, inmunosupresores o un agente antitumoral tal como antraciclina, paclitaxel, cisplatino o gemcitabina.

7. 7.

   Uso de un anticuerpo anti-NGF humanizado o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la preparación de una composición farmacéutica para uso en el tratamiento profiláctico y/o terapéutico para prevenir o reducir el componente inflamatorio asociado con situaciones patológicas o dolor crónico o para uso en el tratamiento de un tumor de próstata o páncreas o patologías inducidas por VIH.

8. 8.

   Una secuencia polinucleotídica que codifica el anticuerpo anti-NGF humanizado o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

9. 9.

   Una célula que expresa la secuencia polinucleotídica de la reivindicación 8, en la que la célula es una célula procariota o una línea celular eucariota inmortalizada.

10. 10.

    El anticuerpo anti-NGF humanizado o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo está marcado por un radionúclido, fluoróforo, colorante, enzima, sustrato enzimático, factor enzimático, inhibidor enzimático o ligando.