ES2355184T3 - Inhibidores terapéuticos de células de músculo liso vascular. - Google Patents

Inhibidores terapéuticos de células de músculo liso vascular. Download PDF

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ES2355184T3 ES94907364T ES94907364T ES2355184T3 ES 2355184 T3 ES2355184 T3 ES 2355184T3 ES 94907364 T ES94907364 T ES 94907364T ES 94907364 T ES94907364 T ES 94907364T ES 2355184 T3 ES2355184 T3 ES 2355184T3
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muscle cells
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Lawrence Leroy Kunz
Richard A. Klein
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Boston Scientific Ltd Barbados
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Abstract

SE PROPORCIONAN UNOS METODOS PARA INHIBIR LA ESTENOSIS CONSIGUIENTE A UN TRAUMA O ACCIDENTE VASCULAR EN UN HUESPED MAMIFERO, QUE COMPRENDEN LA ADMINISTRACION AL PACIENTE DE UN DOSIS TERAPEUTICAMENTE EFECTIVA DE UN CONJUGADO TERAPEUTICO QUE CONTIENE UNA PROTEINA DE UNION DEL MUSCULO VASCULAR LISO QUE SE ASOCIA DE FORMA ESPECIFICA CON LA SUPERFICIE CELULAR DE LA CELULA DEL MUSCULO VASCULAR LISO, JUNTO CON UNA FORMA DE DOSIFICACION DE UN AGENTE TERAPEUTICO QUE INHIBE LA ACTIVIDAD CELULAR DE LA CELULA DEL MUSCULO. TAMBIEN SE PROPORCIONAN METODOS PARA LA APLICACION DIRECTA Y/O ENFOCADA DE AGENTES TERAPEUTICOS A LAS CELULAS DEL MUSCULO VASCULAR LISO QUE PRODUCEN UNA DILATACION Y FIJACION DEL LUMEN VASCULAR MEDIANTE LA INHIBICION DE LA CONTRACCION DE LA CELULA DEL MUSCULO LISO, CONSTITUYENDO POR LO TANTO UN DILATADOR BIOLOGICO.

Description

Campo de la invención
Esta invención se refiere generalmente a agentes terapéuticos para mantener un área luminal expandida. 5
Antecedentes de la invención
La angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA) se usa ampliamente como la modalidad de tratamiento primario en muchos pacientes con arteriopatía coronaria. La PTCA puede aliviar la isquemia miocárdica en pacientes con arteriopatía 10 coronaria reduciendo la obstrucción de la luz y mejorando el flujo coronario. El uso de este procedimiento quirúrgico ha crecido rápidamente, con 39.000 procedimientos realizados en 1983; casi 150.000 en 1987, 200.000 en 1988, 250.000 en 1989, y se estiman más de 500.000 PTCA al año para 1994 (1, 2, 3). La 15 estenosis tras la PTCA sigue siendo un problema significativo, desarrollando de desde el 25% hasta el 35% de los pacientes reestenosis en un plazo de 1 a 3 meses. La reestenosis da como resultado morbilidad y mortalidad significativas y frecuentemente necesita intervenciones adicionales tales como 20 cirugía de derivación coronaria o angioplastia de repetición. Ninguna intervención quirúrgica ni tratamiento posquirúrgico (hasta la fecha) ha demostrado ser eficaz en la prevención de la reestenosis.
Los procesos responsables de la estenosis tras la PTCA no 25 se entienden completamente pero pueden resultar de una interacción compleja entre varias rutas y agentes biológicos diferentes. Vistas en cortes histológicos, las lesiones reestenóticas pueden tener un sobrecrecimiento de células de músculo liso en las capas de la íntima del vaso (3). Se han 30 sugerido varios posibles mecanismos para la proliferación de células de músculo liso tras la PTCA (1, 2, 4, 5).
Los compuestos que según se informa suprimen la proliferación del músculo liso in vitro (4, 6, 7) pueden tener efectos secundarios farmacológicos no deseados cuando se usan in 35 vivo. La heparina es un ejemplo de un compuesto de este tipo, que según se informa inhibe la proliferación de células de músculo liso in vitro pero cuando se usa in vivo tiene el efecto secundario adverso potencial de inhibir la coagulación. Los péptidos de heparina, aunque tienen actividad anticoagulante reducida, tienen la propiedad farmacológica no deseada de tener una semivida farmacológica corta. 5
Se han hecho intentos de solucionar tales problemas usando un catéter de doble balón, es decir, para la administración regional del agente terapéutico en el sitio de angioplastia (por ejemplo, 8; patente estadounidense n.° 4.824.436), y usando materiales biodegradables impregnados con un fármaco, es decir, 10 para compensar problemas de semivida corta (por ejemplo, 9; patente estadounidense n.° 4.929.602).
Las verrucarinas y roridinas son fármacos de tricoteceno producidos como metabolitos secundarios por los hongos del suelo Myrothecium verrucaria y Myrothecium roridium. La verrucarina es 15 un triéster macrocíclico. La roridina es un diéster macrocíclico de verrucarol (10). Como grupo, los tricotecenos están relacionados estructuralmente con las micotoxinas sesquiterpenoides producidas por varias especies de hongos y caracterizadas por la estructura básica 12,13-epoxitricotec-9-20 eno. Su actividad citotóxica frente a células eucariotas está estrechamente correlacionada con su capacidad para unirse a la célula, para internalizarse y para inhibir la síntesis macromolecular y de proteínas en la célula.
A primera vista, al menos cinco consideraciones parecería 25 que impiden el uso de fármacos inhibidores para prevenir la estenosis que resulta del sobrecrecimiento de células de músculo liso. En primer lugar, los agentes inhibidores pueden tener toxicidad sistémica que podría crear un nivel inaceptable de riesgo para pacientes con enfermedad cardiovascular. En segundo 30 lugar, los agentes inhibidores podrían interferir con la cicatrización de heridas vasculares tras la cirugía y eso podría o bien retrasar la cicatrización o bien debilitar la estructura o elasticidad de la pared del vaso recién cicatrizada. En tercer lugar, los agentes inhibidores que destruyen células de músculo 35 liso podrían dañar el endotelio circundante y/u otras células de músculo liso de la media. Las células moribundas y muertas también liberan agentes mitogénicos que podrían estimular la proliferación de células de músculo liso adicionales y exacerbar la estenosis.
En cuarto lugar, la administración de niveles terapéuticamente eficaces de un agente inhibidor puede ser 5 problemática desde varios puntos de vista: concretamente, a) puede ser necesaria la administración de un gran número de moléculas en los espacios intercelulares entre las células de músculo liso, es decir, establecer condiciones favorables para permitir que una dosis terapéuticamente eficaz de moléculas 10 atraviese la membrana celular; b) dirigir un fármaco inhibidor al compartimento intracelular apropiado, es decir, donde se ejerce su acción, puede ser difícil de controlar; y, c) optimizar la asociación del fármaco inhibidor con su diana intracelular, por ejemplo, un ribosoma, mientras que se minimiza 15 la redistribución intercelular del fármaco, por ejemplo a células vecinas, puede ser difícil. En quinto lugar, debido a que la proliferación de células de músculo liso tiene lugar a lo largo de varias semanas parecería a priori que los fármacos inhibidores también deben administrarse a lo largo de varias 20 semanas, quizás de manera continua, para producir un efecto beneficioso.
Tal como resulta evidente a partir de lo anterior, quedan por resolverse muchos problemas en el uso de fármacos inhibidores, incluyendo agentes citotóxicos, para tratar 25 eficazmente la proliferación de células de músculo liso. Será altamente ventajoso desarrollar nuevos métodos para inhibir la estenosis debida a la proliferación de células de músculo liso vascular tras una lesión traumática en los vasos tal como se produce durante la cirugía vascular. Además, la administración 30 de compuestos que producen efectos inhibidores de duración prolongada a las células de músculo liso vascular sería ventajosa. La administración local de tales compuestos de liberación sostenida también sería útil en el tratamiento de otros estados en los que la población de células diana es 35 accesible por tal administración.
Sumario de la invención
Según la invención, se proporcionan nuevos usos de agentes terapéuticos según las reivindicaciones. Además, también se contemplan agentes terapéuticos que inhiben la contracción o migración de las células de músculo liso y mantienen un área 5 luminal ampliada tras, por ejemplo, un traumatismo por angioplastia (por ejemplo, las citocalasinas, tales como citocalasina B, citocalasina C, citocalasina D o similares) para su uso según la presente invención.
La presente invención también contempla el uso de formas de 10 dosificación terapéuticas que implican la liberación sostenida del agente terapéutico en células diana. Preferiblemente, las células diana son células de músculo liso vascular.
Las formas de dosificación de la presente invención son preferiblemente o bien materiales microparticulados o 15 nanoparticulados no degradables o bien materiales microparticulados o nanoparticulados biodegradables. Más preferiblemente, las micropartículas o nanopartículas están formadas por una matriz que contiene polímero que se biodegrada mediante escisión hidrolítica, no enzimática, aleatoria. Una 20 estructura particularmente preferida está formada por una mezcla de poliésteres termoplásticos (por ejemplo, polilactida o poliglicolida) o un copolímero de componentes de lactida y glicolida. La estructura de lactida/glicolida tiene la ventaja añadida de que la biodegradación de la misma forma ácido láctico 25 y ácido glicólico, ambos productos metabólicos normales de mamíferos.
Agentes terapéuticos preferibles dispersados dentro de los materiales microparticulados o nanoparticulados son aquellos que presentan inhibición de una actividad de la célula diana 30 terapéuticamente significativa sin destruir la célula diana, o actividad de destrucción de la célula diana. Para el tratamiento de la reestenosis de células de músculo liso vascular, los agentes terapéuticos útiles inhiben la actividad de la célula diana (por ejemplo, proliferación o migración) sin destruir las 35 células diana. Restos terapéuticos preferidos para este fin son inhibidores de la contracción y/o migración del músculo liso, por ejemplo, las citocalasinas, tales como citocalasina B, citocalasina C, citocalasina D.
La presente invención también proporciona formas de dosificación terapéuticas que implican la administración de un agente terapéutico libre (es decir, no dirigido ni asociado a 5 una pareja de unión) a las células diana. Preferiblemente, las células diana son células de músculo liso vascular y el agente terapéutico es un inhibidor de la contracción de células de músculo liso vascular, lo que permite que la presión hidrostática normal dilate la luz vascular. Tal inhibición de la 10 contracción puede lograrse mediante la inhibición de la actina, lo que puede lograrse y sostenerse preferiblemente a un nivel de dosis inferior al necesario para inhibir la síntesis de proteínas. En consecuencia, las células de músculo liso vascular sintetizan la proteína requerida para reparar un traumatismo 15 celular menor y secretan matriz intersticial, facilitando de ese modo la fijación de la luz vascular en un estado dilatado próximo a su diámetro sistólico máximo. Este fenómeno constituye un efecto de implantación de endoprótesis biológica que disminuye o impide el mecanismo de retroceso no deseado que se 20 produce en hasta el 25 de los procedimientos de angioplastia clasificados como exitosos basándose en un angiograma tras el procedimiento inicial.
Las citocalasinas (que inhiben la polimerización de actina G a F que, a su vez, inhibe la migración y contracción de 25 células de músculo liso vascular) son los agentes terapéuticos preferidos para su uso en esta realización de la presente invención.
Los protocolos con agente terapéutico libre de este tipo efectúan una reducción, un retraso o una eliminación de la 30 estenosis tras la angioplastia u otros procedimientos quirúrgicos vasculares.
Preferiblemente, el agente terapéutico libre se administra directamente o de manera sustancialmente directa al tejido de músculo liso vascular. 35
Tal administración se efectúa preferiblemente mediante un catéter para infusión, para lograr una concentración de 103 M a 10-12 M de dicho agente terapéutico en el sitio de administración en un vaso sanguíneo.
Descripción de los dibujos
La figura 1A representa gráficamente datos experimentales que comparan la capacidad de inhibición de la síntesis de 5 proteínas y la síntesis de ADN de suramina con respecto a células de músculo liso vascular.
La figura 1B representa gráficamente datos experimentales que comparan la capacidad de inhibición de la síntesis de proteínas y la síntesis de ADN de estaurosporina con respecto 10 a células de músculo liso vascular.
La figura 1C representa gráficamente datos experimentales que comparan la capacidad de inhibición de la síntesis de proteínas y la síntesis de ADN de nitroglicerina con respecto a células de músculo liso vascular. 15
La figura 2 representa un estudio de dosis-respuesta in vivo del efecto de la citocalasina B sobre el área luminal de arterias femorales de cerdo.
Descripción detallada de la invención
Tal como se usa en el presente documento los siguientes 20 términos tienen los significados expuestos a continuación: “conjugado terapéutico” significa una proteína de unión a matriz intersticial o músculo liso vascular acoplada (por ejemplo, opcionalmente a través de un ligador) a un agente terapéutico.
“Diana” y “marcador” se usan de manera intercambiable en la 25 descripción de los aspectos del conjugado de la presente invención para dar a entender una molécula reconocida de manera específica por la proteína de unión a músculo liso vascular o matriz, por ejemplo, un antígeno, antígeno polipeptídico o hidrato de carbono de superficie celular (por ejemplo, un 30 glicolípido, una glicoproteína o un proteoglicano) que se expresa en las membranas de la superficie celular de una célula de músculo liso vascular o una estructura de matriz.
“Epítopo” se usa para referirse a un sitio específico dentro de la molécula “diana” al que se une la proteína de unión 35 a músculo liso o matriz, por ejemplo, una secuencia de tres o más aminoácidos o sacáridos.
“Acoplado” se usa para dar a entender una asociación química covalente o no covalente (es decir, hidrófoba como a través de fuerzas de van der Waals o interacciones carga-carga) de la proteína de unión a músculo liso vascular o matriz con el agente terapéutico. Debido a la naturaleza de los agentes 5 terapéuticos empleados, las proteínas de unión estarán asociadas normalmente con los agentes terapéuticos por medio de enlaces covalentes.
“Ligador” significa un agente que acopla la proteína de unión a músculo liso o matriz a un agente terapéutico, por 10 ejemplo, un acoplador químico orgánico.
“Migración” de células de músculo liso significa el movimiento de estas células in vivo desde las capas de la media de un vaso hacia la íntima, tal como también puede estudiarse in vitro siguiendo el movimiento de una célula de una ubicación a 15 otra (por ejemplo, usando cinematografía a intervalos regulares o una grabadora de vídeo y recuento manual de la migración de células de músculo liso fuera de un área definida en el cultivo tisular a lo largo del tiempo).
“Proliferación”, es decir, de células de músculo liso o 20 células cancerosas, significa un aumento del número de células, es decir, mediante mitosis de las células.
“Expresado” significa la transcripción y traducción de ARNm con la síntesis, glicosilación y/o secreción resultante de un polipéptido por una célula, por ejemplo, CSPG sintetizado por 25 una célula de músculo liso vascular o pericito.
“Tricoteceno macrocíclico” pretende dar a entender una cualquiera del grupo de micotoxinas macrocíclicas sesquiterpenoides relacionadas estructuralmente producidas por varias especies de hongos y caracterizadas por la estructura 30 básica 12,13-epoxitricotec-9-eno, por ejemplo, verrucarinas y roridinas que son los productos del metabolismo secundario en los hongos del suelo Myrothecium verrucaria y Myrothecium roridium.
“Liberación sostenida” significa una forma de dosificación 35 diseñada para liberar un agente terapéutico a partir de la misma durante un periodo de tiempo que oscila desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 21 días. También se contempla la liberación a lo largo de un periodo de tiempo más largo como una forma de dosificación de “liberación sostenida” de la presente invención.
“Forma de dosificación” significa una formulación de agente 5 terapéutico libre (no dirigido ni asociado a una pareja de unión), así como formulaciones terapéuticas de liberación sostenida, tales como las que incorporan material microparticulado o nanoparticulado, material polimérico biodegradable o no biodegradable que puede unirse a uno o más 10 péptidos o proteínas de unión para administrar un resto terapéutico dispersado en las mismas a un población de células diana.
“Estaurosporina” incluye estaurosporina, un inhibidor de la proteína cinasa C de la siguiente fórmula, 15
así como diindolalcaloides que tienen una de las siguientes estructuras generales:
Más específicamente, el término “estaurosporina” incluye K-252 (véase, por ejemplo, la solicitud de patente japonesa n.° 62.164.626), BMY-41950 (patente estadounidense n.° 5.015.578), UCN-01 (patente estadounidense n.° 4.935.415), TAN-999 (solicitud de patente japonesa n.° 01.149.791), TAN-1030A 5 (solicitud de patente japonesa n.° 01.246.288), RK-286C (solicitud de patente japonesa n.° 02.258.724) y derivados y equivalentes funcionales de los mismos. Los derivados de estaurosporina incluyen los tratados en las solicitudes de patente japonesa n.os 03.72.485; 01.143.877; 02.09.819 y 10 03.220.194, así como en las solicitudes internacionales PCT n.os WO 89 07.105 y WO 91 09.034 y las solicitudes de patente europea n.os EP 410.389 y EP 296.110. Se conocen derivados de K-252, un producto natural.
Véanse, por ejemplo, las solicitudes de patente japonesa 15 n.os 63.295.988; 62.240.689; 61.268.687; 62.155.284; 62.155.285; 62.120.388 y 63.295.589, así como la solicitud internacional PCT n.° WO 88 07.045 y la solicitud de patente europea n.° EP 323.171.
“Citocalasina” incluye metabolitos fúngicos que presentan 20 un efecto inhibidor sobre el metabolismo celular diana, incluyendo la prevención de la contracción o migración de células de músculo liso vascular. Preferiblemente, las citocalasinas inhiben la polimerización de actina monomérica (actina G) a la forma polimérica (actina F), inhibiendo de ese 25 modo funciones celulares que requieren microfilamentos citoplasmáticos. Normalmente, las citocalasinas se derivan de fenilalanina (citocalasinas), triptófano (cetoglobosinas) o leucina (aspocalasinas), dando como resultado un grupo bencilo, indol-3-il-metilo o isobutilo, respectivamente, en la posición 30 C-3 de un resto perhidroisoindol-1-ona sustituido (fórmula V o VI).
A su vez, el resto perhidroisoindol contiene un anillo que contiene oxígeno o carboxíclico de 11, 13 ó 14 átomos unido a las posiciones C-8 y C-9. Todas las citocalasinas que se producen de manera natural contienen un grupo metilo en C-5; un 5 grupo metilo o metileno en C-12; y un grupo metilo en C-14 o C-16. Las moléculas a modo de ejemplo incluyen citocalasina A, citocalasina B, citocalasina C, citocalasina D, citocalasina E, citocalasina F, citocalasina G, citocalasina H, citocalasina J, citocalasina K, citocalasina L, citocalasina M, citocalasina N, 10 citocalasina O, citocalasina P, citocalasina Q, citocalasina R, citocalasina S, cetoglobosina A, cetoglobosina B, cetoglobosina C, cetoglobosina D, cetoglobosina E, cetoglobosina F, cetoglobosina G, cetoglobosina J, cetoglobosina K, desoxafomina, proxifomina, protofomina, cigosporina D, cigosporina E, 15 cigosporina F, cigosporina G, aspocalasina B, aspocalasina C, aspocalasina D y similares, así como derivados y equivalentes funcionales de los mismos. Ciertos derivados de citocalasina se exponen en las patentes japonesas n.os 72 01.925; 72 14.219; 72 08.533; 72 23.394; 72 01924; y 72 04.164. La citocalasina B se 20 usa en esta descripción como citocalasina prototipo.
Tal como se hace referencia en el presente documento, células de músculo liso y pericitos incluyen aquellas células que se derivan de las capas de la media de los vasos y adventicia de los vasos que proliferan en sitios vasculares 25 hiperplásicos de la íntima tras una lesión, tal como la provocada durante la PTCA. Las características de las células de músculo liso incluyen una morfología histológica (en el examen con microscopio óptico) de una forma de huso con un núcleo alargado ubicado centralmente en la célula con nucléolos 5 presentes y miofibrillas en el sarcoplasma. En el examen con microscopio electrónico, las células de músculo liso tienen mitocondrias delgadas largas en el sarcoplasma yuxtanuclear, unos cuantos elementos tubulares de retículo endoplásmico granular y numerosas agrupaciones de ribosomas libres. También 10 puede ubicarse un complejo de Golgi pequeño cerca de un polo del núcleo. La mayor parte del sarcoplasma está ocupado por miofilamentos paralelos finos que pueden orientarse, en su mayor parte, hacia el eje mayor de la célula muscular.
Estas miofibrillas que contienen actina pueden estar 15 dispuestas en haces con mitocondrias intercaladas entre las mismas. Dispersas a través de la sustancia contráctil de la célula también pueden estar áreas densas ovales, con áreas densas similares distribuidas en intervalos a lo largo de los aspectos internos del plasmalema. 20
Las características de los pericitos incluyen una morfología histológica (en el examen con microscopio óptico) caracterizada por una forma celular irregular. Los pericitos se encuentran dentro de la membrana basal que rodea células endoteliales vasculares y su identidad puede confirmarse 25 mediante inmunotinción positiva con anticuerpos específicos para actina alfa de músculo liso (por ejemplo, anti-alfa-sm1, Biomakor, Rehovot, Israel), HMW-MAA y antígenos de gangliósidos de pericitos tales como AcM 3G5 (11); e inmunotinción negativa con anticuerpos frente a citoqueratinas (es decir, marcadores de 30 fibroblastos y epiteliales) y factor de von Willdebrand (es decir, un marcador endotelial). Tanto las células de músculo liso vascular como los pericitos son positivos mediante inmunotinción con el anticuerpo monoclonal NR-AN-01.
Las formas de dosificación de la invención son útiles para 35 inhibir la actividad de células de músculo liso vascular, por ejemplo, para reducir, retrasar o eliminar la estenosis tras la angioplastia. Tal como se usa en el presente documento, el término “reducir” significa disminuir el engrosamiento de la íntima que resulta de la estimulación de la proliferación de células de músculo liso tras la angioplastia, o bien en un modelo animal o bien en un ser humano. “Retrasar” significa 5 retrasar el tiempo hasta la aparición de hiperplasia visible de la íntima (por ejemplo, observada histológicamente o mediante examen angiográfico) tras la angioplastia y también puede ir acompañada por reestenosis “reducida”. “Eliminar” la reestenosis tras la angioplastia significa “reducir” completamente y/o 10 “retrasar” completamente la hiperplasia de la íntima en un paciente hasta un grado que hace que ya no sea necesario intervenir quirúrgicamente, es decir, reestablecer un flujo sanguíneo adecuado a través del vaso mediante cirugía de derivación de arterias coronarias, aterectomía o angioplastia de 15 repetición. Los efectos de reducir, retrasar o eliminar la estenosis pueden determinarse mediante métodos de rutina para los expertos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, angiografía, evaluación ultrasónica, obtención de imágenes fluoroscópicas, examen con endoscopio de fibra óptica o biopsia 20 e histología.
Las formas de dosificación terapéuticas (del tipo de liberación sostenida) de la presente invención presentan la capacidad de administrar el agente terapéutico a células diana a lo largo de un periodo de tiempo sostenido. Las formas de 25 dosificación terapéuticas de este aspecto de la presente invención pueden ser de cualquier configuración adecuada para este fin. Las formas de dosificación terapéuticas de liberación sostenida preferidas presentan una o más de las siguientes características: 30
- estructura de polvo de flujo libre microparticulado (por ejemplo, de desde aproximadamente 0,5 micrómetros hasta aproximadamente 100 micrómetros de diámetro, prefiriéndose más desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 2 micrómetros) o nanoparticulado (por ejemplo, de desde 35 aproximadamente 1,0 nanómetros hasta aproximadamente 1000 nanómetros de diámetro, prefiriéndose más desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 250 nanómetros);
- estructura biodegradable diseñada para biodegradarse a lo largo de un periodo de tiempo de desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 180 días, prefiriéndose más desde 5 aproximadamente 10 hasta aproximadamente 21 días, o estructura no biodegradable que permite que la difusión del agente terapéutico se produzca a lo largo de un periodo de tiempo de desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 180 días, prefiriéndose desde aproximadamente 10 hasta 10 aproximadamente 21 días;
- biocompatible con el tejido diana y el entorno fisiológico local en el que va a administrarse la forma de dosificación, incluyendo productos de biodegradación biocompatibles;
- facilita una dispersión reproducible y estable del agente 15 terapéutico en las mismas, preferiblemente para formar una matriz de agente terapéutico-polímero, produciéndose la liberación del agente terapéutico activo a través de una o ambas de las siguientes vías: (1) difusión del agente terapéutico a través de la forma de dosificación (cuando el 20 agente terapéutico es soluble en el polímero o mezcla de polímeros que forma la forma de dosificación); o (2) liberación del agente terapéutico a medida que se biodegrada la forma de dosificación; y
- capacidad de unirse a uno o más epítopos de matriz 25 intersticial y/o celular, prefiriéndose desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10.000 enlaces de proteína/péptido de unión-forma de dosificación y prefiriéndose más un máximo de aproximadamente 1 péptido de unión-forma de dosificación por 150 ångströms cuadrados de área superficial de partícula. El 30 número total unido depende del tamaño de partícula usado. Los péptidos o proteínas de unión pueden acoplarse a la forma de dosificación terapéutica particulada a través de modalidades no covalentes o de tipo sándwich de ligando covalente tal como se expone en el presente documento. 35
Las formas de dosificación de liberación sostenida preferibles de la presente invención son materiales microparticulados o nanoparticulados biodegradables. Más preferiblemente, las micropartículas o nanopartículas biodegradables están formadas por una matriz que contiene polímero que se biodegrada mediante escisión hidrolítica, no enzimática, aleatoria para liberar el agente terapéutico, 5 formándose de ese modo poros dentro de la estructura particulada.
Se prefieren polímeros derivados de la condensación de ácidos alfa-hidroxicarboxílicos y lactonas relacionadas para su uso en la presente invención. Un resto particularmente preferido 10 está formado por una mezcla de poliésteres termoplásticos (por ejemplo, polilactida o poliglicolida) o un copolímero de componentes de lactida y glicolida, tales como poli(lactida-co-glicolida). Una estructura a modo de ejemplo, una poli(DL-lactida-co-glicolida) aleatoria, se muestra a continuación, 15 pudiendo manipularse los valores de x e y por un experto en la técnica para lograr propiedades de material microparticulado o nanoparticulado deseables.
Otros agentes adecuados para formar formas de dosificación 20 particuladas de la presente invención incluyen poliortoésteres y poliacetales (Polymer Letters, 18:293, 1980) y poliortocarbonatos (patente estadounidense n.° 4.093.709) y similares.
Los materiales particulados de matriz que contiene polímero 25 de ácido láctico/ácido glicólico preferidos de la presente invención se preparan mediante procedimientos basados en emulsión, que constituyen procedimientos de extracción con disolvente modificados tales como los descritos por Cowsar et al., “Poly(Lactide-Co-Glycolide) Microcapsules for Controlled 30 Release of Steroids”, Methods Enzymonology, 112: 101-116, 1985 (atrapamiento de esteroides en materiales microparticulados); Eldridge et al., “Biodegradable and Biocompatible Poly(DL-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres as an Adjuvant for Staphylococcal Enterotoxin B Toxoid Which Enhances the Level of Toxin-Neutralizing Antibodies”, Infection and Immunity, 59:2978-2986, 1991 (atrapamiento de toxoides); Cohen et al., “Controlled 5 Delivery Systems for Proteins Based on Poly(Lactic/Glycolic Acid) Microspheres”, Pharmaceutical Research, 8 (6):713-720. 1991 (atrapamiento de enzimas); y Sanders et al., “Controlled Release of a Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Analogue from Poly(D,L-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres”, J. Pharmaceutical 10 Science, 73(9): 1294-1297, 1984 (atrapamiento de péptidos).
En general, el procedimiento para formar formas de dosificación particuladas de la presente invención implica disolver el polímero en un disolvente de hidrocarburo halogenado, dispersar una disolución de agente terapéutico 15 (preferiblemente acuosa) en el mismo y añadir un agente adicional que actúa como disolvente para el disolvente de hidrocarburo halogenado pero no para el polímero. El polímero precipita a partir de la disolución de polímero-hidrocarburo halogenado sobre gotitas de la disolución que contiene agente 20 terapéutico y atrapa al agente terapéutico. Preferiblemente, el agente terapéutico se dispersa de manera sustancialmente uniforme dentro de la forma de dosificación de liberación sostenida de la presente invención.
Tras la formación de materiales particulados, se lavan y se 25 endurecen con un disolvente orgánico. Siguen las etapas de lavado con agua y lavado con tensioactivo no iónico acuoso, antes de secar a temperatura ambiente a vacío.
Para fines de biocompatibilidad, las formas de dosificación particuladas, caracterizadas por un agente terapéutico 30 dispersado en las mismas en forma de matriz, se esterilizan antes del envasado, almacenamiento o administración. La esterilización puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente para la misma.
La liberación del agente terapéutico a partir de las formas 35 de dosificación particuladas de la presente invención puede producirse como resultado de tanto difusión como erosión de la matriz particulada.
La velocidad de biodegradación tiene un impacto directo sobre la cinética de liberación del agente terapéutico. La velocidad de biodegradación puede regularse mediante la 5 alteración de la composición o estructura de la forma de dosificación de liberación sostenida. Por ejemplo, puede llevarse a cabo la alteración de la razón lactida/glicolida en formas de dosificación preferidas de la presente invención, tal como se describe por Tice et al., “Biodegradable Controlled-10 Release Parenteral Systems”, Pharmaceutical Technology, págs. 26-35, 1984; mediante inclusión de agentes modificantes de hidrólisis de polímeros, tales como ácido cítrico y carbonato de sodio, tal como se describe por Kent et al., Microencapsulation of Water Soluble Active Polypeptides”, patente estadounidense 15 n.° 4.675.189; alterando la carga del agente terapéutico en el polímero de lactida/glicolida, siendo la velocidad de degradación inversamente proporcional a la cantidad de agente terapéutico contenido en el mismo, y mediante selección acertada de un análogo apropiado de una familia común de agentes 20 terapéuticos que presentan potencias diferentes de manera que se alteren dichas cargas de núcleo; y mediante variación del tamaño de material particulado, tal como se describe por Beck et al., “Poly (DL-Lactide-Co-Glycolide)/Norethisterone Microcapsules: An Injectable Biodegradable Contraceptive”, Biol. Reprod., 28:186-25 195, 1983 o similares. Todos los métodos mencionados anteriormente de regulación de la velocidad de biodegradación influyen en la viscosidad intrínseca de la matriz que contiene polímero, alterando de ese modo la velocidad de hidratación del mismo. 30
La estructura de lactida/glicolida preferida es biocompatible con el entorno fisiológico de mamíferos. Además, estas formas de dosificación de liberación sostenida preferidas tienen la ventaja de que la biodegradación de las mismas forma ácido láctico y ácido glicólico, ambos productos metabólicos 35 normales de mamíferos.
Los agentes terapéuticos de la invención se seleccionan para inhibir una actividad celular de una célula de músculo liso vascular, por ejemplo, proliferación, migración, aumento del volumen celular, aumento de la síntesis de matriz extracelular (por ejemplo, colágenos, proteoglicanos y similares) o secreción 5 de materiales de matriz extracelular por la célula. Preferiblemente, el agente terapéutico actúa o bien: como inhibidor de la migración de células de músculo liso vascular desde la pared de la media hacia la íntima, por ejemplo, un “agente antimigratorio” tal como una citocalasina; o bien como 10 inhibidor del aumento intracelular del volumen celular (es decir, el volumen tisular ocupado por una célula; un “inhibidor de citoesqueleto” o “inhibidor metabólico”).
Los agentes terapéuticos antimigratorios preferidos son las citocalasinas. 15
Ejemplos representativos de “inhibidores de citoesqueleto” incluyen taxol que actúan sobre las redes de microfilamentos y microtúbulos dentro de una célula.
Para las realizaciones de formas de dosificación de liberación sostenida de la presente invención, los agentes 20 terapéuticos preferiblemente son aquellos que inhiben la actividad de células de músculo liso vascular sin destruir las células (es decir, agentes terapéuticos citostáticos). Los agentes terapéuticos preferidos para este fin presentan una o más de las siguientes capacidades: inhibir la síntesis de ADN 25 antes de la inhibición de síntesis de proteínas o inhibir la migración de células de músculo liso vascular hacia la íntima. Estos agentes terapéuticos no inhiben significativamente la síntesis de proteínas (es decir, no destruyen las células diana) y, por tanto, facilitan la reparación celular y la producción de 30 matriz para estabilizar la lesión de la pared vascular provocada por la angioplastia, reduciendo la proliferación de células de músculo liso.
Ejemplos de tales agentes terapéuticos preferidos son inhibidores de proteínas cinasas, tales como citocalasinas, 35 tales como citocalasina B (Sigma Chemical Co.), o análogos o equivalentes funcionales de los mismos. Estos compuestos son citostáticos y se ha demostrado que ejercen citotoxicidad e inhibición de síntesis de proteínas mínimas en concentraciones en las que se produce una inhibición de la síntesis de ADN significativa (véase el ejemplo 1). Un protocolo útil para identificar los agentes terapéuticos útiles en las realizaciones 5 de formas de dosificación de liberación sostenida de la presente invención se expone en el ejemplo 1, por ejemplo. Un experto en la técnica puede diseñar protocolos experimentales sustancialmente equivalentes para realizar una identificación de este tipo para diferentes poblaciones de células diana, tales 10 como tipos de células diana en monocapa adherente.
Otros agentes terapéuticos preferidos útiles en la práctica de la presente invención incluyen restos que pueden reducir o eliminar la proliferación, migración o hiperactividad patológica de tejidos normales. Ejemplos de tales agentes terapéuticos son 15 aquellos que pueden reducir o eliminar la hiperactividad del epitelio y estroma de la córnea, la proliferación patológica o contracción prolongada de células de músculo liso o pericitos de la vasculatura intraocular implicada en la enfermedad ocular degenerativa que resulta de la hiperplasia o la disminución del 20 área de la luz vascular. El agente preferido para este fin es citocalasina B.
Para el tratamiento de un sitio vascular lesionado o traumatizado, las formas de dosificación de la invención pueden administrarse al huésped usando un catéter para infusión, tal 25 como el producido por C.R. Bard Inc., Billerica, MA, o el dado a conocer por Wolinsky (7; patente estadounidense n.° 4.824.436) o Spears (patente estadounidense n.° 4.512.762).
Las formas de dosificación de liberación sostenida de una realización de la invención pueden necesitar sólo que se 30 administren en una dosificación terapéutica antiproliferativa suficiente para exponer las capas celulares próximas (6 a 9) de las células de músculo liso de la túnica media que revisten la luz a la forma de dosificación. Esta dosificación puede determinarse empíricamente, por ejemplo, a) infundiendo vasos de 35 sistemas modelo animales adecuados y usando métodos de microscopía electrónica, fluorescente o inmunohistoquímica para detectar la forma de dosificación y sus efectos; y b) realizando estudios in vitro adecuados.
En un ejemplo representativo, esta dosificación terapéuticamente eficaz se logra determinando en un cultivo tisular de células de músculo liso la dosificación de agente 5 pericelular, que en una exposición continua da como resultado un efecto terapéutico entre las dosis eficaces mínima y tóxica. Este nivel terapéutico se obtiene in vivo determinando el tamaño, el número y la concentración de agente terapéutico y la velocidad de liberación requerida para que los materiales 10 particulados infundidos entre las células de músculo liso de la pared de la arteria mantengan esta dosificación terapéutica pericelular.
La forma de dosificación debe liberar el agente terapéutico a una velocidad que se aproxime a la dosis pericelular de los 15 siguientes agentes terapéuticos a modo de ejemplo: desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 100 microgramos/ml de nitroglicerina, desde aproximadamente 1,0 hasta aproximadamente 1000 microgramos/ml de suramina, desde aproximadamente 0,001 hasta aproximadamente 100 microgramos/ml para citocalasina, y 20 desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 105 nanogramos/ml de estaurosporina.
Los expertos en la técnica reconocerán que dosificaciones terapéuticamente eficaces deseadas de la forma de dosificación de liberación sostenida de la invención dependerán de varios 25 factores.
También se reconocerá que la selección de un agente terapéutico que ejerce sus efectos intracelularmente, por ejemplo, sobre el metabolismo de ADN o ribosomas, influirá en la dosificación y el tiempo requerido para lograr una dosificación 30 terapéuticamente eficaz, y que este proceso puede modelarse in vitro y en estudios en animales, tales como los descritos en los ejemplos proporcionados a continuación, para encontrar el intervalo de concentraciones sobre el que debe administrarse la forma de dosificación para lograr sus efectos de retrasar, 35 reducir o prevenir la reestenosis tras la angioplastia. Una dosificación terapéuticamente eficaz de la forma de dosificación se alcanzará cuando se cumplan al menos tres condiciones: concretamente, (1) la forma de dosificación se distribuye en las capas de la íntima del vaso traumáticamente lesionado; (2) la forma de dosificación se distribuye dentro del compartimento intracelular deseado de las células de músculo liso, es decir, 5 el compartimento necesario para la acción del agente terapéutico, o el agente terapéutico liberado a partir de la forma de dosificación extracelularmente se distribuye dentro del compartimento intracelular relevante; y (3) el agente terapéutico inhibe la actividad celular deseada de la célula de 10 músculo liso vascular, por ejemplo, proliferación, migración, aumento del volumen celular, síntesis de matriz, contracción celular y similares descritas anteriormente.
Se reconocerá que cuando la forma de dosificación va a administrarse con un catéter para infusión, la dosificación 15 terapéutica requerida para lograr la actividad inhibidora deseada para la forma de dosificación también puede anticiparse a través del uso de estudios in vitro. En un aspecto preferido, el catéter para infusión puede ser convenientemente un catéter de doble balón o cuádruple balón con una membrana permeable. En 20 una realización representativa, una dosificación terapéuticamente eficaz de una forma de dosificación es útil en el tratamiento de un traumatismo vascular que resulta de una enfermedad (por ejemplo, aterosclerosis, aneurisma o similares) o procedimientos quirúrgicos vasculares tales como angioplastia, 25 aterectomía, colocación de una endoprótesis (por ejemplo, en un vaso), trombectomía e injerto.
La aterectomía puede realizarse, por ejemplo, mediante extirpación quirúrgica, tratamiento con láser o ultrasonidos, o mediante flujo de fluidos a alta presión. El injerto puede ser, 30 por ejemplo, injerto vascular usando materiales naturales o sintéticos o anastomosis quirúrgica de vasos tal como, por ejemplo, durante el injerto de órganos. Los expertos en la técnica reconocerán que la dosificación terapéutica apropiada para un procedimiento quirúrgico vascular dado (anteriormente) 35 se determina en estudios en modelos animales in vitro e in vivo, y en ensayos preclínicos en seres humanos.
En el caso de formas de dosificación que contienen agentes terapéuticos antimigratorios o antimatriz, pueden usarse migración celular y adherencia celular en ensayos in vitro, respectivamente, para determinar la concentración a la que se alcanzará una dosificación terapéuticamente eficaz en el espacio 5 de fluido creado por el catéter para infusión en la pared del vaso.
Aunque una realización representativa de la invención se refiere a métodos terapéuticos que emplean un catéter para infusión, se reconocerá que también pueden ser útiles otros 10 métodos para la administración de fármacos o vías de administración, por ejemplo, inyección mediante administración intravenosa, intralinfática, intratecal, intraarterial, local, mediante bombas osmóticas implantadas u otras vías intracavitarias. Para la administración intravenosa, se 15 prefieren formas de dosificación nanoparticuladas de la presente invención. La administración intravenosa de materiales nanoparticulados es útil, por ejemplo, cuando la permeabilidad vascular a escapes aumenta en tumores, especialmente en áreas necróticas de tumores que tienen vasos dañados que permiten el 20 escape de partículas hacia el líquido intersticial, y cuando las paredes de las arterias se han denudado y traumatizado permitiendo que las partículas entren en el área intersticial de la túnica media.
Ventajosamente, puede administrarse proteína de unión a 25 células de músculo liso vascular no acoplada (por ejemplo, anticuerpo NR-AN-01 libre) antes de la administración de la forma de dosificación para proporcionar un bloqueante de la unión no específica a sitios de reacción cruzada. El bloqueo de tales sitios es importante debido a que las proteínas de unión a 30 células de músculo liso vascular generalmente tendrán cierto nivel bajo de reactividad cruzada con células en tejidos distintos de las células de músculo liso deseadas. Tal bloqueo puede mejorar la localización del conjugado terapéutico o la forma de dosificación en el sitio vascular específico, por 35 ejemplo, haciendo que más del conjugado terapéutico esté disponible para las células. Como ejemplo, la proteína de unión a músculo liso vascular no acoplada se administra desde aproximadamente 5 minutos hasta aproximadamente 48 horas, lo más preferiblemente desde aproximadamente 5 minutos hasta aproximadamente 30 minutos, antes de la administración del conjugado terapéutico o la forma de dosificación. 5
En una realización preferida de la invención, el “bloqueante” específico no marcado es una forma monovalente o bivalente de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo completo o un fragmento F(ab)’2 Fab, Fab’ o Fv de un anticuerpo). La forma monovalente del anticuerpo tiene la ventaja de minimizar 10 el desplazamiento del conjugado terapéutico o la forma de dosificación mientras que maximiza el bloqueo de los sitios de reacción cruzada no específicos. La proteína de unión a células de músculo liso vascular no acoplada se administra en una cantidad eficaz para bloquear la unión de al menos una parte de 15 los sitios de reacción cruzada no específicos en un paciente.
La cantidad puede variar según factores tales como el peso del paciente y la naturaleza de la proteína de unión. En general, se administra de aproximadamente 0,06 mg a 0,20 mg por kg de peso corporal o más del bloqueante específico no marcado a 20 un ser humano.
Además, opcionalmente puede administrarse una segunda proteína de unión a células de músculo liso vascular irrelevante a un paciente antes de la administración del conjugado terapéutico o la forma de dosificación para reducir la unión no 25 específica del conjugado terapéutico o la forma de dosificación a los tejidos. En una realización preferida, la proteína de unión irrelevante puede ser un anticuerpo que no se une a sitios en el paciente a través de unión específica a antígeno, sino que en su lugar se une de manera no específica, por ejemplo, a 30 través de células reticuloendoteliales que se unen a receptor Fc, unión a asialo-receptor, y mediante unión a células que expresan ubicuitina. El “bloqueante” irrelevante disminuye la unión no específica del conjugado terapéutico o la forma de dosificación y por tanto reduce los efectos secundarios, por 35 ejemplo, toxicidad tisular, asociados con el uso del conjugado terapéutico o la forma de dosificación. El “bloqueante” irrelevante se administra ventajosamente desde 5 minutos hasta 48 horas, lo más preferiblemente desde 15 minutos hasta una hora, antes de la administración del conjugado terapéutico o la forma de dosificación, aunque la duración del tiempo puede variar dependiendo del conjugado terapéutico y la vía o el 5 método de inyección.
Ejemplos representativos de “bloqueantes” irrelevantes incluyen anticuerpos que no son reactivos con tejidos humanos y receptores o proteínas séricas y celulares preparadas a partir de fuentes animales que cuando se someten a prueba se encuentra 10 que no inhiben de manera específica (por ejemplo, con un Ka < 103 M-1) a dianas en la membrana celular humana.
Se reconocerá que las formas de dosificación de la invención no se limitan en su uso a la terapia tras la angioplastia; en su lugar, la utilidad de las formas de 15 dosificación se proscribirá por su capacidad para inhibir actividades celulares de células de músculo liso y pericitos en la pared vascular. Por tanto, otros aspectos de la invención incluyen formas de dosificación y protocolos útiles en la intervención terapéutica temprana para reducir, retrasar o 20 eliminar (e incluso revertir) placas ateroscleróticas y zonas de hiperplasia y/o hipertrofia de la pared vascular. Las formas de dosificación de la invención también encuentran utilidad para la intervención temprana en estados pre-ateroscleróticos, por ejemplo, son útiles en pacientes con un riesgo alto de 25 desarrollar aterosclerosis o con signos de hipertensión que resultan de cambios ateroscleróticos en vasos o estenosis de vasos debido a la hipertrofia de la pared del vaso.
Las formas de dosificación de la invención también pueden usarse en modalidades terapéuticas para potenciar el 30 recrecimiento de células endoteliales en tejidos vasculares lesionados y en muchos tipos de sitios de heridas incluyendo heridas epiteliales. En estas modalidades terapéuticas, las formas de dosificación de la invención encuentran utilidad en la inhibición de la migración y/o proliferación de células de 35 músculo liso o pericitos. Se han implicado las células de músculo liso y pericitos en la producción de factores in vitro que inhiben la proliferación de células endoteliales, y su proliferación también puede dar como resultado una barrera física para establecer un endotelio continuo. Por tanto, las formas de dosificación de la invención encuentran utilidad en la promoción de neoangiogénesis y el aumento de la 5 reendotelialización, por ejemplo, durante la cicatrización de heridas, injertos de vasos y tras cirugía vascular. Las formas de dosificación también pueden liberar modalidades terapéuticas que estimulan o aceleran la reendotelialización de la pared del vaso dañada. Un agente terapéutico a modo de ejemplo para este 10 fin es un factor de permeabilidad vascular.
Todavía otros aspectos de la invención se refieren a modalidades terapéuticas para potenciar la cicatrización de heridas en un sitio vascular y mejorar las propiedades elásticas y estructurales de tejidos vasculares cicatrizados. En estas 15 modalidades terapéuticas que usan la forma de dosificación de la invención, es decir, inhibir la migración y proliferación de células de músculo liso o pericitos en una pared de un vaso, se mejoran la resistencia y la calidad de la cicatrización de la pared del vaso. Las células de músculo liso en el sitio de 20 herida vascular contribuyen al proceso normal de contracción del sitio de herida que promueve la cicatrización de heridas. Actualmente se cree que la migración y proliferación de células de músculo liso y la secreción de matriz por células de músculo liso trasformadas puede disminuir este proceso normal y alterar 25 las cualidades elásticas y estructurales a largo plazo del vaso cicatrizado. Por tanto, otros aspectos de la invención proporcionan formas de dosificación que inhiben la proliferación y migración de pericitos y músculo liso así como la transformación morfológica, y mejoran la calidad de la 30 vasculatura cicatrizada.
Todavía otro aspecto de la presente invención se refiere a modalidades terapéuticas para mantener un volumen luminal expandido tras la angioplastia u otro traumatismo de vasos. Una realización de este aspecto de la presente invención implica la 35 administración de un agente terapéutico que puede inhibir la capacidad de contraerse de células de músculo liso vascular.
Agentes a modo de ejemplo útiles en la práctica de este aspecto de la presente invención son aquellos que pueden provocar que una arteria traumatizada pierda tono vascular, de manera que la presión hidrostática vascular normal (es decir, tensión arterial) expanda el vaso flácido hasta o próximo a su 5 diámetro fisiológico máximo. La pérdida de tono vascular puede provocarse por agentes que interfieren con la formación o función de proteínas contráctiles (por ejemplo, actina, miosina, tropomiosina, caldesmon, calponina o similares). Esta interferencia puede producirse directa o indirectamente a través 10 de, por ejemplo, la inhibición de la modulación por calcio, fosforilación u otras rutas metabólicas implicadas en la contracción de células de músculo liso vascular.
La inhibición de la contracción celular (es decir, pérdida de tono vascular) puede realizarse a través de dos mecanismos 15 para reducir el grado de estenosis vascular. En primer lugar, la inhibición de la contracción celular durante un periodo prolongado de tiempo limita el número de células de músculo liso que migran desde la túnica media hacia la íntima, cuyo engrosamiento da como resultado estenosis luminal vascular. En 20 segundo lugar, la inhibición de la contracción celular provoca que la pared de músculo liso se relaje y se dilate bajo la presión hidrostática vascular normal (es decir, tensión arterial). Agentes terapéuticos, tales como las citocalasinas, inhiben la contracción de células de músculo liso sin suprimir 25 la síntesis de proteínas necesaria para que las células de músculo liso traumatizadas, tras la angioplastia u otras dañadas por enfermedad o quirúrgicamente se reparen a sí mismas. La síntesis de proteínas también es necesaria para que las células de músculo liso secreten la matriz, que fija o retiene la luz en 30 un estado próximo a su diámetro sistólico máximo a medida que se estabiliza la lesión vascular (es decir, un efecto de implantación de endoprótesis inducido biológicamente).
Este efecto de implantación de endoprótesis biológica no sólo da como resultado un área luminal de vaso expandida y un 35 aumento de la velocidad de flujo sanguíneo a través del vaso, sino también reduce significativamente el retroceso elástico tras la angioplastia. El retroceso elástico es un cierre agudo del vaso asociado con vasoespasmo o relajación temprana de la pared muscular, debido a un choque traumático que resulta de la sobredistensión del vaso por un catéter de balón durante la angioplastia. Este espasmo de la túnica media que conduce a 5 disminuciones en el área luminal puede producirse en un plazo de horas, días o semanas tras la dilatación del balón, a medida que se produce el restablecimiento del tono de la pared de músculo vascular. Observaciones recientes durante el examen microscópico de muestras de aterectomía sugieren que el retroceso elástico 10 puede producirse en hasta el 25% de los procedimientos de angioplastia clasificados como exitosos, basándose en el angiograma tras el procedimiento inicial. Debido a que el procedimiento de implantación de endoprótesis biológica relaja la pared de la arteria tras la angioplastia con balón, el médico 15 puede eliminar la hiperinsuflación y su choque traumático resultante como medio para disminuir o retrasar el espasmo del vaso o el retroceso elástico. La reducción o eliminación de la hiperinsuflación disminuye el traumatismo en la pared muscular del vaso, reduciendo de ese modo los determinantes de la 20 proliferación de células de músculo liso en la íntima y, por tanto, reduciendo la incidencia o gravedad de la reestenosis.
La implantación de endoprótesis biológica también disminuye la incidencia de formación de trombos. En arterias femorales de cerdo tratadas con citocalasina B, por ejemplo, se disminuyó la 25 incidencia de microtrombos parietales en comparación con las arterias traumatizadas por balón que no se trataron con el agente terapéutico. Este fenómeno parece ser un beneficio secundario que puede resultar del aumento de flujo sanguíneo a través del vaso traumatizado, obteniéndose dicho beneficio a 30 través de la práctica de la presente invención.
Las citocalasinas son agentes terapéuticos a modo de ejemplo que pueden generar un efecto de implantación de endoprótesis biológica sobre células de músculo liso vascular. Se cree que las citocalasinas inhiben tanto la migración como la 35 contracción de células de músculo liso vascular interaccionando con la actina. Las citocalasinas interaccionan con los extremos de la actina filamentosa inhibiendo el alargamiento de los filamentos de actina. Dosis bajas de citocalasinas (por ejemplo, citocalasina B) también alteran las redes de microfilamentos de actina.
Los datos in vitro indican que después de que las células 5 de músculo liso vascular eliminen la citocalasina B, las células regeneran suficiente actina polimerizada para reanudar la migración en un plazo de aproximadamente 24 horas. Las valoraciones in vivo revelan que las células de músculo liso vascular recuperan el tono vascular en un plazo de 2 a 4 días. 10 Es durante este periodo de recuperación cuando se producen la fijación del diámetro de la luz y el efecto de implantación de endoprótesis biológica.
El agente terapéutico puede dirigirse, pero preferiblemente se administra directamente al vaso traumatizado tras la 15 angioplastia u otro acontecimiento traumático. El efecto de implantación de endoprótesis biológica de la citocalasina B, por ejemplo, puede lograrse usando una sola infusión del agente terapéutico en la región traumatizada de la pared del vaso a una concentración de dosis que oscila desde aproximadamente 0,1 20 microgramos/ml hasta aproximadamente 1,0 microgramos/ml.
Se ha demostrado la inhibición de la migración de células de músculo liso vascular (desde la túnica media hasta la íntima) en el mismo intervalo de dosis (ejemplo 3); sin embargo, es preferible una exposición sostenida del vaso al agente 25 terapéutico con el fin de maximizar estos efectos antimigratorios. Si las células de músculo liso vascular no pueden migrar hacia la íntima, no pueden proliferar allí. Si las células de músculo liso vascular migran a la íntima, una forma de dosificación de liberación sostenida antiproliferativa 30 administrada posteriormente inhibe la proliferación de la íntima. Como resultado, la forma de dosificación de liberación sostenida de la presente invención, que incorpora una citocalasina u otro agente terapéutico antiproliferativo, puede administrarse en combinación con un agente terapéutico de 35 citocalasina libre. De esta manera, pueden lograrse el efecto de implantación de endoprótesis biológica, así como un efecto antimigratorio o antiproliferativo, en un protocolo de una sola administración.
Los agentes útiles en los protocolos de la presente invención pueden identificarse, por ejemplo, según los siguientes procedimientos. Un agente potencial para la 5 administración de agente libre (es decir, no dirigido) presenta una o más de las siguientes características:
(i) conserva un volumen luminal expandido tras la angioplastia (por ejemplo, PTCA, angioplastia transluminal percutánea (PTA) o similares) u otro traumatismo, incluyendo 10 aterectomía (por ejemplo, aterectomía rotacional, láser y similares), procedimientos de derivación de arterias coronarias o similares; o que resulta de una enfermedad vascular (por ejemplo, aterosclerosis, enfermedades oculares secundarias a atrofia o estenosis vascular, enfermedades 15 estenóticas vasculares cerebrales o similares);
(ii) el aumento inicial del área luminal facilitado por el agente no da como resultado ni acentúa la estenosis crónica de la luz;
(iii) inhibe la migración o contracción de células diana; 20
y
(iv) es citostático.
Preferiblemente, un agente terapéutico empleado en el presente documento tendrá las cuatro propiedades; sin embargo, la primera y tercera son más importantes que la segunda y cuarta 25 para la práctica de la presente invención. Por ejemplo, se evaluó la citocalasina B para determinar su idoneidad de uso en protocolos de agente terapéutico libre. El efecto de implantación de endoprótesis biológica de la citocalasina B puede lograrse usando una sola infusión del agente terapéutico 30 en la región traumatizada de la pared del vaso a una concentración de dosis que oscila desde aproximadamente 0,1 microgramos/ml hasta aproximadamente 1,0 microgramos/ml.
Un agente útil en las realizaciones de liberación sostenida de la presente invención presenta una o más de las siguientes 35 características:
(i) conserva un volumen luminal expandido tras la angioplastia (por ejemplo, PTCA, angioplastia transluminal percutánea (PTA) o similares) u otro traumatismo, incluyendo aterectomía (por ejemplo, aterectomía rotacional, láser y similares), procedimientos de derivación de arterias 5 coronarias o similares; o que resulta de una enfermedad vascular (por ejemplo, aterosclerosis, enfermedades oculares secundarias a atrofia o estenosis vascular, enfermedades estenóticas vasculares cerebrales o similares);
(ii) inhibe la proliferación de células diana (por ejemplo, 10 tras una exposición de 5 minutos y 24 horas al agente, cultivos tisulares de músculo liso vascular in vitro demuestran un nivel de inhibición de la captación de 3H-timidina y, preferiblemente, presentan una inhibición relativamente menor de la captación de 3H-leucina); 15
(iii) a una dosis suficiente para inhibir la síntesis de ADN, produce sólo efectos citotóxicos morfológicos de leves a moderados (por ejemplo, grado 2 ó 3 en los ensayos descritos a continuación);
(iv) inhibe la contracción de células diana; y 20
(v) es citostático.
Tras la identificación de un agente terapéutico que presenta uno o más de los atributos anteriores, el agente se somete a un segundo protocolo de pruebas que implica una exposición más prolongada de las células de músculo liso 25 vascular al agente terapéutico.
Un agente útil en las realizaciones de liberación sostenida de la presente invención presenta las siguientes características:
(i) tras una exposición a largo plazo (por ejemplo, 5 días), 30 el agente produce igual o similar efecto in vitro sobre la síntesis de proteínas y la síntesis de ADN en cultivo tisular de músculo liso vascular, tal como se describió anteriormente para las exposiciones de 5 minutos y 24 horas; y
(ii) a una dosis eficaz en el ensayo in vitro a largo plazo 35 para determinar la inhibición de la síntesis de ADN, el agente presenta efectos citotóxicos morfológicos de leves a moderados a lo largo de un plazo más largo (por ejemplo, 10 días).
La evaluación adicional de agentes antiproliferativos potenciales dentro de la presente invención se lleva a cabo en un modelo de arteria femoral de cerdo traumatizada por balón in 5 vivo. Preferiblemente, tales agentes demuestran una inhibición del 50% o mayor de la proliferación celular en células de músculo liso vascular de la túnica media, tal como se indica por un “marcaje rápido con BRDU” de 1 hora antes de la recogida de tejido y su evaluación histológica. Si un agente es eficaz 10 durante un periodo de tiempo suficiente para inhibir la proliferación del músculo liso de la íntima en un 50% o más con una sola exposición, es un agente dentro de la presente invención que no requiere la administración en una forma de dosificación de liberación sostenida. Los agentes que tienen 15 actividad de duración más corta se evalúan para determinar su liberación sostenida si la toxicidad sistémica y el índice terapéutico potencial parecen permitir la administración intravenosa para lograr un 50% de inhibición, o si el agente es susceptible de administración local a las células de músculo 20 liso vascular con liberación sostenida a una dosis antiproliferativa eficaz. Los agentes de liberación sostenida se evalúan en una forma de dosificación de liberación sostenida para estudios de eficacia y optimización de la dosis. Preferiblemente, los agentes antiproliferativos útiles en la 25 práctica de la presente invención disminuyen la estenosis vascular en un 50% en arterias femorales de cerdo traumatizadas por balón y, más preferiblemente, disminuyen la estenosis vascular en un grado similar en arterias coronarias de cerdo. Entonces, tales agentes pueden evaluarse en ensayos clínicos en 30 seres humanos.
La inhibición de la proliferación celular (es decir, síntesis de ADN) es la característica primaria para la liberación sostenida de los agentes.
Por ejemplo, la estaurosporina presenta una captación 35 diferencial entre 3H-leucina y 3H-timidina de manera que es citostática a las dosis administradas. Estudios de citotoxicidad de mayor duración no indicaron que la exposición prolongada al agente terapéutico tuviese un impacto adverso sobre las células diana. Además, el pulso de BRDU indicó que la estaurosporina inhibe la proliferación de células diana. Sin embargo, puede emplearse alternativamente cualquier método conveniente para 5 evaluar la capacidad de inhibición de la proliferación celular. En consecuencia, la estaurosporina es eficaz en la conservación de un volumen luminal expandido.
La invención se entenderá mejor haciendo referencia a los siguientes ejemplos específicos. 10
EJEMPLO 1
Inhibición de la síntesis de proteínas y ADN in vitro de células de músculo liso vascular Se sometió a prueba la capacidad de diversos agentes terapéuticos para inhibir la síntesis de ADN y la síntesis de proteínas en células de músculo 15 liso vascular. Se llevaron a cabo ensayos de citotoxicidad y captación de 3H-timidina y 3H-leucina según los siguientes protocolos.
Exposición de 5 minutos: captación de 3H-leucina: Se sembraron células de músculo liso vascular a 40.000 células/ml 20 en placas de 24 pocillos estériles a 1 ml/pocillo. Se incubaron las placas durante la noche a 37ºC, 5% de CO2, 95% de aire en una atmósfera humidificada (saturación). Se incubaron diluciones logarítmicas del agente terapéutico de interés con las células de músculo liso vascular durante 5 minutos o 24 horas. Se 25 diluyeron muestras de los agentes terapéuticos en medio DMEM:F-12 (Whittaker Bioproducts, Walkersville, Maryland) con suero bovino fetal al 5% (FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD) y suero Plus® al 5% (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Tras la incubación del agente terapéutico, se aspiró la disolución y se añadió 1 30 ml/pocillo de 3H-leucina 0,5 microcuries/ml en DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) libre de leucina con suero Plus® al 5%. Se reincubaron las placas durante la noche a 37ºC, 5% de CO2 en una atmósfera humidificada. Se clasificaron visualmente las células usando un microscopio invertido que usaba una escala 35 de puntuación para determinar la viabilidad y el número de células. El grado 1 a 3 se basa en el porcentaje de viabilidad y número de células en comparación con los pocillos control, con 3=100%, 2=70%-100% y 1=0%-70%. Un registro de esta puntuación ayudó a determinar el efecto citotóxico inmediato de los agentes terapéuticos. Entonces se aspiró el medio y se lavaron las células dos veces con TCA al 5% frío. Se añadieron 400 5 microlitros de NaOH 0,2 M por pocillo y se incubaron las placas durante dos horas a temperatura ambiente en una plataforma giratoria. Se transfirieron 200 microlitros por pocillo de la disolución de células a viales de centelleo de plástico (Bio-Rad Laboratories) y se añadieron 4 mililitros de líquido de 10 centelleo líquido Bio-Safe® II (Research Products InterCorp., Mount Prospect, IL) antes de agitar con vórtex. Se contaron los viales en un contador de centelleo líquido LS2800 de Beckman interconectado con un software de “captura de datos” de Beckman para la conversión a un archivo Lotus 1-2-3® y su análisis 15 usando Lotus 1-2-3®.
Exposición de 5 minutos: captación de 3H-timidina: Se incubaron células de músculo liso vascular en medio completo con FBS al 5% (Gibco) durante la noche a 37ºC en un entorno con un 5% de CO2, humidificado en placas de 24 pocillos estériles. Se 20 aspiró el medio de los pocillos y se añadió medio libre de suero complementado con factores de crecimiento (medio basal DMEM:F-12 complementado con un cóctel de factores de crecimiento, número de catálogo I1884, que contiene insulina (5 microgramos/ml), transferrina (5 microgramos/ml) y selenito de sodio (5 25 nanogramos/ml), disponible de Sigma Chemical, St. Louis, Missouri). Se incubaron las células en este medio durante 24 horas. Para una exposición a agente terapéutico de 5 minutos, se incubaron diluciones logarítmicas del agente terapéutico con las células en medio completo. Tras 5 minutos y la aspiración del 30 medio, se añadió 1 ml/pocillo de 3H-timidina 1,0 microcuries/ml dispersada en medio completo. La exposición de 24 horas implicó la incubación de las células con 1 ml/pocillo de 3H-timidina 1,0 microcuries/ml dispersada en medio completo y las diluciones logarítmicas del agente terapéutico que estaba sometiéndose a 35 prueba. En ambos ensayos de exposición, se incubaron entonces las células durante la noche a 37ºC en un entorno con un 5% de CO2, humidificado. Se puntuaron visualmente las células para determinar la viabilidad y el número de células. Se lavaron las células y se prepararon para su transferencia a viales de centelleo de plástico tal como se describió para el protocolo de 3H-leucina. Se contaron los viales en un contador de centelleo 5 líquido LS2800 de Beckman interconectado con un software de “captura de datos” de Beckman para la conversión a un archivo Lotus 1-2-3® y análisis usando Lotus 1-2-3®.
Estos protocolos son susceptibles de usarse con otras poblaciones de células diana, especialmente tipos de células en 10 monocapa adherente.
Evaluación de la citotoxicidad morfológica-exposición en pulsos: Se sembraron células de músculo liso vascular a 4,0 x 104 células/ml de medio/pocillo en un portaobjetos de cuatro pocillos preparado comercialmente (Nunc, Inc., Naperville, 15 Illinois). Se sembraron suficientes portaobjetos para alojar dos duraciones de exposición en pulsos (5 minutos y 24 horas) y puntos de evaluación de aumentos prescritos (de 24 horas a 128 horas). Se procesaron todos los portaobjetos por duplicado para revelar cualquier anomalía del ensayo. Se diluyó el agente 20 terapéutico en el mismo medio usado en los ensayos de 3H-leucina y 3H-timidina. Se agrupó según la concentración cada portaobjetos de cuatro pocillos a una concentración un logaritmo mayor (pocillo “B”), una concentración un logaritmo menor (pocillo “D”) de la concentración eficaz mínima (pocillo “C”), 25 tal como se determinó mediante los ensayos de 3H-leucina y 3H-timidina descritos anteriormente. Como control para la morfología normal, se dejó sin tratar (sólo el medio) un pocillo (pocillo “A”). La incubación tuvo lugar en un incubador humidificado con un 5% de CO2, a 37ºC. Tras cada uno de los dos 30 puntos de exposición (5 minutos y 24 horas), se aspiró el medio de agente terapéutico de cada pocillo, incluyendo el pocillo sin tratar. Entonces, se añadió un mililitro de medio nuevo para reemplazar el medio aspirado. Se siguió con la reincubación hasta que se lograron cada uno de los puntos de evaluación 35 aumentados. En esos puntos, se aspiró el medio y se reemplazó posteriormente por 1 ml de formalina tamponada neutra al 10% durante una hora para permitir una fijación apropiada. Se tiñeron estos portaobjetos fijados mediante hematoxilina (nuclear) y eosina (citoplasmática) para la clasificación y evaluación morfológica.
Resultados: Los resultados del ensayo de inhibición de 5 proteínas con 3H-leucina de 24 horas y el ensayo de inhibición de la síntesis de ADN con 3H-timidina de 24 horas se muestran en las figuras 1A-1C para suramina, estaurosporina, nitroglicerina, respectivamente.
Todos los compuestos sometidos a prueba mostraron un 10 intervalo terapéutico disponible (el área bajo la curva del ensayo de 3H-leucina es mayor que la que resulta del ensayo de 3H-timidina), lo que indica utilidad en la práctica de las realizaciones de formas de dosificación de liberación sostenida de la presente invención. Más específicamente, los compuestos 15 inhibieron la capacidad de que las células de músculo liso vascular experimenten síntesis de ADN en presencia de FBS al 5% en un mayor grado del que inhibieron la síntesis de proteínas de las células de músculo liso vascular. Los efectos inhibidores de la síntesis de ADN y proteínas de suramina, estaurosporina, 20 nitroglicerina durante una exposición en pulsos de 5 minutos y 24 horas se muestran en la figura 1 A-C, respectivamente.
EJEMPLO 2
Inhibición de la síntesis de proteínas y ADN in vitro de músculo liso vascular por estaurosporina y citocalasina 25
Se sometió a prueba la capacidad de estaurosporina y citocalasina para inhibir la síntesis de proteínas y ADN in vitro en células de músculo liso vascular. Se realizaron ensayos de citotoxicidad y captación de 3H-leucina y 3H-timidina según los siguientes protocolos. 30
Células cultivadas:
Se obtuvieron células BO54 (células de músculo liso de babuino) de explantes de células de músculo liso de babuino de la aorta. Se expandieron las células en medio DMEM (medio de 35 Eagle modificado por Dulbecco):F-12 (Whittaker Bioproducts, Walkersville, Maryland) con suero bovino fetal al 5% (FBS, Gibco) y suero Plus al 5% (JRH Biologicals) (“medio completo”), y se congeló un lote de siembra de células en nitrógeno líquido para su futuro uso en el pase siete.
Exposición de 5 minutos: ensayo de síntesis de proteínas: 5
Se sembraron células de músculo liso vascular a 40.000-50.000 células/ml y se procesaron tal como se describe en el ejemplo 8, “exposición de 5 minutos; captación de 3H-leucina”. Se dispersaron diluciones logarítmicas de estaurosporina (200 ng/ml, 20 ng/ml, 2 ng/ml, 0,2 ng/ml y 0,02 ng/ml) en medio 10 completo. Para citocalasina B, se dispersaron diluciones logarítmicas a 20 µg/ml, 2,0 µg/ml, 0,2 µg/ml, 0,02 µg/ml y 0,002 µg/ml en medio completo. Entonces se añadió el medio completo a los pocillos control. Se añadió un ml/pocillo de cada dilución de agente terapéutico en pocillos cuadruplicados y se 15 incubó el agente de interés con las células de músculo liso vascular durante 5 min. a temperatura ambiente en una campana ventilada estéril. Tras la incubación con el agente terapéutico, se trataron posteriormente los pocillos tal como se describe en el ejemplo 8, “exposición de 5 minutos; captación de 3H-20 leucina”.
Exposición de 5 minutos; ensayo de síntesis de ADN: Se sembraron células de músculo liso vascular (BO54) y se procesaron en placas de 24 pocillos, tal como se describió anteriormente en “exposición de 5 minutos: ensayo de síntesis de 25 proteínas”. Tras una incubación de 5 min. con el agente terapéutico de prueba, se aspiró el medio y se añadió 1 ml/pocillo de 3H-timidina (en lugar de 3H-leucina) 1,0 µCi/ml dispersada en medio completo. Entonces se incubaron las células durante la noche a 37ºC en un entorno con un 5% de CO2, 30 humidificado. Entonces se determinó el efecto tóxico del agente terapéutico, tal como se describió en el ensayo de síntesis de proteínas, anteriormente.
Exposición de 24 y 120 horas. Ensayo de síntesis de proteínas:
Se sembraron células de músculo liso vascular (BO54) a 35 20.000 células/ml en placas de 24 pocillos estériles y se incubaron en medio completo (1 ml/pocillo) durante la noche a 37ºC, 5% de CO2, 95% de aire en una atmósfera humidificada (saturación). Se dispersaron diluciones logarítmicas de estaurosporina (100 µg/ml, 10 µg/ml, 1 µg/ml, 0,1 µg/ml y 0,01 µg/ml) secuencialmente en los dos medios, tal como se describe a 5 continuación. Para citocalasina B, se dispersaron diluciones logarítmicas a 10 µg/ml, 1,0 µg/ml, 0,1 µg/ml, 0,01 µg/ml y 0,001 µg/ml secuencialmente en los dos medios, tal como se describe a continuación:
Medio (1) = medio completo; y 10
Medio (2) = DMEM (libre de leucina) con 3H-leucina 0,5 µCi/ml. Se usa el medio (2) para el periodo de incubación de 24 horas final del experimento.
Más específicamente, en el ensayo de 24 horas, se diluyó cada agente terapéutico en el medio (2), tal como se indicó 15 anteriormente. Se aspiró el medio (1) de los pocillos y se añadieron alícuotas de diluciones de agente terapéutico en el medio (2) por cuadruplicado a los pocillos apropiados. Entonces se añadió el medio (2) a los pocillos control.
En el ensayo de 120 horas, se diluyó cada agente 20 terapéutico en el medio (1), tal como se indicó anteriormente. Se aspiró el medio (1) de los pocillos y se añadieron alícuotas de diluciones de agente terapéutico en el medio (1) por cuadruplicado a los pocillos apropiados. Entonces se añadió el medio (1) a los pocillos control. Se cambió el medio cada 24 25 horas y se añadió agente terapéutico nuevo a los pocillos de prueba. A las 96 h, (es decir, el cuarto día), se diluyó cada agente terapéutico en el medio (2), tal como se indicó anteriormente. Se aspiró el medio (1) de los pocillos y se añadieron alícuotas de diluciones de agente terapéutico en el 30 medio (2) por cuadruplicado a los pocillos apropiados. Entonces se añadió el medio (2) a los pocillos control.
Se incubaron los agentes de prueba en 3H-leucina (y controles) durante la noche a 37ºC, 5% de CO2 en una atmósfera humidificada. Entonces se determinó el efecto tóxico de los 35 agentes terapéuticos, tal como se describe en la exposición de 5 minutos:
Ensayo de síntesis de proteínas, descrito anteriormente. Además, se fotografiaron los cambios en las células a cada dilución usando un microscopio Zeiss (Zeiss, Alemania 5 Occidental) a 320X. Entonces se aspiró el medio y se trataron las células con TCA, tal como se describió anteriormente.
Exposición de 24 y 120 horas. Ensayo de síntesis de ADN: Se realizó este ensayo según los procedimientos descritos para “exposición de 24 y 120 horas; ensayo de síntesis de 10 proteínas”, excepto porque el medio (2) en este ensayo de síntesis de ADN de 24 y 120 h es:
Medio (2) = medio completo con 3H-timidina 1,0 µCi/ml.
Se usa el medio (2) en la incubación de 24 horas final del experimento. 15
Estos ensayos de síntesis de ADN y proteínas son susceptibles de usarse con otras poblaciones de células diana, especialmente tipos de células en monocapa adherente.
Resultados: Se determinó la dosis eficaz mínima (DEM) de cada agente como porcentaje del control que se trató con sólo el 20 medio; se eligió el 50% de los valores control como el parámetro de comparación de la citotoxicidad. En una exposición de 5 min., la estaurosporina demostró una DEM de 100 ng/ml en el ensayo de síntesis de proteínas y 1 ng/ml en el ensayo de ADN. La DEM de 24 horas para la estaurosporina era de 10 ng/ml en el ensayo de 25 síntesis de proteínas y 1 ng/ml en el ensayo de síntesis de ADN. Ambos ensayos proporcionaron una DEM de 1 ng/ml para una exposición de 120 horas de estaurosporina.
En una exposición de 5 minutos, la citocalasina B demostró una DEM de 10 µg/ml en el ensayo de síntesis de proteínas así 30 como en el ensayo de ADN. La DEM de 24 horas para la citocalasina B era de 1,0 µg/ml en el ensayo de síntesis de proteínas y 0,1 µg/ml en el ensayo de síntesis de ADN. Ambos ensayos proporcionaron una DEM de aproximadamente 0,1 µg/ml para una exposición de 120 horas de estaurosporina. 35
Se sometieron a prueba los agentes terapéuticos citocalasina C y citocalasina D a exposiciones de 24 y 48 horas usando las mismas diluciones tal como se describió para la citocalasina B, anteriormente. A las 24 horas, la citocalasina C demostró una DEM de 1,0 µg/ml en el ensayo de síntesis de 5 proteínas y una DEM de 0,01 µg/ml en el ensayo de síntesis de ADN. A las 48 horas, la citocalasina C demostró una DEM de 0,1 µg/ml en el ensayo de síntesis de proteínas y 0,01 µg/ml en el ensayo de síntesis de ADN. La citocalasina D demostró una DEM de 1,0 µg/ml en el ensayo de síntesis de proteínas de 24 horas y 10 una DEM de 0,1 µg/ml en el ensayo de síntesis de ADN de 24 horas. Una exposición de 48 horas a citocalasina D proporcionó una DEM que oscilaba entre 0,1 y 0,01 µg/ml en los ensayos tanto de síntesis de proteínas como de síntesis de ADN.
15
EJEMPLO 3
Inhibición de la migración de células de músculo liso vascular
Se realizaron ensayos de escarificación para determinar la magnitud de la inhibición de la migración de células de músculo liso por la citocalasina B según el siguiente protocolo: se 20 obtuvieron células de músculo liso vascular (BO54) de explantes de músculo liso de aorta de babuino, tal como se describió en el ejemplo 2. Se hicieron crecer las células en placas de cultivo tisular de seis pocillos de fondo plano, que contenían aproximadamente 5 ml de medio. Se sembraron en placa las células 25 de músculo vascular a 200.000 células/pocillo y se colocaron a 37ºC en un incubador con un 5% de CO2 humidificado durante 18 horas. Entonces se escarificaron los pocillos con una parte estéril de una hoja de afeitar de un solo filo que se sostenía mediante pinzas o tenazas y se puso en contacto asépticamente 30 con la parte inferior del pocillo a un ángulo de 90º. Se extrajeron las células de una pequeña zona a lo largo de la escarificación mediante un aplicador con punta de algodón estéril mientras que la hoja estaba en contacto con la parte inferior del pocillo. 35
Tras la incubación, la presencia de células en la zona “escarificada” es indicativa de migración celular a través de la línea de “escarificación”.
Una incubación control mostró una migración celular significativa y sirve como patrón frente al cual se compara la 5 migración de células expuestas al agente terapéutico.
En resumen, se preparó una disolución madre de citocalasina B (Sigma Chemical Co.) en dimetilsulfóxido (DMSO) a 1 mg/ml. Se añadieron diluciones de prueba de citocalasina B o medio control. Cada experimento incluyó dos conjuntos de placas: 10
conjunto A: Exposición al agente de prueba durante 1, 3, 6, 8 y 10 días solamente; y
conjunto B: Exposición al agente de prueba durante 1, 3, 6, 8 y 10 días, seguido por un tiempo de recuperación de siete días con medio control. 15
Se fijaron (formalina al 10% en PBS) y se tiñeron (cloruro de metilrosanilina al 0,02%) ambos conjuntos de placas al término de los tiempos de exposición. Las concentraciones de prueba para citocalasina B eran 1, 0,1 y 0,01 µg/ml y se incluyó un control de medio negativo. 20
Se suministraron medio nuevo y fármaco 3 veces por semana.
La tabla 1 muestra los resultados de estos experimentos. En esta tabla, “M” indica el grado de migración, en el que = sin migración; +1 = migración mínima; +2 = migración leve; +3 = migración moderada y +4 = migración marcada (densidad máxima; 25 límite de inhibición por contacto celular) de las células de músculo liso vascular hacia el área despejada adyacente a la escarificación. En esta tabla, “T” indica un grado de toxicidad morfológica, en el que - = sin toxicidad; +1 = toxicidad mínima; +2 = toxicidad leve; +3 = toxicidad moderada y +4 = toxicidad 30 marcada.
Se expresan los resultados de la migración como “grado en el área despejada del pocillo / grado en una región no alterada del pocillo”. Los valores de toxicidad representan un grado para todas las células en cada pocillo. 35
Los datos indican que la citocalasina B inhibe la migración (+1 a +2) de las células de músculo liso vascular hacia el área despejada adyacente a la escarificación a una dosis de 0,1 µg/ml con sólo toxicidad morfológica mínima (- a +1). Los datos también muestran que las células tratadas (0,1 µg/ml) recuperan 5 la capacidad de migrar (+3 a +4) tras la eliminación del agente terapéutico, incluso tras 10 días de exposición continua al agente terapéutico.
Tabla 1 10
ENSAYO DE ESCARIFICACIÓN-MIGRACIÓN: INHIBICIÓN DE LA MIGRACIÓN DE CÉLULAS DE MÚSCULO LISO VASCULAR POR CITOCALASINA B
Exposición continua Recuperación de 7 días tras la exposición
Dosificación µg/ml Dosificación µg/ml
Día
Control0,0 0,01 0,1 1,0 Control0,0 0,01 0,1 1,0
1 M
+1/+3 +1/+3 +1/+3 -/+2 +3/+4 +3/+4 +3/+4 +2/+3
T
- - - +3 - - - +2
3 M
+3/+4 +3/+4 +1/+4 -/+2 +3/+4 +3/+4 +3/+4 +2/+3
T
+1 +3 - - - +1
6 M
+3/+4 +3/+4 +2/+4 -/+2 +4/+4 +4/+4 +3/+4 +2/+3
T
- - +1 +4 - - - +3
8 M
+3/+4 +3/+4 +2/+4 -/+2 +4/+4 +4/+4 +3/+4 +2/+3
T
- - +1 +4 - - - +3
10 M
+3/+4 +3/+4 +2/+4 -/+2 +4/+4 +4/+4 +4/+4 -2/+3
T
- - +1 +4 - - - +3
EJEMPLO 4
Efectos citotóxicos de agentes terapéuticos sobre células de músculo liso vascular - exposición continua y en pulsos
Se expusieron células de músculo liso vascular a un agente 15 terapéutico en uno de dos formatos de exposición:
Exposición en pulsos: Se describe el protocolo de exposición en pulsos en el ejemplo 1 anteriormente (véase “Evaluación de la citotoxicidad morfológica – exposición en pulsos”).
Exposición continua: Se usa la misma metodología para la evaluación de la citotoxicidad morfológica con exposición continua que para la exposición en pulsos, excepto porque se expusieron de manera continua los pocillos de prueba a agente terapéutico en medio durante el periodo de exposición. Se 5 aspiraron el medio y el agente terapéutico de cada pocillo diariamente, incluyendo del pocillo control sin tratar, y se reemplazaron por 1 ml de medio nuevo y agente terapéutico (o medio solo para los pocillos control). Se siguió con la reincubación, hasta que se lograron cada uno de los puntos de 10 evaluación de aumentos del protocolo de exposición continua a largo plazo. Estos puntos de tiempo de evaluación de aumentos eran a las 6, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 216 y 264 horas. En el periodo de tiempo designado, se fijaron, se tiñeron y se evaluaron las células apropiadas como en el protocolo de 15 exposición en pulsos. Los resultados de un experimento de exposición continua se muestran en la tabla 2 para suramina, estaurosporina y citocalasina B. Los datos de 5 min. y 24 h presentados en la tabla 2 se correlacionan con los datos contenidos en las figuras 1A, 1B. 20
Tabla 2
ENSAYO DE CITOTOXICIDAD MORFOLÓGICA Fármaco y dosis
Protocolo de exposición
Citocalasina B Suramina Estaurosporina
10 µg 1 µg 0,1 µg 0,01 µg 10 mg 1 mg 0,1 mg 0,01 mg 100 ng 10 ng 1 ng 0,1 ng
5 min. + 2 h
0,5 0 0 - 0 0 0 - 0 0 0 -
5 min. + 6 h
4 1 0 - 1 0 0 - 0 0 0 -
5 min. + 24 h
4 0,5 0 - 1 0 0 - 0 0 0 -
5 min. + 48 h
4 1 0 - 2 0 0 - 2 1 0 -
5 min. + 72 h
4,5 1 0 - 3 1 0 - 3 1,5 0 -
5 min. + 96 h
5 1 0 - 3 1 0 - 3,5 1,5 0 -
5 min. + 120 h
5 1 0 - 3 1 0 - 4 1,5 0 -
6 h continuas
- 3 0 0 3 1 0 - 0 0 0 0
24 h continuas
- 3 1 0 3 2 0 - - 0 0 0
24 h + 24 h
- 3 0,5 0 4 3 0 - - 0,5 0 0
24 h + 48 h
- 4 1 0 4 3 0 - - 2 0 0
24 h + 72 h
- 4 0,5 0 4 3 0,5 - - 1 0 0
24 h + 96 h
- 4 0 0 4 3,5 1 - - 1,5 0 0
24 h + 120 h
- 4 0 0 - - - - - 1,5 0 0
24 h continuas
- 3 0 0 - 1 1 0 - 3 1 0
48 h continuas
- 3 1 0 - 3 2 0 - 3 2 0
72 h continuas
- 3 1 0 - 4 3 0 - 3 2 0
96 h continuas
- 3 2 0 - 4 3 0 - 3 2 1
120 h continuas
- 3 1 0 - 5 4 0 - 3 2 1
168 h continuas
- 4 1 0 - 5 4 0 - 3 2 1
216 h continuas
- 4 1 0 - 5 4 0 - 3 2 1
264 h continuas
- 4 1 0 - 5 4 0 - 4 2 1
A una dosificación eficaz in vitro, la citocalasina B (1 µg/ml; una dosis eficaz de antimigración/contracción) y la estaurosporina (1 ng/ml; una dosis eficaz antiproliferativa) presentaron un grado de citotoxicidad de 1 (mínimo) y 2 (leve), 5 respectivamente.
Estudios independientes han indicado que se prefiere un grado de 3 (moderado) o menor para un agente antiproliferativo, citostático de la presente invención.
EJEMPLO 5
Ensayo con BRDU in vivo: Inhibición de la proliferación de células de músculo liso vascular
Ensayo con BRDU: Se cuantificó la proliferación de células 5 de músculo liso vascular in vivo midiendo la incorporación del análogo de base 5-bromo-2’-desoxiuridina (BRDU, disponible de Sigma Chemical Co.) en el ADN durante la proliferación y síntesis de ADN celular.
Se demostró histoquímicamente la incorporación de BRDU 10 usando anticuerpos monoclonales anti-BRDU disponibles comercialmente. El marcaje en pulsos de 1 hora permite la evaluación del número de células que experimentan división durante el periodo de pulsos.
Se usa el protocolo de marcaje en pulsos con BRDU descrito 15 anteriormente como técnica de evaluación patrón con estudios vasculares en cerdos in vivo. Tras los procedimientos quirúrgicos y de tratamiento (tratados, por ejemplo, en el ejemplo 3 en el presente documento) y un periodo de recuperación posquirúrgico, se sedaron los cerdos y se pulsaron con BRDU 1 20 hora antes de la recogida del tejido.
En resumen, se sedaron los cerdos con clorhidrato de tiletamina y xilazina mediante inyección intramuscular.
Entonces se administró BRDU por vía intravenosa a través de la vena auricular lateral. Se administraron dos ml de BRDU a una 25 concentración de 50 mg/ml a cada cerdo de 30-40 lb. Una hora después, se sacrificaron los cerdos mediante pentobarbital administrado por vía intravenosa.
Entonces se extrajeron segmentos de arteria de prueba (un segmento incluía un vaso normal ubicado proximalmente y, si era 30 posible, distalmente con respecto al segmento de arteria tratado). Se transeccionaron los segmentos de arteria a intervalos de 2 mm; se dispusieron en orden en criomoldes con el compuesto O.C.T. (temperatura de corte óptima) (Tissue Ten®, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, IN); y se congelaron en 35 nitrógeno líquido. Se cortaron los bloques a 5 micrómetros y se tiñeron inmunohistológicamente para detectar BRDU usando el siguiente procedimiento.
Detección de células marcadas con BRDU: Tras el marcaje en pulsos con BRDU (1 g de BRDU diluido en 17 ml de agua estéril y 3 ml de NaOH 1 N) y la extracción y el corte del segmento de 5 arteria de prueba (tal como anteriormente), la tinción inmunohistoquímica con el anticuerpo monoclonal anti-BRDU proporciona un medio visual de determinación de un índice mitótico a lo largo de un periodo de tiempo especificado. Se realizó el método de tinción inmunohistoquímica tal como sigue: 10
1) se deshidrataron secciones de 5 µm de la arteria de prueba en acetona fría (-20ºC) durante 10 minutos;
2) se montaron las secciones sobre portaobjetos de vidrio para microscopio y se secaron los portaobjetos en un horno a 37ºC durante 10 minutos; 15
3) se rehidrataron los portaobjetos en PBS durante 10 minutos;
4) se sometieron los portaobjetos a hidrólisis ácida de Feulgen usando HCl 1 N, en la que se calientan previamente dos alícuotas de HCl 1 N a 37ºC y 60ºC antes de seguir; 20
5) se enjuagaron los portaobjetos con 1 ml de HCl 1 N a 37ºC durante 1 min.;
6) se transfirieron los portaobjetos a HCl 1 N a 60ºC durante 15 min.;
7) se enjuagaron los portaobjetos con 1 ml de HCl 1 N a 37ºC 25 durante 1 min.;
8) se lavaron los portaobjetos con PBS a temperatura ambiente, usando 3 cambios de PBS a intervalos de 5 min.;
9) se bloquearon los sitios de reacción cruzada, endógenos en las secciones con suero de cabra normal (1:25 en PBS) 30 durante 20 min.;
10) se lavaron los portaobjetos con PBS, como en la etapa 8;
11) se incubaron las secciones con anticuerpo anti-BRDU de ratón (DAKO Corporation, Carpinteria, CA) a 10 µg/ml durante 30 min.; 35
12) se lavaron los portaobjetos con PBS, como en la etapa 8;
13) se incubaron las secciones con anticuerpo anti-IgG1 de ratón de cabra marcado con peroxidasa del rábano (HRPO) (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA; diluido 1:20 en PBS) y suero AB humano al 4% durante 30 min.; 5
14) se lavaron los portaobjetos con PBS, como en la etapa 8;
15) se incubaron las secciones con cromógeno (3,3’-diaminobencidina (DAB; Sigma) a 5 mg/ml en 200 ml de PBS) y 200 µl de H2O2 al 30% durante 10 min.;
16) se lavaron los portaobjetos con PBS, como en la etapa 8; 10
17) se contratiñeron las muestras con hematoxilina de Gill I (Gill I Lerner Laboratories, Pittsburgh, PA; 30 inmersiones);
18) se lavaron los portaobjetos con PBS, como en la etapa 8; se enjuagaron con una disolución azulada (1 g de carbonato 15 de litio en 500 ml de dH2O); se lavaron con agua desionizada; y
19) entonces se deshidrataron las muestras de prueba, se limpiaron y se cubrieron con cubreobjetos.
Al término de este procedimiento, una tinción 20 inmunohistológica positiva presenta un color marrón en el/los sitio(s) de reactividad.
Los agentes citocidas inhibieron la captación de BRDU en relación a un control con PBS; sin embargo, la citocalasina B y la estaurosporina inhibieron la captación de BRDU (es decir, 25 proliferación celular) sin destruir las células de músculo liso vascular. Se asignó un grado al número de células de músculo liso vascular marcadas con BRDU a 400X aumentos tal como sigue:
1 = ≤ 1/campo de gran aumento (HPF);
2 = de 2 a 5/HPF; 30
3 = de > 5 a ≤10/HPF;
y
4 = > 10/HPF.
Tanto la citocalasina B como la estaurosporina inhibieron la proliferación durante 24 horas tras el traumatismo por balón 35 (grado 1), produciendo un grado de marcaje con BRDU equivalente al de un nivel inicial antes del traumatismo (grado 1). Los controles con anticuerpo monoclonal y PBS presentaron un marcaje con BRDU de grado 2,5 a 4 durante el mismo periodo de tiempo. A los 4 días tras el traumatismo, las arterias tratadas con citocalasina B o estaurosporina, así como los controles con 5 anticuerpo monoclonal y PBS, presentaron un grado de marcaje con BRDU de 4. Las propiedades no citocidas, antiproliferativas de citocalasina B y estaurosporina sugieren que estos agentes son susceptibles de formulaciones de dosificación de liberación sostenida para la reducción de la estenosis vascular. 10
EJEMPLO 6
Implantación de endoprótesis biológica de arterias de cerdo traumatizadas por balón usando citocalasina B
Las arterias de cerdo traumatizadas por balón que se habían 15 tratado con citocalasina B presentaron un área luminal mayor en los puntos de tiempo tras el tratamiento de 4 días y 3 semanas, en comparación con las arterias tratadas con otros agentes de prueba o controles. Se evaluaron histológicamente diez arterias femorales (dos arterias obtenidas de cada uno de los 5 cerdos 20 que se trataron según un protocolo de una sola dosis). Se midió el área luminal máxima de cada arteria y se calculó a partir de imágenes microscópicas digitalizadas mediante un sistema de análisis morfométrico informatizado BQ System IV (R & M Biometrics, Inc., Nashville, TN). Se repitió este experimento 25 con 5 cerdos adicionales (dos arterias por cerdo; dosis de citocalasina B = 0,1 µg/ml, aplicada durante 3 min. a una presión de 1 atm; puntos de tiempo iguales). Se combinaron los datos obtenidos a partir de los dos experimentos. Se observó un aumento del área de la luz en el punto de tiempo tras el 30 tratamiento con citocalasina B de 3 semanas.
También se compararon el área luminal de los segmentos traumatizados y tratados con citocalasina B de las arterias con el área luminal de la región sin tratar normal de la arteria femoral próximal al área de prueba. Los resultados mostraron que 35 el área de la luz en la región de prueba era aproximadamente dos veces tan grande como el área del segmento control normal de la misma arteria. Los agentes de control negativo, PBS y anticuerpo monoclonal NR-AN-01, no mostraron ningún aumento ni ninguna disminución leve en el área de la luz en comparación con el segmento control normal de la misma arteria. 5
Entonces se llevó a cabo un estudio de dosis-respuesta de citocalasina B en 10 cerdos, siguiendo el protocolo experimental descrito en el ejemplo 7. En resumen, se trataron ambas arterias en cada uno de los 2 cerdos con una de las siguientes dosis de citocalasina B: 0,0 µg/ml (es decir, control negativo con PBS); 10 0,01 µg/ml; 0,10 µg/ml; 1,0 µg/ml; y 10,0 µg/ml. Se administró el agente mediante un catéter intraluminal a una presión de 1 atm durante 3 min., y se evaluaron las arterias 3 semanas después mediante el sistema de análisis morfométrico descrito anteriormente. Se determinó la razón de área luminal de arteria 15 tratada con respecto a área luminal de arteria normal próximal como porcentaje de cambio en el área tratada frente a normal. Se observó un efecto umbral significativo a dosis de desde 0,1 µg/ml (aumento de ≈140%) hasta 1,0 µg/ml (figura 2). La dosis de 10 µg/ml parecía ser tóxica para las células de músculo liso 20 vascular (datos no mostrados). La dosis subumbral (0,01 µg/ml) y el control negativo (PBS) presentaron un cambio de ± ≈20% en el área luminal. Estos datos sugieren que la citocalasina B actúa como “endoprótesis biológica” cuando se administra a arterias traumatizadas. 25
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Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Uso de un agente terapéutico citostático para la preparación de una forma de dosificación de liberación sostenida para
    (a) mantener un área luminal de vaso expandida, o
    (b) reducir la estenosis o reestenosis, 5
    en el que el agente se selecciona de citocalasinas.
  2. 2. Uso según la reivindicación 1, en el que la forma de dosificación es o bien microparticulas o nanoparticulas no degradables o bien microparticulas o nanoparticulas biodegradables. 10
  3. 3. Uso según la reivindicación 2, en el que las micropartículas o nanopartículas están formadas por una matriz que contiene polímero que se biodegrada mediante escisión hidrolítica, no enzimática, aleatoria.
  4. 4. Uso según la reivindicación 3, en el que la estructura de 15 matriz que contiene polímero está formada por una mezcla de poliésteres termoplásticos o un copolímero de componentes de lactida y glicolida.
  5. 5. Uso según la reivindicación 1, en el que el agente terapéutico inhibe la actividad de células de músculo liso 20 vascular sin destruir las células.
  6. 6. Uso según la reivindicación 5, en el que el agente terapéutico inhibe la síntesis de ADN antes de la síntesis de proteínas.
  7. 7. Uso según la reivindicación 1, en el que el agente 25 terapéutico está en una concentración en la que ejerce una citotoxicidad e inhibición de la síntesis de proteínas mínima y una inhibición significativa del ADN.
  8. 8. Uso de taxol para la preparación de un medicamento para mantener un área luminal de vaso expandida. 30
  9. 9. Uso de taxol según la reivindicación 8, en el que el área luminal de vaso expandida se mantiene inhibiendo un aumento del volumen celular de las células de músculo liso vascular.
  10. 10. Uso de taxol según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que el medicamento debe administrarse a lo largo de un periodo de tiempo sostenido.
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