DE69233696T2 - Therapeutische Konjugate die die vaskuläre glatten Muskelzellen inhibitieren - Google Patents

Therapeutische Konjugate die die vaskuläre glatten Muskelzellen inhibitieren Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf therapeutische Verfahren, die eine chirurgische oder intravenöse Einführung von Bindungspartnern umfassen, welche auf bestimmte Zielzellpopulationen gerichtet sind, wie Proteine glatter Muskelzellen, Krebszellen und Effektorzellen des Immunsystems, insbesondere zur Behandlung von Zuständen wie Stenose in Folge von Gefäßtrauma oder -Erkrankung, Krebs und Erkrankungen, die durch Immunsystemeffektorzellen vermittelt werden
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die veröffentlichte Patentanmeldung US-A 4 867 973 bezieht sich auf Konjugate aus Antikörper-therapeutischem Mittel, die kovalent an einen Antikörper oder ein Antikörperfragment gebunden sind. Als potentielle Ziele der Antikörper offenbart die US-A 4 867 973 antigene Determinanten von Tumorzellen, Viren, Bakterien oder Parasiten (siehe Sp. 13, 2. Absatz) oder Mycoplasma-, Histokompatibilitäts-, Differentierungs- und Zellmembranantigene (s. Sp. 15, 1. Abs.).
  • Perkutane transluminale Koronarangioplastie (PTCA) wird in breitem Maße als primäre Behandlungsmodalität bei vielen Patienten mit Koronararterienerkrankung verwendet. PCTA kann Myocardischämie in Patienten mit Koronararterienerkrankung durch Verminderung der Lumenobstruktion und Verbessern des Koronarflusses lindern. Die Verwendung dieses chirurgischen Verfahrens ist schnell angestiegen, mit 39.000 Verfahren die 1983 durchgeführt wurden, nahezu 150.000 1987, 200.000 1988, 250.000 1989, und über 500.000 PTCAs pro Jahr werden für 1994 geschätzt (1,2,3). Stenose in der Folge von PTCA bleibt ein signifikantes Problem, wobei 25% bis 35% der Patienten innerhalb der Monate 1 bis 3 eine Restenose entwickeln. Restenose führt zu einer signigikanten Morbidität und Mortalität und macht häufig weitere Eingriffe wie eine wiederholte Angioplastie oder eine Herzbypass-Operation notwendig. Kein chirurgischer Eingriff bzw. keine postchirurgische Behandlung hat sich (bis dato) als wirksam in der Verhinderung von Restenose erwiesen.
  • Die Prozesse, die nach PTCA für Stenose verantwortlich sind, sind nicht vollständig verstanden, können aber aus einem komplexen Wechselspiel mehrerer unterschiedlicher biologischer Mittel und Stoffwechselwege herrühren. In histologischen Schnitten betrachtet könnten restenotische Läsionen ein Überwachstum glatter Muskelzellen in den inneren Lagen der Gefäße aufweisen (3). Mehrere mögliche Mechanismen für Zellproliferation glatter Muskelzellen nach PTCA wurden vorgeschlagen (1, 2, 4, 5).
  • Verbindungen, von denen berichtet wurde, dass sie in vitro die Proliferation glatter Muskelzellen supprimieren, können unerwünschte pharmakologische Nebenwirkungen aufweisen, wenn sie in vivo verwendet werden. Heparin ist ein Beispiel für eine solche Verbindung, von der berichtet wird, dass sie die Proliferation glatter Muskelzellen in vitro hemmt, die aber, wenn sie in vitro verwendet wird, das Potential der nachteiligen Nebenwirkung aufweist, dass die Gerinnung bzw. Koagulation hemmt wird. Heparinpeptide haben, während sie eine verminderte Antikoagulans-Wirkung aufweisen, die unerwünschte pharmakologische Eigenschaft, eine kurze pharmakologische Halbwertzeit zu besitzen. Es wurden Versuche unternommen, solche Probleme zu lösen, indem ein Doppelballon-Katheter verwendet wird, d.h. für die regionale Verabreichung des therapeutischen Mittels am Ort der Angioplastie (z.B. 8; US-Patent Nr. 4,824,436 ), und indem bioabbaubare Materialien verwendet wurden, die mit einem Arzneimittel beschichtet sind, d.h. um Probleme einer kurzen Halbwertszeit zu kompensieren (z.B. 9; US-Patent Nr. 4,929,602 ).
  • Verrucarine und Roridine sind Trichothecen-Arzneimittel, die als sekundäre Metaboliten von den Bodenpilzen Myrothecium verriucaria und Myrothecium roridium hergestellt werden. Verrucarin ist ein makrocyclischer Triester. Roridin ist ein makrocyclischer Diester von Verrucarol (10). Als Gruppe sind die Trichothecene strukturell verwandt mit Sesquiterpen01d-Mykotoxinen, die von mehreren Arten von Pilzen hergestellt werden und durch die 12,13-Epoxytrichothec-9-en-Grundstruktur gekennzeichnet sind. Ihre zytotoxische Aktivität für eukaryontische Zellen hängt mit ihrer Fähigkeit, an die Zelle zu binden, internalisiert zu werden, und Protein- und Makromolekülsynthese in der Zelle zu hemmen, eng zusammen.
  • Mindestens fünf Erwägungen würden, offensichtlich, den Anschein haben, die Verwendung von hemmenden Arzneimitteln zur Verhinderung von Stenose, die aus Überwachstum von glatten Muskelzellen resultiert, ausschließen. Erstens können hemmende Mittel eine systemische Toxizität aufweisen, die ein nicht annehmbares Maß an Risiko für Patienten und bei cardiovaskulären Erkrankungen erzeugen würde. Zweitens könnten inhibitorische Mittel die vaskuläre Wundheilung in Folge des chirurgischen Eingriffs stören und das könnte entweder die Heilung verzögern oder die Struktur oder die Elastizität der neu geheilten Gefäßwand schwächen. Drittens könnten hemmende Mittel, die glatte Muskelzellen töten, das umgebende Endothel und/oder andere mittlere glatte Muskelzellen beschädigen. Tote und sterbende Zellen schütten auch mitogene Mittel aus, die zusätzliche Proliferation glatter Muskelzellen stimulieren und Stenose verschlimmern könnten. Viertens kann von verschiedenen Standpunkten aus die Verabreichung therapeutisch wirksamer Spiegel an hemmenden Mitteln problematisch sein: nämlich a) die Verabreichung einer großen Anzahl von Molekülen in die Interzellularräume zwischen glatten Muskelzellen kann notwendig sein, d.h. um günstige Bedingungen herzustellen, um es einer therapeutisch wirksamen Dosis von Molekülen zu ermöglichen, die Zellmembran zu überschreiten; b) es kann schwierig sein, die Zielrichtung bzw. Gerichtetheit eines hemmenden Arzneimittels in das geeignete intrazelluläre Komparitiment, d.h. in dem die Wirkung ausgeübt wird, zu kontrollieren; und c) die Optimierung die Anlagerung bzw. Bindung des hemmenden Arzneimittels an das intrazelluläre Ziel, z.B. ein Ribosom, bei gleichzeitiger Minimierung intrazellulärer Redistribution des Arzneimittels, z.B. an benachbarte Zellen, kann schwierig sein. Fünftens scheint es a priori auf, dass das hemmende Arzneimittel auch über mehrere Wochen verabreicht werden sollte, vielleicht fortwährend, und eine vorteilige Wirkung zu zeitigen, weil die Proliferation glatter Muskelzellen über mehrere Wochen stattfindet.
  • Es ist aus dem Vorstehenden offensichtlich, dass viele Probleme zu lösen bleiben bei der Verwendung hemmender Arzneimittel, einschließlich zytotoxischer Mittel, um Proliferation glatter Muskelzellen effektiv zu behandeln. Es wäre sehr vorteilhaft, neue Verfahren zur Verhinderung von Stenose aufgrund von Proliferation von glatten Muskelzellen in der Folge von traumatischen Verletzungen an Gefäßen, wie sie während chirurgischen Eingriffen an Gefäßen auftreten, zu entwickeln. Zusätzlich wäre die Verabreichung von Verbindungen, die hemmende Wirkungen von längerer Dauer auf die vakulären glatten Muskelzellen ausüben, vorteilhaft. Die lokale Verabreichung von derartigen Retard-Verbindungen (Verbindungen mit verzögerter Ausschüttung bzw.
  • Freisetzung) wäre auch nützlich bei der Behandlung von anderen Zuständen, bei denen die Zielzellpopulation einer solchen Verabreichung zugänglich ist.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung bezieht sich auf ein Therapeutisches Konjugat umfassend ein bindendes Protein oder Peptid, verbunden mit einem therapeutischen Mittel, wobei das bindende Protein oder Peptid spezifisch an Zellmembranen entweder glatter Gefäßmuskelzellen oder Perizyten bindet, oder an die interstitielle Matrix der Arterienwand bindet, und wobei das therapeutische Mittel den zellulären Metabolismus verändert oder eine zelluläre Aktivität der glatten Gefäßmuskelzellen oder Perizyten hemmt.
  • Die Erfindung bezieht sich zudem auf eine Verwendung des therapeutischen Konjugats für die Herstellung einer therapeutisch wirksamen Dosis eines Medikaments für die Verminderung von Stenose nach Angioplastie.
  • Gemäß eines Aspekts der Erfindung werden neue therapeutische Verfahren und therapeutische Konjugate offenbart zur Hemmung von vaskulären glatten Muskelzellen in einem Säugerwirt. Die therapeutischen Konjugate enthalten eine Bindeprotein oder -peptid für vaskuläre glatte Muskelzellen oder ein Bindeprotein/-peptid für die interstitielle Matrix, welches auf spezifische Weise an interstitielle Matrix (z.B. Kollagen) der Arterienwand bindet, verbunden mit einen therapeutischen Mittel, das die Aktivität der Zelle hemmt. In einer Ausführungsform führt eine Hemmung bzw. Inhibierung zellulärer Aktivität zur Verminderung, Verzögerung, oder zum Ausmerzen von Stenose nach Angioplastie oder anderen gefäßchirurgischen Verfahren. Die erfindungsgemäßen therapeutischen Konjugate erzielen diese vorteilhaften Wirkungen, indem sie an vaskuläre glatte Muskelzellen und Perizyten, die sich in glatte Muskelzellen umwandeln könnten, binden. Die therapeutischen Konjugate können therapeutische Mittel enthalten, die den zellulären Metabolismus verändern, oder Inhibitoren von Proteinsynthese, zellulärer Proliferation, oder Zellmigration sind, oder Mikrotubuli- und Mikrofilamentinhibitoren, die die Morphologie beeinflussen, Zellvolumen erhöhen, und/oder Inhibitoren der Synthese oder Sekretion extrazellulärer Matrix. In einer repräsentativen Ausführungsform umfassen die Konjugate ein zytotoxisches therapeutisches Mittel, das ein Sesquiterpen-Mykotoxin ist, wie ein Verrrucarin oder ein Roridin. Andere Ausführungsformen umfassen zytostatische therapeutische Mittel, die DNA-Synthese und Proliferation hemmen, und zwar bei Dosen, die eine minimale Wirkung auf Proteinsynthese haben, wie Proteinkinase-Inhibitoren (z.B. Staurosporin), Suramin, und Stickoxid-freisetzende Verbindungen (z.B. Nitroglycerin) oder Analoga oder funktionelle Äquivalente davon. Andere Aspekte der Erfindung beziehen sich auf Proteine, die vaskuläre glatte Muskelzellen binden, die spezifisch an ein Chondr01tinsulfatproteoglukan (CSPG) binden, das auf den Membranen von vaskulären glatten Muskelzellen exprimiert werden, und in einer bevorzugten Ausführungsform weist dieses CSPG ein Molekulargewicht von etwa 250 kD auf. In bevorzugten Ausführungsformen bindet das Bindeprotein für vaskuläre glatte Muskelzellen an ein CSPG-Ziel auf der Zelloberfläche mit einer Bindungskonstante von mindestens 10-4M. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthält das Bindeprotein für glatte Muskulatur eine Sequenz von Aminosäuren, die in den Fab-, Fv-, oder CDR ("complementary determining regions")- Regionen des monoklonalen Antikörpers NR-AN-01 oder dessen Funktionellen Äquivalenten zu finden ist.
  • Andere Aspekte der Erfindung umfassen Verfahren zur Verhinderung der Stenose, z.B. nach Angioplastie bei einem Säugerwirt, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosierung eines erfindungsgemäßen therapeutischen Konjugats an einen menschlichen oder tierischen Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf. In einer repräsentativen Ausführungsform kann die Dosierung eines therapeutischen Konjugats mit einem Infusionscatheter verabreicht werden, um eine Konzentration von 10-3M bis 10-12M von besagtem therapeutischen Konjugat an der Stelle der Verabreichung zu erreichen.
  • Die vorliegende Erfindung schlägt außerdem therapeutische Verfahren und therapeutische Dosierungsformen vor, die eine verzögerte Ausschüttung von therapeutischem Mittel in einem Blutgefäß umfassen. Bevorzugt sind die Zielzellen vaskuläre (d.h. Gefäß-) glatte Muskelzellen, Krebszellen, und Zellen, die in Krankheiten involviert sind, die vom Immunsystem vermittelt werden, die durch lokale Verabreichung der Dosierungsform zugänglich sind. Dementsprechend sind die Verfahren und Dosierungsformen dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung nützlich für die Hemmung, d.h. Inhibierung, von vaskulären glatten Muskelzellen in einem Säugerwirt, unter Verwendung eines therapeutischen Mittels, das die Aktivität der Zelle inhibiert, aber die Zelle nicht tötet, und eines Bindeproteins für vaskuläre glatte Muskulatur. Die Verfahren und Dosierungsformen dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung sind auch nützlich für das Hemmen der Zielzellproliferation oder das Töten von solchen Zielzellen, unter Verwendung eines therapeutischen Mittels, das Proliferation hemmt oder cytotoxisch für die Zielzellen ist, und eines Tumorzell-Bindproteins. Zusätzlich sind die Verfahren und Dosierungsformen dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung nützlich für die Verabreichung von zytostatischen, cytotoxischen oder den Metabolismus modulierenden therapeutischen Mitteln an Zielzellen wie Effektorzellen des Immunsystems, die mittels lokaler Verabreichung der Dosierungsform zugänglich sind, unter Verwendung eines Zielzellbindeproteins. Letzlich sind Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung nützlich, um eine pathologische Proliferation von normalem Gewebe zu vermindern oder auszumerzen.
  • Die Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt entweder nichtabbaubare Mikropartikulate oder Nanopartikulate oder bioabbaubare Mikropartikulate oder Nanopartikulate. Bevorzugter sind die Mikropartikel oder Nanopartikel aus einem Polymer gebildet, das eine Matrix enthält, die durch Zufall/Zerfall, nicht-enzymatisch, hydrolytische Spaltung sich abbauen. Solch eine bevorzugte Struktur ist aus einem Gemisch thermoplastischer Polyester (z.B. Polymilchsäure- oder Polyglycon-) gebildet, oder einem Copolymer von Milch- und Glyconsäure, welche beide normale Abbauprodukte von Säugetieren sind.
  • Bevorzugte therapeutische Mittel, die innerhalb der Mikropartiukulate oder Nanopartikulate verteilt bzw. dispergiert sind, sind jene, die eine Hemmung einer therapeutisch signifikanten Zielzellaktivität aufzeigen, ohne die Zielzelle zu töten oder Zielzell-Tötungsaktivität. Zur Behandlung von Restenose vaskulärer glatter Muskelzellen hemmen nützliche therapeutische Mittel Zielzellaktivität (z.B. Proliferation oder Migration) ohne die Zielzellen zu töten. Bevorzugte therapeutische Gruppierungen für diesen Zweck sind Proteinkinaseinhibitoren (z.B. Staurosporin), Suramin, und Stickoxid-freisetzende Verbindungen wie Nitroglycerin, oder Analoga oder funktionelle Äquivalente davon. Bei der Krebstherapie hemmen nützliche therapeutische Mittel die Proliferation oder sie sind für die Zielzellen zytotoxisch. Bevorzugte therapeutische Gruppierungen für diesen Zweck sind Roridin A und Pseudomonas-Exotoxin, oder Analoga oder funktionelle Äquivalente davon. Zur Behandlung von Immunsystem-modulierten Erkrankungen wie Arthritis liefern nützliche therapeutische Mittel zytostatische, zytotoxische oder den Metabolismus modulierende Mittel an Zielzellen, die durch lokale Verabreichung der Dosierungsform zugänglich sind. Bevorzugte therapeutische Gruppierungen für diesen Zweck sind Roridin A, Pseudomonas-Exotoxin, Suramin und Proteinkinaseinhibitoren (z.B. Staurosporin), oder Analoga oder funktionelle Äquivalente davon. Zur Behandlung von pathologisch proliferierenden normalen Geweben sind anti-proliferative Mittel bevorzugt.
  • Die erfindungsgemäßen Dosierungsformen sind zielgerichtet auf eine relevante Zielzellpopulation ausgerichtet, und zwar mittels eines Bindungsproteins bzw. Bindeproteins oder – peptids. Bevorzugte Bindeproteine/-peptide der vorliegenden Erfindung sind Bindeproteine für vakuläre glatte Muskelzellen, Tumorzellbindeprotein und Immunsystem-Effektorzell-Bindeprotein. Bevorzugte Bindeproteine für vaskuläre glatte Muskelzellen binden spezifisch an ein Chondr01tinsulfatproteoglycan (CSPG), das auf den Membranen einer vaskulären glatten Muskelzelle exprimiert wird, und in einer bevorzugten Ausführungsform weist dieses CSPG ein Molekulargewicht von etwa 250 kD auf. In bevorzugten Ausführungsformen bindet das Bindeprotein für vaskuläre glatte Muskulatur an ein CSPG-Ziel auf der Zelloberfläche mit einer Bindungskonstante von mindestens 10-4M. In anderen bevorzugten Ausführungsformen enthält das Bindeprotein für vaskuläre glatte Muskulatur eine Sequenz von Aminosäuren, die man in den Fac, Fv oder CDR ("complementary determining regions") von dem monoklonalen Antikörper NR-AN-01 oder dessen funktionalen Äquivalenten findet. Andere bevorzugte Bindepeptide, die in dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen jene, die im interzellulären Stroms und Matrix zwischen und unter vaskulären glatten Muskelzellen lokalisiert sind. Bevorzugte Bindepeptide dieser Art sind spezifisch mit Collagen, Retikulumfasern oder anderen Verbindungen der interzellulären Matrix assoziiert. Bevorzugte Tumorzellbindeproteine sind mit Oberflächenmarkern assoziiert, die von der Zieltumorzellpopulation exprimiert werden, oder dessen zytoplasmatische Epitope. Bevorzugte Bindeproteine für immunsystem-modulierte Zielzellen sind mit Zelloberflächenmarkern der Ziel-Immunsystem-Effektorzellen oder deren cytoplasmatischen Epitopen assoziiert. Bindungspeptide/-proteine der vorliegenden Erfindung sind auch zielgerichtet auf pathologische proliferierende normale Gewebe ausgerichet.
  • Beschreibung der Zeichnungen
  • 1A, B zeigen eine mikroskopische Aufnahme der vaskulären glatten Muskelzellen in einer Arterie eines 24-jährigen männlichen Patienten mit einem Bindeprotein für vaskuläre glatte Muskulatur, das an die Zelloberfläche und Membran gebunden ist. Der Patient erhielt das Bindeprotein für vaskuläre glatte Muskulatur durch i.v.-Verabreichung 4 Tage bevor das Arteriengewebe für die Histologie präpariert wurde.
  • 2 stellt ein erstes Schema für chemische Kopplung eines therapeutischen Mittels an ein Bindeprotein für vaskuläre glatte Muskulatur dar.
  • 3 stellt ein zweites Schema für chemische Kopplung eines therapeutischen Mittels an ein Bindeprotein für vaskuläre glatte Muskulatur dar.
  • 4A stellt experimentelle Daten grafisch dar, die eine schnelle Bindung von Bindeprotein für vaskulären glatten Muskel an Marker-positive Testzellen in vitro zeigen.
  • 4B stellt experimentelle Daten grafisch dar, die eine schnelle Bindung von Bindeprotein für vaskuläre glatte Muskulatur an vaskuläre glatte Muskelzellen in vitro zeigen.
  • 5A stellt grafisch experimentelle Daten dar, die unerwünschte Zytotoxizität von sogar geringen Spiegeln therapeutischer Konjugate (d.h. RA-NR-AN-01) zeigen, und das freie RA therapeutische Mittel, wenn vaskuläre glatte Muskelzellen für 24 Std. in vitro behandelt wurden.
  • 5B stellt grafisch experimentelle Daten dar, die die Wirkung von RA-NR-AN-01 therapeutischem Konjugat auf die metabolische Aktivität von Marker-positiven und Marker-negativen Zellen zeigen. Die Daten zeigen unerwünschte nichtspezifische Zytotoxizität des Konjugats für alle diese Zellen bei einer 24-Stunden-Behandlung in vitro. Die nicht-spezifischen Ergebnisse sind das Ergebnis von extrazellulärer Hydrolyse des Kopplungsliganden, welche die getesteten Zellen dem freien Arzneimittel aussetzt.
  • 6A stellt grafisch experimentelle Daten dar, die eine unerwünschte nichtspezifische Zytotoxizität von PE-NR-AN-01 therapeutischem Konjugat für Markerpositive und Marker-negative Testzellen nach 24-Stunden-Behandlung in vitro zeigen, obwohl die 24-Stunden-Behandlung einer Erholungsphase über Nacht vor dem Testen der metabolischen Aktivität folgte.
  • 6B stellt experimentelle Daten dar, die nichtspezifische Zytotoxizität des freien PE therapeutischen Mittels auf Marker-positive wie Marker-negative Zellen nach 24 Stunden Behanlung in vitro zeigt.
  • 7A stellt grafisch experimentelle Daten dar, die zeigen, dass eine kurze fünfminütige "Puls"-Behandlung, d.h. anstelle von 24 Stunden, gefolgt von Aussetzen gegenüber [3H]-Leucin, mit freiem RA therapeutischen Mittel, nichtspezifisch cytotoxisch ist, d.h. für Marker-negative HT29-Kontrollzellen, dass aber im Gegensatz dazu das RA-NR-AN-01 therapeutische Konjugat in dieser Pulsbehandlung nicht zytotoxisch ist.
  • 7B stellt grafisch experimentelle Daten dar, die zeigen, dass freies RA therapeutisches Mittel nichtspezifisch zytotoxisch für Marker-negative HT29-Kontrollzellen ist, sogar in einer 5'-Pulsbehandlung gefolgt von einer 24-stündigen Erholungsphase vor Aussetzen gegenüber [3H]-Leucin, dass aber im Gegensatz dazu das RA-NR-AN-01 therapeutische Konjugat für die Zellen in dieser Pulsbehandlung nicht zytotoxisch ist.
  • 7C stellt grafisch Ergebnisse von Experimenten dar, die zeigen, dass eine Pulsbehandlung von Zellen in vitro mit dem RA-NR-AN-01 therapeutischen Konjugat die zelluläre Aktivität in Marker-positiven A375-Zellen, gemessen an der Proteinsynthese, hemmt.
  • 7D zeigt grafisch experimentelle Daten, die zeigen, dass die Pulsbehandlung von Zellen in vitro mit dem RA-NR-AN-01 therapeutischen Konjugat keine langanhaltenden inhibitorischen Wirkungen auf die zelluläre Aktivität von Marker-positiven Zellen zeigte, da die Proteinsynthese in A375-Zellen nicht inhibiert war, wenn den Zellen eine Erholungsphase über Nacht vor dem Testen in vitro zugestanden wurde.
  • 8A zeigt grafisch experimentelle Daten, die zeigen, dass das therapeutische RA-NR-AN-01 Konjugat keine langanhaltenden inhibitorischen Wirkungen auf die zelluläre Aktivität in vaskulären glatten Muskelzellen zeitigte, während eine Pulsbehandlung von Zellen in vitro mit freiem therapeutischen RA-Mittel nichtspezifisch zytotoxisch war, was mittels metabolischer Aktivität in BO54-Zellen nachgewiesen wurde, denen eine 48-stündige Erholungsphase vor dem Testen zugestanden wurde.
  • 8B stellt grafisch experimentelle Daten dar, ähnlich zu jenen, die in 8A oben gezeigt sind, jedoch unter Verwendung eines zweiten Marker-positiven Zelltyps, nämlich A375; die Daten zeigen, dass eine Pulsbehandlung mit dem therapetischen RA-NR-AN-01 Konjugat keine langanhaltenden inhibitorischen Wirkungen auf die zelluläre Aktivität zeitigten, gemessen mittels der metabolischen Aktivität in A375-Zellen, denen eine 48-stündige Erholungsphase vor dem Testen zugestanden wurde.
  • 8C stellt grafisch Ergebnisse ähnlich zu jenen dar, die in 8A und 8B oben gezeigt sind, aber unter Verwendung eines Marker-negativen Kontrollzelltyps, nämlich HT29. Die Ergebnisse zeigen, dass die Pulsbehandlung mit dem therapeutischen RA-NR-AN-01 Konjugat keine langanhaltenden inhibitorischen Wirkungen auf die zelluläre Aktivität Marker-negativer Kontrollzellen zeitigte, gemessen mittels der metabolischen Aktivität in HT29-Zellen, denen eine 48-stündige Erholungsphase vor dem Testen zugestanden wurde.
  • 9A zeigt eine Stenose aufgrund von Zellproliferation von inneren glatten Muskelzellen in einem histologischen Schnitt einer unbehandelten Arterie 5 Wochen nach Angioplastie in einem Tiermodell.
  • 9B zeigt die Hemmung von Stenose in einem histologischen Schnitt einer Arterie, die 5 Wochen nach Angioplastie mit therapeutischem Kojugat behandelt wurde, in einem Tiermodell.
  • 10A stellt grafisch experimentelle Daten dar, die Proteinsynthese- und DNA-Synthese- Hemmungsfähigkeiten von Suramin im Hinblick auf vaskuläre glatte Muskelzellen vergleichen.
  • 10B stellt grafisch experimentelle Daten dar, die Proteinsynthese- und DNA-Synthese- Hemmungsfähigkeiten von Staurosporin im Hinblick auf vaskuläre glatte Muskelzellen vergleichen.
  • 10C stellt grafisch experimentelle Daten dar, die Proteinsynthese- und DNA-Synthese- Hemmungsfähigkeiten von Nitroglycerin im Hinblick auf vaskuläre glatte Muskelzellen vergleichen.
  • 11 zeigt einen Tangentialschnitt parallel zur inneren Oberfläche einer glatten Muskelzelle in vitro, welcher 62.500-fach vergrößert ist und durch zahlreiche endozytische Vesikel gekennzeichnet ist, von denen mehrere mit Antikörper beschichtete Goldkügelchen enthalten, die sich im Prozess der Internalisierung durch die Zelle befinden.
  • 12 zeigt eine glatte Muskelzelle in vitro, welche 62.500-fach vergrößert ist und durch eine bemerkenswerte Akumulation von Goldkügelchen in Lysosomen 24 Stunden nach Aussetzen der Zelle gegenüber den Goldkügelchen ist.
  • 13 zeigt eine glatte Muskelzelle in vitro, welche 62.500-fach vergrößert ist und durch Anhäufung von Goldkügelchen in den Lysosomen gekennzeichnet ist.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die folgenden Begriffe haben, wie sie hier verwendet werden, die Bedeutungen, wie sie im Folgenden ausgeführt werden:
    "Therapeutisches Konjugat" meint ein vaskulären glatten Muskel bindendes oder interstitielle Matrix bindendes Protein, gekoppelt an bzw. verbunden mit (z.B. wahlweise über einen Linker) ein therapeutisches Mittel.
  • "Ziel-" bzw. "Ziel-" und "Marker-" werden derart austauschbar bei der Beschreibung des Konjugataspekts der vorliegenden Erfindung verwendet, dass sie ein Molekül meinen, das auf spezifische Weise von dem Matrix- oder vaskulären glatten Muskel- bindendem Protein erkannt wird, z.B. ein Antigen, Polypeptidantigen oder Zelloberflächenkohlenhydrat (z.B. ein Glycolipid, Glycoprotein oder Proteoglycan), das auf den Zelloberflächenmembranen einer vaskulären glatten Muskelzelle oder einer Matrixstruktur exprimiert wird.
  • "Epitop" wird so verwendet, dass es sich auf eine spezifische Stelle innerhalb des "Ziel-" Moleküls bezieht, die von dem Matrix- oder glatten Muskel- bindenden Protein gebunden wird, z.B. eine Sequenz von drei oder mehr Aminosäuren oder Sacchariden.
  • "Gekoppelt" bzw. "gebunden" wird so verwendet, dass es kovalente oder nicht-kovalente chemische Bindung meint (d.h. hydrophobe wie durch van-der-Waals-Kräfte oder Ladungs-Ladungs-Wechselwirkungen), von Matrix- oder glatten Muskel-bindendem Protein mit dem therapetischen Mittel. Aufgrund der Natur des verwendeten therapeutischen Mittels werden die Bindeproteine normalerweise mittels kovalenter Bindung mit den therapeutischen MItteln verbunden sein.
  • "Linker" meint ein Mittel, das das Matrix- oder glatten Muskel- bindende Protein mit einem therapeutischen Mittel verbindet, z.B. eine organische chemische Verknüpfung.
  • "Migration" von glatten Muskelzellen meint eine Bewegung von diesen Zellen in vivo von den medialen Lagen eines Blutgefäßes in die Intima, wie sie auch in vitro untersucht werden kann, indem die Bewegung einer Zelle von einem Ort zu einem anderen verfolgt wird (z.B. unter Verwendung von Zeitraffercinematographie oder einem Videorekorder und manuellem Zählen von glatter Muskelzellmigration aus einem bestimmten Bereich in der Gewebekultur über die Zeit).
  • "Proliferation", d.h. von glatten Muskelzellen oder Krebszellen, meint einen Anstieg in der Zellzahl, d.h. durch Mitose der Zellen.
  • "Exprimiert" meint mRNA-Transkription und Translation mit darauf folgender Synthese, Glycosylierung und/oder Sekretion eines Polypeptids durch eine Zelle, z.B. CSPG synthetisiert von einer vaskulären glatten Muskelzelle oder einem Perizyten.
  • "Makrocyclisches Trichothecen" soll irgendeines aus der Gruppe strukturell verwandter makrocyclischer Sesquiterpen01d-Mycotoxine meinen, die von mehreren Arten von Pilzen produziert werden und die 12,13-Epoxytrichothec-9-en-Grundstruktur gekennzeichnet sind, z.B. Verrucarine und Roridine, die die Produkte eines Sekundärmetabolismus in den Bodenpilzen Myrothecium verriucaria und Myrothecium roridium sind.
  • "Retard-" bezeichnet eine Dosierungsform, die gestaltet ist, um ein therapeutisches Mittel aus dieser über eine Zeit von etwa 3 bis etwa 21 Tagen freizusetzen. Eine Ausschüttung über eine längere Zeitspanne wird ebenso als "Retard-" Dosierungsform der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen.
  • "Dosierungsform" meint ein Mikropartikulat- oder Nanopartikulat- förmiges, bioabbaubares oder nicht-bioabbaubares polymeres Material, das in der Lage ist, an ein oder mehrere Bindeproteine oder -peptide zu binden, um eine therapeutische Gruppierung, die darin dispergiert ist, an eine Zielzellpopulation zu verabreichen.
  • Wie hier verwendet umfassen glatte Muskelzellen und Perizyten jene Zellen, die von den medialen Lagen von Gefäßen und Adventitiargefäßen, die in intimalen hyperplastischen Lagen nach Verletzung proliferieren, wie das während PCTA verursacht wird. Charakteristika von glatten Muskelzellen umfassen histologische Morphologie (unter Lichtmikroskopischer Untersuchung) einer Spindelform mit einem verlängerten Nukleus, der zentral in der Zelle liegt, mit vorhandenen Nukleoli und Myofibrillem im Sarcoplama. Bei Elektronenmikroskopischer Untersuchung weisen glatte Muskelzellen lange schlanke Mitochondrien im Juxtanucleären Sarcoplasma auf, einige wenige tubuläre Elemente eines granulären endoplasmatischen Retikulums, und zahlreiche Cluster freier Ribosomen. Ein kleiner Golgi-Komplex kann ebenfalls nahe einem Pol des Kerns gelegen sein. Die Mehrzahl des Sarcoplasmas wird von dünnen, parallelen Myofilamenten eingenommen, die größtenteils entlang der Längsachse der Zelle orientiert sein können. Diese Aktinenthaltenden Myofibrillen können in Bündeln angeordnet sein, mit darein eingestreuten Mitochondrien. Verteilt über die kontraktile Substanz der Zelle können auch ovale dichte Bereiche vorhanden sein, wobei ähnlich dichte Bereiche mit Abständen entlang den Seiten des Plasmalemmas verteilt sind. Charakteristika von Perizyten umfassen eine histologische Morphologie (bei lichtmikroskopischer Untersuchung), die durch eine irreguläre Zellform gekennzeichnet ist. Perizyten findet man innerhalb der Basalmembran, die vaskuläre endotheliale Zellen umgibt, und ihre Identität kann durch positive Immunfärbung mit Antikörpern, die für alpha-Actin von glatten Muskelzellen (z.B. anti-alpha-sm1, Biomakor, Rhovot, Israel), HMW-MAA, und Perizytengangliosidantigene wie MAb 3G5 spezifisch sind, bestätigt werden; oder durch negative Immunfärbung mit Antikörpern gegen Zytokeratine (d.h. epitheliale und Fibroblasten- Marker) und von-Willebrand-Faktor (d.h. einen endothelial-Marker).
  • Die therapeutischen Konjugate und Dosierungsformen der Erfindung sind nützlich, um die Aktivität von vaskulären glatten Muskelzellen zu hemmen, z.B. zur Reduktion, Verzögerung oder zum Ausmerzen der Stenose nach Angioplastie. Wie hier verwendet meint der Ausdruck "Reduktion" bzw. "Verminderung" das Abnehmen der intimalen Verdickung, die aus der Stimulation von glatter Muskelzellproliferation nach Angioplastie resultiert, entweder in einem Tiermodell oder beim Menschen. "Verzögern" meint die Verzögerung der Zeit bis zum Beginn einer sichtbaren intimalen Hyperplasie (z.B. histologisch oder durch angiografische Untersuchung beobachtet), nach Angioplastie, und kann auch mit "verminderter" Restenose einhergehen. "Ausmerzen" der Restenose nach Angioplastie vollständiges "Reduzieren" und/oder vollständiges "Verzögern" einer intimalenn Hyperplasie bei einem Patienten, und zwar zu einem Ausmaß, das es nicht mehr erforderlich macht, chirurgisch einzugreifen, d.h., um einen geeigneten Blutstrom durch das Gefäß mittels wiederholter Angioplastie, Arthrectomie oder eine coronare Arterien-Bypass-Operation wiederherzustellen. Die Wirkungen bzw. Auswirkungen des Verminderns, Verzögerns oder Ausmerzens von Stenose können mit Verfahren bestimmt werden, die für den Fachmann auf diesem Gebiet Routine sind, einschließlich, jedoch ohne eine Schränkung auf, Angiographie, Ultraschalluntersuchung, Fluoroskopische Sichtbarmachung, endoskopische Glasfaseroptikuntersuchung oder Biopsie und Histologie. Die therapeutischen Konjugate der Erfindung erreichen diese vorteilhaften Wirkungen indem sie spezifisch an die zellulären Membranen von glatten Muskelzellen und Perizyten binden.
  • Therapeutische Konjugate der vorliegenden Erfindung erhält man, indem man ein vaskulären glatten Muskel bindendes Protein an ein therapeutisches Mittel bindet bzw. koppelt. In dem therapeutischen Konjugat erfüllt das vaskulären glatten Muskel bindende Protein die Funktion der Zielsteuerung von dem therapeutischen Konjugat zu zu vaskulären glatten Muskelzellen oder Perizyten, und das therapeutische Mittel erfüllt die Funktion, die zelluläre Aktivität der glatten Muskelzelle oder des Perizyten zu hemmen.
  • Therapeutische Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung zeigen die Fähigkeit, therapeutisches Mittel über längere Zeitspannen an Zielzellen abzugeben. Therapeutische Dosierungsformen dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung können jede Zusammensetzung aufweisen, die für diesen Zweck geeignet ist. Bevorzugte therapeutische Dosierungsformen zeigen eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften:
    • – Mikropartikulate (z.B. von etwa 0,5 Mikrometer bis etwa 100 Mikrometer im Durchmesser, wobei von etwa 0,5 bis 2 Mikrometer bevorzugt sind) oder Nanopartikulate (z.B. von etwa 1,0 bis etwa 1000 Nanometer im Durchmesser, wobei von etwa 50 bis etwa 250 Nanometer bevorzugt sind), freifließende Pulverstruktur;
    • – bioabbaubare Struktur, die so gestaltet ist, dass sie sich über eine Zeitspanne zwischen etwa 3 und etwa 180 Tagen biologisch abbaut, wobei zwischen etwa 10 und etwa 21 Tagen bevorzugter ist, oder nicht-bioabbaubare Struktur, welche es erlaubt, dass das eine Diffusion des therapeutischen Mittels über eine Zeitspanne zwischen etwa 3 und etwa 180 Tagen auftritt, wobei zwischen etwa 10 und etwa 21 Tagen bevorzugt ist;
    • – biokompatibel mit dem Zielgewebe und der lokalen physiologischen Umgebung, in welche die Dosierungsform verabreicht wird, einschließlich Bioabbauprodukte;
    • – erleichtert eine stabile und reproduzierbare Disperision von therapeutischem Mittel darin, bevorzugt unter Bildung einer Matrix aus therapeutischem Mittel – Polymer, wobei die Ausschüttung des aktiven therapeutischen Mittels über eine oder beide der folgenden Routen auftritt: (1) Diffusion des therapeutischen Mittels durch die Dosierungsform (wenn das therapeutische Mittel in dem Polymer oder dem Polymergemisch, das die Dosierungsform bildet, löslich ist); oder (2) Ausschüttung des therapeutischen Mittels, während die Dosierungsform biologisch abgebaut wird; und
    • – Fähigkeit, an ein oder mehrere zelluläre Epitope und/oder Epitope der interstitiellen Matrix zu binden, wobei von etwa 1 bis etwa 10000 Bindungen zwischen Bindeprotein/-peptid und Dosierungsform pro 150 Quadratangstrom Partikeloberfläche bevorzugter ist. Die Gesamtanzahl an Bindungen hängt von der verwendeten Partikelgröße ab. Die Bindungsproteine oder – peptide sind in der Lage, über kovalente Liganden-Sandwich- oder nicht-covalente Modalitäten an die partikulare therapeutische Dosierungsform zu binden, wie hierin ausgeführt.
  • Therapeutische Nanopartikulatdosierungsformen bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind bioabbaubar und binden an die vaskulären glatten Muskelzellen und treten in solche Zellen ein, vornehmlich durch Endozytose. Der Bioabbau von solchen Nanopartikulaten tritt über die Zeit (z.B. 10 bis 21 Tage) in prälysosomischen Vesikeln und Lysosomen auf. Die bevorzugten therapeutischen Mikropartikulat-Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung binden an die Zelloberfläche oder interstitielle Matrix, abhängig von dem ausgewählten Bindungsprotein oder -peptid, und schütten das therapeutische Mittel zur anschließenden Aufnahme durch die Zielzelle aus, wobei nur einige wenige der kleineren Mikropartikel in die Zelle durch Phagozytose eintreten. Eine Fachkraft auf diesem Gebiet wird anerkennen, dass der genaue Mechanismus, über den eine Zelle eine Dosierungsform der vorliegenden Erfindung assimiliert und metabolisiert, von der Morphologie, Physiologie und den metabolischen Prozessen jener Zellen abhängen wird.
  • Die Größe der zielgerichteten therapeutischen Dosierungsformen ist auch im Hinblick auf die Art und Weise zellulärer Assimilierung wichtig. Zum Beispiel können die kleineren Nanopartikel mit der interstitiellen Flüssigkeit zwischen den Zellen fließen und das infundierte Gewebe penetrieren, bis sie an das normale oder neoplastische Gewebe binden, für dessen Zielausrichtung das Bindungsprotein/-peptid ausgewählt ist. Diese Eigenschaft ist wichtig, beispielsweise weil die Nanopartikel lymphatischen Drainagekanälen von primären neoplastischen, infundierten Foci aus folgen können, wobei eine zielgerichtete Ansteuerung metastatischer Foci entlang des Lymphgangs möglich ist. Die größeren Mikropartikel tendieren eher dazu, einfacher im Interstitium im infundierten primären Gewebe eingeschlossen zu werden.
  • Bevorzugte Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung sind bioabbaubare Mikropartikulate oder Nanopartikulate. Bevorzugter sind die bioabbaubaren Mikropartikel oder Nanopartikel aus einem Polymer gebildet, das eine Matrix enthält, die durch zufällige, nichtenzymatische, hydrolytische Spaltung biologisch abgebaut wird, und zwar unter Ausschüttung von therapeutischem Mittel, wobei Poren innerhalb der Partikulatstruktur gebildet werden.
  • Polymere, die aus einer Kondensation von alpha-Hydroxycarbonsäuren und verwandten Lactonen abgeleitet sind, sind für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Solch eine bevorzugte Gruppierung ist aus einem Gemisch thermoplastischer Polyester (z.B. Polylactid oder Polyglycolid) oder einem Copolymer von Lactid- und Glycolid-Komponenten gebildet, wie poly(Lactid-co-Glycolid). Eine beispielhafte Struktur, ein Zufalls-poly(DL-Lactid-co-glycolid), is unten gezeigt, wobei die Werte von x und y von einem Fachmann auf dem Gebiet so eingestellt werden können, dass wünschenwerte Mikropartikulat- oder Nanopartikulat-Eigenschaften erreicht werden.
  • Figure 00170001
  • Andere Mittel, die geeignet sind, die Partikulatdosierungsformen der vorliegenden Erfindung zu bilden, umfassen Polyorthoester und Polyacetale (Polymer Letters, 18:293, 1980) und Polyorthocarbonate ( U.S.-Patent Nr. 4,093,709 ) und ähnliche.
  • Bevorzugte Milchsäure-/Glycolsäurepolymer- enthaltende Matrixparticulate der vorliegenden Erfindung werden hergestellt, indem emulsionsbasierte Verfahren verwendet werden, die modifizierte Lösungsmittelextraktionsprozesse darstellen, wie jene, die von Cowsar et al., "Poly(lactid-co-glycolide)-Mikrokapseln zur kontrollierten Ausschüttung von Ster01den", Methods Enzymology, 112: 101-116, 1985 (Ster01d-Einschluss in Mikropartikulaten); Eldridge et al., "Mikrosphären als Adjuvans für Staphylokokken Enterotoxin B-Tox01 d, welches den Spiegel an Toxin-neutralisierenden Antikörpern erhöht", Infection and Immunity, 59: 2978-2986, 1991 (Tox01deinschluss); Cohen et al., "Kontollierte Verabreichungssysteme für Proteine basierend auf Poly(Milch-/Glycolsäure)-Mikrosphären", Pharmaceutical Research, 8(6): 713-720, 1991 (Enzymeinschluß); und Sanders et al., "Controllierte Ausschüttung eines Luteinisierenden Hormons-Releasing-Hormon-Analogons aus Poly (D,L-Lactid-co-glycolid)-Mikrosphären", J. Pharmaceutical Science, 73(9): 1294-1297, 1984 (Peptideinschluss), beschrieben sind.
  • Im Allgemeinen umfasst das Verfahren zur Bildung von Partikulatdosierungsformen der vorliegenden Erfindung das Lösen des Polymers in einem halognierten Kohlenwasserstofflösungsmittel, das Dispergieren einer (bevorzugt wässrigen) Lösung eines therapeutischen Mittels darin, und Zugabe eines zusätzlichen Mittels, das als Lösungsmittel für das halogenierte Kohlenwasserstofflösungsmittel, aber nicht für das Polymer dient. Das Polymer fällt aus der Lösung aus Polymer – halogeniertem Kohlenwasserstoff in Tropfen der therapeutisches Mittel enthaltenden Lösung aus und schließt das therapeutische Mittel ein. Nach Bildung des Partikulats wird dieses gewaschen und mit einem organischen Lösungsmittel gehärtet. Es folgen Waschschritte mit Wasser und wässrigem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel, vor dem Trocknen bei Raumtemperatur unter Vakuum.
  • Aus Biokompatibilitätsgründen werden Partikulatdosierungsformen, die sich dadurch auszeichnen, dass ein therapeutisches Mittel darin in Matrixform dispergiert ist, vor der Verpackung, Lagerung oder Verabreichung sterilisiert. Die Sterilisation kann auf jede bequeme Weise durchgeführt werden. Zum Beispiel können die Partikulate mit Gammastrahlung bestrahlt werden, vorausgesetzt, dass das Aussetzen gegenüber dieser Strahlung die Struktur oder die Funktion des therapeutischen Mittels, welches in der Matrix aus therapeutischem Mittel – Polymer dispergiert ist, oderdas Bindungsprotein/-peptid, das damit verbunden ist, nicht nachteilig beeinflusst. Wenn das therapeutische Mittel oder das Bindeprotein/-peptid so nachteilig beeinflusst wird, kann die Partikulatdosierungsform unter sterilen Bedingungen hergestellt werden.
  • Die Ausschüttung bzw. Freisetzung des therapeutischen Mittels aus den Partikulatdosierungsformen der vorliegenden Erfindung kann als Ergebnis von sowohl Diffusion als auch Matrixerosion auftreten. Die Bioabbaurate beeinflusst direkt die Kinetik der Freisetzung von therapeutischem Mittel. Die Bioabbaurate ist durch Veränderung der Zusammensetzung oder Struktur der Dosierungsform regulierbar. Zum Beispiel kann eine Veränderung des Lactid-/Glycolid-Verhältnisses in bevorzugten Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung vorgenommen werden, wie von Tice et al., "Bioabbaubare Parenteralsysteme mit kontrollierter Freisetzung" Pharmaceutical Technology, Seiten 26-35, 1984, beschrieben, vorgenommen werden; durch Einschluß von Polymerhydrolyseverändernden Mitteln wie Zitronensäure und Natriumcarbonat, wie von Kent et al., "Microencapsulation of Water Soluble Active Polypeptides", U.S.-Patent Nr. 4,675, 189 ; und durch Veränderung von Partikulatgröße, wie beschrieben von Beck et al., "Poly(D,L-Lactid-Co-Glycolid/Norethistheron-Mikrokapseln: Ein injizierbares bioabbaubares Verhütungsmittel" Biol. Reprod., 28: 186-195, 1983; oder ähnlichem. Alle die vorgenannten Verfahren zur Regulation der Bioabbaurate beeinflussen die intrinsische Viskosität der Polymer-enthaltenden Matrix, und verändern dabei die Hydrierungsrate.
  • Die bevorzugte Lactid/Glycolid-Struktur ist mit der physiologischen Säugerumgebung biokompatibel. Diese bevorzugten Dosierungsformen weisen auch den Vorteil auf, dass deren Bioabbau Milchsäure und Glycolsäure bildet, beides normale Stoffwechselprodukte von Säugetieren.
  • Funktionelle Gruppen, die für die Bindung von Bindungsprotein/-peptid-Dosierungsformen in der Partikulatstruktur an die Partikel erforderlich sind, sind wahlweise zusammen mit den nicht-abbaubaren oder bioabbaubaren Polymereinheiten in der Partikulatstruktur umfasst. Funktionelle Gruppen, die für diesen Zweck verwendet werden können, umfassen jene, die mit Peptiden reagieren, wie Carboxylgruppen, Amingruppen, Sulfhydrylgruppen und ähnliche. Bevorzugte bindungsverstärkende Gruppierungen umfassen die terminalen Carboxylgruppen der bevorzugten (Lactid-Glycolid)-Polymer-enthaltenden Matrix oder ähnliche.
  • Nützliches vaskulären glatten Muskel bindendes Protein ist eine Polypeptid-, eine peptidische, oder eine mimetische Verbindung (wie unten beschrieben), die in der Lage ist, an ein Ziel oder einen Marker auf der Oberfläche einer vaskulären (d.h. Gefäß-) glatten Muskelzelle auf eine solche Art und Weise zu binden, dass das Bindungsprotein, wenn es von der Zelle aufgenommen wird, einen Transport in ein intrazelluläres Kompartiment herbeiführt, das die Verabreichung des therapeutischen Mittels ermöglicht. Repräsentative Beispiele von nützlichen vaskulären glatten Muskel bindenden Proteinen umfassen Antikörper (z.B. monoklonale und polyklonale affinitätsgereinigte Antikörper, F(ab')2, Fab', Fab und Fv-Fragmente und/oder Komplementariäts-bestimmende Regionen (CDR) von Antikörpern oder deren funktionelle Äquivalente, (z.B. Bindungspeptide und Ähnliches); Wachstumsfaktoren, Cytokine, und Polypeptidhormone und Ähnliche; und Makromoleküle, die extrazelluläre Matrixrezeptoren erkennen (z.B. Integrin- und Fibronectin-Rezeptoren und Ähnliches).
  • Andere bevorzugte Bindungspeptide, die bei der Zielausrichtung der Ausführungsform der Dosierungsform der vorliegenden Erfindung nützlich sein können, umfassen jene, die in das interzelluläre Stroms und die interzelluläre Matrix lenken, die zwischen den und um die vaskulären glatten Muskelzellen herum liegt. Solche Bindungspeptide liefern das therapeutische Mittel an den interstitiellen Raum zwischen den Zielzellen ab. Das therapeutische Mittel wird für die anschließende Aufnahme durch die vaskulären glatten Muskelzellen in solche interstitiellen Raume ausgeschüttet. Bevorzugte Bindungspeptide dieser Art binden an Epitope auf Collagen, extrazelluläre Glycoproteine wie Tenascin, Reticulum- und elastische Fasern und anderes interzelluläres Matrixmaterial.
  • Bevorzugte Tumorzell-bindende Peptide binden an Epitope von myc, ras, bcr/Abl, erbB und ähnliche Genprodukte sowie Mucine, Cytokinrezeptoren wie IL-6, EGF, TGF und Ähnliche, welche sich bei bestimmten Lymphomen (myc), Karzinomen wie Darmkrebs (Mucine), Brustkrebs und Hepatomen (IL-6-Rezeptor), beziehungsweise Brustkrebs (TGF und EGF), befinden. Bevorzugte Peptide, die an Immunsystemeffektorzellen binden, sind anti-TAC, IL-2 und Ähnliche, welche sich bei aktivierten T-Zellen beziehungsweise Makrophagen finden. Andere bevorzugte Bindungspeptide/-proteine, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen Gruppierungen, die in der Lage sind, an pathologisch proliferierende normale Gewebe zu lokalisieren, wie an Perizyten der intraocularen Muskulatur, die bei degenerativen Augenerkrankungen eine Rolle spielen.
  • Erfindungsgemäße therapeutische Mittel werden so ausgewählt, dass sie eine zelluläre Aktivität einer vaskulären glatten Muskelzelle hemmen, z.B. Proliferation, Migration, Anstieg des Zellvolumens, Anstieg der Synthese extrazellulärer Matrix (z.B. Kollagenen, Proteoglycanen, und Ähnlichen) oder Sezernierung von extrazellulären Matrixmaterialien durch die Zelle. Bevorzugt wirkt das therapeutische Mittel entweder: (a) als "cytostatisches Mittel", um Zellteilung bei proliferierenden Zellen entweder zu verhindern oder zu verzögern, indem die Replikation von DNA inhibiert wird (z.B. ein Arzneimittel wie Adriamycin), oder durch Inhibieren der Spindelfaserbildung (z.B. ein Arzneimittel wie Colchicin) und Ähnliches; oder (b) als Inhibitor der Migration von vaskulären glatten Muskelzellen von der medialen Wand in die Intima, z.B. ein "Anti-Migrationsmittel"; oder (c) als Inhibitor des intrazellulären Anstiegs des Zellvolumens (d.h. des Gewebevolumens, das von einer Zelle eingenommen wird, "cytoskelletaler Inhibitor" oder "metabolischer Inhibitor"); oder (d) als Inhibitor, der die zelluläre Proteinsynthese und/oder Sekretion oder Organisation von extrazellulärer Matrix blockiert (d.h. ein "Anti-Matrix-Mittel").
  • Repräsentative Beispiele für "zytostatische Mittel" umfassen z.B. modifizierte Toxine, Methotrexat, Adriamycin, Radionuclide (z.B. wie in Fritzberg et al., U.S.-Patent Nr. 4,897,255 offenbart), Proteinkinaseinhibitoren, Inhibitoren von bestimmten Enzymen wie des nuklearen Enzyms DNA-Top01 somerase II und DNA-Polymerase, RNA-Polymerase, Adenylguanylcyclase, Superoxiddismutaseinhibitoren, terminale Desoxynucleotidyltransferase, Reverse Transkriptase, Antisense-Oligonukleotide, die die Proliferation von glatten Muskelzellen unterdrücken und Ähnliche, welche, wenn sie in ein zelluläres Kompartiment bei geeigneter Dosis verabreicht werden, so wirken, dass sie die Proliferation einer glatten Muskelzelle oder eines Perizyten stören, ohne die Zelle zu töten. Andere Beispiele cytostatischer Mittel umfassen peptidische oder mimetische Inhibitoren (d.h. Antagonisten, Agonisten, oder competitive oder nicht-competitive Inhibitoren) von zellulären Faktoren die (z.B. in Gegenwart von extrazellulärer Matrix) die Proliferation von glatten Muskelzellen oder Perizyten auslösen könnten: z.B Cytokine (z.B. Interleukine wie IL-1), Wachstumsfaktoren (z.B. PDGF, TGFalpha oder beta, Tumornekrosefaktor, von glatten Muskel- und Endothelzellen abgeleitete Wachstumsfaktoren, d.h. Endothelin, FGF), Homing-Rezeptoren (z.B. für Blutplättchen oder Leukozyten), und Rezeptoren der extrazellulären Matrix. Repräsentative Beispiele von nützlichen therapeutischen Mitteln in dieser Kategorie cytostatischer Mittel für die Proliferation glatter Muskelzellen umfassen: Subfragmente von Heparin, Triazoloprymidin (Trapidil, ein PDGF-Antagonist), Lovastatin, und Prostaglandine E1 oder I2.
  • Repräsentative Beispiele für "Anti-Migrationsmittel" umfassen Inhibitoren (d.h. Agonisten und Antagonisten, und competitive oder nicht-competitive Inhibitoren) von chemotaktischen Faktoren und ihren Rezeptoren (z.B. Komplement-Chemotaxine wie C5a, C5a desarg. oder C4a; extrazelluläre Matrixfaktoren, z.B. Kollagen-Abbaufragmente) oder intrazelluläre Zytoskelettelemente, und Phosphatasen und Kinasen, die in [Zell-]-Bewegung involviert sind). Repräsentative Beispiele für nützliche therapeutische Mittel in dieser Kategorie von Antimigrationsmitteln umfassen: Koffeinsäurederivate und Nilvadipin (ein Calcium-Antagonist), und Stero1dhormone.
  • Repräsentative Beispiele für "Zytoskelettinhibitoren" umfassen Colchicin, Vinblastin, und ähnliche, die auf Mikrotubuli- und Mikrofilament-Netzwerke innerhalb einer Zelle einwirken.
  • Repräsentative Beispiele für "Metabolische Inhibitoren" umfassen Trichothecene, und modifizierte Diphterie- und Ricin-Toxine, Pseudomonas-Exotoxin, und Ähnliche. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das therapeutische Konjugat mit einem Mittel konstruiert, das ein einfaches Trichothecen oder ein makrocyclisches Trichothecen ist, z.B. ein Verrucarin oder Roridin. Trichothecene sind Arzneimittel, die von Bodenpilzen der Klasse Fungi imperfecti hergestellt werden oder von Baccharus megapotamica isoliert werden (Bamburg, J. R. Proc. Molec. Subcell. Biol. 8: 41-110, 1983; Jarvis & Mazzola, Acc. Chem. Res. 15: 338-395, 1982). Sie scheinen die toxischsten Moleküle zu sein, die nur Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff enthalten (ramm, C. Fortschr. Chem. Org.
  • Naturst. 31: 61-117, 1974). Von allen wird berichtet, dass sie auf Ebene des Ribosoms als Inhibitoren der Proteinsynthese in den Initiations-, Elongations- und Terminationsphasen wirken.
  • Es gibt zwei breite Klassen von Trichothecenen: Jene, die nur eine zentrale Sesquiterpen01dstruktur aufweisen, und jene, die einen zusätzlichen makrocyclischen Ring aufweisen (einfache bzw. makrocyclische Trichothecene). Die einfachen Trichothecene können in drei Gruppen eingeteilt werden (d.h. Gruppe A, B und C), wie in den U.S.-Patenten Nr. 4,744,981 und 4, 906,452 beschrieben.
  • Repräsentative Beispiele von einfachen Trichothecenen der Gruppe A umfassen: Scirpen, Roridin C, Dihydrotrichothecen, Scirpen-4,8-diol, Verrucarol, Scirpentriol, T-2-Tetraol, Pentahydroxyscirpen, 5 4-Desacetylneosolaniol, Trichodermin, Desacetylcalonectrin, Calonectrin, Diacetylverrucarol, 4-Monoacetoxyscirpenol, 4,15-diacetoxyscirpenol, 7-Hydroxydiacetoxyscirpenol, 8-Hydroxydiacetoxyscirpenol (Neosolaniol), 7,8-Dihydroxydiacetoxyscirpenol, 7-Hydroxy-8-acetyldiacetoxyscirpenol, 8-Acetylneosolaniol, NT-1, NT-2, HT-2, T-2, and Acetyl T-2 toxin.
  • Repräsentative Beispiele für einfache Trichothecene der Gruppe B umfassen: Trichothecolon, Trichothecin, Desoxynivalenol, 3-Acetyldesoxynivalenol, 5-Acetyldesoxynivalenol, 3,15-Diacetyldesoxynivalenol, Nivalenol, 4-Acetylnivalenol (Fusarenon-X), 4,15-Idacetylnivalenol, 4,7,15-Thriacetylnivalenol und Tetraacetylnivalenol.
  • Repräsentative Beispiele von einfachen Trichothecenen der Gruppe C umfassen Crotocol und Crotocin. Repräsentative makrocyclische Trichothecene umfassen Verrucarin A, Verrucarin B, Verrucarin J (Satratoxin C), Roridin A, Roridin D, Roridin E (Satratoxin D), Rorodin H, Satratoxin F, Satratoxin G, Satratoxin H, Vertisporin, Mytoxin A, Mytoxin C, Mytoxin B, Myrotoxin A, Myrotoxin B, Myrotoxin C, Myrotoxin D, Roritoxin A, Roritoxin B, und Roritoxin D. Zusätzlich ist die allgemeine "Trichothecen"-Sesquiterpen01d-Ringstruktur auch bei Verbindungen vorhanden, die "Baccharine" genannt werden, die von der höheren Pflanze Baccharis megapotamica isoliert werden, wie beispielsweise bei Jarvis et al. (Chemistry of Aleopathy, ACS Smposium Series No. 268: Hrsg. A.C. Thomson, 1984, S. 149-159) offenbart.
  • Repräsentative Beispiele von "Anti-Matrix-Mitteln" umfassen Inhibitoren (d.h. Agonisten und Antagonisten und kompetitive und nicht-kompetitive Inhibitoren) der Matrixsynthese, Sekretion und Assemblierung, organisierende Kreuzvernetzung (z.B. Transglutaminasen, die Collagen kreuzvernetzen), Matrix- Umordnung (z.B. nach Wundheilung). Ein repräsentatives Beispiel für ein nützliches therapeutisches Mittel in dieser Kategorie der Anti-Matrix-Mittel ist Colchicin, ein Inhibitor der Sekretion von Extrazellulärer Matrix.
  • Für die Retard-Dosierungsformen (d.h. Dosierungsformen mit verzögerter Ausschüttung bzw. Freisetzung) sind therapeutische Mittel vorzugsweise die, welche die Zellaktivität vaskulärer glatter Muskelzellen inhibieren, ohne die Zellen zu töten (z.B. zytostatische therapeutische Mittel). Bevorzugte therapeutische Mittel für diesen Zweck zeigen eine oder mehrere der folgenden Fähigkeiten: Inhibieren der DNA-Synthese vor der Proteinsyntheseinhibierung, oder Inhibieren der Migration von vaskulären glatten Muskelzellen in die Intima. Diese therapeutischen Mittel inhibieren die Proteinsynthese nicht signifikant (d.h. sie töten die Zielzellen nicht) und erleichtern daher die zelluläre Reparatur und Matrixproduktion zur Stabilisierung von Läsionen der Gefäßwand, die durch Angioplastie verursacht werden, indem die Proliferation von glatten Muskelzellen vermindert wird.
  • Beispielhaft für ein solches bevorzugtes therapeutisches Mittel sind Proteinkinaseinhibitoren, wie Staurosporin (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri), und Suramin (FBA Pharmaceuticals, West Have, Connecticut) sowie Nitroglycerin (DuPont Pharmaceuticals, Inc., Manuti, Puerto Rico), oder deren Analoga oder funktionelle Äquivalente. Diese Verbindungen sind cytostatisch, und es wurde von ihnen gezeigt, dass sie minimale ProteinsyntheseHemmung und Zytotoxizität zeitigen, bei Konzentrationen, bei denen signifikante DNA-Synthese-Hemmung auftritt (siehe Beispiel 8 und 10A-10C). Ein nützliches Protokoll zur Identifizierung von therapeutischen Mitteln, die in Retarddosierungsform-Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung nützlich sind, ist in Beispiel 8 wiedergegeben. Ein Fachmann auf diesem Gebiet ist in der Lage, im Wesentlichen äquivalente Protokolle für Experimente zur Durchführung solch einer Identifizierung für unterschiedliche Zielzellpopulationen, wie adhärente einlagige Zielzelltypen zu gestalten.
  • Andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen Mittel, die für Krebszellen zytotoxisch sind. Bevorzugte Mittel für diese Ausführungsformen sind Roridin A, Pseudomonas Exotoxin und Ähnliche, oder Analoga oder funktionelle Äquivalente von diesen. Eine Vielzahl solcher therapeutischer Mittel einschließlich Radi01sotopen und Ähnlichem wurde identifiziert und ist im Stand der Technik bekannt. Zusätzlich sind Protokolle für die Identifizierung von zytotoxischen Gruppierungen bekannt und werden routinemäßig in der Wissenschaft verwendet.
  • Die Modulierung von Immunsystem-vermittelten Krankheitseffektorzellen kann ebenso unter Verwendung von Retarddosierungsformen der vorliegenden Erfindung erreicht werden. Solch eine Modulierung wird bevorzugt im Hinblick auf Krankheiten durchgeführt, die eine Effektorzellpopulation aufweisen, die über Verabreichung durch lokale Dosierungsformen zugänglich ist. Therapeutische Gruppierungen mit der erforderlichen modulierenden Aktivität, z.B. zellzerstörend, zytostatisch, mit einer Stoffwechsel-verändernden oder ähnlichen Aktivität auf lymphorecticulare Zellen bei der Behandlung von Arthritis (intra-articuläre Verabreichung), Sprue (d.h. einer Enteropathie), Uveitits und Endophtalmitis (intraoculare Verabreichung) und Keratitis (subconjunctionale Verabreichung) haben, können unter Verwendung von Techniken identifiziert werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Bevorzugte Mittel für diese Ausführungsformen umfassen Roridin A, Pseudomonas Exotoxin, Suramin, Proteinkinaseinhibitoren (z.B. Staurosporin) und Ähnliche oder Analoga oder funktionelle Äquivalente von diesen.
  • Andere bevorzugte therapeutische Mittel, die nützlich für die Durchführung der vorliegenden Erfindung sind, umfassen Gruppierungen, die in der Lage sind, eine pathologische Proliferation normaler Gewebe auszumerzen oder zu vermindern. Beispielhaft für solche therapeutischen Mittel sind jene, die in der Lage sind, eine pathologische Proliferation von Perizyten der intraocularen Gefäßmuskulatur zu vermindern oder auszumerzen, welche bei degenerativen Augenerkrankungen impliziert ist.
  • Vaskulären glatten Muskel bindende Proteine der Erfindung binden an Ziele auf der Oberfläche von vaskulären glatten Muskelzellen. Es wird anerkannt werden, dass spezifische Ziele, z.B. Polypeptide oder Kohlenhydrate, Proteoglycane und Ähnliche, die mit den Zellmembranen von vaskulären glatten Muskelzellen in Verbindung stehen, nützlich für die geeignete Auswahl (z.B. durch Klonierung) oder Konstruktion (z.B. durch genetische Manipulation oder chemische Synthese) spezifischer vaskulären glatten Muskel bindender Proteine. Besonders nützliche "Ziele" werden durch glatte Muskelzellen internalisiert, z.B. als Membranbestandteil während Antigenaustausch bei der Erneuerung auftritt. Die Internalisierung durch Zellen kann auch mittels Mechanismen auftreten, die Phagolysosomen, Clathrin-beschichtete Pits, Rezeptor-vermittelte Neuverteilung oder Endocytose und Ähnliches einbeziehen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird solch ein "Ziel" beispielhaft dargestellt durch Chondr01tinsulfatproteoglycane (CSPGs), die von vaskulären glatten Muskelzellen und Perizyten synthetisiert werden, und ein bestimmter Teil (hierin "Epitop" genannt) eines CSPG-Moleküls mit einem apparenten Molekulargewicht von etwa 250 kD ist besonders bevorzugt. Das 250 kD-Ziel ist ein N-verknüpftes Glycoprotein, das eine Komponente eines 400 kD Proteoglycan-Komplexes ist (14). In einer derzeit besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein vaskulären glatten Muskel bindendes Protein bereitgestellt durch einen monoklonalen NR-AN-01-Antikörper (eine Unterkultur von NR-ML-05), die an ein Epitop auf einem CSPG-Zielmolekül von vaskulärem glatten Muskel bindet. Der als NR-ML-05 bezeichnete monoklonale Antikörper bindet Berichten zufolge ein 250 kD CSPG, das von Melanomzellen synthetisiert wird (Morgan et al., U.S. Patent Nr. 4,879,255 ) Glatte Muskelzellen und Perizyten synthetisieren Berichten zufolge ebenfalls ein 250 kD CSPG sowie andere CSPGs (11). NR-ML-05, das an glatte Muskelzellen bindet, wurde offenbart (Fritzberg et al., U.S. Patent Nr. 4,879,225 ). Der monoklonale Antikörper NR-ML-05 und die Subkultur NR-ML-05 Nr. 85-41-4I-A2, Gefrierschranknummer #A2106, wurden beide bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, hinterlegt, und es wurden ihnen die Hinterlegungsnummern HB-5350 beziehungsweise HB-9350 zugeordnet. NR-ML-05 ist der Elterstamm von, und strukturell und funktionell äquivalent zu dem Subklon NR-AN-01, der hierin offenbart ist. Es wird anerkannt werden, dass NR-AN-01 nur ein Beispiel für ein Protein, das vaskulären glatten Muskel bindet, welches spezifisch an das 400 kD CSPG-Ziel bindet, ist, und dass andere Bindungsproteine, die an dieses Ziel und andere Epitope auf diesem Ziel binden, ebenfalls nützlich sind bei den therapeutischen Konjugaten und Verfahren der Erfindung. In dem vorliegenden Fall wurden auch sechs andere monoklonale Maus-Antikörper und zwei humane chimere monoklonale Antikörper ausgewählt, wie hierin beschrieben, die spezifisch das 250 kD CSPG von vaskulären glatten Muskelzellen ansteuern. Die Antikörper. scheinen auch von den glatten Muskelzellen nach dem Binden an die Zellmembran internalisiert zu werden. Immunreaktivitätsstudien haben auch die Bindung der Maus-MAbs an das 250 kD-Antigen in 45 normalen humanen Geweben und 30 verschiedenen Neoplasmen gezeigt, und einige dieser Ergebnisse wurden zuvor veröffentlicht ( U.S.-Patent Nr. 4,879,225 ). Bei dieser Offenbarung und anderen humanen klinischen Studien lokalisierten MAbs, die gegen das CSPG 250 kD Antigen gerichtet waren, in vivo zu vaskulären glatten Muskelzellen.
  • Weiterhin wird anerkannt werden, dass die Aminosäurereste, die in die kinetische Mehrpunktbindung des monoklonalen NR-AN-01-Antikörpers mit einem CSPG-Marker-Antigenepitop involviert sind (d.h. die Aminosäuren, die die Komplementaritätsbestimmende Region ausmachen), durch computergestütztes molekulares Modellieren und durch die Verwendung von Mutanten mit geänderter Antikörperbindungsaffinität. Die Bindungsstellen-Aminosäuren und ein dreidimensionales Modell der NR-AN-01-Antigenbindungsstelle dienen als molekulares Modell für die Konstruktion funktioneller Äquivalente, d.h. kurze Poypeptide ("Minimalpolypeptide"), die eine Bindungsaffinität für ein CSPG aufweisen, das von vaskulären glatten Muskelzellen und Perizyten synthetisiert wird.
  • In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform zur Behandlung von Stenose nach Gefäßchirurgischen Verfahren, z.B. PTCA, werden Bindungsproteine ausgewählt, z.B. Antikörper oder Fragmente, zur Verwendung bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung mit einer Bindungsaffinität von > 104 Liter/Mol für das 250 kD-CSPG von vaskulärem glatten Muskel, und auch die Fähigkeit, von glatten Muskelzellen oder Perizyten gebunden zu werden und internalisiert zu werden.
  • Dreidimensionales Modellieren ist auch nützlich, um andere funktionelle Äquivalente zu modellieren, die die Bindung von NR-AN-01 an sein antigenisches Epitop nachahmen (engl. "mimic"), z.B. "mimetische" chemische Verbindungen, die die dreidimensionalen Aspekte von NR-AN-01-Bindung an sein Epitop auf einem CSPG-Zielantigen nachahmen. Wie hier verwendet bezieht sich "Minimalpeptid" auf eine Aminosäuresequenz, die in der Länge mindestens sechs Aminosäuren aufweist. Wie hier verwendet bezieht sich der Ausdruck "mimetisch" auf ein organisch-chemisches Polymer, das so konstruiert ist, dass die geeignete Abstandsfläche zur Bindung an die Aminosäuren eines NR-AN-01-CSPG-Ziels erreicht wird, welches von vaskulären glatten Muskelzellen oder Perizyten synthetisiert wird.
  • Es wird anerkannt werden, dass die Erfinder auch die Nützlichkeit humaner monoklonaler Antikörper oder "humanisierter" Maus-Antikörper als Bindungsprotein für vaskuläre glatte Muskelzellen in den therapeutischen Konjugaten ihrer Erfindung in Erwägung ziehen. Zum Beispiel kann monoklonaler Mausantikörper "humanisiert" werden, indem die Nukleotidsequenz, die für die Maus-Fv-Region (d.h. enthaltend die Antigenbindungsstellen) mit der Nukleotidsequenz, die für eine humane konstante Domänen-Region und eine FC-Region codiert, rekombiniert werden, z.B. auf eine Weise ähnlich zu der, die in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0,411,893 A2 offenbart ist. Es wird erkannt werden, dass humanisierte Bindungspartner für vaskuläre glatte Muskelzellen den Vorteil aufweisen, dass sie die Immunreaktivität des Antikörpers oder Polypeptids im Wirtsempfänger herabsetzen, was zur Erhöhung der Halbwertszeit und Verminderung der Möglichkeit nachteiliger Immunreaktionen nützlich sein kann.
  • Ebenso werden als nützliche Bindungspeptide für Restenosebehandlungs-Dosierungsformen jene in Erwägung gezogen, die in das interzelluläre Stroms und die Matrix, welche zwischen den vaskulären glatten Muskelzellen und um sie herum liegen, lokalisieren. Solche Bindungspeptide liefern das therapeutische Mittel in den interstitiellen Raum zwischen den Zielzellen ab. Das therapeutische Mittel wird in solche interstitiellen Räume zur anschließenden Aufnahme durch die vaskulären glatten Muskelzellen freigesetzt. Bevorzugte Bindungspeptide dieses Typs sind mit Epitopen auf Collagen, extrazellulären Glycoproteinen wie Tenascin, Reticulum und elastischen Fasern, Cytokeratin und anderen interzellulären Matrixkomponenten assoziiert. Minimalpeptide, mimetische organisch-chemische Verbindungen, humane oder humanisierte monoklonale Antikörper und Ähnliche, die in das intrazelluläre Stroms und die Matrix lokalisieren, sind auch als Bindungspeptide in dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nützlich. Solche Bindungspeptide können entsprechend bekannter Techniken identifiziert und konstruiert oder isoliert werden. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bindet das interstitielle Matrix bindende Protein an ein Zielepitop mit einer Assoziationskonstante von mindestens 10-4M.
  • Nützliche Bindungspeptide für Krebsbehandlungsausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen jene, die mit Zellmembran- und cytoplasmischen Epitopen von Krebszellen eine Bindung eingehen und Ähnliche. Diese Bindungspeptide befinden sich auf der Oberflächenmembran von intakten Zellen beziehungsweise internen Epitopen von zerstörten Zellen, und transportieren das therapeutische Mittel zur Assimilation in die Zielzellen. Minimalpeptide, mimetische organische Verbindungen und humane oder humanisierte Antikörper, die sich an den erforderlichen Tumorzelltypen lokalisieren, sind nützlich als Bindungspeptide der vorliegenden Erfindung. Solche Peptide können identifiziert und konstruiert oder isoliert werden entsprechend bekannter Techniken. Bevorzugte Bindungspeptide dieser Ausführungsforrmen der vorliegenden Erfindung binden an Zielepitope mit einer Assoziationskonstante von mindestens etwa 10-6M.
  • Bindungspeptide für Membran- und cytoplasmische Epitope und Ähnliche, die zu Effektorzellen von Immunsystem-vermittelten Erkrankungen lokalisieren, z.B. Zellen des lymphoretikulären Systems, sind auch nützlich, um Retard-Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung zu verabreichen. Das therapeutische Mittel wird zu den Zielzellen zur Internalisierung bzw. Aufnahme mittels solcher Retard-Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung transportiert. Minimalpeptide, mimetische organische Verbindungen und humane oder humanisierte Antikörper, die zu den erforderlichen Effektorzelltypen lokalisieren, sind auch nützlich als Bindungspeptide der vorliegenden Erfindung. Solche Bindungspeptide können entsprechend bekannter Techniken identifiziert und konstruiert oder isoliert werden. Bevorzugte Bindungspeptide dieser Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung binden an Zielepitope mit einer Assoziationskonstante von mindestens etwa 10-6M.
  • Andere bevorzugte Bindungsproteine oder -peptide, die bei der Umsetzung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen Gruppierungen, die in der Lage sind, zu pathologisch-proliferierenden normalen Geweben zu lokalisieren, wie Perizyten der intraokularen Gefäßmuskulatur, welche bei degenerativen Augenerkrankungen eine Rolle spielen. Das therapeutische Mittel wird zur Aufnahme mittels solcher Retarddosierungsformen zu den Zielzellen geliefert. Minimalpeptide, mimetische organische Verbindungen und humane oder humanisierte Antikörper, die zu den erforderlichen Effektorzelltypen lokalisieren, sind ebenfalls als Bindungspeptide der vorliegenden Erfindung nützlich. Solche Bindungspeptide können entsprechend bekannter Techniken identifiziert und konstruiert oder isoliert werden. Bevorzugte Bindungspeptide dieser Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung binden an ein Zielepitop mit einer Assoziationskonstante von mindestens etwa 10-6M.
  • Repräsentative "Kopplungs-" oder "Verbindungs-" Verfahren zur Verknüpfung oder Verbindung des therapeutischen Mittels mit dem vaskulären glatten Muskel bindenden Protein über kovalente oder nicht-kovalente Bindungen umfassen chemische Kreuzvernetzungen und heterobifunktionale Quervernetzungsverbindungen (d.h. "Linker"), welche unter Bildung einer Bindung zwischen reaktiven Gruppen wie Hydroxyl-, Amino-, Amido- oder Sulfhydrylgruppen auf einem therapeutischen Mittel und anderen reaktiven Gruppen (ähnlicher Natur) auf dem vaskulären glatten Muskel bindenden Protein reagieren. Diese Bindung kann zum Beispiel eine Peptidbindung, eine Disulfidbrücke, eine Thioesterbindung, eine Amidbindung, eine Thioetherbindung, und Ähnliches sein. In einem veranschaulichenden Beispiel wurden Konjugate von monoklonalen Antikörpern mit Arzneimitteln zusammengefasst von Morgan und Foon (Monoclonal Antibody Therapy to Cancer: Preclinical Models and Investigations, Basic and Clinical Tumor Immunology, Vol. 2, Kluwer Academic Publishers, Hingham, MA), und von Uhr J. of Immunol. 133, i-vii, 1948). In einem anderen veranschaulichenden Beispiel, in dem das Konjugat ein cytostatisches Radionucleid-Mittel umfasst, ist das U.S. Patent Nr. 4,897,255 , Fritzberg et al., sehr instruktiv für Kopplungsverfahren, die nützlich sein können. In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform enthält das therapeutische Konjugat ein vaskulären glatten Muskel bindendes Protein kovalent gekoppelt an ein Trichothecen-Arzneimittel. In diesem Fall kann die kovalente Bindung der Verknüpfung zwischen einer oder mehrerer Amino-, Sulfhydryl- oder Carboxylgruppen des vaskulären glatten Muskel bindenden Proteins und a) Trichothecen selbst, b) einer Trichothecenhemisuccinatcarboxysäure; c) einem Trichothecenhemisuccinat (HS)-N-hydroxysuccinimidatester; oder d) Trichothecen-Komplexen mit Poly-L-Lysin oder einem anderen polymeren Trägerstoff, gebildet sein. Repräsentative Beispiele für Kopplungsverfahren zur Herstellung von therapeutischen Konjugaten, die ein therapeutisches Trichothecenmittel enthalten, sind beschreiben in den U.S. Patenten Nr. 4,906,452 und 4,744,981 . Andere Beispiele, die ein Hydrazid zur Bildung einer Verbindung über eine Schiffsche Base zwischen Bindungsprotein und Trichothecenen verwenden, sind in der anhängigen U.S. Patentanmeldung Nr. 07/415,154 beschrieben, auf die hiermit expressis verbis Bezug genommen wird.
  • Die Auswahl des Kopplungsverfahrens wird beeinflusst durch die Wahl des vaskulären glatten Muskel bindenden Proteins oder Peptids, des interstitielle Matrix bindenden Proteins oder Peptids, und des therapeutischen Mittels, und auch durch solche physikalischen Eigenschaften wie z.B. Lagerstabilität und/oder solche biologischen Eigenschaften wie z.B. Halbwertszeit in Zellen und Blut, innerzellulärer Kompartimentierungsweg, und Ähnliches. Zum Beispiel weisen in einem derzeit bevorzugten therapeutischen Konjugat Hemisuccinatkonjugate des therapeutischen Roridin A-Mittels eine längere Serumhalbwertszeit auf als jene von Verrucarin A, und diese erhöhte Stabilität führt zu einer signifikant erhöhten biologischen Aktivität.
  • Die Retarddosierungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein therapeutisches Mittel, das innerhalb einer nicht-bioabbaubaren oder bioabbaubaren polmeren Struktur dispergiert ist. Solch eine Dispersion wird entsprechend des Verfahrens durchgeführt, das von Cowsar et al., "Poly(Lactide-Co-Glycolide) Microcapsules for controlled Release of Ster01ds, Methods Enzymology, 112:101-116, 1985; Eldridge et al., "Biodegradable and Biocampatible Poly(DL-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres as an Adjuvant for Staphylococcal Enterotoxin B Tox01d Which Enhances the Level of Toxin-Neutralizing Antibodies," Infection and Immunity, 59:2978-2986, 1991; Cohen et al., "Controlled Delivery Systems for Proteins Based an Poly(Lactic/Glycolic Acid) Microspheres", Pharmaceutical Research, 8(6):713-720, 1991; and Sanders et al., "Controlled Release of a Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Analogue from Poly(D,L-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres" J. Pharmaceutical Science, 73(9):1294-1297, 1984.
  • Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Retarddosierungsform der vorliegenden Erfindung sind offen für mehrere alternative Arten einer Anbringung an Bindungsproteine oder -peptide. Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, zum Beispiel über kovalente Verbindungen, intermediäre Liganden-Sandwich-Verbindung, nicht-kovalente Adsorption oder partiellen Einschluss an Bindungsproteine/-peptide zu binden. Wenn die bevorzugten Poly-Milchsäure-/Glycolsäure-Partikulate mit dem therapeutischen Mittel darin dispergiert gebildet werden, ist das ungeladene Polymerrückgrat sowohl nach innen (mit dem quasi lipophilen Mittel darin enthalten) als auch mit einer Mehrzahl der Carboxygruppen nach außen orientiert. Diese Oberflächencarboxygruppen können als kovalente Andockstellen dienen, wenn sie zum Beispiel mittels eines Carbodiimids aktiviert werden, für nukleophile Gurppen des Bindungsproteins/-peptids. Solche nukleophilen Gurppen umfassen Lysin-epsilon-Aminogruppen (Amidverknüpfung), Serinhydroxylgruppen (Esterbindung) oder Cystein-Mercaptangruppen (Thioesterbindung). Reaktionen mit bestimmten Gruppen hängen vom pH-Wert und dem Reduktionsstatus der Reaktionsbedingugen ab.
  • Zum Beispiel reagieren Poly-Milch-/Glycolsäurepartikulate mit terminalen Carboxygruppen mit N-Hydroxybenztriazol in Gegenwart von Wasserlöslichem Carbodiimid der Formel R-N=C=N-R' (wobei R eine 3-Dimethylaminopropylgruppe oder Ähnliches und R' eine Ethylgruppe oder Ähnliches ist). Die Benztriazol-derivatisierten Partikulate (d.h. aktivierte Imidat-tragende Gruppierungen) werden dann mit einer nukleophilen Gruppierung eines Proteins/Peptids wie einer verfügbaren Epsilon-Aminogruppierung zur Reaktion gebracht. Alternativ dazu sind p-Nitrophenol, Tetrafluorphenol, N-Hydoxysuccinimid oder ähnliche Moleküle nützlich zur Bildung eines aktiven Esters mit terminalen Carboxygruppen von Polymilch-/-glycol-säure-Partikulaten in Gegenwart von Carbodiimid. Andere nukleophile Gruppierungen von Bindungsproteinen/-peptiden umfassen Hydroxylgruppen von Serin, endogene freie Thiole von Cystein, Thiolgruppen, die aus der Reduktion von Disulfidgruppen von Bindungsprotein/-peptid resultieren, und zwar unter Verwendung von Reduktionsmitteln, die allgemein für diesen Zweck verwendet werden (z.B. Cystein, Dithiothreitol, Mercaptoethanol und Ähnliche), und Ähnliche. Zusätzlich sind die terminalen Carboxygruppen der Po lymilch-/-glycolsäure-Partikulate aktivierbar durch Reaktion mit Thionylchlorid, unter Bildung einer Acylchloridderivatisierten Gruppierung. Die derivatisierten Partikulate werden dann mit nukleophilen Gruppen von Bindungspeptid/-protein unter Bildung von zielgerichteten Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung zur Reaktion gebracht.
  • Direkte Verbindung von Dosierungsform und Bindeprotein oder -peptid könnte die Zielzellerkennung durch das Bindungsprotein/-peptid zerstören. Liganden-Sandwich-Anbindungstechniken sind nützliche Alternativen, um eine Anbindung von Dosierungsform und Bindungsprotein/-peptid zu erreichen. Solche Techniken umfassen die Bildung einer primären Peptidhülle unter Verwendung eines Proteins, das nicht an die Zielzellpopulation bindet. Das Bindungsprotein/-peptid wird dann an die primäre Peptidhülle gebunden, um dem daraus resultierenden Partikulat ein funktionelles Bindungsprotein/-peptid bereitzustellen. Ein beispielhafter Liganden-Sandwich-Ansatz umfasst die kovalente Anbindung von Avidin oder Streptavidin an das Particulat über funktionelle Gruppen wie oben beschrieben im Hinblick auf den "direkten" Bindungsansatz. Das Bindungsprotein oder -peptid wird derivatisiert, bevorzugt minimal, mit funktionalisiertem Biotin (z.B. über aktive Ester, Hydrazid, Iodacetal, Maleimidyl- oder ähnliche funktionale Gruppen). Die Ligandenanbindung (d.h. Bindungspeptid/-funktionalisiertes Biotin) an die verfügbaren Biotinbindungsstellen auf der primären Avidin/Strepdavidin-Proteinhülle geschieht über die Verwendung einer gesättigten Menge biotiylierten Proteins/Peptids.
  • Zum Beispiel werden Polymilch-/Glycolsäurepartikulate mit terminalen Carbonsäuregruppen mit Carbodiimid activiert und anschließend mit Avidin oder Streptavidin zur Reaktion gebracht. Das Bindungsprotein oder -peptid wird mit Biotinamidocaproat-N-hydroxysuccinimidester bei 1-3-molarem Anbieten von Biotin-enthaltender Verbindung gegenüber dem Bindungspeptid/-protein zur Reaktion gebracht, unter Bildung eines biotinylierten Bindungsproteins/-peptids. Einmolarer Überschuss des biotinylierten Bindungsproteins/-peptids wird mit den Avidin-derivatisierten Partikulaten inkubiert, unter Bildung einer zielgerichteten Dosierungsform der vorliegenden Erfindung.
  • Alternativ dazu werden die Partikulatcarboxygruppen biotinyliert (z.B. durch Carbodiimidaktivierung der Carboxygruppen und anschließende Reaktion mit Aminoalkylbiotinamid). Die biotinylierten Partikulate werden dann mit einer gesättigten Konzentration (d.h. einem molaren Überschuss) von Avidin oder Strepdavidin inkubiert, unter Bildung von Protein-beschichteten Partikulaten mit freien Biotin-Bindungsstellen. Solche beschichteten Partikulate sind dann zur Reaktion mit einem molaren Überschuss an biotinyliertem Bindungsprotein, das wie oben beschrieben gebildet wurde, in der Lage. Eine andere Möglichkeit umfasst Avidin- oder Strepdavidin-gebundene Bindungspeptidbindung an Biotinylierte Partikulate.
  • Zusätzlich dazu kann eine Bindungsprotein/-peptid – Partikulat – Anbindung durch Adsorption des Bindungspeptids an dem Partikulat erreicht werden, welche aus dem nichtionischen Charakter des teilweise exponierten Polymerrückgrats des Partikulats resultiert. Under Bedingungen hoher ionischer Stärke (z.B. 1,0 molar NaCl) werden Wasserstoff- und hydrophobe Bindungen zwischen Partikulat und Bindungsprotein/-peptid favorisiert.
  • Ferner kann das Bindungsprotein/-peptid teilweise in die Partikulat-Polymermatrix nach deren Bildung eingeschlossen sein. Unter diesen Umständen stellt solch ein eingeschlossenes Bindungsprotein/-peptid dem Partikulat einen übrig bleibenden selektiven Bindungscharakter zur Verfügung. Milde Partikulatbildungsbedingungen, wie jene die von Cohen et al., Pharmaceutical Research 8: 713-729 (1991) verwendet werden, sind für diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Solch eingeschlossenes Bindungsprotein ist auch bei der Wiederanbindung eines teilweise degradierten Partikulats, das Exocytose durchgemacht hat, nützlich.
  • Andere polymere Partikulatdosierungsformen (z.B. nichtbioabbaubare Dosierungsformen) mit unterschiedlichen exponierten funktionellen Gruppen können an Bindungsproteine oder -peptide entsprechend den oben diskutierten Prinzipien gebunden werden.
  • Beispielhafte nicht-bioabbaubare Polymere, die in der Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind Polystyrole, Polypropylene, Styrol-Acryl-Copolymere und Ähnliche. Solche nicht-bioabbaubaren Polymere umfassen, oder können so derivatisiert werden, dass sie umfassen, funktionelle Gruppen zur Anbindung von Bindungsprotein/-peptid, einschließlich Carbonsäuregruppen, aliphatische primäre Aminogruppen, aromatische Aminogruppen und Hydroxylgruppen.
  • Funktionelle Carbonsäuregruppen werden an das Bindungsprotein oder -peptid zum Beispiel unter Verwendung des Reaktionsmechanismus' gekoppelt, der oben für bioabbaubare Polymilch-/-glycolsäure-Polymerpartikulatdosierungsformen ausgeführt ist. Funktionelle primäre Aminogruppen werden zum Beispiel über deren Reaktion mit Succinatanhydrid verbunden, unter Bildung einer terminalen Carboxygruppierung, die wie oben beschrieben an ein Bindungsprotein/-peptid gebunden werden kann. Zusätzlich können primäre Aminogruppen mit Cyanogenbromid aktiviert werden und Guanidinverbindungen mit Bindungsprotein/-peptid – primären Aminogruppen bilden. Funktionelle Aromatische Aminogruppen werden mit salpetriger Säure diazotisiert, unter Bildung von Diazoniumgruppierungen, welche mit Tyrosinen von Bindungsprotein/-peptid reagieren und dabei eine Diazoverbindung zwischen nicht-bioabbaubarem Partikulat und dem Bindungsprotein/-peptid erzeugen. Funktionelle Hydroxylgruppen werden zum Beispiel mit primären Aminogruppen vom Bindungsprotein/-peptid verbunden, indem die Hydroxylgruppierung in eine terminale funktionelle Carbonsäuregruppe umgewandelt wird. Solch eine Umwandlung kann über eine Reaktion mit Chloressigsäure, gefolgt von einer Reaktion mit Carbodiimid erreicht werden. Sandwich-, Adsorptions- und Einschlusstechniken, die oben im Hinblick auf bioabbaubare Partikulate diskutiert wurden, sind analog anwendbar auf nicht-bioabbaubare Partikulat-Bindungsprotein/-peptid-Anbindung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zielsteuerung (das "Targeting") spezifisch für potentiell proliferierende Zellen, die zu einem verstärkten glatten Muskel in der Intimalregion der traumatisierten Gefäßstelle führt, z.B. nach Angioplastie, z.B. Pericyten und vaskuläre glatte Muskelzellen. Aspekte der Erfindung beziehen sich auf therapeutische Modalitäten, bei welchen das therapeutische Konjugat der Erfindung verwendet wird, um Proliferation glatter Muskelzellen nach Angioplastie, z.B. PTCA, Atherectomie und perkutane transluminale Rotationscoronaratheroblation, zu verzögern, zu vermindern oder auszumerzen.
  • Die Zielausrichtung ("Targeting") kann auch spezifisch für primäre oder metastasierende Tumorfoci sein, die der lokalen Verabreichung zugänglich sind, z.B. Tumoren, die für eine Infiltration durch Laparotomie zugänglich sind oder die sichtbar sind für Fluoroscopische oder Computer-Tomographie-Leitung und Infusionsnadelverabreichung an interne Tumorfoci oder Tumoren, die auf einen kleinen Bereich oder einen Hohlraum innerhalb des Säugers beschränkt sind, z.B. Eierstockkrebs, der im Abdomen liegt. Aspekte dieses Ansatzes umfassen therapeutische Modalitäten, wobei das therapeutische Mittel cytotoxisch für die Zielzellen ist oder metabolisch die Zellen moduliert, ihre Sensitivität gegenüber Chemotherapie und/oder Strahlungstherapie erhöht.
  • Das Targeting kann auch spezifisch für eine für lokale Verabreichung zugängliche Effektorzellpopulation sein, die in Immunsystem-vermittelte Erkrankungen verwickelt sind, z.B. Arthritis, intraoculare Immunsystem-vermittelte Erkrankungen oder Sprue. Aspekte dieses Ansatzes umfassen therapeutische Modalitäten, bei denen das therapeutische Mittel zytotoxisch ist oder die biologische Antwort der Zielzellen modifizerit, um ein therapeutisches Ziel zu beeinflussen.
  • Das Targeting kann auch spezifisch für eine für lokale Verabreichung zugängliche pathologisch proliferierende normale Zellpopulation sein, die z.B. in degenerative Augenerkrankungen verwickelt ist. Aspekte dieses Ansatzes umfassen therapeutische Modalitäten, bei denen das therapeutische Mittel die Proliferation der Zielzellpopulation vermindert oder ausmerzt.
  • Zur Behandlung einer traumatisierten oder erkrankten Gefäßstelle können die therapeutischen Konjugate oder Dosierungsformen der Erfindung an den Wirt unter Verwendung eines Infusionscatheters verabreicht werden, wie er von C. R. Bard Inc., Billenca, MA, hergestellt wird, oder dem von Wolinsky (7; U.S.-Patent Nr. 4,824,436 ) oder von Seears ( U.S.-Patent Nr. 4,512,762 ) offenbarten. In diesem Fall wird eine therapeutisch wirksame Dosis des therapeutsichen Konjugats typischerweise erreicht, wenn die Konzentration an Konjugat im Flüssigkeitsraum zwischen den Ballons des Katheters im Bereich von etwa 10-3 bis 10-12 M liegt. Es wird aus den Beispielen, die hier bereitgestellt werden, anerkannt werden, dass die therapeutischen Konjugate entsprechend der Erfindung nur in einer therapeutischen Dosis verabreicht werden müssen, die ausreicht, um die proximalen (6 bis 9) Zelllagen der Intimazellen, die das Lumen auskleiden, dem therapeutischen Konjugat auszusetzen, und das ferner diese Dosierung empirisch bestimmt werden kann, z.B. a) indem ein Gefäß von einem geeigneten Tiermodellsystem infundiert wird und immunhistochemische Methoden angewandt werden, um das Konjugat und seine Wirkungen zu detektieren (z.B. wie beispielhaft in den BEISPIELEN unten dargestellt); und b) durch Durchführen geeigneter in vitro Studien, wie sie beispielhaft in den Beispielen 3, 4 und 5 unten dargestellt sind. In einem repräsentativen Beispiel wird diese therapeutisch wirksame Dosis erreicht, indem 10 ml einer 200 μg/ml Lösung aus therapeutischem Konjugat hergestellt wird, wobei das vaskulären glatten Muskel bindende Protein NR-AN-01 und das therapeutische Mittel Roridin A ist, ein Trichothecen-Arzneimittel. Zur Behandlung von vaskulärem Trauma, z.B. als Ergebnis eines chirurgischen Eingriffs oder einer Erkrankung (z.B. s. unten), werden 10 ml, wenn das therapeutische Konjugat mit einem Infusionscatheter verabreicht wird, im Allgemeinen ein ausreichendes Volumen sein, um den Catheter zu füllen und 1 bis 1,5 ml in eine bis drei traumatische Läsionsstellen in der Gefäßwand zu infundieren. Es wird von Fachleuten anerkannt werden, dass wünschenswerte therapeutisch wirksame Dosierungen eines therapeutischen Konjugats entsprechend der Erfindung von mehreren Faktoren abhängig sein werden, einschließlich z.B.:: a) Bindungsaffinität des vaskulären glatten Muskel bindenden Proteins im therapeutischen Konjugat; b) dem atmosphärischen Druck, der während der Infusion angewandt wird; c) der Zeit, über die das verabreichte therapeutische Konjugat am Gefäßort verweilt; d) der Natur des verwendeten therapeutischen Konjugats; und/oder e) der Natur des vaskulären Traumas und der gewünschten Therapie. Jene erfahrenen Fachleute, die darin geübt sind, Arzneimittel bei therapeutisch wirksamen Dosen zu verabreichen (z.B. durch Überwachen von Arzneimittelspiegeln und Beobachten von klinischen Wirkungen bei Patienten), werden die optimale Dosierung für einen individuellen Patienten basierend auf Erfahrung und professionellem Urteilsvermögen bestimmen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Druck von 0,3 atm (d.h. 300 mm Hg) bis etwa 3 atm, der über 15 Sekunden bis zu 3 Minuten direkt auf die Gefäßwand aufgebracht wird, angemessen, um eine Infiltration eines therapeutischen Konjugats, welches das NR-AN-01-Bindeprotein enthält, in die glatten Muskelzelllagen einer Säuger-Arterienwand zu erreichen. Jene Fachleute werden anerkennen, dass die Infiltration des therapeutischen Konjugats in die intimalen Lagen einer erkrankten humanen Gefäßwand wahrscheinlich unterschiedlich sein wird und auf einer individuellen Basis bestimmt werden muss.
  • Retard-Dosierungsformen einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden wohl nur in einer therapeutischen Dosis verabreicht werden müssen, um sicherzustellen, dass die proximalen (6 bis 9) Zelllagen der Tunica media – glatten Muskelzellen, die das Lumen auskleiden, der Dosierungsform auszusetzen. Diese Dosierung kann empirisch bestimmt werden, z.B. durch Infundieren von Gefäßen eines geeigneten Tiermodellsystems und Verwendung von immunhistochemischen, Fluoreszenz- oder Elektronenmikroskopischen Verfahren, um die Dosierungsform und seine Wirkungen zu detektieren; und b) Durchführen geeigneter in vitro Studien. In einem repräsentativen Beispiel wird diese therapeutisch wirksame Dosis erreicht, indem in einer Gewebekultur aus glatten Muskelzellen die preicelluläre Dosierung des Mittels bestimmt wird, welche bei kontinuierlichem Aussetzen zu einer therapeutischen Wirkung zwischen den toxischen und minimalen wirksamen Dosen führt. Dieser therapeutische Spiegel wird in vivo erreicht, indem die Größe, Anzahl und die Konzentration eines therapeutischen Mittels sowie dessen Ausschüttungsrate, welche für Partikulate erforderlich ist, die zwischen die glatten Muskelzellen der Arterienwand infundiert wurden, bestimmt werden, und zwar so, dass diese perizelluläre therapeutische Dosis aufrechterhalten bleibt. Diese Dosierungsform sollte das therapeutische Mittel mit einer Rate ausschütten, die für die nachstehenden beispielhaften therapeutischen Mittel die perizelluläre Dosis in etwa erreicht: von etwa 0,1 bis etwa 0,01 Mikrogramm/ml Nitroglycerin, von etwa 1,0 bis etwa 1000 Mikrogramm/ml Suramin, und von etwa 0,1 bis etwa 105 Nanogramm Staurosporin.
  • Es wird von Fachleuten anerkannt werden, dass wünschenswerte therapeutische Dosierungen der erfindungsgemäßen Dosierungsformen von mehreren Faktoren abhängen werden, einschließelich z.B.: a) Bindungsaffinität des Bindungsproteins, dass an die Dosierungsform gebunden ist; b) atmosphärischer Druck und Dauer der Infusion; c) der Zeit, über die die verabreichte Dosierungsform an der Zielstelle verweilt; d) Der Rate der Ausschüttung von therapeutischem Mittel aus der Partikulatdosierungsform; e) der Natur des verwendeten therapeutischen Mittels; f) der Natur des Traumas und/oder der gewünschten Therapie; und/oder g) des interzellulären und/oder intrazellulären Orts bzw. der Lage der Partikulatdosierungsform. Jene erfahrenen Fachleute, die darin trainiert sind, Arzneimittel bei therapeutisch wirksamen Dosierungen zu verabreichen (z.B. durch Überwachen von Spiegeln von therapeutischem Mittel und Beobachten klinischer Wirkungen in Patienten), sind in der Lage, die optimale Dosierung für einen individuellen Patienten auf der Basis von Erfahrung und professionellem Urteilsvermögen zu bestimmen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind 0,3 atm (d.h. 300 mm Hg) bis etwa 3 atm Druck, aufgebracht auf die Arterienwand über 15 Sekunden bis 3 Minuten, angemessen, um eine Infiltration einer Dosierungsform, die an das NR-AN-01-Bindeprotein gebunden ist, in die glatten Muskelzelllagen einer Säuger-Arterienwand zu erreichen. Wilensky et al., "Direct Intraarterial Wall Injection of Microparticles Via a Catheter: A Potential Drug Delivery Strategy Following Angioplasty" Am. Heart Jour., 122 (4): 1136-1140, 1991. Jene Fachleute werden anerkennen, dass die Infiltration einer Retarddosierungsform in eine Zellpopulation wahrscheinlich unterschiedlich sein wird und auf einer individuellen Basis bestimmt werden muss.
  • Es wird auch anerkannt werden, dass die Auswahl eines therapeutischen Mittels, welches seine Wirkungen intrazellulär ausübt, z.B.. auf Ribosomen oder DNA-Metabolismus, die Dosierung und die Zeit, welche erforderlich sind, um eine therapeutisch wirksame Dosis zu erreichen, beeinflussen wird, und dass dieser Prozess in vitro und in Tierstudien nachgestellt werden kann, wie in solchen, die in den Beispielen unten bereitgestellt werden, um den Bereich von Konzentrationen zu finden, über welche das therapeutische Konjugat oder die Dosierungsform verabreicht werden sollte, um seine Wirkungen des Verzögerns, Verminderns oder Verhinderns der Restenose nach Angioplastie zu entfalten. Zum Beispiel sind therapeutische Konjugate, die mit Alpha-, Beta- oder Gammastrahlern mit bekannten spezifischen Aktivitäten radioaktiv markiert sind (z.B. Millicurie pro Millimol oder Milligramm pro Protein), nützlich zur Bestimmung effektiver Dosierungen, indem sie in Tierstudien und menschlichen Versuchsreihen mit quantitativen Bildverfahren oder Autoradiographie histologischer Gewebeschnitte verwendet werden, um die Konzentration an therapeutischem Konjugat zu bestimmen, welche für das therapeutische Protokoll erforderlich ist. Eine therapeutisch wirksame Dosis des therapeutischen Konjugats oder der Dosierungsform wird erreicht, wenn mindestens drei Bedingungen erfüllt sind, nämlich: (1) das therapeutische Konjugat oder die Dosierungsform wird in die intimalen Lagen des traumatisch verletzten Gefäßes verabreicht; (2) das therapeutische Kojugat oder die Dosierungsform wird innerhalb der gewünschten intrazellulären Kompartimente der glatten Muskelzellen verteilt, d.h. dieses Kompartiment ist für die Wirkung des therapeutischen Mittels erforderlich, oder das therapeutische Mittel wird von der Dosierungsform extrazellulär ausgeschüttet und wird innerhalb des relevanten intrazellulären Kompartiments verteilt; und (3) das therapeutische Mittel inhibiert die gewünschte zelluläre Aktivität der vaskulären glatten Muskelzelle, z.B. Proliferation, Migration, Erhöhung des Zellvolumens, Matrixsynthese und Ähnliche, wie oben beschrieben.
  • Es wird anerkannt werden, dass die therapeutische Dosierung, die erforderlich ist, um die gewünschte inhibitorische Aktivität für eintherapeutisches Konjugat oder eine Dosierungsform zu erreichen, wenn das therapeutische Konjugat oder die Dosierungsform mit einem Infusionscatheter verabreicht wird, auch über die Verwendung von in vitro Studien vorhergesehen werden kann. In einem bevorzugten Aspekt kann der Infusionskatheter bequem ein Doppelballon- oder Vierfachballoncatheter mit einer permeablen Membran sein. In einer repräsentativen Ausführungsform ist eine therapeutisch wirksame Dosis eines therapeutischen Konjugats oder einer solchen Dosierungsform nützlich bei der Gehhandlung eines vaskulären Traumas, das aus einer Erkrankung (z.B. Atherosklerose, Aneurisma, oder Ähnliches) oder einem gefäßchirurgischen Verfahren wie Angioplastie, Arthrectomie, Setzen eines Stents (z.B. in ein Gefäß), Thrombectomie, und Transplantation, herrührt. Arthrectomie (auch: Arthrectomia) kann zum Beispiel durchgeführt werden durch chirurgischen Schnitt, Ultraschall- oder Laserbehandlung, oder durch Hochdruckflüssigkeitsfluß. Transplantation kann zum Beispiel durch vaskuläre Transplantation unter Verwendung von natürlichen oder synthetischen Materialien oder die chirurgische Anastomose von Gefäßen z.B. während Gefäßtransplantation durchgeführt werden. Fachleute werden erkennen, dass die geeignete therapeutische Dosierung bei einem gegebenen chirurgischen Verfahren (s. oben) in in vitro und in vivo Tiermodellstudien bestimmt werden kann und in präklinischen humanen Versuchsreihen. In den unten bereitgestellten Beispielen erreichte ein therapeutisches Konjugat, das Roridin A und NR-AN-01 enthielt, eine therapeutisch wirksame Dosis in vivo bei einer Konzentration welche in Testzellen in vitro zelluläre Proteinsynthese inhibierte, und zwar um mindestens 5 bis 50 Prozent, wie aus dem Einbau radioaktiv markierter Aminosäuren geschlossen.
  • Im Falle therapeutischer Mittel von Konjugaten oder Dosierungsformen, die antimigratorische oder anti-Matrix Mittel enthalten, kann die Zellmigration und Zelladhärenz jeweils in in vitro Assays zur Bestimmung der Konzentration verwendet werden, bei welcher eine therapeutisch wirksame Dosierung in dem Flüssigkeitsraum erreicht würde, welcher durch den Infusionscatheter in der Gefäßwand erzeugt wird.
  • Während eine repräsentative Ausführungsform sich auf therapeutische Verfahren, die einen Infusionscatheter verwenden, bezieht, wird anerkannt werden, dass andere Verfahren zur Verabreichung von Arzneimitteln oder andere Wege der Verabreichung auch nützlich sein können, z.B. Injektion über den intravenösen, intralymphatischen, intrathecalen, oder andere Wege. Zur intravenösen Verabreichung werden nanopartikuläre Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Die intravenöse Verabreichung von Nanopartikulaten ist zum Beispiel nützlich, wenn die vasculäre Permeabilität in Tumoren zum Hindurchlecken erhöht ist, insbesondere in nekrotischen Bereichen von Tumoren mit beschädigten Gefäßen, welche das Hindurchlecken von Partikeln in die interstitielle Flüssigkeit erlauben, und wo Arterienwände blossgelegt und traumatisiert wurden, was den Partikeln Eintritt gewährt in die interstitiellen Bereiche der Tunica media.
  • Vorteilhafterweise wird nicht-gekoppeltes vaskulären glatten Muskel bindendes Protein (z.B. freier NR-AN-01-Antikörper) vor der Verabreichung des therapeutischen Mittel-Konjugats oder der Dosierungsform verabreicht, um einen Blocker für nichtspezifische Bindung an kreuzreaktive Stellen bereitzustellen. Das Blockierung solcher Stellen ist wichtig, weil vaskulären glatten Muskel bindende Proteine im allgemeinen zu einem geringen Grad eine Kreuzreaktivität mit Zellen in Geweben aufweisen werden, die nicht die gewünschten glatten Muskelzellen sind. Solch ein Blockieren kann die lokale Beschränkung des therapeutischen Konjugats oder der Dosierungsform auf die spezifische Gefäßstelle verbessern, z.B. indem mehr therapeutisches Konjugat den Zellen zur Verfügung gestellt wird. Als Beispiel wird nicht-gekoppeltes vaskulären glatten Muskel bindendes Protein etwa 5 Minuten bis 48 Stunden, insbesondere bevorzugt 5 Minuten bis 30 Minuten, vor der Verabreichung des therapeutischen Konjugats oder der Dosierungsform verabreicht. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der nichtmarkierte spezifische "Blocker" eine monovalente oder bivalente Form eines Antikörpers (z.B. ein ganzer Antikörper oder ein F(ab)'2-, Fab, Fab', oder Fv-Fragment eines Antikörpers). Die monovalente Form des Antikörpers hat den Vorteil, dass eine Fehllokalisierung des therapeutischen Kojugats oder der Dosierungsform verhindert wird, während das Blockieren der nichtspezifischen kreuzreaktiven Stellen maximiert wird. Das nicht-gekoppelte vaskulären glatten Muskel bindende Protein wird in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, die Bindung an mindestens einem Teil der nichtspezifischen kreuzreaktiven Stellen in einem Patienten zu blockieren. Die Menge kann abhängig von solchen Faktoren wie Patientengewicht und der Natur des Bindeproteins variieren. Im Allgemeinen werden etwa 0,06 mg bsi 0,20 mg pro kg Körpergewicht oder mehr des unmarkierten spezifischen Blockers an einen Menschen verabreicht.
  • Zusätzlich kann wahlweise ein zweites irrelevantes vaskuläre glatte Muskelzellen bindendes Protein vor der Verabreichung des therapeutischen Konjugats oder der Dosierungsform an einen Patienten verabreicht werden, um nichtspezifische Bindung des therapeutischen Konjugats oder der Dosierungsform an Gewebe zu vermindern. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das irrelevante Bindeprotein ein Antikörper sein, welcher nicht an Stellen in dem Patienten über Antigen-spezifische Bindung, aber stattdessen auf eine nichtspezifische Weise bindet, z.B. über die Bindung von Fe-Rezeptor-bindenden Reticuloendothelialen Zellen, Asialo-Rezeptor-Bindung, und durch Bindung an Ubiquitin-exprimierende Zellen. Der irrelevante "Blocker" vermindert die nicht-spezifische Bindung des therapeutischen Konjugats oder der Dosierungsform und vermindert so Nebenwirkungen, z.B. Gewebetoxizität, die mit der Verwendung des therapeutischen Konjugats oder der Dosierungsform einhergeht. Der irrelevante Blocker wird vorteilhafterweise 5 Minuten bis 48 Stunden, insbesondere 15 Minuten bis eine Stunde vor der Verabreichung des therapeutischen Konjugats oder der Dosierungsform verabreicht, obwohl die Zeitspanne abhängig von dem therapeutischen Konjugat und dem Weg oder dem Verfahren der Verabreichung unterschiedlich sein kann. Repräsentative Beispiele irrelevanter "Blocker" umfassen Antikörper, die mit keinem humanen Gewebe und keinen Rezeptoren oder zellulären oder Serumproteinen, die von tierischen Quellen hervorgebracht werden reaktiv sind, die bei einer Testung nicht auf spezifische Weise (z.B. mit einem Ka < 103M-1) an humane Zellmembranziele binden.
  • Es wird anerkannt werden, dass die Konjugate und Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung nicht auf ihre Verwendung für Therapie nach Angioplastie eingeschränkt sind; vielmehr wird die Nützlichkeit der therapeutischen Konjugate und Dosierungsformen durch ihre Fähigkeit vorgeschrieben, zelluläre Aktivitäten von glatten Muskelzellen und Perizyten in der Gefäßwand zu inhibieren. Daher umfassen andere Aspekte der Erfindung therapeutische Konjugate und Dosierungsformen und Protokolle, die bei frühen therapeutischen Interventionen zur Verminderung, Verzögerung oder zum Ausmerzen (und sogar Umkehren) von atherosklerotischen Plaques und Bereichen von Gefäßwandhypertrophie und/oder Hyperplasie nützlich sind. Therapeutische Kojugate und Dosierungsformen der Erfindung finden auch eine Anwendung bei der frühen Intervention bei präatherosklerotischen Zuständen, z.B. sind sie nützlich bei Patienten mit einem hohen Risiko, Atherosklerose zu entwickeln, oder bei Anzeichen von Bluthochdruck als Ergebnis atherosklerotischer Veränderungen in Gefäßen oder bei Gefaßstenose aufgrund von Hypertrophie der Gefäßwand.
  • Die therapeutischen Konjugate und Dosierungsformen der Erfindung können auch bei therapeutischen Modalitäten zum Verstärken des Wiederwachstums von Endothelzellen bei verletzten Gefäßgeweben und bei vielen Arten von Wundstellen, einschließlich Epithelwunden, verwendet werden. Bei diesen therapeutischen Modalitäten finden die therapeutischen Konjugate und Dosierungsformen der Erfindung eine Anwendung bei der Hemmung der Migration und/oder Proliferation von glatten Muskelzellen oder Perizyten. Glatte Muskelzellen und Perizyten wurden in vitro mit der Herstellung von Faktoren in Verbindung gebracht, die endotheliale Zellproliferation inhibieren, und ihre Proliferation kann auch aus einer physischen Barriere resultieren, um ein kontinuierliches Endothel zu etablieren. Daher finden die therapeutischen Konjugaate und Dosierungsformen der Erfindung eine Anwendung bei der Förderung der Neoangiogenese, z.B. während der Wundheilung, bei Gefäßtransplantationen und nach gefäßchirurgischen Eingriffen.
  • Noch weitere Aspekte der Erfindung beziehen sich auf therapeutische Modalitäten zur Verbesserung der Wundheilung an einer Gefäßstelle und Verbessern der strukturellen und elastischen Eigenschaften von geheilten Gefäßgeweben. Bei diesen therapeutischen Modalitäten verbessert das Verwenden des therapeutischen Kojugats oder der Dosierungsform der Erfindung, d.h. das Hemmen der Migration und Proliferation von glatten Muskelzellen oder Perizyten in einer Gefäßwand, die Stärke und die Qualität der Heilung der Gefäßwand. Glatte Muskelzellen an der Stelle der Gefäßwunde tagen zum normalen Prozess der Kontraktion der Wundstelle bei, was die Wundheilung fördert. Es besteht derzeit die Annahme, dass die Migration und Proliferation glatter Muskelzellen von diesem normalen Prozess wegleiten und die strukturellen und elastischen Langzeiteigenschaften des geheilten Gefäßes stören könnte. Daher sorgen andere Aspekte der Erfindung für therapeutische Konjugate und Dosierungsformen, die die Migration und Proliferation von glatten Muskelzellen und Perizyten inhibieren und die Qualität der geheilten Gefäßmuskulatur verbessern.
  • Verfahren zur Behanldung von Krebs und Immunsystem-vermittelten Erkrankungen über lokale Verabreichung von zielausgerichteten ("targeted") Partikulatdosierungsformen können ebenfalls von den hierin beschriebenen Konzepten profitieren. Die Partikulatdosierungsform wird zum Beispiel lokal in primäre oder metastatische Foci von Krebszielzellen verabreicht. Die lokale Verabreichung wird bevorzugt unter Verwendung einer Infusionsnadel oder über den intraluminalen Weg durchgeführt, wodurch die Partikulatdosierungsform in die interzelluläre Region des Tumorgewebes oder in eine Lumenflüssigkeit, die die Tumorzellen umgibt, infundiert wird.
  • Die Einführung in primäre Foci wird bevorzugt im Hinblick auf Zielzellen durchgeführt, die im Allgemeinen auf bestimmte abgeschlossene Bereiche innerhalb eines Säugers beschränkt sind, z.B. Eierstockcarcinome, die in der Abdomenhöhle liegen. Die Dosierungsform der vorliegenden Erfindung bindet an die Zielzellpopulation und wird wahlweise von diesen aufgenommen, zur Ausschüttung des therapeutischen Mittels über eine Zeit[spanne]. Die lokale Verabreichung von Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung an solchen primären Foci führt zu einer lokalisierten Wirkung auf solche Zielzellen mit eingeschränktem Aussetzen des therapeutischen Mittels gegenüber anderen sensitiven Organen, z.B. dem Knochenmark und den Nieren.
  • Wenn metastatische Foci die Zielzellpopulation darstellen werden die verabreichten Mikropartikel und größere Nanopartikel primär an die Zielzellen gebunden, die nahe der Infusionsstelle liegen, und sie werden wahlweise zur Ausschüttung des therapeutischen Mittels von diesen aufgenommen, wodurch ein markierter und lokalisierter Effekt auf die Zielzellen erzeugt wird, welche direkt die Infusionsstelle umgeben. Zusätzlich folgen kleinere Nanopartikel interstitiellem Flüssigkeitsstrom oder lymphatischen Drainagekanälen und binden an Zielzellen, die weiter entfernt von der Infusionsstelle sind und lymphatisches Metastasieren durchmachen.
  • Die zielausgerichteten Dosierungsformen können in Kombination mit allgemeiner verwendeter Immunkonjugattherapie verwendet werden. Auf diese Weise erzielt das Immunkonjugat eine systemische Wirkung innerhalb der Grenzen der systemischen Toxizität, während die Dosierungsform der vorliegenden Erfindung eine konzentrierte und dauerhafte Dosis therapeutisches Mittel an die primären und metastatischen Foci liefert, welche häufig eine unzureichende therapeutische Dosis bei einer solchen "systemischen" Immunkonjugatverabreichung alleine erhalten, und vermeidet oder minimiert so systemische toxische Effekte.
  • Wo die Zielzellpopulation über lokale Verabreichung erreicht werden kann werden die Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet, um Immunsystem-vermittelte Krankheiten zu kontrollieren. Beispielhaft für solche Erkrankungen sind Arthritis, Sprue, Uveitis, Endophthalmitis, Keratitis und Ähnliche. Die Zielzellpopulationen, die in diese Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwickelt sind, sind auf eine Körperhöhlung oder einen Körperraum beschränkt, wie Gelenkkapseln, Pleura- und Abdomenhöhle, Auge und subconjunktivaler Raum. Eine lokale Verabreichung wird bevorzugt unter Verwendung der Infusionsnadel für einen intrapleuralen, intraperitonealen, intraocularen oder sub-conjunktivischen Verabreichungsweg durchgeführt.
  • Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt eine intensivere, lokalisierte Modulation der Immunsystemzellen bereit, mit minimalen Wirkungen auf die systemischen Immunsystemzellen. Wahlweise werden die systemischen Zellen des Immunsystems simultan behandelt mit einem chemotherapeutischen Mittel, das mit einem Bindungsprotein oder -peptid verbunden ist. Solch ein Konjugat penetriert bevorzugt aus dem vaskulären Lumen heraus die Zielimmunsystemzellen.
  • Die lokale Verabreichung der Dosierungsform kann auch lokal auf normales Gewebe gerichtet sein, das zur Proliferation stimuliert wurde, und vermindert eine solche pathologische Proliferation dabei oder merzt sie aus. Ein Beispiel für diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die intraokulare Verabreichung einer Partikulatdosierungsform, die mit einem Bindeprotein oder -peptid beschichtet ist, welches auf Perizyten von neovaskularisierendem Gewebe ausgerichet ist. Die Proliferation dieser Perizyten verursacht degenerative Augenerkrankung. Bevorzugte Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung setzen Verbindungen frei, die in der Lage sind, die pathologische Proliferation der Zielzellpopulation zu unterdrücken.
  • Die Erfindung wird durch Bezugnahme auf die nachfolgenden spezifischen Beispiele besser verstanden werden.
  • BEISPIEL 1
  • Bindung an vaskuläre glatte Muskelzellen in der Blutgefäßwand in vivo
  • 1A und B veranschaulichen die Bindung von NR-AN-01 (einem Maus-IgG2b-MAb ["MAb" = "monoclonal Antibody" = monoklonaler Antikörper] an die glatten Muskelzellen in der Gefäßwand einer Arterienwand bei einem normalen 24-jährigen männlichen Patienten, vier Tage nach der i.v. Verabreichung von NR-AN-01; 1A ist unmarkiert, 1B ist mit den Identifiern #1 und #2 markiert, wie unten beschrieben. 1 ist eine mikroskopische Aufnahme eines histologischen Schnittes durch die mediale Region einer Arterienwand des Patienten nach NR-AN01-Verabreichung, wobei der Schnitt ex vivo mit HRP-gebundenem Ziege-anti-Maus-IgG zur Reaktion gebracht wurde. Die Reaktion des HRP-Kojugates mit NR-ML-05-MAb wurde durch Zugabe von 4-Chlor-1-naphtol als Peroxidasesubstrat sichtbar gemacht. Das Reaktionsprodukt des Substrats bildet einen unlöslichen tiefvioletten Niederschlag an der Reaktionsstelle (gezeigt bei #1, 1). Eine Gegenfärbung wurde verwendet, um kollagenöses extrazelluläres Matrixmaterial sichtbar zu machen (gezeigt bei #2, 1). Glatte Muskelzellen werden bei der mikroskopischen Untersuchung als tiefviolett-gefärbte Zellen sichtbar. Diese mikroskopische Aufnahme zeigt die Fähigkeit des MAb, spezifisch an humane vaskuläre glatte Muskelzellen in vivo zu binden, und von den Zellen aufgenommen zu werden und über längere Zeitspannen in den Zellen verbleiben zu können.
  • BEISPIEL 2
  • Therapeutische Konjugate mit therapeutischen Trichothecen- Mitteln
  • Konjugate aus NR-AN-01 und Roridin A wurden konstruiert, indem ein Hemisuccinatderivat des Trichothecencytotoxins (wie untern beschrieben) an einen monoklonalen Antikörper, der als NR-AN-01 bezeichnet wird, gekoppelt wurde. Zwei Konjugate wurden hergestellt, eines gekoppelt an die Roridin A2'-Position, und eines an die 13'-Position. Es wurden zwei Schemata bei dieser Synthese verwendet, wie in 2 und 3 dargestellt. Das Konjugat wurde dann von nichtreagiertem Roridin A über eine PD-10 SEPHAROSE-Säule (Pharmacia; Piscatawy, N.J.) gereinigt, durch Größenexklusionshochdruckflüssigchromatografie untersucht, und die Säulenfraktionen wurden mittels SDS-PAGE und isoelektrische Fokussierung (IEF), wie unten beschrieben, charakterisiert.
  • 2 zeigt diagrammartig das erste Reaktionsschema zur Synthese von Roridin A-Hemisuccinylsuccinimidat (RA-HS-NHS) über einen zweistufigen Prozess mit den Reagenzien: Succinatanhydrid, Triethylamin (NEt3) und Dimethylaminopyridin (DMAP), die bei Raumtemperatur (RT) in Dichlormethan (CH2Cl2) vorlagen; und N-hydroxysuccinimid (NHS) und di-Cyclohexylcarbodiimid (DCC), ebenfalls in CH2CL2 bei RT.
  • 3 zeigt diagrammartig das zweite Reaktionsschema zur Synthese von Roridin A-Hemisuccinylsuccinimidat (RA-IS-NHS) über einen fünfstufigen Prozess mit den Reagentien: t-Butyldimethylsilylchlorid (TBMS-Cl) und Imidazol in Dimethylformamid (DMF) bei Raumtemperatur (RT); Essigsäureanhydrid, Triethylamin (TEA), und Diethylaminopyridin in Dichlormethan (CH2Cl2) bei RT; Succinatanhydrid, Triethylamin (TEA) und Dimethylaminopyridin (DMAP) in (CH2Cl2) bei RT; und N-Hydroxysuccinimid (NI-IS) und Dicyclohexylcarbodiimid (DCC).
  • Synthese von 2'-Roridin-A-Hemisuccinat (2):
  • Zu 0,5g (0,94 mmol) RoridinA werden 15 ml Dichlormethan gegeben. Zu dieser Lösung wurden unter Rühren 0,104 g (1,04 mmol) Succinatanhydrid gegeben. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 0,2 ml Triethylamin in 5 ml Dichlormethan gegeben. Zu dem homogenen Reaktionsgemisch wurde eine katalytische Menge Dimethylaminopyridin gegeben und es wurde bei RT für 15 Stunden gerührt. Der Vollendung der Reaktion wurde mittels Dünnschichtchromatografie gefolgt (CH2Cl2:CH3OH = 9,7:0,3 mit einigen wenigen Tropfen Essigsäure). Am Reaktionsende wurden 0,3 ml Eisessig hinzugegeben und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgezogen. Der getrocknete rohe Rest wurde zwischen Wasser und Methylenchlorid getrennt. Die vereinigten Methylenchloridextrakte (3 × 50 ml) wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel unter Vakkum abgezogen und es wurde bis zu einem Ertrag von 0,575 g (96%) eines rohen Gemisches aus drei Verbindungen getrocknet. Präparative C18-HPLC-Trennung des rohen Gemisches in 50% Acetonitrid-Wasser mit 2% Essigsäure führte zu einem Ertrag von 0,36 g (60%) von 2 als weißer Feststoff.
  • Synthese von Succinimidyl-2'-Roridin A-Hemisuccinat (3):
  • Zu 0,3 g (0,476 mmol) 2'-Roridin A-Hemisuccinat in 30 ml Dichlormethan wurden 0,055 g (0,478 mmol) N-Hydoxysuccinimid gegeben. Zu dem klaren Reaktionsgemisch wurden 0,108 g (0,524 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid hinzugegeben. Das Reaktiongemisch wurde bei Raumtemperatur 6 Stunden gerührt. Die Vollendung der Reaktion wurde mittels Dünnschichtchromatografie (TLC) gefolgt (CH2Cl2:CH3OH = 9,7:0,3 mit ein paar Tropfen Essigsäure als Entwickler). Einige wenige Tropfen Eisessig wurden zum Reaktionsgemisch hinzugegeben und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgezogen. Zu dem getrockneten Rest wurde Dichlormethan gegeben und das gefällte DCU wurde filtriert. Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck aus dem Niederschlag abgezogen, was zu einem Ertrag eines weißen Feststoffes führte. Aus dem Rohprodukt wurden durch präparative HPLC in 50% Acetonitid mit 2% Essigsäure als mobiler Phase 0,208 g (60%) von 3 gereinigt.
  • Synthese von 13'-t-Butyldimethylsilyl-Roridin A (4):
  • Zu 72,3 mg (0,136 mmol) Roridin A in 0,5 ml Dimethylformamidlösung wurden 0,055 g (0,367 mmol) t-Butydimethylsilylchloridlösung, 0,055 g (0,367 mmol) Imidazol gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 15 Stunden gerührt. Die Vollendung der Reaktion wurde auf Silicageldünnschichtchromatografie unter Verwendung von 1% MeOH-CHCl3 als Entwickler verfolgt. Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch wurde wurde unter Vakuum abgezogen und es wurde getrocknet. Das Rohprodukt wurde durch Blitzchromatografie unter Verwendung von EtOAc:Hexan (1:3) als Elutionsmittel gereinigt. Lösungsmittel aus den Eluaten wurde unter vermindertem Druck abgezogen, unter Erhalt von 0,66 g (75%) von 4 als Feststoff.
  • Synthese von 13'-t-Butyldimethylsilyl-2'-acetyl-Roridin A (5):
  • Zu 0,1 g (0,155 mmol) 13'-t-butyldimethylsilylroridin A in 10 ml Dichlormethan wurden 0,3 ml Essigsäureanhydrid, 0,2 ml Triethylamin und einige wenige Kristalle Dimethylaminopyridn gegeben und bei Raumtemperatur für 2 Stunden gelagert. Die Vollendung der Reaktion wurde mittels TLC in 1% Methanol-Methylenchlorid als Entwickler verfolgt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgezogen und es wurde über eine Silicagelsäule unter Verwendung von 1% Methanol-Chloroform als Elutionsmittel gereinigt. Lösungsmittel aus den Eluaten wurde unter Vakuum abgezogen, unter Erhalt von 0,085 g (80%) von 5 als Feststoff.
  • Synthese von 2'-Acetyl-Roridin A (6):
  • Zu 0,05 g (0,073 mmol) 2'-Acetyl-13'-t-butyldimethylsilyl-Roridin-A in 5 ml Tetrahydrofüran wurden 0,3 ml einer 1 M Tetrabutyl-ammoniumfluorid-Lösung in THF gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt. Die Vollendung der Reaktion wurde mittels Silicageldünnschichtchromatografie verfolt, unter Verwendung von 1% MeOH-CHCl3 als Entwickler. Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck abgezogen und es wurde getrocknet. Das Rohprodukt wurde auf einer Silicagelsäule unter Verwendung von 1% CH3OH-CHCl3 als Elutionsmittel gereinigt. Lösungsmittel aus den vereinigten Eluaten urden unter Vakuum abgezogen, unter Erhalt von 0,020 g (48%) von 6 als Feststoff.
  • Synthese von 2'-Acetyl-13'-hemisuccinyl-Roridin-A (7):
  • Zu 0,05 g (0,087 mmol) 2'-Acetyl-Roridin-A in 1 ml Dichlormethan wurden 0,025 g (0,25 mmol) Succinatanhydrid und 35 ml Triethylamin gegeben. Einige wenige Kristalle Dimethylaminopyridin wurden als Katalysator hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden getrocknet. Die Vollendung der Reaktion wurde mittels Dünnschichtchromatografie unter Verwendung von 5% MeOH-CH2Cl2 als Entwickler verfolgt. Am Ende der Reaktion wurden 30 ml Eisessig hinzugegeben. Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck abgezogen und es wurde getrocknet. Das Rohprodukt wurde zwischen Wasser und Ethylacetat getrennt. Lösungsmittel aus den vereinigten Ethylacetatfraktionen wurde unter vermindertem Druck abgezogen. Rohprodukt wurde gereinigt, indem es über eine Silicagelsäule geleitet wurde, unter Erhalt von 0,039 g (66%) von 7 als weißer Feststoff.
  • Synthese von Succinimidyl-2'-acetyl-13'-Roridin A-Hemisuccinat (8):
  • Zu 0,036 g (0,0050 mmol) 2'-Acetyl-13'-Roridin A-Hemisuccinat in 2 ml Dichlormethan wurden 0,009 g (0,09 mmol) N-Hydroxysuccinimid gegeben. Zu einer gerührten Lösung wurden 0,012 g (0,059 mmol) Dicyclohexylcarbondiimid gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 8 Stunden gerührt. Die Vollendung der Reaktion wurden mittels Silicageldünnschichtchromatografie verfolgt, unter Verwendung von 5% MeOH-CH2Cl2 als Entwickler. Einige wenige Tropfen Eisessig wurden zum Reaktionsgemisch hinzugegeben. Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck abgezogen und es wurde getrocknet. Das Rohprodukt wurde auf einer Silicagelsäule unter Verwendung von 5% MeOH-CH2Cl2 als Entwickler gereinigt. Lösungsmittel aus den vereinigten Eluaten wurde unter Vakuum abgezogen, unter Erhalt von 0,025 g (61%) von 8 als weißer Feststoff.
  • Konjugation (Bindung) von Succinimidyl-2'-Roridin A-Hemisuccinat (3) und Succinimidyl-2'-Acetyl-13'-Roridin A-Hemisuccinat (8) mit vollständigem NR-AN-01-Antikörper (MAb):
  • Die Konjugation wurde bei pH 8,0 in Boratpuffer in Anwesenheit von 25% Dimethylsulfoxid (DMSO)- Lösungsmittel bei Raumtemperatur und unter sanftem Mischen über 45 Minuten vor der Reinigung durch Gelpermeationschromatografie durchgeführt. Das molare Verhältnis Arzneimittelvorläufer zu Antikörper betrug 25:1 und 40:1 für die 2'- bzw. 13'-Roridin A- Analoga (3 bzw. 8). Die Antikörperkonzentration betrug während der Konjugationsreaktion 0,9 bis 1,0 mg/ml.
  • Eine typische 2'-Analogon (3) – Reaktion mit 25 mg Antikörper was die folgende:
  • Zu 4,7 ml 5,3 mg Ab/ml in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, d.h. PBS; 150 mM NaCl, 6,7 mM Phosphat, pH 7,3) wurden 10 ml PBS und 5 ml Boratpuffer (0,5M, pH 8,0) gegeben. Unter sanftem Rühren wurden dann 6,3 ml DMSO enthaltend 1,73 mg Succinimidy-2'-Roridin-A-hemisuccinat (3) gegeben, und zwar tropfenweise über eine Zeitspanne von 15 Sekunden.
  • Reinigung:
  • Zur Reinigung wurden ml – Reaktionsaliquots auf Pharmacia PD-10-Sepharose-Säulen aufgebracht, die in PBS äquilibriert waren. Das eluierte Konjugat wurde in 2,4 bis 4,8 ml Fraktionen aufgefangen. DIe PD-10-gereinigten Konjugataliquots wurden dann vereinigt und auf einem Amicon PM-10 DiAflo-Konzentrierer auf 1,5 bis 2,0 mg Ab/ml aufkonzentriert, über eine 0,2 μ Gelman Acrodisc sterilfiltriert und in sterile Glassgefäße mit 5 ml Volumen gefüllt. Das 2'-Konjugat wurden schockgefroren in flüssigem Stickstoff und dann bis zur Verwendung bei -70°C gelagert. Das 13'-Roridin-A-NR-AN-01-Konjugat wurde gefroren oder gekühlt (d.h. 5-10°C) gelagert.
  • Charakterisierung der Konjugate:
  • Die Proteinkonzentration wurde mittels eines BCA-Assays unter Verwendung der Kupferreagenzmethode bestimmt (Pierce Chemical Corp.).
  • Die Untersuchung des Ausmaßes bzw. Grades der Antikörperdrivatisierung wurde durchgeführt, indem zuerst ein Aliquot Konjugat in 0,2 M Carbonat pH 10,3 für 4 Stunden hydrolysiert wurde (bei RT für das 2'-Konjugat und bei 37°C für das 13' Konjugat), gefolgt von einer Filtration durch eine PM-30-Membran. Das Filtrat wurde dann auf Roridin A in untersucht, und zwar auf einer C18-Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer mobilen Phase aus 50:48:2 CH3CN:H2O:HOAc. Ein 1,32-facher Korrekturfakto wurde verwendet, um im Hinblick auf die parallelen Abbau von makrozyklischen Ringen zu korrigieren, die polare Produkte während der Hdrolyse des 13'-Konjugats gleichzeitig ergibt.
  • Eine Größenexklusionschromatografie auf einer DuPont Zorbax HPLC und eine isoelektrische Fokussierung unter Verwendung von Serva Gelplatten (pH 3 bis 10) wurde ebenfalls durchgeführt. Es wurde kein Anzeichen einer Aggregation bei der HPLC beobachtet.
  • Immunoassays der Roridin-A-Antikörperkonjugate wurden entweder mittels kompetitiven ELISA-Assays unter Verwendung von biotinylierten Ab mit Streptavidin/Peroxidasedetektion, oder unter Verwendung eines kompetitiven Zellbindungsassays unter Verwendung von 125-markiertem Antikörper, durchgeführt. Alternative Immunreaktivität wurde unter Bedingungen einer Antigensättigung in einem Zellbindungsassay gemessen, wobei der Antikörper zuerst zur Verfolgung mit I-125 mittels des Chloramin-T-Verfahrens markiert und anschließend mit den 2'- und 13'-Roridin A-Vorläufern derivatisiert wurde.
  • BEISPIEL 3
  • Kinetik der Bindung an glatte Muskelzellen
  • Zur Verabreichung mittels eines i.v. Katheters ist es wünschenswert, dass das therapeutische Konjugat der Erfindung in weniger als 3 bis 5 Minuten verabreicht ist, so dass der Blutfluss im Patienten wiederhergestellt werden kann. Daher wurden Studien durchgeführt, um die Bindungskinetik von vaskulären Muskel bindenden Proteins zu bestimmen, mit einem Ka von 109 Liter/Mol. Daher wurden Studien durchgeführt. Weil humane vaskuläre glatte Muskelzellen in Kultur langsam wachsen und man herausgefunden hat, dass glatte Muskelzellen von Pavianen den humanen CSPG Zelloberflächenmarker exprimieren, wurden BO54-Pavian-Arterienglattemuskelzellen und humane A375 M/M (Melanom; ATCC # CRL1619)-Zellen, die den CSPG-Oberflächenmarker tragen, bei vielen der Studien, die in den Beispielen unten beschrieben sind, verwendet.
  • Für die kinetischen Bindungsstudien wurden A375 M/M und BO54-Zellen in sterile Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit 2500 Zellen/Vertiefung gesät. Platten wurden in Aluminiumfolie eingewickelt und bei 37°C über Nacht in befeuchteter Atmosphäre mit 5% CO2/95% Luft inkubiert. Nach etwa 18 Stunden Inkubation wurden die Platten herausgenommen und die Zellen wurden mit 0,05% Glutaraldehyd für 5 Minuten fixiert, um Membranaustausch zu verhindern. Nach der Fixierung wurden die Platten ausgiebig mit PBS enthaltend 0,5% Tween-20 gewaschen. Serielle zweifache Verdünnungen eines NR-AN-01 therapeutischen Konjugats enhaltend Roridin A wurden mit Proteinkonzentrationen von 10 mg/ml bi 20 ng/ml erstellt, und jede Verdünnung wurde in zwei Vertiefungen aliquotiert. Die Platten wurden über Nacht bei 4°C mit dem NR-AN-01 für 5, 15, 30 und 60 Minuten inkubiert, wonach das ungebundene Protein durch Absaugen entfernt wurde und 100 ml CS-Puffer (5% Hühnerserun/0,5% Tween 20 in PBS) zu jeder Vertiefung hinzugegeben wurden. CS-Puffer wurde entfernt und das therapeutische NR-AN-01-Konjugat, das an die Zellen gebunden war, wurde durch Zugabe von 100 ml HRP-konjugiertem Ziege-anti-Maus-IgG (Sigma Chemical CO., St. Louis, MO.) zu jeder Vertiefung; Inkubieren bei 4°C für 1 Std.; Waschen mit PBS/0,05% Tween zum Entfernen von ungebundenem Ziege-IgG; und Zugabe von ABTS chromogenem Substrat (d.h. für HRP) sichtbar gemacht. Nach Inkubation für 30 Minuten wurde die Menge an NR-AN-01, das an die Zellen gebunden war, durch Messen der Absorption bei 415 nm und 490 nm unter Verwendung eines ELISA-Plattenlesers, der zur Datenaufnahme mit einem Compaq-Computer ausgerüstet war, quantifiziert.
  • 4A stellt grafisch die Ergebnisse von in vitro Studien dar, bei denen A375 m/m Marker-positive Zellen bei 4°C gehalten wurden (d.h. um Membranaustausch zu verhindern) und für 5 Minuten (geschlossene Quadrate, 4A), 15 Minuten (geschlossene Diamanten, 4A), 30 Minute (geschlossene Quadrate, 4A) oder 60 Minuten (geschlossene Diamanten, 4A) mit unterschiedlichen Konzentrationen von NR-AN-01 (NRAN01 μg/ml). Die Bindung von NR-AN-01-MAb an die A375-Zellen wurde durch Waschen zum Entfernen von ungebundenem Antikörper, Zugabe von HRP-konjugierten Ziege-anti-Maus-IgG zur Reaktion mit zellgebundenem MAb, Waschen zum Entfernen von ungebundenem sekundären Ziegenantikörper, und Zugabe von 2,2'-Azino-bis(3-Ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure (ABTS)-Substrat für Peroxidase quantifiziert. Die Farbenwicklung wurde nach 30 Minuten von sowohl 415nm als auch 490 mit (A415, 490) gemessen.
  • 4B stellt grafisch die Ergebnisse von in vitro Studien dar, und zwar auf eine Art und Weise ähnlich zu der oben im Hinblick auf 4A beschrieben, aber unter verwendung an Marker-positiven glatten Muskelzellen des Typs BO54, d.h. anstelle der A375 m/m Zellen.
  • Die Ergebnisse, die in 4A und 4B dargestellt sind, zeigen signifikante Bindung von NR-AN-01 an A375 und BO54-Zellen innerhalb von 5 Minuten bei 4°C, sogar bei der niedrigsten Dosis von 20 ng/ml.
  • BEISPIEL 4
  • Wirkungen von Roridin A und RA-NR-AN-01-Konjugaten
  • Die Wirkungen von Roridin A (RA) unr RA-NR-AN-01-Konjugaten auf die zelluläre Proteinsynthese, d.h. mittels 3H-Leucin-Einbau, und die metabolische Aktivität (d.h. mittels mitochondrialem MTT-Assay) wurden in den Experimenten getestet, die in den Beispielen 5 und 6 unten detailliert dargestellt sind. Die Studien in Beispiel 4 umfassen Experimente, um die Wirkungen der Langzeit-Behandlung (d.h. 24 Stunden) mit den Mitteln zu bestimmen. Die Studien in Beispiel 5 umfassen Experimente, um die Wirkungen von "Puls"-Behandlungen (d.h. 5 Minuten) zu bestimmen. In beiden Studien wurde die zelluläre Spezifität der Wirkungen ermittelt, indem "Ziel"-Zellen (d.h. Zellen, die denn SCPG-"Marker" trugen) und Nicht-Ziel-Zellen eingeschlossen wurden. Für Vergleichszwecke wurde auch freies RA (d.h. ungekoppelt) in die Studien aufgenommen. Die Wirkungen auf die zelluläre Proteinsynthese oder die metabolische Aktivität wurden entweder unmittelbar nach der Behandlung untersucht, oder es wurde eine "Erholungsphase" gewährt (d.h. eine Inkubation der Zellen über Nacht war eingeschlossen), um die Langzeitwirkungen der Mittel auf die Zellpopulationen zu bestimmen.
  • Metabolische Wirkungen nach Aussetzen über 24 Stunden:
  • Während es bekannt ist, dass Konjugate aus monoklonalem Antikörper und Arzneimittel einen Grad an Spezifität für Zellen, die Markerantigene tragen, aufweisen, wenn sie in vivo verwendet werden, hat es sich bei vielen Systemen als schwieriger herausgestellt, in vitro eine Spezifität der Wirkung zu zeigen, insbesondere mit Verbindungen, die lipophil sind. Daher wurden die vorliegenden Experimente durchgeführt, bei denen die inhibitorischen Wirkungen des NR-AN-01-Roridin A-Konjugats an Ziel- und Nicht-Ziel- Zellen über 24 Stunden getestet wurden. Die Ergebnisse mit RN-NR-AN-01-RA wurden mit der Wirkung von freiem Roridin A über dieselbe 24-Stunden-Spanne verglichen. Ein modifizierter Methyltetrazoliumblau (MTT)-Assay wurde verwendet, mit [3-(4,5-Dimethythriazol-2-yl)-2,2-diphenyltetrazoliumbromid], um die zelluläre metabolische Aktivität zu bestimmen. Man glaubt, dass dieser Assay die mitochondriale Dehydrogenaseaktivität misst. Für einige dieser Studien wurden M14 (Melanom) und BO54 (glatte Muskelzellen) Linien als Marker-positive Zielzellen und HT29-Zellen (Coloncarcinom; ATCC #HTb38) als nicht-Ziel-Spezifitätskontrolle verwendet. In anderen Studien wurden A375-Zellen als Marker-positive Zellen verwendet. Die HT29- und M14-Zellen wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit einer Konzentration von 5,0 × 103 Zellen/Vertiefung, und die BO54-Zellen mit 2,5 × 103 Zeilen/Vertiefung ausgesät. Serielle zweifache Verdünnungen von freiem Roridin A und 2'RA-HS-NR-AN-01 (d.h. Roridin A über ein Hemisuccinat (HS)-Verbindungsmittel an die 2'-Position an NR-AN-01 gekoppelt) wurden in DMEM über einen Bereich von Proteinkonzentrationen von 20 mg/ml bis 40 pg/ml erstellt. Testagentien wurden hinzugegeben (in doppelter Ausführung) zu den Mikrotitervertiefungen, und die Platten wurden in Aluminiumfolie gewickelt und bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre bestehend aus 5% CO2/95% Luft über 24 Stunden inkubiert. Nach 24 Stunden wurde das Medium abgenommen (durch Absaugen), frisches DMEM wurde hinzugegeben (100 ml/Vertiefung), und die Zellen wurden zurückgestellt, um für eine weitere Nacht (d.h. 16-18 Stunden), eine "Erholungsphase", zu inkubieren. Am Ende der "Erhohlungsphase" wurde die zelluläre metabolische Aktivität durch Zugabe von 20 ml einer 5 mg/ml MTT-Lösung pro Vertiefung bestimmt. Die Platten wurden wieder abgedeckt und bei 37°C für 4 Stunden inkubiert, und dann wurde die Reaktion durch Zugabe von 100 ml/Vertiefung von 10%SDS/0,1N HCl enwickelt. Das dunkelblaue solubilisierte Formazan-Reaktionsprodukt wurde bei Raumtemperatur nach 16 bis 18 Stunden entwickelt und unter Verwendung eines ELISA-Mikrotiterplattenlesers bei einer Absorbtion von 570 nm quantifiziert.
  • 5A stellt grafisch die Ergebnisse von in vitro Studien dar, bei welchen Markerpositive BO54 glatte Muskelzellen mit unterschiedlichen Konzentrationen an RA-NR-AN-01 (NRAN01-RA; geschlossene Quadrate, 5A) oder freies Roridin A (Freies RA; geschlossenen Diamanten, 5A) über eine Zeitspann von 24 Stunden gewaschen und dann für eine zusätzliche Erhohlungsphase von 16 bis 18 Stunden über Nacht (o/n) vor dem Testen auf metabolische Aktivität in einem MTT-Assay inkubiert wurden. Die Konzentrationen Freien RAs und von RA-NR-AN-01 sind als die errechnete Konzentrationen von Roridin A (in mg/ml, aufgetragen auf einer logarithmischen Skala) in dem Assay ausgedrückt, s dass direkte Vergleiche gemacht werden konnten. Die metabolische Aktivität der Zellen in dem MTT-Assay wird als prozentualer Anteil der metabolischen Aktivität gemessen in einer Kontrolle unbehandelter Kultur von Zellen (d.h. % Kontrolle) dargestellt. 5B stellt grafisch die Ergebnisse von in vitro Studien dar, die auf ähnliche Weise zu jener oben bezogen auf 5A beschriebenen durchgeführt wurden, aber die Wirkungen von nur RA-NR-AN-β1 (NRAN01-RA) auf drei unterschiedliche Zelltypen verglichen, nämlich: BO54 Marker-positive glatte Muskelzellen (BO54-NRAN01-RA; geschlossene Quadrate, 5B); HT29 Markernegative Kontrollzellen (HT29-NRAN01-RA; geschlossene Diamanten, 5B); und M14 Marker-positiven Zellen (M14-NRAN01-RA; geschlossenen Quadrate, 5B). Wie oben im Hinblick auf 5A beschrieben werden die Konzentrationen in dem vorliegenden Experiment in g/ml Roridin A angegeben. Metabolische Aktivität der Zellen ist auf ähnliche Weise zu der in 5A ausgedrückt, d.h. als prozentualer Anteil an gemessener Aktivität in einer unbehandelten Kontrollkultur von Zellen (% Kontolle).
  • Die Ergebnisse, die in 5A und 5B dargestellt sind, zeigen, dass die metabolische Aktivität, gemessen im MTT-Assay, in allen Zielpopulationen der Testzellen sogar 16 bis 18 Stunden nach einer 24-stündigen Inkubation in allen Testzellen mit entweder freiem Roridin A, oder den 2'- oder 13'- Konjugaten, signifikant herabgesetzt war. Die Wirkungen der RA-NR-AN-01 Konjugate schienen nichtspezifisch inhibitorisch für beide Ziel- (BO54 und M14) als auch nicht-Ziel-Zellen (HT29) zu sein (5A und 5B). Die inhibitorischen Wirkungen wurden bei einer Konzentration an freiem Roridin A oder RA-Konjugat bei einer Konzentration an freiem Roridin A oder RA-Konjugat > 10 ng/ml beobachtet.
  • Für Vergleichszwecke wurde eine zweite Studie durchgeführt, in welcher die Wirkungen von Pseudomonas-Exotoxin-Konjugaten auf Zellen in einem ähnlichen Protokoll untersucht wurden. Für diese Studien wurden Ziel- und Nichtziel-Zellen mit PE oder PE-NR-AN-01 für 24 Stunden behandelt und dann wurde ihnen eine Erhohlungsphase (wie oben) gewährt, bevor die metabolische Aktivität in einem MTT-Assay getestet wurde.
  • 6A stellt grafisch die Ergebnisse von in vitro Studien dar, die auf ähnliche Weise wie jene oben zu 5A beschriebenen durchgeführt wurden, aber so gestaltet waren, um die metabolischen Wirkungen von PR-RA-AN-01 (NRAN01-PE) zu studieren, d.h. statt RA-NR-AN-01. Drei unterschiedliche Zelltypen wurden verwendet, nämlich: Markerpositive glatte BO54-Muskelzellen (8054; leere Quadrate, 6A), Marker-negative HT29-Kontrollzellen (HT29; geschlossene Diamanten, 6A) und Marker-positive M14-Zellen(MT14, geschlossene Quadrate, 6A). Bei dieser Untersuchung ist die Konjugat-Konzentration in mg/ml NR-AN-01-Protein ausgedrückt (aufgetragen auf eine logarithmische Skala) und die Stoffwechselaktivität ist als Prozentsatz der in einer unbehandelten Kontrollkultur gemessenen MTT-Aktivität (% Kontrolle) ausgedrückt.
  • 6B stellt die Ergebnisse von in vitro Studien grafisch dar, die auf ähnliche Art und Weise zu der bezogen auf 6A oben diskutierten durchgeführt wurden, wobei jedoch die Wirkungen verglichen werden sollten, die mit freiem PE (PE) erhalten wurden, anstelle der oben, d.h. in 6A, mit PE-NR-AN-01 erhaltenen. Die Zellen, Kulturbedingungen, Berechnungen und Darstellung der Ergebnisse sind die gleichen wie in 6A oben. Die in 6A und 6B dargestellten Ergebnisse zeigen, dass eine Exposition von PE-NR-AN-01 oder freiem PE von 24 Stunden nicht-spezifisch hemmend für Zellen bei Konzentrationen von > 100 ng/ml war.
  • Während man diesen Typ nichtspezifischer Hemmung als potentiell wertvoll für biologische Arthrectomie eingeschätzt wird, halt man ihn nicht für wünschenswert bei der Behandlung von Restenose, die einer Angioplastie folgt und wobei tote und sterbende Zellen Faktoren freisetzen können, die eine Proliferation glatter Muskelzellen stimulieren.
  • BEISPIEL 5
  • Wirkungen der Puls-Behandlung auf die Zellaktivität
  • Man führte zusätzliche Studien durch, um die Wirkungen eines kurzzeitigen Aussetzens, d.h. 5 Minuten, eines therapeutischen Roridin A-enthaltenden Konjugats auf Zellen zu untersuchen. Bei diesen Untersuchungen wurden sowohl die Stoffwechselaktivität (gemessen in MTT-Assays) als auch die Zellprotein-Synthese (gemessen mittels 3H-Leucin-Einbau) untersucht.
  • Wirkungen nach fünf Minuten Exposition: Proteinsyntheses
  • Die Wirkungen einer Exposition gegenüber freiem Roridin A (RA) oder einem therapeutischen Konjugat von 5 Minuten wurden untersucht. Man verwendete Roridin A-NR-AN-01, das mittels eines Hemisuccinyls (HS) entweder an die 2'-Position (2' RA-HS-NR-AN-01) oder an die 13'-Position (13' RA-HS-NR-AN-01) gekoppelt war. (Im Fall von 13' RA-HS-NR-AN-01 war die 2'-Position von Roridin A zudem acetyliert.) Man verdünnte die RA- 2'- oder 13'-RA-NR-AN-01-Konjugate zweifach in sterilem DMEM zu Konzentrationen im Bereich von 400 ng/ml bis 780 pg/ml Roridin A. (Die Testproben waren alle gegen Roridin A normalisiert, so dass direkte Vergleiche der Wirkungen bei vergleichbaren Dosierungen gezogen werden konnten.) Man füllte Aliquots der Proben in doppelter Ausführung zu 100 ml/Vertiefung in Doppel-Mikrotiter-Platten und inkubierte 5 Minuten bei Raumtemperatur.
  • Man bestimmte sowohl Kurzzeit- als auch Langzeit-Wirkungen der Testproben auf Marker-positive A375- und Marker-negative HT29-Zellen. Für die Untersuchung der Kurzzeit-Wirkung gab man unmittelbar nach der 5 Minuten Behandlung mit Konjugat (oder RA) [3H]-Leucin (0,5 mCi/ml; 100 ml/Vertiefung) zu und wertete die Proteinsynthese über einen Zeitraum von vier Stunden aus. Zur Bestimmung der Langzeit-Wirkung behandelte man die Zellen 5 Minuten, wusch und gab die Zellen erneut für 24 Stunden "Erholungsphase" in Kultur in DMEM-Medium, das entweder 5% NBS/5% Serum Plus (d.h. für A375- oder HT29-Zellen) oder 10% FBS (d.h. für BO54-Zellen) enthielt. Am Ende der "Erholungsphase" entfernte man das Inkubationsmedium (durch Absaugen) und gab 3H-Leucin zu (wie oben). In beiden Fallen (gleich ob kurz- oder langfristig) wertete man die Zellproteinsynthese nach 4 Stunden Inkubieren der Zellen mit 3H-Leucin bei 37°C in einer luftbefeuchteten Kammer (wie oben) aus, und berechnete alle Ergebnisse durch Vergleich mit unbehandelten Zellen (d.h. 100% Kontrolle). Nach 4 Stunden entfernte man das 3H-Leucin und man entfernte die Zellen durch Trypsin-Behandlung vom Boden, Absaugen (unter Vetwendung eines PHD-Zell-Erntens) und sammelte sie durch Filtration durch Glasfaserfilter. Man trocknete die Glasfaserfilter und quantifizierte die Radioaktivität mittels Flüssigkeitsszintillations-Spektroskopie in einem Beckman-Flüssigkeitsszintillationszähler.
  • 7A stellt die Ergebnisse der durchgeführten in vitro-Untersuchungen zur Untersuchung der Wirkungen verschiedener Konzentrationen von Roridin A (freies RA; leere Quadrate, 7A) oder von 2'RA-NR-AN-01-(2'RA-NRAN01; geschlossene Quadrate, 7A) oder 13'RA-NR-AN-01-Konjugaten (13'RA-NRAN01, geschlossene Dreiecke,
  • 7A) bei einer Exposition von 5 Minuten auf Marker-negative NT29-Kontroll-Zellen grafisch dar. Die Konzentrationen von freiem RA, 2'RA-NR-AN-01 oder 13'NR-AN-01 sind als die berechnete Konzentration von Roridin A im Assay (in mg/ml aufgetragen auf einer auf einer logarithmischen Skala) ausgedrückt, d.h. statt der Gesamt- mg/ml an NR-AN-01-Protein, so dass direkte Vergleiche aus den Ergebnissen gezogen werden können. Für diese Untersuchungen behandelte man die Zellen 5 Minuten, wusch und gab sie dann wieder 4 Stunden in Kultur, wobei man in dieser Zeit die Zellproteinsynthese durch Zugabe von 0,5 mCi/ml 3H-Leucin zum Kulturmedium auswertete. Am Ende der vierstündigen Zeitspanne sammelte man die Zellproteine und bestimmte die Radioaktivität. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als prozentualer Anteil der Radioaktivität, die in einer (unbehandelten) HT29-Kontroll-Zellkultur (d.h.% Kontrolle) gemessen wurde.
  • 7B stellt die Ergebnisse der durchgeführten in vitro-Untersuchungen zur Untersuchung der Wirkungen verschiedener Konzentrationen von freiem RA (leere Quadrate, 78) oder von 2'RA-NRAN01 (geschlossene Quadrate, 7B) oder 13' RA-NRAN01 (geschlossene Dreiecke, 78) bei einer Exposition von 5 Minuten auf Marker-negative HT29-Kontroll-Zellen, wie oben bezogen auf 7A beschrieben, grafisch dar, wobei man die Zellen bei den vorliegenden Experimenten für eine Erholungsphase von 16-18 Stunden (d.h. über Nacht) inkubierte, bevor man die Proteinsynthese in einem vierstündigen 3H-Leucin-Proteinsynthese-Assay testete. Die Ergebnisse sind in ähnlicher Weise wie die oben in 7A angegebenen dargestellt.
  • Die in 7A und 7B dargestellten Ergebnisse zeigen die Kurzzeit – bzw. Langzeit-Wirkungen von RA, 2'RA-HS-NR-AN-01 und 13'RA-HS-NR-AN-01 auf die Proteinsynthese von HT29-Kontroll-Zellen. Die Ergebnisse zeigen eine Dosis-Wirkungs-Hemmung der Zellproteinsynthese durch freies Roridin A, jedoch nicht durch RA-NR-AN-01, in HT29-Zellen. Die durch das RA ausgeloste Hemmung während der 5 Minuten Inkubation blieb auch nach der Erholungsphase von 16 bis 18 Stunden bestehen (7B). Jedoch führte die Behandlung von Nicht-Ziel-NT29-Zellen mit 2'RA-HS-NR-AN-01 oder 13'RA-HS-NR-AN-01 zu keiner erkennbaren Hemmung der Proteinsynthese. Deshalb lassen diese Ergebnisse (im Gegensatz zu den oben über 24 Stunden erhaltenen) auf einen überraschenden Spezifitätsgrad der in vitro-Wirkung der NR-AN-01-Konjugate schließen, wenn die Behandlung in einem 5-Minuten-"Puls" ausgeführt wurde. Es war jedoch auch möglich, dass das NR-AN-01-Konjugat inaktiv war, und deshalb führte man zusätzliche Experimente durch, um die Wirkung der Konjugate auf Ziel-Zellen zu untersuchen.
  • 7C stellt die Ergebnisse von in vitro-Untersuchungen zur Untersuchung der Wirkungen verschiedener Konzentrationen von freiem RA (leere Quadrate, 7C) oder von 2'RA-NR-AN-01 (geschlossene Quadrate, 7C) oder 13'RA-NR-AN-01 (geschlossene Dreiecke, 7C) bei einer Exposition von 5 Minuten auf Marker-positive A375 m/m Zellen, wie oben zu 7A beschrieben, grafisch dar. Bei den vorliegenden Untersuchungen inkubierte man die A375-Zellen 5 Minuten in dem Testmittel, wusch und testete sie zudem weitere 4 Stunden durch Zugabe von 0,5 mCi/ml 3H-Leucin zum Kulturmedium auf Proteinsynthese. Die Ergebnisse der Experimente sind auf ähnliche Art und Weise wie die oben bezogen auf 7A beschriebenen aufgetragen.
  • 7D stellt die Ergebnisse der durchgeführten in vitro-Untersuchungen zur Untersuchung der Wirkungen verschiedener Konzentrationen von freiem RA (leere Quadrate, 7D) oder von 2'RA-NRAN01 (geschlossene Quadrate, 7D) oder 13'RA-NRAN01 (geschlossene Dreiecke, 7D) bei einer Exposition von 5 Minuten auf Marker-positive A375 m/m -Zellen, wie oben bezogen auf 7B beschrieben, grafisch dar. Bei den vorliegenden Experimenten inkubierte man die A375-Zellen 5 Minuten, wusch und gab sie danach erneut für eine Erholungsphase von 16-18 Stunden (d.h. über Nacht) in Kultur, wonach man die Proteinsynthese in einem vierstündigen 3H-Leucin-Proteinsyntheseassay testete. Die Ergebnisse der Experimente sind auf ähnliche Art und Weise wie die oben bezogen auf 7A beschriebenen aufgetragen.
  • Die in 7C und 7D dargestellten Ergebnisse zeigen die Kurzzeit- bzw. Langzeit-Wirkungen von RA, 2'RA-HS-NR-AN-01 und 13'RA-HS-NR-AN-01 auf die Proteinsynthese durch A375-Ziel-Zellen. Die Behandlung der Ziel-Zellen sowohl mit therapeutischem 2'- oder 13'-RA-NR-AN-01-Konjugat führte zu einer kurzzeitigen Hemmung der Proteinsynthese, d.h. beobachtet unmittelbar nach der 5-Minuten-Puls-Behandlung (7C). In Kombination mit den Ergebnissen aus 7A und 7B oben lassen diese Ergebnisse darauf schließen, dass die RA-NR-AN-01 -Konjugate aktiv waren und dass sie spezifisch hemmend für Ziel-Zellen waren, jedoch nicht für Nicht-Ziel-Zellen. interessanterweise beobachtete man keine langfristigen hemmenden Wirkungen, wenn die "Puls-behandelten Ziel-Zellen erneut in Kultur gegeben wurden (7D). Die in 7C und 7D dargestellten Ergebnisse zeigen zudem, dass Roridin A unspezifisch hemmend für Testzellen ist (d.h. ähnlich wie oben in 7A und 7B) und dass seine Wirkungen auf Zellen sogar nach einer Erholungsphase von 16-18 Stunden bestehen bleiben. Die spezifischen Wirkungen der RA-NR-AN-01-Konjugate auf Ziel-Zellen während einer "Puls-Behandlung scheinen daher eine Eigenschaft des NR-AN-01 – Bindungsproteins zu sein.
  • Die mit glatten BO54-Arterienmuskelzellen erhaltenen Ergebnisse waren ähnlich der oben mit den A375-Zellen erhaltenen, d.h. freies Roridin A zeigte kurzfristig eine Dosis-Wirkungs-Inhibierung der Proteinsynthese, die 60%, 66% und 90% der Kontrolle bei 200 ng/ml, 100 ng/ml bzw. 50 ng/ml entsprach; und langfristig entsprachen die Wirkungen auf die Proteinsynthese 27%, 46% und 98% der Kontrolle bei gleichen Dosierungen. Dagegen zeigten die 2'- und 13'-RA-NR-AN-01-Konjugate nur 10-20% Hemmung für die Kurz- und Langzeitwirkungen auf die Proteinsynthese (d.h. > 80% der Kontrolle).
  • Somit zeigen die Ergebnisse eine reversible spezifische Kurzzeitwirkung des Roridin A-konjugierten NR-RA-01 auf Ziel-Zellen bei "Puls"-Behandlung. Da bei diesen Experimenten jedoch nur die Proteinsynthese ausgewertet wurde, war es möglich, dass die Zellstoffwechselaktivität in den Zellen aufgrund der "Puls"-Behandlung beeinflusst war. Deshalb führte man zusätzliche Untersuchungen durch, in denen die auf eine "Puls"-Behandlung folgende Zellstoffwechselaktivität ausgewertet wurde.
  • Wirkungen nach 5 Minuten Exposition: Stoffwechselaktivität
  • Man führte 48 Stunden nach 5 Minuten Exposition von RA oder RA-NR-AN-01-Konjugaten auf Ziel- und Nicht-Ziel-Zellen MTT-Assays durch. Die Ziel-Zellen in diesen Untersuchungen umfassten BO54- und A375-Zellen, die Nicht-Ziel-Zellen umfassten HT29-Zellen. Sterile Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit 2500 Zellen/Vertiefung besät, diese wurden in Aluminiumfolie eingewickelt und es wurde 16-18 Stunden in einer 5% CO2/95% Luftenthaltenden befeuchteten Kammer inkubiert. Man stellte Serien zweifacher Verdünnungen von Roridin A, 2'RA-HS-NR-AN-01 und 13'RA-HS-NR-AN-01 im Bereich von 400 ng/ml bis 780 pg/ml her und gab 100 ml-Aliquots der Verdünnungen in doppelter Ausfertigung in die Vertiefungen. Nach fünfminutiger Exposition der Testproben wusch man die Zellen, um die Testproben zu entfernen, und gab frisches Medium zu. Man ließ sich die Zellen 48 Stunden erholen, bevor man sie testete, d.h. man inkubierte die Platten 48 Stunden und bestimmte danach die Zellstoffwechselaktivität durch Zugabe von 20 ml/Vertiefung einer 5 mg/ml-MTT-Lösung. Man deckte die Platten ab und entwickelte wie oben beschrieben (Beispiel 4). Das dunkelblaue solubilisierte Formazan-Reaktionsprodukt entwickelte sich bei Raumtemperatur nach 16-18 Stunden Inkubation. Man quantifizierte die Proben mittels ELISA-Mikrotiterleser bei einer Absorption von 570 nm.
  • 8A stellt die Ergebnisse von in vitro-Untersuchungen zur Erforschung der Wirkungen einer 5 Minuten Exposition verschiedener Konzentrationen von Roridin A (leere Quadrate, 8A), 2'RA-NR-AN-01 (NRAN01-2'RA; geschlossene Diamanten, 8A) oder 13'RA-NR-AN-01 (NRAN01-13'RA; geschlossene Quadrate, 8A) auf glatte Markerpositive BO54-Muskelzellen grafisch dar. Man führte die Experimente auf ähnliche Art und Weise wie oben bezogen auf 7B beschrieben durch, wobei jedoch anstelle der Proteinsynthese wie in 7B die Stoffwechselaktivität mittels MTT-Assay untersucht wurde und man den Zellen 48 Stunden Erholung (anstelle der 24 Stunden wie in 7B) gab. Die Ergebnisse der Experimente sind auf ähnliche Art und Weise wie die oben bezogen auf 7A beschriebenen aufgetragen.
  • 8B stellt die Ergebnisse der in vitro-Untersuchungen zur Untersuchung der Wirkungen einer 5 Minuten Exposition verschiedener Konzentrationen von Roridin A (leere Quadrate, 8B), 2'RA-NR-AN-01 (NRAN01-2'RA; geschlossene Diamanten, 8B) oder 13'RA-NR-AN-01 (NRAN01-13'RA; geschlossene Quadrate, 8B) auf Markerpositive A375 m/m-Zellen grafisch dar. Man führte die Experimente auf ähnliche Art und Weise wie oben bezogen auf 8A beschrieben durch (und trug auch die Ergebnisse auf ähnliche Art und Weise auf).
  • 8C stellt die Ergebnisse der in vitro-Untersuchungen zur Untersuchung der Wirkungen einer 5 Minuten Exposition verschiedener Konzentrationen von Roridin A (leere Quadrate, 8C), 2'RA-NR-AN-01 (NRAN01-2'RA; geschlossene Diamanten, 8C) oder 13'RA-NR-AN-01 (NRAN01-13'RA; geschlossene Quadrate, 8C) auf Marker-negative HT29-Zellen grafisch dar. Man führte die Experimente auf ähnliche Art und Weise wie oben bezogen auf 8A beschrieben durch (und trug auch die Ergebnisse auf ähnliche Art und Weise auf).
  • Die in den 8A bis 8C dargestellten Ergebnisse zeigen leichte Unterschiede zwischen den verschiedenen RA-NR-AN-01-Konjugaten bei den höchsten Dosierungen, aber bei den niedrigeren Dosierungen hemmten die 2'- und 13'-RA-NR-AN-01-Konjugate langfristig (d.h. 48 Stunden) nicht signifikant die Stoffwechselaktivität der Ziel-Zellen (d.h. BO54 und A375) oder Nicht-Ziel-Zellen (d.h. HT29). Daher lassen die Ergebnisse darauf schließen, dass die Kurzzeit-lnhibierung der Ziel-Zellen-Proteinsynthese (7C und 7D, oben) nicht zu mittels MTT-Assay messbaren Langzeit-Stoffwechselwirkungen auf die Zellen führen. Dass diese Assays Stoffwechselveränderungen in Zellen detektieren können, die aus einer 5 Minuten Exposition herrühren, beweisen die mit freiem Roridin A erhaltenen Ergebnisse. In diesem Fall war freies Roridin A nichtspezifisch hemmend für Ziel- und Nicht-Ziel-Zelltypen, auch wenn man den Wirkstoff nur 5 Minuten auf die Zellen einwirken ließ und sie danach erneut für eine Erholungsphase von 48 Stunden in Kultur gab (8A bis 8C).
  • Daher deuten die Ergebnisse mit freiem Roridin A daraufhin, dass der MTT-Assay in der Lage war, durch fünfminutige Exposition induzierte Stoffwechselveränderungen zu detektieren. Insgesamt lassen diese Ergebnisse darauf schließen, dass RA-NR-AN-01-Konjugate die Ziel-Zell-Aktivität (d.h. die Proteinsynthese spezifisch hemmen können, wenn sie in einer "Puls"-Behandlung verabreicht werden, und dass diese Wirkungen reversibel sind, ohne signifikante Langzeitwirkungen weder auf Proteinsynthese noch Zellstoffwechselaktivität (gemessen in einem MTT-Assay). Man beurteilte diese in vitro-Eigenschaften der RA-NR-AN-01 -Konjugate als äußerst nützlich für die Hemmung der glatten Muskelzellen-Aktivität in vivo. Deshalb führte man danach Tiermodell-Untersuchungen durch, um die Wirkungen dieser therapeutischen Konjugate in vivo auszuwerten.
  • BEISPIEL 6
  • Bestimmung der Infusionsbedingungen in einem Tiermodell
  • Die therapeutischen Konjugate entsprechend der vorliegenden Erfindung sind zur Hemmung von Stenosen als Folge von Gefäßtrauma oder -erkrankung geeignet. In einem veranschaulichenden Beispiel behandelt man ein Gefäßtrauma, das während einer Angioplastie verursacht wurde, während des chirurgischen Verfahrens durch Entfernen des zur Durchführung der Angioplastie verwendeten Katheters und führt einen Ballon-Infusionskatheter in das Blutgefäß ein. Man positioniert den Infusionskatheter mit der Instillationsöffnung (oder alternativ dazu eine permeable Membranregion) in der traumatisierten Zone des Gefäßes und übt dann Druck aus, um das therapeutische Konjugat einzuführen. Beispielsweise kann ein Infusionskatheter mit zwei Ballons verwendet werden, und sobald ein Ballon auf irgendeiner Seite der Traumastelle aufgeblasen wird, entsteht ein Raum für Flüssigkeit, der dann mit einer geeigneten Infusionsflüssigkeit, die das therapeutische Konjugat enthält, gefüllt werden kann.
  • Es wurde bereits berichtet, dass die Infusion eines Marker-Enzyms der Meerrettich-Peroxidase (HRP) bei einem Druck von 300 mm Hg über 45 Sekunden in die Koronararterien von Hund oder Mensch zu einer Penetration der HRP in die Gefäßwand führte (6). Bei HRP handelt es sich jedoch um ein kleineres Molekül als NR-AN-01, und die Koronar-Arterien von Hund und Mensch sind ebenfalls deutlich kleiner als die Karotis- oder Femoralarterien, die im vorliegenden Hausschwein-Modellsystem verwendet wurden. Es wurden deshalb in einem Hausschwein-Modellsystem Experimente durchgeführt, um die für die Abgabe eines therapeutischen Konjugats an die glatten Gefäßmuskelzellen in Karotis- und Femoral-Arterien geeigneten Infusionsbedingungen zu bestimmen. Man bewachte die Abgabebedingungen mittels der Untersuchung der Penetration der Gefäßwand durch das therapeutische Konjugat und der spezifischen Bindung des therapeutischen Konjugats an die glatten Gefäßmuskelzellen in der Gefäßwand.
  • Man infundierte die Koronar- und Fernoral-Arterien von Hausschweinen oder nichtmenschlichen Primaten unter Verwendung eines Infusionskatheters mit NR-AN-01 für 45 Sekunden bis 3 Minuten bei unterschiedlichen Drücken im Bereich von 0,4 atm (300 mm Hg) bis 3 atm. Nach der Infusion spülte man die Gefäße mit steriler Kochsalzlösung und bereitete sie unter Verwendung von HRP-konjugiertem Ziegen-Antimaus-lgG für die Immunohistochemie vor, um den NR-AN-01-Maus-lgG in der Gefäßwand zu detektieren. Man stellte fest, dass eine vollständige Penetration des NR-AN-01 in diese Gefäßwände bei einem Druck von 3 atm nach 3 Minuten erreicht wurde.
  • Man verwendete auch Immunohistologie, um zu bestimmen, welche Tiermodellsysteme das Ziel-Antigen für NR-AN-01 exprimierten. Man exponierte NR-AN-01 auf Gewebeschnitte von Gefäßen bereits vorliegender experimenteller Tierarten, wusch und brachte sie mit HRP-konjugiertem Ziegen-Antimaus-lgG zur Reaktion. Man fand heraus, dass lediglich nichtmenschliche Primaten und Schweine das 250 kD-NR-AN-01-Ziel-Antigen mit dem Menschen teilen.
  • Um zu bestimmen, ob NR-AN-01 in spezifischer Weise in vivo an sein Ziel-Antigen bindet, infundierte man die Koronar- und Femoral-Arterien von Hausschweinen unter Verwendung eines Infusionskatheters mit therapeutischen Konjugaten, spülte die Infusionsstellen mit steriler Kochsalzlösung, verschloss danach die Operationsstellen und ließ die Tiere noch 3 bis 5 Tage am Leben. Am Ende dieser Zeitspanne schnitt man die Gefäßinfusionsstellen heraus und bereitete sie für die Immunohistologie vor, wobei man nochmals Ziegen-Antimaus-lgG verwendete, um NR-AN-01 zu identifizieren. Man identifizierte NR-AN-01 in der Gefäßwand von Koronar- und Femoral-Arterien von Schweinen 3 bis 5 Tage nach dem chirurgischen Eingriff, und NR-AN-01 schien nur an glatte Gefäßmuskelzellen gebunden zu sein. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass NR-AN-01 dazu in der Lage ist, in vivo an sein Ziel-Antigen spezifisch zu binden.
  • BEISPIEL 7
  • Inhibierung von glatten Gefäßmuskelzellen in vivo
  • Die Ballonkatheter-induzierten Traumata folgende intimale Proliferation glatter Muskelzellen ist ein gutes Modell zur Bewertung der Wirksamkeit therapeutischer Konjugate zur Inhibierung glatter Muskelzellaktivität in vivo als Antwort auf Gefäßtraumata, einschließlich Angioplastie folgende Restenose. Man verwendete Hausschweine, um die Wirkungen von NR-AN-01 (in diesen Untersuchungen als glatte Gefäßmuskel- bindendes Protein oder kurz VSMPB bezeichnet; therapeutische Konjugate mit Roridin A sind als VSMPB-RA bezeichnet) zu untersuchen. Die Ereignisse, die normalerweise bei einer Ballonkatheterangioplastie in Arterien von Schweinen auftreten, sind bereits beschrieben worden (12). In diesen Untersuchungen führte eine Erweiterung der Karotisarterie unter Verwendung eines übergroßen Ballons (Verhältnis Ballon: Arterie etwa 1,5:1) zu einer vollständigen Abtragung des Endothels über ein Gebiet von 1,5 bis 2 cm Länge. Obwohl man diese Länge einer traumatischen Verletzung wählte, um eine Thrombose zu minimieren, lag dennoch eine erwähnenswerte Blutplättchenablagerung und Thrombusbildung vor. Das Verfahren führte ebenfalls zu einem Schnitt durch die internen elastischen Lamellen in das arterielle Medium und zu Nekrose der glatten medialen Muskelzellen. Verdickung der Intima auf Grund glatter Muskelzellen-Proliferation trat 7 Tage nach der Verletzung ein und erreichte nach 14 Tagen eine mittlere maximale Dicke von 85 mm. Das histologische Auftreten dieser Neointima ähnelt dem proliferativen neointimalen Gewebe der menschlichen Restenose sehr (13).
  • Man führte ein Testprotokoll mit Einzeldosierung von NR-AN-01 – Roridin A – Konjugaten in Hausschweinen durch. Eine lokale Verabreichung der Testkonjugate, d.h. durch einen Katheter in eine Region eines durch zeitweilige Gleitligaturen begrenzten traumatisierten Gefäßes, um die systemische Toxizität zu verringern, wurde so gestaltet, dass gleichzeitig ein hochgradiges Einwirken für die glatten Ziel-Muskelzellen zur Verfügung gestellt wurde. Dieser intraarterielle Verabreichungsweg in Tiermodell-Untersuchungen ahmt den vorgeschlagenen Weg in menschlichen Koronar-Arterien nach.
  • Dieses Testprotokoll wurde als initiales In-vivo- Screening für intraarterielles, ortsspezifisches, Katheter-verabreichtes glatte Gefäßmuskelzellenbindendes Protein (VSMBP) gestaltet. Man untersuchte ebenfalls die Toxizität des freien Medikaments, d.h. auf pathobiologische Wirkungen auf arterielle glatte Muskelzellen. Die therapeutisch wirksame Dosierung des Roridin A-NR-AN-01-Konjugats bestimmte man mittels in vitro-Untersuchungen und am genauen intraarteriellen Verabreichungsdruck bestimmte man durch Verabreichen freier MAb und MAb-Konjugate an Tiere, wie oben in Beispiel 7 beschrieben.
  • In dem Experiment verwendete man sechs Hausschweine aus einer Kreuzung (Duroc X), entwöhnte Schweine mit etwa 30 Pfund Körpergewicht. Man wies die Tiere zufallig dem nachfolgenden Behandlungsplan zu, wobei jedes Schwein vier Behandlungen, aufgeteilt zwischen der rechten und linken Karotis- und Femoral- Arterie, unterzogen wurde, wovon es sich bei einer um eine PBS-Kontrolle handelte (Tabellen 1-3 unten). Tabelle 1:
    Gruppe Nr. Behandlungsgruppe Materialbeschreibung
    1 Kontrolle, VSMBP VSMPB 200 mg/ml in PBS, pH 6,5
    2 Kontrolle, PBS PBS, pH 6,5 in sterilem Injektionswasser
    3 Kontrolle, Arzneimittel Roridin A, 2,5 mg/ml in PBS, pH 6,5
    4 Test, Konjugat VSMPB-RA2' (200 mg/ml VSMPB & 2,5 mg/ml RA)
    5 Test, Konjugat VSMPB-RA13' (200 mg/ml VSMPB & 3,1 mg/ml RA)
    6 Test, CONJ + RA VSMPB-RA2' (200 μg/ml VSMPB & 2,5 mg/ml RA) PLUS 2,5 mg/ml freies Roridin A
    7 Test, CONJ + RA VSMPB-RA13' (200 mg VSMPB + 3,1 μg/ml RA) PLUS 2,5 mg/ml Roridin A)
  • Chirurgisches Verfahren:
  • Testkonjugate und Kontrollverbindungen wurden als einzelne intraarterielle Infusionen an der Stelle des Abtrags des Endothels und Traumas verabreicht, das durch einen Ballon-Katheter induziert war. Sowohl in der Karotis- als auch in der Fernoral-Arterie wurden 1 bis 2 cm des Endothels durch intraluminale Passage eines 23 cm Nummer 3 (Fernoral) und Nummer 4 (Karotis) Cutters, Uresil, Vascu-Flo, Silikonverschluß-Ballonkatheter abgetragen, der ausreichend mit Kochsalzlösung gedehnt war, um einen leichten Widerstand hervorzurufen. Diese Technik ruft eine leichte Dehnung der Arterie hervor. Im Anschluss an diese Behandlung wurden sowohl proximal als auch distal Gleitligaturen, Seide Größe 3-0, in der Nahe der Enden der abgetragenen Bereiche gelegt und man führte einen französischen Ernährungskleinkindkatheter für Kinder (Cutter-Resiflex) ein, der an eine Pumpe angeschlossen war. Eine Vordruckspritze wurde benutzt, um die Testkonjugate und Kontrollverbindungen direkt dem abgetragenen Bereich bei einem Druck von drei Atmospharen drei Minuten zu verabreichen. Die Gleitligaturen wurden nach 3 Minuten Expositionszeitspanne entfernt und der arterielle Blutfluss wurde wiederhergestellt. In diesen Untersuchungen wurden einige Äste der Femoral- und Karotisarterien mit einer 00 Seidennaht so abgebunden, wie es zum Erreichen einer Druckinfusion in der behandelten Region erforderlich ist. Der größte distale Ast der Femoral-Arterie wurde eingeschnitten und als Eingangsstelle für die Katheter verwendet, welcher dann in die Haupt-Femoral-Arterie eingeführt wurden. Im Anschluß an diese Katheterisierung in der Haupt-Femoral-Arterie wurde der zweite Zweig abgebunden. In diesen Fallen dient die Ligation oder Incision dazu, dass Einführen des Katheters zu ermöglichen, und die Öffnungen wurden dann mit drei bis vier Nahten von 5-0 Monosilamenpolybutylester (Novafil, D & G Monfil Inc., Monati, P. R. 00701.) verschlossen.
  • Nachfolgende Verfahren:
  • Nach der Operation wurden die Schweine während der Quarantäne und der Erholungszeitspannen nach Eingriff in 3 × 5-Fuß großen Innenlaufställen mit Zementboden gehalten. Sie wurden dann für den Rest der fünf Wochen dauernden Heilungszeit vor dem Entnehmen der Gewebe für histologische Untersuchungen in innen- und außenliegende Umzäunungen gebracht.
  • Die Tiere erholten sich von dem Eingriff normal ohne Anzeichen von Blutungen oder Entzündungen an den Stellen des Eingriffs. Alle sechs Tiere wurden fünf bis sechs Tage nach Behandlung mit einem Doppler-Stetoskop untersucht, und alle Arterien bei jedem dieser Tiere waren durchgängig. Nach Behandlung waren bei allen Tieren Appetit, Aktivität und Gewichtszunahme normal.
  • Pathologie und histologische Untersuchung:
  • Fünf Wochen nach der Traumatisierung und Behandlung der Arterien wurden die Tiere mit Telazol (Tileaminhydrochlorid) über intramuskulare Injektion sediert, heparinisiert (i.v. 2 ml Natriumheparin 1000 Einheiten/ml) und mittels i.v. Pentobarbital getötet. Sowohl die rechten als auch die linken Karotis- und Femoral-Arterien wurden entfernt, einschließlich der normalen Gefäße, die sowohl distal als auch proximal zum behandelten Bereich vorhanden waren. Diese Arterien wurden vermessen und der Ort der Ligaturen sowie grobe Abnormalitaten notiert. Die Arterien wurden in 2 mm Abschnitten durchtrennt und in der Folge in Kühlgefäßen mit OCT (Tissue Tek, Miles Laborstories Inc., Elkhart, IN.46515.) angeordnet und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Blöcke wurden mit einer Dicke von 5 Mikrometern geschnitten und mit H & E, Massons Trichrome und Movats Pentachrome für morphologische Studien angefärbt. Die Schnitte wurden auch für das immunohistologische Färben der glatten Gefäßmuskel verwendet.
  • Eine histologische Untersuchung der Stufenschnitte der Arterien zeigte eine bemerkenswerte Inhibierung der intimalen glatten Muskelproliferation in den traumatisierten und mit RA-NR-AN-01-Konjugaten behandelten Bereichen (Tabelle 2). Diese Inhibierung war sogar bei einer mehr als groben Untersuchung der Gefäße ersichtlich. Die Hemmung der intimalen glatten Muskelzellproliferation wurde bei minimalem oder keinem Beweis für Zelltod von glatter Muskulatur in der Arterienwand erreicht. Ein Querschnitt einer so traumatisierten Arterie wird in den 9A und 9B gezeigt. Tabelle 2 Intimale Proliferation von glattem Muskel in traumatisierten und behandelten Schweinearterien
    Behandlung Anzahl untersuchter Arterien Intimale SMC-Hypertrophie* Durchschnitt (Bereich)
    Kontrolle, MAb 4 3,75 (3-4)
    Kontrolle, PBS 4 4 (4)
    Kontrolle, RA 2 4 (4)
    Test, 2'RA (Hoher Druck) 1 1 (1)
    (Geringer Druck) 1 3 (3)
    Test 13' RA (Hoher Druck) 1 1 (1)
    (Geringer Druck) 1 1 (1)
    • *Intimale SMC-Hypertrophie, intimale Hypertrophie glatter Muskelzellen, bewertet auf einer Skala von 1+ (minimal) bi 4+ (maximal)
  • Die in 9A dargestellten Ergebnisse zeigen (bei 160 × Vergrößerung) einen Querschnitt einer unbehandelten Arterie fünf Wochen nach Angioplastie. Dominante histologische Eigenschaften der Arterie umfassen eine Verlagerung des Endothels (siehe #1 in 9A) weg von der internen elastischen Lamina (siehe #2 in 9A), anscheinend als Folge einer Proliferation der glatten Muskulatur der Intima (siehe #3, 9A).
  • Die in 9B dargestellten Ergebnisse zeigen (bei 160 × Vergrößerung) einen Querschnitt einer behandelten Arterie fünf Wochen nach Angioplastie und Infusion mit RA-NR-AN-01-therapeutischem Konjugat. Das Gefäß dieses Abschnitts war größerem mechanischen Stress unterworfen als das in 9A gezeigte Gefäß mit mehreren Stellen, an denen die externe elastische Membran gerissen war, und die mit einer Proliferation glatter Muskelzellen in die äußeren Schichten der Media (d.h. siehe #4 in 9B) verbunden waren. Die Behandlung mit dem therapeutischen Konjugat hemmte die Hypertrophie der Intima, was aus dem Fehlen einer Verlagerung des Endothels (siehe #1, 9B) aus der internen elastischen Lamina (siehe #2, 9B) hervorgeht. Überraschenderweise war dieser hemmende Effekt auf die glatten Muskelzellen der Intima nicht von einer Hemmung der Hypertrophie der medialen glatten Muskelzellen in den Bereichen, an denen die externe elastische Membran gerissen war (siehe #4, 9B), begleitet.
  • Dies ist ein sehr vorteilhaftes Ergebnis, weil die Wundheilung in den behandelten Gefäßen ohne die nachteiligen Konsequenzen einer Intima-Hyperplasie und Stenose oder Nekrose glatter Muskelzellen in der Media fortschreitet.
  • In diesen histologischen Untersuchungen wurden auch Vergleiche zwischen der Wirksamkeit von sowohl 2'- als auch 13'-Roridin-A-Konjugat durchgeführt mit dem Ergebnis, dass das 13'-Konjugat (d.h. 13'RA-HS-NR-AN-01) in Bezug auf die Hemmung der Hyperplasie glatter Muskelzellen der Intima aktiver erscheint als das 2'-Konjugat (d.h. 2'RA-HS-NR-AN-01). In diesen Untersuchungen scheint eine Infusion des 13'-Konjugats bei niedrigem Druck die Proliferation effektiver zu hemmen als bei hohem Druck und das 13'-Konjugat scheint auch aktiver zu sein als das 2'-Konjugat.
  • In 9B führt das nach Angioplastie verabreichte therapeutische Konjugat zu einer etwa 95%igen Hemmung der Hypertrophy glatter Muskeln, welche das Lumen in dem unbehandelten Gefäß (9A) einengt. Das therapeutische Konjugat verursacht diesen Effekt in signifikanter Weise auf die glatten Muskelzellen aus, welche von den medialen Schichten der glatten Muskulatur in die Intima wandern, ohne das Endothelium zu beeinflussen oder Anzeichen von Nekrose (d.h. Zelltod) in den glatten Muskelzellen der medialen Schichten der Arterienwand hervorzurufen. Die Untersuchungen zeigten auch keine histologischen Anzeichen einer mononuklearen Infiltration oder Fibrose, die aus toxischen Effekten auf die Gefäßwand resultieren können. Auch wurden sichtbare Anzeichen einer Heilung in den Lagen der Intima der behandelten Gefäße beobachtet und es wurde ein Neuwachstum von Endothel beobachtet, d.h. Endothelzellen wachsen auf der dünnen Schicht glatter Muskelzellen in der Intima, welche zwischen dem Endothel und der internen elastischen Lamina liegt (d.h. #I und #2, 9B). Diese gemeinsamen histologischen Befunde legen nahe, dass die höchst wünschenswerten Eigenschaften einer Wundheilung, Neuwachstum des Endothels und verbesserte Festigkeit die Folge einer Behandlung mit einem therapeutischen Konjugat sind, welches die Hyperplasie glatter Muskelzellen in den Lagen der Intima des Gefäßes hemmen.
  • BEISPIEL 8
  • Es wurde die Fähigkeit verschiedener therapeutischer Mittel untersucht, der die DNA-Synthese und Protein-Synthese in glatten Gefäßmuskelzellen zu hemmen. 3H-Leucin und 3H-Thymidin- Aufnahme und Zytotoxizitäts-Assays wurden entsprechend der folgenden Protokolle durchgeführt.
  • 3H-Leucin-Aufname:
  • Vasculäre glatte Muskelzellen wurden mit 40.000 Zellen/ml in Sterilen Platten mit 24 Vertiefungen mit 1 ml/Vertiefung gesät. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C, 5% CO, 95% Luft in einer feuchten Atmosphäre (Sättigung) inkubiert. Logarithmische Verdünnungen des jeweils interessierenden therapeutischen Mittels wurden mit den glatten Gefäßmuskelzellen 5 Minuten oder 24 Stunden inkubiert. Proben der therapeutischen Mittel wurden in DMEM: F-12-Medium (Whittaker Bioproducts, Walkersville, Maryland) mit 5% fötalem Kälberserum (GBS, Gibco) und 5% Serum Plus (JRH Biologicals) verdünnt. Nach der Inkubation des therapeutischen Mittels wurde die Lösung abgesaugt und 1 ml/Vertiefung 3H-Leucin in Leucin-freiem DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) mit 5% Serum Plus und 0,5 Mikrocurie/ml wurden hinzugegeben. Die Platten wurden erneut über Nacht bei 37°C 5% CO, in feuchter Atmosphäre inkubiert. Die Zellen wurden unter Verwendung eines inversen Mikroskops nach einer Bewertungsskala zur Bestimmung der Lebensfähigkeit und Zellzahl bewertet. Die Bewertung von 1 bis 3 basiert auf dem prozentualen Anteil der Zell-Lebensfähigkeit und der Anzahl im Vergleich zu den Kontroll-Vertiefungen, wobei 3 = 100%, 2 = 70% – 100% und 1 = 0% – 70% bedeutet. Eine Aufnahme dieser Bewertung hilft bei der Bestimmung zytotoxischer Effekte durch die therapeutischen Mittel. Das Medium wurde dann abgesaugt und die Zellen wurden dann zwei Mal mit kaltem 5%igem TCA gewaschen. 400 Mikroliter einer 0,2 M NaOH-Lösung gab man pro Vertiefung zu und inkubierte die Platten zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einer rotierenden Plattform. 200 Mikroliter pro Vertiefung der Zell-Lösung transferierte man in Plastik-Scintillationsgefäße (Bio-Rad Laborstories) und gab 4 ml flüssige Scintillationflüssigkeit BioSafe II vor den Vortexen zu. Die Gefäße wurden auf einem Reckmann LS2800-Flüssigscintillationszähler ausgezählt, der mit einem Interface für die Reckmann "Data Capture Software zur Umwandlung in ein Lotus 1-2-3 File und Analyse unter Lotus 1-2-3 ausgerüstet war.
  • 3H-Thymidin-Aufnahme:
  • Glatte Gefäßmuskelzellen wurden in einem Vollmedium mit 5% FBS (Gibco) in einer feuchten Umgebung mit 5% CO2, in sterilen Platten mit 24 Vertiefungen inkubiert. Man saugte das Medium von den Platten ab und ergänzte serumfreies Medium mit Wachstumsfaktoren (DMEM: F-12 Basismedium, ergänzt mit Wachstumsfaktor- Mischung Katalog Nr. 11884, das Insulin (5 Mikrogramm/ml), Transferrin (5 Mikrogramm/ml) und Natriumselenit (5 Nanogramm/ml) enthielt, erhältlich von Sigma Chemical, St. Louis, Missouri. Die Zellen wurden in diesem Medium 24 Stunden inkubiert. Für 5 Minuten Exposition mit dem therapeutischen Mittel wurden logarithmischen Verdünnungen des therapeutischen Mittels mit den Zellen in Vollmedium inkubiert. Nach 5 Minuten und Absaugen des Mediums gab man 1 ml/Vertiefung in Vollmedium dispergierten 1,0 Mikrocurie/ml zu. Bei der 24-stündigen Exposition wurden die Zellen mit 1 ml/Vertiefung in Vollmedium dispergiertem 3H-Thymidin mit 1,0 Mikrocurie/ml und logarithmischen Verdünnungen des getesteten therapeutischen Mittels inkubiert. In beiden Expositionsversuchen wurden die Zellen dann über Nacht bei 37°C in einer feuchten Umgebung mit 5% CO2, inkubiert. Die Zellen wurden visuell bezüglich Lebensfähigkeit und Zellanzahl bewertet. Die Zellen wurden gewaschen und für die Überführung in Plastikscintillationsröhrchen, wie für das 3H-Leucin Protokoll beschrieben, vorbereitet. Die Röhrchen wurden auf einem Reckmann LS2800-Flüssigscintillationszähler ausgezählt, der ein Interface mit der Reckmann "Data Capture-Software zur Umwandlung in ein Lotus 1-2-3 File und Auswertung unter Verwendung von Lotus 1-2-3 ausgerüstet war.
  • Diese Protokolle sind auch geeignet, für die Verwendung mit anderen Zielzellpopulationen angepasst zu werden, insbesondere adhärente Monolayer-Zelltypen.
  • Morphologische zytotoxische Untersuchung:
  • Glatte Gefäßmuskelzellen wurden mit 4,0 × 104 Zellen/ml Medium/Vertiefung auf kommerziell hergesellten 4-Vertiefungs-Platten (Nunc, Inc., Naperville) ausgesät. Es wurden genügend Platten eingesät, um sie an je zwei Expositionsdauern (5 Minuten und 24 Stunden) sowie an zuvor festgelegten Evaluierungspunkten (24 Stunden bis 128 Stunden) zu untersuchen. Alle Platten wurden in doppelter Ausführung durchgeführt, um etwaige Assay-Anomalien zu erkennen. Das therapeutische Mittel wurde in den gleichen Medien, wie sie für die 3H-Leucin und 3H-Thymidin-Assays verwendet wurden, verdünnt. Auf jeder der vier Vertiefungsplatten wurden Konzentrationen aufgebracht, die eine logarithmische Konzentration oberhalb (Vertiefung "B") und eine logarithmische Konzentration unterhalb (Vertiefung "D") der minimalen Wirkkonzentration (Vertiefung "C") war. Als Kontrolle für die normale Morphologie ließ man eine Vertiefung (Vertiefung "A") unbehandelt (nur Medium). Die Inkubation wurde bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2, durchgeführt. Nach jedem der beiden Expositionspunkte (5 Minuten und 24 Stunden) wurde das Medium mit dem therapeutischen Mittel aus jeder Vertiefung abgesaugt, einschließlich der unbehandelten Vertiefung. 1 ml frisches Medium wurde zugegeben, um das abgesaugte Medium zu ersetzen. Anschließend wurde erneut inkubiert, bis jeweils die vorbestimmten Evaluierungspunkte erreicht waren. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Medium abgesaugt und anschließend durch 1 ml 10%iges, neutral gepuffertes Formalin eine Stunde ersetzt, um eine sachgerechte Fixierung zu erreichen. Die fixierten Platten wurden durch Hematoxylin (Zellkern) und Eosin (Cytoplasma) für die morphologische Evaluierung und Bewertung gefärbt. Die Ergebnisse des 24 Stunden 3H-Leucin-Protein-Hemmungsassays und des 24 Stunden 3H-Thymidin-DNA-Synthesehemmungsassays werden in den 10A-10C für Suramin, Staurosporin und Nitroglycerin gezeigt. Jede der getesteten Verbindungen besaß einen zugänglichen therapeutischen Bereich (der Bereich unter der Kurve des 3H-Leucin-Assays ist größer als der aus dern 3H-Thymidin-Assay resultierende), was die Brauchbarkeit der erfindungsgemäßen Ausführungsformen mit verzögerter Dosierungsform in der Praxis belegt. Insbesondere hemmen die Verbindungen die Fähigkeit, DNA-Synthese in Gegenwart von 5% FBS durchzuführen, in einem größeren Ausmaß, als sie die Protein-Synthese glatter Gefäßmuskelzellen hemmen.
  • BEISPIEL 9
  • Die Fähigkeit glatter Gefäßmuskelzellpartikel, welche mit dem bindenden Protein oder Peptid beschichtet sind, zu binden und aufzunehmen, wurde sowohl in vivo als auch in vitro anhand von Goldteilchen nachgewiesen, die mit monoklonalem Antikörper (NR-AN-01) beschichtet waren. Die glatten Gefäßmuskelzell- Gewebekulturen (BO54), eine Antigen-positive Kontrollzelllinie (A375) und eine Antigen-negative Kontrollzelllinie (HT29) wurden mit 10 Nanometer Gold-Teilchen inkubiert, wobei eine Gruppe mit NR- AN-01 beschichtet war und eine zweite Kontrollgruppe unbeschichtet war. Die Zellen wurden den Teilchen als Monolager ausgesetzt und Zellsuspensionskulturen wurden an sechs Zeitpunkten (d.h. 1 Minute, 5 Minuten, 15 Minuten, 30 Minuten, 60 Minuten und 24 Stunden) hinsichtlich Bindung und Aufnahme (bzw. Internalisierung) mittels Elektronenmikroskopie untersucht.
  • Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der Untersuchungen, welche zeigen, dass das Binden an die Zelloberfläche spezifisch ist. Wenn Partikelaggregate auf der Monolayer-Oberfläche sowohl der glatten Gefäßmuskelzellen als auch der Kontrollzellen abgelagert wurden, wurden diese Teilchen nicht spezifisch durch Makro- Mikrophagozytose internalisiert. Bei der nicht spezifischen Haftung von Goldplättchen ohne NR-AN-01 auf der Oberflache wurde von den NT29-Zellen produziertes Mucin beobachtet, was zu einer moderaten, nicht spezifischen Internalisierung führte. Die Aufnahme der mit NR-AN-01 versehenen Goldteilchen durch glatte Gefäßmuskelzellen war in Zellsuspensionkulturen hochspezifisch.
    Figure 00720001
  • 11 zeigt einen tangentialen Schnitt parallel zur inneren Fläche einer glatten Muskelzelle, die durch zahlreiche endozytische Vesikel charakterisiert ist, von denen einige Antikörperbeschichtete Goldpartikel enthalten, welche gerade von der Zelle aufgenommen werden. Diese endozytischen Vesikel mit an der Zelloberfläche gebundenen Antigenen wurden stimuliert, so dass sie mit Lysosomen in einem höheren Ausmaß fusionieren, als dies bei einem normalen Zellrecycling von Oberflächenmembranen der Fall ist. Die resultierende deutliche Anreicherung an internalisierten Partikeln wurde am 24 Stunden-Zeitpunkt festgestellt und ist in 12 dargestellt.
  • Die auf die Bindung an die Oberfläche glatter Gefäßmuskelzellen, Internalisierung und Lysosomanreicherung ausgerichteten Goldpartikel wurden ebenfalls in vivo untersucht. NR-AN-01 beschichtete Goldpartikel wurden bei einem Druck von 3 atm innerhalb von 3 Minuten in die Oberschenkelarteriewand eines Schweins unmittelbar im Anschluss an ein durch einen Ballon hervorgerufenes Trauma mit einem intravascularen Katheter eingeführt, der zur behandelten Fläche, die proximal und distal mit gleitender Ligatur verschlossen ist, offen ist. Die Internalisierungsrate der Partikel variierte mit dem Grad der Schädigung, welche die glatte Gefäßmuskelzelle durch das durch einen Ballon hervorgerufene Trauma erlitten hatte. Zellen mit geringer oder ohne Schädigung internalisierten die Partikel durch Endozytose oder Phagozytose rasch, wobei sich die internalisierten Partikel in Lysosomen anreicherten. Durch das Trauma zerstörte Zellen zeigten eine Bindung an die Oberfläche der Partikel. Zellen, die durch das Trauma beschädigt wurden aber noch am Leben waren, wurden durch Bindung an die Oberflache der Partikel mit verzögerter Internalisierung und Lysosomanreicherung gekennzeichnet.
  • 13 zeigt die spezifische Anreicherung in den Lysosomen in vivo eine Woche nach der Verabreichung der Partikel.
  • Literaturverzeichnis
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  • Während die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung illustriert und beschrieben worden ist, wird anerkannt werden, daß etliche Änderungen daran vorgenommen werden können, ohne Geist und Umfang der Erfindung zu verlassen.

Claims (35)

  1. Therapeutisches Konjugat umfassend ein bindendes Protein oder Peptid, verbunden mit einem therapeutischen Mittel, wobei das bindende Protein oder Peptid spezifisch an Zellmembranen entweder glatter Gefäßmuskelzellen oder Perizyten bindet, oder an die interstitielle Matrix der Arterienwand bindet, und wobei das therapeutische Mittel den zellulären Metabolismus verändert oder eine zelluläre Aktivität der glatten Gefäßmuskelzellen oder Perizyten inhibiert.
  2. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 1, wobei die inhibierte Zellaktivität ausgewählt ist aus mindestens einer der Möglichkeiten Proteinsynthese, DNA-Synthese, Spindelfaserbildung, zelluläre Proliferation, Zellmigration, Mikrotubulibildung, Mikrofilamentbildung, Synthese extrazellulärer Matrix, Sekretion extrazellulärer Matrix, oder Steigerung des Zellvolumens.
  3. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 1, wobei das therapeutische Mittel die Zielzelle im Wesentlichen nicht abtötet.
  4. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 1, wobei das therapeutische Mittel zytotoxisch ist.
  5. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 4, wobei das zytotoxische therapeutische Mittel ein Sesquiterpenoid-Mykotoxin ist.
  6. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 5, wobei das Sesquiterpenoid-Mykotoxin Verrucarin oder Roridin ist.
  7. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 1, wobei das therapeutische Mittel zytostatisch ist.
  8. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 7, wobei das zytostatische therapeutische Mittel ausgewählt ist aus mindestens einer der Möglichkeiten Modifizierte Toxine, Methotrexat, Adriamycin, Radionukliden, peptidischen oder mimetischen Inhibitoren, oder Proteinkinaseinhibitoren.
  9. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 7, wobei das zytostatische therapeutische Mittel ausgewählt ist aus mindestens einer der Möglichkeiten Subfragmente von Heparin, Triazolpyrimidin, Lovastatin, oder Prostaglandinen E1 oder 12.
  10. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 1, wobei das therapeutische Mittel ein zytoskelettaler Inhibitor ist.
  11. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 10, wobei der zytoskelettale Inhibitor Coichicin oder Vinblastin ist.
  12. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 1, wobei das therapeutische Mittel ein metabolischer Inhibitor ist.
  13. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 12, wobei der metabolische Inhibitor ausgewählt ist aus mindestens einer der Möglichkeiten Trichothecenen, modifizierten Diphterie-, Ricin-Toxinen oder Pseudomonas-Exotoxin.
  14. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 1, wobei das an glatte Gefäßmuskelzellen bindende Protein oder Peptid spezifisch mit einem Chondroitinsulfat-Proteoglykan verknüpft ist, das auf den Membranen der glatten Gefäßmuskelzelle exprimiert wird.
  15. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 14, wobei das Chondroitinsulfat-Proteoglykan ein Molekulargewicht von etwa 400 kD aufweist.
  16. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 14, wobei das Chondroitinsulfat-Proteoglykan ein Molekulargewicht von etwa 250 kD aufweist.
  17. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 14, wobei das die glatte Gefäßmuskelzelle bindende Protein oder Peptid spezifisch mit einer Assoziationskonstante von 104 l/Mol an das Chondroitinsulfat-Proteoglykan bindet.
  18. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 1, wobei das bindende Protein oder Peptid an intrazelluläres Stroms und Matrix zwischen glatten Muskelzellen und um diese herum lokalisiert ist.
  19. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 18, wobei das bindende Protein oder Peptid spezifisch an Kollagen, extrazellulären Glykoproteinen, Tenascin, retikulären Fasern, elastischen Fasern oder anderen Verbindungen der interzellulären Matrix gebunden wird.
  20. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 1, wobei das Tumorzellen-bindende Protein oder Peptid an Zelloberflächenmarker, oder deren cytoplasmatische Epitope, gebunden wird, die von der Zieltumorzelle exprimiert werden.
  21. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 20, wobei das Tumorzellen-bindende Protein oder Peptid an Epitope von myc, ras, bcr/Abl, erbB, Mucinen, IL-6, EGF oder TGF gebunden wird.
  22. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 1, wobei das Immunsystemeffektorzellen-bindende Protein oder Peptid an Zelloberflächenmarker der Zielimmunsystemeffektorzelle oder deren cytoplasmatische Epitope gebunden wird.
  23. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 22, wobei das Immunsystemeffektorzellen-bindende Protein oder Peptid anti-TAC oder IL-2 ist.
  24. Das therapeutische Konjugat nach einem der Ansprüche 1-23, wobei das therapeutische Mittel in einer Dosierungsform vorliegt.
  25. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 24, wobei die Dosierungsform bioabbaubar ist.
  26. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 24, wobei die Dosierungsform Mikropartikel, Nanopartikel oder ein Gemisch aus diesen umfasst.
  27. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 26, wobei die Mikropartikel oder Nanopartikel ein Polymer umfassen, das aus der Kondensation von Hydroxycarbonsäuren und verwandten Laktonen abgeleitet ist.
  28. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 26, wobei die Mikropartikel oder Nanopartikel aus einem Gemisch thermoplastischer Polyester gebildet ist.
  29. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 26, wobei der thermoplastische Polyester ein Polylactid, ein Polyglycolid, oder ein Copolymer aus Lactid und Glycolid ist.
  30. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 24, wobei die Dosierungsform eine Retarddosierungsform ist, welche in der Lage ist, das therapeutische Mittel über eine Zeitspanne freizusetzen.
  31. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 30, wobei die Zeitspanne zur Freisetzung des therapeutischen Mittels im Bereich von etwa 3 bis etwa 180 Tage liegt.
  32. Das therapeutische Konjugat nach Anspruch 31, wobei die Zeitspanne zur Freisetzung des therapeutischen Mittels im Bereich von etwa 10 bis etwa 21 Tage liegt.
  33. Verwendung des therapeutischen Konjugats nach einem der Ansprüche 1-32 zur Herstellung einer therapeutisch wirksamen Dosierung eines Arzneimittels zur Verminderung von Stenose nach Angioplastie.
  34. Die Verwendung nach Anspruch 33, wobei das Arzneimittel in einer Form vorliegt, die zur Verabreichung mit einem Katheter an einem Verabreichungsort in einem Patienten geeignet ist.
  35. Die Verwendung nach Anspruch 33, wobei das Arzneimittel in einer Form vorliegt, die zur Verabreichung mit einer Infusionsnadel an einem Verabreichungsort in einem Patienten geeignet ist.
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