CN114146087B - 一种毛钩藤碱在治疗血小板减少症药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物化学领域，具体涉及毛钩藤碱在制备治疗血小板减少症药物中的应用；所述毛钩藤碱如式I所示。本发明毛钩藤碱在制备药物中的应用，可以显著提升体内血小板水平，降低血小板减少症患者的出血风险和需要输血的机率，降低输血感染风险；并且相比于TPO及TPO受体激动剂（如艾曲波帕、罗米司亭等）治疗费昂贵的限制，毛钩藤碱具有获取容易、成本较低、副作用小等优势，可以大大减少患者家庭负担和降低社会医疗保障经费压力。

Description

一种毛钩藤碱在治疗血小板减少症药物中的应用
技术领域
本发明涉及药物化学领域，特别是一种天然药物化合物在制备药物中的用途，具体涉及毛钩藤碱在治疗血小板减少症药物中新用途。
背景技术
血小板减少症(Thrombocytopenia)导致的出血是当今医学治疗的难题之一。其发生病因主要涉及三类：血小板生成减少(如骨髓衰竭综合征)、血小板清除增加(如免疫性血小板减少性紫癜)以及血小板滞留时间延长(如脾功能亢进、药物、妊娠等引起的血小板减少症)。其中，成人原发免疫性血小板减少症(ITP)的发病率约为(5～10)/10万，60岁以上的老年人是该病的高发群体。ITP引起的血小板减少主要以体液或细胞免疫障碍导致巨核细胞(MKs)数量、质量异常，血小板生成减少，进而诱发皮肤黏膜出血。虽然ITP可治疗、可控制，但目前尚无法彻底治愈，也不能改变其自然病程。
另一方面，抗肿瘤化疗药物对骨髓巨核细胞产生抑制作用，肿瘤患者血小板减少症发生率为9.7％，而“顺铂+吉西他滨”化疗方案的血小板减少的发生率则高达37％。此外，在国内入住重症监护病房的患者中，8.3％至67.6％存在血小板减少的现象。治疗过程中，有14％至44％的重症患者发生血小板减少，使得患者的发生出血事件、输血量、死亡风险也显著上升。
现阶段关于血小板减少症的治疗方法主要有输注血小板、促血小板生长因子、促血小板生成素受体激动剂、免疫治疗及其他治疗。但以上手段治疗效果十分有限，副作用也难以预防。据报道，血小板同种异体免疫反应的抗人白细胞抗原(Anti-human leukocyteantigen，HLA)抗体可能导致血小板输注无效，同时尚可增加感染性疾病发生的风险，细胞生长因子有产生抗血小板生成素(thrombopoietin，TPO)抗体的可能。而且，TPO及TPO受体激动剂(如艾曲波帕、罗米司亭等)治疗费用昂贵，加大了家庭负担和社会压力。
中药是药用化合物的天然宝库，同时也是发现新型活性化合物的重要途径。近年来，许多临床及基础研究已证实，中药植物中几种天然活性成分包括有机酸类、酚类、黄酮类、多糖类、植物氨基酸等具有一定的止血、凝血之功效。在多种因素导致的血小板减少及巨核细胞生成障碍的治疗手段上，中药活性成分促造血的应用无疑提供了一种安全、有效、低价的治疗新思路。
茜草科(Rubiaceae)植物钩藤(Uncaria Rhynchophylla(Miq.)Jacks)广泛分布于我国的两广、四川、云南、贵州、江西等地。2010年版《中华人民共和国药典》记载包括以带钩茎枝为主要药用成分的大叶钩藤、毛钩藤、华钩藤、无柄果钩藤，均为钩藤属。古代中医认为钩藤性寒味甘，归肝、心包经，具清热平肝、熄风定惊等功效。现代大量医学研究表明，钩藤含有吲哚生物碱、黄酮类化合物、三萜类化合物等多种化学成分，其中吲哚生物碱为最重要的有效活性成分，毛钩藤碱(HS)属柯楠属型吲哚类生物碱。研究表明，HS具有调节心血管功能、神经保护、抗肿瘤、改善肿瘤耐药等药理学效应，尚无关于钩藤对于血小板减少症的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于：针对现有技术存在的血小板减少症治疗效果不佳的问题，提供一种天然药物化合物毛钩藤碱在制备治疗血小板减少症药物中的应用。
发明人通过细胞实验以及动物实验，发现造血干细胞、巨核系祖细胞经过HS处理后，在分子层面影响GATA-1、FOG-1等信号通路，促进巨核系祖细胞分化，增加血小板分化与成熟，达到改善血小板减少症的效果。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种毛钩藤碱在制备治疗血小板减少症药物中的应用；所述毛钩藤碱如下式I所示。
毛钩藤碱：C22H28N2O3
骨髓巨核细胞分化成熟障碍是造成血小板生成减少的重要原因，血小板由成熟巨核细胞胞质裂解脱落而成，其形成过程为：造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)分化为巨核系祖细胞，然后巨核系祖细胞分化为成熟的巨核细胞，最后是成熟的巨核细胞经过复杂的血管内微环境的刺激向血小板转化。毛钩藤碱能够作用于CD41、CD42b表面抗原，通过激活分化相关信号通路的蛋白方式，促进巨核系祖细胞发育为成熟巨核细胞期间，巨核细胞体积增大，内部充满血小板特异性颗粒，细胞质中骨架蛋质含量增加，形成高度曲折的凹陷内膜分化为血小板，改善辐照致血小板减少症症状。
通过小鼠试验进一步验证了毛钩藤碱在小鼠体内促进巨核系祖细胞分化的作用，发现可能通过作用于MEK-ERK通路，并调控该通路下游核转录因子FOG-1、TAL-1的表达，进一步调控K562细胞分化，确认毛钩藤碱具有促血小板生成的体内活性作用，能够改善血小板减少症。因此，毛钩藤碱可以从巨核系祖细胞分化的机理上，消除巨核细胞分化障碍所导致的造血功能障碍，实现诱导巨核细胞分化、成熟、释放，促进血小板生成。
作为本发明的优选方案，所述血小板减少症是由于化疗和/或放疗所致血小板减少症。现有医学技术对于多种疾病的治疗方案都常常会伴随发生血小板减少症的问题，通过应用毛钩藤碱进行改善，可以很好地辅助现有医学治疗方案的实施。
作为本发明的优选方案，所述血小板减少症是原发性或继发性贫血所致血小板减少症。
毛钩藤碱促进巨核细胞成熟及分化，可促进释放大量血小板发挥止血、凝血、血管修复等多重生理功能。通过向小鼠注射毛钩藤碱可以提高辐射小鼠血小板最低值，缩短血小板恢复正常时间，对小鼠体重影响不明显，对肝脏、脾脏没有明显毒副作用。
作为本发明的优选方案，所述药物是治疗下列任意一种疾病的药物：再生障碍性贫血(AA)、化疗诱导血小板减少(CIT)、急性白血病化疗后血小板减少症、原发免疫性血小板减少症(ITP)、弥散性血管内凝血(DIC)、血栓性血小板减少症(TTP)、肝素诱发的血小板减少症(HIT)、系统性红斑狼疮(SLE)、特发性血小板减少性紫癜、慢性肝病相关血小板减少症。
作为本发明的优选方案，所述毛钩藤碱通过促进表面抗原CD41/CD42b表达发挥促进巨核细胞分化作用。或者包括以下活性机理，所述毛钩藤碱通过激活分化相关信号通路的蛋白的方式发挥作用。或者包括以下活性机理，所述毛钩藤碱通过干预K562和/或Meg-01促进细胞分化。
作为本发明的优选方案，所述毛钩藤碱通过影响GATA-1、GATA-2、FOG-1、TAL-1、RUNX-1、NF-E2等核转录因子，实现促进人红白血病细胞(如K562细胞)分化的作用，达到治疗血小板减少症作用。
毛钩藤碱干预作用下，巨核细胞表面的CD41/CD42b表达提高，选择性实现巨核细胞分化成熟，向巨核系分化而非红系(HS干预作用下，红系特异性转录因子KLF-1没有显著改变，即从基因层面没有向红系分化)。HSCs分化至早期巨核系祖细胞，并从巨核系祖细胞发育为成熟巨核细胞期间，巨核细胞体积增大，内部充满血小板特异性颗粒，细胞质中骨架蛋质含量增加，形成高度曲折的凹陷内膜，特异性表面抗原CD41(GPⅡb/Ⅲa受体)持续表达。
优选地，经过分子对接分析，确定HS与MEK在细胞内有互相结合的可能性。而后，通过细胞实验，印证了所述毛钩藤碱通过调控MEK-ERK通路实现细胞分化干预，并调控通路下游核转录因子FOG-1、TAL-1的表达，调控K562细胞分化。
优选地，所述毛钩藤碱通过核转录因子GATA-1、FOG-1、TAL-1、RUNX-1、NF-E2作用，实现促进细胞分化作用。
毛钩藤碱通过多种路径影响巨核系祖细胞的分化，引导多种信号通路(可能与上调MEK/ERK信号通路参与转录因子FOG-1和TAL-1表达有关)使得巨核细胞发育成熟及分化，实现促进巨核细胞分化(促血小板生成)的作用。
进一步，所述毛钩藤碱在制备的药物中含量大于或等于5mg。根据小鼠动物实验结果显示，大于或等于5mg/kg的给药量，能够提高辐射血小板减少小鼠模型的血小板最低值，缩短血小板恢复至正常时间。
优选地，所述毛钩藤碱在制备的药物中含量为5-500mg。实验发现毛钩藤碱在10μM条件下对巨核细胞分化影响最显著，其主要针对巨核细胞分化的早期。按照成人体重和小鼠试验体重及比表面积进行换算，毛钩藤碱制成药物含量控制在上述范围可以较好的发挥作用。例如，可以是8mg、10mg、20mg、30mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg等。进一步经过换算后，优选毛钩藤碱在制备的药物中含量为10-100mg。更优选地，毛钩藤碱含量为30-60mg。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明毛钩藤碱在制备药物中的应用，利用毛钩藤碱具有促巨核细胞分化(促血小板生成)的作用，通过毛钩藤碱改善治疗血小板减少症，小鼠试验结果表明在使用毛钩藤碱干预7天以后，小鼠外周血液中血小板含量提高和模型组相比有显著升高。给药第14天，与模型组相比有显著升高，表明毛钩藤碱具有很好的实现了血小板减少症治疗作用。所以，本发明应用毛钩藤碱可以降低血小板减少症患者的需要输血的机率，相应的降低输血感染风险，对于治疗危害国民健康血液系统疾病具有重要意义。
2、本发明毛钩藤碱应用于治疗血小板减少症，相比于TPO及TPO受体激动剂(如艾曲波帕、罗米司亭等)治疗费昂贵的限制，毛钩藤碱可以通过天然中药材原料提取获得，具有容易获取的优势，治疗成本相比于现有药物治疗方案降低50％以上，可以大大减少患者家庭负担和降低社会医疗保障经费压力。而且，毛钩藤碱促进巨核细胞分化产生血小板的作用强度适宜，不会造成血小板的过度升高。
附图说明
图1是HS干预K562不同时间-浓度镜下形态学改变。
图2是HS干预Meg-01不同时间-浓度镜下形态学改变。
图3是不同时间-浓度HS对K562、Meg-01细胞CD41/CD42b的表达影响。其中，A.K562细胞的流式结果；B.Meg-01细胞的流式结果。
图4是不同时间-浓度HS对K562、Meg-01细胞CD41/CD42b表达影响的结果统计图。其中，A、C为CD41表达结果统计图；B、D为CD42b表达结果统计图。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n＝3。
图5是HS干预K562、Meg-01细胞的Giemsa染色结果。其中，A.K562细胞Giemsa染色；B.Meg-01细胞Giemsa染色。
图6是K562和Meg-01的DNA倍性结果。A.K562细胞；B.Meg-01细胞。
图7是K562和Meg-01的DNA倍性结果统计图。其中，A.K562细胞；B.Meg-01细胞。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；n＝3。
图8是qRT-PCR检测第1、3、5、7天基因变化水平。与对照组相比，**P<0.01，***P<0.001；n＝3。
图9是PCR检测不同基因在不同时间点的变化水平，注：将空白对照组默认为1，在图中以虚线标示。
图10是HS干预K562细胞的JAK2、STAT3、STAT5蛋白表达。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；n＝3。
图11是统计分析HS对K562细胞JAK2、STAT3、STAT5蛋白表达。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n＝3。
图12是HS干预K562细胞的MEK、ERK蛋白表达。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n＝3。
图13是统计分析HS对K562细胞MEK-ERK蛋白表达水平。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n＝3。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明作详细的说明。为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例(一)体外实验
1主要实验材料
1.1实验细胞和实验药品
K562细胞：人红白血病细胞，于2017年5月由西南医科大学附属医院中心实验室惠赠。Meg-01细胞：人成巨核白血病细胞，于2019年3月购于北京中原公司(ATCC中国代理商)。
毛钩藤碱，英文名Hirsutine，缩写HS，CAS：7729-23-9，分子量368.47。单体成分由课题组前期购于成都普思科技生物有限公司，纯度≥98％，生产批号：19092602。HS粉末于4℃长期避光、干燥保存。细胞使用药品：二甲基亚砜(DMSO)按恰当比例配置后于-20℃冰箱中保存，保存期不超过3个月。
1.2主要实验试剂
表1主要实验试剂信息
1.3主要实验仪器
以下实施例中使用的部分仪器名称、制造商和仪器型号信息如下：STS-8A转移脱色摇床，上海，琪特分析仪器，STS-8A。凝胶成像分析系统，美国，Bio-Rad，ChemiDocXRS。正置荧光显微镜，德国leica DM2000；倒置相差显微镜，Olympus CKX53；立式压力蒸汽灭菌器，博讯实业YXQ-LS-100A；流式细胞仪，BD FACSVerse。
2实验方法
2.1HS对K562和Meg-01细胞分化的形态学影响
取对数生长期K562和Meg-01细胞，细胞培养体系为2mL/孔，K562细胞数为每孔2×104个/mL，Meg-01细胞数为4×104个/mL，均采用6孔板培养。分别设置对照组(Control)、HS组(药物浓度为10、5、2.5μM)。Meg-01细胞设置对照组(Control)、HS组(药物浓度为10、5、2.5μM)，各组设置三个重复孔。每天倒置显微镜下观察细胞的形态学变化(巨核细胞分化后形态增大)，并于开始出现细胞形态变化第3、5、7天随机取细胞分布均匀的视野进行拍照记录。
2.2流式细胞术检测HS对K562和Meg-01细胞表面抗原表达的影响
取对数生长期K562和Meg-01细胞，细胞培养体系为2mL/孔，K562细胞数为每孔2×104个/mL，Meg-01细胞数为4×104个/mL，均采用6孔板培养。分别设置对照组(Control)、HS组(药物浓度为10，5，2.5μM)。Meg-01细胞设置对照组(Control)、HS组(药物浓度为10，5，2.5μM)，各组设置三个重复孔。分别于干预第3、5、7天从培养箱中取出6孔板，将拍照记录后的所有细胞收集并转移至2mLEP管中1000r/min×5min离心后去上清，并用预冷PBS洗涤一次。调整细胞密度为1×106个/mL。取100μL细胞悬液于EP管中，冰上避光加入5μL FITC-CD41染液和5μL PE-CD42b染液，用200μL移液器枪头轻轻混匀，冰上避光孵育30min。在K562细胞体系中，按上述方法冰上避光加入5μL PE-CD71染液孵育30min。30min后将EP管中的液体转移至流式检测管中，再加入400μL PBS停止反应，混匀后冰上避光送检。采用FCM检测细胞抗原表面标志物CD41/42以及K562细胞的CD71的表达。X坐标通道选择FITC，Y坐标通道选择PE-A，实验重复三次。
2.3Giemsa染色检测HS对K562和Meg-01细胞的形态学的影响
取对数生长期的K562、Meg-01细胞进行Giemsa染色，参考试剂使用说明进行染色操作。细胞培养体系为2mL/孔，K562细胞数为每孔2×104个/mL，Meg-01细胞数为4×104个/mL，均采用6孔板培养，细胞种板及细胞密度计算方式同上，并设置三个重复孔放入培养箱中培养7天。从培养箱中取出培养至第7天的K562及Meg-01细胞，收集全部细胞后1000r/min×5min离心去上清，然后用预冷PBS洗涤一次。取Giemsa浓缩液100μL，Giemsa稀释液900μL充分混匀，即可使用(即Giemsa染色液)。用移液器取10μL细胞悬液滴于干燥、干净载玻片上，按常规制备血涂片方法制备染片，并放置于通风橱自然风干。制备的染色涂片厚薄适宜，细胞分布均匀。用甲醇固定2～3min，将染色涂片放置染色架上，滴加稀释好的Giemsa染色液使其覆盖全部细胞涂片范围，室温染色7～10min。用自来水缓慢从玻片一端冲洗(注意：勿先倒去Giemsa染液或直接对细胞涂片处冲洗)，在微湿状态下镜下观察。待水膜风干后滴1滴中性树胶封片(注意缓慢封片，避免产生气泡影响后续观察及拍照)。中性树胶封片后平铺放置室内48h后镜下观察并选用放大倍数为10×，20×显微镜拍照。
2.4流式细胞术检测HS对K562和Meg-01细胞表面抗原表达的影响
取对数生长期K562和Meg-01细胞，细胞培养体系为2mL/孔，K562细胞数为每孔2×104个/mL，Meg-01细胞数为4×104个/mL，均采用6孔板培养。分别设置对照组(Control)、HS组(药物浓度为10、5、2.5μM)。Meg-01细胞设置对照组(Control)、HS组(药物浓度为10、5、2.5μM)，各组设置三个重复孔。第7天从培养箱中取出6孔板，收集全部细胞，300×g离心5min。
使用Cycletest Plus DNA Reagent试剂盒检测：去上清并留50μL，加入1mLBuffer重悬。常温300×g，离心5min，留50μL去上清液。加入1mLBuffer重悬，计数，调整细胞密度为1×106个/mL，取5×105个细胞，常温下离心，400g×5min后尽去上清，根据CycletestPlus DNA Reagent试剂盒说明书加入125μL A液孵育10min，加入125μL B液孵育10min，冰上加入C液100μL，避光4℃孵育10min。上流式细胞仪机器检测。
上述检测应用的CycleTEST PLUS DNA试剂盒包含四个组件：A液(10毫升)：在精胺四盐酸盐洗涤剂缓冲液中含有胰蛋白酶，用于实体组织碎片的酶解以及细胞膜和细胞骨架的消化。B液(8毫升)：在柠檬酸盐稳定缓冲液和精胺四盐酸盐中含有胰蛋白酶抑制剂和核糖核酸酶A，以抑制胰蛋白酶活性并消化RNA。C液(8毫升)：在柠檬酸盐稳定缓冲液中含有碘化丙啶(PI)和精胺四盐酸盐。PI以化学计量方式与DNA结合，最终浓度至少为125μg/mL。Buffer缓冲溶液(3瓶，每瓶50毫升)：含有柠檬酸钠、蔗糖和二甲基亚砜(DMSO)，用于收集和/或冷冻细胞悬液。
2.5联苯胺染色
部分药品及细胞准备同Giemsa染色。染色方法及镜下拍照观察：从培养箱中取出培养至第7天的K562和Meg-01细胞，收集全部细胞后1000r/min×5min离心去上清，然后用预冷PBS洗涤一次。细胞涂片滴加预冷甲醛固定液，4℃固定30～60s。染色前，过氧化物酶染色液(DAB染色液)B1与过氧化物酶氧化剂(DAB氧化剂)B2按B1:B2＝1000:1比例混合，即为POX孵育液。POX孵育液现配现用。在细胞涂片表面滴加配制好的POX孵育液，室温(20～25℃)避光孵育25～30min，水洗2min。滴加WG染色液，孵育30～60s。直接滴加等量WG buffer，染色10～15min。用自来水缓缓从载玻片一端冲洗，晾干后镜检。
3、实验结果
3.1HS对K562、Meg-01细胞镜下分化的影响
镜下观察结果显示HS药物浓度为10μM、5μM、2.5μM作用于K562、Meg-01细胞后的第3天没有明显变化，第5天开始出现细胞变大，形态呈圆形、椭圆形等不规则形态改变，其效果持续至第7天细胞长满整块六孔板。如图1(K562)、图2(Meg-01)。
镜下观察结果显示HS药物浓度为10μM、5μM、2.5μM作用于K562、Meg-01细胞后的第3天没有明显变化，第5天开始出现细胞变大，形态呈圆形、椭圆形等不规则形态改变，其效果持续至第7天细胞长满整块六孔板。
3.2HS对K562、Meg-01细胞表面抗原表达的影响
HS在10、5、2.5μM药物浓度下作用于K562、Meg-01细胞后的第3、5、7天通过FCM测定细胞表面抗原标志物CD41和CD42b的相对表达量。其结果显示：在第3天，HS 10μM对K562细胞CD41表达影响显著，对照组：8.59％±2.77％，HS 10μM组：38.6％±5.459％(P＜0.001)，HS 5μM组为30.93％±0.60％，HS药物浓度2.5μM组为21.885％±0.28％，相较于对照组均有显著差异(P＜0.001)；第5天，3个不同浓度的CD41表达与对照组(1.60％±0.99％)相比，HS10μM组为14.80％±4.74％，有统计学差异(P＜0.001)，HS 5μM组为8.56％±1.32％，有统计学差异(P＜0.05)；第7天，HS药物浓度10μM组为9.05％±0.69％，CD41表达与对照组(2.52％±0.24％)相比，有统计学差异(P＜0.01)，HS 5μM组为10.12％±1.70％，有统计学差异(P＜0.01)。如图3中A所示、图4中A所示。
K562细胞CD42b表达结果显示：在第3天，10、5、2.5μM与对照组相比均有显著差异(P＜0.001)；在第5天，除10μM与对照组相比有显著差异外(P＜0.001)，5、2.5μM与对照组相比没有显著差异(P＞0.05)；在第7天，10、5、2.5μM与对照组相比均无显著差异(P＞0.05)。如图3中A所示、图4中B所示。
HS对Meg-01细胞的影响与K562细胞相比不完全相同。不同浓度的HS干预Meg-01细胞的FCM检测结果显示：第3天，CD41表达与对照组为3.045％±1.51％，10μM药物组为14.585％±0.29％，与对照组比较有统计学差异(P＜0.001)，5μM药物组为5.815％±1.36％，2.5μM药物组为4.01％±1.0％；第5天CD41表达的对照组为9.09％±3.58％，10μM药物组为17.855％±4.21％，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，5μM药物组为6.89％±3.13％，2.5μM药物组为12.64％±3.41％；第7天CD41表达的对照组为11.66％±3.82％，与对照组相比，10μM药物组为21.9％±0.14％，有统计学差异(P＜0.001)，5μM药物组为11.26％±0.83％，2.5μM药物组为12.92％±2.74％。如图3中B所示、图4中C所示。
Meg-01细胞CD42b表达结果显示：在第3天，10μM浓度与对照组相比有差异(P＜0.05)；在第7天，10μM浓度与对照组相比有显著差异(P＜0.001)。如图3中B所示、图4中D所示。
其中，图3是不同时间-浓度HS对K562、Meg-01细胞CD41/CD42b的表达影响。其中A.K562细胞的流式结果；B.Meg-01细胞的流式结果。图4是不同时间-浓度HS对K562、Meg-01细胞CD41/CD42b表达影响的结果统计图。其中，A、C为CD41表达结果统计图；B、D为CD42b表达结果统计图。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n＝3。
3.3HS对K562、Meg-01细胞Giemsa染色的形态观察
按照“Giemsa染色的形态观察”试验方法进行细胞实验。通过FCM及镜下观察时间浓度变化的关系显示结果，选用10μM浓度下的HS处理K562、Meg-01细胞后第7天，显微镜下Giemsa染色观察结果显示：与对照组相比，HS药物组中K562、Meg-01细胞出现多倍体增加、细胞核分叶增多的现象。染色结果如图5所示，HS干预K562、Meg-01细胞的Giemsa染色结果，其中A.K562细胞Giemsa染色；B.Meg-01细胞Giemsa染色。
3.4HS促K562、Meg-01细胞分化的DNA倍性变化
K562、Meg-01两株细胞对HS药物浓度10μM干预后的第7天，DNA倍性表现结果并不完全相同。FCM结果显示：毛钩藤碱10μM干预后，对照组K562细胞株的2N细胞数量为对照组：60.35％±9.050％、药物组：47.75％±0.75％。4N细胞数量百分比为对照组：28.17％±0.60％、药物组：38.50％±0.7937％，显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。≥8N细胞数量百分比为对照组：1.61％±0.83％、药物组：12.87％±1.16％，百分比显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)。
Meg-01细胞株药物干预后2N细胞数量百分比为对照组：64.55％±0.9500％、药物组：56.90％±0.50％，低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；4N细胞数量对照组：27.75％±0.55％、药物组：35.25％±0.25％，其百分比显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)；但≥8N细胞数量百分比为对照组：2.56％±0.57％、药物组：4.17％±1.55％。结果如图6、图7所示。HSCs分化至早期巨核系祖细胞，并从巨核系祖细胞发育为成熟巨核细胞期间，巨核细胞体积增大，内部充满血小板特异性颗粒，细胞质中骨架蛋质含量增加，形成高度曲折的凹陷内膜。最终，成熟的巨核细胞经过复杂的血管内微环境的刺激向血小板转化，提升血小板含量，达到改善血小板减少症状的作用。
图6是K562和Meg-01的DNA倍性结果。其中，A.K562细胞；B.Meg-01细胞。图7是K562和Meg-01的DNA倍性结果统计图，其中A.K562细胞；B.Meg-01细胞。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；n＝3。在巨核细胞发育成熟的阶段，染色体不断复制但细胞胞质及细胞膜并不分开，因此形成2倍体甚至128倍体的巨大细胞。细胞形态变大，胞内核分叶增多，形成巨核祖细胞，最终分化为较为成熟的巨核细胞，实现提高血小板含量的效果。
3.5毛钩藤碱对K562细胞联苯胺染色
对K562、Meg-01细胞进行联苯胺染色，细胞内产生的血红蛋白与H2O2结合显蓝色，而促K562红系分化的阳性Hemin(氯化血红素)可见到被染色呈蓝色的细胞，HS干预K562细胞后镜下没有见到蓝色细胞，与对照组相比没有差异。由此可以得出，HS干预后K562细胞向巨核系分化而非红系。
实施例(二)体内实验
1.实验材料
1.1实验动物
昆明小鼠80只雌雄各半，SPF级，4周龄，体重18-22g，购自成都达硕生物技术股份有限公司(许可证号：SCXK(川)2013-24)，饲养条件：西南医科大学SPF动物中心，四川省实验动物管理委员会实验动物设施条件合格证号：SYXK(川)2018-213号。温度：25～26℃，湿度：45％～70％，24h明暗交替，常规全价颗粒饲料喂养，雌雄各半，分开饲养，自由饮水。
1.2主要实验试剂
表2主要实验试剂信息
1.3主要实验仪器
表3主要实验仪器信息
2实验方法
2.1实验造模及分组
所有实验SPF级昆明小鼠适应性饲养3天后，随机选取60只小鼠，雌雄各半，进行X射线照射1次。造模条件：西南医科大学附属医院放射肿瘤科，4GyX射线全身一次性均匀照射。照射后第1天采集眼眶静脉血(血细胞分析稀释液160μL+眼眶静脉血40μL)后统计分析，并将血小板计数在650×103/μL至1200×103/μL之间的小鼠纳入正式实验。按血小板基线水平随机将入选的照射小鼠分为模型组，TPO组，高剂量组(5mg/kg)，中剂量组(2.5mg/kg)，低剂量组(1.25mg/kg)，每组10只，雌雄各半。未照射正常组10只，照射组50只，共计60只小鼠。实验分组及方案如表4。实验方案由西南医科大学动物使用与管理委员会批准(许可证号NO.20170341)。实验分组及造模方案如下：
表4实验分组及造模
2.2毛钩藤碱的配制及给药方式
2.2.1毛钩藤碱的配制方式
①TPO配备方式：7500U/mL规格的TPO取出126μL生理盐水稀释至4mL，冰上避光保存，现配现用。
②HS配备方式：首先，将HS配置成0.1g/mL的储液。其次，计算得出所需药品的按2％的DMSO及5％的聚山梨酯80配置成所需体积，冰上避光保存，现配现用。
2.2.2给药方式及周期
未照射正常组和模型组，按小鼠体重每10g以生理盐水0.1mL腹腔注射；TPO组，依据人(300U/kg)和小鼠剂量比例换算为2700U/kg；HS高剂量组依据前期预实验结果以5mg/kg/d腹腔注射给药；HS中剂量组以2.5mg/kg/d腹腔注射给药；HS低剂量组以1.25mg/kg/d腹腔注射给药。TPO组及高、中、低剂量组注射体积为每0.1mL/10g，采血分组后第1天(即辐射后第2天)，每天定时腹腔注射1次，连续给药至第14天。
2.3小鼠体重测量
为明确每日给药体积，同时了解小鼠给药后体重变化情况，照射后第1天在电子天平上称量体重，每两天测量一次并记录，直至第14天。
2.4小鼠外周血小板计数
照射后第1、4、7、10、14天进行小鼠眼底静脉丛取血并检测外周血象。小鼠眼底静脉丛取血40μL，立即加入预装有160μl稀释液的EP管中，立即吹打混匀，并于2h内使用血细胞分析仪检测各组小鼠血常规。
2.5小鼠脏器指数变化
为了解HS对小鼠脏器影响情况，当给药至第15天后，模型组血小板恢复至正常水平，采取颈椎脱臼法处死小鼠后取出与血小板相关的肝脏及脾脏，并称量、记录、统计。
2.6统计学分析
统计采用SPSS20.0软件进行统计分析，作图软件选用GraphPad Prism 5.0进行作图，计量资料使用Mean±SD表示。两两比较用t检验，独立样本单因子变异数的分析选用One-way ANOVA认为P＜0.05差异有统计学意义。
3实验结果
3.1HS对辐照致血小板减少模型小鼠的体重变化影响
为明确每日给药体积，同时了解小鼠给药后体重变化情况，照射后第1天在电子天平上称量体重，每两天测量一次并记录，直至第14天。给与4Gy X射线全身照射后，照射后第1天开始，每2天测量一次体重的结果显示：在第7天，低剂量组1.25mg/kg与未照射对照组相比体重有显著差异(P＜0.05)；在第11天时，模型组与对照组相比有显著差异(P＜0.05)。在其他时间点，小鼠体重没有显著差异。小鼠体重的均值可以显示出未照射对照组比其余X射线照射组均值高，直到第14天时随血小板的恢复而均值差异减小，实验结果如下表所示。
表5 HS对辐照致血小板减少小鼠模型体重水平的影响(n＝10)
注：模型组与对照组相比，*P＜0.05，对照组与低剂量组(1.25mg/kg)相比，％P＜0.05
3.2HS对辐照致血小板减少模型小鼠的外周血小板水平影响
照射后第1、4、7、10、14天进行小鼠眼底静脉丛取血并检测外周血象。小鼠眼底静脉丛取血40μL，立即加入预装有160μl稀释液的EP管中，立即吹打混匀，并于2h内使用血细胞分析仪检测各组小鼠血常规。结果显示：给药第0天(即照射后第1天)，血小板基线值没有显著差异。给药第4天，对照组与模型组没有显著差异(P＞0.05)，TPO组(P＜0.01)、5mg/kg组(P＜0.05)、2.5mg/kg组(P＜0.001)与模型组相比均显著升高。给药第7天，对照组与模型组相比，有显著差异(P＜0.001)，TPO组(P＜0.01)、高剂量组(5mg/kg)(P＜0.05)与模型组相比均显著升高。给药第10天，对照组与模型组相比有显著差异(P＜0.001)，TPO组(P＜0.05)、高剂量组(5mg/kg)(P＜0.05)与模型组相比均显著升高。给药第14天，对照组与模型组相比没有显著差异(P＞0.05)，但TPO组(P＜0.001)及HS的高剂量组(5mg/kg)(P＜0.01)与模型组相比则有显著升高，表明HS具有安全的恢复血小板作用，并不会导致血小板数量过度升高。如下表所示。
表6 HS对辐照致血小板减少小鼠模型外周血小板水平的影响(n＝10)
注：模型组与对照组相比，***P＜0.001；模型组与TPO组相比，&P＜0.05，&&P＜0.01，&&&P＜0.001；模型组与高剂量组，#P＜0.05，##P＜0.01；模型组与中剂量组，$$$P＜0.001
3.3HS对辐照致血小板减少模型小鼠的脏器指数水平影响
为了解HS对小鼠脏器影响情况，当给药至第15天后，模型组血小板恢复至正常水平，采取颈椎脱臼法处死小鼠后取出与血小板相关的肝脏及脾脏，并称量、记录、统计。给药14天结束后，下表为小鼠血小板相关的脏器例如肝脏、脾脏指数，各组间比较均未有显著统计学差异(P＞0.05)，表明HS对于毒性小，可以安全的应用，详细测试数据如下表所示。
表7 HS对辐照致血小板减少小鼠模型肝脏、脾脏指数的影响(n＝10)
在本次小鼠体内实验中，在给药后第4天，模型组与正常组血小板之间在无显著差异的情况下，阳性药物TPO组、高剂量(5mg/kg)、中剂量组(2.5mg/kg)的血小板迅速升高。在血小板下降至最低点，即给药后第7天时，阳性药物TPO组、高剂量(5mg/kg)组能够提高照射小鼠血小板的最低水平，之后血小板开始恢复。在恢复期间，即第10天时，TPO组、高剂量组血小板的数目优于其他照射组。在第14天时，各个照射组血小板均恢复。其中TPO组、HS高剂量组5mg/kg组因给药长达14天，长时间刺激骨髓巨核细胞分化，其血小板数值显著高于其他组别。证明HS 5mg/kg给药组能够提高照射小鼠血小板最低值，同时也能缩短血小板恢复至正常时间。在对小鼠体和脏器的影响方面，HS对照射小鼠的体重影响不明显，同时也对肝脏、脾脏没有明显毒副作用。
实施例(三)分子机制
1实验材料
1.1实验细胞
选用K562细胞进行相关分子机制研究。相关信息同体外部分。
1.2主要实验试剂
表8主要实验试剂信息
1.3主要实验仪器
表9主要实验仪器信息
2实验方法
取对数生长期K562细胞，细胞培养体系为2mL/孔，K562细胞数为每孔2×104个/mL，Meg-01细胞数为4×104个/mL，均采用6孔板培养。分别设置对照组(Control)、HS组(10μM)，各组设置三个重复孔。分别于药物干预1、3、5、7天的同一时间点收集所有K562细胞提取总RNA。qRT-PCR法检测8个目的基因GATA-1、GATA-2、FOG-1、TAL-1、RUNX-1、NF-E2、KLF-1、FLI-1的mRNA表达水平。目的基因和内参基因的引物序列如下。
表10引物序列
同时，分别于药物干预1、3、5、7天制备细胞裂解总蛋白，采用WB免疫印迹法检测目的转录因子GATA-1、FOG-1、TAL-1、RUNX-1、NF-E2在不同时间点蛋白的表达水平；此外，检测第1、3、5、7天HS10μM干预K562细胞后验证3条与巨核细胞分化相关信号通路PI3K-AKT、JAK2-STAT3/5、MEK-ERK的磷酸化蛋白/总蛋白的表达情况以确定其主要发挥促巨核分化的调控通路。
3.实验结果
3.1HS对巨核细胞分化相关转录因子的mRNA表达的影响
根据前期表型实验结果分析后，选用10μM浓度条件下的HS作用于K562细胞分别于干预第1、3、5、7天四个时间点，检测巨核细胞分化相关的8个转录因子GATA-1、GATA-2、FOG-1、TAL-1、RUNX-1、NF-E2、KLF-1、FLI-1的mRNA表达情况。
结果显示：同对照组相比，GATA-1在第3天(P＜0.01)、第5天(P＜0.001)mRNA表达显著增加；FOG-1在第1、3、5、7天全部时间点的mRNA表达均显著增加(P＜0.001)；TAL-1在第1(P＜0.01)、3(P＜0.001)、7(P＜0.001)天mRNA表达显著增加；RUNX-1则随干预时间的增加mRNA表达量逐渐上升，在第5、7天mRNA表达有统计学差异(P＜0.001)；NE-E2在第5天(P＜0.001)、第7天(P＜0.05)的mRNA表达量相较对照组具有统计学差异；GATA-2mRNA则在第1天相较对照组具有统计学差异(P＜0.01)，其后的第3、5、7天没有检测到表达量的增加；红系分化标志性转录因子KLF-1在1、3、5、7天与对照组比较均没有统计学差异；而转录因子FLI-1则在本实验中没有检测到mRNA表达。如图8、图9。
其中，图8是qRT-PCR检测第1、3、5、7天基因变化水平。与对照组相比，**P<0.01，***P<0.001；n＝3。图9是PCR检测不同基因在不同时间点的变化水平，注：将空白对照组默认为1，在图中以虚线标示。
3.2Western-Blot检测HS促K562细胞分化相关核转录蛋白及信号通路的表达
上一步研究已证实，HS 10μM干预K562第1、3、5、7天PCR检测的8个关键核转录因子中GATA-1、FOG-1、TAL-1、RUNX-1、NF-E2表达增加。故采用WB法验证GATA-1、FOG-1、TAL-1、RUNX-1、NF-E2核转录因子蛋白表达水平。
其结果显示：与对照组相比，GATA-1在第1天(P＜0.01)、第3天(P＜0.05)表达量增加，差异有统计学意义，而第5天、第7天没有显著差异；FOG-1只在第3天(P＜0.05)表达量与对照组相比，差异有统计学意义；TAL-1只在第3天(P＜0.001，)表达量增加，与对照组相比差异有统计学意义，而第7天(P＜0.001)表达量则下降；RUNX-1在第5天(P＜0.05)蛋白表达升高，差异有统计学意义；NF-E2在第5天蛋白表达量增加(P＜0.01)，与对照组相比差异有统计学意义。
3.3Western-Blot检测HS促K562细胞分化的信号通路
通过WB免疫印迹法，检测第1、3、5、7天HS10μM干预K562细胞后验证3条与巨核细胞分化相关信号通路PI3K-AKT、JAK2-STAT3/5、MEK-ERK的磷酸化蛋白/总蛋白的表达情况。
3.3.1对JAK2-STAT3/5信号通路蛋白的影响
WB结果显示：HS作用于K562后的第1、3、5、7天的p-JAK2/JAK2比值在第1天及第3表达升高，且差异有统计学意义(P＜0.05)；p-STAT3/STAT3比值在第1天及第3表达升高，且差异有统计学意义(P＜0.01、P＜0.01)，第5天对照组与药物组相比没有统计学差异，第7天p-STAT3/STAT3比值则显示对照组高于HS药物组。而p-STAT5/STAT5则在HS作用于K562细胞第1、3、5、7天和对照组相比无显著差异。如图10、图11。
图10是HS干预K562细胞的JAK2、STAT3、STAT5蛋白表达。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；n＝3。
图11是统计分析HS对K562细胞JAK2、STAT3、STAT5蛋白表达。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n＝3。
3.3.2FCM测定MEK、ERK抑制剂对细胞分化的影响
药品准备及细胞种板体系同上。MEK抑制剂为10μM，ERK抑制剂为500nM。分组设置为：对照组(Control)，对照+抑制剂组(Control+PD98059，Control+PD184352)，药物+抑制剂组(10μM+PD98059，Control+PD184352)，药物组(10μM)。
3.3.3对MEK-ERK信号通路的影响
WB结果显示：HS作用于K562细胞后的第1、3、5、7天的p-MEK/MEK比值在第1、3、5天同对照组相比显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001)，但在第7天，对照组与药物组相比没有显著统计学差异。同样地，HS作用于K562后的第1、3、5、7天的p-ERK/ERK比值在第1、3、5天同对照组相比显著增加，差异有统计学意义(P＜0.01、P＜0.05、P＜0.01)，但在第7天，对照组与药物组相比没有显著统计学差异。如图12、图13。图12是HS干预K562细胞的MEK、ERK蛋白表达。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n＝3。图13是统计分析HS对K562细胞MEK-ERK蛋白表达水平。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n＝3。
4.结论如下：
1.HS10μM条件下对巨核细胞分化影响最显著，其主要针对巨核细胞分化的早期，对于分化晚期巨核细胞仍有一定影响，但不如早期显著。
2.HS促进K562细胞分化的作用可能与GATA-1、GATA-2、FOG-1、TAL-1、RUNX-1、NF-E2等核转录因子相关。
3.HS可能通过作用于MEK-ERK通路，并调控该通路下游核转录因子FOG-1、TAL-1的表达，进一步调控K562细胞分化。
4.HS5mg/kg干预辐照致血小板减少小鼠模型具有促血小板生成的体内活性作用。

Claims (5)

1.毛钩藤碱在制备治疗血小板减少症药物中的应用；所述毛钩藤碱如式I所示：
所述血小板减少症是由于放疗所致血小板减少症或原发免疫性血小板减少症；
所述药物中含有有效量的毛钩藤碱。
2.根据权利要求1所述的毛钩藤碱在制备治疗血小板减少症药物中的应用，其特征在于，所述毛钩藤碱在制备的药物中含量大于或等于5mg。
3.根据权利要求2所述的毛钩藤碱在制备治疗血小板减少症药物中的应用，其特征在于，所述毛钩藤碱在制备的药物中含量为5-500mg。
4.根据权利要求3所述的毛钩藤碱在制备治疗血小板减少症药物中的应用，其特征在于，所述毛钩藤碱在制备的药物中含量为10-100mg。
5.根据权利要求4所述的毛钩藤碱在制备治疗血小板减少症药物中的应用，其特征在于，所述毛钩藤碱在制备的药物中含量为30-60mg。
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