JP2006176541A - 血管平滑筋細胞の治療用インヒビター - Google Patents

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リロイ クンツ，ローレンス
Richard A Klein
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Abstract

【課題】新規な血管伸長剤の提供。
【解決手段】哺乳類血管平滑筋細胞の収縮又は移動を抑制するのに効果的な量の細胞増殖抑制剤を含んで成り、前記の量が、細胞外マトリクスを分泌する管平滑筋細胞の能力を除去しない量である、外傷を有する哺乳類血管を生物学的に伸長させる剤。
【選択図】なし

Description

本発明は、とくに状態、例えば、血管の外傷または疾患後の狭窄、脾細胞の機能亢進または過形成から生ずる疾患および免疫系のエフェクター細胞により仲介される疾患を処置のために、ある種の標的細胞の集団、例えば、平滑筋細胞、癌細胞、疾患の状態を改善するために変調を必要とする体細胞および免疫系のエフェクター細胞に対して向けられた結合相手の外科的または静脈内導入を包含する治療方法に一般に関する。平滑筋のタンパク質の増殖または移動または収縮を変更することができる活性剤の外科的または静脈内導入を、また、記載する。本発明は、また、血管の管腔の拡張または固定を生ずる（生物学的ステンティング（stenting) 作用) 血管平滑筋細胞への治療剤の直接または標的放出に関する。また、細胞破壊性接合体および血管平滑筋細胞のインヒビターの持続放出投与形態の組み合わせた投与を開示する。
経皮的経管腔的冠状血管形成 (PTCA) は、冠状動脈の疾患をもつ多数の患者において主要な処置の物理療法として広く使用されている。この外科的処置は急速成長し、1983年に39,000の処置が実施され、1987年に 150,000の処置が実施され、1988年に 250,000の処置が実施され、そして1994年までに 500,000PTCA／年を超えることが推定される。PTCA後の狭窄は有意な問題を残し、患者の25％〜35％は１〜３月以内に再狭窄を発生している。再狭窄は有意な罹病率および死亡率を生じ、そしてしばしばそれ以上の関与、例えば、反復した血管形成または冠状バイパス手術を必要とする。外科的関与または手術後の処置（今日まで）は再狭窄の予防において有効であることが証明された。
PTCA後の狭窄の原因となるプロセスは完全には理解されないが、いくつかの異なる生物学因子および経路の間で複雑な相互作用から生ずることがある。組織学的断面で見ると、病変は血管の内膜層の中に平滑筋細胞の異常増殖を有することがある（３）。PTCA後の平滑筋細胞の増殖についてのいくつかの可能なメカニズムは示唆するされてきている（１，２，４，５）。
生体外で望ましくない平滑筋の増殖を抑制すると報告されている化合物（４，５，６）は、生体内で使用するとき、望ましくない薬理学的副作用を有することがある。ヘパリンは１つのこのような例であり、生体外で平滑筋細胞の増殖を阻害すると報告されているが、生体内で使用するとき、凝固を阻害するという潜在的悪い副作用を有する。ヘパリンのペプチドは、抗凝固剤活性が減少しているが、短い薬理学的半減期を有するという望ましくない薬理学的性質を有する。二重バルーンカテーテルを使用することによって、すなわち、血管形成部位における治療剤の領域的放出について、そして薬物を含浸された生物分解性物質を使用することによって、すなわち、短い半減期の問題を補償するために、このような問題を解決する試みがなされた（例えば、９；米国特許第 4,929,602号)。
ベルカリン類 (Verrucarins)およびロリジン類 (Roridins) は、上の真菌ミロセリシウム・ベルカリア (Myrothecium Verrucaria) およびミロセリシウム・ロリジウム (Myrothecium roridium) により二次代謝物として産生されるトリコテセン薬物である。ベルカリンは巨大環トリエステルである。ロリジンはベルカロールの巨大環ジエステルである。グループとして、トリコテセンは真菌のいくつかの種により産生されるセスキテルペノイドマイコトキシン類に構造的に関係し、そして12, 13−エポキシトリコテク−９−エンの基本構造により特徴づけられる。真核細胞に対するそれらの細胞障害性活性は、細胞に結合し、内在化し、そして細胞中のタンパク質および高分子の合成を阻害するそれらの能力と密接に相関関係する。
少なくとも５つの考察が、それらの面上に、平滑筋細胞の異常増殖から生ずる狭窄を予防するために阻害剤の使用を排除するように思われる。
第１に、阻害剤は心臓血管の疾患をもつ患者について許容されえないレベルの危険をつくることができる全身的毒性を有することがある。
第２に、阻害剤は手術後の血管の創傷の治癒を妨害することがあり、そしてそれは治癒を遅延するか、あるいは新しく治癒した血管壁の構造または弾性を弱化することがある。
第３に、平滑筋細胞を殺す阻害剤は取り囲む内皮および／または他の内側平滑筋細胞を損傷することがある。死亡した細胞および死亡する細胞は、また、追加の平滑筋細胞の増殖を刺激しかつ狭窄を再燃させることがある分裂促進剤を放出する。
第４に、阻害剤の治療効果のレベルの放出はいくつかの観点から問題となることがある：すなわち、ａ）平滑筋細胞の間の細胞間空間の中への多数の分子の放出は、すなわち、治療的に有効投与量の分子が細胞膜を横切るようにさせるために好適な状態を確立するために必要である：ｂ）適切な細胞内隔室の中に阻害薬物を向けることは、すなわち、その作用が発揮される場合、コントロールすることが困難である：そしてｃ）阻害薬物とその細胞内標的、例えば、リボソームとの連合を最適化すると同時に、例えば、付近の細胞への、薬物の細胞間の再分布を最小とすることは困難であることがある。
第５に、平滑筋細胞の増殖は数週にわたって起こるので、有益な作用を生成するために、多分連続的に、阻害薬物をまた数週にわたって投与すべきであるように推定的に思われる。
以上から明らかなように、平滑筋細胞の増殖を効果的に処置するために、細胞障害性剤を包含する、阻害薬物の使用において解決すべき多数の問題が残っている。血管の手術の間に起こるような血管への外傷性障害後の血管平滑筋細胞の増殖のための狭窄を抑制する新規な方法を開発することは高度に有利であろう。さらに、延長した期間の抑制を生成する化合物の血管平滑筋細胞への放出は有利であろう。このような持続放出性化合物の局所的投与は、また、標的細胞の集団がこのような投与によりアクセス可能である他の状態の処置において有用であろう。
本発明の１つの面において、哺乳動物宿主において血管平滑筋細胞を阻害する新規な治療方法および治療接合体が提供される。治療接合体は、血管平滑筋細胞の細胞膜に特定の方法で結合する血管平滑筋結合性タンパク質またはペプチド、あるいは動脈壁のその間質マトリックス（例えば、コラーゲン）に特定の方法で結合し、細胞の活性を阻害する治療剤にカップリングした、間質マトリックス結合性タンパク質／ペプチドを含有する。１つの態様において、細胞の活性の阻害は、血管形成または他の血管手術法後の狭窄の減少、遅延または排除を生ずる。本発明の治療接合体は、血管平滑筋細胞および、平滑筋細胞の中に転移することができる、血管周囲細胞に連合することによって、これらの有利な作用を達成する。
治療接合体は次のものを含有する：（１）細胞の代謝を変更するか、あるいはタンパク質合成、細胞の増殖、または細胞の移動のインヒビターである治療剤；（２）形態に影響を与えるか、あるいは細胞体積を増加する、微小管およびミクロフィラメントのインヒビター；および／または（３）細胞外マトリックスの合成または分泌のインヒビター。１つの代表的態様において、接合体はセスキテルペノイドマイコトキシンである細胞障害性治療剤、例えば、ベルカリンまたはロリジンを含む。他の態様は、投与量において DNA合成または増殖を阻害し、タンパク質合成に対して最小の作用を有する静細胞性治療剤、例えば、タンパク質キナーゼインヒビター（例えば、スタウロスポリン）、スラミン、および酸化窒素解放化合物（例えば、ニトログリセリン）またはそれらの類似体または機能的同等体を包含する。
さらに、平滑筋細胞の収縮または移動を阻害しそして、例えば、血管形成外傷後の、拡大した管腔区域を維持する治療剤（例えば、サイトカラシン類、例えば、サイトカラシンＢ、サイトカラシンＣ、サイトカラシンＤなど）を、また、本発明による使用のために考えられる。本発明の他の面は、血管平滑筋細胞の膜上の発現されるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG) に特異的に連合する血管平滑筋結合性タンパク質に関し、そして好ましい態様において、このCSPGは約250kDaの分子量を有する。好ましい態様において、血管平滑筋結合性タンパク質は、少なくとも10-4Ｍの連合定数で細胞表面上のCSPG標的に結合する。他の好ましい態様において、血管平滑筋結合性タンパク質はモノクローナル抗体NR−AN−01またはその機能的同等体の Fab, FvまたはCDR(相補性決定領域) の中に見出されるアミノ酸配列を含有する。
本発明の他の面は、処置を必要とするヒトまたは動物の被検体に治療的に有効投与量の本発明の治療接合体を投与することによって、哺乳動物宿主における、例えば、血管形成後の、狭窄を阻害する方法を包含する。１つの代表的態様において、前記投与量の治療接合体を、注入カテーテルで投与して、血管中の投与部位においてスーパーオキシドジスムターゼ治療接合体の10-3Ｍ〜10-12 Ｍの濃度を達成することができる。
本発明は、また、標的細胞に治療剤を持続的に解放することを含む治療方法および治療投与の形態を考える。好ましくは、標的細胞は血管平滑筋細胞、癌細胞、疾患を改善するために変調を必要とする体細胞および投与形態の局所的投与によりアクセス可能である免疫系仲介疾患に関係する細胞である。結局、本発明のこの面の方法および投与形態は、細胞の活性 (例えば、増殖、収縮、移動など) を阻害するが、細胞および血管平滑筋結合性タンパク質を殺さない治療剤を使用する、哺乳動物宿主における血管平滑筋細胞の阻害のために有用である。
また、本発明のこの面の方法および投与形態は、標的細胞および標的細胞結合性タンパク質の増殖を阻害するか、あるいはそれらに対して細胞障害性である治療剤を使用する、標的細胞の増殖を阻害するか、あるいはこのような標的細胞を殺すために有用である。さらに、本発明のこの面の方法および投与形態は、標的細胞結合性タンパク質を使用する、投与形態の局所的投与によりアクセス可能である、標的細胞、例えば、免疫系のエフェクター細胞に、静細胞性、細胞破壊性または代謝変調性の治療剤を放出すために有用である。最後に、本発明の投与形態は、正常組織 (すなわち、体細胞) の病理学的増殖または機能亢進を減少または排除するために有用である。
本発明の投与形態は、好ましくは非分解性の微小粒子またはナノ粒子あるいは生物分解性の微小粒子またはナノ粒子あるいはである。より好ましくは、微小粒子またはナノ粒子は、ランダム、非酵素的、加水分解性の切断により生物分解するマトリックスを包含するポリマーから形成される。とくに好ましい構造体は、熱可塑性ポリエステル (例えば、ポリアクチドまたはポリグリコリド) の混合物あるいはラクチドまたはグリコリド成分のコポリマーから形成される。ラクチド／グリコリド構造体は、それらの生物分解が、両方共哺乳動物の正常の産生物である、乳酸およびグリコール酸を形成するという付加された利点を有する。
微小粒子またはナノ粒子内に分散した好ましい治療剤は、治療的に有意な標的細胞を殺さないで標的細胞の阻害、あるいは標的細胞を殺す活性を示すものである。血管平滑筋細胞の再狭窄の処置のために、有用な治療剤は標的細胞を殺さないで標的細胞の活性（例えば、増殖または移動）を阻害する。この目的に好ましい治療部分は、タンパク質キナーゼインヒビター（例えば、スタウロスポリンなど）、平滑筋移動および／または収縮インヒビター（例えば、サイトカラシン類、例えば、サイトカラシンＢ、サイトカラシンＣ、サイトカラシンＤなど）、スラミン、および酸化窒素解放化合物、例えば、ニトログリセリン、あるいはそれらの類似体または機能的同等体である。
癌の治療において、有用な治療剤は増殖を阻害するか、あるいは標的細胞に対して細胞障害性である。この目的に好ましい治療部分はロリジンＡおよびシュードモナス・エキソトキシン（Pseudomonas exotoxin) 、それらの類似体または機能的同等体である。免疫系仲介疾患、例えば、関節炎の処置のために、有用な治療剤は、静細胞性、細胞破壊性または代謝仲介性の治療剤を、投与形態の局所的投与によりアクセス可能である標的細胞を放出する。
この目的に好ましい治療部分は、ロリジンＡ、シュードモナス・エキソトキシン（Pseudomonas exotoxin) 、スラミンおよびタンパク質キナーゼインヒビター（例えば、スタウロスポリン）、スフィンゴシン、あるいはそれらの類似体または機能的同等体である。病理学的に増殖する正常組織（例えば、増殖性硝子体網膜症、角膜パンヌスなど）の処置のために、抗増殖剤または抗移動剤は好ましい（例えば、サイトカラシン類、トキソール、ソマトスタチン、ソマトスタチン類似体、Ｎ−エチルマレイミド、アンチセンスオリゴヌクレオチド類など）。
本発明の投与形態は、結合性タンパク質またはペプチドにより関係する標的細胞の集団にターゲッティングされる。本発明の好ましい結合性タンパク質／ペプチドは、血管平滑筋結合性タンパク質、腫瘍細胞結合性タンパク質および免疫系エフェクター細胞結合性タンパク質である。好ましい血管平滑筋結合性タンパク質は血管平滑筋細胞の膜上で発現されたコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）に特異的に連合し、そして好ましい態様において、このCSPGは約250kDaの分子量を有する。好ましい態様において、血管平滑筋結合性タンパク質は、少なくとも10-4Ｍの連合定数で細胞表面上のCSPG標的に結合する。
他の好ましい態様において、血管平滑筋結合性タンパク質はモノクローナル抗体NR−AN−01またはその機能的同等体の Fab, FvまたはCDR(相補性決定領域) の中に見出されるアミノ酸配列を含有する。本発明のこの態様において有用な他の好ましい結合性タンパク質は、細胞間支質および血管平滑筋細胞の間に位置するマトリックスに局在化するものを包含する。この型の好ましい結合性タンパク質は、特別にコラーゲン、細網状線維または他の細胞間マトリックス化合物に連合する。好ましい腫瘍細胞の結合性タンパク質は標的腫瘍細胞の集団またはそれらの細胞質エピトープにより発現された表面細胞マーカーに連合する。好ましい免疫系変調標的細胞結合性タンパク質は、標的免疫系エフェクター細胞またはそれらの細胞質エピトープの細胞表面マーカーに連合する。本発明の結合性ペプチド／タンパク質は、また、病理学的に増殖する正常組織をターゲッティングする。
本発明は、また、遊離の（すなわち、非ターゲッティングまたは非結合性相手が連合しない）治療剤を標的細胞に投与することを包含する治療方法および治療投与形態を提供する。好ましくは、標的細胞は血管平滑筋細胞であり、そして治療剤は血管平滑筋細胞の収縮のインヒビターであり、正常の静水圧が血管管腔を拡張できるようにする。このような収縮阻害はアクチンの阻害により達成することができ、これは好ましくははタンパク質合成の阻害に必要であるより低い投与レベルで達成および持続が可能である。結局、血管平滑筋細胞は小さい細胞外傷を修復しかつ間質マトリックスを分泌するために要求されるタンパク質を合成し、これによりその最大の収縮直径に近い拡張した状態で血管管腔の固定を促進する。
この現象は、初期の処置後の血管造影図に基づいて成功したと分類された血管形成処置の25％までにおいて起こる、望ましくない反動（recoil) 機構を減少または防止する生物学的ステンティング効果を構成する。サイトカラシン類 (これらはＧ〜Ｆアクチンの重合を阻害し、そしてこれらのアクチンは血管平滑筋細胞の移動または収縮を阻害する）は、本発明のこの態様において使用するための好ましい治療剤である。この型の遊離の治療剤のプロトコールは血管形成または他の血管外科的処置後の狭窄を減少、遅延または排除する。好ましくは、遊離の治療剤は血管平滑筋組織に直接または実質的に直接投与される。このような投与は好ましくは注入カテーテルにより実施して、血管の投与部位において前記治療剤の10-3Ｍ〜10-12 Ｍの濃度を達成する。
本発明の他の態様は、血管狭窄に関係する増殖する血管平滑筋細胞を破壊するために、細胞破壊性ターゲテッド接合体を投与することを包含する。この生物学的動脈筋切除後に解放される分裂促進剤は、本発明の抗収縮（抗移動）または抗増殖性の持続解放剤の投与により、残留する生存能力のある血管平滑筋細胞を刺激して増殖させかつ血管を再狭窄するのを防止される。
ここにおいて使用するとき、次の用語は後述するような意味を有する：
「治療接合体」は、治療剤にカップリングした（例えば、必要に応じてリンカーを通して）血管平滑筋または間質マトリックスの結合性タンパク質を意味する。
「標的」および「マーカー」は、マトリックスまたは血管平滑筋の結合性タンパク質により特定の方法で認識される分子、例えば、抗原、ポリペプチド抗原あるいは血管平滑筋細胞またはマトリックス構造体の細胞表面膜上に発現される細胞表面の炭水化物（例えば、グリコリピド、糖タンパク質、またはプロテオグリカン）を記載するとき、互換的に使用される。
「エピトープ」は、マトリックスまたは平滑筋の結合性タンパク質により結合される「標的」分子内の特定の部位、例えば、３またはそれ以上のアミノ酸の配列または糖類を意味する。
「カップリングした」は、マトリックスまたは血管平滑筋の結合性タンパク質と治療剤との共有結合または非共有結合の化学的連合（すなわち、ファンデルワールス力または電荷−電荷の相互作用によるような疎水性）を意味するために使用する。使用する治療剤の特質のために、結合性タンパク質は通常共有結合により治療剤と連合する。
「リンカー」は、マトリックスまたは平滑筋の結合性タンパク質を治療剤にカップリングさせる物質、例えば、有機化学のカップラーを意味する。
平滑筋細胞の「移動」は、血管の内側板から内膜の中へのこれらの生体内の動きを意味し、例えば、また、１つの位置から他の位置への動きをたどることによって生体外で研究することができる（例えば、時間経過のシネマトグラフィーまたはビデオカメラおよび経時的組織培養中の規定区域の中から外への平滑筋細胞の移動のマニュアルカウンティングを使用して）。
「増殖」、すなわち、平滑筋細胞または癌細胞の増殖は、すなわち、細胞の有糸分裂による、細胞数の増加を意味する。
「発現された」は、細胞によるポリペプチド、例えば、血管平滑筋細胞または血管周囲細胞により合成されたCSPGの合成、グリコシル化および／または分泌を生ずる、mRNAの転写および翻訳を意味する。
「巨大環トリコテセン」は、真菌のいくつかの種により産生されたそして12, 13−エポキシトリコテク−９−エンの基本構造により特徴づけられる、構造的に関係するセスキテルペノイドマイコトキシンのグループの任意の１つ、例えば、土の真菌ミロセリシウム・ベルカリア (Myrothecium verrucaria) およびミロセリシウム・ロリジウム (Myrothecium roridium) 中の二次代謝物の産生物であるベルルカリン類およびロリジン類を意味することを意図する。
「持続放出性」は、約３〜約21日間の範囲の期間の間治療剤をそれから解放するように設計された投与形態を意味する。より長い期間にわたる解放は、また、本発明の「持続放出性」投与形態として考えられる。
「投与形態」は、遊離の（連合する非ターゲッテッドまたは非結合性タンパク質）治療剤配合物、ならびに持続放出性治療配合物、例えば、微小粒子またはナノ粒子、標的細胞集団にその中に分散した治療部分を放出するように１種または２種以上の結合性タンパク質またはペプチドに結合できる生物分解性または非生物分解性ポリマー物質を含むものを意味する。
「スタウロスポリン」は、スタウロスポリン、すなわち、次の式、
のタンパク質キナーゼＣインヒビター、ばらびに次の一般構造式の１つを有するジインドロアルカノイド類を包含する：
さらに詳しくは、用語「スタウロスポリン」は、次のものを包含する：Ｋ−252(参照、例えば、日本国特許出願第62,164,626号) 、BMY-41950(米国特許第 5,015,578号) 、 UCN-01(米国特許第 4,935,415号) 、TAN-999(日本国特許出願第01,149,791号) 、TAN-1030A(日本国特許出願第01,246,288号) 、RK-286C(日本国特許出願第02,258,724号) およびそれらの機能的同等体および誘導体。
スタウロスポリンの誘導体は、次のものを包含する：日本国特許出願第 03,72,485；日本国特許出願第01,143,877号、日本国特許出願第 02,09,819号および日本国特許出願第03,220,194号、ならびに PCT国際特許出願 No. WO89 07,105号、 PCT国際特許出願 No. WO91 09,034号および欧州特許出願 No. EP410,389号および欧州特許出願 No. EP296,110号に記載されているもの。Ｋ−252 の誘導体、天然の産生物は既知である。参照、例えば、日本国特許出願第63,295,988号；日本国特許出願第62,240,689号、日本国特許出願第61,268,687号、日本国特許出願第62,155,284号；日本国特許出願第62,155,285号、日本国特許出願第62,120,388号および日本国特許出願第63,295,589号、ならびに PCT国際特許出願 No. WO88 07,045号および欧州特許出願 No. EP323,171号。
「サイトカラシン」は、標的細胞の代謝への阻害作用、例えば、血管平滑筋細胞の収縮または移動の妨害を示す真菌の代謝物を包含する。好ましくは、サイトカラシンはモノマーのアクチン（Ｇ−アクチン）の重合形態（Ｆ−アクチン）への重合を阻害し、これにより細胞質ミクロフィラメントを必要とする細胞機能を阻害する。サイトカラシンは典型的にはフェニルアラニン（サイトカラシン類）、トリプトファン（ケトグロボシン類）、またはロイシン（アスポカラシン類）から誘導され、置換されたパーヒドロイソインドール−１−オン部分の位置Ｃ−３において、それぞれ、ベンジル、インドル−３−イルメチルまたはイソブチル基を生ずる（式Ｖまたは・）。
次に、パーヒドロイソインドール部分は、位置Ｃ−８およびＣ−９に結合した11−，13−または14−原子炭素環または酵素含有環を含有する。すべての天然に存在するサイトカラシン類は、Ｃ−５にメチル基；Ｃ−12にメチルまたはメチレン基；およびＣ−14またはＣ−16にメチル基を含有する。
分子の例は次のものを包含する：サイトカラシンＡ、サイトラシンＢ、サイトカラシンＤ、サイトカラシンＥ、サイトカラシンＦ、サイトカラシンＧ、サイトラシンＨ、サイトカラシンＪ、サイトカラシンＫ、サイトカラシンＬ、サイトカラシンＭ、サイトカラシンＮ、サイトカラシンＯ、サイトラシンＰ、サイトカラシンＱ、サイトカラシンＲ、サイトカラシンＳ、ケトグロボシンＡ、ケトグロボシンＢ、ケトグロボシンＤ、ケトグロボシンＥ、ケトグロボシンＦ、ケトグロボシンＧ、ケトグロボシンＪ、ケトグロボシンＫ、デキサホミン、プロキシホミン、プロトホミン、ザイゴスポリンＤ、ザイゴスポリンＥ、ザイゴスポリンＦ、ザイゴスポリンＧ、アスポカラシンＢ、アスポカラシンＣ、アスポカラシンＤなど、ならびにそれらの機能的同等体および誘導体。ある種のサイトカラシン誘導体は、日本国特許出願第 72 01 925号；日本国特許出願第 72 14,219号、日本国特許出願第 72 08,533号、日本国特許出願第 72 23,394号；日本国特許出願第72 01924号；および日本国特許出願第 72 04,164号に記載されている。
ここにおいて記載するように、平滑筋細胞および血管周囲細胞は、障害、例えば、PTCAの間に引き起こされる障害後に内膜過形成性血管部位において増殖する血管の内側板および外膜血管から誘導される細胞を包含する。
平滑筋細胞の特性は、核が存在する細胞の中の中央に長円形核が位置しそして筋形質の中に筋源繊維が位置する、紡錘体の形状の組織学的形態（光学顕微鏡の検査下で）を包含する。電子顕微鏡検査下で、平滑筋細胞は、傍核の筋形質中の細長いミトコンドリア、顆粒状内質小網のわずかの管状要素、および遊離リボソームの多数のクラスターを有する。小さいゴルジ複合体は、また、核の１つの極付近に位置する。筋形質の大部分は細い、平行の筋フィラメントにより占有されており、これらの筋フィラメントは、大部分について、筋細胞の長軸に対して方向づけられることができる。これらのアクチン含有筋原繊維は束で配置されており、ミトコンドリアはそれらの間に介在する。細胞の収縮物質を通して、また、卵形の密な区域が散在することができ、同様な密な区域は原形質膜の内面に沿って間隔を置いて分布する。
血管周囲細胞の特性は、不規則な細胞の形状により特徴づけられる組織学的形態（光学顕微鏡の検査下で）を包含する。血管周囲細胞は血管内皮細胞を取り囲む基底膜内に存在し、そしてそれらの同一性はアルファ平滑筋アクチン（例えば、抗アルファーsm１，Biomakor, Rehovot, Iarael), HMW-MAA、および血管周囲細胞ガングリオシド抗原、例えば、MAb 3G5(11) に対して特異的な抗体による陽性の免疫染色：およびサイトケラチン類（すなわち、上皮および線維芽のマーカー）およびフォン・ウィルブランド因子（すなわち、内皮マーカー）に対して抗体による陽性の免疫染色により確証することができる。血管平滑筋細胞および血管周囲細胞の両方は、NR−AN−01モノクローナル抗体による免疫染色で陽性である。
本発明の治療接合体および投与形態は、血管平滑筋細胞の活性を阻害するために、例えば、血管形成後の狭窄の減少、遅延、または排除するために有用である。ここにおいて使用するとき、用語「減少」は、動物モデルまたは人間において、血管形成後の平滑筋細胞の増殖の刺激から生ずる、内膜の厚さの増加を減少することを意味する。「遅延」は血管形成後の可視の内膜の過形成（例えば、組織学的にあるいは血管造影検査により観察される）の開始までの時間の遅延を意味し、そして、また、再狭窄の「減少」が伴うことがある。
血管形成後の再狭窄の「排除」は、外科的に干渉すること、すなわち、反復した血管形成、動脈切除、または冠状動脈バイパス手術により血管を通る適当な血流を再確立することをもはや必要としない程度に、患者における内膜過形成を、完全に「減少する」および／または完全に「遅延する」ことを意味する。狭窄を減少し、遅延するか、あるいは排除する効果は、次のものを包含するが、これらに限定されない、当業者にとって日常的な方法により決定することができる：血管造形、超音波的評価、Ｘ線透視画像形成、光学線維の内視鏡検査または生検および組織学。本発明の治療接合体は、平滑筋細胞および血管周囲細胞の細胞膜に特異的に結合することによって、これらの有利な効果を達成する。
本発明の治療接合体は、血管平滑筋結合性タンパク質を治療剤にカップリングすることによって得られる。治療接合体において、血管平滑筋結合性タンパク質は治療接合体を血管平滑筋細胞または血管周囲細胞にターゲッティングする機能を実行し、そして治療剤は血管平滑筋細胞または血管周囲細胞の細胞活性を阻害する機能を実行する。
本発明の治療投与形態（持続放出型）は、治療剤を標的細胞に持続した期間にわたって放出する能力を示す。本発明のこの面の治療投与形態は、この目的に適当な任意の形状を有することができる。好ましい持続放出性の治療投与形態は、次の特性の１または２以上を示す。
− 微小粒子（例えば、約 0.5マイクロメートル〜約 100マイクロメートル、より好ましくは約 0.5〜約２マイクロメートルの直径）またはナノ粒子（例えば、約 1.0ナノメートル〜約1000ナノメートル、より好ましくは約50〜約 250ナノメートルの直径) 、自由流動性の粉末状構造体；
− 約３〜約 180日、より好ましくは約10〜約21日の間の期間にわたって生物分解可能に設計された生物分解性構造体、あるいは約３〜約 180日、より好ましくは約10〜約21日の間の期間にわたって治療剤の拡散が起こるように設計された非生物分解性構造体；
− 生物適合性生物分解産生物を包含する、投与形態が投与される標的組織および局所的生理学的環境と生物適合性；
− 好ましくは治療剤−ポリマーマトリックスを形成するために、その中の治療剤の安定なかつ再現性ある分散を促進し、活性な治療剤の解放は次のルートの１つまたは両方を通して起こる：（１）投与形態を通る治療剤の拡散（治療剤が投与形態を形成するポリマーまたはポリマー混合物の中に可溶性である）；あるいは（２）投与形態が生物分解するときの治療剤の解放；および
− １または２以上の細胞および／または間質混合物のエピトープに結合する能力、約１〜約 10,0000結合性タンパク質／ペプチド−投与形態の結合は好ましく、そして最大約１結合性ペプチド−投与形態／PTCA表面積の 150平方オングストロームはより好ましい。合計の結合数は使用する粒子大きさに依存する。結合性のタンパク質またはペプチドは、ここに記載するように粒状治療投与形態に共有結合のリガンドのサンドイッチまたは非共有結合の形式を通して粒状の治療投与形態にカップリングすることができる。
本発明の好ましい態様のナノ粒子の持続放出性治療投与形態は生物分解性であり、そして血管平滑筋細胞に結合し、そしてこのような細胞の中に主としてエンドサイトーシスにより入る。このようなナノ粒子の生物分解は、プレリソソームの小胞およびリソソームにおいて経時的に (例えば、10〜21日間) 起こる。本発明の好ましいより大きい微小粒子の治療投与形態は、選択した結合性のタンパク質またはペプチドに依存して、標的細胞表面または間質マトリックスに結合し、そして引き続く細胞の吸収のために治療剤を解放し、より小さい微小粒子のわずかのみはファゴサイトーシスにより細胞の中に入る。この分野における実施者は予測するように、標的細胞が本発明の投与形態を同化および代謝する正確な機構は、これらの細胞の形態、生理学および代謝プロセスに依存する。
ターゲッテッド持続放出性治療粒状投与形態の大きさは、また、細胞の同化のモードに関して重要である。例えば、より小さいナノ粒子は間質流体とともに細胞の間を流れることができ、そして結合性タンパク質／ペプチドが標的として選択した正常または新形成組織に結合するまで、注入された組織を浸透する。この特徴は、例えば、ナノ粒子が注入された一次新形成フォーカスからのリンパ排出チャンネルをたどり、リンパ管に沿って転移性フォーカスをターゲッティングするので、重要である。より大きい微小粒子は、注入された一次組織中で間質的に容易に捕捉される傾向がある。
本発明の好ましい持続放出性投与形態は、生物分解性微小粒子またはナノ粒子である。より好ましくは、生物分解性微小粒子またはナノ粒子は、不規則な、非酵素的、加水分解的切断により生物分解して治療剤を解放し、これにより粒状構造体内に孔を形成する、ポリマー含有マトリックスから形成される。
アルファヒドロキシカルボン酸および関係するラクトンの縮合から誘導されたポリマーは、本発明における使用に好ましい。とくに好ましい部分は、熱可塑性ポリエステル（例えば、ポリラクチドまたはポリグリコリド）またはラクチドおよびグリコリド成分のコポリマー、例えば、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）の混合物から形成される。例示的構造、ランダムポリ（DL−ラクチド−コ−グリコリド）を下に示し、ｘおよびｙの値はこの分野における実施者により操作して所望の微小粒子またはナノ粒子の性質を達成する。
本発明の粒状投与形態を形成するために適当な他の物質は、ポリオルトエステルおよびポリアセタール（Polymer Letters , 18：293, 1980)およびポリオルトカーボネート (米国特許第 4,093,709号) などを包含する。
本発明の好ましい乳酸／グリコール酸のポリマーを含有するマトリックス粒子は、エマルジョンに基づく方法、すなわち、変更された溶媒抽出法を構成する方法、例えば、次の参考文献に記載されている方法により製造される::Cowsarら、“Poly (Lactide-Co-Glycolide) Microcapsules for Controlled Release of Steroids,"Mcthods Enzymology, 112 ：101-116, 1985(微小粒子中のステロイドの捕捉) ；Eldridgeら、“Biodegradable and Biocompatible Poly (DL-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres as an Adjuvant for Staphylococcus Enterotoxin B Toxoid Which Enhances the Level of Toxin-Neutralizing Antibodies," Infection and Immunity, 59：2978−2986, 1991 (トキソイドの捕捉) ； Cohenら、“Controlled Delivery Systems for Proteins Based on Poly (Laclide/Glycolic Acid) Microspheres,"Phamaceutical Research, 8 (6) ：713-720, 1991(酵素の捕捉）；および Sandersら、“Controlled Relcase of a Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Analogue from Poly (DL-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres,"J. Phamaceutical Science, 73(9) ：1294−1297, 1984 (ペプチドの捕捉)。
一般に、本発明の粒状投与形態を形成する方法は、ポリマーをハロゲン化炭化水素溶媒中に溶解し、治療剤溶液 (好ましくは水性) をその中に分散させ、そしてハロゲン化炭化水素溶媒の溶媒であるが、ポリマーの溶媒ではない溶媒として作用する追加の物質を添加することを包含する。ポリマーはポリマー−ハロゲン化炭化水素溶液から外に治療剤含有溶液の上に沈澱し、そして治療剤を捕捉する。好ましくは、治療剤は本発明の持続放出性投与形態内に実質的に均一に分散する。粒子の形成後、それらを洗浄しそして有機溶媒で硬化させる。水の洗浄および水性非イオン性界面活性剤の洗浄工程後、室温において真空下に乾燥する。
生物適合性の目的のために、粒状投与形態は、マトリックスの形態でその中に分散した治療剤により特徴づけられ、安定化された後、包装、貯蔵または投与される。安定化は任意の普通の方法で実施することができる。例えば、粒子をガンマ線で照射することができ、ただしこのような放射線への露出は治療剤−ポリマーマトリックスまたはそれに取り付けられた結合性タンパク質／ペプチドの中に分散した治療剤の構造または機能に悪い衝撃を与えてはならない。治療剤または結合性タンパク質／ペプチドがそのように悪く衝撃される場合、粒状投与形態は無菌条件下に製造することができる。
本発明の粒状投与形態からの治療剤の解放は、拡散および粒状マトリックスの侵食の両方の結果として起こることができる。生物分解速度は治療剤解放速度に直接衝撃を与える。生物分解速度は持続放出性投与形態の組成または構造を変更することによって調節可能である。
例えば、本発明の好ましい投与形態におけるラクチド／グリコリド比の変更は、例えば、次のように実施することができる、例えば、Ticeら、Biodegradable Controled-Release Parenteral Systems,"Pharmaceutical Technology , pp. 26−35, 1984に記載されているように；Kentら、“Microencapsulation of Water Soluble Active Polypeptides,"米国特許第 4,675,189号に記載されているように、ポリマーの加水分解変性剤、例えば、クエン酸および炭酸ナトリウムを含める；ラクチド／グリコリドのポリマー中の治療剤の配合を変更する、分解速度はその中に含有される治療剤の量に逆比例する、そして前記コアの配合量を変更するために異なる効能を示す治療剤の普通の族の適当な類似体の賢明な選択；およびBeckら、“Poly (DL-Lactide-Co-Glycolide)/Norethisterone Microcapsules：An Injectable Biodegradable Contraceptive,"Biol. Reprod. , 28：186-195, 1983 に記載されているように、粒子大きさの変更など。生物分解速度を調節する前述の方法のすべてはポリマーを含有するマトリックスの極限粘度数に影響を及ぼし、これによりその水和速度を変更する。
好ましいラクチド／グリコリド構造体は哺乳動物の生理学的環境と生物適合性である。また、これらの好ましい持続放出性投与形態は、それらの生物分解が両方共哺乳動物の正常の代謝産生物である乳酸およびグリコール酸を形成するという利点を有する。
粒子に結合する結合性タンパク質／ペプチド−粒状投与形態のために要求される官能基を、必要に応じて粒状構造体の中に、非分解性または生物分解性のポリマー単位と一緒に含める。この目的に利用できる官能基は、ペプチドと反応性であるもの、例えば、カルボキシル基、アミン基、スルフヒドリル基などを包含する。好ましい結合増強部分は、好ましい（ラクチド−グリコリド）ポリマーを含有するマトリックスなどの末端カルボキシル基を含む。
有用な血管平滑筋結合性タンパク質は、直ちの間質マトリックス中で治療剤を細胞外に解放し、引き続いて治療剤を残りの無傷の平滑筋細胞の中に拡散させる、および／または全体のターゲッテッド生物分解性部分の細胞内の隔室の中に細胞を内在化し、治療剤の放出を可能とするような方法で、無傷のまたは崩壊した血管平滑筋細胞の表面成分上の標的またはマーカーに結合することができる、ポリペプチド、ペプチド、または模倣化合物（後述するように）である。有用な血管平滑筋結合性タンパク質の代表例は、次のものを包含する：抗体（例えば、モノクローナルおよびポリクローナルアフィニティー精製抗体、F(ab′)2、Fab′、Fab、およびFv断片および／または抗体の相補性決定領域(CDR) またはそれらの機能的同等体、 (例えば、結合性ペプチドなど))；成長因子、サイトカイン、およびポリペプチドのホルモンなど；および高分子認識細胞外マトリックスレセプター（例えば、インテグリンおよびフィブロネクチンレセプターなど）。
本発明の投与形態の態様をターゲッティングするとき有用な他の好ましい結合性ペプチドは、細胞間支質および血管平滑筋細胞の間に位置するマトリックスに局在化するものを包含する。このような結合性ペプチドは、治療剤を標的細胞の間の間質空間に放出する。この型の好ましい結合性ペプチドは、コラーゲン、細胞外糖タンパク質、例えば、テナシン、小網および弾性線維および他の細胞内マトリックス物質上のエピトープに連合する。
好ましい腫瘍細胞結合性ペプチドは、 myc, ras, ber/Abl, erbBなどの遺伝子産生物のエピトープ、ならびにムチン, サイトカインレセプター、例えば、IL−６，EGF, TGFなどに連合し、それらの結合性ペプチドは、それぞれ、ある種のリンパ腫(myc) 、癌、例えば、結腸癌(ras) 、乳癌および肝腫瘍 (IL−６レセプター）、および乳癌(EGFおよびTGF)に局在化する。好ましい免疫系エフェクター細胞結合性ペプチドは抗−TAC, IL−２などであり、これらは、それぞれ、活性化Ｔ細胞およびマクロファージに局在化する。本発明の実施において有用な他の好ましい結合性タンパク質／ペプチドは、病理学的に増殖する正常組織、例えば、眼の退行変性疾患に関係する眼内血管系の血管周囲細胞に局在化することができる。
本発明の治療剤は、血管平滑筋細胞の細胞活性、例えば、増殖、移動、細胞体積の増加、細胞外マトリックス合成の増加（例えば、コラーゲン、プロテオグリカンなど）、あるいは細胞による細胞外マトリックス物質の分泌を阻害するように選択する。好ましくは、治療剤は次のように作用する：ａ） DNAの複製を阻害する（例えば、アドリアマイシン、スタウロスポリンなどのような薬物）か、あるいは紡錘形線維の形成を阻害する（例えば、コルヒチンのような薬物）ことによって、増殖する細胞における細胞分割を防止または遅延するための「細胞増殖抑制胞剤」として；あるいはｂ）内側板壁から筋肉内の中への血管平滑筋細胞の移動のインヒビターとして、例えば、「抗移動剤」、例えば、サイトカラシン；あるいはｃ）細胞体積の細胞内増加のインヒビター（すなわち、細胞により占有される組織体積；「細胞骨格インヒビター」または「代謝インヒビター」）として；あるいはｄ）細胞タンパク質の合成および／または細胞外マトリックスの分泌または構築をブロックするインヒビター（すなわち、「抗マトリックス剤」）として。
「細胞増殖抑制剤」の代表例は、次のものを包含する：例えば、変性トキシン、メトトレキセート、アドリアマイシン、放射性核種（例えば、Frlzbergら、米国特許第 4,897,255号に開示されているもの) 、タンパク質キナーゼインヒビター (例えば、スタウロスポリン) 、特定の酵素 (例えば、核酵素 DNAトポイソメラーゼIIおよび DNAポリメラーゼ、 RNAポリメラーゼ、アデニルグアニルシクラーゼ) のインヒビター、スーパーオキシドジスムターゼのインヒビター、末端デオキシヌクレオチジル−トランスフェラーゼ、逆転写酵素、平滑筋細胞の増殖を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドなど、これらは細胞の隔室の中に適当な投与量で放出されたとき、細胞を殺さないで血管平滑筋細胞または血管周囲細胞の増殖を障害する作用をするであろう。
「細胞増殖抑制剤」の他の例は、次のものを包含する：血管平滑筋細胞または血管周囲細胞の増殖をトリガーすることができる（例えば、細胞外マトリックスの存在下に）細胞の因子のペプチドのまたは模倣インヒビター（すなわち、拮抗物質、作用物質、または競合または非競合インヒビター）：例えば、サイトカイン（例えば、インターロイキン、例えば、IL−１）、成長因子（例えば、PDGF, TGF-アルファまたは−ベータ、腫瘍壊死因子、平滑筋−および内皮−誘導成長因子、すなわち、エンドセリン、FGF)、ホーミングレセプター (例えば、血小板または白血球) 、および細胞外マトリックスレセプター (例えば、インテグリン) 。平滑筋の増殖のための静細胞剤のこのカテゴリーの中の有用な治療剤の代表例は次のものを包含する：ヘパリン、トリアゾピリミジン（Trapidil；PDGF拮抗物質) 、ロバスタチンおよびプロスタグランジンＥ１または12のサブフラグメント。
「抗移動剤」の代表例は次のものを包含する：ケモスタクティック（chemostactic) 因子およびそれらのレセプター (補体ケモタクシン、例えば、 C5a, C5a desargまたは C4a；細胞外マトリックス因子、例えば、コラーゲン分解断片) の、あるいは移動に関係する細胞内細胞骨格タンパク質 (例えば、アクチン、細胞骨格要素、およびホスファターゼおよび移動に関係するキナーゼ) のインヒビター (すなわち、作用物質および拮抗物質、および競合または非競合インヒビター) 。抗移動剤のこのカテゴリーにおいて有用な治療剤の代表例は、カフェイン酸誘導体およびニルバジピン (カルシウム拮抗物質) 、およびステロイドホルモンを包含する。好ましい抗移動剤はサイトカラシンである。
「細胞骨格インヒビター」の代表例は、細胞内で微小管およびミクロフィラメントの網状組織に作用するコルヒチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、タキソールなどを包含する。
「代謝インヒビター」の代表例は、スタウロスポリン、トリコテセン、および変性したジフテリアおよびリシンのトキシン、シュードモナス・エキソトキシン (Pseudomonas exotoxin) などを包含する。好ましい態様において、治療接合体は簡単なトリコテセンまたは巨大環トリコテセン、例えば、ベルルカリンまたはロリジンである治療剤を使用して構成される。
トリコテセン類は、クラスファンジ・インパーフェクチ (Fungi imperfecti) の上の真菌により生産されるか、あるいはバッカルス・メガポタミカ (Baccharus megapotamica) から単離される薬物である (Bamburg, J. R., Proc. Molec. Subcell. Biol. , ８：41-110, 1983；Jarvisおよび Mazzola, Acc. Chem. Res. , 15：338-395, 1982)。それらは、炭素、水素および酸素のみを含有する最も毒性の分子であるように思われる (Tamm, C., Fortschr. Chem. Org. Naturst. , 31：61-117, 1974) 。それらは、開始、伸び、または末端の期におけるタンパク質合成のインヒビターとしてリボソームのレベルで作用するとすべて報告されている。
トリコテセン類の２つの広いクラスが存在する：中央のセスキテルペノイド構造のみを有するものおよび追加の巨大環を有するもの（それぞれ、簡単なおよび巨大環のトリコテセン）。簡単なトリコテセン類は、米国特許第 4,744,981号および米国特許第 4,906,452号 (ここに引用によって加える) に記載されているように、３つのグループ（すなわち、グループＡ，Ｂ、およびＣ）に細分割することができる。
グループＡの簡単なトリコテセン類の代表例は次のものを包含する：スキルペン、ロリジンＣ、ジヒドロトリコテセン、スキルペン−４，８−ジオール、ベルルカロール、スキルペントリオール、Ｔ−２テトラオール、ペンタヒドロキシスキルペン、４−デアセチルネオソラニオール、トリコデルミン、デアセチルチルカロネクトリン、カロネクトリン、ジアセチルベルカロール、４−モノアセトキシスキルペノール、４，15−ジアセトキシスキルペノール、７−ヒドロキシジアセトキシスキルペノール、８−ヒドロキシジアセトキシ−スルキペノール（ネオソラニオール）、７，８−ジヒドロキシジアセトキシスキルペノール、７−ヒドロキシ−８−アセチルジアセトキシスキルペノール、８−アセチルネオソラニオール、NT−１，NT−２，HT−２，Ｔ−２、およびアセチルＴ−２トキシン。
グループＢの簡単なトリコテセン類の代表例は次のものを包含する：トリコテコロン、トリコテシン、デオキシニバレノール、３−アセチルデオキシニバレノール、５−アセチルデオキシニバレノール、３，15−ジアセチルデオキシニバレノール、ニバレノール、４−アセチルニバレノール（フサレノン−Ｘ）、４，15−ジアセチルニバレノール、４，７，15−トリアセチルニバレノール、およびテトラ−アセチルニバレノール。グループＣの簡単なトリコテセン類の代表例は、クロトロールおよびクロトシンを包含する。
代表的な巨大環トリコテセンは次のものを包含する：ベルカリンＡ、ベルカリンＢ、ベルカリンＪ（サトラトキシンＣ）、ロリジンＡ、ロリジンＤ、ロリジンＥ（サトラトキシンＤ）、ロリジンＨ、サトラトキシンＦ、サトラトキシンＧ、サトラトキシンＨ、ベルチスポリン、ミトキシンＡ、ミトキシンＣ、ミトキシンＢ、ミロトキシンＡ、ミロトキシンＢ、ミロトキシンＣ、ミロトキシンＤ、ロリトキシンＡ、ロリトキシンＢ、およびロリトキシンＤ。さらに、一般的「トリコテセン」セスキテルペノイドの環構造は、また、高等植物バッカルス・メガポタミカ (Baccharis megapotamica) から単離された用語「バッカリン類」化合物の中に存在し、そしてこれらは文献、例えば、Chemistry of Alleopathy, ACS Symposium Series No. 268 ：A. C. Thompson編、1984, pp. 149-159)に記載されている。
「抗マトリックス剤」の代表例は、マトリックスの合成、分泌および集合、構築の架橋（例えば、トランスグルタミナーゼの架橋コラーゲン）、およびマトリックスの改造作用（例えば、創傷治癒後）のインヒビター（すなわち、作用物質および拮抗物質および競合および非競合インヒビター）を包含する。抗マトリックス剤のこのカテゴリーにおける有用な治療剤の代表例は、コルヒチン、細胞外マトリックスの分泌のインヒビターである。
本発明の持続放出性投与形態の態様のために、治療剤は好ましくは細胞を殺さないで血管平滑筋細胞活性を阻害するもの（すなわち、細胞増殖抑制性治療剤）である。この目的に好ましい治療剤は、次の能力の１または２以上を示す：タンパク質合成の阻害前に DNA合成を阻害することあるいは筋肉内の中への血管平滑筋細胞の移動を阻害することである。これらの治療剤はタンパク質合成を有意に阻害せず（すなわち、標的細胞を殺さない）、したがって、平滑筋細胞の増殖を減少することによって、細胞の修復およびマトリックスの産生を促進して、血管形成により引き起こされる血管壁の病変を安定化する。
このような好ましい治療剤の例は、タンパク質キナーゼインヒビター、例えば、スタウロスポリン（スタウロスポリンはシグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Co.) 、ミゾリー州セントルイスから入手可能である）、サイトカラシン類、例えば、サイトカラシンＢ（シグマ・ケミカル・カンパニー）、およびスラミン(FBAファーマシューティカル (Pharmaceuticals)、コネクチカット州ウェストヘブン) 、ならびにニトログリセリン (デュポン・ファーマシューティカル・インコーポレーテッド (DuPont Pharmaceuticals, Inc.) 、プエリトリコ、マヌチ) またはそれらの類似体または機能的同等体である。
これらの化合物は静細胞性であり、そして有意な DNA合成の阻害が起こる場合の濃度において最小のタンパク質合成の阻害および細胞障害性を発揮することが示された (参照、実施例８および第10Ａ図〜第10Ｄ図）。本発明の持続放出性投与形態の態様において有用な治療剤を同定するために有用なプロトコールは、例えば、実施例８に記載されている。この分野における実施者は、異なる標的細胞の集団、例えば、付着性単層標的細胞の型のためについてこのような同定を行うための、実質的に同等の実験のプロトコールを設計することができる。
本発明の他の態様は、癌細胞に対して細胞障害性である物質を包含する。これらの態様のために好ましい物質は、ロリジンＡ、シュードモナス・エキソトキシン（Pseudomonas exotoxin) などまたはそれらの類似体または機能的同等体である。放射性同位元素などを包含する、このような治療剤の体液過剰は同定され、そしてこの分野において知られている。さらに、細胞障害性部分の同定のためのプロトコールは既知であり、そしてこの分野において日常的に使用される。
免疫系仲介疾患のエフェクター細胞の変調は、また、本発明の持続放出性投与形態を使用して達成することがきる。このような変調は、局所的持続放出性投与形態の投与によりアクセス可能であるエフェクター細胞の集団を有する疾患に関して、好ましくは実施される。関節炎 (関節内投与) 、スプルー（経口的投与) 、ブドウ膜炎および眼内炎 (眼内投与) および角膜炎 (結膜下投与）の処置においてリンパ細網細胞に対して要求される変調活性、例えば、細胞致死性、静細胞性、代謝変調などの活性を有する治療部分は、この分野において知られている技術を使用して同定可能である。
これらの物質は、また、多数の障害を生ずる上皮腺および内分泌器官の機能亢進を減少するために使用することができる。これらの態様のために好ましい物質は、ロリジンＡ、シュードモナス・エキソトキシン（Pseudomonas exotoxin) 、スラミン、タンパク質キナーゼインヒビター（例えば、スタウロスポリン）など、またはそれらの類似体または機能的同等体を包含する。
本発明の実施において有用な他の好ましい治療剤は、正常組織の病理学的増殖、移動または機能亢進を減少または排除することができる部分を包含する。このような治療剤の例は、角膜内皮およびストロマの機能亢進、過形成または血管管腔区域の減少から生ずる眼の退行変性疾患に関係する眼内血管系お血管平滑筋細胞または血管周囲細胞の病理学的増殖または延長した収縮を減少または排除することができるものである。この目的に好ましい物質はスタウロスポリンおよびサイトカラシンＢである。
本発明の血管平滑筋結合性タンパク質は、血管平滑筋細胞の表面上の標的に結合する。認識されるように、血管平滑筋細胞の細胞膜に連合する特定の標的、例えば、ポリペプチドまたは炭水化物、プロテオグリカンなどは、特定の血管平滑筋結合性タンパク質を適当に選択（例えば、クローニングにより）または構成（例えば、遺伝子操作または化学的合成により）するために有用である。とくに有用な「標的」は、平滑筋細胞により内在化され、例えば、このとき膜成分の抗原のターンオーバーが更新において起こる。細胞により内在化は、また、ファゴリソソーム、クラトリン被覆穴、レセプター仲介再分布またはエンドサイトーシスなどを包含する機構によることができる。
好ましい態様において、このような「標的」の例は、血管平滑筋細胞および血管周囲細胞により合成されるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）であり、そして約 250kDの見掛けの分子量を有するCSPG分子の離散部分 (ここにおいてエピトープと呼ぶ) はことに好ましい。 250kDの標的は、より大きい 400kDのプロテオグリカン複合体の成分である (14) 。１つの現在好ましい態様において、血管平滑筋結合性タンパク質は、血管平滑筋CSPG標的分子中のエピトープに結合するNR−AN−01モノクローナル抗体により提供される。NR−ML−05と表示するモノクローナル抗体は、黒色腫細胞により合成された 250kDのCSPGに結合すると報告されている (Morganら、米国特許第 4,897,255号)。
平滑筋細胞および血管周囲細胞は、また、 250kDのCSPGならびに他のCSPGを合成すると報告されている (11) 。平滑筋細胞に結合するNR−ML−05は開示された(Fritzbergら、米国特許第 4,879,225号) 。モノクローナル抗体NR−ML−05および継代培養NR−ML−05 No. 85−41−4I−A2, freeze#A2106は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション (American Type Culture Collection) 米国マリイランド州ロックビレに受託されそして、それぞれ、受け入れ番号HB−5350およびHB−9350を許された。NR−ML−05は、ここに開示するサブクローンNR−AN−01の親であり、そして構造的かつ機能的にそれと同等である。
認識されるように、NR−AN−01は、 400kDののCSPG標的に特異的に連合する血管平滑筋結合性タンパク質のちょうど１つの例であり、そしてこの標的に連合する他の結合性タンパク質およびこの標的中の他のエピトープ（14）は、また、本発明の治療接合体および方法において有用である。この場合において、６つの他のネズミモノクローナル抗体および２つのヒトキメラモノクローナル抗体を、また、選択し、これらは血管平滑筋細胞の 250kDのCSPGに特異的にターゲッティングする。抗体は、また、細胞膜への結合後に平滑筋細胞により内在化されるように思われる。免疫反応性の研究は、また、45のヒト正常組織および30の異なる新生物における 250kDの抗原へのネズミMAb の結合を示し、そしてこれらの結果のいくつかは従来開示された (米国特許第 4,979,225号)。
この開示および他のヒト臨床的研究において、CSPGの 250kDのの抗原に対して向けられた MAbは生体内で血管平滑筋細胞に局在化した。さらに、認識されるように、CSPGマーカー抗原性エピトープとのNR−AN−01モノクローナル抗体の多点速度論の連合に関係するアミノ酸残基 (すなわち、相補性決定領域を構成するアミノ酸) は、コンピューター補助の分子のモデリングによりおよび抗体結合親和性を変更した突然変異体の使用により決定される。結合部位のアミノ酸およびNR−AN−01抗原結合部位の３次元のモデルは、血管平滑筋細胞および血管周囲細胞により系されたCSPGについての結合親和性を有する、機能的同等体、例えば、短いポリペプチド（「小さいポリペプチド」）を構成するための分子モデルとして働く。
血管の外科的処置後に狭窄を処置する現在好ましい態様において、本発明の実施において使用するための、例えば、PTCA、選択した結合性タンパク質、例えば、抗体または断片は血管平滑筋の 250kDのCSPGについての＞104 リットル／モルの結合親和性を有し、そして、また、血管平滑筋細胞または血管周囲細胞に結合しそしてそれらにより内在化される能力を有する。
３次元のモデリングは、また、NR−AN−01のその抗原性エピトープへの結合を模擬する他の機能的同等体、例えば、CSPG標的抗原においてNR−AN−01のそのエピトープへの結合の３次元の面を模擬する「模倣性」化合物を構成するために有用である。ここにおいて使用するとき、「模倣性ポリペプチド」は少なくとも６アミノ酸の長さのアミノ酸配列を意味する。ここにおいて使用するとき、用語「模倣性」は血管平滑筋細胞または血管周囲細胞により合成される、例えば、NR−AN−01のCSPG標的のアミノ酸への結合のために適切な間隔を達成するために構成された、有機化学のポリマーを意味する。
認識されるように、本発明者らは、また、本発明の治療接合体における血管平滑筋結合性タンパク質としてヒトモノクローナル抗体または「ヒト化」ネズミ抗体の利用を考える。例えば、ネズミモノクローナル抗体は、ネズミFv領域 (すなわち、抗原結合部位を含有する) をエンコードするヌクレオチド配列をヒト一定ドメイン領域およびFc領域をエンコードするヌクレオチド配列で、例えば、欧州特許出願第0,411,893 A2号に開示されている方法に類似する方法で、遺伝子組み換えすることによって「キメラ化」することができる。ヒト化血管平滑筋結合性タンパク質は宿主受容体における抗体またはポリペプチドの免疫反応性を減少するという利点を有し、これはこれにより生体内の半減期を増加しそして悪い免疫反応の可能性を減少するために有用であろうことが認識されるであろう。
また、再狭窄の処置のために有用な結合性ペプチドとして考えられる本発明の持続放出性投与形態は、血管平滑筋細胞の間に位置細胞間支質およびマトリックスに局在化するものである。このような結合性ペプチドは治療剤を標的細胞の間の間質空間に放出する。治療剤は、血管平滑筋細胞により引き続く吸収のために、このような間質空間の中に解放される。この型の好ましい結合性ペプチドは、コラーゲン、細胞外糖タンパク質、例えば、テナシン、小網および弾性繊維、サイトケラチンおよび他の細胞間ミトコンドリア成分上のエピトープに連合する。
細胞内支質およびマトリックスに局在化する最小ペプチド、模倣性有機化合物、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体などは、また、本発明のこの態様において結合性ペプチドとして有用である。このような結合性ペプチドは、既知の技術に従い、同定しそして構成するか、あるいは単離することができる。本発明の好ましい態様において、間質マトリックスの結合性タンパク質は、少なくとも約10-4Ｍの連合定数で標的エピトープに結合する。
本発明の癌処置の態様に有用な結合性ペプチドは、癌細胞などの細胞膜および細胞形質のエピトープに連合するものである。この結合性タンパク質は、それぞれ、無傷の細胞の表面膜および崩壊した細胞の内部のエピトープに局在化し、そして標的細胞の中への同化のために治療剤を放出する。要求される腫瘍細胞の型に局在化する最小ペプチド、模倣性有機化合物およびヒトまたはヒト化抗体は、また、本発明の結合性ペプチドとして有用である。このような結合性ペプチドは、既知の技術に従い、同定しそして構成するか、あるいは単離することができる。本発明のこれらの態様の好ましい結合性ペプチドは、少なくとも約10-6Ｍの連合定数で標的エピトープに結合する。
免疫系仲介疾患のエフェクター細胞、例えば、リンパ細網系の細胞に局在化する膜および細胞形質のエピトープに対して結合性ペプチドは、また、本発明の持続放出性投与形態を放出するために有用である。治療剤はこのような持続放出性投与形態によりその中への内在化のために標的細胞に放出される。要求されるエフェクター細胞の型に局在化する最小ペプチド、模倣性有機化合物およびヒトまたはヒト化抗体は、また、本発明の結合性ペプチドとして有用である。このような結合性ペプチドは、既知の技術に従い、同定しそして構成するか、あるいは単離することができる。本発明のこれらの態様の好ましい結合性ペプチドは、少なくとも約10-6Ｍの連合定数で標的エピトープに結合する。
本発明の実施において有用な他の好ましい結合性タンパク質またはペプチドは、病理学的に増殖する正常組織、例えば、眼の退行変性疾患に関係する眼内血管系の血管周囲細胞に局在化することができる部分を包含する。治療剤はこのような持続放出性投与形態によりその中への内在化のために標的細胞に放出される。要求される病理学的に増殖する正常細胞の型に局在化する最小ペプチド、模倣性有機化合物およびヒトまたはヒト化抗体は、また、本発明の結合性ペプチドとして有用である。このような結合性ペプチドは、既知の技術に従い、同定しそして構成するか、あるいは単離することができる。本発明のこれらの態様の好ましい結合性ペプチドは、少なくとも約10-6Ｍの連合定数で標的エピトープに結合する。
共有結合または非共有結合を通して血管平滑筋結合性タンパク質に治療剤を連鎖させる代表的な「カップリング」法は化学的交差リンカーおよびヘテロ二官能架橋化合物（すなわち、「リンカー」）を包含し、これらのリンカーは血管平滑筋結合性タンパク質中で反応して反応性基（例えば、ヒドロキシル、アミノ、アミド、またはスルフヒドリル基）の間で結合を形成する。この結合は、例えば、ペプチド結合、ジサルファイド結合、チオエステル結合、アミド結合、チオエーテル結合などであることができる。１つの例示的例において、モノクローナル抗体と薬物との接合体はMorganおよびFoon (Monoclonal Antibody Therapy to Cancer: Preclinical Models and Investigations, Basic and Clinical Tumor Immunology , Vol. 2, Kluwer Academic Publishers、マサチュセッツ州ヒンガム) およびUhr(J. of Immunol., 133 ：ｉ−vii, 1984)により要約された。
接合体が放射性核種の細胞増殖抑制剤を含有する、他の例示的例において、米国特許第 4,897,255号、 Fritzbergら (ここに引用によって加える) は有用でありうるカップリング法の教示である。１つ現在好ましい態様において、治療接合体はトリコテセン薬物に共有結合出カップリングした血管平滑筋結合性タンパク質を含有する。この場合において、連鎖の共有結合は、血管平滑筋結合性タンパク質の１または２以上のアミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基と、ａ）トリコテセンそれ自体；ｂ）トリコテセンヘミスクシネートカルボン酸；ｃ）トリコテセンヘミスクシネート（HS) Ｎ−ヒドロキシスクシンイミデートエステル；またはｄ）ポリ−Ｌ−リジンまたは任意のポリマーの担体とのトリコテセン複合体との間で形成することができる。
トリコテセン治療剤を含有する治療接合体を製造するカップリング法の代表例は、米国特許第 4,906,452号および米国特許第 4,744,981号 (ここに引用によって加える) に記載されている。結合性タンパク質とトリコテセンとの間でシッフ塩基の連鎖を形成するためにヒドラジドを使用する１つの例は、係属中の米国特許出願第07／ 415,154号 (ここに引用によって加える) に開示されている。
カップリング法の選択は、血管平滑筋結合性タンパク質またはペプチド、間質マトリックスの結合性タンパク質またはペプチドおよび治療剤の選択により、およびまた、例えば、貯蔵寿命の安定性のような物理的性質により、および／または、例えば、細胞および血液中の半減期、細胞内隔室化ルートなどにより影響を受けるであろう。例えば、１つの現在好ましい治療接合体において、ロリジンＡ治療剤のヘミスクシネート接合体はベルルカリンＡのそれらより長い血清半減期を有し、そしてこの増加した安定性は有意に増加した生物学的活性を生ずる。
本発明の持続放出性の態様は、非生物分解性または生物分解性のポリマー構造体内に分散した治療剤を含む。このような分散は次の文献に記載されている手順に従い実施される：Cowsarら、“Poly (Lactide-Co-Glycolide) Microcapsules for Controlled Release of Steroids,"Methods Enzymology, 112 ：101-116, 1985 ；Eldridgeら、“Biodegradable and Biocompalible Poly (DL-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres as an Adjuvant for Staphylococeal Enterotoxin B Toxoid Which Enhances the Level of Toxin-Neutralizing Antibodies,"Infection and Immunity, 59：2978−2986, 1991； Cohenら、“Controlled Delivery Systems for Proteins Based on Poly (Lactide／Glycolic Aced) Microspheres,"Phamaceutical Research, 8 (6) ：713-720, 1991 ；および Sandersら、“Controlled Release of Luteinizing Hormone-Releasing HormoneAnalogue from Poly (D, L-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres," J. Phamaceutical Science, 73 (9)：1294−1297, 1984。
本発明の持続放出性投与形態の物理的および化学的特性は、結合性タンパク質またはペプチドへの取り付けのいくつかの別のモードに付することが可能である。本発明の投与形態（持続放出型）は、例えば、共有結合、直ちのリガンドサンドイッチ取り付け、または非共有結合の吸着または部分的捕捉を通して結合性タンパク質／ペプチドに結合することができる。好ましいポリラクチド／グリコール酸粒子をその中に治療剤を分散させて形成するとき、未帯電のポリマー主鎖は内方に（その中に擬親油性治療剤が含有される）および外方に末端のカルボキシ基の大部分に沿って配向されている。
これらの表面のカルボキシ基は、結合性タンパク質／ペプチドの親核基のために、例えば、カーボジイミドで活性化したとき、共有結合の取り付け部位として働くことができる。このような親核基は、リジンエプシロンアミノ基（アミド連鎖）、セリンヒドロキシル基（エステル連鎖）またはシステインメルカプタン基（チオエステル連鎖）を包含する。特定の基との反応は、pHおよび反応条件の還元性状態に依存する。
例えば、末端カプロン酸基を有するポリ−乳酸／グリコール酸の粒子をＮ−加水分解ベンゾトリアゾールと、式Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ′（ここでＲは３−ジメチルアミノプロピル基などでありそしてＲ′はエチルなどである）の水溶性カーボジイミドの存在下に反応させる。次いでベンゾトリアゾール誘導体粒子（すなわち、活性化イミデートを有する部分）をタンパク質／ペプチド親核部分、例えば、有効なエプシロンアミノ部分と反応させる。あるいは、ｐ−ニトロフェノール、テトラフルオロフェノール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどの分子は、カーボジイミドの存在下にポリ−乳酸／グリコール酸の粒子の末端カルボキシ基をもつ活性エステルを形成するために有用である。
他の結合性タンパク質／ペプチドの親核部分は、セリンのヒドロキシル基、システインの内因性遊離チオールを包含し、チオール基は結合性タンパク質／ペプチドのジサルファイド架橋の還元からその目的に普通の使用される還元剤（例えば、システイン、ジチオスレイトール、メルカプトエタノールなど）などを使用して生ずる。さらに、ポリ−乳酸／グリコール酸の粒子を塩化チオニルとの反応により活性化して塩化アシル誘導体部分を形成することができる。次いで、誘導体された粒子を結合性タンパク質／ペプチドの親核基と反応させて、本発明のターゲテッド投与形態を形成する。
直接の持続放出性投与形態−結合性タンパク質またはペプチドの接合は、結合性タンパク質／ペプチドの標的細胞の認識を混乱することがある。リガンドサンドイッチ取り付け技術は、持続放出性投与形態−結合性タンパク質／ペプチドの取り付けを達成するために有用な別法である。このような技術は、標的細胞の集団に結合しないタンパク質を使用して一次ペプチドまたはタンパク質の外殻を形成することを包含する。次いで結合性タンパク質／ペプチドを一次ペプチドまたはタンパク質の外殻に結合させて、機能的結合性タンパク質／ペプチドをもつ生ずる粒子を形成する。
リガンドサンドイッチのアプローチの例は、アビジンまたはストレプトアビジンを粒子に、「直接」結合のアプローチに関して前述したように官能基を通して共有結合で取り付けることを包含する。結合性タンパク質またはペプチドを、好ましくは、官能化ビオチンで誘導する（例えば、活性エステル、ヒドラジド、ヨードアセタール、マレイミジルなどの官能基を通して）。アビジン／ストレプトアビジンの一次タンパク質外殻の有効なビオチン結合部位へのリガンド（すなわち、結合性ペプチドまたはタンパク質／官能化ビオチン）の取り付けは、飽和量のビオチニル化タンパク質／ペプチドを使用して起こる。
例えば、末端カルボキシル基をもつポリ−乳酸／グリコール酸の粒子をカーボジイミドで活性化し、そして引き続いてアビジンまたはストレプトアビジンと反応させる。結合性タンパク質またはペプチドをビオチンアミドカプロエートＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと１〜３モルのビオチン含有化合物／結合性タンパク質／ペプチドにおいて反応させて、ビオチニル化結合性タンパク質／ペプチドを形成する。モル過剰のビオチニル化結合性タンパク質／ペプチドをアビジン誘導粒子とインキュベーションして、本発明のターゲテッド投与形態を形成する。
あるいは、粒子のカルボキシ基をビオチニル化する（例えば、カルボキシ基のカーボジイミドの活性化および引き続くアミノアルキルビオチンアミドとの反応により）。次いでビオチニル化粒子を飽和濃度（すなわち、モル過剰）のアビジンまたはストレプトアビジンとインキュベーションして、遊離ビオチン結合部位を有するタンパク質被覆粒子を形成する。次いでこのような被覆された粒子は、前述したように形成されたビオチニル化結合性タンパク質のモル過剰と反応することができる。他のオプションは、ビオチニル化粒子へのアビジンまたはストレプトアビジン結合結合性タンパク質またはペプチドの取り付けを包含する。
さらに、結合性タンパク質／ペプチド−粒子の取り付けは、粒子の部分的に露出したポリマーの主鎖の非イオン性特性から生ずる、結合性タンパク質の粒子への吸着により達成することができる。高いイオン強度の条件（例えば、 1.0モルのNaCl) 下に、水素および疎水性粒子−結合性タンパク質／ペプチドの結合は促進される。
そのうえ、結合性タンパク質／ペプチドは粒子のポリマーのマトリックスの中にそれが形成するときに部分的に捕捉されることができる。これらの環境下に、このような捕捉された結合性タンパク質／ペプチドは残留選択的結合特性を粒子に与える。適度の粒子形成条件、例えば、 Cohenら、Phamaceutical Research, 8 ：713-720 (1991)において使用されている条件は、本発明のこの態様のために好ましい。このような捕捉された結合性タンパク質は、また、エンドサイトーシスを行った、部分的に分解した粒子の標的細胞の取り付けにおいて有用である。異なる露出された官能基を有する他のポリマーの粒子の投与形態 (例えば、非生物分解性の投与形態) は、前述の原理に従い結合性タンパク質またはペプチドに結合させることができる。
本発明の実施において有用な非生物分解性ポリマーの例は、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレンアクリルコポリマーなどである。このような非生物分解性ポリマーは、結合性タンパク質／ペプチドの取り付けのための官能基、例えば、カルボン酸基、脂肪族第１アミノ基、芳香族アミノ基およびヒドロキシル基を有するか、あるいはそれらを有するように誘導することができる。
カルボン酸の官能基は、例えば、ポリ−乳酸／グリコール酸の生物分解性ポリマー粒子の投与形態について前述した反応機構を使用して、結合性タンパク質またはペプチドにカップリングさせる。第１アミノ官能基は、例えば、それとコハク酸無水物との反応によりカップリングして、前述したように結合性タンパク質／ペプチドに結合させることができる末端カルボキシ部分を形成する。さらに、第１アミノ基は臭化シアンで活性化し、そして結合性タンパク質／ペプチドの第１アミノ基とグアニジン連鎖を形成することができる。
芳香族アミノ官能基は、例えば、亜硝酸でジアゾ化して、結合性タンパク質／ペプチドのチロシンと反応するジアゾニウム部分を形成し、これにより非生物分解性粒子と結合性タンパク質／ペプチドとの間にジアゾ結合を生成する。ヒドロキシル官能基を結合性タンパク質／ペプチドの第１アミノ基に、例えば、ヒドロキシル部分を末端カルボン酸官能基に変換することによって、カップリングさせる。このような変換はクロロ酢酸との反応および引き続くカーボジイミドとの反応により達成することができる。生物分解性粒子に関して前述した、サンドイッチ、吸着および捕捉の技術は、非生物分解性粒子−結合性タンパク質／ペプチドの結合に同様な適用可能である。
好ましい態様において、ターゲッティングは、外傷を受けた血管部位の内膜領域における平滑筋の増加を生ずる潜在的に増殖する細胞、例えば、血管形成後の、例えば、血管周囲細胞および血管平滑筋細胞に対して特異的である。本発明の面は、本発明を治療接合体を使用して、血管形成、例えば、粒子、動脈切除および経皮的経管腔的冠状回転アセロブレイション(atheroblation) 後の平滑筋の増殖を遅延、減少、または排除するために使用される。
他の好ましい態様において、ターゲッティングは、局所的投与に対してアクセス可能な一次または転移性腫瘍フォーカス、例えば、開腹により浸潤のための露出されるか、あるいはＸ線透視検査のために可視とされた一次または転移性腫瘍のフォーカスに対して特異的であるか、あるいは哺乳動物内の小さい区域または腔に制限された内部の腫瘍のフォーカスまたは腫瘍、例えば、腹の中に位置する卵巣癌、フォーカスまたは多フォーカスの腫瘍などへのコンピューター化局所解剖の誘導および注入の針の投与である。本発明のこの態様の面は、治療剤が標的細胞に対して細胞障害性であるか、あるいは細胞を代謝的に変調して、化学療法および／または放射線治療に対する細胞を感受性を増加する、治療条件を包含する。
他の態様において、ターゲッティングは免疫系仲介疾患、例えば、関節炎、眼内の免疫系仲介疾患またはスプルーに関係する局所的投与のアクセス可能なエフェクター細胞の集団に対して特異的である。本発明のこの態様の面は、治療剤が標的細胞に対して細胞障害性であるか、あるいは標的細胞の生物学的応答を変更して治療の目的を達成する、治療条件を包含する。
他の態様において、ターゲッティングは局所的投与がアクセス可能な、例えば、眼の退行変性疾患、角膜パンヌス、活動過剰内分泌腺などに関係する、病理学的に増殖するか、あるいは活動過剰の正常細胞の集団に対して特異的である。本発明のこの態様の面は、治療剤が標的細胞の集団の増殖または活動過剰を減少または排除する、治療条件を包含する。
外傷を受けたまたは疾患のある血管部位の処置のために、本発明の治療接合体または投与形態は宿主に注入カテーテル、例えば、C. R. Bard Inc. 、マサチュセッツ州ビレリカにより製造されたもの、あるいはWolinsky (７；米国特許第 4,824,436号) またはSpears (米国特許第 4,512,762号) により開示されているものを使用して投与することができる。この場合において、治療接合体の治療的に有効な投与量は、カテーテルのバルーンの間の流体空間中の接合体の濃度が約10-3〜10-12Mの範囲にあるとき、典型的には到達される。
ここに提供された実施例から認識されるように、本発明の治療接合体は管腔をライニングする内膜または膜媒質の細胞の基部の（６〜９）細胞層を抗増殖治療接合体に対して暴露するために十分な抗増殖治療投与量で放出されることが必要であるが、これに対して抗収縮治療投与量は膜媒質全体を暴露することが必要であり、そしてさらにこの投与量は実験的に、例えば、ａ）適当な動物モデルの系からの血管を注入しそして免疫組織化学的方法を使用して接合体およびその作用を検出する（例えば、下の実施例において例示されているように）；そしてｂ）適当な生体外の研究、例えば、下の実施例３，４、および５において例示されている研究を実施することによって決定することができる。
代表例において、この治療的に有効な投与量は10mlの 200μｇ／mlの治療接合体の溶液を調製することによって達成され、ここで血管平滑筋結合性タンパク質はNR−AN−01でありそして治療剤はロリジンＡ、トリコテセン薬物である。血管外傷、例えば、手術または疾患から生ずる外傷（例えば、下を参照）を処置するために、治療接合体を注入カテーテルで投与するとき、10mlは普通にカテーテルを充填しかつ１〜1.5ml を血管壁の中の１〜３つの外傷損傷部位の中に注入するために十分であろう。当業者は認識するように、本発明による治療接合体の所望の治療的に有効な投与量はいくつかの因子、例えば、ａ）治療接合体中の血管平滑筋結合性タンパク質の結合親和性；ｂ）注入の間に加えられる大気圧；ｃ）投与された治療接合体が血管部位に存在する時間経過；ｄ）使用する治療剤の特質；および／またはｅ）血管の外傷の特質および所望の治療に依存するであろう。
治療的に有効な投与量で薬物を放出するように訓練された当業者（例えば、薬物のレベルを監視しそして患者における臨床的効果を観察することによって）は、経験および専門的判断に基づいて個々の患者のために最適な投与量を決定するであろう。好ましい態様において、約 0.3気圧 (すなわち、300mmHg)〜約３気圧の圧力を血管壁に15秒〜３分間直接加えることは、NR−AN−01結合性タンパク質を含有する治療接合体を哺乳動物の動脈壁の平滑筋層の中に浸潤させるために適切である。当業者は認識するように、疾患のあるヒト血管壁の内膜層の中への治療接合体の浸潤は多分変動し、そして個々の基準で決定することが必要であろう。
本発明の態様の持続放出性投与形態は、管腔をライニングする膜媒質の平滑筋細胞の基部の（６〜９）細胞層を投与形態に対して暴露するために十分な抗増殖治療投与量で放出されることがのみが必要である。この投与量は実験的に、例えば、ａ）適当な動物モデルの系からの血管を注入しそして免疫組織化学的、Ｘ線透視検査または電子顕微鏡検査の方法を使用して投与形態およびその作用を検出する；そしてｂ）適当な生体外の研究を実施することによって決定することができる。
代表例において、この治療的に有効な投与量は、連続的暴露において、毒性および最小有効投与量の間で治療効果を生ずる、血管周囲細胞剤の投与量を平滑筋細胞組織培養において決定することによって達成される。この治療レベルは、血管周囲細胞の治療投与量を維持するために動脈壁の平滑筋細胞の間に注入される粒子のために要求される治療剤の大きさ、数および濃度および解放速度を決定することによって、生体内で得られる。投与形態は、次の例示的治療剤の血管周囲細胞の投与量に近似する速度で治療剤を解放すべきである：約0.01〜約 100μｇ／mlのニトログリセリン、約 1.0〜約1000μｇ／mlのスラミン、約 0.001〜約 100μｇ／mlのサイトカラシン、および約0.01〜約105 ng／mlのスタウロスポリン。
当業者は認識するように、本発明の持続放出性投与形態の所望の治療的に有効な投与量はいくつかの因子、例えば、ａ）投与形態に関連する結合性タンパク質の結合親和性；ｂ）大気圧および注入の期間；ｃ）投与された投与形態が標的部位に存在する時間経過；ｄ）粒状投与形態からの治療剤の解放速度；ｅ）使用する治療剤の特質；ｆ）外傷の特質および所望の治療；および／またはｇ）粒状投与形態の細胞間および／または細胞内の位置に依存するであろう。治療的に有効な投与量で薬物を放出するように訓練された当業者（例えば、治療剤のレベルを監視しそして患者における臨床的効果を観察することによって）は、経験および専門的判断に基づいて個々の患者のために最適な投与量を決定するであろう。
好ましい態様において、約 0.3気圧 (すなわち、300mmHg)〜約３気圧の圧力を血管壁に15秒〜３分間直接加えることは、NR−AN−01結合性タンパク質に結合した持続放出性投与形態を哺乳動物の動脈壁の平滑筋層の中に浸潤させるために適切である。Wolinskyら、“Direct Intrarterial Wall Injection of Microparticles Via a Catheter：A potential Drug Delivery Strategy Following Angiplsty," Am. Heart Jour. , 122 (4) ：1136−1140, 1991。当業者は認識するように、標的細胞の集団の中への持続放出性投与形態の浸潤は多分変動し、そして個々の基準で決定することが必要であろう。
また、認識されるように、その作用を細胞内的に、例えば、リボソームまたは DNA代謝に発揮する治療剤の選択は、投与量および治療的に有効な投与量を達成するために要求される時間に影響を及ぼすであろう、そしてこのプロセスは生体外でおよび動物の研究、例えば、下に提供された実施例に開示されているものにおいてモデリングして、血管形成後の再狭窄を遅延、減少または防止するというその作用を達成するために治療接合体または投与形態を投与すべき濃度の範囲を見出することができる。
例えば、既知の比活性のアルファー、ベーターまたはガンマー放射体（例えば、ミリキュリー／ミリモルまたはミリグラムのタンパク質）で放射線標識化した治療接合体は、治療的に有効な投与量を決定するために有用であり、ここでそれらを動物の研究およびヒトの実験において使用して、組織学的組織の断面の定量的画像形成またはオートラジオグラフィーにより治療プロトコールにより要求される治療接合体の濃度を決定する。
治療接合体または投与形態の治療的に有効な投与量は、少なくとも３つの条件を満足するとき、到達されるであろう：すなわち、（１）治療接合体または投与形態は外傷的に障害された血管の内膜層の中に分布される；（２）治療接合体または投与形態は平滑筋細胞の所望の細胞内の隔室、すなわち、治療剤の活性のために必要な隔室の中に分布されるか、あるいは投与形態から細胞外に解放された治療剤は関係する細胞内の隔室の中に分布される；および（３）治療剤は血管平滑筋細胞の所望の細胞活性、例えば、前述の増殖、移動、細胞体積の増加、マトリックスの合成、細胞の収縮などを阻害する。
認識されるように、治療接合体または投与形態を注入カテーテルで放出すべき場合、治療接合体または投与形態について所望の阻害活性を達成するために要求される治療投与量は、また、生体外の研究の使用により予測することができる。好ましい面において、注入カテーテルは便利には透過性膜をもつ二重のバルーンまたは四重のバルーンのカテーテルであることができる。１つの代表的態様において、治療接合体または投与形態の治療的に有効な投与量は、疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、動脈瘤など）または血管外科的処置、例えば、血管形成、動脈切除、ステントの配置（例えば、血管の中）、血栓切除、および移植から生ずる血管の外傷の処置において有用である。
動脈切除は、例えば、外科的切除、超音波およびレーザーの処置によるか、あるいは高圧の流体流により実行することができる。移植は、例えば、合成材料の特質を使用する血管の移植であるか、あるいは、例えば、器官の移植の間の、血管の吻口であることができる。当業者は認識するように、所定の血管の外科的処置（上の）のために適当な治療投与量は生体外および生体内の動物モデルの研究において、およびヒトの前臨床の実験において決定される。下に提供される実施例において、ロリジンＡおよびNR−AN−01を含有する治療接合体は、放射線標識化アミノ酸の取り込みにより判定されるように、被験細胞において細胞のタンパク質合成を少なくとも５〜50％だけ阻害する濃度において、生体内で治療的に有効な投与量を達成した。
抗移動または抗マトリックスの治療剤を含有する接合体または投与形態の治療剤の場合において、それぞれ、生体外アッセイにおける細胞の移動および細胞の付着を使用して、血管壁の中に注入カテーテルによりつくられた流体空間において治療的に有効な投与量が到達される濃度を決定することができる。
本発明の１つの代表的な態様は注入カテーテルを使用する治療方法に関するが、認識されるように、薬物の放出の他の方法または投与のルート、例えば、静脈内、リンパ内、くも膜下、動脈内、移植された浸透圧ポンプによる局所的放出または他の腔内ルートは、また、有用であることができる。静脈内投与のために、本発明のナノ粒子の投与形態は好ましい。例えば、血管の透過性が漏れについて腫瘍において、ことに間質流体の中への粒子の漏れを可能とする、損傷した血管を有する腫瘍の壊死区域において、増加する場合、および動脈壁が表皮剥離しそして外傷を受けて、膜媒質の間質区域へ粒子が入るのを可能とする場合において、ナノ粒子の静脈内投与は有用である。
有利には、カップリングしていない血管平滑筋結合性タンパク質（例えば、遊離のNR−AN−01抗体）を、治療剤の接合体または投与形態の投与前に、投与して、交差反応性部位への非特異的結合のブロッカーを提供する。このような部位のブロックは重要である。なぜなら、血管平滑筋結合性タンパク質は一般に所望の平滑筋細胞以外の組織中の細胞との交差反応性のレベルが多少低いからである。このようなブロッキングは特定の血管部位における治療接合体または投与形態の局在化を、例えば、細胞への有効な治療接合体を多くすることによって、改良することができる。１例として、カップリングしない血管平滑筋結合性タンパク質は、治療接合体または投与形態の投与前の、約５分〜約48時間、最も好ましくは約５分〜約30分に投与される。
本発明の好ましい態様において、非標識化の特定の「ブロッカー」は抗体の１価または２価の形態（例えば、全抗体または抗体のF(ab′)2, Fab, Fab′、またはFv断片) である。抗体１価の形態は治療接合体または投与形態の変位を最小と同時に非特異的交差反応性のブロッキングを最大にするという利点を有する。カップリングしない血管平滑筋結合性タンパク質は、患者における非特異的交差反応性部位の少なくとも一部分の結合をブロックするために有効な量で投与される。この量は、因子、例えば、患者の体重および結合性タンパク質の特質に従い変化することができる。一般に、約0.06mg〜0.20mg／kg体重またはそれ以上の非標識化の特定のブロッカーをヒトに投与する。
さらに、治療接合体または投与形態の投与前に、第２の無関係の血管平滑筋結合性タンパク質を必要に応じて患者に投与して、組織への治療接合体または投与形態の非特異的結合を減少することができる。好ましい態様において、無関係の結合性タンパク質は、患者の部位に抗原特異的結合を通して結合しないが、その代わり非特異的方法で、例えば、Fcレセプター結合性細網内細胞、アシアロ (asialo) −レセプターの結合を通して、そしてユビクイチン発現細胞への結合により結合する抗体であることができる。
無関係の「ブロッカー」は治療接合体または投与形態の非特異的結合を減少し、こうして治療接合体または投与形態の使用に関連する副作用、例えば、組織の毒性を減少する。無関係の「ブロッカー」は、治療接合体または投与形態の投与前の、約５分〜約48時間、最も好ましくは約15分〜１時間に投与されるが、時間の長さは治療接合体および注入のルートまたは方法に依存して変化することがある。無関係の「ブロッカー」の代表例は、試験したとき、特定の方法で（例えば、Ka＜103 ／Ｍで）ヒト細胞膜の標的に結合しないことが発見された、動物源から調製された、ヒト組織およびレセプターまたは細胞または血清タンパク質と非反応性である抗体を包含する。
認識されるように、本発明の接合体および投与形態は使用において血管形成後のの治療に制限されず；むしろ、治療接合体および投与形態の有用性は血管壁における平滑筋細胞および血管周囲細胞の細胞活性を阻害するそれらの能力により禁止されるであろう。こうして、本発明の他の面は、初期の治療的関与においてアテローム性動脈硬化症のプラークおよび血管壁の肥大および／または過形成の区域を減少、遅延、または排除（およびさらに逆転）するために有用である治療接合体および投与形態およびプロトコールを包含する。本発明の治療接合体および投与形態は、また、初期関与のためにアテローム性動脈硬化症前の状態において実用性を見出す、例えば、それらはアテローム性動脈硬化症を発生する高い危険にあるか、あるいは血管壁の肥大のために血管のアテローム性動脈硬化症の変化または血管の狭窄から生ずる高血圧の徴候をもつ患者において有用である。
本発明の治療接合体および投与形態は、また、障害のある血管組織および上皮の創傷を包含する多数の種類の創傷部位における内皮細胞の再生を増強する治療的条件において使用することができる。これらの治療的条件において、本発明の治療接合体および投与形態は血管平滑筋細胞または血管周囲細胞の移動および／または増殖の阻害において実用性を見出す。平滑筋細胞および血管周囲細胞は内皮細胞の増殖を阻害する生体外の因子の産生に関係づけられてきており、そしてそれらの増殖は、また、連続的内皮の確立に対する物理的バリヤーを生ずることがある。こうして、本発明の治療接合体および投与形態は、例えば、治癒、血管移植の間および血管手術後の新血管形成および再内皮化の増加を促進するとき実用性を見出す。投与形態は、また、損傷した血管壁の再内皮化を刺激または加速する解放治療条件であることができる。この目的のための治療剤の例は血管透過因子である。
本発明のなお他の面は、血管部位における創傷の治癒を増強しかつ治癒した血管組織の構造的および弾性特性を改良する治療的条件に関する。本発明の治療接合体または投与形態を使用するこれらの治療的条件において、すなわち、血管壁における血管平滑筋細胞または血管周囲細胞の移動および増殖を阻害するために、血管の治癒の強さおよび品質は改良されるであろう。血管の創傷部位における平滑筋細胞は、創傷の治癒を促進する創傷部位の収縮の正常のプロセスに寄与する。平滑筋細胞の移動および増殖および形質転換された平滑筋細胞によるマトリックスの分泌はこの正常プロセスから外れ、そして治癒した血管の長期の構造的および弾性的品質を障害すると現在と信じられる。こうして、本発明の他の面は、平滑筋および血管周囲細胞の増殖および移動ならびに形態学的形質転換を阻害し、そして治癒した血管系の品質を改善する治療接合体および投与形態を提供する。
本発明は、また、細胞破壊性治療接合体および細胞破壊性治療剤を包含する組み合わせの治療法を提供する。細胞破壊性接合体は、血管平滑筋細胞に特異的に局在化することができる結合相手（例えば、タンパク質またはペプチド）およびこのような細胞を殺すことができる活性剤を含む。細胞破壊性接合体は、好ましくは静脈内にまたは任意の他の便利なルートを通して、投与されて、標的平滑筋細胞に局在化し、そして狭窄または再狭窄の事象に関係する増殖する細胞を破壊する。
この細胞の破壊はミトゲンの解放および他の代謝の事象を引き起こし、これらの事象は、引き続いて、血管平滑筋細胞の増殖に一般に導く。本発明の持続放出性の抗増殖または抗収縮投与形態は、次に、好ましくは注入カテーテルまたは任意の便利な投与形態で投与される。持続放出性投与形態は血管平滑筋細胞の増殖および／または移動および収縮を遅延し、これにより管腔の直径を維持する。この処置法は血管平滑筋細胞の過形成などから生ずる狭窄性血管において有用な生物学的動脈切除を構成する。
本発明は、また、ターゲテッド粒状投与形態の局所的投与を通して癌および免疫系仲介疾患の処置方法を提供する。粒状投与形態は、例えば、癌の標的細胞の一次および／または転移性のフォーカスの中に局所的に投与される。局所的投与は、好ましくは、注入針または管腔内の投与のルートを使用して実施されて、腫瘍組織の取扱説明書領域において、あるいは腫瘍細胞を取り囲む管腔流体の中に粒状投与形態を注入する。
一次フォーカスの導入は、好ましくは、一般に哺乳動物内の限られた区域に位置する標的細胞、例えば、腹腔の中に位置する卵巣癌に関して実施される。一夜ん投与形態は標的細胞の集団に結合しそして、必要に応じて、治療剤の経時的解放のためのその中に内在化される。このような一次フォーカスへの本発明の投与形態の局所的投与は、他の感受性の器官、例えば、骨髄および腎臓の治療剤への暴露を制限して、このような標的細胞への局在化作用を生ずる。
転移性フォーカスが標的細胞の集団を構成するとき、投与される微小粒子およびより大きいナノ粒子は注入部位に近く位置する標的細胞に主として結合しそして、必要に応じて、治療剤の解放のために内在化され、これにより注入部位を直ちに取り囲む標的細胞に対して顕著なかつ局在化した作用を発生する。さらに、より小さいナノ粒子は間質流体流またはリンパ排出チャンネルをたどり、そして注入部位に対して遠位の標的細胞に結合しそしてリンパ転移を行う。
本発明のこの態様のターゲテッド投与形態は、いっそう普通の免疫接合体の治療と組み合わせて使用することができる。この方法において、免疫接合体は全身的毒性の限界内で全身的作用を達成するが、本発明の投与形態は濃縮されかつ持続された投与量の治療剤を、このような「全身的」免疫接合体の投与単独から不適切な治療的投与量をしばしば受け取る、一次および転移性フォーカスに放出し、そして全身的毒性作用を回避するか、あるいは最小とする。
標的細胞の集団が局所的投与によりアクセス可能である場合、本発明の投与形態は免疫系仲介疾患を抑制するために利用される。このような疾患の例は関節炎、スプルー、ブドウ膜炎、眼内炎、角膜炎などである。本発明のこれらの態様に関係する標的細胞の集団は体腔または空間、それぞれ、関節襄、胸腔、体腔、眼および結膜下の空間に限定される。局所的投与は、好ましくは、胸内、腹腔内、眼内または結膜下の投与のルートのために注入針を使用して実施される。
本発明のこの態様は、全身的免疫系細胞への作用を最小にして、免疫系細胞のいっそう強い、局在化された変調を提供する。必要に応じて、免疫系の全身的細胞は結合性タンパク質またはペプチドに接合された化学療法剤で同時に処置することができる。このような接合体は好ましくは血管管腔から標的免疫系細胞の中に侵入する。
局所的粒状投与形態の投与は、また、増殖するように刺激された正常組織に局在化させ、これによりこのような病理学的（すなわち、活動過剰的）状態を減少または排除することができる。本発明のこの態様の１例は、新脈管系形成組織の血管周囲細胞および平滑筋細胞に局在化する結合性タンパク質またはペプチドで被覆された、粒状投与形態の眼内投与を包含する。これらの血管周囲細胞の増殖は眼の退行変性疾患を引き起こす。本発明の好ましい投与形態は、標的細胞の集団の病理学的増殖を抑制できる化合物を解放する。好ましい投与形態は、また、血管管腔区域および血流を増加する化合物を解放し、この血液投与形態の減少により生成する病理学的変更を減少することができる。
本発明のなお他の面は、血管形成または他の血管外傷後の拡張した管腔体積を維持する治療的理学療法に関する。本発明のこの面の１つの態様は、血管平滑筋細胞の収縮能力を阻害することができる治療剤の投与を包含する。本発明のこの面の実施において有用な物質の例は、正常の血管の静水圧（すなわち、血圧）が弛緩性血管をその最大の生理学的直径にまたはその付近に拡張させるように、外傷を受けた動脈が血管の緊張を損失するようにさせる物質である。血管の緊張の損失は、収縮タンパク質（例えば、アクチン、トロパマイシン、カルデスモン、カルポニンなど）の形成または機能を妨害する物質により引き起こすことができる。この妨害は、例えば、カルシウムの変調、リン酸化または血管平滑筋細胞の収縮に関係する他の代謝経路の阻害を通して、直接または間接的に起こすことができる。
細胞の収縮（すなわち、血管の緊張の損失）の阻害は２つの機構を通して働いて、血管の狭窄の程度を減少させることができる。第１に、延長した期間の間の細胞の収縮の阻害は、膜媒質から内膜の中に移動する平滑筋細胞の数を制限し、内膜の厚さの増加は血管管腔の狭窄を生ずる。第２に、細胞の収縮の阻害は正常血管静水圧（すなわち、血圧）下に平滑筋壁を弛緩および拡張させる。治療剤、例えば、サイトカラシンは、外傷を受けた、血管形成後の、あるいは他の外科的または疾患的に損傷した平滑筋細胞がそれら自体の修復に必要なタンパク質合成を壊滅させないで、平滑筋細胞の収縮を阻害する。タンパク質合成は、また、平滑筋細胞がマトリックスを分泌するために必要であり、このマトリックスは血管の損傷が安定化するとき、管腔をその最大の収縮直径付近の状態に固定または保持する（すなわち、生物学的に誘発されたステンティング作用）。
この生物学的ステンティング（stenting) 作用は血管管腔区域を拡張させそして血管を通る血液の流速を増加するばかりでなく、かつまた血管形成後の弾性的反動を有意に減少させる。弾性的反動は、血管形成の間のバルーンカテーテルによる血管の過度の伸長から生ずる外傷ショックのために、血管痙攣または筋肉壁の弛緩に関連する血管の急性閉鎖である。管腔区域の減少に導く膜媒質のこの痙攣はバルーン拡張後数時間、数日または数週以内に起こり、このとき血管筋壁の回復が起こる。
動脈切除の標本の顕微鏡検査の間の最近の観察が示唆するように、弾性的反動は、初期の処置後の血管造影図に基づいて、首尾よく分類された血管形成処置の25％までにおいて起こることがある。生物学的ステンティング処置はバルーン血管形成後の動脈壁を弛緩させるので、臨床医は、血管痙攣または弾性的反動を減少または遅延するための手段として、過度の膨脹およびその結果生ずる外傷ショックを排除することができる。過度の膨脹の減少または排除は血管の筋肉壁への外傷を減少し、これにより内膜における平滑筋細胞の増殖の決定因子減少し、したがって、再狭窄の発生または重症を減少する。
生物学的ステンティングは、また、血栓の形成の発生を減少する。サイトカラシンＢで処理したブタ大腿動脈において、壁の微小血栓の発生は治療剤で処置しなかったバルーンで外傷を受けた動脈に比較して減少した。この現象は、外傷を受けた血管を通る血流の増加から生じうる二次的利益であるように思われ、前記利益は本発明の実施を通して得られる。
サイトカラシン類は、血管平滑筋細胞への生物学的ステンティングの作用を発生することができる治療剤の例である。サイトカラシン類は、アクチンと相互作用することによって、血管平滑筋細胞の移動および収縮の両方を阻害すると考えられる。サイトカラシン類はフィラメント状アクチンの末端と相互作用してアクチンのフィラメントの伸長を阻害する。低い投与量のサイトカラシン類（例えば、サイトカラシンＢ）は、また、アクチンのミクロフィラメントの網状組織を崩壊させる。生体外のデータが示すように、血管平滑筋細胞がサイトカラシンＢを除去した後、細胞は約24時間以内に十分な重合したアクチンを再生して移動を再開する。生体内の評価において、血管平滑筋細胞は２〜４日以内に血管の緊張を再び獲得することが明らかにされた。管腔直径の固定および生物学的ステンティング作用が起こるのは、この回復期間の間である。
治療剤をターゲッティングすることができるが、好ましくは血管形成または他の外傷事象後に外傷を受けた血管に直接投与する。例えば、サイトカラシンＢの生物学的ステンティング作用は、約 0.1μｇ／ml〜約 1.0μｇ／mlの範囲の投与濃度で血管壁の外傷を受けた領域の中に治療剤を単一に注入して達成される。
血管平滑筋細胞の移動（膜媒質から内膜への）の阻害は、同一投与量範囲において証明された（実施例11）：しかしながら、治療剤への血管の持続した暴露はこれらの抗移動作用を最大するために好ましい。血管平滑筋細胞が内膜の中に移動することができない場合、それらはそこで増殖することができない。血管平滑筋細胞が内膜へ移動する場合、引き続いて投与された抗増殖性持続放出性投与形態は内膜の増殖を阻害する。その結果、サイトカラシンまたは他の抗増殖治療剤を含有する本発明の持続放出性投与形態は、遊離サイトカラシン治療剤と組み合わせて投与することができる。この方法において、生物学的ステンティング作用、ならびに抗増殖または抗移動作用は、単一の投与のプロトコールで達成することができる。
本発明のプロトコルにおいて有用である作用物質は例えば以下の手順に従って同定可能である。自由な作用物質投与（つまりターゲティングされていない）のための潜在的な作用物質は、以下の特性のうちの単数又は複数のものを示す：
（ｉ）血管形成術（例えばPTCA、経皮経管血管形成(PTA) など) 又はアテローム切除 (例えばrotoblater、レーザーなど) 、冠動脈バイパス手術などを含むその他の外傷の後の又は血管の病気 (例えばアテローム硬化症、血管狭窄症又は萎縮症に二次的に起こる眼の病気、脳血管狭窄症など）の結果として生じる拡張した管腔体積を保持する；
（・）作用物質によって容易になった管腔面積の初期増加の結果として管腔の慢性的狭窄をもたらしたり又はこの狭窄を強調したりしない：
（・）標的細胞の収縮又は移動を阻害する；及び
（・）細胞増殖抑制性をもつ。
好ましくは、ここで利用される治療用作用物質は、４つの特性の全てを有することになる；しかしながら、本発明の実施のためには第１及び第３の特性が第２及び第４の特性よりも重要である。例えばサイトカラシンＢは自由な治療用作用物質のプロトコルにおいて使用することに対する適性を決定する目的で評価された。サイトカラシンＢの生物学的ステント効果は、１mlにつき約 0.1ミリグラムから約 1.0ミリグラムの用量濃度範囲で血管壁の外傷を受けた領域内に治療用作用物質の輸液を一回用いることによって、達成することができる。
本発明の持続放出性の実施態様において有用な作用物質は、以下の特徴のうちの単数又は複数のものを示す：
（ｉ）血管形成術（例えばPTCA、経皮経管血管形成(PTA) など) 又はアテローム切除 (例えばrotoblater、レーザーなど) 、冠動脈バイパス手術などを含むその他の外傷の後の又は血管の病気 (例えばアテローム硬化症、血管狭窄症又は萎縮症に二次的に起こる眼の病気、脳血管狭窄症など）の結果として生じる拡張した管腔体積を保持する）；
（・）標的細胞の増殖を阻害する（例えばこの作用物質に対してインビトロで５分及び24時間露呈した後、血管平滑筋組織培養は、一定レベルの 3Ｈ−チミジン摂取阻害を立証し、好ましくは比較的低い 3Ｈ−ロイシン摂取阻害を示す）；
（・）DNA 合成を阻害するのに充分な用量で、穏やかから中位までの（例えば以下で記述する検定においてグレード２又は３）形態学的な細胞毒性効果を生み出す；
（・）標的細胞濃度を阻害する：及び
（ｖ）細胞増殖抑制性をもつ。
前記属性のうちの１つ又は複数のものを示す治療用作用物質を固定した時点で、この作用物質を、それに対する血管平滑筋細胞のより長時間の露呈が関与する第２の試験プロトコルに付す。
本発明の持続放出性実施態様において有用な作用物質は、次のような特性を示す：
（ｉ）長時間（例えば５日間）の露呈時点で、作用物質は、上で５分及び24時間の露呈について記述したものと同じ又は類似の血管平滑筋組織培養 DNA合成及びタンパク質合成に対するインビトロ効果を生み出す；及び
（・）DNA 合成阻害についての長期インビトロ検定において、有効な用量で、作用物質は、より長い期間（例えば10日間）にわたり穏やかから中位までの形態学的細胞毒性効果を示す。
本発明の範囲内での潜在的な抗増殖性作用物質のさらなる評価が、インビトロでのバルーンで外傷を受けたブタの大腿動脈モデルにおいて行なわれる。好ましくは、このような作用物質は、組織収集及び組織学的評価に先立つ１時間の「BRDU閃光標識付け」によって示されるように中膜血管平滑筋細胞内での細胞増殖の50％以上の阻害を立証する。作用物質が、１図の露呈で内膜平滑筋増殖を50％以上阻害するのに充分な時間有効であるならば、それは、持続放出性用量形態での投与を必要としない本発明の範囲内の作用物質である。
全身時毒性及び潜在的な治療指数が、静脈内投与により50％の阻害を達成するのを可能にするようなものであると思われる場合、又は有効な抗増殖用量にて持続放出によって血管平滑筋細胞に対し局所的に送り出すように作用物質を導くことができる場合には、さらに短かい持続時間の活性をもつ作用物質を持続放出のために評価する。持続放出性作用物質は用量最適化及び効力の研究のため持続放出性用量形態で評価される。好ましくは、本発明の実施において有用な抗増殖性作用物質は、バルーン外傷を受けたブタの大腿動脈内で血管狭窄を50％減少させ、さらに好ましくは、ブタの冠動脈内で同程度まで血管狭窄を減少させる。このとき、かかる作用物質をヒトの臨床試験にて評価することが可能となる。
細胞増殖（すなわち DNA合成）の阻害は、作用物質の持続放出のための主要な特徴である。例えば、スタウロスポリンは、投与された用量で細胞増殖抑制性を有するように 3Ｈ−ロイシン及び 3Ｈ−チミジンの摂取の間の差を示す。より長い時間の細胞障害性研究は、治療用作用物質に対する長時間の露呈が標的細胞に対して不利な影響を及ぼさないことを示した。さらに、BRDUパルス法によると、スタウロスポリンが標的細胞の増殖を阻害することがわかった。しかしながら、細胞増殖能力を評価するための適切なあらゆる方法を代替的に使用することができる。従って、スタウロスポリンは、拡張した管腔体積を保持するのに有効である。
本発明は、以下の特定的な例を参照することによってより良く理解できることだろう。
例１． インビボでの血管壁内血管平滑筋細胞に対する結合
図１は、NR−AN−01の静脈内投与から４日目の、24才の男性患者の動脈血管壁内の平滑筋細胞に対するNR−AN−01（マウスIgG2b MAb)の結合を示している。図１は、切片が半ビボで HRP接合されたヤギ抗マウスIgG と反応させられた、NR−AN−01投与後の患者の動脈壁の内側領域を通して採取された組織学的切片の顕微鏡写真である。
NR−AN−01 Mabとの HRP接合体の反応は、ペルオキシダーゼ基質 (色原体) として４−クロロ−１−ナフトール又は３，３′−ジアミノベンチジンテトラヒドロクロリドを付加することによって視覚化された。基質の反応生成物は、反応部位において、不溶性の紫色又は暗褐色の沈降物を形成する（図１に＃２で示す）。膠原性の細胞外基質物質（図１に＃２と示す）又は細胞核（＃１，図１）を視覚化するために、対比染色が用いられた。平滑筋細胞は、顕微鏡検査で紫色に染色された細胞として視覚化される。この顕微鏡写真は、インビボでヒトの血管平滑筋に特異的に統合しかつ細胞により内在化されて、さらに長い期間細胞内にとどまる MAbの能力を実証している。
例２． トリコテセン治療用作用物質を含む治療用接合体
NR−AN−01と呼ばれるモノクローナル抗体に対して (以下に記述するとおり) トリコテセン細胞毒素のヘミスクシネート誘導体を化学的にカップリングさせることによって、NR−AN−01及びロリジンＡの接合体を構築した。２つの接合体は、１方がロリジンＡの２′位置に、もう一方が13′位置にカップリングされた状態で調製された。この合成において、図２及び図３に記されている２つの方式を使用した。次に、接合体を、PD-10 SEPHA ROSE・カラムクロマトグラフィ(Pharmacia；Piscataway, NJ) によって未反応のロリジンＡから精製し、サイズ排除高圧液体クロマトグラフィーによって分析し、次にカラム画分を以下に記述する通りSDS-PAGE及び等電点電気泳動(IEF) によって特徴づけした。
図２は、室温（RT) でジクロロメタン (CH2Cl2) 内に存在する無水コハク酸、トリエチルアミン (NEt3) 及びジメチルアミノピリジン (DMAP) を用いて、及びRTで同じくCH2Cl2内でＮ−ヒドロキシスクシンイミド(NHS) 及びジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC) 試薬を用いて、という試薬を使った２段階プロセスを通してのロリジンＡヘミスクシニルスクシンイミデート（RA−HS−NHS)の合成のための第１の反応方式を概略的に示している。
図３は、室温（RT) でジメチルホルムアミド(DMF) 中の塩化ｔ−ブチル−ジメチルシリル（TMMS−Cl) 及びイミダゾールを用いて；RTでジクロロメタン (CH2Cl2) 内の無水酢酸、トリエチルアミン(TEA) 及びジエチルアミノピリジンを用いて；RTで (CH2Cl2) 内の無水コハク酸；トリエチルアミン(TEA) 及びジメチルアミノピリジン (DMAP) を用いて；及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド(NHS) 及びジクロロヘキシルカルボジイミド(DCC) 試薬を用いてといった、試薬を使った５段階プロセスを通しての、ロリジンＡヘミスクシニルスクシンイミデート（RA−HS−NHS)の合成のための第２の反応方式を概略的に示している。
２′−ロリジン−Ａ−ヘミコハク酸（２）の合成：
0.5 ｇ (0.94mmol) のロリジンＡに対して、15mlのシクロロメタンを付加した。この溶液に対して、撹拌しながら 0.104ｇ (1.04mmol) の無水コハク酸を付加した。反応混合物に対し、５mlのシクロロメタン中の、 0.2mlのトリエチルアミンを付加した。均質な反応混合物に対して、触媒量のジメチルアミノピリジンを付加し、15時間室温で撹拌した。反応の完了後、薄層クロマトグラフィを行なった (数滴の酢酸を伴って、CH2Cl2：CH3OH ＝ 9.7：0.3)。反応終了後、 0.3mlの氷酢酸を付加し、減圧下で溶剤を除去した。乾燥した粗製残留物は、水と塩化メチレンの間で分割された。無水硫酸ナトリウム上で組合さった塩化メチレン抽出物（３×50ml）を乾燥させ、真空下で溶剤を除去して、３つの化合物の粗製混合物を 0.575ｇ (96％) 得た。２％の酢酸を伴う50％のアセトニトリル・水の中の粗製混合物の予備的 C18HPLC分離は、白色固体として0.36ｇ (60％) の２を生み出した。
スクシンイミジル２′−ロリジンＡヘミスクシネート（３）の合成：
30mlのジクロロメタン中の２′ロリジンＡヘミコハク酸 0.3ｇ(0.476mmol) に対して、 0.055ｇ(0.487mmol) のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを付加した。清澄な反応混合物に対して、 0.108ｇ(0.524mmol) のジシクロヘキシルカルボジイミドを付加した。６時間室温で反応混合物を撹拌した。反応終了後、顕色用溶剤として（数滴の酢酸を伴う、CH2Cl2：CH3OH ＝ 9.7：0.3)を用いて TLCを行なった。反応混合物に対して数滴の氷酢酸を付加し、溶剤を減圧下で除去した。乾燥残留物に対してジクロロメタンを加え、沈降させた DCUをろ過した。ろ液からの溶剤を、減圧下で除去し、白色固体を得た。粗製生成物から、流動層として２％の酢酸を用いて50％のアセトニトリル中で予備的HPLCにより、 0.208ｇ (60％) の３を精製した。
13′−ｔ−ブチルジメチルシリルロリジンＡ（４）の合成：
0.5ml のジメチルホルムアシド溶液中の72.3mg(0.136mmol) のロリジンＡに対して、 0.055ｇ(0.367mmol) の塩化ｔ−ブチルジメチル及び 0.025ｇ(0.368mmol) のイミダゾールを付加した。反応混合物を15時間室温で撹拌した。反応完了後、顕色用溶剤として１％のMeOH−CHCl3 を用いてシリカゲル薄層クロマトグラフィを行なった。反応混合物からの溶剤を、真空下で除去し、乾燥させた。粗製生成物を、水と塩化メチレンの間で分割させた。組合わされた塩化メチレン抽出物からの溶剤を、減圧下で除去し、乾燥させた。溶離用溶剤として EtoAc：ヘキサン（１：３）を用いて閃光クロマトグラフィにより、精製生成物を精製した。溶離液からの溶剤を、減圧下で除去して、固体として0.66ｇ (75％) の４を得た。
13′−ｔ−ブチルジメチルシリル２アセチルロリジンＡ（５）の合成：
10mlのジクロロメタン中の 0.1ｇ(0.155mmol) の13′−ｔ−ブチルジメチルシリルロリジンＡに対して、 0.3mlの無水酢酸、 0.2mlのトリエチルアミン及び数個のジメチルアミノピリジン結晶を付加し、２時間室温で保管した。反応の完了後、顕色用溶剤としての１％メタノール−塩化メチレン中で TLCを行なった。減圧下で溶剤を除去し、溶離用溶剤として１％のメタノールクロロホルムを用いてシリカゲルカラムによりこれを精製した。溶離液からの溶剤を真空下で除去して、固体として 0.085ｇ (80％) の５を得た。
２′アセチルロリジンＡ（６）の合成：
５mlのテトラヒドロフラン中の0.05ｇ(0.073mmol) の２′−アセル13′−ｔ−ブチルジメチルシリルロリジンＡに対して THF中の 0.3mlの１Ｍのテトラブチル−フッ化アンモニウム溶液を付加した。室温で２時間、反応混合物を撹拌した。反応完了後、顕色用溶剤として１％のMeOH−CHCl3 を用いてシリカゲル薄層クロマトグラフィを行なった。反応混合物からの溶剤を、減圧下で除去し、乾燥させた。溶離用溶剤として１％の CH3OH−CHCl3 を用いてシリカゲル上で、粗製生成物を精製した。組合された溶離液からの溶剤を真空下で除去して、 0.020ｇ (48％) の６を固体として得た。
２′−アセチル13′−ヘミスクシニルロリジンＡ（７）の合成：
１mlのジクロロメタン中の0.05ｇ(0.087mmol) の２′−アセチルロリジンＡに対して、0.025 ｇ（0.25mmol）の無水コハク酸と35mlのトリエチルアミンを付加した。触媒として、数個のジメチルアミノピリジン結晶を付加した。反応混合物を室温で24時間撹拌した。反応完了後、顕色用溶剤として５％のMeOH−CH2Cl2を用いて薄層クロマトグラフィを行なった。反応の終了時点で30mlの氷酢酸を付加した。反応混合物からの溶剤を、減圧下で除去し乾燥させた。粗製生成物は水と酢酸エチルの間で分割させた。減圧下で、一緒にした酢酸エチル画分からの溶剤を除去した。粗製生成物をシリカゲルカルムを通して精製し、 0.039ｇ (66％の７を白色固体として得た。
スクシンミジル２′−アセチル13′−ロリジンＡヘミスクシネート（８）の合成：
２mlのジクロロメタン中の 0.036ｇ (0.0050mmol) の２′−アセチル13′−ロリジンＡヘミコハク酸に対して 0.009ｇ（0.09mmol）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを付加した。撹拌した溶液に対して、 0.012ｇ(0.059mmol) のジシクロヘキシルカルボジイミドを付 加した。反応混合物を、８時間室温で撹拌した。反応完了後、顕色用溶剤として５％のMeOH−CH2Cl2を用いてシリカゲル薄層クロマトグラフィを行なった。反応混合物に対して数滴の氷酢酸を付加した。反応混合物からの溶剤を、減圧下で除去し、乾燥させた。溶離用溶剤として５％のMeOH−CH2Cl2を用いてシリカゲルカラム上で粗製生成物を精製させた。組合せた溶離液からの溶剤を真空下で除去して、白色固体として 0.025ｇ（61％）の８を除去した。
スクシンイミジル２′−ロリジンＡヘミスクシネート（３）とスクシンイミジル２′−アセチル13′−ロリジンＡヘミスクシネート（８）のNR−AN−01全抗体(MAb) に対する接合 (コンジュゲーション) ：
ゲル浸透クロマトグラフィによる精製に先立ち45分間穏やかに混合しながら室温で25％のジメチルスルフォキシド (DMSO) 溶剤の存在下でホウ酸緩衝液中でpH8.0 にて、接合反応を行なった。トリコテセン薬物前駆体抗体のモル提供比は、２′及び13′ロリジンＡ類似体（３及び８）について、それぞれ25：１及び40：１であった。抗体濃度は、接合反応中 0.9〜1.0 mg／mlであった。
25mlの抗体との標準的な２′類似体（３）反応は以下のとおりであった。
リン酸緩衝液（すなわち PBS；150mM のNaCl, 6.7mM のリン酸塩、pH7.3)中１mlにつき 5.3mgのAb 4.7mlに対して、10mlの PBS及び５mlのホウ酸緩衝液(0.5Ｍ, pH8.0)を付加した。穏やかに撹拌しながら、反応混合物に対して、次に、1.37mgのスクシンイミジル２′ロリジンＡヘミスクシネート（３）を含む 6.3mlのDMSOを15秒間にわたり滴下で加えた。
精製：
精製するためには、 PBS中で平衡化されたPharmacia PD−10セファロース（商標）カラムに対して、１mlの反応アリコートを加えた。 2.4〜4.8 mlの画分で、溶離された接合体を収集した。次にPD−10で精製した接合体アリコートをプールし、Amiconの PM-10 DiA-flo・濃縮器上で 1.5〜2.0 mgのAb／mlまで濃縮させた：次に、 0.2μの Gelman Acrodisc（商標）を通して無菌ろ過し、５mlの体積で無菌ガラスバイアル中に充てんした。
２′の接合体を液体窒素内で急速凍結させ、次に使用するまで−70℃で保管した。13′ロリジンＡ NR−AN−01接合体を凍結状態又は冷蔵状態（すなわち５〜10℃）で保管した。
接合体の特徴づけ：
銅試薬方法（Pierce Chemical Corp.)を用いてBCA 検定によりタンパク質濃度を決定した。
抗体誘導体化の度合の評価は、４時間（２′接合体については室温で又は13′接合体については37℃で）pH10.3の 0.2Ｍの炭酸塩中で接合体アリコートをまず加水分解させ、次にPM−30膜を通してろ過することによって行なった。次にそれぞれ50：48：２の CH3CN：H2O ：HOAC比の流動層を用いてＣ−18逆相HPLC上でロリジンＡについてろ液を検定した。13′接合体の加水分解中極性生成物を生成する平行した大環状環分解について補正するべく、1.32の補正係数を用いた。
DuPont Zorbax（商標）HPLC上でのサイズ排除クロマトグラフィ及び Serva（商標）ゲル平板 (pH３〜10) を用いた等電点電気泳動も同様に行なわれた。HPLCによっては、いかなる凝集の兆候も観察されなかった。
ストレプトアビジン／ペルオキシダーゼ検出を伴うビオチニル化−Abを用いた競合ELISA によって、又は 125Ｉで標識付けされた抗体を用いた競合細胞結合検定によって、ロリジンＡ−抗体接合体の免疫検定を行なった。代替的には、免疫反応性は、抗体がまずクロラミンＴ方法によりＩ−125 で追跡標識づけされ次にひき続き２′及び13ロリジンＡ前駆体で誘導体化される細胞結合検定において抗体飽和条件下で測定された。
トリコテセンの構造式は以下のとおりである：
例３． 平滑筋細胞に対する結合の反応速度論
静脈内カテーテルによる投与のためには、本発明の治療用接合体が３〜５分以内に投与され、かくして患者の体内で血液流が再度樹立され得ることが望ましい。従って、 109リットル／モルを上回るKaで平滑筋結合タンパク質の結合反応速度を決定するための研究が行なわれた。ヒトの血管平滑筋細胞は培養中でゆっくりと成長し、比の平滑筋細胞はヒトのCSPG細胞表面標識を発現することがわかっていたことから；以下の例で記述する研究の多くにおいて、CSPG表面標識を支持するB054比動脈平滑筋細胞及びヒトのA375Ｍ／Ｍ（黒色腫：ATCC#CRL1619) 細胞を使用した。
反応速度論的な結合の研究のためには、2500細胞／ウェルの割合で、無菌96ウェルマイクロタイタープレートの中にA375Ｍ／Ｍ及びB054細胞を播種した。プレートをアルミホイルの中に包み込み、５％ CO2／95％空気の加湿雰囲気内で一晩37℃でインキュベートした。約18時間後、インキュベーションプレートを除去し、膜の反転を防ぐため５分間0.05％のグルタルアルデヒドで細胞を固定した。固定の後、プレートを、0.5％の Tween−20（商標）を含む PBSで徹底的に洗った。ロリジンＡを含むNR−AN−01治療用接合体の２倍の階段希釈液を、10mg／ml〜20ng／mlのタンパク質濃度で調製し、各希釈液を２つのウェルに等分した。５分、15分、30分及び60分間NR−AN−01と共に４℃でウレートをインキュベートし、その後未結合のタンパク質を吸引によって除去し、各ウェルに対して 100mlのCS緩衝液(PBS中５％のニワトリ血清／ 0.5％の Tween20（商標）) を加えた。
CS緩衝液を除去し各ウェルに 100mlの HRP接合されたヤギの抗マウス IgG(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) を加え、１時間４℃でインキュベートし、未結合のヤギ IgGを除去すべく PBS／0.05％ Tween（商標）で洗浄し、２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ABTS) 色素産生基質 (すなわち HRPに対して) を加えることによって、細胞に結合したNR−AN−01治療用接合体を視覚化した。30分間インキュベートした後、Compaqコンピュータによるデータ収集用に装備された ELISAプレート読取り装置を用いて 415nm及び 490nmで吸収度を測定することによって、細胞に結合したNR−AN−01の量を数量化した。
図４Ａは、NR−AN−01のさまざまな濃度（NRANO1μｇ／ml）で５分間（開放正方形、図４Ａ）、15分間（閉鎖菱形、図４Ａ）、30分間（閉鎖正方形、図４Ａ）又は60分間（開放菱形、図４Ａ）、A375ｍ／ｍ標識陽性細胞を４℃に保った（すなわち膜の反転を防ぐため）インビトロ研究の結果をグラフ表示している。A375細胞に対するNR−AN−01 MAbの結合は、未結合抗体を除去するべく洗浄し、 HRP接合されたヤギ抗マウスIgG を付加して細胞結合した MAbと反応させ、未結合のヤギ第２抗体を除去するべく洗浄し、ペルオキシダーゼのための２，２′−アジノ−ビス13−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸)(ABTS) 基質を付加することによって、数量化された。 415nmと 490nmの両方において30分後に顕色を監視した (ABS415,490) 。
図４Ｂは、図４Ａに関して上述したものと類似する要領で、ただしA375ｍ／ｍ細胞の代りにB054標識陽性の平滑筋細胞を用いて行なわれたインビトロ研究の結果をグラフで表わしてる。
図４Ａ及び図４Ｂに示された結果は、20ng／mlという最低の用量でさえ４℃で５分以内にA375及びB054細胞に対するNR−AN−01の有意な結合を示している。
実施例４． ロリジンRoridin A 及びRA−NR−AN−01抱合体の効果
細胞タンパク質合成（即ち 3Ｈ−ロイシン取り込みにより）及び代謝活性（即ちミトコンドリアMTT 検定により）に及ぼすロリジンＡ（RA）及びRA−NR−AN−01接合体の作用を以下の実施例５及び６に詳述した実験で試験した。実施例４の実験は、薬剤による長時間（即ち24時間）処理の効果を測定するための実験を含む。実施例５の試験は、細胞に及ぼす“パルス”（即ち５分）処理の効果を測定するための実験を含む。両試験において、“標的”細胞（即ちCSPG“マーカー”を有する細胞）及び非標的細胞を含入することにより、効果の細胞特異性を評価した。比較のために、遊離RA（即ち非結合）も試験に含めた。細胞タンパク質合成又は代謝活性に及ぼす作用を処理直後に評価するかあるいは“回復期間”を置いて（即ち37℃で細胞を一夜インキュベートして）細胞集団に及ぼす薬剤の長時間効果を測定した。
24時間曝露後の代謝効果：
モノクローナル抗体−薬剤抱合体がin vivo で用いた場合にはマーカー抗原を保有する細胞に対してある程度の特異性を有することは公知である一方、特に親液性の化合物を用いて効果のin vitroでの特異性を立証することは多数の系においては困難であることが示されている。したがって、RA−NR−AN−01−ロリジンＡ抱合体の阻害作用を24時間に亘って標的及び非標的細胞に関して調べる本実験を実施した。RA−NR−AN−01を用いた場合の結果を同じく24時間の遊離ロリジンＡの作用と比較した。修飾メチルテトラゾリウム青(MTT）検定を利用して臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム(Sigma）を用いて細胞代謝活性を測定した。この検定は、細胞ミトコンドリアデヒドロゲナーゼ活性を測定すると考えられる。
これらの試験の幾つかに関しては、Ｍ14（黒色腫）及びBO54（平滑筋）細胞株をマーカー陽性標的細胞として、並びにHT29細胞（結腸癌；ATCC #HTB38)を非標的特異性対照として用いた。他の試験においては、Ａ375 をマーカー陽性細胞として用いた。HT29及びＭ14細胞を96ウエルマイクロ滴定プレート中に 5.0×103 細胞／ウエルの濃度で、BO54細胞を 2.5×103 細胞／ウエルで植え付けた。遊離ロリジンＡ及び２′RA−NR−AN−01（即ちNR−AN−01と２′位置でヘミスクシネート（HS）を介して結合するロリジンＡ）の連続２倍希釈液を20mg／ml−40mg／mlのタンパク質濃度範囲でDMEM中に調製した。被験物質をマイクロ滴定ウエルに加え(100ml／ウエル）（二通り）、プレートをアルミ箔でくるんで、５％ CO2／95％空気で構成される湿潤空気中で37℃で24時間インキュベートした。
24時間後、培地を取り出し（吸引により）、新鮮なDMEMを加えて(100ml／ウエル）、細胞を戻してさらに一夜（即ち16−18時間）“回復期間”の間インキュベートした。“回復期間”終了時に、各ウエルに５mg／mlのMTT 溶液20mlを加えて細胞代謝活性を測定した。プレートを覆い、37℃で４時間インキュベート後、100ml／ウエルの10％ SDS／0.1N HClを加えることにより反応を起こした。16−１8 時間後に室温で暗青色可溶化ホルマザン反応生成物を生じ、 570nmの吸光度でELISA マイクロ滴定プレート読み取り装置を用いて定量した。
図５Ａは、in vitro試験の結果をグラフに示したものであり、この場合、BO54マーカー陽性平滑筋細胞を異なる濃度のRA−NR−AN−01（NRAN01−RA；図５Ａの白四角）又は遊離ロリジンＡ（遊離RA；図５Ａの中黒菱形）と一緒に24時間インキュベートし、洗浄して、さらに16−18時間、一夜（ｏ／ｎ）回復期間の間培養に戻した後に、MTT 検定で代謝活性を調べた。遊離RA及びRA−NR−AN−01の濃度は検定におけるロリジンＡの算出濃度（対数目盛りでプロットした、mg／ml）（即ち本検定におけるNR−AN−01タンパク質の総mg／mlではなく）として表わされ、したがって直接比較で可能である。MTT 検定における細胞の代謝活性は、細胞の対照未処理培養で測定される代謝活性のパーセンテージ（即ち％対照）として示される。
図５Ｂは、図５Ａに関して上記したものと同様の方法で実施したin vitro試験の結果をグラフに示したものであるが、この場合、３つの異なる細胞型、即ちBO54マーカー陽性平滑筋細胞（BO54−NRAN01−RA；図５Ｂの白四角）；HT29マーカー陰性対照細胞（HT29−NRAN01−RA；図５Ｂの中黒菱形）；及びＭ14マーカー陽性細胞（Ｍ14−NRAN01−RA；図５Ｂの中黒四角）に及ぼすRA−NR−AN−01（NRAN01−RA）のみの作用を比較する。図５Ａに関して上記されているように、本実験における濃度はμｇ／ロリジンＡ １mgに換算して表される。細胞の代謝活性は、図５Ａと同様の方法で、即ち細胞の未処理対照培養で測定される活性のパーセンテージ（即ち％対照）として表される。
図５Ａ及び図５Ｂに示した結果は、MTT 検定で測定した代謝活性が、遊離ロリジンＡあるいは２′又は13′RA−NR−AN−01抱合体において24時間インキュベーション後16−18時間目においてさえ、試験細胞の全集団で有意に減少したことを明示する。RA−NR−AN−01接合体の作用は、標的（BO54及びＭ14）及び非標的（HT29）細胞に対して非特異的阻害性であると思われる（図５Ａ及び５Ｂ）。阻害作用は、＞10ng／mlの遊離ロリジンＡ又はRA抱合体濃度で観察された。
比較のために、細胞に及ぼすシュードモナス属Pseudomonas 外毒素（PE）接合体の作用を同様のプロトコールで評価する二次試験を実施した。これらの試験に関しては、標的及び非標的細胞をPE又はPE−NR−AN−01で24時間処理後、MTT 検定で代謝活性を調べる前に“回復期間”（上記）を置いた。
図６Ａは、図５Ａに関して上記したものと同様の方法で実施したin vitro試験の結果をグラフに示したものであるが、この場合は、細胞に及ぼすPE−NR−AN−01（NRAN01−PE）（即ちRA−NR−AN−01ではなくて）の代謝作用を試験するよう意図した。３つの異なる細胞型、即ちBO54マーカー陽性平滑筋細胞（BO54；図６Ａの白四角）；HT29マーカー陰性対照細胞（HT29；図６Ａの中黒菱形）；及びＭ14マーカー陽性細胞（Ｍ14；図６Ａの中黒四角）を用いた。この試験では、接合体の濃度は、μｇ／ml NR−AN−01タンパク質（対数目盛りでプロット）で表し、代謝活性は未処理対照培養で測定されたMTT 活性のパーセンテージ（％対照）として表す。
図６Ｂは、図６Ａに関して上記した方法と同様の方法で実施したin vitro試験の結果をグラフに示したものであるが、この場合、遊離PEを用いて得られた効果（PE）とPE−NR−AN−01を用いて上記で得られた効果（即ち図６Ａ）とを比較するよう意図した。細胞、培養条件、算出法、及び結果の表示法は、上記図６Ａの場合と同様である。
図６Ａ及び図６Ｂに示した結果は、PE−NR−AN−01又は遊離ロリジンＡへの24時間曝露は、＞100 ng／mlの濃度では細胞に対して非特異的阻害性を示した。
この型の非特異的阻害は生物学的アテロエクトミーにとって有益であるかもしれないと考えられる一方、死滅した並びに死に瀕した細胞が平滑筋増殖を刺激する因子を放出する可能性がある血管形成術後の再狭窄の治療には望ましいとは思えなかった。
実施例５． 細胞活性に及ぼすパルス処理の効果
細胞に及ぼすロリジンＡ含有治療用抱合体への短時間、即ち５分間曝露の効果を評価するために別の試験を実施した。これらの試験では、代謝活性(MTT検定で測定）及び細胞タンパク質合成(3Ｈ−ロイシン取り込みにより測定）の両方を評価した。
５分間曝露後の効果：タンパク質合成
遊離ロリジンＡ（RA）又は治療用抱合体への５分間曝露の効果を評価した。２′位置（２′RA−HS−NR−AN−01）又は13′位置（13′RA−HS−NR−AN−01）でヘミスクシニル（HS）を介して結合するロリジンＡ−NR−AN−01を用いた（13′RA−HS−NR−AN−01の場合はさらに、ロリジンＡの２′位置をアセチル化した）。RA、２′又は13′RA−NR−AN−01抱合体を、 400ng／ml− 780pg／mlの濃度範囲の滅菌DMEM又はロリジンＡ中で２倍に希釈した（被験物質はすべてロリジンＡに対して標準化したので、匹敵する用量で効果を直接比較することができた）。試料を２通りのマイクロ滴定プレート中に 100ml／ウエルでアリコート化（２通り）して、室温で５分間インキュベートした。
マーカー陽性Ａ375 及びマーカー陰性HT29細胞に及ぼす被験物質の短時間及び長時間効果を測定した。短時間効果を試験するために、 100ml／ウエルの〔 3Ｈ〕−ロイシン（0.5mCi／ml）を抱合体（又はRA）の５分間処理直後に加え、タンパク質合成を４時間に亘って評価した。長時間効果を測定するためには、細胞を５分間処理し、洗浄後、培養に戻して、５％ NBS／５％Serum Plus・（即ちＡ375 又はHT29細胞用）か又は10％ FBS（即ちBO54細胞用）を含有するDMEM培地中で24時間“回復”期間を置いた。“回復”期間終了時に、インキュベーション培地を取り出して（吸引により）、 3Ｈ−ロイシンを加えた（上記と同様）。
いずれの場合も（即ち短時間でも長時間でも）、湿潤室（上記）中で37℃で４時間 3Ｈ−ロイシンを用いて細胞をインキュベートすることにより細胞のタンパク質合成を評価し、結果はすべて、非処理細胞（即ち 100％対照）と比較することにより算出した。４時間後、 3Ｈ−ロイシンを除去し、トリプシン処理により基質から細胞を取り出して、吸引（PHD（商標）細胞収穫装置（Cambridge Technology, Inc., Cambridge, MA)を用いて）し、ガラス繊維フィルター上で濾過して収集した。ガラス繊維フィルターを乾燥させて、Beckman 液体シンチレーションカウンターでの液体シンチレーション分光測定により放射能を定量した。
図７Ａは、in vitro試験の結果をグラフに示したものであり、この試験は、異なる濃度のロリジンＡ（遊離RA；図７Ａの白四角）、又は２′RA−NR−AN−01（２′RA−NRAN01；図７Ａの中黒四角）、又は13′RA−NR−AN−01（13′RA−NRAN01；図７Ａの中黒三角）接合体への５分間曝露の対照HT29マーカー陰性細胞に及ぼす効果を調べるために実施した。遊離RA、２′RA−NR−AN−01又は13′NR−AN−01の濃度は本検定におけるロリジンＡの算出濃度（対数目盛りでプロット、mg／ml）（即ちNR−AN−01タンパク質の総mg／mlというよりは）として表わされ、したがって結果の直接比較が可能である。これらの試験のために、細胞を５分間処理し、洗浄した後、４時間培養に戻し、この間培養培地に0.5mCi／mlの 3Ｈ−ロイシンを加えることにより細胞タンパク質合成を評価した。４時間終了時に、細胞タンパク質を収集して、放射能を測定した。結果は、対照（非処理）HT29細胞培養で記録された放射能のパーセンテージ（即ち％対照）として表される。
図７Ｂは、図７Ａに関して上記したように、異なる濃度の遊離RA（図７Ｂの白四角）、２′RA−NRAN01（図７Ｂの中黒四角）、又は13′RA−NRAN01（図７Ｂの中黒三角）への５分間曝露の対照HT29マーカー陰性細胞に及ぼす効果を調べるために実施したin vitro試験の結果をグラフに示したものであるが、本実験では、細胞を16−18時間回復期間（即ち一夜；ｏ／ｎ）インキュベートした後に４時間 3Ｈ−ロイシンタンパク質合成検定でタンパク質合成を調べた。結果は図７Ａに上記されているのと同様の方法で示す。
図７Ａ及び図７Ｂに示した結果は、HT29対照細胞によるタンパク質合成に及ぼすそれぞれRA、２′RA−HS−NR−AN−01及び13′RA−HS−NR−AN−01の短時間及び長時間効果を明示する。結果は、HT29細胞においては、RA−NR−AN−01によらずに、５分間インキュベーション中にRAにより引き起こされる阻害は16−18時間回復期間後も依然として明らかであった（図７Ｂ）。これに対比して、２′RA−HS−NR−AN−01又は13′RA−HS−NR−AN−01による非標的HT29細胞の処理は、タンパク質合成の検出可能な阻害を引き起こさなかった。したがって、これらの結果は（24時間に亘って上記で得られた結果ものに対比して）、処理が５分間“パルス”で加えられた場合には、NR−AN−01−接合体のin vitro作用に対する驚くほどの特異性を示唆すると思われる。しかしながら、NR−AN−01−抱合体が不活性である可能性もあり、そこでさらなる実験を実施して標的細胞に及ぼす接合体の効果を評価した。
図７Ｃは、図７Ａに関して上記したように、異なる濃度の遊離RA（図７Ｃの白四角）、２′RA−NRAN01（図７Ｃの中黒四角）、又は13′RA−NRAN01（図７Ｃの中黒三角）への５分間曝露のＡ375 ｍ／ｍマーカー陽性細胞に及ぼす効果を調べるin vitro試験の結果をグラフに示す。本実験では、Ａ375 細胞を被験物質中で５分間インキュベートし、洗浄して、培地に0.5mCi／ml 3Ｈ−ロイシンを加えることにより、次の４時間のタンパク質合成を調べた。結果は図７Ａに上記されているのと同様の方法でプロットする。
図７Ｄは、図７Ｂに関して上記したように、異なる濃度の遊離RA（図７Ｄの白四角）、２′RA−NRAN01（図７Ｄの中黒四角）、又は13′RA−NRAN01（図７Ｄの中黒三角）への５分間曝露のＡ375 ｍ／ｍマーカー陽性細胞に及ぼす効果を調べるin vitro試験の結果をグラフに示す。本実験では、Ａ375 細胞を被験物質中で５分間インキュベートし、洗浄して、16−18時間回復期間の間培養に戻して、その後タンパク質合成を４時間 3Ｈ−ロイシンタンパク質合成検定中に調べた。実験の結果は図７Ａに上記されているのと同様の方法でプロットする。
図７Ｃ及び図７Ｄに示した結果は、Ａ375 標的細胞によるタンパク質合成に及ぼすそれぞれRA、２′RA−HS−NR−AN−01及び13′RA−HS−NR−AN−01の短時間及び長時間効果を明示する。２′又は13′RA−NR−AN−01治療用接合体による標的細胞の処理は、タンパク質合成の短時間（即ち５分間パルス処理直後に観察された）阻害を引き起こした（図７Ｃ）。これらの所見は、上記の図７Ａ及び図７Ｂにおける所見と結びつけた場合には、RA−NR−AN−01−接合体が活性であり、それらは非標的細胞ではなく、標的細胞に対して特異的に阻害性であったことを示唆する。
面白いことに、“パルス”処理標的細胞を培養に戻した場合、長時間阻害効果は全く観察されなかった（図７Ｄ）。図７Ｃ及び図７Ｄに示した結果さらに、ロリジンＡが試験細胞に対して非特異的に阻害性を有し（即ち上記図７Ａ及び図７Ｂと同様の方法で）、細胞に及ぼすその効力は16−18時間回復期間後でさえ明らかであることを明示する。したがって、“パルス”処理中の標的細胞に及ぼすRA−NR−AN−01接合体の特異的効果は、NR−AN−01結合タンパク質の一特性であると思われる。
BO54動脈平滑筋細胞に関して得られた結果は、上記のＡ375 細胞に関して得られたものと同様であった。即ち、遊離ロリジンＡは短時間出は 200ng／ml， 100ng／ml及び50ng／mlで対照の60％、66％及び90％のタンパク質合成の用量−反応阻害を示し、長時間では、タンパク質合成に及ぼす効果は同一用量で対照の27％，46％及び98％であった。これに対比して、２′又は13′RA−NR−AN−01はタンパク質合成に及ぼす短時間又は長時間効果に関しては10−20％阻害（即ち対照の＞80％）しか示さなかった。
したがって、結果は“パルス”療法として施された場合の標的細胞に及ぼすロリジンＡ−接合化NR−AN−01の短時間特異的可逆的効果を示す。しかしながら、これらの実験ではタンパク質合成のみを評価したため、細胞代謝活性が“パルス”処理の結果として細胞中で作用を及ぼしうる可能性があった。したがって、“パルス”処理後に細胞代謝活性を評価する別の試験を実施した。
５分間曝露後の効果：代謝活性
RA又はRA−NR−AN−01抱合体への標的及び非標的細胞の５分間曝露後48時間目にMTT 検定を実施した。これらの試験における標的細胞としてはBO54及びＡ375 が挙げられ、非標的細胞としてはHT29細胞が挙げられる。滅菌96ウエルマイクロ滴定プレートに2500細胞／ウエルで接種して、アルミ箔でくるんで、５％ CO2／95％空気を含有する湿潤室中で16−18時間インキュベートした。ロリジンＡ（RA）、２′RA−HS−NR−AN−01及び13′RA HS−NR−AN−01の 400ng／mlから 780pg／mlまでの連続２倍希釈液を調製し、希釈液の 100mlアリコートを二通りのウエル中に分散させた。
被験試料に５分間曝露後、細胞を洗浄して被験物質を取り出し、新鮮な培地を加えた。細胞を48時間の回復期間を置いた後に試験した。即ちプレートを48時間インキュベートし、次に20ml／ウエルの５mg／ml MTT溶液を加えることにより、細胞代謝活性を測定した。プレートを覆い、37℃で４時間インキュベートし、次いで上記のように反応を起こさせた（上記の実施例４参照）。暗青色可溶化ホルマザン反応生成物を16−18時間インキュベーション後に室温で生じさせた。 570nmの吸光度でELISA マイクロ滴定プレート読み取り装置を用いて試料を定量した。
図８Ａは、in vitro試験の結果をグラフに示したものであり、この試験は、異なる濃度のロリジンＡ（図８Ａの白四角）、２′RA−NR−AN−01（NRAN01−２′RA；図８Ａの中黒菱形）、又は13′RA−NR−AN−01（NRAN01−13′RA；図８Ａの中黒四角）への５分間曝露のBO54マーカー陽性平滑筋細胞に及ぼす効果を調べるために実施した。実験は図７Ｂに関して上気したのと同様の方法で実施したが、しかし代謝活性は、図７Ｂの場合のようなタンパク質合成ではなくMTT 検定により検定し、細胞を48時間（図７Ｂの場合のような24時間ではなく）回復させた。図７Ａに関して記載（上記）されたと同様の方法で実験結果をプロット化した。
図８Ｂは、異なる濃度のロリジンＡ（図８Ｂの白四角）、２′RA−NR−AN−01（NRAN01−２′RA；図８Ｂの中黒菱形）、又は13′RA−NR−AN−01（NRAN01−13′RA；図８Ｂの中黒四角）への５分間曝露のＡ375 ｍ／ｍマーカー陽性細胞に及ぼす効果を調べるために実施したin vitro試験の結果をグラフに示したものである。本実験は、図８Ａに関して上記したものと同様の方法で実施した（そして結果をプロット化した）。
図８Ｃは、異なる濃度のロリジンＡ（図８Ｃの白四角）、２′RA NR−AN−01（NRAN01−２′RA；図８Ｃの中黒菱形）、又は13′RA−NR−AN−01（NRAN01−13′RA；図８Ｃの中黒四角）への５分間曝露のHT29マーカー陰性細胞に及ぼす効果を調べるために実施したin vitro試験の結果をグラフに示したものである。本実験は、図８Ａに関して上記したものと同様の方法で実施した（そして結果をプロット化した）。
図８Ａ−８Ｃに示した結果は、最高用量での異なるRA−NR−AN−01接合体間のわずかな差を示すが、しかし低用量では、２′及び13′RA−NR−AN−01は長時間（即ち48時間）標的細胞（即ちBO54及びＡ375)又は非標的細胞（即ちHT29）代謝活性を有意に阻害しなかった。したがって結果は標的細胞タンパク質合成の短時間阻害（上記図７Ｃ−７Ｄ）はMTT 検定で測定されるように細胞に長時間代謝効果を引き起こさないことを示唆する。これらの検定が５分間曝露に起因する細胞の代謝変化を検出できたということは、遊離ロリジンＡを用いて得られた結果により立証される。この場合、遊離ロリジンＡは、細胞を５分間だけ薬剤に曝露したのちに48時間回復期間の間培養に戻した場合でさえ、標的及び非標的細胞型に対して非特異的阻害性を示した（図８Ａ−８Ｃ）。
したがって、遊離ロリジンＡに関する所見は、MTT 検定が５分間曝露中に引き起こされた代謝変化を検出出来たことを示唆する。これらの所見を合わせて考えると、“パルス”処理で投与した場合はRA−NR−AN−01接合体は標的細胞活性（即ちタンパク質合成）を特異的に阻害しうる、そしてこれらの効果は可逆的でタンパク質合成又は細胞代謝活性に及ぼす有意の長時間効果を伴わない(MTT検定で測定されるように）ことが示唆される。RA−NR−AN−01抱合体のこれらのin vitro特性は、in vivo 平滑筋細胞活性の阻害に非常に有用であると判断された。したがって次に動物モデル試験を実施してin vivo のこれらの治療用接合体の効果を評価した。
実施例６． 動物モデルにおける注入条件の確定
本発明の治療用接合体は外傷又は疾病後の狭窄を阻止するのに有用である。実例では、血管形成術を実施するために用いたカテーテルを除去し、血管中にバルーン注入カテーテルを挿入することにより、血管形成術中に引き起こされる血管性外傷を外科手術中に処置する。注入カテーテルを血管の外傷領域に点滴注入口（あるいは浸透膜領域）を付けて配置し、圧力を掛けて治療用接合体を導入する。例えば、２個のバルーン付き注入カテーテルを用いて、１個のバルーンを外傷部位のどちらかの側で膨らませて、治療用接合体を含有する適切な注入液が充填され得る液体間隙を作る。
300mmHg の圧力で45秒間イヌ又はヒト冠動脈にセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP）マーカー酵素を注入すると血管壁中にHRP が浸透するということが過去に報告されている（６）。しかしながら、HRP はNR−AN−01より小さい分子であり、ヒト及びイヌ冠動脈も本家畜ブタモデル系における頸動脈又は大腿動脈よりかなり小さい。したがって、家畜ブタモデル系において、頸動脈及び大腿動脈の血管平滑筋さあ簿屁の治療用抱合体の供給に適した注入条件を確定するための実験を実施した。血管壁中への治療用接合体の浸透、及び治療用接合体と血管壁の血管平滑筋細胞との特異的結合を評価することにより供給条件をモニタリングした。
注入カテーテルを用いて、家畜ブタ又は非ヒト霊長類の冠動脈及び大腿動脈に 0.4気圧（300mmHg)−３気圧の範囲の多数の圧力で45秒間−３分間NR−AN−01を注入した。注入後、血管に滅菌食塩水をどっと流して、血管壁中のNR−AN−01マウスIgG を検出するためにHRP 抱合ヤギ抗マウスIgG を用いて免疫組織化学用に調製した。３分後に３気圧の圧力でこれらの血管壁中へのNR−AN−01の完全浸透が達成されることが確定された。
さらに免疫組織学を用いて、動物モデル系がNR−AN−01に対する標的抗原を発現することを確定した。容易に入手出来る実験動物種からの血管組織切片をNR−AN−01に曝露し、洗浄して、HRP 抱合ヤギ抗マウスIgG と反応させた。非ヒト霊長類及びブタのみはヒトと250kD NR−AN−01標的抗原を共有することが判明した。
NR−AN−01が特異的方法でその標的抗原とin vivo に結合し得るか否かを調べるために、注入カテーテルを用いて家畜ブタの冠動脈及び大腿動脈に治療用抱合体を注入し、注入部位を滅菌食塩水で洗い流して、次に手術部位を閉じて、動物をさらに３−５日間保持した。この期間の終了時に、血管注入部位を切り開き、再びヤギ抗マウスIgG を用いて免疫組織学用に調製してNR−AN−01を同定した。NR−AN−01は、手術後３−５日目にブタ冠動脈及び大腿動脈の血管壁中で同定され、血管平滑筋細胞とだけ会合すると考えられた。これらの所見は、NR−AN−01がin vivo でその標的抗原と特異的に結合し得ることを示唆する。
実施例７． in vivo の血管平滑筋細胞の阻害
バルーンカテーテル誘発性外傷に派生する血管内膜平滑筋増殖は、血管形成術後の再狭窄を含めた血管性外傷によるin vivo の平滑筋細胞活性の阻害に対する接合体の治療効力を評価するための良いモデルである。家畜ブタを用いてNR−AN−01（即ち血管平滑筋結合タンパク質又はこれらの試験においては単にVSMBP と呼ぶ；そしてロリジンＡを伴う治療用接合体をVSMBP −RAと呼ぶ）の効果を試験した。一般にブタ動脈におけるバルーン血管形成術に派生する出来事は以前に記載されている（12）。これらの試験では、特大バルーン（およそ 1.5：１のバルーン：動脈比）を用いた頸動脈の拡張は、長さ 1.5−２センチの領域の完全内皮裸出を引き起こした。
血栓を最小にしようとしてこの長さの外傷性損傷を選択したが、しかし依然として顕著な血小板沈着及び血栓形成が認められた。本手法はさらに、内弾性膜を通って動脈中膜への切開並びに中膜平滑筋細胞の壊死を引き起こした。平滑筋増殖による内膜肥厚は損傷後７日目に現れ、14日目に85mmの平均最大厚に達した。この新生内膜はヒト再狭窄の増殖性新生内膜組織に非常によく似ている（13）。
NR−AN−01−ロリジンＡ接合体を用いて家畜ブタで一回投与試験プロトコールを実施した。カテーテルを介して一時的スリップ結紮により局限される外傷化血管の領域中への被験接合体の局所投与を意図して、標的平滑筋細胞に高レベル曝露を提供する一方で全身性毒性を低減した。動物モデルにおける投与のこの動脈内経路はヒト冠動脈で提唱される経路をシミュレートする。試験プロトコールは、小動脈内、部位特異的、カテーテル投与性、血管平滑筋結合タンパク質(VSMBP) 接合体の初期in vivo スクリーニングとして意図した。さらに小動脈平滑筋細胞に及ぼす病理生物学的作用に関して、遊離薬剤の毒性を評価した。実施例７に記載されているように、ロリジンＡ−NR−AN−01抱合体の治療的有効用量をin vitro試験で確定し、遊離MAb 及びMAb 抱合体を動物に投与することにより適切な小動脈内投与圧力を調べた。
乳離れしたばかりの体重約30ポンドの肥育用ブタである６頭の家畜雑種ブタ（Duroc X)を実験に用いた。動物を無作為に以下の処理レジメンに割り当てたが、この場合、各ブタは右及び左の頸及び大腿動脈で分けられた４つの異なる処置を受け、このうち１つはPBS 対照である（下表１−５）。
外科的手法：
被験接合体及び対照化合物を１回動脈内注入として、バルーンカテーテルにより引き起こされた内皮裸出及び外傷部位に投与した。わずかに抵抗を生じるように食塩水で十分に膨張させたサイズ３（大腿）及びサイズ４（頸）Uresil Vascu-Flo・シリコーン閉塞バルーンカテーテル（Uresil Technology Center, Skokie, 11) を管内を23cmの長さ通過させて内皮を１−２cmに亘って剥離させた。この技法により動脈がわずかに膨張した。この処理後、近位及び遠位スリップ結紮（３−０ 絹糸）を剥離領域末端近くに施して、Inflation Pro ・（USCI, C. R. Bard, Inc., Billerica, MA)圧力注射器に取り付けたサイズ８のFrench, Infant Feeding Catheter (Cutter Resiflex, Berkeley, CA) を用いて被験接合体及び対照化合物を３気圧で３分間、裸出セグメントに直接投与した。
３分間曝露期間後にスリップ結紮を取り外して、動脈血流が再び流れるようにした。これらの試験では、処理領域で加圧注入を達成する必要がある場合には、大腿又は頸動脈の枝を00絹縫合糸で結紮した。大腿動脈の最大遠位枝（伏在動脈）を切開して、カテーテル用入口部位として用いて、その後カテーテルを主大腿動脈中に通した。主大腿動脈でのこのカテーテル処理操作後、二次枝を結紮した。これらの場合、結紮及び切開を施してカテーテルを中に入れ、その後開口部を５−０モノシラメンポリプテステル（Novafil, D & G Monofil Inc., Monati, PR)で３−４針縫合して閉じた。
追跡調査法：
手術後、ブタは隔離及び手術回復期間中は３×５フィートのセメント床室内囲い場内で飼育した。その後、５週間治癒期間の残りを過ごさせるために動物を室内／室外囲いに移した後に、組織学的検査用組織を収集した。
動物は手術から正常に回復し、手術部位の出血又は炎症は認められなかった。処理後５−６日目に、ドップラー聴診器で６頭すべてを検査し、各動物の全動脈を開存させた。処理後、全動物が正常な食欲、活動性及び体重増加を示した。
肉眼的病理学及び組織学的評価：
動脈の外傷化及び処理後５週目に、筋注により体重30ポンド当たり 0.6mlのテラゾール Telazol・（塩酸チレタミン；A. H. Robins Co., Richmond, VA) 及び 0.5mlのキシラジン (Lloyd Laboratories, Shenandoah, IA) で鎮静させて、ヘパリンを加え（ナトリウムヘパリン２mlを静注、1000単位／ml) 、静注ペントバルビタールにより安楽死させた。左右の頸及び大腿動脈を、処理セグメントに近位及び遠位のものが含まれる正常血管とともに取り出した。動脈を測定し、結紮及び肉眼的異常の位置に留意した。動脈を２mm間隔で横断し、O.C.T （最適切断温度) 化合物 (Tissue Tek・, Miles Laboratories Inc., Elkhart, IN) 付クリオモルドに順に並べ、液体窒素中で凍結させた。形態学的試験用に、ブロックを５μに切断して、Ｈ＆Ｅ、マッソントリクローム Massons Trichrome及びモパトペンタクローム Movats Pentachrome で染色した。切片はさらに血管平滑筋の免疫組織学的染色に用いた。
動脈の段階切片の組織学的検査から、外傷を施し、RA−NR−AN−01接合体処理した領域における内膜平滑筋増殖の顕著な阻害が明示された（表２）。血管の亜肉眼的評価でさえも、この阻害は明らかであった。内膜平滑筋細胞増殖の阻害には、血管壁の平滑筋細胞死の組織学的証拠は最小度に認められるか、あるいは全く認められなかった。このような外傷化動脈の横断面を図９Ａ及び９Ｂに示す。
図９Ａに示した結果は、血管形成術後５週間目の未処理動脈の横断面（倍率 160倍) を示す。動脈の主な組織学的特徴としては、内弾性膜（図９Ａの＃２）から離れて内皮（図９Ａの＃１）が転位しているのが挙げられるが、これは明らかに内膜平滑筋増殖（図９Ａの＃３）に依るものである。
図９Ｂに示した結果は、血管形成術及びRA−NR−AN−01治療用抱合体注入後５週間目の処理動脈の横断面（倍率 160倍) を示す。この切片の血管には図９Ａに示した血管よりも大きな機械的ストレスを加えたが、多数の部位で外弾性膜が破裂し、中膜外層にそれに関連した平滑筋細胞の増殖が観察された（図９Ｂの＃４）。治療用抱合体で処理すると内膜肥厚阻害され、これは内弾性膜（図９Ｂの＃２）から内皮（図９Ｂの＃１）が転位していないことで立証される。意外にも、平滑筋細胞に及ぼすこの阻害効果は、外弾性膜（図９Ｂの＃４）が破裂した領域の中膜平滑筋細胞の肥厚を伴わずに達成された。
これは非常に幸運な結果であって、というのも傷の治療が内膜肥厚及び再狭窄、又は中膜の平滑筋細胞の壊死といった悪い結果を伴わずに処理血管中で進行するからである。
これらの組織学的試験においてさらに２′及び13′−ロリジンＡ抱合体の有効性を比較した結果、13′抱合体（即ち13′RA−HS−NR−AN−01）は平滑筋細胞の内膜肥厚を阻止するに際して２′抱合体（即ち２′RA−HS NR−AN−01）よりも活性であると考えられるという所見を得た。この試験においては、13′抱合体の低圧注入は高圧よりも有効に平滑筋増殖を阻害し、そして13′抱合体はさらに２′接合体よりも有効であると思われた。
図９Ｂにおいて、血管形成術後の部位に治療用抱合体を投与すると、未処理血管の管腔を狭くする平滑筋肥厚の約95％阻害を生じた（図９Ａ）。有意に、治療用抱合体は平滑筋細胞に及ぼすその効力を発揮して中膜平滑筋層から内膜中に移動し、内皮に影響を及ばさずあるいは動脈壁の中膜層の平滑筋細胞の壊死（即ち細胞死）のいかなる徴候も生じなかった。試験はさらに、血管壁に及ぼす毒性作用に起因するような単核球浸潤又は繊維症のいかなる組織学的徴候も示さなかった。さらに処理血管の内膜層に治癒の明らかな徴候が観察され、内皮の再生長が観察され、つまり内皮細胞が内皮と内弾性膜（図９Ｂの＃１及び＃２）との間にある内膜中の平滑筋の薄層全体を覆って増殖した。これらの組織学的観察を合わせると、血管の内膜層における平滑筋過形成を阻止する治療用抱合体による処理後の傷治癒、内皮の再生長及び血管強度の改良についての非常に望ましい特徴が示唆される。
実施例８． 血管平滑筋細胞in vitro DNA及びタンパク質合成阻害
血管平滑筋細胞におけるDNA 合成及びタンパク質合成を阻害する種々の治療薬の能力を調べた。 3Ｈ−ロイシン及び 3Ｈ−チミジン取り込み並びに細胞毒性検定を以下のプロトコールに従って実施した。
５分間曝露； 3 Ｈ−ロイシン取込み：
40,000細胞／mlの血管平滑筋細胞を滅菌24ウエルプレート中に１ml／ウエルで植え付けた。湿潤大気（飽和）中に５％ CO2，95％空気で37度Ｃでプレートを一夜インキュベートした。問題の治療薬の対数希釈液を５分間又は24時間、血管平滑筋細胞とともにインキュベートした。治療薬の試料を、５％ウシ胎児血清（FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD) 及び５％血清プラスSerum Plus・ (JRH Biosciences, Lenexa, KS)を含有するDMEM：Ｆ−12培地中で希釈した。
治療薬インキュベーション後、溶液を吸引し、５％血清プラスSerum Plus（商標）を含有するロイシン無含有DMEM (Dulbeccoの修正イーグル培地）に溶解した 0.5マイクロキュリー／mlの 3Ｈ−ロイシン１ml／ウエルを加えた。湿潤大気中５％ CO2で37℃で一夜、プレートを再インキュベートした。スコアリング尺度を用いる倒立顕微鏡を用いて細胞を視覚的に等級分けして、生存度及び細胞数を確定した。等級１−３は、対照ウエルと比較した細胞の生存度及び数のパーセントを基礎にし、３＝ 100％、２＝70％− 100％及び１＝０％−70％であった。このスコアリングの記録は治療薬の直接細胞毒作用を確定するのに手助けとなった。次に培地を吸引し、細胞を冷５％TCA で２回洗浄した。
ウエル当たり 400μl の 0.2M NaOHを加え、プレートを回転操作台上で室温で２時間インキュベートした。 200μl ／ウエルの細胞溶液をプラスチック製シンチレーションバイアル (Bio-Rad Laboratories) 中に移して、４mlのBio-Safe（商標）II液体シンチレーション液 (Research Products InterCorp., Mount Prospect, IL) を加えたのちに攪拌した。Lotus １−２−３（商標）ファイルへの変換及びLotus １−２−３（商標）を用いた分析のためにBeckman “Data Capture"ソフトウェアとインターフェースで接続するBeckman LS2800液体シンチレーション計数計でバイアルを計数した。
５分間曝露； 3 Ｈ−チミジン取込み：
血管平滑筋細胞を滅菌24ウエルプレート中の湿潤５％CO2 環境で37℃で一夜、５％FBS (Gibco) を含む完全培地中でインキュベートした。培地をウエルから吸引し、成長因子 (DMEM：インシュリン（５μｇ／ml) 、トランスフェリン（５μg/ml) 及びナトリウムセレナイト（５ng／ml)(SigmaChemical, St. Louis, Missouriから購入) を含有する成長因子カクテル（カタログ番号・1884) を補充したＦ−12基礎培地) を補充した血清無含有培地を加えた。細胞をこの培地中で24時間インキュベートした。５分間治療薬曝露のために、治療薬の対数希釈液を細胞とともに完全培地中でインキュベートした。
５分後に培地を吸引した後、完全培地中に分散された 1.0マイクロキュリー／mlの 3Ｈ−チミジン１ml／ウエルを加えた。24時間曝露には完全培地中に分散された 1.0マイクロキュリー／mlの 3Ｈ−チミジン１ml／ウエルとともに細胞をインキュベーションとすることが含まれており、治療薬の対数希釈液を試験した。両曝露試験においては、次に細胞を湿潤５％ CO2環境で37℃で一夜インキュベートした。細胞を生存度及び細胞数に関して視覚的に評価した。細胞を洗浄し、 3Ｈ−ロイシンプロトコールに関して記載したようにプラスチック製シンチレーションバイアルに移すために調製した。Lotus １−２−３（商標）ファイルへの変換及びLotus １−２−３（商標）を用いた分析のためにBeckman “Data Capture"ソフトウェアとインターフェースで接続するBeckmanLS 2800液体シンチレーション計数計でバイアルを計数した。
これらのプロトコールは、他の標的細胞集団、特に付着性単層細胞型にも用い得る。
形態学的細胞毒性評価−パルス曝露：
血管平滑筋細胞を 4.0×104 細胞／培地１ml／ウエルで、市販の４ウエルスライド（Nunc, Inc., Naperville, lllinois) 上に植え付けた。２つのパルス曝露長（５分間及び24時間）に十分なスライドに植え付けされ、増分評価点（24時間及び 128時間) が規定された。スライドは全て２通り試験してあらゆる検定異常を明示した。 3Ｈ−ロイシン及び 3Ｈ−チミジン検定に用いたのと同じ培地中に本治療薬を希釈した。各４ウエルスライドは、上記の 3Ｈ−ロイシン及び 3Ｈ−チミジン検定により確定されたように、最小有効濃度（ウエル“Ｃ”）より高い一対数濃度（ウエル“Ｂ”）、より低い一対数濃度（ウエル“Ｄ”）に一まとめにした濃度であった。正常形態に関する対照として、あるウエル（ウエル“Ａ”）を未処理（培地のみ）のままにした。
インキュベーションは、37℃，５％ CO2湿潤インキュベター中で実施した。各２（５分間及び24時間) 曝露点後、治療薬培地を各ウエル（未処理ウエルを含む）から吸引した。次いで新鮮な培地１mlを加えて吸引培地と取り換えた。各増分評価点に届くまで、再インキュベーションを続けた。これらの時点で、培地を吸引して、次いで10％中性緩衝ホルマリン１mlに取り換えて１時間置いて、適正に固定させた。これらの固定スライドをヘマトキシリン（核）及びエオシン（細胞質）で染色して、形態学的評価及び等級分けをおこなった。
結果：
24時間 3Ｈ−ロイシンタンパク質阻害検定及び24時間 3Ｈ−チミジンDNA 合成阻害検定の結果を、スラミン、スタウロスポリン、ニトログリセリン及びサイトカラシンＢに関してそれぞれ図10Ａ−10Ｄに示す。被験化合物はすべて、利用可能な治療範囲（ 3Ｈ−ロイシン検定の曲線下の面積は 3Ｈ−チミジン検定のものより大きい）を明示し、このことは本発明の持続性放出投与形態態様の実施に際して有用であることを示す。さらに、本化合物は血管平滑筋細胞のタンパク質合成を阻害するよりも大きく５％ FBSの存在下でDNA 合成を行う血管平滑筋細胞の能力を阻害した。５分間及び24時間パルス曝露中のスラミン、スタウロスポリン、ニトログリセリン及びサイトカラシンＢのタンパク質及びDNA 合成阻害効果を、図10Ａ−Ｄにそれぞれ示す。
実施例９． 血管平滑筋細胞による標的化粒子の特異的結合及びインターナリゼーション
結合タンパク質又はペプチドで被覆された粒子を結合し、インターナライズする血管平滑筋細胞の能力を、モノクローナル抗体（NR−AN−01）被覆金ビーズを用いてin vitro及びin vivo の両方で立証した。血管平滑筋細胞組織培養（BO54) 、抗原陽性対照細胞株（Ａ375)及び抗原陰性対照細胞株（HT29) を10nmの金ビーズとともに、NR−AN−01で被覆した一群及び二次非被覆対照群を用いてインキュベートした。細胞を単層及び細胞懸濁培養としてビーズに曝露し、電子顕微鏡により結合及びインターナリゼーションに関して６つの時点（即ち１分、５分、15分、30分、60分及び24時間) で調べた。
表３〜表５は、細胞表面との結合が特異的であることを示す実験の結果を示す。表３〜表５で用いた相対的等級システムは、粒子結合の主観的評価を表し、０＝なし；１＝最小度；２＝軽度；３＝中等度；４＝顕著である。粒子の集合体が平滑筋細胞及び対照細胞の両方の単層表面上に積もった場合、粒子はマクロ及びミクロ食作用により非特異的にインターナライズされた。細胞を懸濁液中に保持した場合、非特異的インターナリゼーションは最小度であるか又は認められなかった。HT29細胞により産生された表面ムチンへのNR−AN−01を欠く金ビーズの非特異的付着が観察され、その適度の非特異的インターナリゼーションが生じた。NR−AN−01標的化金ビーズの血管平滑筋細胞取込みは、細胞懸濁培養において非常に特異的であった。
図11は、細胞にインターナライズされる過程でそのいくつかが抗体被覆金ビーズを含有する多数のエンドサイトーシス性小胞を特徴とする平滑筋細胞の内表面に平行な接線切片を示す。細胞表面抗原に付着する粒子を伴うこれらのエンドサイトーシス性小胞を刺激して、正常細胞表面膜再循環に関して予測されるよりも高い比率でリソソームと融合させた。インターナライズ粒子のその結果生じる顕著な蓄積が24時間時点で観察されたが、それを図12に示す。
標的化金ビーズ血管平滑筋細胞表面結合、インターナリゼーション及びリソソーム濃縮はin vivo でも同様に観察された。バルーン外傷直後にブタ大腿動脈の壁中に３気圧で３分間適用されるスリップ結紮で近位及び遠位で閉塞された処理領域により開放端化された血管内カテーテルを介してNR−AN−01被覆金ビーズを注入した。ビーズインターナリゼーション速度は、バルーン外傷中に血管平滑筋細胞が蒙る損傷の程度によって変化した。最小度の損傷を有するか又は全く損傷がない細胞はエンドサイトーシス及び食作用により粒子を迅速にインターナライズして、リソソーム中でインターナライズ粒子を濃縮した。外傷により殺された細胞は、表面ビース結合を示した。外傷による損傷は受けたが生き残った細胞は、インターナリゼーション及びリソソーム濃縮の遅延を伴うビーズ表面結合を特徴とした。図13は、ビーズ投与後１週間目のin vivo のリソソーム中の粒子濃縮を示す。
実施例10． スタウロスポリン及びサイトカラシンによる血管平滑筋in vitroDNA 及びタンパク質合成阻害
血管平滑筋細胞におけるin vitro DNA及びタンパク質合成を阻害するスタウロスポリン及びサイトカラシンの能力を試験した。以下のプロトコールに従って、 3Ｈ−ロイシン及び 3Ｈ−チミジン取込み並びに細胞毒性検定を実施した。
培養化細胞：
大動脈ヒヒ平滑筋細胞の外植片からBO54細胞（ヒヒ平滑筋細胞）を得た。細胞を５％ウシ胎児血清（FBS, Gibco）及び５％ Serum Plus （商標）(JRH Biologicals)を含有するDMEM (Dulbeccoの修正イーグル培地）：Ｆ−12培地（Whittaker Bioproducts, Walkersville, Maryland)（“完全培地”）中に広げて、細胞の種一組を液体窒素中で凍結して継代７回での将来の使用に備えた。
５分間曝露；タンパク質合成検定：
血管平滑筋細胞を40,000−50,000細胞／mlで植え付けて、実施例８の“５分間曝露； 3Ｈ−ロイシン取込み”に記載されているように処理した。スタウロスポリンの対数希釈液(200ng／ml，20ng／ml，２ng／ml， 0.2ng／ml及び0.02ng／ml）を完全培地中に分散させた。サイトカラシンＢに関しては、20ng／ml，２ng／ml， 0.2ng／ml，0.02ng／ml及び 0.002ng／mlの対数希釈液を完全培地中に分散させた。次に完全培地を対照ウエルに加えた。１ml／ウエルの各治療薬希釈液を４通りのウエルに加え、問題の薬剤を血管平滑筋細胞とともに滅菌通風口付集風器中で室温で５分間インキュベートした。治療薬インキュベーション後、ウエルを実施例８の“５分間曝露； 3Ｈ−ロイシン取込み”に記載されているように処理した。
５分間曝露；DNA 合成検定：
血管平滑筋（BO54）細胞を植え付けて、上記の“５分間曝露；タンパク質合成検定”に記載されているように処理した。被験治療薬で５分間インキュベーション後、培地を吸引して、完全培地に分散させた１ml／ウエルの 1.0μCi／ml 3Ｈ−チミジン（ 3Ｈ−ロイシンでなく）を加えた。次に湿潤５％ CO2環境で37℃で一夜、細胞をインキュベートした。次いで、上記のタンパク質合成検定に記載されているように、治療薬の毒性効力を確定した。
24及び 120時間曝露；タンパク質合成検定：
血管平滑筋（BO54）細胞を20,000細胞／mlで滅菌24ウエルプレートに植え付けて、湿潤大気（飽和）中５％ CO2，95％空気で37℃で一夜、完全培地（１ml／ウエル）中でインキュベートした。スタウロスポリンの対数希釈液(100ng／ml，10ng／ml，１ng／ml， 0.1ng／ml及び0.01ng／ml）を、次いで下記のように２つの培地中に分散させた。サイトカラシンＢに関しては、10ng／ml，１ng／ml， 0.1ng／ml，0.01ng／ml及び 0.001ng／mlの対数希釈液を下記のように２つの培地中に分散させた：
培地（１）−完全培地；及び
培地（２）−DMEM（ロイシン無含有）。 0.5μCi／mlの 3Ｈ−ロイシンを含む。培地（２）は、実験の最終24時間インキュベーション期間に用いる。
さらに、24時間検定において、各治療薬を上記のように培地（２）中で希釈した。ウエルから培地（１）を吸引し、培地（２）中の治療薬希釈液のアリコートを適切なウエルに４通りに加えた。次いで培地（２）を対照ウエルに加えた。
120時間検定では、上記のように各治療薬を培地（１）に希釈した。培地（１）をウエルから吸引し、培地（１）中の治療薬希釈液のアリコートを適切なウエルに４通りに加えた。次いで培地（１）を対照ウエルに加えた。培地を24時間毎に取り換えて、新鮮な治療薬を被験ウエルに加えた。96時間目（即ち４日目）に、上記のように、各治療薬を培地（２）で希釈した。培地（１）をウエルから吸引し、培地（２）中の治療薬希釈液のアリコートを適切なウエルに４通りに加えた。次いで培地（２）を対照ウエルに加えた。
3Ｈ−ロイシン（及び対照）中の被験薬剤を湿潤大気中５％ CO2で37度Ｃで一夜インキュベートした。次いで上記の５分間曝露；タンパク質合成検定に記載されているように、治療薬の毒性効力を測定した。さらに、各希釈での細胞の変化をツアイス Zeiss顕微鏡（Zeiss, West Germany)を用いて 320倍で写真撮影した。次に培地を吸引して、上記のように細胞をTCA で処理した。
24及び 120時間曝露；DNA 合成検定：
“24及び 120時間曝露；タンパク質合成検定”に関して記載された手順にしたがって本発明を実施したが、但し本24及び 120時間DNA 合成検定における培地（２）は：
培地（２）＝完全培地。 1.0μCi／mlの 3Ｈ−チミジンを含む。
培地（２）は、実験の最終24時間インキュベーション期間に用いる。
これらのタンパク質及びDNA 合成検定は、他の標的細胞集団、特に付着性単層細胞型にも用いうる。
結果：
培地のみで処理した対照のパーセンテージとして、各薬剤の最小有効用量(MED）を確定した；対照の50％値を細胞毒性基準として選択した。５分間曝露で、スタウロスポリンはタンパク質合成検定では 100ng／ml、DNA 検定では１ng／mlのMED を立証した。スタウロスポリンに関する24時間MED はタンパク質合成検定では10ng／ml、DNA 合成検定では１ng／mlであった。両検定は、スタウロスポリンの 120時間曝露に関しては１ng／mlのMED を示した。
５分間曝露で、サイトカラシンＢはタンパク質合成検定ではDNA 検定と同じく10ng／mlのMED を立証した。サイトカラシンに関する24時間MED はタンパク質合成検定では 1.0ng／ml、DNA 合成検定では 0.1ng／mlであった。両検定は、スタウロスポリンの 120時間曝露に関しては約 0.1ng／mlのMED を示した。
上記のサイトカラシンＢに記載されたと同じ希釈液を用いて、サイトカラシンＣ及びサイトカラシンＤ治療薬を24時間及び48時間曝露で試験した。24時間で、サイトカラシンＣはタンパク質合成検定では 1.0ng／ml、DNA 検定では0.01ng／mlのMED を立証した。48時間では、サイトカラシンＣはタンパク質合成検定では 0.1ng／ml、DNA 検定では0.01ng／mlのMED を立証した。サイトカラシンＤは、24時間タンパク質合成検定では 1.0ng／ml、24時間DNA 検定では 0.1ng／mlのMED を立証した。サイトカラシンＤへの48時間曝露は、タンパク質合成検定及びDNA 検定の両方で 0.1ng／ml−0.01ng／mlの範囲のMED を示した。
実施例11． 血管平滑筋細胞移動阻害
サイトカラシンＢによる平滑筋細胞移動阻害の程度を確定するための引っ掻き検定を、以下のプロトコールに従って実施した：
実施例10に記載されているように、ヒヒ大動脈平滑筋の外植片から血管平滑筋細胞（BO54）を得た。細胞を約５mlの培地を入れた平底６ウエル組織培養プレートで増殖させた。血管平滑筋細胞を 200,000細胞／ウエルで平板培養して、湿潤５％ CO2インキュベーター中に37℃で１時間置いた。次に片刃剃刀をクランプ又はプライヤーで保持して、90度の角度でウエルの底に無菌的に接触させて、滅菌した部分でウエルを引っ掻いた。刃をウエルの底に接触させたままで、滅菌綿棒で引っ掻き部分に沿った小領域から細胞を取り出した。インキュベーション後、“引っ掻き”領域中の細胞の存在は、引っ掻き線を横切って細胞が移動したことを示す。対照インキュベーションは有意の細胞移動を示し、治療薬に曝露された細胞の移動を比較する基準として役立つ。
要するに，１mg／mlでジメチルスルホキシド（DMSO）中に溶解したサイトカラシンＲ（Sigma Chemical Co.）のストック溶液を調製した。サイトカラシンＢ又は対照培地の被験希釈液を加えた。各実験には、下記の２組のプレートが含まれた：
Ａ組： １，３，６，８及び10日間被験薬剤曝露のみ；
Ｂ組： １，３，６，８及び10日間被験薬剤曝露。その後対照培地で７日間の回復時間。
曝露終了時に、両組のプレートを固定し(PBSに溶解した10％ホルマリン）、染色（0.02％クリスタルバイオレット）した。サイトカラシンＢの試験濃度は、１，0.1 及び0.01μｇ／mlで、陰性培地対照も含まれた。新鮮な培地及び薬剤を週に３回供給した。
表６は、これらの実験の結果を示す。表中、“Ｍ”は移動等級を示し、ここでは引っ掻き部分に隣接した除去領域中への血管平滑筋細胞の、−＝移動なし；＋１＝最小度；＋２＝軽度；＋３＝中等度；＋４＝顕著（最大密度：細胞接触阻害の限界）な移動を示す。表中、“Ｔ”は、形態学的毒性等級を示し、ここでは、−＝毒性なし；＋１＝最小度；＋２＝軽度；＋３＝中等度；＋４＝顕著な毒性を示す。移動結果は、“ウエルの除去領域における等級／ウエルの非妨害領域における等級”として表される。毒性値は、各ウエル中の全細胞に関する等級を示す。
データは、 0.1μｇ／mlの用量で引っ掻き部分に隣接する除去領域中への血管平滑筋細胞の移動（＋１−＋２）をサイトカラシンＢが阻止することを示し、最小（−−＋１）形態学的毒性のみを示す。データはさらに、治療薬への10日間の連続曝露後でさえ、処理(0.1μｇ／ml）は治療薬除去後に移動する（＋３−＋４）能力を再獲得することを示す。
実施例12． 血管平滑筋細胞に及ぼす治療薬細胞毒性作用パルス及び連続曝露
血管平滑筋細胞を２つの曝露フォーマットのうちの１つで治療薬に曝露した：
パルス曝露： パルス曝露プロトコールは実施例８に記載されている（“形態学的細胞毒評価−パルス曝露”参照）。
連続曝露： パルス曝露と同様の方法を用いて連続曝露形態学的細胞毒性評価を行うが、但し試験ウエルは曝露期間中は培地中の治療薬に連続的に曝露される。培地及び治療薬を毎日対照ウエルを含めた各ウエルから吸引して、新鮮な培地及び治療薬（又は対照ウエルに関しては培地のみ）１mlに取り換えた。長時間連続曝露プロトコールの各増分評価時点に届くまで、再インキュベーションを続けた。これらの増分評価時点は、６，24，48，72，96，120, 168，216 及び 264時間であった。指定時間に、適切な細胞を固定し、染色して、パルス曝露プロトコールの場合と同様に評価した。連続曝露実験の結果を、スラミン、スタウロスポリン及びサイトカラシンＢに関して表７に示す。表７に示した５分間及び24時間データは、図10Ａ，10Ｂ及び10Ｃに含まれるデータと相関関係がある。
In vitro有効用量で、サイトカラシンＢ（１μｇ／ml；抗移動／収縮有効用量）及びスタウロスポリン（１ng／ml；抗増殖有効用量）はそれぞれ等級１（最小度）及び２（軽度）の細胞毒性を示した。個々の試験は、本発明の細胞増殖抑制性抗増殖剤に関しては等級３（中等度）又はそれ以下の等級が好ましいことを示した。
実施例13． In vivo 薬剤検定：血管平滑筋細胞増殖の阻害
薬剤検定： 細胞DNA 合成及び増殖中の塩基類似体 ５−ブロモ−２′−デオキシウリジン（BRDU, Sigma Chemical Co.から購入）のDNA への取り込みを測定することにより、in vivo 血管平滑筋増殖を定量した。市販の抗BRDUモノクローナル抗体を組織化学的に用いて、BRDU取込みを立証した。１時間パルス標識によりパルス期間に分裂中の細胞の数を査定できる。
上記のBRDUパルス標識プロトコールをin vivo ブタ血管試験に関する標準評価法として用いる。手術及び処理操作（例えば本明細書の実施例７及び11で考察）並びに術後回復期間後、ブタを鎮静化し、BRDUでパルス処理して１時間後に組織を収集した。
要するに、筋注により塩酸チレタミン及びキシラジン（実施例７の“肉眼的病理学及び組織学的評価”と同様）を用いてブタを鎮静させた。次にBRDUを外側耳静脈を介して静注投与した。50mg／mlの濃度のBRDU２mlを体重30−40ポンドの各ブタに投与した。１時間後、ペントバルビタールを静注してブタを屠殺した。次いで試験動脈セグメントを取り出した（セグメントは、処理動脈セグメントに関して近位に、そして可能な場合には遠位に位置する正常血管を含んだ）。動脈セグメントを２mm間隔で横断し、O.C.T.（最適切断温度）化合物（Tissue Tek・, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, IN)を有する凍結型cryomolds に順に並べて、液体窒素中で凍結させた。ブロックを５ミクロンの切片にして、免疫組織学的染色をし、以下の手法を用いてBRDUを検出した。
BRDU標識化細胞検出：
BRDU（１ｇ BRDU を滅菌水17ml及び１N NaOH３ml中に希釈）パルス標識並びに試験動脈セグメント除去及び切片作製（上記）後、抗BRDUモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的染色により、特異化期間中の有糸分裂指数を測定する視覚的手段が提供される。免疫組織化学的染色は以下のように実施した：
１）被験動脈の５μｍ切片を冷アセトン（−20℃）で10分間脱水した；
２）切片をガラス顕微鏡スライド上に載せて、スライドを37℃で10分間乾燥させた；
３）スライドをPBS 中で10分間、再脱水した；
４）１N HCl を用いてスライドにホイルゲン酸加水分解を施す。この場合、処理前に１N HCl の２つのアリコートを37℃及び60℃に予熱する；
５）スライドを37℃で１分間、１mlの１N HCl で洗浄した；
６）スライドを60℃の１N HCl に15分間移した；
７）スライドを37℃で１分間、１mlの１N HCl で洗浄した；
８）スライドを室温PBS で洗浄した。PBS は５分間隔で３回換えた；
９）切片上の内因性交差反応部位を正常ヤギ血清(PBS中１：25）で20分間遮断した；
10）工程８と同様に、スライドをPBS で洗浄した；
11）切片をマウス抗BRDU抗体（DAKO Corporation, Carpinteria, CA)とともに10μｇ／mlで30分間インキュベートした；
12）工程８と同様に、スライドをPBS で洗浄した；
13）切片をセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識化（HRPO）ヤギ抗マウスIgG1（Jackson Immunoresearch Laboratries. Inc., West Grove, PA; PBS で１：20に希釈）及び４％ヒトAB血清とともに30分間インキュベートした；
14）工程８と同様に、スライドをPBS で洗浄した；
15）切片を色素原（３，３′−ジアミノベンジジン（DAB; Sigma), 200ml PBS中に５mg／mlで）及び 200μｌの30％H2O2とともに10分間インキュベートした；
16）工程８と同様に、スライドをPBS で洗浄した；
17）試料をGill Iヘマトキシリン（Gill I Lerner Laboratories, Pittsburgh, PA; 30ディップ）で対比染色した；
18）工程８と同様に、スライドをPBS で洗浄した；青み溶液（dH2O 500ml中に炭酸リチウム１gm）で濯ぎ；脱イオン水で洗浄した；そして
19）被験試料を脱水し、浄化して、カバーグラスをかけた。
この手順の終了時に、陽性免疫組織学的染色は反応性の部位で褐色を示す。
殺細胞剤は、PBS 対照に関してBRDU取込みを阻害した；しかしながら、サイトカラシンＢ及びスタウロスポリンは、血管平滑筋細胞を殺さずにBRDU取込み（即ち細胞増殖）を阻害した。BRDUで標識された血管平滑筋細胞の数を、以下のように 400倍の倍率での等級に割り当てた：
１＝≦１／高パワー領域（HPF)；
２＝２−５／HPF ；
３＝＞５−≦10／HPF ；及び
４＝＞10／HPF 。
サイトカラシンＢ及びスタウロスポリンはともにバルーン外傷後24時間増殖を阻害し（等級１）、外傷前基準（等級１）と同じBRDU標識等級を生じた。PBS 及びモノクローナル抗体対照は、同一期間に等級 2.5−４のBRDU標識を示した。外傷後４日目に、サイトカラシンＢ又はスタウロスポリンで処理した動脈、並びにPBS 及びモノクローナル抗体対照は、BRDU標識等級４を示した。サイトカラシンＢ及びスタウロスポリンの抗増殖非殺細胞特性は、これらの薬剤が血管狭窄の低減のための持続性放出投与処方物たり得ることを示唆する。
実施例14． サイトカラシンＢを用いたバルーン外傷化ブタ動脈の生物学的ステント処理
サイトカラシンＢで処理したバルーン外傷化ブタ動脈は、他の被験薬で処理した動脈又は対照と比較した場合、より大きな管腔面積を示した。10本の大腿動脈（実施例７に記載の１回投与プロトコールに従って処理した５頭のブタの各々から２本ずつ得た動脈）を組織学的に評価した。各動脈の最大管腔面積を、BQシステムIVコンピューター処理計測学的分析システム（R & M Biometrics, Inc., Nashville, TN)によるデジタル化顕微鏡像から測定し、算出した。さらに５頭のブタ（１頭につき動脈２本；サイトカラシンＢ用量＝ 0.1μｇ／ml，１気圧で３分間適用；同一時点）を用いて、本実験を繰り返した。２つの実験から得たデータを合わせた。サイトカラシンＢ処理後３週間目の時点での管腔面積の増大が観察された。
さらに動脈の外傷化及びサイトカラシンＢ処理セグメントの管腔面積を、被験領域に近位の大腿動脈の正常非処理領域の管腔面積と比較した。結果は、被験領域の管腔面積が同一動脈の正常対照セグメントの面積の約２倍の大きさであることを示した。陰性対照薬、PBS 及びモノクローナル抗体NR−AN−01は、同一動脈の正常対照セグメントと比較した場合、管腔面積の増大を全く示さないか又はわずかの減少を示した。
次にサイトカラシンＢ用量反応試験を、実施例７に記載の実験プロトコール後に10頭のブタで実施した。手短に言えば、２頭のブタの各々の両方の動脈を以下のいずれかの用量のサイトカラシンＢで処理した： 0.0μｇ／ml（即ちPBS 陰性対照）；0.01μｇ／ml； 1.0μｇ／ml及び10.0μｇ／ml。薬剤は、管腔内カテーテルにより１気圧で３分間供給し、上記の計測学的分析システムにより３週間後に評価した。処理動脈管腔面積対近位正常動脈管腔面積の比を処理面積対正常面積の％変化として確定した。 0.1μｇ／ml（・ 140％増大）から 1.0μｇ／mlの範囲の用量で有意の閾値作用が観察された（図14）。10μｇ／ml用量は血管平滑筋細胞に有毒であると考えられた（データは示していない）。亜閾値用量（0.01μｇ／ml）及び陰性対照(PBS）は、管腔面積の±・20％変化を示した。これらのデータは、外傷化動脈に供給された場合、サイトカラシンＢが“生物学的ステント”として作用することを示唆する。
実施例15． ラテックス粒子のカルボン酸官能基とのNR−AN−01抗体の直接抱合
抗体被覆ラテックス粒子（抗体被覆持続性放出投与形態のモデル）は、以下の無菌法を用いて得られる：
抱合：
0.01％ Tween−20（商標）（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート，Sigma)を含有する0.05Ｍホウ酸ナトリウム４mlに、５mgのNR−AN−01モノクローナル抗体を含有するPBS 0.5ml を加えた。室温で撹拌しながら、この溶液に直径１μｍのカルボキシル化ラテックス粒子50mgを含有する水性懸濁液 2.5mlを加えた。その直後に、 100mgの新たに溶解させた１（３−ジメチル−アミノプロピル）３−エチルカルボジイミドHCl を含有する0.50mlの水を撹拌しながら加える。次に溶液を撹拌しながら室温で１−２時間インキュベートする。その後反応混合物を、0.2％ゼラチン安定剤（リン酸塩／ゼラチン緩衝液）を含有する50mMリン酸塩緩衝液(pH6.6) 50mlで希釈する。混合物を40,000xgで、４−10℃で２時間遠心分離する。上清をデカントし、低レベル音波処理を10秒間用いて、ペレットをリン酸塩／ゼラチン緩衝液50ml中に再懸濁する。遠心分離を繰り返し、ペレットを２回再懸濁して、その後リン酸塩／ゼラチン緩衝液中に再懸濁する。次に標準プロトコール及びソルビタール賦形剤を用いて、接合粒子を親液化する。
特性表示：
（ａ）整粒： レーザー異方性により、１μｍより大きい粒子に関しては顕微鏡検査によって、粒子サイズ均等性を査定する。
（ｂ）特異的結合査定： 抱合粒子とのタンパク質／ペプチド抱合体のインキュベーション（インキュベーション混合物には遮断剤タンパク質／ペプチドが含まれないこともある）後、組織又は細胞ペレットミクロトーム薄片の組織学的検査により、平滑筋細胞との特異的結合を調べる。好ましい検出方法としては、二次抗体検定（即ち抗マウスIg）又は競合検定（即ち放射性同位元素標識化タンパク質／ペプチド接合体と関連したラジオシンチグラフによる検出）が挙げられる。
（ｃ）タンパク質／ペプチド誘導化の程度の査定：ラテックス粒子を放射性同位元素標識化抗体で被覆して、その後被覆粒子に関連した放射能を検出することにより、この測定を実施する。
抗体被覆粒子の特性表示を表８に記載する。
抗体接合中のpHの粒子凝集作用を表９に示す。
これらのデータは、タンパク質又はペプチドが本発明の持続性放出投与形態と直接抱合しうることを示唆する。さらに末端カルボン酸基を有するポリ乳酸／グリコール酸粒子は本明細書に記載の手順、あるいは本明細書に記載の別の手順にしたがって接合される。
引 用 文 献
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図１Ａは、血管平滑筋結合性タンパク質が細胞表面および膜に結合した24歳の男性の患者の動脈中の血管平滑筋細胞の顕微鏡写真である。動脈組織を組織学について準備する前の４日にｉ．ｖ．投与により、患者に血管平滑筋結合性タンパク質を投与した。 図１Ｂは、血管平滑筋結合性タンパク質が細胞表面および膜に結合した24歳の男性の患者の動脈中の血管平滑筋細胞の顕微鏡写真である。動脈組織を組織学について準備する前の４日にｉ．ｖ．投与により、患者に血管平滑筋結合性タンパク質を投与した。 図２は、血管平滑筋結合性タンパク質への治療剤の化学的カップリングの第１概要を描写する。 図３は、血管平滑筋結合性タンパク質への治療剤の化学的カップリングの第２概要を描写する。 図４Ａは、生体外のマーカー陽性被験細胞への血管平滑筋結合性タンパク質の急速な結合を示す実験データをグラフで描写する。 図４Ｂは、血管平滑筋細胞への血管平滑筋結合性タンパク質の急速な結合を示す実験データをグラフで描写する。
図５Ａは、血管平滑筋細胞を生体外で24時間処理したとき、低いレベルの治療接合体（すなわち、RA−NR−AN−01）および遊離RA治療剤の望ましくない細胞障害性を示す実験データをグラフで表す。 図５Ｂは、マーカー陽性および陰性の細胞の代謝活性へのRA−NR−AN−01治療剤の作用を示す実験データをグラフで表す。これらのデータは生体外の24時間の処理におけるすべてのこれらの細胞についての接合体の望ましくない非特異的細胞障害性を示す。非特異性は、試験した細胞を遊離の薬物へ暴露するカップリングリガンドの細胞外加水分解から生ずる。 図６Ａは、24時間の処理後に一夜の回復期間を置いて代謝活性を試験してさえ、生体外の24時間の処理後におけるマーカー陽性およびマーカー陰性の被験細胞についてのPE−NR−AN−01治療接合体の望ましくない非特異的細胞障害性を示す実験データをグラフで描写する。 図６Ｂは、生体外の24時間の処理後のマーカー陽性およびマーカー陰性の被験細胞についての遊離PE治療剤の非特異的細胞障害性を示す実験データを描写する。
図７Ａは、短い５分の「パルス」処理、すなわち、24時間の代わりに、次いで〔３Ｈ〕ロイシンへの暴露を示す実験データをグラフで表し、遊離のRA治療剤は非特異的に細胞障害性であり、すなわち、対照のHT29マーカー陽性細胞について、しかし、対照的に、RA−NR−AN−01治療接合体はこの「パルス」処理において細胞障害性ではないことを示す実験データをグラフで表す。 図７Ｂは、遊離のRA治療剤は、５分「パルス」処理および引き続く〔３Ｈ〕ロイシンへの暴露前の24時間の回復期間においてさえ、対照HT29マーカー陰性細胞について非特異的に細胞障害性であるが、対照的に、RA−NR−AN−01治療接合体は細胞に対して細胞障害性ではないことを示す実験データをグラフで表す。 図７Ｃは、RA−NR−AN−01治療接合体を使用する生体外の細胞の「パルス」処理が、タンパク質合成により測定して、マーカー陽性A375細胞において細胞活性を阻害することを示す実験の結果をグラフで表す。 図７Ｄは、A375細胞におけるタンパク質合成は、細胞を生体外の試験前に一夜の回復期間に付したとき、阻害されなかったので、RA−NR−AN−01治療接合体を使用する生体外の細胞の「パルス」処理がマーカー陽性細胞において細胞活性に対して長く続く阻害作用を発揮しなかったことを示す実験データをグラフで表す。
図８Ａは、遊離RA治療剤を使用する生体外の細胞の「パルス」処理は非特異的に細胞障害性であったが、試験前に48時間の回復期間に付したB054細胞における代謝活性により証明されるように、血管平滑筋細胞における細胞活性に対して長く続く阻害作用を発揮しなかったことを示す実験データをグラフで表す。 図８Ｂは、上の図８Ａに表すものに類似する実験データをグラフで描写するが、第２マーカー陽性細胞の型、すなわち、A375を使用すると、RA−NR−AN−01治療接合体を使用する「パルス」処理は、試験前に48時間の回復期間に付したA375細胞における代謝活性により証明されるように、細胞活性に対して長く続く阻害作用を発揮しなかったことをデータは示す。 図８Ｃは、上の図８Ａおよび図８Ｂに表すものに類似する結果をグラフで描写するが、マーカー陰性対照細胞の型、すなわち、HT29を使用する。結果が示すように、RA−NR−AN−01治療接合体を使用する「パルス」処理は、試験前に48時間の回復期間に付したHT29細胞における代謝活性により証明されるように、マーカー陰性対照細胞の細胞活性に対して長く続く阻害作用を発揮しなかった。
図９Ａは、動物モデルにおける血管形成後５週における未処置の組織学的切片における内膜の平滑筋細胞の増殖のための狭窄を示す。 図９Ｂは、動物モデルにおける血管形成後５週における治療接合体で処置した動脈の組織学的切片における狭窄の抑制を示す。 図10Ａは、スラミンのタンパク質合成および DNA系の阻害を血管平滑筋細胞に関して比較する実験データをグラフで描写する。 図10Ｂは、スタウロスポリンのタンパク質合成および DNA系の阻害を血管平滑筋細胞に関して比較する実験データをグラフで描写する。 図10Ｃは、ニトログリセリンのタンパク質合成および DNA系の阻害を血管平滑筋細胞に関して比較する実験データをグラフで描写する。
図11は、62,500倍に拡大しそしてそれらのいくつかが細胞により生体外で内在化されているプロセスにおける抗体被覆金ビーズを含有する多数のエンドサイトーシスの小胞により特徴づけられる平滑筋細胞の内表面に対して平行の接線方向の断面を示す。 図12は、62,500倍に拡大しそして生体外で金ビーズに細胞を暴露した後24時間におけるリソソーム中の金ビーズの顕著な蓄積により特徴づけられる平滑筋細胞を示す。 図13は、62,500倍に拡大しそして生体内のリソソーム中の金ビーズの蓄積により特徴づけられる平滑筋細胞を示す。 図14は、ブタの大腿動脈の管腔区域へのサイトカラシンＢの作用の生体内の投与量応答の研究を描写する。

Claims (26)

  1. 哺乳類血管平滑筋細胞の収縮又は移動を抑制するのに効果的な量の細胞増殖抑制剤を含んで成り、前記の量が、細胞外マトリクスを分泌する管平滑筋細胞の能力を除去しない量である、外傷を有する哺乳類血管を生物学的に伸長させる剤。
  2. 細胞を実質的に殺すことなく、外傷を有する哺乳類管平滑筋細胞の病的収縮又は移動を抑制するのに有効な量の細胞増殖抑制剤を含んで成り、前記の量が、細胞外マトリクスを分泌する管平滑筋細胞の能力を除去しない量である、管腔直径を維持又は拡張するための剤。
  3. 哺乳類管平滑筋細胞の増加を抑制するのに効果的な抗増殖剤の持続放出型を含んで成る、請求項１又は２に記載の剤。
  4. 前記剤が持続放出型である、請求項１又は２に記載の剤。
  5. 局所投与形である、請求項１又は２に記載の剤。
  6. カテーテルにより投与される、請求項１又は２に記載の剤。
  7. 外傷の前もしくは後、又は外傷中に投与される、請求項１又は２に記載の剤。
  8. 全身的に投与される、請求項１又は２に記載の剤。
  9. 前記持続放出型が、ミクロ粒子又はナノ粒子である、請求項４に記載の剤。
  10. 細胞体質阻害剤である、請求項１又は２に記載の剤。
  11. 前記細胞体質阻害剤がタキソール又はその類似体である、請求項10に記載の剤。
  12. 前記細胞体質阻害剤が、サイトカラシン又はその誘導体もしくは類似体である、請求項10に記載の剤。
  13. 前記細胞体質阻害剤がサイトカラシンＢ又はその誘導体もしくは類似体である、請求項12に記載の剤。
  14. 哺乳類血管平滑筋細胞の病的増加を抑制するために効果的な量の殺細胞剤及び持続放出型の細胞増殖抑制剤を含んで成る、哺乳類の外傷を有する血管に投与するための組成物。
  15. 前記細胞増殖抑制剤がタキソール又はその類似体である、請求項14に記載の組成物。
  16. 前記細胞増殖抑制剤が、サイトカラシン、又はその誘導体もしくは類似体である、請求項14に記載の組成物。
  17. タキソール又はその類似体を含んで成る、哺乳類血管の狭窄又は再狭窄の治療剤。
  18. タキソールを含んで成る、請求項17に記載の剤。
  19. 局所投与用の、請求項17に記載の剤。
  20. カテーテルを介して投与される、請求項17に記載の剤。
  21. 全身的に投与される、請求項17に記載の剤。
  22. 経口投与される、請求項17に記載の剤。
  23. 血管が工程血管外傷にかかっている、請求項17に記載の剤。
  24. 前記外傷が、血管形成し得る、ステントの設置、又は移植に関連する、請求項１又は２に記載の剤。
  25. 前記の量が、血管平滑筋細胞の増殖を抑制するために有効な量である、請求項17に記載の剤。
  26. アクチンの重合を抑制する、請求項２に記載の剤。
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