ES2226120T3 - Inhibidor terapeutico de celulas del musculo liso vascular. - Google Patents

Inhibidor terapeutico de celulas del musculo liso vascular.

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ES2226120T3
ES2226120T3 ES98914366T ES98914366T ES2226120T3 ES 2226120 T3 ES2226120 T3 ES 2226120T3 ES 98914366 T ES98914366 T ES 98914366T ES 98914366 T ES98914366 T ES 98914366T ES 2226120 T3 ES2226120 T3 ES 2226120T3
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cytochalasin
cytoskeletal
inhibitor
cells
smooth muscle
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English (en)
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Lawrence L. Kunz
Richard A. Klein
John M. Reno
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Boston Scientific Ltd Barbados
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Abstract

La invención se refiere a un procedimiento para inhibir la estenosis o restenosis que sigue a un trauma vascular en un anfitrión mamífero, incluyendo la administración al anfitrión de la dosis terapéutica eficaz de agente citostático y/o inhibidor citoesquelético de forma que se limite biológicamente el vaso traumatizado. También proporciona un procedimiento para inhibir o reducir la reforma vascular que sigue a un trauma vascular, mediante la administración de una cantidad eficaz de inhibidor cicloesquelético. Además proporciona una composición farmacéutica y el conjunto que incluye un agente terapéutico de la invención.

Description

Inhibidor terapéutico de células del músculo liso vascular.
Antecedentes de la invención
La Angioplastia Coronaria Percutánea Transluminal (PTCA) se usa extensamente como modalidad de tratamiento primario en muchos pacientes con enfermedad arterial coronaria. La PTCA puede aliviar la isquemia de miocardio en pacientes con enfermedad arterial coronaria reduciendo la obstrucción de la luz y mejorando el flujo coronario. El uso de este procedimiento quirúrgico ha crecido rápidamente, con 39.000 procedimientos realizados en 1983, casi 150.000 en 1987, 200.000 en 1988, 250.000 en 1989 y casi 500.000 PTCA por año estimadas para 1994 (Popma et al., Amer. J. Med., 88: 16N-24N (1990); Fanelli et al., Amer. Heart Jour, 119: 357-368 (1990); Johnson et al., Circulation, 18 (Suppl. II):II-82 (1988)). La estenosis después de la PTCA sigue siendo un problema importante, con un 25 a 35% de pacientes que sufren reestenosis entre los meses 1 a 3 siguientes. La reestenosis origina una morbididad y mortalidad significativas y frecuentemente necesita posteriores intervenciones tales como repetir la angioplastia o cirugía de desviación coronaria. En 1993 ninguna intervención o tratamiento postquirúrgico ha demostrado ser eficaz para prevenir la reestenosis.
Los procesos responsables de la reestenosis después de PTCA no se comprenden totalmente pero puede originarse de una compleja relación entre varios agentes y vías biológicas diferentes. Visualizadas en secciones histológicas, las lesiones reestenóticas pueden tener un sobrecrecimiento de células del músculo liso en la capa íntima del vaso (Johnson et al., Circulation, 78 (Suppl. II): II-82 (1988)). Se han sugerido varios mecanismos posibles para la proliferación de células del músculo liso después de PTCA han sugerido (Popma et al., Amer. J. Med., 88 16N-24N (1990); Fanelli et al, Amer. Heart Jour., 119: 357-368 (1990); Liu et al., Circulation, 79:1374-1387 (1989); Clowes et al., Circ. Res., 56 139-145 (1985)).
Los compuestos que han demostrado suprimir la proliferación de músculo liso in vitro (Liu et al., Circulation, 79:1374-1387 (1989); Goldman et al., Atherosclerosis, 65: 215-225 (1987); Wolinsky et al., JACC, 15 (2): 475-481 (1990)) pueden tener efectos secundarios farmacológicos indeseados cuando se usan in vivo. La heparina es un ejemplo de uno de tales compuestos, que ha demostrado inhibir la proliferación de células del músculo liso in vitro pero cuando se usa in vivo tiene posibles efectos secundarios que inhiben la coagulación. Los péptidos de la heparina, que aunque tienen menor actividad anticoagulante, tienen la propiedad farmacológica indeseada de tener una semivida farmacológica corta. Se han destinado esfuerzos por solucionar dichos problemas usando un catéter de doble globo, es decir, para la liberación regional del agente terapéutico en el lugar de la angioplastia (por ejemplo, Nabel et al., Science, 244: 1342-1344 (1989); patente de Estados Unidos nº 4.824.436) y usando materiales biodegradables impregnados con un fármaco, es decir, para compensar los problemas de semivida corta (por ejemplo, Middlebrook et al., Biochem. Pharm., 38 (18): 3101-3110 (1989); patente de Estados Unidos nº 4.929.602).
Por su parte, al menos cinco consideraciones parecerían evitar el uso de fármacos inhibidores para prevenir la estenosis derivada del sobrecrecimiento de células del músculo liso. En primer lugar, los agentes inhibidores pueden tener toxicidad sistémica que podría crear un nivel inaceptable de riesgo para pacientes con enfermedad cardiovascular. En segundo lugar, los agentes inhibidores podría interferir con la cicatrización vascular después de la cirugía y podrían retrasar la cicatrización o debilitar la estructura o elasticidad de la pared del vaso recién cicatrizado. En tercer lugar, los agentes inhibidores que destruyen células del músculo liso podrían dañar al endotelio circundante y/u otras células del músculo liso de la capa media. La muerte y destrucción de células también libera agentes mitógenos que podrían estimular una mayor proliferación de células del músculo liso y exacerbar la estenosis. En cuarto lugar, la liberación de niveles terapéuticamente eficaces de un agente inhibidor puede plantear un problema desde varios puntos de vista: a saber, a) puede ser necesaria la liberación de un gran número de moléculas en los espacios intercelulares entre las células del músculo liso; es decir, establecer condiciones favorables para permitir que una dosis terapéuticamente eficaz de moléculas cruce la membrana celular; b) dirigir un fármaco inhibidor al compartimento intracelular adecuado, es decir, donde se ejerce su acción, puede ser difícil de controlar; y c) optimizar la asociación del fármaco inhibidor con su diana intracelular, por ejemplo, un ribosoma, mientras se minimiza la redistribución intracelular de fármaco, por ejemplo, hacia células vecinas, puede ser difícil. En quinto lugar, puesto que la proliferación de células del músculo liso tiene lugar durante varias semanas, a priori parecería que los fármacos inhibidores también deberían administrarse durante varias semanas, quizás de forma continuada, para producir un efecto beneficioso.
Como es evidente a partir de lo anterior, quedan muchos problemas sin resolver en el uso de fármacos inhibidores para tratar de forma eficaz la proliferación de células del músculo liso.
Por tanto, existe una necesidad de un procedimiento para inhibir o reducir la estenosis debida a la proliferación de células del músculo liso vascular después de lesión traumática a los vasos tal como la que se produce durante la cirugía vascular. También existe la necesidad de liberar compuestos a las células del músculo liso vascular que ejerzan efectos inhibidores durante períodos de tiempo prolongados.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona el uso de inhibidores citoesqueléticos en la preparación de medicamentos para inhibir o reducir la disminución en el área de la luz de un vaso en un vaso de mamífero, por ejemplo, para administración a un vaso de mamífero traumatizado por un procedimiento quirúrgico, por ejemplo, por un procedimiento de angioplastia. En la práctica de la presente invención, un inhibidor citoesquelético preferido incluye, por ejemplo, taxol y análogos o derivados del mismo tales como taxótero, o una citocalasina, tal como citocalasina B, citocalasina C, citocalasina D, o análogos o derivados de los mismos. La administración de dichos inhibidores citoesqueléticos es eficaz para fijar biológicamente la luz del vaso, inhibir o reducir el remodelado vascular del vaso, inhibir o reducir la proliferación de células del músculo liso vascular o cualquiera de sus combinaciones. La administración de inhibidores citoesqueléticos se lleva a cabo preferiblemente durante el procedimiento que traumatiza el vaso, por ejemplo, durante la angioplastia u otro procedimiento quirúrgico vascular. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas y formas de dosificación que contienen inhibidores citoesqueléticos para usar en el presente procedimiento, así como kits que los contienen.
Así, los medicamentos, composiciones farmacéuticas y formas de dosificación descritos en la presente memoria se pueden usar para fijar biológicamente la luz de un vaso sanguíneo de mamífero traumatizado. Tal como se usa en la presente memoria "fijar biológicamente la luz de un vaso" significa la fijación de la luz vascular en un estado dilatado próximo a su diámetro sistólico máximo. El procedimiento para fijar biológicamente la luz de un vaso comprende la administración de una cantidad eficaz de un inhibidor citoesquelético al vaso sanguíneo. Con preferencia, el inhibidor citoesquelético está dispersado en un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 \mug para citocalasina B/ml de vehículo y, con preferencia se administra localmente a través de un catéter. Con preferencia, un porción de la cantidad administrada penetra hasta al menos aproximadamente 6 a 9 capas celulares de la túnica media interna del vaso y por ello es eficaz para fijar biológicamente la luz del vaso. Realizaciones preferidas de la invención contienen una citocalasina o uno de sus análogos dispersada en un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable a aproximadamente 0,001 a aproximadamente 25 \mug por ml de vehículo acuoso.
Las condiciones de administración con catéter preferidas incluyen emplear un catéter para liberar aproximadamente 4 a aproximadamente 25 ml de una composición que comprende el inhibidor citoesquelético dispersado o disuelto en un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable. El inhibidor citoesquelético se libera a una presión en la conexión de aproximadamente 3 a aproximadamente 8 atm, más preferiblemente de aproximadamente 4 a aproximadamente 5 atm, durante aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 minutos, más preferiblemente durante aproximadamente 0,7 a aproximadamente 3 minutos. Las presiones hidrostáticas en cabeza preferidas para la administración por catéter incluyen aproximadamente 0,3 a aproximadamente 1,0 atm, más preferiblemente aproximadamente 0,5 a aproximadamente 0,75 atm. La cantidad de inhibidor citoesquelético se controla de modo que permita que las células del músculo liso vascular continúen sintetizando proteína, que se requiere para reparar un traumatismo celular menor, y segregar matriz intersticial, facilitando de este modo la fijación de la luz vascular en un estado dilatado próximo a su máximo diámetro sistólico, es decir, proporcionar una acción de fijar biológicamente la luz del vaso. Con preferencia, el inhibidor citoesquelético se administra directamente o casi directamente al área traumatizada del tejido del músculo liso vascular.
Los medicamentos, composiciones farmacéuticas y formas de dosificación se pueden usar para inhibir o reducir el remodelado vascular de un vaso sanguíneo de mamífero traumatizado, administrando una cantidad eficaz del inhibidor citoesquelético al vaso sanguíneo traumatizado.
Como se describe en la presente memoria más adelante, un estudio de dosis-respuesta demostró que la citocalasina B tenía un índice terapéutico (TI) logarítmico de 2. Un gran índice terapéutico permite la difusión de niveles terapéuticos del agente desde el sistema de liberación, por ejemplo, un dispositivo implantable, sin toxicidad hacia las células inmediatamente adyacentes al orificio de salida del sistema. Por otro lado, incluso a la máxima concentración de citocalasina B en un vehículo líquido, existe poca o nula toxicidad observada en células adyacentes al sistema de liberación. Se encontró que la citocalasina B y el taxol inhibían ambos la proliferación de la íntima en los vasos sometidos a un traumatismo vascular quirúrgico. Esta inhibición tiene como resultado una endotelización más rápida y completa de la pared del vaso después del traumatismo.
En particular, los medicamentos, composiciones y formas de dosificación se pueden usar para inhibir o reducir la disminución de la luz del vaso en un vaso sanguíneo de mamífero traumatizado por un procedimiento quirúrgico. En dichos procedimientos, se administra una cantidad eficaz de inhibidor citoesquelético al vaso sanguíneo de un mamífero, estando el inhibidor citoesquelético en forma cristalina sustancialmente pura y siendo los cristales de un tamaño que proporcione una liberación sostenida del inhibidor citoesquelético. Con preferencia, los cristales tienen un tamaño de aproximadamente 0,1 micrómetro a aproximadamente 10 mm, preferiblemente un tamaño de aproximadamente 1 micrómetro a aproximadamente 25 micrómetros. Los procedimientos para determinar el tamaño de los cristales útiles para la liberación sostenida son bien conocidos en la técnica. Con preferencia, el inhibidor citoesquelético se administra in situ, por medio de un dispositivo implantable, en el que el inhibidor citoesquelético está embebido de forma liberable en, revestido sobre, o embebido y revestido sobre, el dispositivo implantable. Con preferencia, el inhibidor citoesquelético cristalino está embebido de forma liberable en, o dispersado en, una envuelta adventicia, por ejemplo, una membrana de silicona. Por ejemplo un dispositivo terapéutico implantable preferido de la invención comprende de aproximadamente 5 a aproximadamente 70, preferiblemente de aproximadamente 7 a aproximadamente 50 y, más preferiblemente, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30, por ciento en peso de una citocalasina, por ejemplo, citocalasina B o uno de sus análogos, referido al porcentaje en peso de la envuelta adventicia. Otro dispositivo implantable terapéutico preferido de la invención comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 70, preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 y, más preferiblemente, de aproximadamente 3 a aproximadamente 10, por ciento en peso de taxol, o uno de sus análogos, referido al porcentaje en peso de la envuelta adventicia. Como alternativa, un dispositivo implantable terapéutico preferido de la invención comprende de aproximadamente 30 a aproximadamente 70, preferiblemente de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 y, más preferiblemente, de aproximadamente 30 a aproximadamente 50, por ciento en peso de taxol o uno de sus análogos, referido al porcentaje en peso de envuelta adventicia. Como alternativa, el inhibidor citoesquelético cristalino puede estar suspendido en un vehículo que proporcione una solución que comprende los cristales, es decir, está en una solución saturada.
Así, en un primer aspecto, la presente invención proporciona el uso de una forma de dosificación que comprende un inhibidor citoesquelético, en la que el inhibidor citoesquelético está en forma sustancialmente cristalina y en la que los cristales tienen un tamaño que proporciona la liberación sostenida del inhibidor citoesquelético, para la preparación de un medicamento para inhibir o reducir la disminución del área de la luz del vaso de un vaso sanguíneo de mamífero traumatizado por un procedimiento quirúrgico, administrándose dicha forma de dosificación al vaso sanguíneo del mamífero.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona el uso de una forma de dosificación que comprende una citocalasina o uno de su análogos en forma sólida en una matriz no líquida para la preparación de un medicamento para inhibir o reducir la disminución del área de la luz del vaso de un vaso sanguíneo de mamífero, en el que la forma de dosificación se administra al vaso sanguíneo de mamífero y siendo la matriz no líquida un gel, pasta o membrana.
Los cristales pueden administrarse al vaso sanguíneo como una emulsión o microemulsión. La cantidad de inhibidor citoesquelético es eficaz para inhibir o reducir la disminución de área de la luz del vaso de un vaso sanguíneo de mamífero. Con preferencia, la emulsión o microemulsión está en una forma de dosificación de liberación sostenida. Con preferencia, la microemulsión tiene un diámetro de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 1000 nm, y más preferiblemente de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 300 nm.
Los cristales pueden comprender micropartículas o nanopartículas que comprenden el inhibidor citoesquelético, por ejemplo, citocalasina, taxol o uno de sus análogos. La forma de dosificación de liberación sostenida se administra a través de un dispositivo implantable que no es un catéter, preferiblemente no un catéter usado para realizar angioplastia exangüe. La cantidad administrada es eficaz para inhibir o reducir la disminución en el área de luz del vaso de un vaso sanguíneo de mamífero. La forma de dosificación de liberación sostenida comprende preferiblemente micropartículas de 4 a aproximadamente 50 micrómetros de diámetro. La forma de dosificación de liberación sostenida también puede comprender preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 y, más preferiblemente más de 3 y menos de 10 micrómetros de diámetro. Para nanopartículas, los tamaños preferidos incluyen de aproximadamente 10 a aproximadamente 5000, más preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 500 y, más preferiblemente, de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 nanómetros.
Así, la invención proporciona un medicamento para administrar a un vaso sanguíneo de mamífero traumatizado por un procedimiento quirúrgico una forma sólida sustancialmente pura de una citocalasina o uno de sus análogos, eficaz para inhibir o reducir la disminución en el área de la luz de un vaso de un vaso sanguíneo de mamífero. Formas sólidas preferidas incluyen, aunque sin quedar limitadas a las mismas, micropartículas o nanopartículas que comprenden la citocalasina o uno de sus análogos, cristales o microcristales de citocalasina o uno de sus análogos, micropartículas o nanopartículas que comprenden cristales o microcristales de la citocalasina o uno de sus análogos, o un gel o pasta que comprende la citocalasina o uno de sus análogos.
También se proporciona un kit que comprende, envasado por separado, al menos un dispositivo implantable adaptado para la liberación in situ, preferiblemente liberación local, de al menos un inhibidor citoesquelético a un lugar en la luz de un vaso de mamífero traumatizado y al menos una forma de dosis unitaria del inhibidor citoesquelético como el que se ha descrito antes para la liberación por dicho dispositivo. La liberación de la forma de dosis unitaria al vaso traumatizado a través del dispositivo es eficaz para fijar biológicamente la luz del vaso, inhibir o reducir el remodelado vascular del vaso, inhibir o reducir la proliferación de células del músculo liso vascular, o cualquiera de sus combinaciones.
La forma de dosis unitaria puede comprender el inhibidor citoesquelético cristalino en una emulsión o microemulsión que comprende al menos un inhibidor citoesquelético. La liberación de la forma de dosis unitaria a través del dispositivo al vaso de mamífero traumatizado es eficaz para inhibir o reducir la disminución en el diámetro de la luz del vaso en el vaso.
De forma alternativa, la forma de dosis unitaria puede comprender el inhibidor citoesquelético cristalino en micropartículas o nanopartículas, por ejemplo, que comprenden taxol o uno de sus análogos. Con preferencia, el kit también comprende una segunda forma de dosis unitaria que comprende un vehículo portador líquido farmacéuticamente aceptable para dispersar dichas micropartículas o dichas nanopartículas antes de la liberación. La liberación de las micropartículas o nanopartículas dispersadas al vaso de mamífero traumatizado es eficaz para inhibir o reducir la disminución del diámetro de la luz del vaso en el vaso.
Otra realización más de la invención es una composición farmacéutica adecuada para administración por medio de un dispositivo implantable. La composición comprende una cantidad de una citocalasina o uno de sus análogos (preferiblemente sustancialmente puro) en forma sólida, preferiblemente cristalina, eficaz para inhibir o reducir la estenosis o reestenosis de un vaso de mamífero traumatizado por un procedimiento quirúrgico; y una matriz de liberación no líquida farmacéuticamente aceptable para dicha citocalasina o su análogo, siendo la matriz de liberación no líquida un gel, pasta o membrana, por ejemplo, una membrana de silicona, y siendo el dispositivo una derivación o una envuelta adventicia.
La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad de una citocalasina o uno de sus análogos sólida sustancialmente pura eficaz para inhibir o reducir la estenosis o reestenosis de un vaso de mamífero traumatizado por un procedimiento quirúrgico, estando dicha citocalasina o sus análogos en forma cristalina.
La citocalasina cristalina en dicha composición puede estar en una emulsión o microemulsión.
La invención también proporciona dispositivos terapéuticos. Una realización de la invención comprende una derivación terapéutica que comprende una cantidad de un inhibidor citoesquelético en forma sólida eficaz para inhibir la estenosis o reducir la reestenosis después de colocar una derivación terapéutica. Las composiciones o medicamentos de la invención pueden administrarse usando una prótesis terapéutica artificial. Otra realización de la invención comprende una envuelta adventicia terapéutica que comprende una cantidad de un inhibidor citoesquelético en forma sólida eficaz para inhibir la estenosis o reducir la reestenosis después de colocar la envuelta.
También se proporciona por la invención un dispositivo terapéutico que comprende una endoprótesis vascular ("stent") solapada con una prótesis artificial, comprendiendo dicha prótesis artificial aproximadamente 5 a 70 por ciento de un inhibidor citoesquelético en forma sólida.
Los medicamentos, composiciones, kits y dispositivos descritos antes se pueden usar para inhibir la disminución de diámetro de la luz de un vaso. El inhibidor citoesquelético se administra con preferencia a través de un dispositivo implantable, no siendo el dispositivo implantable un catéter que tiene un primer y un segundo miembro expansible, es decir, globos, que están dispuestos en lados opuestos del área del vaso a tratar con el fin de aislar la porción del vaso a tratar antes de la administración del inhibidor citoesquelético. Con preferencia, la porción aislada de vaso no se lava para eliminar la sangre antes de la administración del inhibidor citoesquelético ("angioplastia exangüe"). "Aislado", tal y como se usa en la presente memoria, no significa contacto oclusivo del área de tratamiento real por el globo del catéter, que se prefiere en la práctica de la presente invención. Por otro lado, la angioplastia exangüe, tal como la que se describe en Slepian, patente de Estados Unidos nº 5.328.471, es decir, en la que la región a tratar se lava, puede introducir traumatismo o traumatismo posterior al vaso, puede aumentar la posibilidad de complicaciones y no es necesaria para conseguir un efecto beneficioso.
Como se ha citado antes, se pueden administrar al vaso los medicamentos, composiciones, kits y dispositivos de la invención que contienen una forma de dosificación de una citocalasina o uno de sus análogos, en un vehículo no líquido o matriz eficaz para inhibir o reducir la disminución del área de la luz del vaso de un vaso sanguíneo de mamífero. La forma de dosificación es una forma de dosificación sustancialmente sólida. El vehículo o matriz no líquido es un gel, pasta o una membrana, pero no incluye micropartículas, nanopartículas y similares, que comprenden citocalasina o uno de sus análogos.
Como se ha citado antes, la invención también proporciona un kit que comprende, preferiblemente en envases separados, un dispositivo implantable adaptado para la liberación de al menos un inhibidor de citocalasina en el lugar de la luz de un vaso de mamífero traumatizado y una forma de dosificación unitaria que comprende al menos un inhibidor citoesquelético, en el que la administración de la, al menos una porción de la forma de dosificación unitaria es eficaz para inhibir o reducir la disminución en el diámetro de la luz de un vaso del vaso. El dispositivo no es un catéter que tiene un primer y un segundo miembro expansible que están dispuestos en lados opuestos de la región a tratar de forma que se aísla una porción del vaso a tratar antes de la administración o en el que la porción aislada del vaso no se lava para eliminar la sangre antes de la administración.
Tal y como se ha citado antes, la forma de dosificación unitaria puede comprender un vial que comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 ml de aproximadamente 0,001 pg a aproximadamente 25 \mug de un inhibidor citoesquelético, con preferencia, una citocalasina, por ml de vehículo líquido, estando adaptada la forma de dosificación para la liberación a través de un dispositivo implantable y en el que el vial está marcado para usar en el tratamiento o inhibición de la estenosis o reestenosis. Con preferencia, la forma de dosis unitaria comprende un vial que comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 ml de aproximadamente 0,01 \mug a aproximadamente 10 \mug de citocalasina B por ml de vehículo líquido. Así, el volumen presente en un vial puede ser mayor que, o aproximadamente igual que, el volumen presente en el dispositivo implantable. De igual modo, el volumen presente en el dispositivo implantable puede ser mayor que, o aproximadamente igual que, el volumen administrado. De igual modo, el volumen administrado puede ser mayor que, o aproximadamente igual que, el volumen que tiene un efecto beneficioso.
La dosis unitaria puede comprender un vial que comprende una cantidad citoestática de un inhibidor citoesquelético en un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable. Con preferencia, el inhibidor citoesquelético comprende una citocalasina, taxol, o uno de sus análogos.
En las reivindicaciones subordinadas se describen realizaciones particularmente preferidas de la invención.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1A es una microfotografía de células del músculo liso vascular de un paciente varón de 24 años.
La Figura 1B es una microfotografía de células del músculo liso vascular en una arteria de un paciente varón de 24 años con proteína de unión al músculo liso vascular ligada a la superficie celular y a la membrana. El paciente recibió la proteína de unión al músculo liso vascular por administración i.v. 4 días antes de que el tejido arterial se preparara para la histología.
La Figura 2 representa un primer esquema para el acoplamiento químico de un agente terapéutico a una proteína de unión al músculo liso vascular.
La Figura 3 representa un segundo esquema para el acoplamiento químico de un agente terapéutico a una proteína de unión al músculo liso vascular.
La Figura 4A representa gráficamente datos experimentales que muestran una rápida unión de la proteína de unión al músculo liso vascular a células de ensayo positivas al marcador in vitro.
La Figura 4B representa gráficamente datos experimentales que muestran una rápida unión de la proteína de unión al músculo liso vascular a células del músculo liso vascular in vitro.
La Figura 5A presenta gráficamente datos experimentales que muestran una citotoxicidad indeseable de niveles incluso bajos de conjugado terapéutico (es decir, RA-NR-AN-01), y el agente terapéutico RA libre, cuando las células del músculo liso vascular se trataron durante 24 horas in vitro.
La Figura 5B presenta gráficamente datos experimentales que muestran los efectos de conjugado terapéutico RA-NR-AN-01 sobre la actividad metabólica de células positivas y negativas al marcador. Los datos muestran citotoxicidad no específica no deseable del conjugado por todas las células en un tratamiento in vitro de 24 horas. La ausencia de especificidad se origina por la hidrólisis extracelular del ligando de acoplamiento que expone las células ensayadas a fármaco libre.
La Figura 6A representa gráficamente datos experimentales que muestran citotoxicidad no específica indeseable de conjugado terapéutico PE-NR-AN-01 para células de ensayo positivas y negativas al marcador después de 24 horas de tratamiento in vitro, aunque el tratamiento de 24 horas estuvo seguido por un período de recuperación de una noche antes de ensayar la actividad metabólica.
La Figura 6B representa datos experimentales que muestran citotoxicidad no específica del agente terapéutico PE libre sobre células de ensayo positivas y negativas al marcador después de 24 horas de tratamiento in vitro.
La Figura 7A presenta gráficamente datos experimentales que muestran que un tratamiento "pulsado" de 5 minutos, es decir, en lugar de 24 horas, seguido por la exposición a ^{[3}H]-leucina, con agente terapéutico RA libre que es citotóxico no específico, es decir, para controlar las células negativas al marcador HT29 control, pero, en contraste, el conjugado terapéutico RA-NR-AN-01 no es citotóxico en el tratamiento "pulsado".
La Figura 7B presenta gráficamente datos experimentales que muestran que el agente terapéutico RA libre es citotóxico no específico para las células negativas al marcador HT29 control, incluso en un tratamiento "pulsado" de 5 minutos seguido por un período de recuperación de 24 horas antes de la exposición a [^{3}H]-leucina, pero, en contraste, el conjugado terapéutico RA-NR-AN-01 es no citotóxico a las células.
La Figura 7C presenta gráficamente resultados de experimentos que muestran que el tratamiento "pulsado" de células in vitro con el conjugado terapéutico RA-NR-AN-01 inhibe la actividad celular en células A375 positivas al marcador, como se midió por síntesis de proteínas.
La Figura 7D presenta gráficamente datos experimentales que muestran que el tratamiento "pulsado" de células in vitro con el conjugado terapéutico RA-NR-AN-01 no ejerció efectos inhibidores de larga duración sobre la actividad celular en células positivas al marcador, puesto que la síntesis de proteínas en las células 375 no se inhibió cuando se dejaron las células un período de recuperación de una noche antes del ensayo in vitro.
La Figura 8A presenta gráficamente datos experimentales que muestran que aunque el tratamiento "pulsado" de células in vitro con el agente RA libre era citotóxico no específico, el conjugado terapéutico RA-NR-AN-01 no ejerció efectos inhibidores de larga duración sobre la actividad celular en células del músculo liso vascular, como se puso de manifiesto por la actividad metabólica en células BO54 que se dejaron un período de recuperación de 48 horas antes del ensayo.
La Figura 8B representa gráficamente datos experimentales similares a los presentados en la Figura 8A anterior, pero usando un segundo tipo de células positivas al marcador, a saber, A375, los datos muestran que el tratamiento "pulsado" con el conjugado terapéutico RA-NR-AN-Q1 no ejerció efectos inhibidores de larga duración sobre la actividad celular, como se midió por la actividad metabólica en células A375 que se dejaron un período de recuperación de 48 horas antes del ensayo.
La Figura 8C representa gráficamente resultados similares a los presentados en la Figura 8A y la Figura 8B, anteriores, pero usando un tipo de célula control negativa al marcador, a saber HT29. Los resultados muestran que el tratamiento "pulsado" con el conjugado terapéutico RA-NR-AN-01 no ejerció efectos inhibidores de larga duración sobre la actividad celular de las células control negativas al marcador, como se midió por actividad metabólica en células HT29 que se dejaron un período de recuperación de 48 horas antes del ensayo.
La Figura 9A muestra la estenosis debida a proliferación de células del músculo liso de la capa íntima en una sección histológica de una arteria no tratada 5 semanas después de angioplastia en un modelo animal.
La Figura 9B muestra la inhibición de la estenosis en una sección histológica de una arteria tratada con conjugado terapéutico a las 5 semanas después de la angioplastia en un modelo animal.
La Figura 10A representa gráficamente datos experimentales que comparan la capacidad de inhibición de síntesis de proteínas y de síntesis de ADN de sumarina con respecto a células del músculo liso vascular.
La Figura 10B representa gráficamente datos experimentales que comparan la capacidad de inhibición de la síntesis de proteínas y la síntesis de ADN de estaurosporina con respecto a células del músculo liso vascular.
La Figura 10C representa gráficamente datos experimentales que comparan la capacidad de inhibición de la síntesis de proteínas y la síntesis de ADN de nitroglicerina con respecto a células del músculo liso vascular. La Figura 10D representa gráficamente datos experimentales que comparan la capacidad de inhibición de la síntesis de proteínas y la síntesis de ADN de citocalasina B con respecto a células del músculo liso vascular.
La Figura 11 muestra una sección tangencial paralela a la superficie interna de una célula de músculo liso que está aumentaba 62.500 veces y que está caracterizada por numerosas vesículas endocíticas, algunas de las cuales contienen microesferas de oro revestidas de anticuerpo en el proceso de ser internalizada por la célula in vitro.
La Figura 12 muestra una célula de músculo liso que está aumentada 62.500 veces y está caracterizada por una marcada acumulación de microesferas de oro en lisosomas a las 24 horas después de la exposición de la célula a las microesferas in vitro.
La Figura 13 muestra una célula de músculo liso que está aumentada 62.500 veces y está caracterizada por una marcada acumulación de microesferas de oro en lisosomas in vivo.
La Figura 14 representa un estudio de dosis-respuesta in vivo de los efectos de citocalasina B sobre el área de la luz de arterias femorales de cerdo.
La Figura 15 es un gráfico que representa la inhibición de la proliferación de células del músculo liso en vasos traumatizados en función del tiempo por citocalasina B (BC) o taxol (TAX) administrados en envueltas de silicona (SW).
La Figura 16 es un gráfico que representa la inhibición de proliferación de células del músculo liso en vasos traumatizados en función del tiempo por CB al 10% ó 30% peso/peso en SW o por TAX al 5% peso/peso en SW.
La Figura 17 es un gráfico que representa la inhibición de proliferación de células del músculo liso en vasos en función del tiempo por CB o TAX en silicona, CB en gel de colágeno soportado por una malla de colágeno bovino (CG-CM) o CB en un gel Pluronic soportado por una malla de colágeno bovino (PG-CW).
Descripción detallada de la invención Definiciones
"Conjugado terapéutico" significa una proteína de unión al músculo liso vascular o a una matriz intersticial acoplada (por ejemplo, opcionalmente a través de un resto engarce) con un inhibidor citoesquelético. Los conjugados terapéuticos usados conforme a la invención como se describen en la presente memoria se obtienen acoplando una proteína de unión al músculo liso vascular con un inhibidor citoesquelético. En el conjugado terapéutico, la proteína de unión al músculo liso vascular desempeña la función de dirigir el conjugado terapéutico a las células del músculo liso vascular o pericitos, y el inhibidor citoesquelético desempeña la función de inhibir la actividad celular o la proliferación de células del músculo liso vascular o pericitos.
"Agente terapéutico" tal y como se define en la presente memoria se refiere a un inhibidor citoesquelético.
"Diana" y "marcador" se usan de forma indistinta en la descripción de los presentes conjugados para referirse a una molécula reconocida de una forma específica por la matriz o proteína de unión al músculo liso vascular, por ejemplo, un antígeno, antígeno polipeptídico o carbohidrato de la superficie celular (por ejemplo, un glicolípido, glicoproteína o proteoglucano) que es expresado sobre las membranas de la superficie celular de una célula del músculo liso vascular o una estructura matricial.
"Epítopo" se usa para referirse a un sitio específico en la molécula "diana" que se une por la matriz o proteína de unión del músculo liso, por ejemplo, una secuencia de tres o más aminoácidos o sacáridos.
"Acoplado" se usa para referirse a una unión química covalente o no covalente (es decir, unión hidrófoba como la descrita por las fuerzas de Van der Walls o interacciones carga-carga) de la matriz o proteína de unión al músculo liso vascular con el agente terapéutico, incluyendo la formación de quelatos. Con preferencia, las proteínas de unión se asocian con los inhibidores citoesqueléticos por medio de enlaces covalentes.
"Engarce" se refiere a un resto que acopla la matriz o proteína de unión del músculo liso con un inhibidor citoesquelético, por ejemplo, como se obtiene de un agente de acoplamiento químico orgánico.
Tal y como se usa en la presente memoria, "sustancialmente" puro significa al menos aproximadamente 90%, preferiblemente al menos aproximadamente 98% y, más preferiblemente, al menos aproximadamente 99%, libre de contaminantes cuando se ensaya por procedimientos empleados convencionalmente por la técnica.
Tal y como se usa en la presente memoria, "sustancialmente" sólido o cristalino significa al menos aproximadamente 90%, preferiblemente al menos aproximadamente 98% y, más preferiblemente al menos aproximadamente 99%, exento de formas o fases no sólidas o no cristalinas cuando se ensaya por procedimientos empleados de forma convencional en la técnica.
"Migración" de células del músculo liso significa el movimiento de estas células in vivo desde la capa media de un vaso hacia la íntima, que puede estudiarse también in vitro siguiendo el movimiento de una célula de un sitio a otro (por ejemplo, usando cinematografía con intervalos de tiempo o un grabador de video y recuento manual de la migración de células del músculo liso desde un área definida de cultivo de tejido en el tiempo).
"Proliferación" significa un aumento en el número de células, es decir, por mitosis de las células. Tal y como se usa en la presente memoria, "células del músculo liso" no se refiere a células de músculo liso vascular neoplásicas, es de células cancerosas.
"Dispositivo implantable" se refiere a cualquier material que pueda ser retenido y liberar un inhibidor citoesquelético a modo de liberación del mismo in situ de una forma controlada a un vaso de mamífero. Un dispositivo implantable incluye dispositivos que se colocan en la luz del vaso, por ejemplo, un catéter permanente o endoprótesis vascular, o sobre el exterior de un vaso, por ejemplo, una envuelta adventicia, malla o cobertura, o que forman parte del propio vaso, por ejemplo para reemplazar una porción de un vaso enfermo o traumatizado, por ejemplo, un injerto sintético. El dispositivo implantable puede comprender el inhibidor citoesquelético en una forma que esté inmerso de forma liberable en y/o revestido sobre el dispositivo. El inhibidor citoesquelético también puede estar inmerso de forma liberable en y/o revestido sobre una matriz soporte liberable farmacéuticamente aceptable, que puede aplicarse en y/o estar inmersa en el dispositivo o administrarse directamente al vaso. Por ejemplo, una matriz útil en ciertas realizaciones de la invención incluye, aunque no queda limitada a, micropartículas, nanopartículas, un gel, una pasta, o una membrana permeable. Un dispositivo implantable se puede implantar por un período de tiempo limitado, por ejemplo, liberación de un inhibidor citoesquelético por un catéter o aguja de liberación por infusión, o por un período de tiempo prolongado, por ejemplo, una endoprótesis vascular o injerto. Los vasos, en los que se puede insertar el dispositivo implantable de la invención, incluyen, aunque no quedan limitados a los mismos, las arterias coronarias, femoral, carótida y periféricas.
"Anómalo, patológico o inapropiado" con respecto a la actividad o proliferación significa división, crecimiento o migración de células, pero no células cancerosas, que se produce más rápidamente o en un grado significativamente mayor que el producido de forma típica en una célula que funcione normalmente del mismo tipo o en lesiones no encontradas en tejido sano.
"Expresado" significa transcripción y traducción de ARNm con la síntesis, glicosilación y/o secreción resultante de un polipéptido por una célula, por ejemplo, CSPG sintetizada por una célula del músculo liso vascular o pericito.
"Remodelado vascular" significa una disminución del volumen, diámetro o área de la luz vascular que no es el resultado de engrosamiento o proliferación de células del músculo liso de la neoíntima y que se produce por lo general después de un traumatismo vascular por procedimientos quirúrgicos. Así, una reducción en el área ("constricción") circunscrita por la lámina o membrana elástica interna (IEL) sin una cantidad significativa de formación de neoíntima se denomina "remodelado vascular". Véase Isner, Circ., 89, 2937 (1994). El área de la sección transversal de la luz de un vaso se puede medir por planimetría directa, por ejemplo, por ultrasonidos intravasculares (IVUS) o en una autopsia. Tal y como se usa en la presente memoria, "remodelado vascular" no incluye el ensanchamiento compensatorio de un vaso que acompaña a la proliferación de neoíntima para adaptarse al aumento de la íntima. Este ensanchamiento compensatorio también se denomina remodelado vascular "positivo".
"Liberación sostenida" se refiere a una forma de dosificación diseñada para liberar un inhibidor citoesquelético desde la misma durante un período de tiempo de aproximadamente 0,0005 a aproximadamente 180, preferiblemente de aproximadamente 1 a 3 a aproximadamente 150 y, más preferiblemente, de aproximadamente 30 a aproximadamente 120 días. La liberación durante un período de tiempo mayor también se contempla como "liberación sostenida" en el contexto de la presente invención. Por otro lado, se contempla que los procedimientos descritos en la presente memoria se pueden llevar a la práctica con una forma de dosificación de liberación sostenida administrada por vía local o sistémica.
"Forma de dosificación" incluye una formulación que comprende un inhibidor citoesquelético libre (no asociado a diana o no asociado con una pareja de unión), así como una formulación de liberación sostenida que comprende un inhibidor citoesquelético. Por ejemplo, formulaciones de liberación sostenida pueden comprender micropartículas o nanopartículas, microemulsiones, materiales poliméricos biodegradables o no biodegradables, o cualquiera de sus combinaciones, que comprende un inhibidor citoesquelético dispersado en las mismas, así como formas cristalinas del inhibidor citoesquelético como se ha descrito antes. Una forma de dosificación asociada a una diana o a una pareja de unión incluye una formulación terapéutica de liberación sostenida que comprende micropartículas o nanopartículas, microemulsiones y/o materiales poliméricos biodegradables o no biodegradables. La forma de dosificación de liberación sostenida está unida a una o más proteínas o péptidos de unión, de forma que libere un inhibidor citoesquelético dispersado en la misma a una población de células diana que se une a la proteína o péptido de unión.
"Citocalasina" incluye un metabolito fúngico que presenta un efecto inhibidor sobre el metabolismo de la célula diana, incluyendo la prevención o migración de células del músculo liso vascular. Con preferencia, las citocalasinas inhiben la polimerización de actina monomérica (actina G) a la forma polimérica (actina F), inhibiendo de este modo las funciones celulares que requieren microfilamentos citoplásmicos. Las citocalasinas se obtienen de forma típica de fenilalanina (citocalasinas), triptofano (cetoglobosinas) o leucina (aspocalasinas), dando lugar a un grupo bencilo, indol-3-il metilo o isobutilo, respectivamente, en la posición C-3 de un resto perhidroisoindol-1-ona sustituido (Fórmula I o II).
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El resto perhidroisoindol contiene a su vez un anillo que contiene oxígeno o carbocíclico de 11-, 13- ó 14 átomos unido a las posiciones C-8 y C-9. Todas las citocalasinas de origen natural contienen un grupo metilo en C-5; un grupo metilo o metileno en C-12; y un grupo metilo en C-14 o C-16. Citocalasinas ejemplo incluyen citocalasina A, citocalasina B, citocalasina C, citocalasina D, citocalasina E, citocalasina F, citocalasina G, citocalasina H, citocalasina J, citocalasina K, citocalasina L, citocalasina M, citocalasina N, citocalasina O, citocalasina P, citocalasina Q, citocalasina R, citocalasina S, cetoglobosina A, cetoglobosina B, cetoglobosina C, cetoglobosina D, cetoglobosina E, cetoglobosina F, cetoglobosina G, cetoglobosina J, cetoglobosina K, desoxafomina, proxifomina, protofomina, zigosporina D, zigosporina E, zigosporina F, zigosporina G, aspocalasina B, aspocalasina C, aspocalasina D y similares, así como equivalentes funcionales y sus derivados. En las patentes japonesas números 72 01.925; 72 14.219; 72 08.533; 72 23.394; 72 01.924; y 72 04.164 se describen ciertos derivados de citocalasina.
La citocalasina B se usa en esta descripción como citocalasina típica.
Tal y como se usa en la presente memoria, "taxol" incluye taxol, así como sus análogos funcionales, equivalentes o derivados. Por ejemplo, derivados y análogos de taxol incluyen, aunque sin quedar limitados a los mismos, taxótero, bacatina, 10-desacetiltaxol, xilosil-10-desacetiltaxol, cefalomanina, 10-desacetil-7-epitaxol, 7-epitaxol, 10-desacetilbacatina III, 10-desacetilcefaolmanina y sus análogos o derivados descritos en Kingston et al. (New Trends in Nat. Prod. Chem., 26, 219 (1986)), Bringli et al. (documento WO 93/17121), Golik et al. (documento EPA 639577), Kelly et al. (documento WO 95/20582) y Cassady and Dourous (edit., En: Anticancer Agents Based on Natural Product Models, Academic Press, NY (1980)). Se conocen en la técnica también procedimientos para preparar taxol y numerosos análogos y derivados del mismo.
"Tricoteceno macrocíclico" se refiere a uno cualquiera de los grupos de micotoxinas macrocíclicas sesquiterpenoides estructuralmente relacionadas producidas por varias especies de hongos y caracterizadas por la estructura básica 12,13-epoxitricotec-9-eno, por ejemplo, verrucarinas y roridinas que son productos del metabolismo secundario en los hongos del suelo Myrothecium verrucaria y Myrothecium roridium.
Existen dos grandes clases de tricotecenos: los que tienen solo una estructura sesquiterpenoide central y los que tienen otro anillo macrocíclico adicional (tricotecenos sencillos y macrocíclicos, respectivamente). Los tricotecenos sencillos pueden subdividirse en tres grupos (es decir, Grupo A, B y C) como se describe en las patentes de Estados Unidos números 4.744.981 y 4.906.452 (incorporadas en la presente memoria como referencia). Ejemplos representativos de los tricotecenos sencillos del Grupo A incluyen: escirpeno, roridina C, dihidrotricoteceno, escirpen-4,8-diol, verrucarol, escirpentriol, T-2 tetraol, pentahidroxiescirpeno, 4-desacetilneosolaniol, tricodermina, desacetilcalonectrina, calonetricina, diacetilverrucarol, 4-monoacetoxiescirpenol, 4,15-diacetoxiescirpenol, 7-hidroxidiacetoxiescirpenol, 8-hidroxidiacetoxiescirpenol (neosolaniol, 7,8-dihidroxidiacetoxiescirpenol, 7-hidroxi-8-acetildiacetoxiescirpenol, 8-acetilneosolaniol, NT-1, NT-2, HT-2, T-2 y acetil T-2 toxina. Ejemplos representativos de los tricotecenos sencillos del Grupo B incluyen: tricotecolona, tricotecina, desoxinivalenol, 3-acetildesoxinivalenol, 5-acetildesoxinivalenol, 3,15-diacetildesoxinivalenol, nivalenol, 4-acetilnivalenol (fusarenon-X), 4,15-idacetilnivalenol, 4,7,15-triacetilnivalenol y tetraacetilnivalenol. Ejemplos representativos de los tricotecenos sencillos del Grupo C incluyen: crotocol y crotocina. Tricotecenos macrocíclicos representativos incluyen verrucarina A, verrucarina B, verrucarina J (Satratoxina C), roridina A, roridina D, roridina E (satratoxina D), roridina H, satratoxina F, satratoxina G, satratoxina H, vertisporina, mitoxina A, mitoxina C, mitoxina B, mirotoxina A, mirotoxina B, mirotoxina C, mirotoxina D, roritoxina A, roritoxina B y roritoxina D. Además, la estructura de anillo sesquiterpenoide "tricoteceno" general también está presente en compuestos denominados "bacarinas" aislados a partir de la planta superior Baccharis megapotamica, y estos se describen en la bibliografía, por ejemplo, se describen por Jarvis et al. (Chemistry of Alleopathy, ACS Symposium Series No. 268: ed. A.C. Thompson, 1984, págs. 149-159) y Jarvis & Mazzola (Acc. Chem. Res. 15:338-395, 1982)). Los tricotecenos también se producen por los hongos del suelo de la clase Fungi imperfecti (Bamburg, J.R. Proc. Molec. Subcell. Biol. 8:41-110, 1983)).
"Estaurosporina" incluye estaurosporina, un inhibidor de proteína quinasa C de la siguiente fórmula (III),
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así como los diindolalcaloides que tienen una de las siguientes estructuras generales:
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De forma más específica, el término "estaurosporina" incluye K-252 (véase, por ejemplo la solicitud de patente japonesa nº 62.164.626), BMY-41950 (patente de Estados Unidos nº 5.015.578), UCN-01 (Patente de Estados Unidos nº 4.935.415), TAN-999 (solicitud de patente japonesa nº 01.149.791), TAN-1030A (solicitud de patente japonesa nº 01.246.288), RK-286C (solicitud de patente japonesa nº 02.258.724) y equivalentes funcionales y derivados de los mismos. Los derivados de estaurosporina incluyen los descritos en las solicitudes de patente japonesa números 03.72.485; 01.143.877; 02.09.819 y 03.220.194, así como en las solicitudes internacionales PCT números WO 89 07.105 y WO 91 09.034 y las solicitudes de patente europea números EP 410.389 y EP 296.110. Se conocen derivados de K-252, un producto natural. Véase, por ejemplo, las solicitudes de patente japonesa números 63.295.988; 62.240.689; 61.268.687; 62.155.284; 62.155.285; 62.120.388 y 63.295.589, así como la solicitud internacional PCT nº WO 88 07.045 y la solicitud de patente europea nº EP 323.171.
Tal y como se cita en la presente memoria, células del músculo liso y pericitos incluyen las células derivadas de las capas medias de los vasos y adventicias que proliferan en sitios vasculares hiperplásicos de la íntima después de una lesión, tal como la causada durante PTCA. Las características de las células del músculo liso incluyen una morfología histológica (al examinarlas al microscopio óptico) de una forma de huso (fusiforme) con un núcleo alargado situado en el centro de la célula con nucleolos presentes y miofibrillas en el sarcoplasma. Al examinarlas al microscopio electrónico, las células del músculo liso tienen mitocondrias delgadas alargadas en el sarcoplasma yustanuclear, unos pocos elementos tubulares de retículo endoplásmico granular y numerosos grupos de ribosomas libres. También puede locarlizarse un complejo de Golgi cerca de un polo del núcleo. La mayor parte del sarcoplasma está ocupado por miofilamentos paralelos delgados que pueden estar, para la mayor parte, orientados a lo largo del eje mayor de la célula muscular. Estas miofibrillas que contienen actina pueden estar dispuestas en haces con mitocondrias interpuestas entre ellos. Dispersadas en la sustancia contráctil de la célula también puede haber áreas ovales densas, con áreas densas similares distribuidas a intervalos a lo largo de aspectos internos del plasmalema.
Las características de los pericitos incluyen una morfología histológica (al examinarlas al microscopio óptico) caracterizada por una forma celular irregular. Los pericitos se encuentran en la membrana basal que rodea a las células del endotelio vascular y su identidad se puede confirmar por inmunotinción positiva con anticuerpos específicos para actina del músculo liso alfa (por ejemplo, anticuerpos sml anti-alfa, Biomakor, Rehovot, Israel), HMW-MAA y antígenos gangliosido de pericito, por ejemplo, MAb 3G5 (Schlingemann et al., Am. J. Pathol., 136 1393-1405 (1990)); e inmunotinción negativa con anticuerpos frente a citoqueratinas (es decir, marcadores epiteliales y de fibroblastos) y factor de von Willdebrand (es decir, marcador endotelial). Tanto las células del músculo liso vascular como los pericitos son positivos por inmunotinción con anticuerpo monoclonal NR-AN-01.
Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "traumatismo vascular por un procedimiento quirúrgico" incluye los efectos de intervenciones quirúrgicas/mecánicas en la vasculatura de un mamífero, pero no incluye el traumatismo vascular debido a patologías vasculares orgánicas, es decir, enfermedades e infecciones.
Así, traumatismo vascular por procedimientos quirúrgicos dentro del alcance de los tratamientos a los cuales se pueden aplicar medicamentos, composiciones, kits y dispositivos de la invención incluyen (1) trasplante de órganos, tales como de corazón, riñón, hígado y similares, por ejemplo, que implican anastomosis de un vaso; (2) cirugía vascular, por ejemplo, cirugía de desviación coronaria, biopsia, reposición de una válvula cardiaca, aterectomía, trombectomía y similares; (3) terapias vasculares transcatéter (TVT) que incluyen angioplastia, por ejemplo, procedimientos de angioplastia con láser y PTCA, empleando catéteres de globo y catéteres permanentes; (4) injertos vasculares usando materiales naturales o sintéticos, tales como en los injertos de desviación coronaria con vena safena, injertos de dacron y venosos usados para reconstrucción arterial periférica, y similares; (5) colocación de una derivación mecánica, por ejemplo, una derivación de hemodiálisis de PTFE usadas para comunicaciones arteriovenosas; y (6) colocación de una endoprótesis intravascular, que puede ser metálica, plástica o de un polímero biodegradable. Véase la solicitud de patente de Estados Unidos número de serie 08/389.712, presentada el 15 de febrero de 1995. En H. Kambic et al., "Biomaterials in Artificial Organs", Chem. Eng. News, 30 (14 de abril, 1986), se puede encontrar una descripción general de dispositivos implantables y biomateriales de los cuales están formados.
Inhibidores citoesqueléticos de uso en la presente invención
Los inhibidores citoesqueléticos útiles en las formas de dosificación, medicamentos, kits y composiciones farmacéuticas de la invención que incluyen inhibidores citoesqueléticos que fijan biológicamente la luz de un vaso y/o reducen o inhiben el remodelado vascular y/o inhiben o reducen la proliferación de células del músculo liso vascular después de un traumatismo vascular por un procedimiento quirúrgico. Los inhibidores citoesqueléticos usados en las formas de dosificación, medicamentos, kit y composiciones farmacéuticas de la invención se seleccionan para inhibir una actividad celular de una célula del músculo liso vascular, por ejemplo, proliferación, migración, aumento del volumen celular, aumento en la síntesis de la matriz extracelular (por ejemplo, colágeno, proteuglucano y similares) o secreción de materiales de la matriz extracelular por la célula.
El agente terapéutico es un inhibidor citoesquelético y es con preferencia: a) un "agente citostático" que actúa previniendo o retardando la división celular en células en proliferación inhibiendo la replicación de DNA o inhibiendo la formación de fibras fusiformes y similares; b) un inhibidor de la migración de células del músculo liso vascular desde la pared de la capa media a la íntima, por ejemplo, un "agente antimigratorio", por ejemplo, una citocalasina; c) como un inhibidor del aumento intracelular en el volumen celular (es decir, el volumen de tejido ocupado por una célula; un "inhibidor citoesquelético"); d) un inhibidor que bloquea la síntesis de proteínas celulares y/o la secreción u organización de matriz extracelular (es decir, un "agente antimatriz"); o cualquiera de sus combinaciones.
Ejemplos representativos de "agentes citostáticos" incluyen, por ejemplo, toxinas modificadas, metotrexato, adriamicina, radionúclidos (por ejemplo, véase Fritzberg et al., patente de Estados Unidos nº 4.897.255), inhibidores de proteína quinasa (por ejemplo, estaurosporina), taxol o sus análogos (por ejemplo, taxótero), inhibidores de enzimas específicas (tales como enzima ADN topoisomerasa II y ADN polimerasa, ARN polimerasa, adenil guanil ciclasa), inhibidores de superóxido dismutasa, desosinucleotidil-transferasa terminal, transcriptasa inversa, oligonucleótidos antisentido que suprimen la proliferación de células del músculo liso y similares, que cuando se liberen a un compartimento celular en una dosis apropiada actuarán reduciendo la proliferación de una célula de músculo liso o pericito sin destruir la célula.
Ejemplos representativos de "agentes antimigración" incluyen inhibidores (es decir, agonistas y antagonistas, e inhibidores competitivos o no competitivos) de factores quimiotácticos y sus receptores (por ejemplo, quimiotaxinas del complemento tales como C5a, C5a desarg o C4a; factores de la matriz extracelular, por ejemplo fragmentos de degradación del colágeno), o de proteínas citoesqueléticas intracelulares implicadas en la locomoción (por ejemplo, actina, elementos citoesqueléticos y fosfatasas y quinasas implicadas en la locomoción). Ejemplos representativos incluyen ácido cafeico y derivados y nilvadipina (un antagonista del calcio) y hormonas esteroideas. Agentes terapéuticos antimigratorios preferidos son las citocalasinas.
Ejemplos representativos de "inhibidores citoesqueléticos", un subgrupo de agentes citostáticos, incluyen colchicina, vinblastina, citocalasinas, taxol o análogos o derivados de los mismos que actúan sobre las redes de microtúbulos y microfilamentos en el interior de la célula. Inhibidores citoesqueléticos preferidos incluyen citocalasina B y taxol.
Ejemplos representativos de "agentes antimatriz" incluyen inhibidores (es decir, agonistas y antagonistas e inhibidores competitivos y no competitivos) de la síntesis, secreción y ensamblaje de la matriz, reticulación organizacional (por ejemplo (reticulación de colágeno con transglutaminasas) y remodelado de matriz (por ejemplo, después de la cicatrización de heridas). Un ejemplo representativo en esta categoría de agentes antimatriz es colchicina, un inhibidor de la secreción de matriz extracelular. Otro ejemplo es tamoxifeno, para el cual existen evidencias con respecto a su capacidad para organizar y/o estabilizar, así como disminuir, la proliferación de células del músculo liso después de una angioplastia. La organización y estabilización pueden derivarse del bloqueo de la maduración de células del músculo liso vascular en la forma que prolifera patológicamente.
Identificación de inhibidores citoesqueléticos útiles en la práctica de la invención
La identificación de inhibidores citoesqueléticos útiles en la práctica de la invención se puede determinar por procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un inhibidor citoesquelético que entra dentro del alcance de la invención como se describe en la presente memoria presenta una o más de las siguientes características. El inhibidor citoesquelético:
(i)
origina la retención de un área, diámetro o volumen de la sección transversal expandida de un vaso después de angioplastia (por ejemplo, PTCA, angioplastia percutánea transluminal (PTA) o similar) u otros traumatismos, incluyendo aterectomía (por ejemplo, dispositivo rotatorio de corte, láser y similar), procedimientos de desviación de arterias coronarias y similares;
(ii)
facilita un aumento inicial en el área, diámetro o volumen de la sección transversal luminal que no origina o acentúa estenosis crónica de la luz;
(iii)
inhibe la contracción o migración de células diana; y
(iv)
es citostático.
Procedimientos para medir el área, diámetro o volumen de la sección transversal luminal incluyen, aunque sin quedar limitados a los mismos, evaluación por ultrasonidos, visualización fluoroscópica, exploración endoscópica con fibra óptica o biopsia e histología.
Con preferencia, un inhibidor citoesquelético empleado en la presente memoria tendrá las cuatro propiedades; sin embargo, la primea y tercera son por lo general más importantes que la segunda y la cuarta para la práctica de la presente invención en los procedimientos descritos antes. Se encontró que la administración de citocalasina B puede tener un efecto de fijación biológica de la luz de un vaso. El efecto de fijación biológica de la luz de un vaso se puede conseguir usando una infusión simple del agente terapéutico en la región traumatizada de la pared del vaso en una concentración de dosis que varía de aproximadamente 0,1 microgramos/ml a aproximadamente 10,0 microgramos/ml (Ejemplo 16).
En el caso de inhibidores citoesqueléticos que presentan propiedades antimigratorias o antimatriz, se pueden usar la migración y adherencia celular en ensayos in vitro, respectivamente, para determinar la concentración a la cual se alcanzará una dosis terapéuticamente eficaz en el espacio de fluido en la pared del vaso creado por un catéter de infusión.
Un inhibidor citoesquelético útil en las realizaciones de liberación sostenida de la presente invención presenta una o más de las siguientes características. El inhibidor citoesquelético:
(i)
origina la retención de un diámetro o área de la sección transversal luminal expandida después de angioplastia (por ejemplo, PTCA, angioplastia percutánea transluminal (PTA) o similar) u otro traumatismo incluyendo aterectomía (por ejemplo, dispositivo rotatorio de corte, láser y similares), procedimientos de desviación de arterias coronarias o similares;
(ii)
inhibe la proliferación de células diana (por ejemplo, después de exposiciones de 5 minutos y 24 horas al agente, cultivos de tejido de músculo liso vascular in vitro demuestran un nivel de inhibición de recaptación de ^{3}H-timidina y, preferiblemente, presentan una inhibición relativamente menor de recaptación de ^{3}H-leucina);
(iii)
en una dosis suficiente para inhibir la síntesis de ADN, produce solo efectos citotóxicos morfológicos de leves a moderados (por ejemplo grado 2 ó 3 en los ensayos descritos a continuación);
(iv)
inhibe la contracción de células diana; y
(v)
es citostático.
Tras la identificación de un inhibidor citoesquelético útil que presenta una o más de las propiedades anteriores, el inhibidor citoesquelético se somete a un segundo protocolo de ensayo que implica exposición más prolongada de células del músculo liso vascular (CMLV) al inhibidor citoesquelético. Por ejemplo, un inhibidor útil en las realizaciones de liberación sostenida de la presente invención también presenta las siguientes características:
(i)
tras la exposición de larga duración (por ejemplo 5 días), el inhibidor produce el mismo efecto in vitro o similar sobre la síntesis de ADN en cultivo de tejido de músculo liso vascular y síntesis de proteínas, que el descrito antes para las exposiciones de 5 minutos y 24 horas; y
(ii)
en una dosis eficaz en el ensayo in vitro de larga duración para la inhibición de síntesis de ADN, el inhibidor presenta efectos citotóxicos morfológicos de leves a moderados durante el período de tiempo mayor (por ejemplo 10 días).
Se lleva a cabo una evaluación posterior de agentes antiproliferación potencialmente útiles en un modelo de arteria femoral de cerdo traumatizada por un globo in vivo. Con preferencia, estos agentes demuestran una inhibición igual o superior al 50% de la proliferación celular en las células de músculo liso vascular de la túnica media, como se indica por un "marcaje rápido con BRDU" antes de la recolección de tejido y evaluación histológica (Ejemplo 13). Si un inhibidor es eficaz en este ensayo para inhibir la proliferación de músculo liso de la íntima en un 50% o más con una única exposición, no requiere administración en una forma de dosificación de liberación sostenida.
Los inhibidores se evalúan para la liberación sostenida si la toxicidad sistémica e índice terapéutico potencial parecen permitir la administración intravenosa para conseguir el umbral de inhibición del 50% o si el inhibidor es idóneo para administración local en las células del músculo liso vascular mediante la liberación sostenida en una dosis antiproliferativa eficaz. Con preferencia, los inhibidores antiproliferativos útiles en la práctica de la presente invención reducen la estenosis vascular en un 50% en arterias femorales de cerdo traumatizadas por un globo y, más preferiblemente, reducen la estenosis vascular en un grado similar en arterias coronarias de cerdo.
La inhibición de proliferación celular (es decir, síntesis de ADN) es la característica principal de los inhibidores útiles en formas de dosificación de liberación sostenida. Por ejemplo, un inhibidor citoesquelético preferido presenta una diferencia entre la recaptación de ^{3}H-leucina y ^{3}H-timidina de modo que pueda administrarse en dosis citostáticas. Por otro lado estudios citotóxicos indican que la exposición prolongada a los inhibidores citoesqueléticos no tendrá un impacto adverso sobre las células diana. Además, el tratamiento pulsado con BRDU indica que el inhibidor citoesquelético es eficaz para inhibir la proliferación de células diana. Sin embargo, de forma alternativa se puede emplear cualquier procedimiento conveniente para evaluar la capacidad de un inhibidor citoesquelético de inhibir la proliferación celular.
Formas de dosificación de liberación sostenida
Realizaciones de formas de dosificación de liberación sostenida de la invención pueden comprender micropartículas, nanopartículas o microemulsiones que tienen un inhibidor citoesquelético dispersado en las mismas o pueden comprender el inhibidor citoesquelético en forma sólida pura, preferiblemente cristalina. Para la administración por liberación sostenida, se prefieren las formas de dosificación en micropartículas que comprenden inhibidores citoesqueléticos puros, preferiblemente cristalinos como se han descrito antes en la memoria. Las formas de dosis terapéuticas pueden estar en cualquier configuración adecuada para liberación sostenida. Las formas de dosificación terapéutica de liberación sostenida preferidas presentan una o más de las siguientes características:
- micropartículas (por ejemplo, de aproximadamente 0,01 micrómetros a aproximadamente 200 micrómetros de diámetro, preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50 micrómetros y, más preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 micrómetros) o nanopartículas (por ejemplo, de aproximadamente 0,01 nanómetros a aproximadamente 1000 nanómetros de diámetro, preferiblemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 nanómetros), estructura de polvo fluido que comprende cristales o microcristales,
- estructura biodegradable diseñada para biodegradarse durante un período de tiempo preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 180 días, preferiblemente de aproximadamente 1 a 3 días a aproximadamente 150 días o estructura no biodegradable que permite que se produzca la difusión de agente terapéutico durante un período de tiempo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 180 días, más preferiblemente de aproximadamente 30 a aproximadamente 120 días;
- biocompatible con el tejido diana y el entorno fisiológico local en el que se administra la forma de dosificación, incluyendo proporcionar productos biocompatibles de degradación;
- facilitar una dispersión estable y reproducible del inhibidor citoesquelético en las mismas, preferiblemente para formar una matriz inhibidor citoesquelético-polímero produciéndose la liberación del inhibidor citoesquelético por una o ambas de las siguientes vías: (1) difusión del inhibidor citoesquelético a través de la forma de dosificación (cuando el inhibidor citoesquelético es soluble en la mezcla de polímero conformada que define las dimensiones de la forma de dosificación); o (2) la liberación del inhibidor citoesquelético en la forma de dosificación se biodegrada; y/o
- para formas de dosificación dirigidas a diana que tienen, preferiblemente, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10.000 enlaces de proteínas/péptidos de unión a la forma de dosificación y más preferiblemente, un máximo de aproximadamente 1 enlace de péptido de unión a la forma de dosificación por 150 Angstron cuadrados de área superficial de partículas. El número total de enlaces proteína/péptido de unión a la forma de dosificación depende del tamaño de partículas usado. Las proteínas o péptidos de unión pueden acoplarse a las partículas de la forma de dosificación terapéutica a través de las modalidades de ligandos covalentes tipo sandwich o no covalentes como se describe en la presente memoria.
Las formas de dosificación terapéuticas de liberación sostenida en nanopartículas son preferiblemente biodegradables y, opcionalmente, se unen a las células del músculo liso vascular y entran en dichas células, principalmente por endocitosis. La biodegradación de las nanopartículas se produce en el tiempo (por ejemplo de 30 a 120 días) en vesículas prelisosómicas y lisosomas. Realizaciones de formas de dosificación terapéuticas en micropartículas de mayor tamaño preferidas de la presente invención liberan los inhibidores citoesqueléticos para una posterior recaptación de células diana entran en la célula diana solo una pequeña cantidad de las micropartículas de menor tamaño. Un experto en la técnica apreciará que el mecanismo preciso por el cual una célula diana asimila y metaboliza una forma de dosificación de la presente invención depende de la morfología, fisiología y procesos metabólicos de dichas células. El tamaño de las formas de dosificación terapéuticas de liberación sostenida en partículas también es importante con respecto al modo de asimilación celular. Por ejemplo, las nanopartículas de menor tamaño pueden fluir con el fluido intestinal entre las células y penetrar en el tejido primario infundido y, así son útiles para liberar inhibidores citoesqueléticos antiproliferativos.
Como alternativa, las realizaciones de forma de dosificación de liberación sostenida pueden comprender una emulsión o microemulsión que tiene un inhibidor citoesquelético dispersado en la misma. Por lo general, las microemulsiones se definen como dispersiones isotrópicamente transparentes termodinámicamente estables de dos líquidos inmiscibles estabilizados por películas interfaciales de moléculas superficialmente activas. Las microemulsiones se pueden formar de forma espontánea. La formación de microemulsiones normalmente conlleva una combinación de tres a cinco componentes, a saber, un aceite, agua, un tensioactivo, un tensioactivo complementario y un electrolito. En general, todas las emulsiones farmacéuticas diseñadas para administración parenteral son del tipo aceite en agua (o/w). Una microemulsión de fármaco parenteral puede ser útil para liberar fármacos poco solubles en agua, estabilización de compuestos hidrolíticamente sensibles, reducción de la irritación de, o toxicidad de fármacos administrados por vía intravenosa, preparación de formas de dosificación de liberación sostenida y liberación dirigida de fármacos a diversos órganos.
La tendencia a formar una microemulsión agua en aceite (w/o) o aceite en agua (o/w) se ve influenciada por las propiedades del aceite y del tensioactivo. Los tensioactivos se clasifican convenientemente en base a una escala experimental conocida como equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) que va de 1 a 20. El concepto de valor HLB y la determinación del mismo para tensioactivos se describe por Milton J. Rosen en "Surfactants & Interfacial Phenomena", J. Wiley & Sons, New York, NY, 1978, páginas 242-245 o por Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3ª Edición, Vol. 8, 1979, en las páginas 910-915.
En general, se forman microemulsiones (w/o) usando dos tensioactivos (o emulsionantes) que tienen un valor HLB en el intervalo de aproximadamente 3 a 6 mientras que las microemulsiones (o/w) se forman usando tensioactivos que tienen un valor HLB en el intervalo de aproximadamente 8 a 18. Se conoce desde hace tiempo que la tensión interfacial contribuye a la estabilidad termodinámica de las microemulsiones. Para conseguir esto, el tensioactivo presenta preferiblemente baja solubilidad en las fases oleosa y acuosa, y preferiblemente se absorbe en la interfase agua-aceite con una reducción simultánea de la tensión interfacial. Cuando la tensión interfacial es menor que 2 x 10^{-6} N/m, se puede formar una microemulsión estable. En Bhargava et al., Pharm. Tech., 46-53, marzo de 1987 y Kahlweit, Science, 240, 617-621, 1988 se proporcionan revisiones generales de microemulsiones.
Las microemulsiones son de forma típica sustancialmente no opacas, es decir, son transparentes u opalescentes cuando se ven al microscopio óptico. En estado no alterado, éstas son ópticamente isotrópicas (no birefringentes) cuando se ven con luz polarizada. La fase dispersada comprende de forma típica partículas o gotitas que normalmente tienen un tamaño de 5 a 200 nm y esto da lugar a su transparencia óptica. Estas partículas pueden ser esféricas aunque son posibles otras estructuras.
La función del tensioactivo común, normalmente un alcohol de cadena corta, es aumentar la fluidez interfacial penetrando la película de tensioactivo y por consiguiente creando una película desordenada debido al espacio de huecos entre las moléculas de tensioactivo. Sin embargo, el uso de un tensioactivo común en microemulsiones es opcional y se han descrito emulsiones y microemulsiones autoemulsionantes exentas de alcohol (véase, por ejemplo Pouton et al., Int. Journal of Pharmaceutics, 27, 335-348, 1985 y Osborne et al., J. Disp. Sci. Tech., 9, 415-423, 1988).
Hay muchas ventajas de usar una microemulsión con respecto a una emulsión convencional (o macroemulsión) para el transporte (liberación) de un fármaco. Las microemulsiones se pueden formar de forma espontánea, sin necesidad de un alto aporte de energía y son por tanto fáciles de preparar y del aumento de escala a aplicaciones comerciales; tienen estabilidad termodinámica debido a su menor tamaño de partículas y, por tanto, tienen una larga vida de almacenamiento útil. Tienen una apariencia isotrópicamente transparente de modo que se pueden controlar por medios espectroscópicos. Tienen una viscosidad relativamente baja y, por tanto, son fáciles de transportar y mezclar. También tienen un área interfacial alta que acelera las reacciones en superficie. Tienen una baja tensión interfacial que permite flexibilidad y alto poder de penetración. También, ofrecen la posibilidad de mejorar la solubilización del fármaco y la protección contra la hidrólisis enzimática. Por otro lado, las microemulsiones pueden sufrir una inversión de fase tras la adición de un exceso de la fase dispersada o como respuesta a un cambio de temperatura y esta es una propiedad de estos sistemas que puede afectar a la liberación de fármaco desde las microemulsiones tanto in vitro como in vivo.
El término "aceite" se usa en la presente memoria en un sentido general para identificar una gran clase de sustancias de origen mineral, vegetal, animal, esencial, sintético o comestible, siempre que dichas sustancias sean farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, aceites útiles para preparar microemulsiones son ésteres de ácidos trigrasos de glicerol que tienen de aproximadamente 9 a 83, más preferiblemente, de aproximadamente 21 a 60 y, más preferiblemente, de aproximadamente 21 a 45 átomos de carbono. Triglicéridos preferidos son triglicéridos de cadena corta (9 a 15 átomos de carbono) y de cadena media (21 a 45 átomos de carbono). Así, los triésteres de glicerol incluyen aceites comestibles naturales como aceites de cánola, maíz, oliva, girasol y coco, los ésteres decanoicos y aceites químicamente sintetizados, por ejemplo, triacetina, 1-oleil-2,3-diacetil glicerol y similares.
Los alcoholes que son útiles en microemulsiones incluyen, aunque sin quedar limitados a los mismos; propilenglicol (como CH_{2}OH-CH_{2}-CH_{2}OH y/o CH_{3}-CHOH-CH_{2}OH); glicerol; azúcares mono- y disacáridos C_{5}-C_{12}, por ejemplo, dextrosa, sacarosa, fructosa, en forma pura o en otras formas, por ejemplo, melazas, azúcar moreno, azúcar inverso, sirope refinado, sirope de maíz; y alcoholes azúcares tales como sorbitol, xilitol y manitol. Los alcoholes se pueden usar de forma individual o como mezclas de dos o más. Por otro lado, estos alcoholes son preferentemente solubles en agua más que en los aceites con los que se usan.
Los tensioactivos que pueden ser útiles para preparar microemulsiones incluyen los tensioactivos iónicos y no iónicos que son útiles en productos ingeribles por vía oral, destinados al uso por seres humanos, por ejemplo, alimentos, bebidas, pastelería, fármacos y dentífricos. La selección de tensioactivos para usar con un aceite particular depende del valor HLB (equilibrio hidrófilo-lipófilo) de los tensioactivos.
Diversos tensioactivos iónicos (aniónicos) incluyen ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, éster monoglicérido del ácido diacetiltartárico, éster diglicérido del ácido diacetiltartárico, éster monoglicérido del ácido cítrico, y sus sales, éster diglicérido de ácido cítrico, éster monoglicérido del ácido láctico, éster diglicérido del ácido láctico, éster dioctil sulfosuccinato sódico del ácido fosfórico, éster diglicérido del ácido fosfórico, lecitina, lecitina hidroxilada. Diversos tensioactivos no iónicos incluyen polisorbatos, ésteres de sorbitán del ácido mirístico, ésteres de sorbitán del ácido palmítico, ésteres de sorbitán del ácido esteárico, ésteres de sorbitán del ácido oleico, ésteres de poliglicerol del ácido mirístico, ésteres de poliglicerol del ácido palmítico, ésteres de poliglicerol del ácido esteárico, ésteres de poliglicerol del ácido oleico, éster monoglicérido del ácido mirístico, éster monoglicérido del ácido palmítico, éster monoglicérido del ácido esteárico, éster monoglicérido del ácido oleico, éster diglicérido del ácido mirístico, éster diglicérido del ácido palmítico, éster diglicérido del ácido esteárico, éster diglicérido del ácido oleico, (etoxi)_{n}-monoglicérido del ácido mirístico, (etoxi)_{n}-monoglicérido del ácido palmítico, (etoxi)_{n}-monoglicérido del ácido esteárico, (etoxi)_{n}-monoglicérido del ácido oleico, en los que n es un número entero de 10 a 30, (etoxi)_{n}-diglicérido del ácido mirístico, (etoxi)_{n}-diglicérido del ácido palmítico, (etoxi)_{n}-
diglicérido del ácido esteárico, (etoxi)_{n}-diglicérido del ácido oleico, en los que n es un número entero de 10 a 30, éster de sacarosa del ácido mirístico, éster del ácido palmítico, éster del ácido esteárico, éster del ácido oleico, éster propilenglicol del ácido mirístico, éster del ácido palmítico, éster del ácido esteárico y éster del ácido oleico.
Por otro lado, se pueden usar cualquiera de las sales convencionales de derivados superficialmente activos, con la condición por supuesto de que sean farmacéuticamente aceptables. Un experto en la técnica puede seleccionar una sal o derivado particular llevando a cabo ensayos de rutina, si fuera necesario. en particular, son típicas de tales compuestos las sales de metales alcalinos y los derivados taurocolato.
Un tensioactivo no iónico incluye preferiblemente un condensado de óxido alcalino de un compuesto orgánico que contiene uno o más grupos hidroxilo. Por ejemplo, están disponibles corrientemente alcoholes etoxilados y/o propoxilados o éster o mezclas de los mismos y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Tensioactivos adecuados incluyen, aunque sin quedar limitados a los mismos TYLOXAPOL; POLOXAMER 4070; POLOXAMER 188; estearato de POLYOXYL 40; POLYSORBATE 80 y POLYSORBATE 20, así como los diversos compuestos comercializados con el nombre comercial TWEEN (ICI America, Inc., Wilmington, Del., Estados Unidos) y PLURONIC F-68 (marca comercial de BASF, Ludwigshafen, Alemania para un copolímero de polioxietileno y polioxipropileno).
Algunos ejemplos específicos de tensioactivos útiles en la invención pueden incluir, sales biliares, colato sódico, una mezcla de monocetiléter de etilenglicol 1000 al 80% en peso y etilenglicol 400 al 20% en peso y polioxietilenéter. La cantidad de tensioactivo en la invención varía de 5 a 10% en peso de la cantidad total de material de la envuelta y cápsula. Si la cantidad de tensioactivo es menor que 0,5% en peso, no se podrá formar la emulsión.
Composiciones farmacéuticas que comprenden una microemulsión comprenden también preferiblemente un conservante, por ejemplo metil-, etil-, propil- y butilparabeno que son médicamente aceptados para administración parenteral. No obstante, puede que no sean necesarios conservantes si las composiciones pueden esterilizarse en autoclave sin reducir esencialmente su estabilidad. Si se desea, las composiciones farmacéuticas o medicamentos de la presente invención también pueden comprender un regulador de la presión osmótica tal como manitol o glicerina, siendo preferida la glicerina para administración parenteral y el manitol para administración oral. Las composiciones de la presente invención también pueden comprender un antioxidante, por ejemplo \alpha-tocoferol.
La preparación de microemulsiones es bien conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, Wolf et al. (patente de Estados Unidos nº 4.835.002); Lee et al. (patente de Estados Unidos nº 5.362.424); Benita et al. (patente de Estados Unidos nº 5.364.632); Owen et al. (documento WO 94/08604): Constantinides (documento WO 94/08605); Constantinides et al. (documento WO 94/19000); Constantinides et al. (documento WO 94/190001); y Constantinides et al. (documento WO 94/19003).
Microemulsiones preferidas para usar en la invención se describen en la patente de Estados Unidos nº 5.478.860, patente de Estados Unidos nº 4.389.330 y patente de Estados Unidos nº 5.407.609.
Realizaciones de formas de dosificación de liberación sostenida preferidas de la presente invención comprenden micropartículas o nanopartículas biodegradables. Más preferiblemente, las micropartículas o nanopartículas biodegradables de forman de una matriz que contiene polímero que se biodegrada por escisión al azar, no enzimática, hidrolítica liberando el inhibidor citoesquelético, formando de este modo poros en la estructura en partículas.
Se prefieren polímeros derivados de la condensación de ácidos \alpha-hidroxicarboxílicos y lactonas relacionadas. Un resto particularmente preferido se forma de una mezcla de poliésteres termoplásticos (por ejemplo, polilactida o poliglicolida) o un copolímero de componentes lactida y glicolida, tales como poli(lactida-co-glicolida). A continuación se muestra una estructura ejemplo, una poli(DL-lactida-co-glicolida) al azar, siendo los valores de x e y manipulables por un experto en la técnica para conseguir propiedades de micropartículas o nanopartículas deseables.
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Otros agentes adecuados para formar formas de dosificación en partículas incluyen poliortoésteres y poliacetales (Polymer Letters, 18:293 (1980) y poliortocarbonatos (patente de Estados Unidos nº 4.093.709) y referencias similares.
Las partículas de matriz que contiene polímero de ácido láctico/ácido glicólico se preparan por procesos basados en emulsión, que constituyen procesos de extracción de disolvente modificados, véase, por ejemplo procesos descritos por Cowsar et al., "Poly(Lactide-Co-Glycolide) Microcapsules for Controlled Release of Steroids", Methods Enzymology, 112:101-116, 1985 (atrapar esteroides en micropartículas); Eldridge et al., "Biodegradable and Biocompatible Poly(DL-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres as an Adjuvant for Staphylococcal Enterotoxin B Toxoid Which Enhances the Level of Toxin Neutralizing Antibodies", Infection and Immunity, 59:2978-2986, 1991 (atrapar toxoides); Cohen et al., "Controlled Delivery Systems for Proteins Based on Poly(Lactic/Glycolic Acid) Microspheres", Pharmaceutical Research, 8(6):713- 720, 1991 (atrapar enzimas); y Sanders et al., "Controlled Release of a Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Analogue from Poly(D,L-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres", J. Pharmaceutical Science, 73(2)1294-1297, 1984 (atrapar péptidos).
En general, el procedimiento para formar formas de dosificación en partículas implica disolver el polímero en un disolvente hidrocarbonado halogenado, dispersar una solución de inhibidor citoesquelético en el mismo (preferiblemente acuosa) y añadir un otro agente que actúe como disolvente para el disolvente hidrocarbonado halogenado pero no para el polímero. El polímero precipita en la solución de hidrocarburo halogenado-polímero sobre gotitas del inhibidor citoesquelético que contienen solución y atrapa al inhibidor citoesquelético. Con preferencia, el inhibidor citoesquelético está prácticamente dispersado de forma uniforme en la realización de forma de dosificación de liberación sostenida de la presente invención. Después de formar las partículas, éstas se lavan y endurecen con un disolvente orgánico. Siguen etapas de lavado con agua y tensioactivo no iónico acuoso, antes de secar a temperatura ambiente a vacío.
A efectos de biocompatibilidad, las formas de dosificación en forma de partículas, caracterizadas por un inhibidor citoesquelético dispersado en la matriz de las partículas, se esterilizan antes de envasar, almacenar o administrar. La esterilización se puede llevar a cabo de cualquier forma conveniente para la misma. Por ejemplo, se pueden irradiar las partículas con radiación gamma, con tal que la exposición de dicha radiación no afecte de forma adversa a la estructura o función del inhibidor citoesquelético dispersado en la matriz de inhibidor citoesquelético-polímero de la proteína/péptido de unión unido a la misma. Si el inhibidor citoesquelético o proteína/péptido de unión se ve afectado de modo adverso, las formas de dosificación en partículas se pueden producir en condiciones estériles.
La liberación del inhibidor citoesquelético de las realizaciones de forma de dosificación en partículas de la presente invención se puede producir como resultado de difusión y erosión de la matriz de partículas. La velocidad de biodegradación afecta directamente a la cinética de liberación del inhibidor citoesquelético. La velocidad de biodegradación se puede regular alterando la composición o estructura de la forma de dosificación de liberación sostenida. Por ejemplo, se puede realizar la alteración de la relación de lactida/glicolida como se describe por Tice et al., "Biodegradable Controlled-Release Parenteral Systems", Pharmaceutical Technology, páginas 26-35, 1984; por inclusión de agentes que alteren la velocidad de hidrólisis polimérica, tal como ácido cítrico y carbonato sódico, como se describe por Kent et al., "Microencapsulation of Water Soluble Active Polypeptides", patente de Estados Unidos nº 4.675.189; alterando la carga de inhibidor citoesquelético en el polímero de lactida/glicolida, siendo la velocidad de degradación inversamente proporcional a la cantidad de inhibidor citoesquelético contenida en el mismo, por selección cuidadosa de un análogo apropiado de una familia común de inhibidores citoesqueléticos que presenten potencias diferentes de modo que se alteren dichas cargas del núcleo; y variando el tamaño de partículas, como se describe por Beck et al., "Poly(DL-Lactide-Co-Glycolide)/Norethisterone Microcapsules: An Injectable Biodegradable Contraceptive", Biol-Reprod., 28:186-195, 1983, o similares. Todos los procedimientos citados antes de regulación de la velocidad de biodegradación influyen en la viscosidad intrínseca de la matriz que contiene polímero, alterando de este modo la velocidad de hidratación de la misma.
La estructura de lactida/glicolida preferida es biocompatible con el entorno fisiológico de los mamíferos. Además, estas formas de liberación sostenida preferidas tienen la ventaja de que su biodegradación forma ácido láctico y ácido glicólico, ambos productos normales en el metabolismo de mamíferos.
Grupos funcionales requeridos para la unión de proteínas/péptidos a la forma de dosificación en partículas se incluyen opcionalmente en o sobre la matriz de partículas y están unidos a las unidades poliméricas no degradables o biodegradables. Grupos funcionales que son útiles para este fin incluyen los que son reactivos con péptidos, por ejemplo, grupos carboxilo, grupos amino, grupos sulfhidrilo y similares. Los restos preferidos que potencian la unión incluyen los grupos carboxilo terminal de la matriz que contiene polímero preferida (lactida-glicolida) o similares.
Inhibidores citoesqueléticos útiles en las realizaciones de forma de dosificación de liberación sostenida de la presente invención son los que inhiben la actividad de células del músculo liso vascular sin destruir las células (es decir, inhibidores citoesqueléticos citostáticos). Un inhibidor citoesquelético citostático también se puede definir como un resto capaz de inhibir una o más actividades patológicas de las células diana durante un tiempo suficiente para conseguir un beneficio terapéutico. Así, los inhibidores citoesqueléticos preferidos presentan una o más de las siguientes capacidades: inhibición de la síntesis de ADN antes que la inhibición de la síntesis de proteínas, o inhibición de la migración de células del músculo liso vascular a la íntima. Estos inhibidores citoesqueléticos no inhiben de forma significativa la síntesis de proteínas (es decir, no destruyen las células diana) y, por tanto, facilitan la reparación celular y producción de matriz, que a su vez actúa estabilizando la lesión en la pared vascular causada por angioplastia, reduciendo la proliferación de células de músculo liso.
Inhibidores citoesqueléticos preferidos son citocalasinas, por ejemplo, citocalasina B (Sigma Chemical Co.) y taxol, o análogos o equivalentes funcionales del mismo. Estos compuestos son citostáticos y han demostrado ejercer una inhibición mínima de síntesis de proteínas y citotoxicidad en concentraciones a las cuales se produce una inhibición significativa de la síntesis de ADN (véase el Ejemplo 8 y las Figuras 10A a 10D). Por ejemplo, en el Ejemplo 9 se muestra un protocolo útil para identificar inhibidores citoesqueléticos útiles en realizaciones de formas de dosificación de liberación sostenida de la presente invención.
Para ilustrar, un inhibidor citoesquelético, por ejemplo citocalasina B, se incorpora en micropartículas de poli(DL-lactida-coglicolida) biodegradables o en nanopartículas. Las micropartículas tienen un diámetro de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 \mum, preferiblemente de 4 \mum a aproximadamente 15 \mum y, más preferiblemente, de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 \mum. Las nanopartículas tienen diámetros de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 nanómetros, preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 250 nanómetros y, más preferiblemente, de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 nanómetros. Las micropartículas o nanopartículas que comprenden el inhibidor citoesquelético se pueden introducir además en, o sobre un dispositivo implantable, por ejemplo, en un revestimiento de endoprótesis vascular, o liberarse en un vehículo líquido adecuado por un dispositivo implantable, por ejemplo, mediante un catéter de infusión. Con preferencia, la forma de dosificación de liberación sostenida es biodegradable y, con preferencia, se biodegrada durante aproximadamente 30 a 120 días. La forma de dosificación de liberación sostenida se administra preferiblemente durante el traumatismo vascular debido a un procedimiento quirúrgico.
Una forma de dosificación de liberación sostenida preferida de la invención comprende micropartículas biodegradables, preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 \mum de diámetro, que son compatibles con el tejido y compatibles físicamente con un dispositivo implantable, por ejemplo, un catéter de infusión con aguja o un catéter de microinfusión. Otra forma de dosificación de liberación sostenida preferida de la invención comprende nanopartículas biodegradables, preferiblemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 nanómetros de diámetro, que son compatibles con el tejido y compatibles físicamente con un dispositivo implantable, por ejemplo un catéter de infusión con aguja o un catéter de microinfusión. Para liberar la formas de dosificación de liberación sostenida con catéter, los tamaños de hueco de catéter son preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 8 micrómetros, más preferiblemente, de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,8 micrómetros de diámetro.
La concentración celular del inhibidor citoesquelético que se alcanza en la túnica media y/o íntima del vaso tratado es eficaz para inhibir la proliferación y migración de células del músculo liso vascular, por ejemplo, se alcanza una concentración celular de al menos aproximadamente 0,1 \mug/ml de citocalasina B. La inhibición de las células del músculo liso vascular da lugar a una reendotelización más rápida y completa después del traumatismo vascular debido a un procedimiento quirúrgico, por ejemplo, colocación intravencional de la endoprótesis vascular. La mayor velocidad de reendotelización reduce la pérdida en el área o diámetro de la sección transversal luminal y reduce la pérdida en el flujo sanguíneo.
Una forma de dosificación de liberación sostenida preferida de la invención comprende una forma sólida cristalina pura de un inhibidor citoesquelético. Esta realización de la forma de dosificación de liberación sostenida de la presente invención comprende además preferiblemente un soporte matriz farmacéuticamente aceptable compatible con el tejido que proporciona una estructura de soporte para los cristales, por ejemplo, un cuerpo conformado de silicona, gel de colágeno retenido en una malla de colágeno, gel pluronic retenido en una malla de colágeno o manitol retenido en un cuerpo conformado de silicona. Así, por ejemplo, las formas de dosificación de liberación sostenida que comprenden citocalasina B y un soporte matriz farmacéutico comprende preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 70%, más preferiblemente de aproximadamente 7 a aproximadamente 40% e incluso más preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 30% en peso de citocalasina B/porcentaje en peso del total del soporte matriz-forma de dosificación de liberación sostenida de agente terapéutico. Las formas de dosificación de liberación sostenida que comprenden taxol y un soporte matriz farmacéutico comprenden preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 70%, más preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 50%, e incluso más preferiblemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 8% en peso de taxol/porcentaje en peso del total de soporte matriz-forma de dosificación de liberación sostenida de agente terapéutico. Por lo general, las formas de dosificación de liberación sostenida que comprenden un inhibidor citoesquelético en forma sustancialmente cristalina comprenden de 3 a 50, y más preferiblemente de 5 a 40 por ciento en peso de la forma de dosificación.
Identificación y preparación de formas de dosificación dirigidas a diana que se pueden usar para preparar medicamentos y otras formas de la invención
Las proteínas de unión a células del músculo liso vascular útiles en la invención se unen a dianas sobre la superficie de células del músculo liso vascular. Una proteína de unión al músculo liso vascular útil es un compuesto polipeptídico, peptídico o mimético (como se describe más adelante) que puede unirse una diana o marcador sobre un componente de superficie de una célula del músculo liso vascular intacta o alterada. Dicha unión permite la liberación de inhibidores citoesqueléticos extracelularmente en la matriz intersticial inmediata con difusión posterior del inhibidor citoesquelético en las restantes células del músculo liso vascular intactas y/o internalización por la célula en el compartimento intracelular del resto biodegradable dirigido a diana completo, permitiendo así la liberación en el mismo del inhibidor citoesquelético. Se reconocerá que dianas específicas, por ejemplo, polipéptidos o carbohidratos, proteoglucanos y similares, que se asocian en las membranas celulares de células del músculo liso vascular son útiles para seleccionar (por ejemplo, clonando) o construir (por ejemplo, por ingeniería genética o síntesis química) proteínas de unión al músculo liso vascular específicas apropiadas. "Dianas" particularmente útiles son internalizadas por células del músculo liso, por ejemplo, puesto que en la renovación se produce formación de antígeno constituyente de la membrana. La internalización por células también se puede producir por mecanismos que implican fagolisosomas, pocillos revestidos de clatirina, redistribución mediada por receptor o endocitosis y similares.
Ejemplos representativos de proteínas de unión al músculo liso vascular incluyen anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y policlonales), fragmentos F(ab')_{2}, Fab', Fab y Fv y/o regiones que determinan complementariedad (CDR) de dichos anticuerpos, citoquinas y hormonas polipeptídicas y similares; y macromoléculas que reconocen receptores de la matriz extracelular (por ejemplo, receptores de integrina y fibronectina y similares).
En una realización preferida, por ejemplo, una "diana" se ejemplifica por proteoglucanos de condroitin sulfato (CSPG) sintetizados por células del músculo liso vascular y pericitos, y se prefiere especialmente como diana una porción discreta (denominada en la presente memoria epítopo) de la molécula de CSPG que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 250 kD. La diana de 250 kD es una glicoproteína unida por N que es un componente de un complejo de proteoglucano de 400 kD (Bumol et al., PNAS USA, 79:1245-1249 (1982)). En una realización preferida de la invención, se proporciona una proteína de unión al músculo liso vascular por el anticuerpo monoclonal NR-AN-01 (un subcultivo de NR-ML-05) que se une a un epítopo en una molécula diana CSPG del músculo liso vascular. El anticuerpo monoclonal denominado NR-ML-05 se une de forma expresa a CSPG de 250 kD sintetizado por células de melanoma (Morgan et al., patente de Estados Unidos nº 4.897.255).
Se ha descrito que las células del músculo liso y pericitos sintetizan CSPG de 250 kD así como otros CSPG (Schlingeman et al., supra). Se ha descrito la unión de NR-ML-05 a células del músculo liso (Fritzberg et al., patente de Estados Unidos nº 4.879.225). El hibridoma, NR-ML-05, que segrega un anticuerpo monoclonal que se une a CSPG de 400 kD, se ha depositado en la American Type Culture Collection, Rockville, MD y se le ha concedido el número de acceso 9350. NR-ML-05 es el promotor de, y es estructural y funcionalmente equivalente al subclon NR-AN-01 descrito en la presente memoria.
Se reconocerá que NR-AN-01 es solo un ejemplo de una proteína de unión al músculo liso vascular que se asocia de forma específica con la diana CSPT de 400 kD y que también son útiles otras proteínas de unión que se asocian a esta diana y otros epítopos en esta diana (Bumol et al., PNAS USA, 79:1245-1249 (1982)) en los medicamentos, composiciones, dispositivos, kits de la invención cuando los medicamentos, composiciones, dispositivos o kits se usan para tratar estenosis después de procedimientos de cirugía vascular, por ejemplo PTCA, proteínas de unión preferidas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos, para usar en la práctica de la invención tienen una afinidad de unión mayor que 10^{4} litros/mol para CSPG de 250 kD del músculo liso vascular y también la capacidad de unirse a y ser internalizados por células de músculo liso vascular o pericitos.
Por otro lado, se reconocerá que los residuos aminoacídicos implicados en la asociación cinética multipunto del anticuerpo monoclonal NR-AN-01 con un epítopo antigénico marcador CSPG (es decir, los aminoácidos que constituyen las regiones que determinan complementariedad) se pueden determinar por modelado asistido por ordenador y usando los mutantes que tienen afinidad de unión al anticuerpo alterada. Los aminoácidos del sitio de unión y el modelo en tres dimensiones del sitio de unión al antígeno NR-AN-01 pueden servir como modelo molecular para construir equivalentes funcionales, por ejemplo, polipéptidos ("polipéptidos mínimos") que tienen afinidad de unión por un CSPG sintetizado por células del músculo liso vascular y pericitos.
El modelado en tres dimensiones también es útil para construir otros equivalentes funcionales que emulan la unión de NR-AN-01 a su epítopo antigénico, por ejemplo, compuestos químicos "miméticos" que emulan los aspectos tridimensionales de la unión de NR-AN-01 a su epítopo en un antígeno diana CSPG. Tal y como se usa en la presente memoria, "polipéptido mínimo" se refiere a una secuencia de aminoácidos de al menos seis aminoácidos de longitud. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "mimético" se refiere a un oligómero o polímero químico orgánico construido para conseguir la apropiada separación para la unión a los aminoácidos, por ejemplo, un CSPG diana de NR-AN-01 sintetizado por células del músculo liso vascular o pericitos.
También se ha previsto que anticuerpos monoclonales humanos o anticuerpos murinos "humanizados" que se unen a proteína de unión del músculo liso vascular sean útiles en conjugados terapéuticos. Por ejemplo, se pueden "quimerizar" anticuerpos monoclonales murinos por recombinación genética de la secuencia nucleotídica que codifica la región Fv murina (es decir, que contiene sitios de unión a antígenos) con la secuencia nucleotídica que codifica una región de dominio constante humana y una región Fc, por ejemplo de una manera similar a la descrita en la solicitud de patente europea nº 411.893. Algunos residuos murinos también pueden estar retenidos en el marco de la región variable humana para garantizar unas características de unión en el sitio diana apropiadas. Se reconocerá que parejas de unión del músculo liso vascular humanizadas tienen la ventaja de disminuir la inmunoreactividad del anticuerpo o polipéptido en el receptor hospedador, y pueden ser útiles para aumentar la semivida in vivo y reducir la posibilidad de reacciones inmunes adversas al conjugado.
También se contemplan como útiles péptidos de unión para formas de dosificación de liberación sostenida adaptadas para el tratamiento de reestenosis aquellas que se localizan en el estroma intercelular y en la matriz localizada entre las células del músculo liso vascular. Dichas proteínas de unión pueden liberar el inhibidor citoesquelético en el espacio intersticial entre las células diana. El inhibidor citoesquelético se libera en los espacios intersticiales para la posterior recaptación por las células del músculo liso vascular. Péptidos de unión preferidos de este tipo se asocian con epítopos en colágeno, glicoproteínas extracelulares, por ejemplo, tenascina, fibras del retículo y elastina, citoqueratina y otros componentes de la matriz intercelular. Péptidos mínimos, compuestos químicos orgánicos miméticos, anticuerpos monoclonales humanos o humanizados y similares que pueden localizarse en el estroma y matriz intracelular también son útiles como péptidos de unión en esta realización de la presente invención. Estos péptidos de unión se pueden identificar y construir o aislar conforme a técnicas conocidas. En realizaciones preferidas de la presente invención la proteína de unión a la matriz intersticial se une a un epítopo diana con una constante de asociación de al menos aproximadamente 10^{-4} M.
Procedimientos representativos de "acoplamiento" para ligar el inhibidor citoesquelético a través de enlaces covalentes o no covalentes a la proteína de unión al músculo liso vascular incluyen compuestos entrecruzadores químicos y de entrecruzamiento heterobifuncional (es decir, "engarces") que reaccionan formando un enlace entre grupos reactivos (tales como grupos hidroxilo, amino, amido o sulfhidrilo) en un inhibidor citoesquelético y otros grupos reactivos (de una naturaleza similar) en la proteína de unión al músculo liso vascular. Este enlace puede, por ejemplo, ser un enlace peptídico, un puente disulfuro, un enlace tioéster, un enlace amida, un enlace tioéter y similares.
En un ejemplo ilustrativo, se han resumido conjugados de anticuerpos monoclonales con fármacos por Morgan and Foon (Monoclonal Antibody Therapy to Cancer: Preclinical Models and Investigations, Basic and Clinical Tumor Immunology, Vol. 2, Kluwer Academic Publishers, Hingham, MA) y por Uhr J. of lmmunol. 12:i-vii, 1984). En otro ejemplo ilustrativo en el que el conjugado contiene un agente citostático radionúclido, patente de Estados Unidos nº 4.897.255, Fritzberg et al., es instructivo en procedimientos de acoplamiento que se pueden usar para preparar los presentes conjugados.
La elección del procedimiento de acoplamiento estará influenciada por la elección de la proteína o péptido de unión al músculo liso vascular, proteína o péptido de unión a la matriz intersticial e inhibidor citoesquelético, y también por propiedades físicas tales como, por ejemplo, estabilidad durante la vida útil de almacenamiento y/o por propiedades biológicas, por ejemplo, semivida en células y en sangre, vía de compartimentación intracelular y similares.
El carácter físico y químico de las realizaciones de forma de dosificación de liberación sostenida de la presente invención permite varios modos alternativos de unión de las formas de dosificación a las proteínas o péptidos de unión. Las formas de dosificación (tipo liberación sostenida) como las que se describen en la presente memoria pueden unirse a proteínas/péptidos de unión a través, por ejemplo, de enlaces covalentes, unión tipo sandwich con ligando intermedio o adsorción no covalente o atrapamiento parcial. Cuando las partículas preferidas de ácido poli-láctico/glicólico se forman con el inhibidor citoesquelético dispersado en las mismas, la estructura principal de polímero no cargado se orienta tanto hacia el interior (con el agente terapéutico casi lipófilo contenido en el mismo) como hacia el exterior, junto con la mayoría de grupos carboxilo terminal. Estos grupos carboxilo de superficie pueden servir como sitios de unión covalente cuando se activan, por ejemplo, por una carbodiimida) por grupos nucleófilos del péptido/proteína de unión. Tales grupos nucleófilos incluyen grupos epsilon-amino de lisina (unión amida), grupos hidroxilo de serina (unión éster) o grupos mercaptano de cisteína (unión tioéster). Las reacciones con grupos particulares dependen del pH y del estado de reducción de las condiciones de reacción.
Por ejemplo, se pueden hacer reaccionar partículas de ácido poliláctico/glicólico que tienen grupos ácido carboxílico terminales con N-hidroxibenzotriazol en presencia de una carbodiimida soluble en agua de fórmula R-N=C=N-R' (en la que R es un grupo 3-dimetilaminopropilo o similares y R' es un grupo etilo o similares). Las partículas derivadas de benzotriazol (es decir, restos que tienen imidato activado) se hacen reaccionar entonces con un resto nucleófilo proteína/péptido tal como un resto epsilon-amino disponible. Como alternativa, son útiles para formar un éster activo con los grupos carboxilo terminales de partículas de ácido poliláctico/glicólido moléculas de p-nitrofenol, tetrafluorofenol, N-hidroxisuccinimida o similares en presencia de carbodiimida. Otros restos nucleófilos de proteínas/péptidos de unión incluyen grupos hidroxilo de serina, tioles libres endógenos de cisteína, grupos tiol resultantes de la reducción de puentes disulfuro de proteínas/péptidos de unión usando agentes reductores empleados corrientemente para dicho fin (por ejemplo, cisteína, ditiotreitol, mercatoetanol y similares) y similares. Además, los grupos carboxilo terminales de las partículas de ácido poliláctico/glicólico pueden activarse por reacción con cloruro de tionilo formando un resto derivatizado de cloruro de acilo. Las partículas derivatizadas se hacen reaccionar entonces con grupos nucleófilos de péptidos/proteínas de unión formando formas de dosificación dirigidas a diana.
La conjugación directa de forma de dosificación de liberación sostenida a péptidos o proteínas de unión puede trastornar el reconocimiento de la proteína/péptido de unión de la célula diana. Las técnicas de unión tipo sandwich ligando son alternativas útiles para conseguir la unión de la forma de dosificación de liberación sostenida a la proteína/péptido de unión. Estas técnicas implican la formación de una envuelta de péptido o proteína primaria usando una proteína que no se une a la población de células diana. La proteína/péptido de unión se une entonces a la envuelta de péptido o proteína primaria proporcionando la partícula resultante con proteína/péptido de unión funcional. Una técnica de ligando sandwich ejemplo implica la unión covalente de avidina o estreptavidina a las partículas a través de grupos funcionales como se ha descrito antes con respecto a la técnica de unión "directa". La proteína o péptido de unión se derivatiza, preferiblemente lo mínimo, a través de biotina funcionalizada (por ejemplo, a través de un éster activo, hidrazida, yodoacetal, maleimidilo o grupos funcionales similares). La unión del ligando (es decir, péptido o proteína de unión/biotina funcionalizada) a los sitios de unión de biotina disponibles de la envuelta de proteína primaria avidina/estreptavidina se produce usando una cantidad saturada de proteína/péptido biotinilado.
Por ejemplo, partículas de ácido poliláctico/glicólico que tienen grupos ácido carboxilo terminal se activan con carbodiimida y seguidamente reaccionan con avidina o estreptavidina. La proteína o péptido de unión se hacen reaccionar con éster biotinamidocaproato de N-hidroxisuccinimida en una relación 1-3 molar de compuesto que contiene biotina con respecto a proteína/péptido de unión para formar una proteína/péptido de unión biotinilado. Un exceso molar de proteína/péptido de unión biotinilado se incuba con las partículas derivatizadas con avidina para formar una forma de dosificación dirigida a diana.
Como alternativa, los grupos carboxi de las partículas se biotinilan (por ejemplo, a través de activación con carbodiimida del grupo carboxi y posterior reacción con aminoalquilbiotinamida). Las partículas biotiniladas se incuban entonces con una concentración de saturación (es decir, un exceso molar) de avidina o estreptatividina para formar partículas revestidas de proteína que tienen sitios de unión a biotina libres. Estas partículas revestidas pueden reaccionar con un exceso molar de proteína de unión biotinilada como se ha descrito antes. Otra opción implica la unión de péptido o proteína de unión unida a avidina o estreptavidina a partículas biotiniladas.
Además, la unión proteína/péptido de unión-partícula puede conseguirse por adsorción del péptido de unión en la partícula, resultado del carácter no iónico de la estructura principal de polímero parcialmente expuesta de la partícula. En condiciones de alta fuerza iónica (por ejemplo, 1,0 molar de NaCl), se favorece la unión hidrógeno y partícula hidrófoba-proteína/péptido de unión.
Por otro lado, la proteína/péptido de unión puede atraparse parcialmente en la matriz polimérica de partículas tras su formación. En estas circunstancias, dicha proteína/péptido de unión atrapada proporciona un carácter de unión selectivo residual a la partícula. Se prefieren condiciones de formación de partículas suaves, por ejemplo, las empleadas por Cohen et al., Pharmaceutical Research, 8: 713-720 (1991), para atrapar la proteína o péptido en la matriz. Las proteínas de unión atrapadas también son útiles en la nueva unión a células diana de una partícula parcialmente degradada que ha sufrido exocitosis. Las proteínas o péptidos de unión pueden unirse a otras formas de dosificación en forma de partículas poliméricas (por ejemplo, formas de dosificación no biodegradables) que tienen diferentes grupos funcionales expuestos conforme a los principios descritos antes.
Polímeros no biodegradables ejemplo útiles en la práctica de la presente invención son poliestirenos, polipropilenos, copolímeros de estireno, ácido acrílico y acrilato y similares. Tales polímeros no biodegradables incorporan o pueden derivatizarse para incorporar grupos funcionales para la unión de la proteína/péptido de unión, incluyendo grupos ácido carboxílico, grupos amino primario alifáticos, grupos amino aromáticos y grupos hidroxilo.
Se acoplan grupos funcionales ácido carboxílico a la proteína o péptido de unión usando, por ejemplo, los mecanismos de reacción descritos antes para formas de dosificación en partículas poliméricas biodegradables de ácido poliláctico/glicólico. Los grupos funcionales amino primarios se acoplan, por ejemplo, por reacción de los mismos con anhídrido succínico para formar un resto carboxi terminal que puede unirse a péptido/proteína de unión como se ha descrito antes. Además, los grupos amino primarios se pueden activar con bromuro de cianógeno y formar enlaces guanidina con grupos amino primario de proteínas/péptidos de unión. Por ejemplo, los grupos funcionales amino aromáticos se diazotan con ácido nitroso formando moléculas de diazonio que reaccionan con tirosina proteínas/péptido de unión, produciendo de este modo un enlace diazo entre la partículas no biodegradable y la proteína/péptido de unión. Los grupos funcionales hidroxilo se acoplan a grupos amino primario de proteína/péptido de unión, por ejemplo, convirtiendo el resto hidroxilo en un resto que comprende un grupo funcional ácido carboxílico terminal. Esta conversión se puede llevar a cabo a través de reacción con ácido cloroacético seguido por reacción con carbodiimida. De forma análoga se aplican técnicas tipo sandwich, de adsorción y atrapamiento, descritas antes con respecto a partículas biodegradables, para la fijación de la proteína/péptido de unión a partículas no biodegradables.
Dosificaciones: Formulación y vías de administración de inhibidores citoesqueléticos
La cantidad de inhibidor citoesquelético administrada se ajusta para tratar traumatismos vasculares de diferente gravedad. Por ejemplo, son suficientes menores dosis para tratar traumatismo vascular menor, por ejemplo, para prevenir rechazo vascular después de injerto o trasplante, mientras que son suficientes mayores dosis para tratar traumatismo vascular más extensivo, por ejemplo, para tratar reestenosis después de angioplastia. Así, para fijar biológicamente la luz de un vaso traumatizado se administra un inhibidor citoesquelético tal como citocalasina B en una dosis total sistémica de aproximadamente 1 a aproximadamente 24 ml, preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 ml, a aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 \mug de citocalasina B/ml de vehículo, preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 \mug de citocalasina B por ml de vehículo y, más preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 8,0 \mug de citocalasina B por ml de vehículo, aunque pueden ser beneficiosas otras dosis. En particular, menores concentraciones de citocalasina B pueden ejercer un efecto terapéutico cuando se emplee como vehículo un disolvente no acuoso. La administración de una dosis sistémica de citocalasina B da como resultado aproximadamente 5 a aproximadamente 40, preferiblemente de aproximadamente 8 a aproximadamente 30, lambda de la solución que contiene citocalasina B que entra en el espacio intersticial que rodea las células de la túnica media y estando de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 4, preferiblemente de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 ml de la solución expuestos a la pared del vaso por el transporte de la solución a la adventicia. Por otro lado, estas dosificaciones también pueden presentar efectos antiproliferativos.
La administración de medicamentos, composiciones o formas de dosificación de la presente invención puede ser continua o intermitente, dependiendo, por ejemplo, de las condiciones fisiológicas de los receptores, de si el objetivo de la administración es terapéutico o profiláctico y de otros factores conocidos por los expertos en la técnica. La administración de los medicamentos, composiciones o formas de dosificación de la invención puede ser esencialmente continua durante un período previamente seleccionado de tiempo o puede ser en una serie de dosis espaciadas, por ejemplo, antes, durante o después del traumatismo vascular debido a un procedimiento quirúrgico, antes y durante, antes y después, durante y después o antes, durante y después del traumatismo vascular debido a un procedimiento quirúrgico. Por otro lado, la administración de medicamentos, composiciones o formas de dosificación se selecciona con el fin de no dañar más el vaso traumatizado.
Una o más formas de dosificación unitarias que comprenden el inhibidor citoesquelético, que se puede formular para liberación sostenida, se pueden administrar por una diversidad de vías que incluyen oral, o parenteral, incluyendo las vías rectal, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intrapulmonar e intranasal. Cuando los medicamentos, composiciones y formas de dosificación de la invención se preparan para administración oral, éstas se combinan preferiblemente con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable para formar una formulación farmacéutica, preferiblemente en forma de dosis unitaria. Los ingredientes activos totales en estas formulaciones pueden comprender de 0,1 a 99,9% en peso de la formulación. "Farmacéuticamente adecuado" se refiere a que al vehículo, diluyente, excipiente y/o sal deben ser compatibles con el resto de ingredientes de la formulación y no ser perjudiciales para el receptor de la misma.
Se pueden preparar formulaciones farmacéuticas que contienen un inhibidor citoesquelético por procedimientos conocidos en la técnica usando ingredientes bien conocidos y disponibles fácilmente. Por ejemplo, se puede formular una citocalasina con excipientes, diluyentes o vehículos comunes y conformarse en comprimidos, cápsulas, suspensiones, polvos y formas similares. Ejemplos de excipientes, diluyentes y vehículos que son adecuados para tales formulaciones incluyen los siguientes, cargas y extendedores, por ejemplo, almidón, azúcares, manitol y derivados silícicos; agentes ligantes, por ejemplo, carboximetil celulosa, HPMC y otros derivados de la celulosa, alginatos, gelatina y polivinilpirrolidona; agentes humectantes tales como glicerol; agentes disgregantes, por ejemplo, carbonato cálcico y bicarbonato sódico; agentes para retardar la disolución, por ejemplo, parafina; aceleradores de la readsorción tales como compuestos de amonio cuaternario; agentes superficialmente activos, por ejemplo, alcohol cetílico, monoestearato de glicerol, vehículos adsorbentes tales como caolín o bentonita; y lubricantes, por ejemplo, talco, estearato de calcio y de magnesio y polietilfenoles sólidos. Véase Fondy et al. (documento WO 88/10259).
Por ejemplo, los comprimidos o comprimidos con forma de cápsula que contienen un inhibidor citoesquelético pueden incluir agentes tamponantes, por ejemplo, carbonato cálcico, óxido de magnesio y carbonato magnésico. Los comprimidos con forma de cápsula y comprimidos también pueden incluir ingredientes inactivos tales como celulosa, almidón pregelatinizado, dióxido de silicio, hidroxipropil metilcelulosa, estearato de magnesio, celulosa microcristalina, almidón, talco, dióxido de titanio, ácido benzoico, ácido cítrico, almidón de maíz, aceite mineral, polipropilenglicol, fosfato sódico y estearato de cinc y similares. Las cápsulas de gelatina dura y blanda que contienen un inhibidor citoesquelético pueden contener ingredientes inactivos, por ejemplo, gelatina, celulosa microcristalina, lauril sulfato sódico, almidón, talco y dióxido de titanio y similares, así como vehículos líquidos tales como polietilenglicoles (PEG) y aceite vegetal.
Los inhibidores citoesqueléticos también se pueden formular como elixires o soluciones para la administración oral conveniente o como soluciones apropiadas para administración parenteral, por ejemplo, por vía intramuscular, subcutánea o intravenosa. En la práctica de ciertas realizaciones de la presente invención, el inhibidor citoesquelético se dispersa en un vehículo farmacéuticamente aceptable que está en fase líquida y se libera a través de un dispositivo implantable, por ejemplo, un catéter. Vehículos farmacéuticamente aceptables útiles para estos fines incluyen los vehículos empleados generalmente, tales como solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones (por ejemplo, emulsiones aceite/agua o agua/aceite) y agentes humectantes de diversos tipos.
Las formulaciones farmacéuticas de inhibidores citoesqueléticos pueden adoptar la forma de una solución o dispersión acuosa o anhidra o, como alternativa, la forma de una emulsión o suspensión. Véase Fondy et al. (documento WO 90/13293).
Estas formulaciones pueden contener vehículos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables que son bien conocidos en la técnica anterior. Es posible, por ejemplo, preparar soluciones usando uno o más disolventes orgánicos que sea(n) aceptables desde el punto de vista fisiológico, elegidos, además del agua, de disolventes, por ejemplo, acetona, etanol, alcohol isopropílico, ésteres glicol tales como los productos comercializados con el nombre "Dowanol", poliglicoles y polietilenglicoles, ésteres alquilo (C_{1}-C_{4}) de ácidos de cadena corta, preferiblemente etil o isopropil lactato, triglicéridos de ácidos grasos, por ejemplo, productos comercializados con el nombre "Miglyol", miristato de isopropilo, aceites animales, minerales y vegetales y polisiloxanos.
Las composiciones y medicamentos conforme a la invención también pueden contener agentes espesantes tales como celulosa y/o derivados de la celulosa. Estos también pueden contener gomas, por ejemplo, goma xantana, guar, o carbo o goma arábiga o, como alternativa, polietilenglicoles, bentonas y montmorillonitas y similares.
Es posible añadir, su fuera necesario, un adyuvante elegido de antioxidantes, tensioactivos, otros conservantes, agentes peliculantes, queratolíticos o comedolíticos, perfumes y colorantes. Además, se pueden añadir otros ingredientes activos, bien para los estados patológicos descritos o por otro estado patológico.
Por ejemplo, entre los antioxidantes se pueden citar t-butilhidroquinona, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado y un \alpha-tocoferol y sus derivados. Las formas galénicas acondicionadas fundamentalmente para aplicación tópica adoptan la forma de cremas, leches, geles, dispersiones o microemulsiones, lociones espesadas hasta un mayor o menor grado, almohadillas impregnadas, pomadas o bastoncillos o, como alternativa, la forma de formulaciones en aerosol en forma de pulverizador o espuma o, como alternativa, en forma de una pastilla de jabón.
Además, los inhibidores citoesqueléticos se adaptan bien a la formulación como formas de dosificación de liberación sostenida y similares. Las formulaciones pueden estar constituidas de modo que éstas liberen el ingrediente activo solo o preferiblemente en una zona particular del tracto intestinal, por ejemplo, durante un período de tiempo. Los revestimientos, envueltas y matrices protectoras pueden realizarse, por ejemplo, en sustancias poliméricas o ceras.
La liberación local de los inhibidores citoesqueléticos puede ser por una diversidad de técnicas que administran el agente en, o cerca del sitio vascular traumatizado. Los ejemplos de técnicas de liberación específicas del sitio o locales dirigidas no se pretende que sean limitantes sino ilustrativos de las técnicas disponibles. Los ejemplos incluyen catéteres de liberación local, tales como un catéter de infusión, un catéter permanente, o un catéter con aguja, endoprótesis vasculares, injertos sintéticos, envueltas adventicias, derivaciones y endoprótesis u otros dispositivos implantables, vehículos específicos para el sitio, inyección directa o aplicaciones directas.
La liberación local por un implante describe la colocación quirúrgica de una matriz que contiene el inhibidor citoesquelético en el área de lesión o área traumatizada. La matriz implantada libera el inhibidor citoesquelético por difusión, reacción química o activadores de disolvente. Véase, por ejemplo, Lange, Science, 249, 1527 (1990).
Un ejemplo de liberación local dirigida por un implante es el uso de una endoprótesis vascular. Las endoprótesis vasculares se diseñan para prevenir mecánicamente el colapso y reoclusión de las arterias coronarias u otros vasos. La incorporación de un inhibidor citoesquelético en la endoprótesis vascular puede liberar el inhibidor citoesquelético directamente en la lesión. La liberación local de agentes por esta técnica se describe en Koh, Pharmaceutical Technology (octubre de 1990).
Por ejemplo, se emplea una endoprótesis intravascular metálica, plástico o biodegradable que comprende el inhibidor citoesquelético. La endoprótesis vascular comprende preferiblemente un revestimiento biodegradable, un revestimiento poroso o permeable no biodegradable, o una membrana biodegradable o no biodegradable o un revestimiento a modo de vaina de prótesis sintética, por ejemplo de PTFE, que comprende el inhibidor citoesquelético. Una realización más preferida de la invención es una endoprótesis vascular revestida en la que el revestimiento comprende una forma de dosificación de liberación sostenida del inhibidor citoesquelético. En una realización alternativa, una endoprótesis vascular biodegradable también puede tener un agente terapéutico impregnado en la misma, es decir, en la endoprótesis matriz.
Una endoprótesis vascular biodegradable con el inhibidor citoesquelético impregnado en la misma se puede revestir además con un revestimiento biodegradable o con un revestimiento poroso no biodegradable que tenga la forma de dosificación de liberación sostenida del inhibidor citoesquelético dispersada en la misma. Esta endoprótesis puede proporcionar una velocidad de liberación diferencial del inhibidor citoesquelético, es decir, puede haber una velocidad de liberación inicial más rápida de inhibidor citoesquelético desde el revestimiento, seguida por una liberación retardada del inhibidor citoesquelético impregnado en la endoprótesis vascular matriz, tras la degradación de la endoprótesis vascular matriz. La endoprótesis vascular también proporciona un medio mecánico para proporcionar un aumento en el área luminal de un vaso. Por otro lado, la colocación de endoprótesis vasculares que comprenden un inhibidor citoesquelético que es un inhibidor de la proliferación de células del músculo liso también puede reducir o prevenir la proliferación de la íntima. Esta inhibición de células del músculo liso de la íntima y estroma producida por músculo liso y pericitos puede conducir a una reendotelización más rápida y completa después de la colocación intravencional de una endoprótesis vascular. La mayor velocidad de reendotelización y estabilización de la pared del vaso después de la colocación de la endoprótesis vascular puede reducir la pérdida de área luminal y el menor flujo sanguíneo debidos a proliferación de células del músculo liso vascular que es una de la principales causas de fallos de las endoprótesis vasculares.
Otro ejemplo de liberación local dirigida por un implante es el uso de una envuelta adventicia. La envuelta comprende una matriz vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un gel Pluronic que esté libre, o contenido en una malla de colágeno, dicho gel tiene dispersado en el mismo un inhibidor citoesquelético. Una realización de la invención es un gel Pluronic (F-127, BASF) que es soluble a 4ºC pero solidifica a 37ºC, por ejemplo, en contacto con fluido o tejido en un ser humano. Para preparar un envuelta que contiene gel Pluronic, se añadieron 4 ml de tampón fosfato, pH 7,0 (CirRes, vol. 76, abril 1995), a 1 g de gel pluronic F-127, que se mezcló durante la noche a 4ºC. El inhibidor citoesquelético se añadió a la mezcla antes de la administración local. La mezcla se puede aplicar directamente a una pared arterial expuesta quirúrgicamente, o se puede aplicar a la superficie de una matriz de colágeno bovino (BioCare, Inc., Topeka, KS), que se envuelve alrededor de la arteria y se unen los bordes mediante suturas.
Otra realización de la invención es la incorporación del inhibidor citoesquelético en los espacios nodales expandidos de una membrana tipo injerto de PTFE (Impra, Inc., Tempe, AZ) que puede rodear, o colocarse sobre la superficie interior o exterior de, una endoprótesis vascular interluminal que comprende metal o un polímero biodegradable o no biodegradable. El inhibidor citoesquelético, o una forma de dosificación de liberación sostenida del inhibidor citoesquelético, llena los espacios nodales de la pared de la membrana de PTFE y/o reviste las superficies interna y/o externa de la membrana.
Otra realización más de la invención es una mezcla de una forma cristalina de un inhibidor citoesquelético en un gel de colágeno bovino (BioCare, Inc., Topeka, KS). Los cristales tenían un tamaño que variaba de aproximadamente 0,1 micrómetros a aproximadamente 1 mm. Por lo general, los cristales se pulverizaron para generar cristales de menor tamaño. La mezcla se aplicó directamente sobre la superficie de la arteria y los tejidos subcutáneos circundantes se suturaron alrededor del vaso y se cerró la piel. Se disolvió colágeno bovino (BioCare, Inc., Topeka, KS) en solución salina estéril (1:1) y se añadió el inhibidor citoesquelético. De forma alternativa, se aplicó el gel de colágeno a una malla de colágeno bovino que se envolvió seguidamente alrededor del vaso y se suturaron los bordes para mantener la malla en su sitio. La malla de colágeno bovino (BioCare, Inc.) se cortó a un tamaño de, por ejemplo, 1 cm x 1 cm, y se aplicó el inhibidor citoesquelético sobre la superficie de la malla.
Una realización adicional de la invención comprende atrapar el inhibidor citoesquelético cristalino en una membrana de silicona de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 3, preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 0,7 mm de espesor, por ejemplo, polímero de silicona Q-7 4830 (Dow Corning, Midland, MI). El polímero (parte A y B, 1:1) se mezcla con una espátula. Se pulveriza una carga inerte, por ejemplo, manitol, y se tamiza hasta un tamaño de malla en la fracción de 53 a 75. El manitol y el inhibidor citoesquelético se mezclan en proporciones determinadas y luego se pulveriza con el polímero formando un material compuesto. El material compuesto se llena en un molde achatado y se comprime hasta 3,45 x 10^{7} Pa. El material compuesto se cura a continuación a 80ºC durante 2 horas. La membrana de material compuesto se corta al tamaño deseado, por ejemplo, 1 cm x 1 cm, se envuelve alrededor de la arteria y se mantiene en su lugar suturando los bordes de la membrana entre sí.
También se puede revestir un inhibidor citoesquelético sobre la parte externa de la envuelta. La envuelta y/o revestimiento son preferiblemente biodegradables. Se prefiere que el inhibidor citoesquelético esté en forma de dosificación de liberación sostenida.
Otro ejemplo es un sistema de liberación en el que se inyecta un polímero que contiene el inhibidor citoesquelético en el área de la lesión en forma líquida. El polímero solidifica seguidamente o se endurece formando el implante que queda retenido in situ. Esta técnica se describe en el documento PCT WO 90/037868 (Donn, 19 de abril de 1990).
Otro ejemplo es la liberación de un inhibidor citoesquelético por sellado endoluminal polimérico. Esta técnica usa un catéter para aplicar un implante polimérico a la superficie interna de la luz. El inhibidor citoesquelético está incorporado en el implante polimérico biodegradable y se libera de este modo en el sitio quirúrgico. Esta técnica se describe en el documento PCT WO 90/01969 (Schindler, 23 de agosto de 1989).
Otro ejemplo más de liberación local es mediante inyección directa de vesículas o micropartículas en la lesión o pared de la arteria adyacente a la lesión. Estas micropartículas pueden estar formadas por sustancias tales como proteínas, lípidos, hidratos de carbono o polímeros sintéticos. Estas micropartículas llevan el inhibidor citoesquelético incorporado en las micropartículas o sobre las micropartículas en forma de revestimiento. Los sistemas de liberación que incorporan micropartículas se describen en Lange, Science., 249, 1527 (1990) y Mathiowitz et al., J App. Poly. Sci., 26, 809 (1981).
Para administración tópica, los agentes terapéuticos se pueden formular como se conoce en la técnica para aplicación directa a un área deseada. Las formas convencionales para este propósito incluyen apósitos para heridas, vendajes revestidos u otras coberturas poliméricas, pomadas, lociones, pastas, jaleas, pulverizadores y aerosoles. El porcentaje en peso de un inhibidor citoesquelético presente en una formulación típica variará dependiendo de diversos factores, pero por lo general variará de 0,005% a 95% del peso total de la formulación y de forma típica de 1 a 25% en peso.
Estados patológicos que pueden tratarse adecuadamente con el medicamento, composiciones, kit o formas de dosificación de la invención
Los medicamentos, kits, composiciones y formas de dosificación que se han descrito antes en la presente memoria son útiles para tratar o inhibir una disminución del volumen, área y/o diámetro de la luz de un vaso asociados con un traumatismo debido a un procedimiento quirúrgico. Tal y como se usa en la presente memoria, "vasos" incluyen vasos de mamífero, por ejemplo, arterias coronarias, así como arterias periféricas, femorales y carótidas. Se reconocerá que los medicamentos, composiciones, kits y formas de dosificación (tanto libres como de liberación sostenida) de la invención no están limitados al uso para terapia después de angioplastia; sino que más bien la utilidad de los medicamentos, composiciones, kits y formas de dosificación estará determinada por su capacidad para inhibir actividades celulares de las células del músculo liso y pericitos en la pared vascular. Así, un traumatismo vascular incluye, aunque sin quedar limitado a traumatismos asociados con un procedimiento intervencionista, tal como angioplastia, colocación de una endoprótesis vascular, derivación, implante de estenosis, injerto sintético o natural, envuelta adventicia, catéter permanente u otros dispositivos implantables. Los injertos incluyen injertos tratados con agente terapéutico, por ejemplo, injertos impregnados o revestidos.
Los medicamentos, composiciones, kits y formas de dosificación de la invención también son útiles en modalidades terapéuticas para mejorar el recrecimiento de células endoteliales en tejidos vasculares dañados y en otros sitios de herida incluyendo heridas epiteliales. En estas modalidades terapéuticas, los medicamentos, composiciones, kits y formas de dosificación de la invención y los conjugados que se describen en la presente memoria encuentran utilidad para inhibir la migración y/o proliferación de células del músculo liso o pericitos. Las células del músculo liso o pericitos se han relacionado con la producción de factores in vitro que inhiben la proliferación de células endoteliales, y su proliferación también puede originar una barrera física para establecer un endotelio continuo. Así, los medicamentos, composiciones, kits y formas de dosificación de la invención y conjugados descritos en la presente memoria encuentran utilidad en promover neoangiogénesis y en una mayor reendotelización, por ejemplo, durante la cicatrización de heridas, injertos de vasos y después de cirugía vascular. Las formas de dosificación también pueden liberar modalidades terapéuticas que estimulan o aceleran la reendotelización de la pared del vaso dañada.
En algunas realizaciones de la presente invención se puede usar un inhibidor citoesquelético que pueda inhibir la capacidad de las células del músculo liso vascular de contraerse, por ejemplo, una citocalasina. Inhibidores citoesqueléticos ejemplo útiles en la práctica de este aspecto de la presente invención son los que son capaces de hacer que una arteria traumatizada pierda tono vascular, tal que la presión hidrostática vascular normal (es decir, la tensión arterial) extienda el vaso flácido hasta, o cerca de su diámetro fisiológico máximo. La pérdida de tono vascular puede estar causada por inhibidores citoesqueléticos que interfieren en la formación o funcionamiento de proteínas contráctiles (por ejemplo, actina, miosina, tropomiosina, caldesmon, calponina o similares). Esta interferencia puede producirse directamente o indirectamente a través, por ejemplo, de la inhibición de la modulación del calcio, fosforilación u otras vías metabólicas implicadas en la contracción de células del músculo liso vascular.
La inhibición de la contracción celular (es decir, pérdida de tono vascular) puede actuar a través de dos mecanismos para reducir el grado de estenosis vascular. En primer lugar, la inhibición de la contracción celular durante un período prolongado de tiempo limita el número de células del músculo liso que migra desde la túnica media hacia la íntima, el engrosamiento de la cual da lugar a estenosis luminal vascular. En segundo lugar, la inhibición de la contracción hace que la pared del músculo liso se relaje y dilate por debajo de la presión hidrostática vascular normal (es decir, la tensión arterial).
Las citocalasinas inhiben la contracción de células del músculo liso sin abolir la síntesis de proteínas necesaria para células del músculo liso dañadas traumatizadas, postangioplastia u otro proceso quirúrgico o por enfermedad para autorrepararse. La síntesis de proteínas también es necesaria para que las células del músculo liso segreguen matriz, que fija o retiene la luz en un estado próximo a su diámetro sistólico máximo a medida que se estabiliza la lesión (es decir, un efecto de fijación biológica de la luz de un vaso).
Este efecto de fijación biológica de la luz de un vaso no solo da lugar a un área o diámetro de la sección transversal luminal del vaso expandido y a un aumento en el caudal de sangre, sino que también reduce de forma significativa la retracción elástica después de la angioplastia. La retracción elástica es un cierre agudo del vaso asociado con un vasospasmo o relajación temprana de la pared vascular, debido a shock traumático originado por un sobreestiramiento del vaso por un catéter de globo durante la angioplastia. Este espasmo de la túnica media que conduce a disminución del área de la sección transversal luminal puede producirse en un período de horas, días o semanas después de la dilatación del globo, cuando se produce la restauración del tono de la pared del músculo vascular.
Recientes observaciones durante examen al microscopio de muestras de aterectomía sugieren que la retracción elástica puede producirse en hasta un 25% de los procedimientos de angioplastia clasificados como éxitos, en base a un angiograma posterior al procedimiento inicial. Debido a que el procedimiento de fijar biológicamente la luz de un vaso relaja la pared de la arteria después de la angioplastia con globo, el médico puede eliminar el exceso de inflado y su shock traumático resultante como medio para disminuir o retardar el espasmo o retracción elástica del vaso. La reducción o eliminación de exceso de inflado disminuye el traumatismo sobre la pared muscular del vaso, reduciendo de este modo los determinantes de proliferación de células del músculo liso de la íntima y, por tanto, reduciendo la incidencia o intensidad de reestenosis.
La fijación biológica de la luz de un vaso también reduce la incidencia de formación de trombos. En arterias femorales de cerdo tratadas con citocalasina B, por ejemplo, la incidencia de microtrombos murales se redujo al compararla con arterias traumatizadas con globo que no se trataron con el inhibidor citoesquelético. Este fenómeno parece ser un beneficio secundario que puede originarse por el mayor flujo sanguíneo a través del vaso traumatizado, obteniéndose dicho beneficio por los medicamentos, composiciones, kits, formas de dosificación y dispositivos de la presente invención. En arterias tratadas con formas de dosificación de liberación sostenida de citocalasina B, la citocalasina B puede también prevenir la contracción y organización de plaquetas que se requiere para la formación de trombos.
Las citocalasinas son capaces de generar un efecto de fijar biológicamente la luz de un vaso sobre las células del músculo liso vascular. Se cree que las citocalasinas inhiben tanto la migración como la contracción de células del músculo liso vascular interaccionando con actina. Las citocalasinas interaccionan con los extremos de acción filamentosa inhibiendo la elongación de filamentos de actina. Bajas dosis de citocalasinas (por ejemplo, citocalasina B) también alteran las redes de microfilamentos de actina. Datos in vitro indican que después de que las células del músculo liso vascular aclaren la citocalasina B, las células volvieron a generar suficiente actina para reanudar la migración en aproximadamente 24 horas. Las evaluaciones in vitro revelan que las células del músculo liso vascular vuelven a ganar tono vascular en 2 a 4 días. Es durante este período de recuperación cuando se produce el efecto de fijar biológicamente la luz de un vaso y de fijación del diámetro luminal.
El inhibidor citoesquelético puede dirigirse, pero preferiblemente se administra directamente en el vaso traumatizado antes, durante, o después de la angioplastia u otro suceso traumático. El efecto de fijar biológicamente la luz de un vaso de la citocalasina B, por ejemplo, se puede conseguir usando una única infusión de aproximadamente 1 a aproximadamente 24 ml, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 ml, de un vehículo más el inhibidor citoesquelético en la región traumatizada de la pared del vaso en una concentración de dosis que varía de aproximadamente 0,1 microgramos de agente terapéutico/ml de vehículo a aproximadamente 10,0 microgramos de inhibidor citoesquelético/ml de vehículo.
La inhibición de la migración de células del músculo liso vascular (desde la túnica media a la intima) se ha demostrado en el mismo intervalo de dosis (Ejemplo 11); sin embargo, se prefiere una exposición sostenida del vaso al inhibidor citoesquelético con el fin de maximizar estos efectos antimigratorios. Si las células del músculo liso vascular no pueden migrar hacia la íntima, éstas no pueden proliferar en la misma. Si las células del músculo liso vascular migran hacia la íntima, una forma de dosificación de liberación sostenida antiproliferativa administrada posteriormente puede inhibir la proliferación de la íntima. Como resultado, se puede administrar la realización de forma de dosificación de liberación sostenida de la presente invención, que incorpora una citocalasina u otro inhibidor citoesquelético antiproliferativo, en combinación con un inhibidor citoesquelético libre. De este modo, se puede conseguir en un protocolo de dosificación única un efecto de fijar biológicamente la luz de un vaso, así como un efecto antiproliferativo o antimigratorio.
Procedimiento de uso de los productos de la invención
La invención proporciona medicamentos, composiciones, kits y dispositivos. Estos productos se pueden usar para tratar un mamífero que tiene, o tiene riesgo de padecer, una disminución en el volumen, área o diámetro de un vaso, por ejemplo, estenosis o reestenosis de un vaso sanguíneo. El procedimiento comprende la administración de al menos un inhibidor citoesquelético en una cantidad eficaz para fijar biológicamente la luz de un vaso, inhibir o reducir la proliferación de células del músculo liso vascular, o cualquiera de sus combinaciones.
Para la prevención de la disminución de la luz del vaso asociada con un traumatismo vascular debido a un procedimiento quirúrgico, el inhibidor citoesquelético se puede administrar antes, durante y/o después del procedimiento, o cualquiera de sus combinaciones. Por ejemplo, para la prevención de reestenosis, se administran preferiblemente antes, durante y/o después del procedimiento traumático (por ejemplo, angioplastia) una serie de dosis separadas de inhibidor citoesquelético, opcionalmente en forma de dosificación de liberación sostenida. La dosis puede también liberarse de forma local, a través de un dispositivo implantable, por ejemplo, un catéter, introducido en el vaso afectado durante el procedimiento. Con preferencia, se administra una forma de dosificación de liberación sostenida a través de un dispositivo implantable durante el procedimiento traumático. Después de llevar a cabo el procedimiento traumático se pueden administrar una serie de dosis de seguimiento, preferiblemente en forma de dosificación de liberación sostenida, durante un tiempo suficiente para reducir de forma sustancial el riesgo de, o prevenir, reestenosis. Una duración preferida del protocolo terapéutico para este fin implica la administración durante aproximadamente 3 a aproximadamente 26 semanas después de la angioplastia.
Los expertos en la técnica reconocerán que las dosis terapéutica/profilácticamente eficaces de inhibidores citoesqueléticos y las formas de dosificación dependerán de varios factores que incluyen, por ejemplo: a) la afinidad de unión de la proteína de unión al músculo liso vascular, si existe, en la forma de dosificación; b) la presión atmosférica y duración de la presión aplicada durante la infusión; c) el tiempo durante el cual el inhibidor citoesquelético o forma de dosificación administrado reside en el sito vascular; d) la naturaleza del inhibidor citoesquelético empleado; e) la naturaleza del traumatismo vascular y terapia deseados; f) para formas de dosificación de liberación sostenida, la velocidad de liberación del inhibidor citoesquelético desde la forma de dosificación, y/o g) para formas de dosificación de liberación sostenida, la localización intercelular y/o intracelular de la forma de dosificación. Los expertos adiestrados para liberar fármacos en dosis terapéuticamente eficaces (por ejemplo, controlando los niveles de fármaco y observando los efectos clínicos en los pacientes) determinarán la dosis óptima para un paciente particular en base a su experiencia y criterio profesional. Los expertos en la técnica reconocerán que la infiltración del inhibidor citoesquelético en las capas íntimas de la pared de un vaso traumatizado en forma libre o de dosificación de liberación sostenida está sujeta a variación y será necesario determinarla de forma individual.
Una dosificación terapéuticamente eficaz del inhibidor citoesquelético se alcanzará de forma típica cuando la concentración del inhibidor citoesquelético en el espacio fluido entre los globos del catéter esté en el intervalo de aproximadamente 10^{-3} a 10^{-12} M. Se reconocerá a partir de los Ejemplos proporcionados junto con la presente que los inhibidores citoesqueléticos y formas de dosificación pueden necesitar solo ser liberados en una dosificación terapéutica antiproliferativa suficiente para exponer al inhibidor citoesquelético el 10% más interno, preferiblemente el 20% más interno y, más preferiblemente, el 99% más interno de las células de la túnica media que revisten la luz. Esta dosificación se puede determinar de forma experimental, por ejemplo, a) por infusión de los vasos desde sistemas modelo animales adecuados y usando métodos inmunohistoquímicos, fluorescentes o de microscopía electrónica para detectar el agente y sus efectos (por ejemplo, tal como se ejemplifica en los Ejemplos siguientes); y b) llevando a cabo estudios in vitro adecuados (véase, por ejemplo, los Ejemplos 3, 4 y 5 siguientes).
Por ejemplo, con respecto a la liberación con catéter, los expertos en la técnica reconocerán que las dosis terapéutica/profiláticamente eficaces de los inhibidores citoesqueléticos y formas de dosificación dependerán de factores que incluyen: a) la presión atmosférica aplicada durante la infusión; b) el tiempo durante el cual el agente administrado reside en el sitio vascular; c) la forma del inhibidor citoesquelético empleado; y/o d) la naturaleza del traumatismo vascular y terapia deseados. Catéteres que se pueden usar en la práctica de la invención incluyen catéteres tales como los descritos en Just et al. (patente de Estados Unidos nº 5.232.444), Abusio et al. (patente de Estados Unidos nº 5.213.576), Shapland et al. (patente de Estados Unidos nº 5.282.785), Racchini et al. (patente de Estados Unidos nº 5.458.568), Wolinsky (patente de Estados Unidos nº 4.824.436), Spears (patente de Estados Unidos nº 4.512.762) y Shaffer et al. (patente de Estados Unidos nº 5.049.132).
Una dosis terapéuticamente eficaz es por lo general la dosis de agente pericelular en cultivo en el tejido de células del músculo liso, es decir, una dosis a la cual a una exposición continua da como resultado un efecto terapéutico entre las dosis tóxicas y mínima eficaz. Este nivel terapéutico se obtiene in vivo determinando el tamaño, número y concentración de inhibidor citoesquelético y velocidad de liberación requerida para partículas infundidas entre las células del músculo liso de la pared arterial con el fin de mantener esta dosis terapéutica pericelular. La forma de dosificación liberará el inhibidor citoesquelético a una velocidad que se aproxime a la dosis pericelular de los siguientes agentes terapéuticos ejemplo: de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 microgramos/ml de nitroglicerina, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 1000 microgramos/ml de suramina, de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 100 microgramos/ml de citocalsina, de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 105 microgramos/ml de estaurosporina, así como de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 100 microgramos/ml de taxol. Así, para citocalasina B, la dosis sistémica da como resultado de aproximadamente 5 a aproximadamente 40, preferiblemente, de aproximadamente 8 a aproximadamente 30, lambda de la solución que entra en el espacio intersticial que rodea las células de la túnica media, y de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 4, preferiblemente de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 ml de la solución liberada a la pared del vaso mediante la adventicia.
La administración de una dosis terapéutica celular de, por ejemplo, citocalasina B a células del músculo liso vascular tras traumatismo por dilatación de un globo se puede conseguir reemplazando todo el volumen de la túnica media con el inhibidor citoesquelético para producir un efecto de fijar biológicamente la luz de un vaso, es decir, todas las células se exponen a una concentración de inhibidor citoesquelético eficaz para fijar biológicamente la luz del vaso. Por ejemplo, un estudio de respuesta a dosis que empleó arterias femorales de cerdo mostró que si toda la túnica media se infundía usando un catéter de infusión con citocalasina B en un intervalo de aproximadamente 0,1 \mug/ml de vehículo a 10,0 \mug/ml de vehículo, se originaba un efecto de fijar biológicamente la luz de un vaso. Es decir, se observó una retención más extensiva del tamaño de la luz arterial (diámetro o área de la sección transversal) con respecto al tamaño de la luz arterial producido por un globo de dilatación. El efecto terapéutico tuvo un nivel umbral de 0,1 \mug/ml de citocalasina B sin efecto por debajo de esta dosis y sin aumento en la eficacia terapéutica hasta 10 \mug/ml de citocalasina B. Así, la citocalasina B tiene un amplio índice terapéutico que varía de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 \mug/ml, sin evidencia de toxicidad a 10 \mug/ml. Diez \mug/ml es la concentración de saturación máxima de citocalasina B en solución salina. El efecto terapéutico producido por la administración de citocalasina B se hace más evidente durante 3 a 8 semanas después del traumatismo con el globo.
Para conseguir que una dosis terapéutica celular produzca un efecto de fijar biológicamente la luz de un vaso, es decir, uno en el que cada célula de la túnica media quede expuesta a un intervalo de concentración terapéutica, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 \mug/ml a aproximadamente 8,0 \mug/ml de citocalasina B, se llena un catéter, por ejemplo, un catéter MIC2 o MIC3 con un volumen del inhibidor citoesquelético en solución y se libera a una presión de la conexión que no dañe al vaso. Por ejemplo, se liberan de 9 a 24 ml (MIC2) o 5 a 10 ml (MIC3) de una solución de citocalasina B 8,0 \mug/ml a una presión de la conexión de 4 a 5 atmósferas durante un total de 90 segundos de tiempo de infusión. La liberación del anticuerpo monoclonal NR-ML-05 a la túnica media en estas condiciones se consiguió en modelos de arteria coronaria y femoral de cerdo. Con la presión de la conexión y tiempo de exposición mantenidos constantes, la cantidad de solución infundida puede variar porque el caudal se determina por la fuerza del ajuste. Si el caudal está por debajo del intervalo recomendado, el ajuste es demasiado fuerte para establecer una presión en cabeza hidrostática constante y, por tanto, no existe una dosis uniforme alrededor de la pared del vaso. Si el caudal está por encima del intervalo recomendado, entonces el ajuste es demasiado flojo para establecer la presión hidrostática en cabeza requerida para forzar a la solución a la región intersticial de la túnica media y la dosis a las células particulares es inferior al nivel terapéutico requerido.
También se prefiere que la administración con catéter del inhibidor citoesquelético a la túnica media y adventicia produzca un daño mínimo o nulo al vaso sanguíneo por chorros o disecciones acentuadas producidas por el procedimiento de PTCA. Por otro lado, se prefiere que la presión en cabeza hidrostática en la interfase del globo de infusión y el vaso sanguíneo varíe de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 1,5, preferiblemente de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 0,8 y, más preferiblemente, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 0,75 atmósferas, de modo que se fuerce más rápidamente la solución que contiene el inhibidor citoesquelético al espacio intersticial de la túnica media sin romper los pequeños vasos en la adventicia, el origen de la cual se expone a la presión en cabeza hidrostática.
Con preferencia, la administración del inhibidor citoesquelético da como resultado una liberación uniforme del inhibidor citoesquelético en la túnica media. Por otro lado, la administración con catéter del inhibidor citoesquelético da como resultado la liberación de una cantidad eficaz del agente a la adventicia a través del vasa vasorum, así como de la túnica media. Con preferencia, el inhibidor citoesquelético también se distribuye de forma uniforme a la adventicia. La administración con catéter de un inhibidor citoesquelético, por ejemplo, de aproximadamente 4 a aproximadamente 24 ml de citocalasina B a aproximadamente 8,0 \mug/ml, preferiblemente da como resultado un modelo uniforme de liberación de inhibidor citoesquelético, a una profundidad de penetración de hasta al menos aproximadamente un 10% más interna, más preferiblemente hasta al menos aproximadamente un 20% más interna, incluso más preferiblemente hasta un 100% más interna, de la túnica media. En el momento en que un inhibidor citoesquelético difundido desde el 10% más interna de la túnica media hasta sus límites externos en un estudio coronario en cerdos, se encontró que las células en los límites externos estaban expuestas a una dosis terapéutica.
Una forma preferida del inhibidor citoesquelético incluye citocalasina B en solución salina a una concentración de aproximadamente 8,0 \mug/ml en viales de 30 ml, que liberarán la dosis terapéutica celular preferida descrita antes necesaria para tratar una lesión simple. Con preferencia, la cantidad se distribuye de manera uniforme hasta el 20% más interno de la túnica media y se distribuye de manera uniforme a la adventicia.
En otro procedimiento terapéutico, se infunde una solución de inhibido citoesquelético, in vivo o ex vivo, en las paredes de vasos aislados (venas o arterias) que se usaran para injertos vasculares. En este ejemplo, el vaso que servía como injerto se separó o aisló y seguidamente se distendió mediante una infusión de una solución de un inhibidor citoesquelético. Con preferencia, la infusión se lleva a cabo mediante una presión en la conexión de aproximadamente 4 a aproximadamente 5 atm durante un período de tiempo de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 minutos, preferiblemente durante aproximadamente 1 a aproximadamente 2 minutos. Esta pauta de infusión dará como resultado la penetración de una dosis eficaz del inhibidor citoesquelético en las células del músculo liso de la pared vascular. Con preferencia, el inhibidor citoesquelético estará a una concentración de aproximadamente 0,1 \mug/ml a aproximadamente 8,0 \mug/ml de infundido. Con preferencia, el inhibidor citoesquelético será una citocalasina y, más preferiblemente, el inhibidor citoesquelético empleado será citocalasina B, o uno de sus análogos funcionalmente equivalentes.
Es conocido por los expertos en la técnica que los vasos periféricos que se usan para injertos vasculares en otros sitios periféricos o en injertos de desviación de arterias coronarias, fallan frecuentemente debido a estenosis postquirúrgica. Puesto que la infusión de citocalasina B mantiene el área luminal vascular en vasos traumatizados quirúrgicamente en virtud de su actividad de fijar biológicamente la luz de un vaso, su administración en este proceso puede retardar la capacidad del vaso para contraerse, dando lugar a un mayor diámetro luminal o área de la sección transversal. Por otro lado, una ventaja de esta realización es que la administración de citocalasina B de este modo puede prevenir la constricción o espasmo que se produce con frecuencia después de que los injertos vasculares se someten a anastomosis en sus posiciones proximales o distales, que puede conducir a una reducción en su función, si no al fallo total, de injertos vasculares. Así, la fijación biológica de la luz del vaso producida por citocalasinas disminuirá la incidencia de espasmos, que se puedan producir desde unos pocos días hasta meses después del procedimiento de injerto.
En otro uso los productos de la invención se pueden usar en situaciones en las que la angioplastia no es suficiente para abrir una arteria bloqueada, tal como en las situaciones que requieren la inserción de una endoprótesis vascular o derivación intravascular u otros dispositivos implantables. Así, la invención también proporciona endoprótesis vasculares, envueltas adventicias, injertos sintéticos o derivaciones que comprenden el inhibidor citoesquelético en forma sólida. Un inhibidor citoesquelético preferido es una citocalasina, por ejemplo, citocalasina B o uno de sus análogos que sea un equivalente funcional de citocalasina B. Otro inhibidor citoesquelético preferido de la invención es taxol o un análogo de taxol que sea un equivalente funcional de taxol. Con preferencia, el inhibidor citoesquelético está en forma de liberación sostenida.
Así, un dispositivo implantable, por ejemplo, una endoprótesis vascular o derivación intravascular, proporciona un medio mecánico para proporcionar un aumento en el diámetro luminal de un vaso, además del proporcionado por la acción de fijar biológicamente la luz de un vaso y/o actividad antiproliferativa del inhibidor citoesquelético, tal como citocalasina B o taxol, inmersos de forma liberable en el mismo, o administrados en solución o suspensión durante el procedimiento quirúrgico. Por otro lado, la colocación de un dispositivo implantable proporciona una mayor eficacia reduciendo o previniendo proliferación de la íntima. Esta inhibición de células del músculo liso de la íntima y estroma producido por el músculo liso posibilita una reendotelización más rápida y completa después de la colocación intravencional del dispositivo.
Kits que comprenden un dispositivo de liberación implantable y al menos un inhibidor citoesquelético de la invención
La invención proporciona un kit que comprende material de acondicionamiento que encierra, envasado por separado, al menos un dispositivo implantable adaptado para la liberación de un inhibidor citoesquelético, por ejemplo, un catéter, una envuelta adventicia, una válvula, una endoprótesis vascular, una derivación o un injerto sintético, y al menos una forma de dosis unitaria que comprende un inhibidor citoesquelético, así como medios de instrucción para su uso, conforme a los presentes procedimientos. La forma de dosis unitaria puede comprender una cantidad de al menos uno de los presentes inhibidores citoesqueléticos eficaz para conseguir los resultados terapéuticos descritos en la presente memoria cuando se libere por vía local y/o sistémica. Una realización preferida de la invención es un kit que comprende un catéter adaptado para la liberación local de al menos un inhibidor citoesquelético en una posición de la luz de un vaso de mamífero, junto con medios de instrucción que indiquen su uso conforme a la presente invención. En un aspecto preferido, el catéter de infusión puede se de forma conveniente un catéter de doble globo o de cuatro globos con una membrana permeable.
También se ha ideado que el kit de la invención comprenda un dispositivo de liberación distinto a un catéter, por ejemplo, una envuelta adventicia, una válvula, endoprótesis vascular o derivación, para la liberación sistémica o local. Una válvula, endoprótesis vascular, envuelta o derivación útil en los procedimientos de la invención puede comprender un revestimiento biodegradable o un revestimiento no biodegradable poroso, por ejemplo, una membrana de PTFE que tenga dispersado en su interior uno o más inhibidores citoesqueléticos como los descritos en la presente memoria, con preferencia, una forma de dosificación de liberación sostenida del inhibidor citoesquelético.
Otra realización de la invención es un kit que comprende un dispositivo adaptado para la liberación local de al menos dos inhibidores citoesqueléticos, una dosis unitaria de un primer inhibidor citoesquelético y una dosis unitaria de un segundo inhibidor citoesquelético, junto con instrucciones de uso conforme a la presente invención. Las formas de dosis unitaria del primer y segundo inhibidor citoesquelético se pueden introducir a través de luces discretas de un catéter, o mezclarse entre sí antes de la introducción en una única luz de un catéter. Si las formas de dosis unitaria se introducen en luces discretas de un catéter, la liberación de los inhibidores citoesqueléticos puede producirse de forma simultánea o secuencial. Por otro lado, se puede emplear un catéter de una única luz para liberar una forma de dosis unitaria de un inhibidor citoesquelético, seguida por la carga posterior de la luz con otro inhibidor citoesquelético y la liberación del inhibidor citoesquelético en la luz del vaso. Cualquiera o ambas dosis unitarias pueden actuar reduciendo la disminución del diámetro de la luz del vaso en el sitio diana.
Como alternativa, una dosis unitaria de uno de los inhibidores citoesqueléticos puede administrarse localmente, por ejemplo, a través de un catéter, mientras que una dosis unitaria de otro inhibidor citoesquelético se administra por vía sistémica, por ejemplo, por administración oral.
La invención se comprenderá mejor haciendo referencia a los siguientes ejemplos específicos.
Ejemplo 1 Unión a células del músculo liso vascular en la pared del vaso sanguíneo in vivo
La Figura 1B ilustra la unión de NR-AN-01 (un IgG2b Mab murino) a células del músculo liso en la pared vascular de una arteria en un paciente de 24 años, 4 días después de la administración i.v. de NR-AN-01. La Figura 1B es una microfotografía de una sección histológica tomada a través de la región media de una pared arterial del paciente después de administración de NR-AN-01, en la que la sección se hizo reaccionar ex vivo con IgG antiratón de cabra conjugado con HRP. La reacción del conjugado de HRP con el MAb NR-AN-01 se visualizó añadiendo 4-cloro-1-naftol o tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina como sustrato de peroxidasa (cromógeno). El producto de reacción del sustrato forma un precipitado insoluble de color púrpura o marrón oscuro en el sitio de reacción (mostrado en #2, Figura 1B). Para visualizar material de matriz extracelular colagenosa se usó tinción complementaria (mostrado en #2, Figura 1B). Las células del músculo liso se visualizan al microscopio como células teñidas de púrpura (Figura 1A y Figura 1B). Esta microfotografía (Figura 1B) demuestra la capacidad del MAb de unirse de forma específica al músculo liso vascular humano in vivo y a ser internalizado por las células y permanecer en las células durante períodos prolongados.
Ejemplo 2 Conjugados terapéuticos que contienen tricloteceno
Se construyeron conjugados de NR-AN-01 y Roridina A por acoplamiento químico de un derivado hemisuccinato de citotoxina tricloteceno (como se describe más adelante) con un anticuerpo monoclonal denominado NR-AN-01. Se prepararon dos conjugados, uno acoplado a Roridina A, posición 2' y el otro en la posición 13'. Se usaron dos esquemas en esta síntesis, como se representa en la Figura 2 y en la Figura 3. El conjugado se purificó seguidamente de la Roridina A sin reaccionar por cromatografía en columna PD-10 SEPHAROSE® (Pharmacia; Piscatawa, NJ), se analizó por cromatografía líquida de alta presión de exclusión molecular y las fracciones de la columna se caracterizaron por SDS-PAGE y focalización isoeléctrica (IEF) como se describe más adelante.
La Figura 2 muestra de forma esquemática el primer esquema de reacción para la síntesis de Roridina A hemisuccinil succinimidato (RA-HS-NHS) a través de un proceso en dos etapas con reaccionantes: anhídrido succínico, trietilamina (NEt_{3}) y dimetilaminopiridina (DMAP) presentes en diclorometano (CH_{2}Cl_{2}) a temperatura ambiente (TA); y reaccionantes N-hidroxisuccinimida (NHS) y diciclohexil carbodiimida (DCC) también en CH_{2}Cl_{2} a TA.
La Figura 3 muestra de forma esquemática el segundo esquema de reacción para la síntesis de Roridina A hemisuccinil succinimidato (RA-HS-NHS) a través de un proceso en cinco etapas con reaccionantes: cloruro de t-butil-dimetil sililo (TBMS-Cl) e imidazol en dimetilformamida (DMF) a temperatura ambiente (TA); anhídrido acético, trietilamina (TEA) y dietilaminopiridina en diclorometano (CH_{2}Cl_{2}) a TA; anhídrido succínico, trietilamina (TEA) y dimetilaminopiridina (DMAP) en (CH_{2}Cl_{2}) a TA; y reaccionantes N-hidroxisuccinimida (NHS) y diciclohexil carbodiimida (DCC).
Síntesis de ácido 2' Roridina A hemissuccinico (2)
Se añadieron 15 ml de diclorometano a 0,5 g (0,94 mmol) de Roridina A. A esta solución se añadieron 0,104 g (1,04 mmol) de anhídrido succínico. Se añadieron a esta mezcla 0,2 ml de trietilamina en 5 ml de diclorometano. Se añadió a la mezcla de reacción homogénea una cantidad catalítica de dimetilaminopiridina y se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas. La finalización de la reacción se siguió por cromatografía en capa fina (CH_{2}Cl_{2}: CH_{2}OH = 9,7:0,3 con unas pocas gotas de ácido acético). Al final de la reacción se añadieron 0,3 ml de ácido acético glacial y el disolvente se eliminó a presión reducida. El residuo bruto seco se repartió entre agua y cloruro de metileno. Los extractos reunidos de cloruro de metileno (3 x 50 ml) se secaron sobre sulfato sódico anhidro, se eliminó el disolvente a vacío y se secó proporcionando 0,575 g (96%) de una mezcla bruta de compuestos. Separación por HPLC Preparativa C18 de la mezcla bruta en acetonitrilo al 50% - agua con ácido acético al 2% proporcionó 0,36 g (60%) de 2 como un sólido blanco.
Síntesis de succinimidil 2'-Roridina A hemisuccinato (3)
Se añadieron 0,055 g (0,478 mmol) de N-hidroxisuccinimida a 0,3 g (0,476 mmol) de ácido 2'-Roridina A hemisuccínico en 30 ml de diclorometano. Se añadieron a la mezcla transparente 0,108 g (0,524 mmol) de diciclohexilcarbodiimida. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 horas. La finalización de la reacción se siguió por TLC (CH_{2}Cl_{2}: CH_{3}OH=9,7:0,3 con unas pocas gotas de ácido acético) como disolvente de desarrollo. Se añadieron a la mezcla de reacción unas pocas gotas de ácido acético glacial y el disolvente se eliminó a presión reducida. Se añadió al diclorometano residuo seco y se filtró el DCU precipitado. El disolvente del filtrado se eliminó a presión reducida proporcionando un sólido blanco. Del producto bruto, se purificaron 0,208 g (60%) de 3 por HPLC preparativa en acetonitrilo al 50% con ácido acético al 2% como fase móvil.
Síntesis de 13'-t-Butildimetilsili roridina A (4)
Se añadieron 0,055 g (0,367 mmol) de cloruro de t-butildimetilsililo y 0,025 g (0,368 mmol) de imidazol a 72,3 mg (0,136 mmol) de Roridina A en 0,5 ml de solución de dimetilformamida. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas. La finalización de la reacción se siguió por cromatografía en capa fina sobre gel de sílice usando MeOH al 1%-CHCl_{3} como disolvente de desarrollo. El disolvente de la mezcla de reacción se eliminó a vacío y se secó. El producto bruto se repartió entre agua y cloruro de metileno. El disolvente de los extractos de cloruro de metileno reunidos se eliminó a presión reducida y se secó. El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida usando EtOAc:hexano (1:3) como disolvente de elución. El disolvente de los eluatos se eliminó a presión reducida proporcionando 0,66 g (75%) de 4 como un sólido.
Síntesis de 13'-Butildimetilsilil 2'-Acetil Roridina A (5)
Se añadieron 0,3 ml de anhídrido acético, 0,2 ml de trietilamina y unos pocos cristales de dimetilaminopiridina a 0,1 g (0,155 mmol) de 13'-t-butildimetilsilil Roridina A en 10 ml de diclorometano y se almacenó a temperatura ambiente durante 2 horas. La finalización de la reacción se siguió por TLC en metanol al 1% - cloruro de metileno como disolvente de desarrollo. El disolvente se eliminó a presión reducida y se purificó por una columna en gel de sílice usando metanol al 1% - cloroformo como disolvente de elución. El disolvente de los eluatos se eliminó a vacío proporcionando 0,085 g (80%) de 5 como un sólido.
Síntesis de 2' Acetil Roridina A (6)
Se añadieron 0,3 ml de solución 1M de fluoruro de tetrabutil-amonio en THF a 0,05 g (0,073 mmol) de 2'-acetil 13'-t-butildimetilsilil Roridina A en 5 ml de tetrahidrofurano. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La finalización de la reacción se siguió por cromatografía en capa fina sobre gel de sílice usando MeOH al 1%-CHCl_{3} como disolvente de desarrollo. El disolvente de la mezcla de reacción se eliminó a presión reducida y se secó. El producto bruto se purificó en una columna de gel de sílice usando CH_{3}OH al 1%-CHCl_{3} como disolvente de elución. El disolvente de los eluatos reunidos se eliminó a vacío proporcionando 0,020 g (48%) de 6 como un sólido.
Síntesis de 2'-Acetil-13'-hemisuccinil Roridina A (7)
Se añadieron 0,025 g (0,25 mmol) de anhídrido succínico y 35 ml de trietilamina a 0,05 g (0,087 mmol) de 2'-acetil Roridina A en 1 ml de diclorometano. Se añadieron como catalizador unas pocas gotas de dimetilaminopiridina. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La finalización de la reacción se siguió por cromatografía en capa fina usando MeOH al 5%-CH_{2}Cl_{2} como disolvente de desarrollo. Al finalizar la reacción se añadieron 30 ml de ácido acético glacial. El disolvente de la mezcla de reacción se eliminó a presión reducida y se secó. El producto bruto se repartió entre agua y acetato de etilo. El disolvente de las fracciones de acetato de etilo reunidas se eliminó a presión reducida. El producto bruto se purificó haciéndolo pasar a través de una columna de gel de sílice proporcionando 0,039 g (66%) de 7 como un sólido blanco.
Síntesis de succinimidil 2'-acetil-13'-Roridina A hemisuccinato (8)
Se añadieron 0,009 g (0,09 mmol) de N-hidroxisuccinimida a 0,036 g (0,0050 mmol) de ácido 2'-acetil 13'-Roridina A hemisuccínico en 2 ml de diclorometano. Se añadieron a una solución agitada 0,012 g (0,059 mmol) de diciclohexilcarbodiimida. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 8 horas. La finalización de la reacción se siguió por cromatografía en capa fina sobre gel de sílice usando MeOH al 5%-CH_{2}Cl_{2} como agente de desarrollo. Se añadieron a la mezcla de reacción unas gotas de ácido acético glacial. El disolvente de la mezcla de reacción se eliminó a presión reducida y se secó. El producto bruto se purificó en una columna de gel de sílice usando MeOH al 5%-CH_{2}Cl_{2} como disolvente de elución. El disolvente de los eluatos reunidos se eliminó a vacío proporcionando 0,025 g (61%) de 8 como un sólido blanco.
Conjugación de succinimidil 2'-Roridina A hemisuccinato (3) y succinimidil 2'-Acetil-13'-Roridina A hemisuccinato (8) con anticuerpo completo (MAb) NR-AN-01
Las reacciones de conjugación se realizaron a pH 8,0 en tampón borato en presencia de dimetil sulfóxido al 25% (DMSO) como disolvente a temperatura ambiente con agitación suave durante 45 minutos antes de purificar por cromatografía de exclusión de tamaños. Las relaciones molares de precursor farmacológico tricloteceno a anticuerpo fueron 25:1 y 40:1 para los análogos de 2' y 13' Roridina A (3 y 8), respectivamente. La concentración de anticuerpo fue 0,9 a 1,0 mg/ml durante la reacción de conjugación.
Una reacción típica del análogo 2' (3) con 25 mg de anticuerpo fue como sigue
Se añadieron 10 ml de PB S y 5 ml de tampón borato (0,5 M, pH 8,0) a 4,7 ml de 5,3 mg de Ab/ml en solución salina tamponada con fosfato (es decir, PBS; NaCl 150 mM, fosfato 6,7 mM, pH 7,3). Con agitación suave de la mezcla de reacción, se añadieron 6,3 ml de DMSO que contenía 1,37 mg de succinimidil 2' Roridina A hemisuccinato (3) gota a gota durante un período de 15 segundos.
Purificación
Para purificar, se cargaron alícuotas de reacción de 1 ml en columnas Pharmacia PD-10 Sepharose® equilibradas en PBS. El conjugado eluido se recogió en fracciones de 2,4 a 4,8 ml. Las alícuotas de conjugado purificado en PD-10 se agruparon y concentraron en un concentrador Amicon PM-10 DiAflo® hasta 1,5 a 2,0 mg de Ab/ml; se filtraron estéril a través de un Acrodis® 0,2 Gelman y se llenaron en viales de vidrio estériles en volúmenes de 5 ml.
El conjugado 2' se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y seguidamente se almacenó a -70ºC hasta su uso. El conjugado NR-AN-01 13' Roridina A se almacenó congelado o se refrigeró (es decir, 5 a 10ºC).
Caracterización de conjugados
La concentración de proteínas se determinó por ensayo BCA usando el método del reaccionante de cobre (Pierce Chemical Corp.).
La valoración del grado de derivatización de anticuerpo se realizó hidrolizando en primer lugar una alícuota de conjugado en carbonato 0,2 M, pH 10,3 durante 4 horas (a temperatura ambiente para el conjugado 2' o a 37ºC para el conjugado 13') seguido por filtración a través de una membrana PM-30. El filtrado se ensayó para determinar la Roridina A en un sistema HPLC C-18 de fase inversa usando una fase móvil de CH_{3}CN:H_{2}O:HOAc con una relación 50:48:2, respectivamente. Se usó un factor de corrección de 1,32 para corregir la descomposición de anillo macrocíclico paralela que da productos polares durante la hidrólisis del conjugado 13'.
También se realizaron cromatografía de exclusión de tamaños en un sistema HPLC DuPont Zorbax® y focalización isoeléctrica usando placas del gel Serva® (pH 3 a 10). No hay indicación de observar agregación por HPLC.
El inmunoensayo de conjugados Roridina A-anticuerpo se realizó en un ELISA competitivo usando Ab biotinilado con detección de estreptavidina/peroxidasa o por un ensayo de unión celular competitivo usando anticuerpo marcado con ^{125}I. Como alternativa se midió la inmunoreactividad en condiciones de saturación de antígeno en un ensayo de unión celular en el que el anticuerpo se marcó inicialmente con I-125 por el método de cloramina T y luego se derivatizó con los precursores de Roridina A 2' y 13'.
Ejemplo 3 Cinética de unión a células del músculo liso
Para administración por un catéter i.v., es deseable que los conjugados terapéuticos se administren en menos de 3 a 5 minutos, de modo que el flujo sanguíneo pueda reestablecerse en el paciente. Por tanto, se llevaron a cabo estudios para determinar la cinética de unión de una proteína de unión al músculo liso con una Ka mayor que 10^{9} litros/mol. Debido a que las células del músculo liso vascular humano crecen lentamente en cultivo, y se encontró que células del músculo liso de babuino expresan el marcador de la superficie celular CSPG humano, se usaron en muchos de los estudios descritos en los siguientes ejemplos células de músculo liso de arteria de babuino BO54 y células A375 M/M humanas (melanoma; ATCC #;CRL1619) que tienen el marcador de superficie CSPG.
Para los estudios de cinética, se sembraron en placas de microvaloración de 96 pocillos a 2500 células/pocillo células A375 M/M y BO54. Las placas se envolvieron en papel de aluminio y se incubaron a 37ºC durante la noche en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5%/aire al 95%. Después de aproximadamente 18 horas, se retiraron las placas de incubación y se fijaron las células con glutaraldehído al 0,05% durante 5 minutos para evitar la renovación de la membrana. Después de fijar, se lavaron las placas exhaustivamente con PBS que contenía Tween 20 al 0,5%. Se prepararon diluciones en serie a la mitad de un conjugado terapéutico NR-AN-01 que contenía Roridina A en concentraciones de proteína de 10 mg/ml a 20 ng/ml y se prepararon alícuotas de cada dilución en dos pocillos. Las placas se incubaron a 40ºC con el conjugado NR-AN-01 durante 5, 15, 30 y 60 minutos, después de lo cual se retiró la proteína no ligada por aspiración y se añadieron 100 ml de tampón CS (suero de pollo al 5%/Tween® 20 al 0,5% en PBS) a cada pocillo. Se separó el tampón CS y el conjugado terapéutico NR-AN-01 unido a las células se visualizó añadiendo 100 ml de IgG antiratón de cabra conjugado con HRP (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a cada pocillo; incubando a 4ºC durante 1 hora; lavando con PBS/Tween al 0,05% para separar el IgG de cabra no ligado y añadiendo sustrato cromógeno ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS) (es decir, para HRP). Después de incubar durante 30 minutos, se cuantificó la cantidad de NR-AN-01 ligado a las células midiendo la absorbancia a 415 nm y 490 nm usando un lector de placas ELISA equipado para la adquisición de datos por un ordenador Compaq.
La Figura 4A representa gráficamente los resultados de los estudios in vitro en los que se mantuvieron a 4ºC células positivas al marcador A375 m/m (es decir, para evitar la renovación de la membrana) durante 5 minutos (cuadrados abiertos, Figura 4A), 15 minutos (rombos cerrados, Figura 4A), 30 minutos (cuadrados cerrados, Figura 4A) o 60 minutos (rombos abiertos, Figura 4A) con diferentes concentraciones de NR-AN-01 (NRAN01 \mug/ml). La unión del anticuerpo NR-AN-01 a las células A375 se cuantificó lavando para eliminar el anticuerpo no ligado, añadiendo IgG antirarón de cabra conjugado con HRP para que reaccionara con el MAb ligado a las células, lavando para eliminar el segundo anticuerpo de cabra no ligado y añadiendo sustrato ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS) para peroxidasa. La aparición de color se controló después de 30 minutos a 415 nm y 490 nm (ABS415,490).
La Figura 4B representa gráficamente los resultados de estudios in vitro llevados a cabo de una forma similar a la descrita antes con respecto a la Figura 4A, pero usando células del músculo liso positivas al marcador BO54, es decir, en lugar de células A375 m/m.
Los resultados presentados en la Figura 4A y en la Figura 4B muestran una unión significativa de NR-AN-01 a células A375 y BO54 en un período de 5 minutos a 4ºC, incluso en la dosis más baja de 20 ng/ml.
Ejemplo 4 Efectos de Roridina A y conjugados RA-NR-AN-01
En los experimentos detallados en el Ejemplo 5 y Ejemplo 6 siguientes se ensayaron los efectos Roridina A (RA) y conjugados RA-NR-AN-01 sobre la síntesis de proteína celular (es decir, por incorporación de ^{3}H-leucina) y actividad metabólica (es decir, por ensayo de MTT mitocondrial). Los estudios en el Ejemplo 4 incluyen experimentos para determinar los efectos de un tratamiento de larga duración (es decir, 24 horas) con los agentes. Los estudios en el Ejemplo 5 incluyen experimentos para determinar los efectos de tratamiento "pulsado" (es decir, 5 minutos) sobre células. En ambos estudios, la especificidad celular de los efectos se evaluó incluyendo células "diana" (es decir, células que incorporan el "marcador" CSPG) y células no diana. Con fines comparativos, se incluyó también RA libre (es decir, no acoplada) en los estudios. Los efectos sobre la síntesis de proteínas celulares o actividad metabólica se evaluaron inmediatamente después del tratamiento, o se dejó un "período de recuperación" (es decir, que supone incubar las células durante la noche a 37ºC) para determinar los efectos a largo plazo de los agentes sobre las poblaciones de células.
Efectos metabólicos después de la exposición de 24 horas
Aunque se conoce que los conjugados anticuerpo monoclonal-fármaco pueden tener un grado de especificidad para células que incorporen antígenos marcadores cuando se emplean in vivo, se ha demostrado que es más difícil en muchos sistemas demostrar la especificidad de acción in vivo, en especial con compuestos que son lipófilos. De este modo se llevaron a cabo los presentes experimentos, en los cuales se ensayaron los efectos inhibidores de conjugado NR-AN-01-Roridina A en células diana y no diana durante 24 horas. Los resultados con RA-NR-AN-01 se compararon con el efecto de Roridina A libre durante el mismo período de 24 horas. Se usó un ensayo de azul de metil-tetrazolio modificado (MTT) con bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-iI)-2,5-difenil tetrazolio (Sigma) para determinar la actividad metabólica celular. Este ensayo se piensa que mide la actividad deshidrogenasa en mitocondrias celulares. Para algunos de estos estudios, se usaron líneas celulares M14 (melanoma) y BO54 (músculo liso) como células diana positivas al marcador y células HT29 (carcinoma de colon; ATCC #HTB38) como control de especificidad no diana. En otros estudios se usó A375 como célula positiva al marcador. Las células HT29 y M14 se sembraron en placas de microvaloración de 96 pocillos en una concentración de 5,0 x 10^{3} células/pocillo y las células BO54 se sembraron a 2,5 x 10^{3} células/pocillo. Se prepararon diluciones en serie a la mitad de Roridina A libre y 2'-RA-HS-NR-AN-01 (es decir, Roridina A acoplada a través de un agente de acoplamiento hemisuccinato (HS) en la posición 2' a NR-AN-01) en DMEM en un intervalo de concentraciones de proteína de 20 mg/ml a 40 pg/ml. Se añadieron agentes de ensayo (por duplicado) a pocillos de microvaloración (100 ml/pocillo) y las placas se envolvieron en papel de aluminio y se incubaron a 37ºC en una atmósfera humidificada compuesta por CO_{2} al 5%/aire al 95% durante 24 horas. Después de 24 horas, se retiró el medio (por aspiración), se añadió DMEM (100 ml/pocillo) y se devolvieron las células para incubar durante otra noche más (es decir, 16 a 18 horas) como "período de recuperación". Al finalizar el "período de recuperación" se determinó la actividad metabólica celular añadiendo 20 ml a cada pocillo de una solución de MTT 5 mg/ml. Las placas se cubrieron y se incubó a 37ºC durante 4 horas y luego se desarrolló la reacción añadiendo 100 ml/pocillo de SDS al 10%/HCl 0,1 N). El producto de reacción en formazan solubilizado de color azul oscuro se desarrolló a temperatura ambiente después de 16 a 18 horas y se cuantificó usando un lector de placas de microvaloración en ELISA a una absorbancia de 570 nm.
La Figura 5A representa gráficamente los resultados de estudios in vitro en los que se incubaron células de músculo liso positivas al marcador BO54 con diferentes concentraciones de RA-NR-AN-01 (NRAN01-RA; cuadrados abiertos, Figura 5A) o Roridina A libre (RA libre; rombos cerrados, Figura 5A) durante un período de 24 horas, se lavó y se devolvió al cultivo durante el período de recuperación de una noche de 16 a 18 horas adicional antes de ensayar la actividad metabólica en un ensayo MTT. Las concentraciones de RA libre y RA-NR-AN-01 se expresan como la concentración calculada de Roridina A (en mg/ml representada en escala logarítmica) en el ensayo (es decir, en lugar de los mg/ml totales de proteína NR-AN-01 en el ensayo), de modo que se pueden realizar comparaciones directas. La actividad metabólica de las células en el ensayo MTT se presenta como porcentaje de la actividad metabólica medida en un cultivo de células control no tratadas (es decir % del control).
La Figura 5B representa gráficamente los resultados de estudios in vitro llevados a cabo de una forma similar a la descrita antes con respecto a la Figura 5A, pero comparando los efectos solo de RA-NR-AN-01 (NRAN01-RA) sobre tres tipos de células diferentes: a saber, células del músculo liso BO54 positivas al marcador (BO54-NRAN01-RA; cuadrados abiertos, Figura 5B); células HT29 control negativas al marcador (HT29-NRAN01-RA; rombos cerrados, Figura 5B); y células M14 positivas al marcador (M14-NRAN01-RA; cuadrados cerrados, Figura 5B). Como se describe antes con respecto a la Figura 5A, las concentraciones en el presente experimento se expresan en términos de ug/ml de Roridina A. La actividad metabólica de las células se expresa de una forma similar a la de la Figura 5A, es decir, como porcentaje de la actividad medida en un cultivo control sin tratar de células (% de control).
Los resultados presentados en la Figura 5A y en la Figura 5B muestran que la actividad metabólica medida en el ensayo MTT fue significativamente menor en todas las poblaciones de células ensayadas, incluso 16 a 18 horas después de un período de incubación de 24 horas en cualquiera de Roridina A o en los conjugados 2' ó 13' de RA-NR-AN-01. Los efectos de los conjugados RA-NR-AN-01 parecen ser inhibidores no específicos tanto para células diana (BO54 y M14) como no diana (HT29) (Figuras 5A y 5B). Los efectos inhibidores se observaron en Roridina A libre o en RA-conjugado con concentración > 10 ng/ml.
A efectos comparativos, se llevó a cabo un segundo estudio en el que se evaluaron los efectos de conjugados de endotoxina de Pseudomonas (PE) sobre las células en un protocolo similar. Para estos estudios, se trataron células diana y no diana con PE o PE-NR-AN-01 durante 24 horas y se dejó un "período de recuperación" (como antes) antes de analizar la actividad metabólica en un ensayo MTT.
La Figura 6A representa gráficamente los resultados de estudios in vitro llevados a cabo de una forma similar a los descritos antes con respecto a la Figura 5A, pero diseñados para estudiar los efectos metabólicos de PE-NR-AN-01 (NRAN01-PE) sobre las células, es decir, en lugar de RA-NR-AN-01. Se usaron tres tipos diferentes de células: a saber, células del músculo liso BO54 positivas al marcador (BO54; cuadrados abiertos, Figura 6A; células control HT29 negativas al marcador (HT29; rombos cerrados, Figura 6A); y, células M14 positivas al marcador (MT14; cuadrados cerrados, Figura 6A). En este estudio, se expresa la concentración de conjugado en \mug/ml de proteína NR-AN-01 (representado en una escala logarítmica) y la actividad metabólica se expresa como porcentaje de actividad MTT medida en un cultivo control no tratado (% de control).
La Figura 6B representa gráficamente los resultados de estudios in vivo llevados a cabo de una forma similar a la descrita antes con respecto a la Figura 6A, pero diseñado para comparar los efectos obtenidos con PE libre (PE) con los obtenidos antes, es decir, en la Figura 6A, con PE-NR-AN-01. Las células, condiciones de cultivo, cálculos y presentación de los resultados son iguales a los de la Figura 6A anterior.
Los resultados presentados en la Figura 6A y en la Figura 6B muestran que una exposición de 24 horas a PE-NR-AN-01 o PE libre era inhibidora no específico para células en concentraciones mayores que 100 ng/ml.
Aunque este tipo de inhibición no específica se consideró que era de posible valor para aterectomía biológica, no se consideró deseable para el tratamiento de reestenosis después de angioplastia en la que las células muertas y que van a morir pueden liberar factores que estimulen la proliferación de músculo liso.
Ejemplo 5 Efectos del tratamiento pulsado sobre la actividad celular
Se llevaron a cabo otros estudios para evaluar los efectos de una exposición de corta duración, es decir, 5 minutos, a un conjugado terapéutico que contenía Roridina A sobre las células. En estos estudios, se evaluó tanto la actividad metabólica (medida en ensayos MTT) como la síntesis de proteína celular (medida por incorporación de ^{3}H-leucina).
Efectos después de 5 minutos de exposición: Síntesis de proteínas
Se evaluaron los efectos de una exposición de 5 minutos a Roridina A libre (RA) o un conjugado terapéutico. Se emplearon Roridina A-NR-AN-01 acoplado a través de un hemisuccinilo (HS) bien en la posición 2' (2'RA-HS-NR-AN-01) o en la posición 13' (13'RA-HS-NR-AN-01). (En el caso de 13'RA-HS-NR-AN-01, también estaba acetilada la posición 2' de Roridina A. La RA, conjugados 2' o 13'RA-NR-AN-01 se diluyeron a la mitad en DMEM estéril en un intervalo de concentraciones que variaba de 400 ng/ml a 780 pg/ml de Roridina A. (Las muestras de ensayo estaban todas normalizadas con respecto a Roridina A, de modo que se podían realizar comparaciones directas de los efectos en dosis comparables). Se tomaron alícuotas de las muestras (por duplicado) en placas de microvaloración por duplicado a 100 ml/pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos.
Se determinaron tanto los efectos a corto plazo como a largo plazo de las muestras de ensayo sobre células A375 positivas al marcador y HT29 negativas al marcador. Para el estudio de los efectos a corto plazo, se añadieron inmediatamente después de un tratamiento de 5 minutos con conjugado (o RA) 100 ml/pocillo de ^{3}H-leucina (0,5 mCi/ml) y se evaluó la síntesis de proteínas durante un período de cuatro horas. Para determinar los efectos a largo plazo, se trataron las células durante 5 minutos, se lavaron y luego de devolvieron al cultivo para un período de "recuperación" de 24 horas en medio DMEM que contenía bien NBS al 5%/Serum Plus® al 5% (es decir, para células A375 o HT29) o FBS al 10% (es decir, para células BO54). Al finalizar el período de "recuperación", se retiró el medio de incubación (es decir, por aspiración) y se añadió ^{3}H-leucina (como antes). En ambos casos (es decir, a corto plazo y a largo plazo), la síntesis de proteínas de las células se evaluó incubando las células con ^{3}H-leucina durante 4 horas a 37ºC en una cámara humidificada (como antes) y todos los resultados se calcularon comparando con células no tratadas (es decir, control 100%). Después de 4 horas se retiró la ^{3}H-leucina, se separaron las células del sustrato por tratamiento con tripsina, se aspiraron (usando un recolector celular PHD^{TM} (Cambridge Technology, Inc., Cambridge, MA)) y se recogieron por filtración en filtros de fibra de vidrio. Los filtros de fibra de vidrio se secaron y se cuantificó la radiactividad por espectroscopía de centelleo líquido en un contador de centelleo líquido Beckman.
La Figura 7A representa gráficamente los resultados de estudios in vitro llevados a cabo para investigar los efectos sobre células HT29 negativas al control de una exposición de 5 minutos a diferentes concentraciones de Roridina A (RA libre; cuadrados abiertos, Figura 7A) o conjugados 2'RA-NR-AN-01 (2'RA-NRAN01; cuadrados cerrados, Figura 7A) o 13'RA-NR-AN-01 (13'RA-NRAN01; triángulos cerrados, Figura 7A). Las concentraciones de RA libre, 2'RA-NR-AN-01 o 13'NR-AN-01 se expresan como la concentración calculada de Roridina A en el ensayo (en \mug/ml representados en una escala logarítmica), es decir, en lugar de los \mug/ml totales de proteína NR-AN-01, de modo que se puedan hacer comparaciones directas. Para estos estudios, se trataron las células durante 5 minutos, se lavaron y luego se devolvieron al cultivo durante 4 horas, tiempo durante el cual se evaluó la síntesis de proteína celular añadiendo 0,5 mCi/ml de ^{3}H-leucina al medio de cultivo. Al finalizar el período de 4 horas, se recogieron las proteínas celulares y se determinó la radiactividad. Los resultados se expresan como porcentaje de la radiactividad registrada en un cultivo de células HT29 control (no tratado) (es decir, % del control).
La Figura 7B representa gráficamente los resultados de estudios in vitro que investigan los efectos sobre células HT29 negativas al marcador control de una exposición de 5 minutos a diferentes concentraciones de RA libre (cuadrados abiertos, Figura 7B), 2'RA-NRAN01 (cuadrados cerrados, Figura 7B) o 13'RA-NRAN01 (triángulos cerrados, Figura 7B) como se describe con respecto a la Figura 7A, pero en los presentes experimentos las células se incubaron durante un período de recuperación de 16 a 18 horas (es decir, durante la noche) antes de ensayar la síntesis de proteínas en un ensayo de síntesis de proteínas de ^{3}H-leucina de cuatro horas. Los resultados se presentan de una forma similar a los anteriores de la Figura 7A.
Los resultados presentados en la Figura 7A y en la Figura 7B muestran los efectos a corto plazo y a largo plazo, respectivamente, de RA, 2'RA-HS-NR-AN-01 y 13'-RA-HS-NR-01 sobre la síntesis de proteínas por células HT29 control. Los resultados muestran una inhibición dosis-respuesta de la síntesis de proteínas celulares por Roridina A libre, pero no por RA-NR-AN-01 en células HT29. La inhibición desencadenada por RA durante los 5 minutos de incubación estaba todavía de manifiesto después de las 16 a 18 horas del período de recuperación (Figura 7B). Por el contrario, el tratamiento de células HT29 no diana con 2'RA-HS-NR-AN-01 o 13'-RA-HS-NR-01 no originó una inhibición detectable sobre la síntesis de proteínas. Así, estos resultados (al contrario de los obtenidos antes durante 24 horas) parecen sugerir un grado sorprendente de especificidad a la acción in vitro de los conjugados de NR-AN-01 cuando el tratamiento se liberó en un pulso de 5 minutos. No obstante, también fue posible que el conjugado de NR-AN-01 fuera inactivo y así se llevaron a cabo experimentos adicionales para evaluar el efecto de los conjugados sobre células diana.
La Figura 7C representa gráficamente los resultados de estudios in vitro que investigan los efectos sobre células A375 m/m positivas al marcador de una exposición de 5 minutos a diferentes concentraciones de RA libre (cuadrados abiertos, Figura 7C), 2'RA-NR-AN-01 (cuadrados cerrados, Figura 7C) o 13'RA-NR-AN-01 (triángulos cerrados, Figura 7C), como se describe antes con respecto a la Figura 7A. En los presentes estudios, las células A375 se incubaron durante 5 minutos en el agente de ensayo, se lavaron y se evaluaron para detectar la síntesis de proteínas durante las cuatro horas siguientes añadiendo 0,5 mCi/ml de ^{3}H-leucina al medio de cultivo. Los resultados de los experimentos se representan de una forma similar a los descritos antes con respecto a la Figura 7A.
La Figura 7D representa gráficamente los resultados de estudios in vitro que investigan los efectos de células A375 m/ml positivas al marcador de una exposición de 5 minutos a diferentes concentraciones de RA libre (cuadrados abiertos, Figura 7D), 2'RA-NRAN01 (cuadrados cerrados, Figura 7D), 13'RA-NRAN01 (triángulos cerrados, Figura 7D), como se ha descrito antes con respecto a la Figura 7B. En los presentes estudios, se incubaron las células A375 durante 5 minutos en el agente de ensayo, se lavaron y luego se devolvieron al cultivo durante un período de recuperación de 16 a 18 horas (es decir, recuperación durante la noche), después de dicho tiempo se evaluó la síntesis de proteína durante un ensayo de 4 horas de síntesis de proteínas con ^{3}H-leucina. Los resultados de los experimentos se representan de una forma similar a los descritos antes con respecto a la Figura 7A.
Los resultados presentados en la Figura 7C y en la Figura 7D muestran los efectos a corto plazo y a largo plazo, respectivamente de RA, 2'RA-HS-NR-AN-01 y 13'-RA-HS-NR-AN-01 sobre la síntesis de proteínas por células diana A375. El tratamiento de células diana con el conjugado terapéutico 2' ó 13'RA-NR-AN-01 dio lugar a una inhibición a corto plazo de la síntesis de proteínas, es decir, observada inmediatamente después de un tratamiento pulsado de un minuto (Figura 7C). Estos hallazgos, cuando se combinan con los hallazgos de la Figura 7A y la Figura 7B, anteriores, sugieren que los conjugados RA-NR-AN-01 eran activos y que éstos eran inhibidores específicos para células diana pero no para células no diana. Resulta interesante que cuando se devolvieron las células diana tratadas con un "pulso" al cultivo no se observaron efectos inhibidores a largo plazo (Figura 7D). Los resultados presentados en la Figura 7C y en la Figura 7D de nuevo muestran que Roridina A es inhibidora no específica de células de ensayo (es decir, de una forma similar a la Figura 7A y la Figura 7B, anteriores) y que su efecto sobre las células se manifiesta incluso después de un período de recuperación de 16 a 18 horas. Así, los efectos específicos de los conjugados RA-NR-AN-01 sobre células diana durante un tratamiento "pulsado" parecen ser una propiedad de las proteínas de unión a NR-AN-01.
Los resultados obtenidos con células del músculo liso arterial BO54 fueron similares a los obtenidos antes con células A375, es decir, Roridina libre mostró una inhibición dosis-respuesta de la síntesis de proteína a corto plazo igual al 60%, 66% y 90% del control a 200 ng/ml, 100 ng/ml y 50 ng/ml; y en los efectos a largo plazo sobre la síntesis de proteínas igual a 27%, 46% y 98% del control en las mismas dosis. Por el contrario, los conjugados 2' ó 13'RA-NR-AN-01 mostraron una inhibición de solo el 10-20% para los efectos a corto o largo plazo sobre la síntesis de proteínas (es decir, > 80% del control).
Así, los resultados muestran un efecto reversible específico a corto plazo de NR-AN-01 conjugado con Roridina A sobre células diana liberadas en forma de un tratamiento "pulsado". Sin embargo, puesto que se evaluó solo la síntesis de proteínas en estos experimentos, era posible que la actividad metabólica celular pudiera estar afectada en las células como resultado del tratamiento "pulsado". Por tanto, se llevaron a cabo otros estudios en los que se evaluó la actividad metabólica celular después del tratamiento "pulsado".
Efectos después de 5 minutos de exposición: Actividad metabólica
Se llevaron a cabo ensayos MTT a las 48 horas después de una exposición de 5 minutos de células diana y no diana a RA o conjugados AR-NR-AN-01. Las células diana en estos estudios incluyeron BO54 y A375 y las células no diana incluyeron células HT29. Se sembraron placas de microvaloración de 96 pocillos con 2500 células/pocillo, se envolvieron en papel de aluminio y se incubaron en una cámara humidificada que contenía CO_{2} al 5%/aire al 95% durante 16 a 18 horas. Se prepararon diluciones en serie a la mitad de Roridina A (RA), 2'RA-HS-NR-AN-01 y 13'RA-HS-NR-AN-01 a partir de 400 ng/ml a 780 pg/ml y se dispensaron alícuotas de 100 ml en pocillos duplicados. Después de una exposición de 5 minutos a las muestras de ensayo, se lavaron las células para eliminar las muestras de ensayo y se añadió medio nuevo. Las células se dejaron 48 horas de recuperación antes de ensayar: es decir, se incubaron las placas durante 48 horas y luego se determinó la actividad metabólica celular añadiendo 20 ml/pocillo de una solución de MTT 5 mg/ml. Las placas se cubrieron y se incubaron a 37ºC durante 4 horas y luego se desarrolló la reacción como se ha descrito antes (véase el Ejemplo 4 anterior). El producto de reacción de formazan solubilizado azul oscuro se desarrolló a temperatura ambiente después de una incubación de 16 a 18 horas. Las muestras se cuantificaron usando un lector de placas de microvaloración ELISA a una absorbancia de 570 nm.
La Figura 8A representa gráficamente los resultados de estudios in vitro que investigan los efectos de células del músculo liso BO54 positivas al marcador de una exposición de 5 minutos a diferentes concentraciones de Roridina A (cuadrados abiertos, Figura 8A), 2'RA-NR-AN-01 (NRAN01-2'RA; rombos cerrados, Figura 8A) o 13' RA-NR-AN-01 (NRAN01-13'RA; cuadrados cerrados, Figura 8A). Los experimentos se llevaron a cabo de una forma similar a la descrita antes con respecto a la Figura 7B, pero se ensayó la actividad metabólica por un ensayo MTT, es decir, en lugar de la síntesis de proteínas como en la Figura 7B, y se dio a las células también un período de 48 horas para recuperarse (en lugar de 24 horas como en la Figura 7B). Los resultados de los experimentos se representan de una forma similar a la descrita (antes) con respecto a la Figura 7A.
La Figura 8B representa gráficamente los resultados de estudios in vivo que investigan los efectos de células A375 positivas al marcador de una exposición de 5 minutos a diferentes concentraciones de Roridina A (cuadrados abiertos, Figura 8B), 2'RA-NR-AN-01 (NRAN01-2'RA; rombos cerrados, Figura 8B), 13'RA-NAN-01 (NRAN01-13'RA; cuadrados cerrados, Figura 8B). Los experimentos se llevaron a cabo (y los resultados se representaron) de una forma similar a la descrita antes con respecto a la Figura 8A.
La Figura 8C representa gráficamente los resultados de estudios in vitro que investigan los efectos sobre células HT29 negativas al marcador de una exposición de 5 minutos a diferentes concentraciones de Roridina A (cuadrados abiertos, Figura 8C), 2'RA-NR-AN-01 (NRAN01-2'RA; rombos cerrados, Figura 8C), 13'RA-NR-AN-01 (NRAN01-13'RA; cuadrados cerrados, Figura 8C). Los experimentos se llevaron a cabo (y los resultados se representaron) de una forma similar a la descrita antes con respecto a la Figura 8A.
Los resultados presentados en las Figuras 8A-8C muestran ligeras diferencias entre los diferentes conjugados RA-NR-AN-01 en las dosis mayores, pero en las dosis menores 2' y 13'RA-NR-AN-01 no inhibieron de forma significativa la actividad metabólica de las células diana (es decir, BO54 y A375) o células no diana (es decir, HT29) durante un período de larga duración (es decir, 48 horas). Así, los resultados sugieren que la inhibición a corto plazo de la síntesis de proteínas en células diana (Figuras 7C-7D, anteriores) no tiene efectos metabólicos a largo plazo sobre las células como se midió por los ensayos MTT. Que estos ensayos pudieron detectar alteraciones metabólicas en células resultado de una exposición de 5 minutos fue evidente por los resultados obtenidos con Roridina A libre. En este caso, la Roridina A libre fue inhibidora no específica de los tipos de células diana y no diana, incluso cuando las células se expusieron al agente durante solo 5 minutos y luego se devolvieron al cultivo durante el período de recuperación de 48 horas (Figuras 8A-8C).
Así, los hallazgos con Roridina A libre sugieren que el ensayo MTT podía detectar alteraciones metabólicas inducidas durante una exposición de 5 minutos. Considerando conjuntamente estos hallazgos sugieren que los conjugados RA-NR-AN-01 pueden inhibir de forma específica la actividad de células diana (es decir, la síntesis de proteínas) cuando se administran en un tratamiento "pulsado" y que estos efectos eran reversibles sin efectos a largo plazo significativos sobre la síntesis de proteínas o la actividad metabólica celular (como se midió por el ensayo MTT). Se consideró que estas propiedades in vitro de los conjugados RA-NR-AN-01 eran de gran utilidad para la inhibición de actividad de células del músculo liso in vivo. Por tanto, se llevaron a cabo seguidamente estudios en modelos animales para evaluar los efectos de estos conjugados terapéuticos in vivo.
Ejemplo 6 Determinación de las condiciones de infusión en un modelo animal
Los conjugados terapéuticos descritos en la presente memoria son útiles para inhibir la estenosis después de traumatismo o enfermedad vascular. En un ejemplo ilustrativo, se trata durante el procedimiento quirúrgico el traumatismo vascular inducido durante angioplastia retirando el catéter usado para llevar a cabo la angioplastia e insertando un catéter de infusión con globo en el vaso. El catéter de infusión se sitúa con el orificio de instilación (o, de forma alternativa, una región de membrana permeable) en el área traumatizada del vaso y se aplica seguidamente presión para introducir el conjugado terapéutico. Por ejemplo, se puede usar un catéter de infusión con dos globos, y cuando se infla un globo en cualquiera de los lados del sitio de traumatismo se crea un espacio fluido que puede llenarse con un fluido de infusión adecuado que contiene el conjugado terapéutico. Se ha descrito con anterioridad que la infusión de enzima marcadora peroxidada de rábano picante (HRP) a una presión de 300 mm Hg. durante 45 segundos en arterias coronarias de perro o humanas dio lugar a la penetración del HRP en la pared del vaso (Goldman et al., supra). Sin embargo, HRP es una molécula más pequeña que NR-AN-01 y las arterias coronarias humanas y de perro también son considerablemente menores que las arterias carótidas o femorales en el presente sistema modelo de cerdo doméstico. Por tanto, se llevaron a cabo experimentos para determinar, en un sistema modelo de cerdo doméstico, las condiciones de infusión adecuadas para la liberación de un conjugado terapéutico a las células del músculo liso vascular en arterias carótidas y femorales. Las condiciones de liberación se controlaron evaluando la penetración del conjugado terapéutico en la pared vascular, y la unión específica del conjugado terapéutico a las células del músculo liso vascular en la pared del vaso.
Usando un catéter de infusión, se infundieron las arterias coronarias y femorales de cerdos domésticos o primates no humanos con NR-AN-01 durante 45 segundos a 3 minutos a varias presiones en el intervalo de aproximadamente 0,4 atmósferas (300 mm Hg) a 3 atmósferas. Después de la infusión, los vasos se lavaron con solución salina estéril y se prepararon para inmunohistoquímica usando IgG antiratón de cabra conjugado con HRP para detectar el IgG de ratón NR-AN-01 en la pared del vaso. Se determinó que se consiguió una penetración total de NR-AN-01 en estas paredes de vasos a una presión de 3 atmósferas después de 3 minutos.
También se usó inmunohistología para determinar que sistema modelo animal expresaba el antígeno diana para NR-AN-01. Se expusieron secciones de tejido vascular de especies animales experimentales fácilmente disponibles a NR-AN-01, se lavaron y se hicieron reaccionar con IgG antiratón de cabra conjugado con HRP. Se encontró que solo los primates no humanos y los cerdos compartían el antígeno diana NR-AN-01 de 250 kD con el hombre.
Para determinar si NR-AN-01 podía unirse de forma específica a su antígeno diana in vivo, se infundieron las arterias coronarias y femorales de cerdos domésticos con conjugados terapéuticos usando un catéter de infusión, se lavaron los sitios de infusión con solución salina estéril, se cerraron los sitios quirúrgicos seguidamente y se mantuvieron los animales durante otros 3 a 5 días. Al finalizar este tiempo, se abrieron los sitios de infusión vascular y se prepararon para inmunohistología, una vez más usando IgG antiratón de cabra para identificar NR-AN-01. Se identificó NR-AN-01 en la pared del vaso de arterias coronarias y femorales de cerdo 3 a 5 días después de la cirugía y el NR-AN-01 parecía estar asociado solo con células del músculo liso vascular. Estos hallazgos sugieren que NR-AN-01 puede unirse de forma específica a su antígeno diana in vivo.
Ejemplo 7 Inhibición de células del músculo liso vascular in vivo
La proliferación de músculo liso de la íntima que sigue a un traumatismo inducido por un catéter de globo es un buen modelo para evaluar la eficacia terapéutica de conjugados para inhibir la actividad de células del músculo liso in vivo como respuesta a un traumatismo vascular, incluyendo reestenosis después de angioplastia. Se usaron cerdos domésticos para estudiar el efecto de NR-AN-01 (es decir, denominada proteína de unión al músculo liso vascular o simplemente VSMBP en estos estudios; y los conjugados terapéuticos con Roridina A se denominan VSMBP - RA). Los sucesos que siguen normalmente a una angioplastia de globo en la arteria porcina se han descrito con anterioridad (Steele et al., Circ Res., 57: 105-112 (1985)). En estos estudios, la dilatación de la arteria carótida usando un globo sobredimensionado (relación globo:arteria de aproximadamente 1,5:1) dio como resultado una denudación endotelial completa en un área de 1,5-2 cm de longitud. Aunque esta longitud de lesión traumática se seleccionó para intentar minimizar la trombosis, todavía había deposición de plaquetas y formación de trombos. El procedimiento también dio como resultado la disección a través de la lámina elástica interna en la media arterial y necrosis de células del músculo liso de la media. El engrosamiento de la íntima debido a proliferación de músculo liso fue evidente 7 días después de la cirugía y alcanzó un espesor máximo medio de 85 mm a los 14 días. La apariencia histológica de esta neoíntima es muy similar al tejido neoíntimo proliferativo de la reestenosis humana (Schwartz et al., Circ., 82: 2190-2200 (1990)).
Se llevó a cabo un protocolo de ensayo de una única dosis en cerdos domésticos con conjugados NR-AN-01-Roridina A. La administración localizada de conjugados de ensayo, es decir, a través de un catéter en una región de un vaso traumatizada confinada por ligaduras deplazadas temporales se diseñó para reducir la toxicidad sistémica al mismo tiempo que proporcionaba un alto nivel de exposición para las células del músculo liso diana. Esta vía intraarterial de administración en estudios con modelo animal simuló la vía propuesta en arterias coronarias humanas. El protocolo de ensayo se diseñó como un rastreo in vivo inicial de conjugados de proteína de unión al músculo liso vascular (VSMBP) administrados mediante catéter, específicos del sitio intraarteriolar.
También se evaluó la toxicidad del fármaco libre, es decir, para los efectos patobiológicos sobre células del músculo liso arteriolar. La dosis terapéuticamente eficaz del conjugado Roridina A-NR-AN-01 se determinó por estudios in vitro, y la presión de administración intraarteriolar idónea se determinó administrando MAb libre y conjugados de MAb a animales, como se ha descrito antes en el Ejemplo 7.
En el experimento se usaron seis cerdos cruzados domésticos (Duroc X), cerdos para cebar destetados de aproximadamente 13,60 libras de peso. Los animales se asignaron al azar a la siguiente pauta de tratamiento, en la que cada cerdo tenía cuatro tratamientos diferentes divididos entre las arterias carótida y femoral izquierda y derecha, uno de las cuales es un PBS control (Tablas 1-3, a continuación).
TABLA 1
6
Procedimiento quirúrgico
Se administraron conjugados de ensayo y compuestos control en forma de una infusión intraarterial en el sitio de denudación endotelial y se indujo traumatismo por un catéter de globo. Se rasparon tanto las arterias carótidas como femorales en 1 cm a 2 cm del endotelio mediante una pasada intraluminal de un catéter de globo de oclusión de silicona de 23 cm, tamaño 3 (femoral) y tamaño 4 (carótida) UresilVascu-Flo® (Uresil Technology Center, Skokie, IL), suficientemente distendido con solución salina para generar poca resistencia. Después de este tratamiento, se colocaron ligaduras deslizantes proximal y distal de seda 3-0 cerca de los extremos de la región raspada y se usó un catéter tamaño French 8 de alimentación de lactantes (Cutter-Resiflex, Berkeley, CA) unido a una jeringa de presión Inflation Pro® (USCI, C.R. Bard, Inc., Billerica, MA) para administrar los conjugados de ensayo y compuestos control directamente al segmento denudado a una presión de tres atmósferas durante tres minutos. Las ligaduras deslizantes se retiraron después de tres minutos de exposición y se volvió a establecer el flujo sanguíneo arterial. En estos estudios, se ligaron ramas de las arterias femoral o carótida con sutura de seda 00 como se requiere para obtener una infusión a presión en la región tratada. La rama distal mayor de la arteria femoral (la arteria safena) se perforó y se usó como sitio de entrada para los catéteres que se hicieron pasar seguidamente a la arteria femoral principal. Después de este procedimiento de cateterización en la arteria femoral principal, se ligó la rama secundaria. En estos casos, la ligadura o incisión se usó para permitir la entrada de los catéteres y las aberturas se cerraron seguidamente con 3 a 4 suturas de polibutéster monofilamento 5-0 (Novafil, D & G Monofil Inc., Monati, PR).
Procedimientos de seguimiento
Después de la cirugía, se mantuvieron los cerdos en corralizas cubiertas de 3 x 5 pies con suelo de cemento durante los períodos de cuarentena y recuperación quirúrgica. Estos se pasaron seguidamente a pocilgas cubiertas/abiertas para el resto del período de curación de cinco semanas antes de la recogida de tejidos para histología.
Los animales se recuperaron con normalidad de la cirugía sin evidencia de hemorragia o inflamación en los sitios de cirugía. Los seis animales se examinaron 5 a 6 días después del tratamiento con un estetoscopio doppler y fueron evidentes todas las arterias en cada uno de los animales. Después del tratamiento, todos los animales tuvieron apetito, actividad y aumento de peso normales.
Evaluación macroscópica de patología e histológica
Cinco semanas después de traumatizar y tratar las arterias, se sedaron los animales con 0,6 ml de Telazol® (hidrocloruro de tiletamina; A.H. Robins Co., Richmond, VA) y 0,5 ml de xilazina (Lloyd Laboratories, Shenandoah, IA) por 13,60 kg de peso corporal por inyección intramuscular, se heparinizaron (iv, 2 ml de heparina sódica, 1000 unidades/ml) y se sacrificaron por i.v. de pentobarbital. Se extirparon las arterias carótida y femoral derecha e izquierda con tejido normal incluyendo proximal y distal al segmento tratado. Las arterias se midieron y se anotó la posición de las ligaduras y anomalías evidentes. Las arterias se transectaron a intervalos de 2 mm y se dispusieron en orden en criomoldes con compuesto a la Temperatura de Corte Óptima (T.C.O.) (Tissue Tek®, Miles Laboratories Inc., Elkhart, IN) y se congelaron en nitrógeno líquido. Los bloques se seccionaron a 5 micrómetros y se tiñeron con H & E, Massons Trichrome y Movats Pentachrome para los estudios morfológicos. También se usaron secciones para la tinción histológica del músculo liso vascular.
La exploración histológica de las secciones cortadas de las arterias reveló una marcada inhibición de proliferación de músculo liso de la íntima en las regiones traumatizadas y tratadas con conjugados RA-NR-AN-01 (Tabla 2). esta inhibición fue evidente incluso en una evaluación más precisa de los vasos. La inhibición de proliferación de células del músculo liso de la íntima se produjo con evidencia mínima o no histológica de muerte de células del músculo liso en la pared arterial. En las Figuras 9A y 9B se proporcionan secciones transversales de una de tales arterias traumatizadas.
TABLA 2 Proliferación de músculo liso de la íntima en arterias porcinas traumatizadas y tratadas
7
Los resultados presentados en la Figura 9A muestran (a un aumento de 160x) una sección transversal de una arteria no tratada 5 semanas después de angioplastia. Las características histológicas dominantes de la arteria incluyen desplazamiento del endotelio (véase #1, Figura 9A) hacia fuera de la lámina elástica interna (véase #2, Figura 9A), aparentemente debido a proliferación de músculo liso de la íntima (véase #3, Figura 9A).
Los resultados presentados en la Figura 9B muestran (a un aumento de 160x) una sección transversal de una arteria tratada 5 semanas después de angioplastia e infusión del conjugado terapéutico RA-NR-AN-01. El vaso en esta sección se sometió a una mayor tensión mecánica que el vaso mostrado en la Figura 9A, con varios sitios en los que se rompió la membrana elástica externa y se observó proliferación asociada de células del músculo liso en las capas externas de la media (es decir, véase #4 en la Figura 9B). El tratamiento con conjugado terapéutico inhibió la hipertrofia de la íntima, como se pone de manifiesto por la falta de desplazamiento del endotelio (véase #1, Figura 9B) desde la lámina elástica interna (véase #2, Figura 9B). De forma sorprendente, este efecto inhibidor sobre células del músculo liso de la íntima se llevó a cabo sin hipertrofia inhibidora de células del músculo liso en la media en las áreas en las que se rompió la membrana elástica externa (véase #4, Figura 9B).
Este es un resultado muy afortunado debido a que la cicatrización de la herida transcurre en el vaso tratado sin las consecuencias adversas de hiperplasia y estenosis de la íntima, o necrosis de células del músculo liso en la media.
En estos estudios histológicos, también se realizaron comparaciones de la eficacia de ambos conjugados 2' y 13'-Roridina A con el hallazgo de que el conjugado 13' (es decir, 13'RA-HS-NR-AN-01) parecía ser más activo a la hora de inhibir la hiperplasia de la íntima de células del músculo liso que el conjugado 2' (es decir, 2' RA-HS-NR-AN-01). En este estudio, la infusión a baja presión del conjugado 13' parecía inhibir la proliferación de músculo liso de forma más eficaz que la alta presión y el conjugado 13' parecía también ser más eficaz que el conjugado 2'.
En la Figura 9B, el conjugado terapéutico administrado en el sitio después de angioplastia produjo una inhibición de aproximadamente 95% de la hipertrofia de músculo liso que reducía la luz del vaso no tratado (Figura 9A). Resultaba significativo que el conjugado terapéutico ejercía sus efectos sobre células del músculo liso que migran desde las capas del músculo liso de la media a la íntima, sin afectar al endotelio, o sin producir ningún signo de necrosis (es decir, muerte celular) en las células del músculo liso en las capas medias de la pared arterial. Los estudios tampoco pudieron mostrar ningún signo histológico de infiltración mononuclear o fibrosis tal como podría resultar de los efectos tóxicos sobre la pared del vaso. Además, se observaron signos visibles de cicatrización en las capas íntimas de los vasos tratados y se observó recrecimiento del endotelio, es decir, células endoteliales que crecen sobre la capa delgada de células del músculo liso de la íntima que se ubica entre el endotelio y la lámina elástica interna (es decir, #1 y #2, Figura 9B). Estas observaciones histológicas sugieren las características muy deseables de curación de heridas, recrecimiento del endotelio y resistencia vascular mejorada después del tratamiento con un conjugado terapéutico que inhibe la hiperplasia de músculo liso en las capas íntimas del vaso.
Ejemplo 8 Inhibición de la síntesis de DNA y proteínas de células del músculo liso vascular in vitro
Se ensayó la capacidad de diversos agentes para inhibir la síntesis de DNA y proteínas en células del músculo liso vascular. Los ensayos de recaptación de ^{3}H-leucina y ^{3}H-timidina y de citotoxicidad se llevaron a cabo conforme a los siguientes protocolos.
Exposición de 5 minutos: Recaptación de ^{3}H-leucina: Se sembraron células del músculo liso vascular a 40.000 células/ml en placas de 24 pocillos estériles a 1 ml/pocillo. Las placas se incubaron durante la noche a 37ºC, CO_{2} al 5%, aire al 95% en una atmósfera humidificada (saturación). Se incubaron diluciones logarítmicas del agente terapéutico de interés con las células del músculo liso vascular durante 5 minutos o 24 horas. Las muestras de los agentes terapéuticos se diluyeron en medio DMEM:F-12 (Whittaker Bioproducts, Walkersville, Maryland) con suero bovino fetal al 5% (FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD) y SerumPlus® al 5% (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Después de incubar el agente terapéutico, se aspiró la solución y se añadió 1 ml/pocillo de ^{3}H-leucina 0,5 microcurie/ml en DMEM exento de leucina (Medio Eagle modificado por Dulbecco) con SerumPlus® al 5%. Las placas se volvieron a incubar durante la noche a 37ºC, CO_{2} al 5% en atmósfera humidificada. Las células se clasificaron visualmente usando un microscopio invertido que usaba una escala de valoración para determinar la viabilidad y el número de células. El grado 1 a 3 se basa en el porcentaje de viabilidad celular y número de células comparado con pocillos control, siendo 3 = 100%, 2 = 70%-100% y 1 = 0% -70%. Un registro de esta valoración ayuda a determinar el efecto citotóxico inmediato de los agentes terapéuticos. El medio se aspiró seguidamente y se lavaron las células dos veces con TCA frío al 5%. Se añadieron 400 microlitros de NaOH 0,2 M por pocillo y las placas se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente en una plataforma giratoria. Se transfirieron 200 microlitros por pocillo de la solución celular a viales de centelleo de plástico (Bio-Rad Laboratories) y se añadieron 4 mililitros de líquido de centelleo Bio-Safe® II (Research Products InterCorp., Mount Prospect, IL), antes de usar un Vortex. Se realizó el recuento de los viales en un contador de centelleo líquido Beckman LS2800 con un software "Data Capture" de Beckman como interfaz para la conversión a un fichero Lotus 1-2-3® y análisis usando Lotus 1-2-3®.
Exposición de 5 minutos: Recaptación de ^{3}H-timidina: Se incubaron células del músculo liso vascular en medio completo con FBS al 5% (Gibco) durante la noche a 37ºC en un ambiente humidificado con CO_{2} al 5% en placas de 24 pocillos estériles. El medio se aspiró de los pocillos y se añadió medio exento de suero suplementado con factores de crecimiento (DMEM: medio F- 12 basal suplementado con un cóctel de factores de crecimiento, número de catálogo I1884, que contenía insulina (5 microgramos/ml), transferrina (5 microgramos/ml) y selenito sódico (5 nanogramos/ml), disponible de Sigma Chemical, St. Louis, Missouri). Se incubaron las células en este medio durante 24 horas. Durante una exposición a agente terapéutico de 5 minutos, se incubaron diluciones logarítmicas del agente terapéutico con las células en medio completo. Después de 5 minutos y de aspirar el medio se añadió 1 ml/pocillo de ^{3}H-timidina 1,0 microcurie/ml dispersada en medio completo. La exposición de 24 horas implicó incubación de las células con 1 ml/pocillo de ^{3}H-timidina 1,0 microcurie/ml dispersada en medio completo y diluciones logarítmicas del agente terapéutico que se está ensayando. En ambos ensayos de exposición, se incubaron seguidamente las células durante la noche a 37ºC en un ambiente humidificado con CO_{2} al 5%. La viabilidad y número de células se valoró visualmente. Las células se lavaron y prepararon para transferirlas a viales de centelleo de plástico como se ha descrito para el protocolo de ^{3}H-leucina. El recuento de los viales se realizó en un contador de centelleo líquido Beckman LS2800 con un software "Data Capture" de Beckman como interfaz para la conversión a un fichero Lotus 1-2-3® y análisis usando Lotus 1-2-3®.
Estos protocolos son idóneos para usar con otras poblaciones de células diana, en especial para los tipos de células monocapa adherentes.
Evaluación de la citotoxicidad morfológica - exposición pulsada: Se sembraron células del músculo liso vascular a 4,0 x 10^{4} células/ml de medio/pocillo en un portamuestras de cuatro pocillos preparado comercialmente (Nunc, Inc., Naperville, Illinois). Se sembraron suficientes placas para acomodar dos longitudes de exposición pulsada (5 minutos y 24 horas) y los puntos de evaluación en incrementos prescritos (24 horas a 128 horas). Todas las platinas se realizaron por duplicado para revelar cualquier anomalía del ensayo. El agente terapéutico se diluyó en el mismo medio usado en los ensayos de ^{3}H-leucina y ^{3}H-timidina. Cada portamuestras de cuatro pocillos se limitó en concentración a una concentración mayor logarítmica (pocillo "B"), una concentración menor logarítmica (pocillo "D") de la concentración mínima eficaz (pocillo "C"), como se determina por los ensayos descritos antes de ^{3}H-leucina y ^{3}H-timidina. Como control para la morfología normal, se dejó un pocillo sin tratar (pocillo "A") (solo medio). La incubación tuvo lugar en un incubador humidificado con CO_{2} al 5% a 37ºC. Después de cada unos de los dos puntos de exposición (5 minutos y 24 horas), el medio de agente terapéutico se aspiró de cada pocillo, incluyendo el pocillo sin tratar. Se añadió entonces un ml de medio nuevo para reemplazar el medio aspirado. Se volvió a incubar hasta que se consiguió cada uno de los puntos de evaluación incrementado. En estos puntos, se aspiró el medio y a continuación se reemplazó con 1 ml de formalina tamponada neutra al 10% durante una hora para permitir una fijación apropiada. Estos portamuestras fijados se tiñeron por hematoxilina (nuclear) y eosina (citoplásmico) para la evaluación morfológica y clasificación.
Resultados: Los resultados del ensayo de inhibición de proteínas por ^{3}H-leucina a las 24 horas y el ensayo de inhibición de síntesis de DNA por ^{3}H-timidina a las 24 horas se muestran en las Figuras 10A-10D para suramina, estaurosporina, nitroglicerina y citocalasina B, respectivamente.
Ejemplo 9 Unión específica e internalización de partículas diana por células del músculo liso vascular
La capacidad de las células del músculo liso vascular de unirse e internalizar partículas revestidas con proteína o péptido de unión se demostró con microesferas de oro revestidas de anticuerpo monoclonal (NR-AN-01) in vitro e in vivo.
Se incubaron cultivos tisulares de células de músculo liso vascular (BO54), una línea de células control positivas al antígeno (A375) y una línea de células control negativas al antígeno (HT29) con microesferas de oro de 10 nm, con un grupo revestido con NR-AN-01 y un segundo grupo control no revestido. Las células se expusieron a las microesferas en forma de cultivos en monocapa y en suspensión celular y se examinaron en seis puntos de tiempo (es decir, 1 minuto, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos y 24 horas) para determinar la unión e internalización por microscopía electrónica.
La Tabla 3 muestra los resultados de la experimentación, indicando que la unión a la superficie celular es específica. El sistema de valoración relativo usado en la Tabla 3 representa una valoración subjetiva de la unión de partículas, en la que 0 = nula, 1 = mínima; 2 = leve; 3 = moderada; y 4 = acentuada. Si sedimentan agregados de partículas sobre la superficie monocapa de células de músculo liso y de control, las partículas no se internalizaron de forma específica por macro y microfagocitosis. Cuando las células se mantuvieron en una suspensión celular, la internalización no específica fue mínima o no hubo. Se observó adherencia no específica de microesferas de oro exentas de NR-AN-01 a la mucina superficial producida por células HT29, dando lugar a una internalización modesta no específica de la misma. Las recaptación de células del músculo liso vascular de microesferas de oro dirigidas a diana con NR-AN-01 fue muy específica en cultivos en suspensión celular.
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La Figura 11 muestra una sección tangencial paralela a la superficie interna de una célula de músculo liso caracterizada por numerosas vesículas endocíticas, algunas de las cuales contienen microesferas de oro revestidas de anticuerpo en el proceso de ser internalizadas por la célula. Estas vesículas endocíticas con partículas unidas a antígenos de la superficie celular se estimularon para fusionarse con lisosomas a una velocidad mayor que la esperada para el reciclaje normal de la membrana de la superficie celular. La acumulación acentuada de partículas internalizadas resultante se observó en el punto de 24 horas y se muestra en la Figura 12.
También se observó in vivo la unión a la superficie de células del músculo liso vascular de microesferas de oro dirigidas a diana, la internalización y la concentración de lisosomas. Las microesferas de oro revestidas de NR-AN-01 se infundieron a través de un catéter intravascular, con los extremos abiertos y con un área tratada ocluida proximal y distalmente con ligaduras deslizantes, a una presión de 3 atmósferas aplicada durante 3 minutos en la pared de una arteria femoral de cerdo inmediatamente después del traumatismo con globo. La velocidad de internalización de microesferas variaba con el grado de lesión sostenida por las células de músculo liso vascular durante el traumatismo con globo. Las células con lesión mínima o nula internalizaron rápidamente las partículas por endocitosis y fagocitosis, concentrando las partículas internalizadas en lisosomas. Las células que fueron destruidas por el traumatismo presentaron unión de microesferas en la superficie. Las células que fueron dañadas por el traumatismo pero sobrevivieron se caracterizaron por unión a la superficie de microesferas con una internalización retardada y concentración en lisosomas. La Figura 13 muestra la concentración de partículas en los lisosomas in vivo a una semana después de la administración de las microesferas.
Ejemplo 10 Inhibición de la síntesis de proteínas y DNA in vitro en el músculo liso vascular por estaurosporina y citocalasina
Se ensayó la capacidad de estaurosporina y citocalasina para inhibir la síntesis de DNA y proteínas in vitro en células del músculo liso vascular. Se llevaron a cabo ensayos de recaptación de ^{3}H-leucina y ^{3}H-timidina y de citotoxicidad conforme a los siguientes protocolos.
Células cultivadas
Se obtuvieron células BO54 (células de músculo liso de babuino) de explantes de células de músculo liso de aorta de babuino. Las células se extendieron en medio DMEM (medio Eagle modificado por Dulbecco:F-12 (Whittaker Bioproducts, Walkersville, Maryland) con suero bovino fetal al 5% (FBS, Gibco) y SerumPlus® al 5% (JRH Biologicals) ("medio completo"), y se congeló un lote sembrado de células en nitrógeno líquido para uso posterior en el pase siete.
Exposición de 5 minutos; Ensayo de síntesis de proteínas
Se sembraron células del músculo liso vascular a 40.000 - 50.000 células/ml y se procesaron como se describe en el Ejemplo 8, "exposición de 5 minutos; recaptación de ^{3}H-leucina". Se dispersaron en medio completo diluciones logarítmicas de estaurosporina (200 ng/ml, 20 ng/ml, 2 ng/ml, 0,2 ng/ml y 0,02 ng/ml). Para la citocalasina B, se dispersaron en medio completo diluciones logarítmicas a 20 \mug/ml, 2,0 \mug/ml, 0,2 \mug/ml, 0,02 \mug/ml y 0,002 \mug/ml. El medio completo se añadió entonces a los pocillos control. Se añadió en pocillos por cuatriplicado 1 ml/pocillo de cada una de las diluciones de agente terapéutico y se incubó el agente de interés con las células del músculo liso vascular durante 5 minutos a temperatura ambiente en una campana ventilada estéril. Después de la incubación del agente terapéutico, se trataron seguidamente los pocillos como se describe en el Ejemplo 8, "exposición de 5 minutos; recaptación de ^{3}H-leucina".
Exposición de 5 minutos; Ensayo de síntesis de DNA: Se sembraron células del músculo liso vascular (BO54) y se procesaron en placas de 24 pocillos como se ha descrito antes en "Exposición de 5 minutos: Ensayo de síntesis de proteínas". Después de 5 minutos de incubación con el agente terapéutico de ensayo, se aspiró el medio y se añadió 1 ml/pocillo de ^{3}H-timidina 1,0 \muCi/ml (en lugar de ^{3}H-leucina) dispersada en medio completo. Las células se incubaron seguidamente durante la noche a 37ºC en un ambiente humidificado con CO_{2} al 5%. El efecto tóxico del agente terapéutico se determinó a continuación como se describe en el Ensayo de síntesis de proteínas anterior.
Exposición de 24 y 120 horas; Ensayo de síntesis de proteínas: Se sembraron células de músculo liso vascular (BO54) a 20.000 células/ml en placas estériles de 24 pocillos y se incubaron en medio completo (1 pocillo) durante la noche a 37ºC, CO_{2} al 5%, aire al 95% en una atmósfera humidificada (saturación). Se dispersaron diluciones logarítmicas de estaurosporina (100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml y 0,01 ng/ml) secuencialmente en los dos medios como se describe a continuación. Para citocalasina B, se dispersaron secuencialmente en los dos medios diluciones logarítmicas a 10 \mug/ml, 1,0 \mug/ml, 0,1 \mug/ml, 0,01 \mug/ml y 0,001 \mug/ml como se describe a continuación:
Medio (1) = Medio completo; y
Medio (2) = DMEM (exento de leucina) con 0,5 \muCi/ml de ^{3}H-leucina. El Medio (2) se usa para el período de incubación final de 24 horas del experimento. De forma más específica, en el ensayo de 24 horas, cada agente se diluye en medio (2), como se ha indicado antes. El Medio (1) se aspiró de los pocillos y se añadieron alícuotas de diluciones de agente terapéutico en Medio (2) por cuatriplicado a los pocillos apropiados. Se añadió entonces Medio (2) a los pocillos control.
En el ensayo de 120 horas, se diluyó cada agente en Medio (1), como se ha indicado antes. Se aspiró el Medio (1) de los pocillos, se añadieron alícuotas de las diluciones de agente en Medio (1) por cuatriplicado a los pocillos apropiados. Se añadió entonces Medio (1) a los pocillos control. El medio se cambió cada 24 horas y se añadió medio nuevo a los pocillos de ensayo. A las 96 horas (es decir, al cuarto día), se diluyó cada agente en Medio (2), como se ha indicado antes. Se aspiró el Medio (1) de los pocillos y se añadieron alícuotas de las diluciones de agente en Medio (2) por cuatriplicado a los pocillos apropiados. Se añadió entonces Medio (2) a los pocillos control.
Los agentes de ensayo en ^{3}H-leucina (y controles) se incubaron durante la noche a 37ºC, CO_{2} al 5% en una atmósfera humidificada. Se determinó entonces el efecto tóxico de los agentes como se describe en la Exposición de 5 minutos: Ensayo de síntesis de proteínas, descrita antes. Además, se fotografiaron los cambios en las células en cada dilución usando un microscopio Zeiss (Zeiss, Alemania) a 320x. Se aspiró el medio a continuación y se procesaron las células con TCA, como se ha descrito antes.
Exposición de 24 y 120 horas; Ensayo de síntesis de DNA: Este ensayo se llevó a cabo conforme al procedimiento descrito para "Exposición de 24 y 120 horas; Ensayo de síntesis de proteínas", salvo que el Medio (2) en este Ensayo de DNA de 24 y 120 horas es:
Medio (2) = Medio completo con ^{3}H-timidina 1,0 \muCi/ml. El Medio (2) se usa en la incubación final de 24 horas del experimento.
Estos ensayos de síntesis de proteínas y DNA son idóneos para usar con otras poblaciones de células diana, en especial los tipos de células monocapa adherentes.
Resultados: Se determinó la dosis mínima eficaz (DME) de cada agente como porcentaje del control que se trató solo con medio; el 50% de los valores control se eligió como característica de citotoxicidad. A una exposición de 5 minutos, la estaurosporina demostró una DME de 100 ng/ml en el ensayo de síntesis de proteínas y 1 ng/ml en el ensayo de DNA. Las DME a las 24 horas para estaurosporina fueron 10 ng/ml en el ensayo de síntesis de proteínas y 1 ng/ml en la síntesis de DNA. Ambos ensayos dieron una DME de 1 ng/ml para la exposición de 24 horas de estaurosporina.
A una exposición de 5 minutos, la citocalasina B demostró una DME de 10 \mug/ml en el ensayo de síntesis de proteínas así como en el ensayo de DNA. La DME a 24 horas para citocalasina B como 1,0 \mug/ml en el ensayo de síntesis de proteínas y 0,1 \mug/ml en el ensayo de síntesis de DNA. Ambos ensayos dieron una DME de aproximadamente 0,1 \mug/ml para una exposición de 120 horas de estaurosporina.
Se ensayaron citocalasina C y citocalasina D a exposiciones de 24 y 48 horas usando las mismas diluciones que se han descrito para citocalasina B antes. A las 24 horas, citocalasina C demostró una DME de 1,0 \mug/ml en el ensayo de síntesis de proteínas y una DME de 0,01 \mug/ml en el ensayo de síntesis de DNA. A las 48 horas, la citocalasina C demostró una DME de 0,1 \mug/ml en el ensayo de síntesis de proteínas y una DME de 0,01 \mug/ml en el ensayo de síntesis de DNA. Citocalasina D demostró una DME de 1,0 \mug/ml en del ensayo de síntesis de proteínas a las 24 horas y una DME de 0,1 \mug/ml en el ensayo de síntesis de DNA a las 24 horas. Una exposición de 48 horas a citocalasina D dio una DME que variaba desde 0,1 a 0,01 \mug/ml en los ensayos de síntesis de proteínas y de síntesis de DNA.
Ejemplo 11 Inhibición de la migración de células del músculo liso vascular
Se llevaron a cabo ensayos de raspado para determinar el grado de inhibición de la migración de células del músculo liso por citocalasina B conforme al siguiente protocolo:
Se obtuvieron células del músculo liso vascular (BO54) de explantes de músculo liso de aorta de babuino como se describe en el Ejemplo 10. Las células se reprodujeron en placas de cultivo tisular de seis pocillos y fondo plano, que contenían aproximadamente 5 ml de medio. Las células del músculo liso vascular se cultivaron a 200.000 células/pocillo y se colocaron en un incubador con CO_{2} al 5% humidificado a 37ºC durante 18 horas. Los pocillos se rasparon a continuación con una porción estéril de una hoja de afeitar de borde sencillo que se sostenía con pinzas o tenacillas y se puso en contacto asépticamente con el fondo del pocillo con un ángulo de 90º. Las células de una pequeña área a lo largo de la raspadura se retiraron mediante un aplicador con punta de algodón estéril mientras la cuchilla estaba en contacto con el fondo del pocillo. Después de la incubación, la presencia de células en el área "raspada" indica migración celular a través de la línea de raspado. Una incubación control mostró migración celular significativa y sirve como patrón frente al cual se compara la migración de células expuestas al agente terapéutico.
De forma resumida, se preparó una solución madre de citocalasina B (Sigma Chemical Co.) en dimetil sulfóxido (DMSO) a 1 mg/ml. Se añadieron diluciones de ensayo de citocalasina B o medio control. Cada experimento incluyó dos series de placas:
Grupo A: Agente de ensayo expuesto durante 1, 3, 6, 8 y 10 días solamente; y
Grupo B: Agente de ensayo expuesto durante 1, 3, 6, 8 y 10 días, seguido por un séptimo día con medio control.
Ambos grupos de placas se fijaron (formalina al 10% en PBS) y se tiñeron (violeta cristal al 0,02%) al finalizar las exposiciones. Las concentraciones de citocalasina B fueron 1, 0,1 y 0,01 \mug/ml, y se incluyó un control del medio negativo. Se suministró medio y fármaco nuevos tres veces por semana.
La Tabla 4 muestra los resultados de estos experimentos. En esta Tabla "M" indica Grado de Migración, en el que - = sin migración; +1 = migración mínima; +2 = leve; +3 = moderada; y +4 = acentuada (máxima densidad; límite de inhibición del contacto celular) de células del músculo liso vascular en el área aclarada adyacente a la raspadura. En esta Tabla la "T" indica un Grado de Toxicidad Morfológica, en el que - = sin toxicidad; +1 = toxicidad mínima; +2 = leve; +3 = moderada; y +4 = acentuada. Los resultados de migración se expresan como "Grado en el Área Aclarada del Pocillo / Grado en la Región no Alterada del Pocillo". Los valores de toxicidad representan un grado para todas las células de cada pocillo.
Los datos indican que citocalasina B inhibe la migración (+1 a +2) de células del músculo liso vascular en el área aclarada adyacente a la raspadura en una dosis de 0,1 \mug/ml con una toxicidad morfológica mínima (- a +1). Los datos también muestran que las células tratadas (0,1 \mug/ml) vuelven a adquirir la capacidad de migrar (+3 a +4) después de retirar el agente terapéutico, incluso 10 días después de la exposición continua al agente terapéutico.
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(Tabla pasa a página siguiente)
13
Ejemplo 12 Efectos citotóxicos del agente sobre células del músculo liso vascular -Exposición pulsada y continua
Se expusieron células del músculo liso vascular a un agente en uno de dos formatos de exposición:
Exposición pulsada
El protocolo de exposición pulsada se describe en el Ejemplo 8 anterior (Véase "Evaluación de la Citotoxicidad Morfológica - Exposición Pulsada").
Exposición continua
Se usa la misma metodología para la evaluación de citotoxicidad morfológica en la exposición continua que para la exposición pulsada, salvo que los pocillos de ensayo se expusieron continuamente al agente en medio durante el período de exposición. El medio y el agente se aspiraron de cada pocillo a diario, incluyendo del pocillo control sin tratar, y se reemplazaron con 1 ml de medio y agente nuevos (o medio solo para los pocillos control). La reincubación siguió, hasta que se alcanzó cada uno de los puntos de evaluación por incrementos del protocolo de exposición continua a largo plazo. Estos puntos de tiempo de evaluación por incrementos fueron a 6, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 216 y 264 horas. En el período de tiempo designado, se fijaron los pocillos apropiados, se tiñeron y se evaluaron como en el protocolo de exposición pulsada. Los resultados de un experimento de exposición continua se muestran en la Tabla 5 para suramina, estaurosporina y citocalasina B. Los datos de 5 minutos y 24 horas presentados en la Tabla 5 se relacionan con los datos contenidos en las Figuras 10A, 10B y 10C.
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(Tabla pasa a página siguiente)
14 
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A una dosis eficaz in vitro, citocalasina B (1 \mug/ml; una dosis eficaz antimigración/contracción) y estaurosporina (1 ng/ml; una dosis eficaz antiproliferativa) mostraron un grado de citotoxicidad de 1 (mínimo) y 2 (leve), respectivamente. Estudios independientes han indicado que se prefiere un grado de 3 (moderado) o inferior para un agente citostático antiproliferativo de la presente invención.
Ejemplo 13 Ensayo BRDU in vivo: Inhibición de proliferación de células del músculo liso vascular
Ensayo BRDU: Se cuantificó la proliferación de músculo liso vascular in vivo mediante medida de la incorporación del análogo base 5-bromo-2'-desoxiuridina (BRDU, disponible de Sigma Chemical Co.) en DNA durante la síntesis y proliferación de DNA celular. La incorporación de BRDU se demostró de forma histoquímica usando anticuerpos monoclonales anti-BRDU disponibles de forma comercial. El marcado por pulsos de 1 hora permite valorar el número de células que sufren división durante el período pulsado.
El protocolo de marcado por pulsos de BRDU descrito antes se usa como técnica de evaluación convencional en estudios vasculares con cerdos in vivo. Siguiendo los procedimientos quirúrgicos y de tratamiento (descritos, por ejemplo, en los Ejemplos 7 y 11 en la presente memoria) y un período de recuperación posterior a la cirugía, se sedaron cerdos y se pulsaron con BRDU 1 hora antes de la obtención del tejido.
En resumen, se sedaron cerdos con hidrocloruro de tiletamina y xilazina (como en el Ejemplo 7, "Evaluación Macroscópica de Patología e Histológica") por inyección intramuscular. Se administró entonces BRDU por vía intravenosa a través de la vena del oído lateral. Se administraron a cada cerdo de 13,6 a 18,14 kg dos ml de BRDU a una concentración de 50 mg/ml. Una hora después, se sacrificaron los cerdos por administración intravenosa de pentobarbital. Se extirparon segmentos de arteria de ensayo (un segmento incluía vaso normal situado proximalmente y, si era posible, distalmente con respecto al segmento de arteria tratada). Los segmentos de arteria se transectaron a intervalos de 2 mm; se dispusieron en orden en criomoldes con compuesto a T.C.O. (temperatura óptima de corte) (TissueTek®, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, IN); y se congelaron en nitrógeno líquido. Los bloques se seccionaron a 5 micrómetros y se tiñeron inmunohistológicamente para detectar BRDU usando el siguiente procedimiento.
Detección de células marcadas con BRDU: Después de marcar por pulsos con BRDU (1 g de BRDU diluido en 17 ml de agua estéril y 3 ml de NaOH 1 N) y extirpar el segmento de arteria de ensayo y seccionar (véase antes), la tinción inmunohistoquímica con anticuerpo monoclonal anti-BRDU proporciona un medio visual de detectar un índice mitótico en un período especificado. El procedimiento de tinción inmunohistoquímica se llevó a cabo como sigue:
1)
Se deshidrataron secciones de 5 \mum de arteria de ensayo en acetona fría (-20ºC) durante 10 minutos;
2)
Se montan las secciones en portas de microscopio de vidrio y se secan los portas en un horno a 37ºC durante 10 minutos;
3)
Se vuelven a hidratar los portas en PBS durante 10 minutos;
4)
Se someten los portas a hidrólisis ácida de Feulgen usando HCl 1N, en la que se precalientan dos alícuotas de HCl 1N hasta 37ºC y 60ºC antes de proceder;
5)
Se aclaran los portas con 1 ml de HCl 1N a 37ºC durante 1 minuto;
6)
Se transfieren los portas a HCl 1N a 60ºC durante 15 minutos;
7)
Se aclaran los portas con 1 ml de HCl 1N a 37ºC durante 1 minuto;
8)
Se lavan los portas con PBS a temperatura ambiente, usando tres cambios de PBS a intervalos de 5 minutos;
9)
Se bloquean los sitios de reacción cruzada endógenos en las secciones con suero de cabra normal (1:25 en PBS) durante 20 minutos;
10)
Se lavan los portas con PBS como en la etapa 8;
11)
Se incuban las secciones con anticuerpos anti-BRDU de ratón (DAKO Corporation, Carpinteria, CA) a 10 \mug/ml durante 30 minutos;
12)
Se lavan los portas con PBS como en la etapa 8;
13)
Se incuban las secciones con IgG anti-ratón de cabra marcado con peroxidasa de rábano picante (HRPO) (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA; diluido 1:20 en PBS) y suero AB humano al 4% con PBS como en la etapa 8;
14)
Se lavan los portas con PBS como en la etapa 8;
15)
Se incuban secciones con cromógeno (3,3'-diaminobenzidina, DAB; Sigma) a 5 mg/ml en 200 ml de PBS) y 200 \mul de H_{2}O_{2} al 30% durante 10 minutos;
16)
Se lavan los portas con PBS como en la etapa 8;
17)
Se vuelven a teñir las muestras con hematoxilina Gill I (Gill I Lerner Laboratories, Pittsburgh, PA; 30 inmersiones);
18)
Se lavan los portas con PBS como en la etapa 8; se aclaran con una solución de azulado (1 gm de carbonato de litio en 500 ml de dH_{2}O); se lavan con agua desionizada; y
19)
Se vuelven a hidratar las muestras de ensayo, se aclaran y se coloca un cubreobjetos.
Al finalizar este procedimiento, una tinción inmunohistológica positiva presenta un color marrón en el sitio(s) de reactividad.
Los agentes citocidas inhibieron la recaptación de BRDU con respecto al control PBS; sin embargo, citocalasina B y estaurosporina inhibieron la recaptación de BRDU (es decir, la proliferación celular) sin destruir células del músculo liso vascular. Al número de células del músculo liso vascular marcadas con BRDU se le asignó un grado a 400 aumentos como sigue:
1 = \leq 1/campo de alta potencia (HPF);
2 = 2 a 5/HPF;
3 = > 5 a \leq 10/HPF; y
4 = > 10/HPF.
Tanto citocalasina B como estaurosporina inhibieron la proliferación durante 24 horas después de traumatismo por globo (grado 1), proporcionando un grado de marcado BRDU equivalente al de un estado inicial previo al traumatismo (grado 1). Los controles en PBS y anticuerpo monoclonal presentaron grado 2,5 a 4 de marcado con BRDU durante el mismo período. A los 4 días después del traumatismo, las arterias tratadas con citocalasina B o estaurosporina, así como los controles en PBS y anticuerpo monoclonal presentaron un grado de marcado con BRDU de 4. Las propiedades no citocidas antiproliferativas de citocalasina B y estaurosporina sugieren que estos agentes son idóneos para formulaciones de dosificación de liberación sostenida para la reducción de estenosis vascular.
Ejemplo 14 Conjugación directa de anticuerpo NR-AN-01 con grupos funcionales carboxílicos de una partícula de látex
Se pueden obtener partículas de látex revestidas de anticuerpos (un modelo de una forma de dosificación de liberación sostenida revestida de anticuerpo) usando la siguiente técnica aséptica:
Conjugación
Se añaden 0,5 ml de PBS que contiene 5 mg de anticuerpo monoclonal NR-AN-01 a 5 ml de borato sódico 0,05 M, pH 8,5, que contiene Tween-20 al 0,01% (monolaurato de polioxietilen sorbitán, Sigma). Se añaden a esta solución a temperatura ambiente, con agitación en Vortex, 2,5 ml de una suspensión acuosa que contiene 50 mg de partículas de látex carboxiladas de 1 \mum de diámetro. Inmediatamente después, se añaden con agitación en Vortex 0,5 ml de agua que contiene 100 mg de 1-(3-dimetil-aminopropil)-3-etil-carbodiimida HCl recién disuelto. La solución se incuba a continuación con agitación durante 1 a 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluye entonces con 50 ml de tampón fosfato 50 mM, pH 6,6, que contiene estabilizador de gelatina al 0,2% (tampón fosfato / gelatina). La mezcla se centrifuga a 40.000 x g durante 2 horas a 10ºC. Se decanta el líquido sobrenadante y se resuspende el sedimento en 50 ml de tampón fosfato/gelatina usando sonicación de bajo nivel durante 10 segundos. Se repite la centrifugación y se resuspende el sedimento dos veces, seguido por resuspensión en el tampón fosfato/gelatina. Las partículas conjugadas se liofilizan a continuación usando protocolos convencionales y excipientes de sorbitol.
Caracterización
(a) Clasificación: La homogeneización del tamaño de partículas se valora por anisotropía con láser o, para partículas mayores que 1 \mum, por examen al microscopio.
(b) Valoración de la unión específica: La unión específica a células del músculo liso se determina por examen histológico de tejido o de secciones cortadas con microtomo de sedimento celular después de incubar la proteína/conjugados de proteína con partículas conjugadas, con o sin proteína/péptido bloqueador incluido en la mezcla de incubación. Las técnicas de detección preferidas incluyen ensayos de anticuerpos secundarios (es decir, Ig anti-ratón) o ensayos competitivos (es decir, detección por radiocentelleo en combinación con conjugados de proteínas/péptidos marcados con radioisótopos).
(c) Valoración del grado de derivatización de proteína/péptido: Esta determinación se lleva a cabo revistiendo las partículas de látex con anticuerpo marcado con radioisótopos, seguido por detección de la radiactividad asociada con las partículas revestidas.
La caracterización de partículas revestidas de anticuerpo se describe en la Tabla 6.
TABLA 6 Caracterización de Partículas de látex revestidas de NR-AN-01
15
El efecto sobre la agregación de partículas del pH durante la conjugación con anticuerpos se presenta en la Tabla 7.
TABLA 7 Efecto del pH durante la conjugación de anticuerpo - agregación de partículas
16 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 + Usando MES 50 mM (pH 5,5); tampón fosfato (pH 7,0); o borato (pH
8,5) como se ha descrito.\cr  ++ Como se valora por examen al
microscopio, en una escala de 0 a
100%.\cr}
Estos datos sugieren que proteínas o péptidos se pueden conjugar directamente con formas de dosificación de liberación sostenida de la presente invención. De forma más específica, partículas de ácido poliláctico/glicólico que tienen grupos carboxilo terminales se conjugarán conforme al procedimiento descrito en la presente memoria o a procedimientos alternativos descritos en sus memorias descriptivas.
Ejemplo 15 Estudios in vivo de citocalasina B
Biodistribución de citocalasina B. Para determinar la biodistribución de citocalasina B, se inyectó a ratones (i.p.) 50 mg/kg de citocalasina B. Se inyectó a ratones control DMSO/Tween 20/carboxilmetil celulosa ("vehículo"). Los ratones se sacrificaron a las 3, 12, 24 y 72 horas después de la administración de citocalasina B o vehículo. Se extirparon los órganos, se homogeneizaron, se extrajeron y se cuantificó la cantidad de citocalasina B en los tejidos por HPLC. Aproximadamente un 75% de la citocalasina B permanecía en la cavidad peritoneal o en el sitio de inyección. De los órganos ensayados, la mayor cantidad de citocalasina B se encontró en el hígado. Análisis posteriores mostraron que la dosis máxima tolerada para citocalasina B fue de 50 mg/kg, y que esta dosis se puede administrar cada dos días.
Se administró también citocalasina B por vía intravenosa a ratones a 3,5 mg/kg (en metanol o Tween 20/carboximetil celulosa). Los ratones se sacrificaron a los 2 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 3 horas y 12 horas después de la administración de citocalasina B y se analizaron extractos de tejidos para determinar la citocalasina por HPLC. La máxima recuperación de citocalasina B de los extractos de tejidos fue del 32%. Los datos mostraron que citocalasina B estaba localizada en el pulmón y en el sitio de inyección, y que 3,5 mg/kg de citocalasina B no daban lugar a toxicidad aguda. A las 12 horas después de la administración, había niveles muy bajos de citocalasina B en los tejidos.
Se inyectó ^{3}H-citocalasina B (2 \mug; 30 \muCi/\mug) i.v. en ratones BALB/c que tenían vejigas urinarias que se habían ligado externamente. Los animales se sacrificaron a los 15 minutos, 30 minutos, 2 horas o 16 horas después de la inyección. Se extirparon los órganos, se desecaron en papel secante, se pesaron, se secaron al aire y se ensayó la radiactividad. Del 50 al 73% de la dosis inyectada total se encontraba en los tejidos muestreados (sangre, corazón, cerebro, músculo, huesos, pulmón, hígado, bazo, estómago, riñón, intestinos y vejiga urinaria). La depuración de ^{3}H-citocalasina B de la sangre fue extremadamente rápida, estando menos de un 1% de la dosis inyectada en circulación después de 15 minutos. Solo el hígado, el músculo esquelético y los intestinos mostraron una retención significativa de actividad de ^{3}H. Todos los tejidos tuvieron una depuración de la actividad de ^{3}H inferior al 1,5% de la dosis inyectada por gramo de tejido a las 16 horas.
Metabolismo de citocalasina B. Se mezcló citocalasina B en una dosis de 1,5 u 8 \mug/ml con cortes de hígado humano viable y no viable y media y se valoró la cantidad de ^{3}H-citocalasina B en la media o tejido por HPLC (Tablas 8 y 9).
La citotoxicidad de ^{3}H-citocalasina B y sus metabolitos también se valoró evaluando los cambios dependientes de la dosis en la función mitocondrial controlando la actividad de bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio (MTT) después de una exposición de 24 horas de cortes de hígado humano al agente de ensayo (Tabla 10).
TABLA 8 Distribución de ^{3}H-citocalasina b en la media y en tejido de hígado humano
17 
\newpage
TABLA 9
Estudio del metabolismo de cortes de hígado humano Naturaleza de la actividad de tritio Grado de conversión metabólica
18 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 10 Absorbancia de MTT en cortes de hígado humano expuestos a ^{3}H-citocalasina B durante 24 horas
19 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}{150mm}  ^{a}  Los valores de absorbancia de
MTT reflejan la viabilidad mitocondrial en la que los valores altos
de absorbancia representan mitocondrias viables y mientras que los
valores bajos de absorbancia reflejan mitocondrias no funcionales.
\end{minipage} \cr \cr   \begin{minipage}{150mm} Cada valor
representa la media  \pm  desviación típica de la densidad óptica de
muestras hepáticas por triplicado.
\end{minipage} \cr}
Los resultados de las Tablas 8-9 indicaron que el 98% de la ^{3}H-citocalasina B se había metabolizado en las 24 horas después de la administración con más de un 80% de la reactividad total presente en la media y menos de un 20% en el tejido. Los resultados de la tabla 10 indicaron que la ^{3}H-citocalasina B o sus metabolitos posteriores no eran citotóxicos.
Con el fin de determinar el metabolismo de ^{3}H-citocalasina B en sangre humana, se disolvió ^{3}H-citocalasina B (8 \mug/ml) en solución salina; dilución 1:1 de solución salina y plasma humano; o dilución 1:1 de solución salina y sangre humana completa. Las mezclas se incubaron durante 20 horas a 37ºC y seguidamente se analizaron por HPLC para determinar la estabilidad y metabolismo. ^{3}H-citocalasina B no se metabolizó cuando se mezcló con solución salina o plasma. No obstante, ^{3}H-citocalasina B se metabolizó por sangre humana completa, teniendo el metabolito un tiempo de retención por HPLC y un perfil consistentes con el observado en el ensayo de cortes de hígado humano (véase antes).
Estudios de toxicidad: Con el fin de determinar la toxicidad de citocalasina B, se inyectaron a ratas (4 machos y 4 hembras) 10 \mug/ml de citocalasina B cuatro veces al día durante 7 días (Tabla 11). Se registraron datos relativos a cambios de peso corporal, consumo de alimento, eficacia del alimento, parámetros hematológicos, parámetros de coagulación, parámetros de bioquímica sérica y hallazgos macroscópicos de la autopsia. El único parámetro que sugirió un efecto adverso de la administración de citocalasina B fue una elevación del peso medio relativo del corazón en animales hembra tratadas. No hubo cambios macroscópicos o al microscopio detectados en el corazón que justificaran la elevación. Así, la administración diaria de citocalasina B a ratas en una dosis de 800 \mug/ml (para una dosis total inyectada de 5600 \mug/kg) puede tener un efecto sobre el peso del corazón de ratas hembra (pero no de machos). No obstante, no se extrajo sangre coagulada de forma rutinaria de las luces del corazón antes del peso del corazón.
TABLA 11
20
Para determinar la toxicidad de la administración crónica de citocalasina B, se administró citocalasina B por vía intravenosa a ratas Sprague-Dawley durante siete días (Tabla 12). Se recogieron datos relativos a consumo de alimento, peso corporal, parámetros hematológicos, parámetros bioquímicos, perfiles de coagulación, peso de órganos, observaciones clínicas, hallazgos macroscópicos en la autopsia e histopatología. Se encontró que la administración crónica intravenosa de citocalasina B en dosis de hasta 600 \mug/kg/día no dio como resultado indicación de efectos adversos o toxicidad.
TABLA 12
21
Un estudio similar en perros (Tabla 13), que obtuvo datos sobre el consumo de alimento, pesos corporales, parámetros hematológicos, parámetros bioquímicos, perfiles de coagulación, pesos de órganos, observaciones clínicas, auscultación de la cavidad torácica, exploración oftálmica, hallazgos macroscópicos en autopsia e histopatología (grupo de dosis alta), encontró que la administración intravenosa de citocalasina B durante siete días consecutivos a perros Beagle en dosis de hasta 648 \mug/kg/día (una dosis acumulada de 4.536 \mug/kg) no dio como resultado ningún indicio de efectos adversos o toxicidad.
TABLA 13
22
Ejemplo 16 Fijación biológica de la luz de arterias de cerdo traumatizadas con un globo
Se traumatizaron arterias femorales de cerdo como se describe en el Ejemplo 7, y luego se trataron con citocalasina B. Se realizó una infusión de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2 ml de citocalasina B a 0,1 \mug/ml en porciones de la arteria que se habían separado de otras porciones mediante ligaduras. La arteria se sometió a presión durante 3 minutos y se aspiró el fluido. Se retienen aproximadamente 8 a aproximadamente 30 lambda de la solución en el espacio intersticial que rodea las células en la túnica media. Se evaluaron seguidamente diez arterias femorales (dos arterias obtenidas de cada uno de los 5 cerdos que se trataron conforme al protocolo de dosis única descrito en el Ejemplo 7) de forma histológica a los 4 días ó 3 semanas después de la administración de citocalasina B. Se midió el área luminal máxima de cada arteria y se calculó a partir de imágenes digitalizadas al microscopio por un sistema de análisis morfométrico informatizado BQ System IV (R & M Biometrics, Inc., Nashville, TN). Este experimento se repitió con otros 5 cerdos (dos arterias por cerdo; dosis de citocalasina B = 0,1 \mug/ml, aplicada durante 3 minutos a una presión de 1 atmósfera; mismos puntos de tiempo). Se combinaron los datos obtenidos de los dos experimentos. Las arterias de cerdo traumatizadas con globo que se habían tratado con citocalasina B presentaron una mayor área luminal en los puntos de tiempo después del tratamiento de 4 días y 3 semanas, al compararlas con arterias tratadas con otros agentes de ensayo o controles.
El área luminal de los segmentos traumatizados y tratados con citocalasina B de las arterias se comparó también con el área luminal de la región no tratada normal de la arteria femoral proximal al área de ensayo. Los resultados mostraron que el área luminal en la región de ensayo fue aproximadamente dos veces mayor que el área del segmento de control normal de la misma arteria. Los agentes de control negativos, PBS y anticuerpo monoclonal NR-AN-01, no mostraron aumento o una ligera reducción en el área luminal al comparar con el segmento de control normal de la misma arteria.
Se llevó a cabo seguidamente un estudio de respuesta a una dosis de citocalasina B en 10 cerdos, siguiendo el protocolo experimental descrio en el Ejemplo 7. En resumen, se trataron ambas arterias femorales en cada uno de 2 cerdos con una de las dosis siguientes de citocalasina B: 0,0 \mug/ml (es decir, control negativo PBS); 0,01 \mug/ml; 0,10 \mug/ml; 1,0 \mug/ml; y 10,0 \mug/ml como se ha descrito antes. El agente se liberó mediante un catéter intraluminal a una presión de 1 atmósfera durante 3 minutos y se evaluaron las arterias 3 semanas después mediante el sistema de análisis morfométrico descrito antes. La relación del área luminal de la arteria tratada a área luminal de la arteria normal proximal se determinó como cambio porcentual en el área tratada frente a la normal, o el tamaño luminal de la arteria (diámetro o área de la sección transversal) de arterias tratadas con respecto a arterias traumatizadas pero no tratadas. Se observó un efecto umbral significativo en dosis de 0,1 \mug/ml (aproximadamente un aumento del 140%) a 1,0 \mug/ml (Figura 14). La dosis subumbral (0,01 \mug/ml) y el control negativo (PBS) mostraron aproximadamente un cambio de \pm20% en el área luminal.
Las microfotografías electrónicas revelaron que en una hora de traumatismo con globo, había una despolimerización de los miofilamentos en vasos traumatizados, que son orgánulos que pueden contraerse. La despolimerización de los miofilamentos es una respuesta fisiológica normal de las células del músculo liso vascular al traumatismo, y es la primera etapa en su transformación de una célula contráctil a una secretora y migradora. El tratamiento de arterias porcinas traumatizadas con aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10,0 \mug/ml de citocalasina B no dio como resultado una mayor velocidad o una velocidad más extensiva de despolimerización de las miofibrillas. No obstante, las microfotografías electrónicas mostraron que se retardó la nueva formación de miofilamentos. En base al aumento sostenido en el diámetro del vaso, se puede ralentizar la vuelta a la contractilidad vascular normal de forma más extensiva que la sugerida por la vuelta retardada a la morfología normal.
Las áreas traumatizada y tratada de la arteria no sufrieron la constricción o constricción geométrica crónica (vascular) que se produce normalmente en controles simulados en el cerdo, y que se ha descrito en seres humanos después de PTCA. Secciones transversales de la arteria mostraron una mayor área de la sección transversal del vaso total, obtenida midiendo la relación del área del vaso en el interior de la lámina elástica externa (EEL) del área tratada con respecto a la media del área del vaso total de las regiones proximal y distal de la misma arteria, comparada con arterias traumatizadas pero no tratadas con citocalasina B. En arterias que se traumatizaron con un globo flexible que lesiona la pared del vaso sin desprender la túnica media, no se produjo una proliferación íntima más uniforme y el mayor tamaño del vaso (área dentro de la EEL) dio como resultado una mayor área de la sección transversal luminal y una reducción significativa de la reestenosis. Cuando los vasos estaban dañados de forma más extensa y la túnica media se había replegado, hubo una proliferación más extensa y remodelado de trombos que dio lugar a una proliferación de la íntima muy
variable.
Así, la administración de citocalasina B a células del músculo liso vascular porcinas mediante un catéter de infusión después de traumatismo por dilatación con un globo dio lugar a una retención más extensiva del tamaño de la luz de la arteria (diámetro y área de la sección transversal) que la producida por el globo de dilatación. Este efecto se consigue reemplazando todo el volumen del fluido intersticial entre las células de la túnica media con el agente tera-
péutico.
Por otro lado, citocalasina B tiene un amplio índice terapéutico que varía de aproximadamente 0,1 a 10 \mug/ml, sin evidencia de toxicidad a 10 \mug/ml. Diez \mug/ml es la concentración de saturación máxima de citocalasina B en solución salina. Por otro lado, el efecto producido por la administración de citocalasina B se hace más evidente durante las 3 a 8 semanas después del traumatismo por globo. Estos datos sugieren que citocalasina B actúa como "fijación biológica de la luz" cuando se libera a arterias traumatizadas.
Se evaluaron arterias porcinas traumatizadas con globo control y tratadas (0,1 \mug/ml de citocalasina B) a 1, 4, 7, 14 ó 21 días después de la intervención. El análisis morfométrico en secciones histológicas congeladas de arteria mostró que las arterias tratadas con citocalasina B alcanzaron un estado de dilatación sostenida que cambió muy poco entre los días 7 y 21. Un análisis de varianza de dos vías indicó una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,5) en las áreas de la luz arterial durante tres semanas entre los grupos tratados con citocalasina B y
control.
Un estudio dosis-respuesta de arterias coronarias porcinas traumatizadas con globo mostró que el tratamiento con citocalasina B a 0,1, 1,5 ó 10,0 \mug/ml (Tabla 14, "fijación biológica de la luz") dio como resultado una dilatación arterial sostenida del área luminal coronaria a las tres semanas después de la intervención. Por otro lado, la administración de citocalasina B no dio como resultado lesiones de miocardio o arteriales atribuibles a la citocalasina B como se pudo evaluar histológicamente. No se observaron cambios significativos estadísticamente y biológicamente atribuibles a citocalasina B en los parámetros bioquímicos, parámetros hematológicos, pesos corporales, tensión arterial o electrocardiogramas.
TABLA 14 Datos morfométricos coronarios porcinos
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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}{145mm} * La dosis se basa en la concentración
de citocalasina B ( \mu g/ml) en el volumen de aproximadamente 8 a
aproximadamente 30 lambda de fluido liberado a aproximadamente 10 a
aproximadamente 20% de la túnica media.
\end{minipage} \cr}
También se traumatizaron arterias coronarias porcinas por embolectomía o globo de PTCA sobredimensionado, y luego se realizó una infusión de 8 a 16 ml de citocalasina B a 8,0 \mug/ml en la pared arterial con un catéter MIC para conseguir una dosis terapéutica. Los controles incluyeron un control diluyente y un control sin tratar traumatizado, y todos los animales se sacrificaron 4 semanas después de la intervención y se fijaron las arterias coronarias por perfusión.
Se llevó a cabo una morfometría en secciones seleccionadas de segmentos proximal, tratado y distal de las arterias coronarias (Tabla 15).
TABLA 15 Estudio de la arteria coronaria porcina
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Aunque los datos mostrados en la Tabla 15, al contrario que los estudios previos, mostraron que la liberación local de citocalasina B no dio como resultado un aumento estadísticamente significativo en el área luminal, los datos muestran que hubo una tendencia a remodelado beneficioso de la arteria como se puso de manifiesto por una mayor área luminal unida por la lámina elástica externa en las arterias tratadas con citocalasina B cuando se compararon con el resto de controles. El diámetro de, o el área en, la EEL de la arteria puede compararse con controles como indicador del grado de remodelado vascular. La falta de aumento estadísticamente significativo en el área luminal puede deberse a la mayor variabilidad entre muestras, mayor formación de neoíntima y/o mayor grado de traumatismo.
En resumen, estos estudios demostraron que la administración de un inhibidor citoesquelético, tal como citocalasina B, en una cantidad que puede fijar biológicamente la luz de un vaso traumatizado puede también ser eficaz para inhibir o reducir la proliferación de células del músculo liso vascular.
Ejemplo 17 Formulaciones de liberación sostenida de citocalasina B y taxol
Con el fin de determinar la eficacia de formas de dosificación de liberación sostenida local de citocalasina B o taxol para inhibir reestenosis, se aplicaron citocalasina B o taxol en una estructura de soporte, por ejemplo, una "envuelta" sobre el tejido de la adventicia que rodea una arteria carótida de conejo traumatizada con un globo (Grupos 1 a 11) o una arteria femoral de cerdo traumatizada con un globo (Grupo 12) (Tabla 16).
Las arterias en los animales del grupo 1a y 1b se trataron con 20 mg de citocalasina B en 1 g de un gel de colágeno bovino (BioCore, Inc., Topeka, KS) que estaba soportado, o inmerso en, una envuelta de malla de colágeno bovino ((Skin Temp-Biosynthetic Skin Dressing, BioCore, Inc., Topeka, KS). A 1 semana después del tratamiento, la arteria tratada con citocalasina B en el animal 1233 no mostró proliferación de la íntima o adventicia. Se produjo una acentuada muerte celular en la zona externa de la túnica media con heterófilos infiltrados en la túnica media. Los heterófilos estuvieron presentes fuera de la envuelta, pero la citocalasina B inhibió la infiltración de heterófilos y macrófagos en de la envuelta. La arteria del animal control (1249) tuvo una proliferación de la íntima moderada y se infiltraron heterófilos e histiocitos en la envuelta. La muerte celular en la túnica media fue mínima.
A las 2 semanas después del tratamiento, se produjo una proliferación de la íntima y adventicia mínima en el área tratada con una envuelta con citocalasina B de la arteria (animal 1224). La íntima se dispuso de forma holgada y la infiltración de heterófilos fue mínima. Había presentes células gigantes sincitiales. En la arteria del animal con envuelta control (animal 1222), hubo una proliferación moderada con heterófilos y macrófagos en el área de la envuelta. Estas células fueron visibles en la túnica media.
A las tres semanas después del tratamiento, no se observó proliferación de la íntima en el área tratada con una envuelta con citocalasina B de la arteria (1244). Alrededor de la envuelta había presentes heterófilos y células gigantes sincitiales. No hubo necrosis significativa de las células en la túnica media con infiltración de heterófilos y macrófagos. No había presente endotelio. En la arteria control (animal 1232) hubo una acentuada proliferación de la íntima, con tejido de la adventicia y perivascular bien organizado. Se infiltraron en la envuelta heterófilos y macrófagos. Las células en la túnica media fueron viables y hubo un trombo mural en la luz del vaso. Así, la inhibición de proliferación de la íntima se apreció en las arterias de los animales del Grupo 1a y 1b tratados con citocalasina B, sin embargo, no hubo reacción significativa hacia el material de la envuelta.
Las arterias de los animales en el Grupo 2a y 2b se trataron con citocalasina B (30% peso/peso; 300 mg de citocalasina B/g silicona) en una envuelta de silicona (Q-7 4840, Dow Corning, Midland, MI). Una semana después del traumatismo no hubo proliferación significativa de la íntima o adventicia de células del músculo liso (CML) o tejido de mensénquima (animal 1229). Hubo una necrosis significativa de CML en la zona externa de la túnica media. En áreas que parecían estar mínimamente traumatizadas por el globo flexible la necrosis celular varió de nula a mínima. Esto indica que las células traumatizadas fueron más propensas a morir cuando estaban expuestas a esta dosis de citocalasina B pero que esta dosis no era citocida para CML normales o mínimamente traumatizadas. Se produjo una mínima infiltración de células mononucleares y polimorfonucleares en la túnica media. Se apreciaron unos pocos heterófilos infiltrados en la luz del vaso.
En el animal control (1228) hubo menos necrosis celular en la túnica media, y la necrosis presente estuvo localizada en la zona interna en lugar de en la zona externa de la pared arterial. Así, la inhibición de citocalasina B de reparación celular parece aumentar la necrosis en la túnica media. El control también carecía de proliferación en la túnica media o adventicia y organización de coágulos perivasculares. La infiltración celular en cualquier área fue mínima.
Dos semanas después de iniciar el tratamiento con citocalasina B se produjo una inhibición completa de proliferación de la íntima y solo una mínima organización de coágulos perivasculares que se debió fundamentalmente a formación de fibrina y no a la proliferación de mesénquima (animal 1227). Hubo una ligera infiltración de células polimorfonucleares e infiltración mínima de células mononucleares en la túnica media y adventicia. No había presente endotelio en el área de la envuelta, salvo unos pocos focos aislados pequeños. La arteria control (animal 1226) tuvo una moderada proliferación de la íntima y proliferación de la adventicia con organización de mesénquima del área de coágulos perivasculares. Los focos de proliferación endotelial fueron mayores y más extensos en el animal control al compararlo con el vaso tratado con citocalasina B.
Con exposición de 3 semanas (animal 1212) a citocalasina B en una envuelta de silicona, el vaso mostró una acentuada pérdida celular en la túnica media que fue más intensa en la zona externa. La infiltración celular en la túnica media y adventicia fue mínima y la endotelización solo estuvo presente en unas pocas áreas localizadas. Hubo una proliferación moderada irregular de la íntima; sin embargo, las células de la íntima y algunas células endoteliales que estaban presentes estaban desorganizadas y sin polaridad. La inhibición de la migración de citocalasina B dio como resultado una pérdida de organización o polaridad. La proliferación de la íntima también fue leve en el vaso control (1230); sin embargo, la íntima estaba bien organizada y también casi totalmente endotelizada. Hubo una pérdida mínima en la túnica media. Así, se observó una inhibición de la íntima significativa en las dos primeras semanas en los animales tratados del Grupo 2.
Los vasos en los animales en el grupo 3a y 3b se trataron con 8 mg de citocalasina B en 100 mg de un gel pluronic (F-127, BASF) que estaba soportado por una envuelta de malla de colágeno bovino de 1 cm x 1 cm. Una semana después del tratamiento, la arteria tratada con citocalasina B del animal 1250 tenía ligera proliferación de la íntima de un espesor irregular. Había aproximadamente una reendotelización del 30% y las células de la túnica media eran viables, siendo la pérdida más significativa (leve) en la zona interna de la túnica media. Se produjo una acentuada reacción piogranulomatosa al gel pluronic en la región perivascular y adventicia. La trombosis completa de la arteria control del animal 1261 evitó su evaluación.
A las dos semanas, el gel pluronic con citocalasina B estimuló una reacción piogranulomatosa acentuada en el tejido de la adventicia y perivascular. Hubo una leve e irregular proliferación de la íntima y una completa endotelización. Las células de la túnica media fueron viables. Parecía haber una leve pérdida celular de la zona interna de la túnica media. La arteria del animal control (1247) tenía una leve e irregular proliferación de la íntima, una completa endotelización con células endoteliales hinchadas y células viables en la túnica media. Se produjo una acentuada reacción inflamatoria piogranulomatosa a los restos del gel pluronic.
A las tres semanas, las arterias de los animales 1248 y 1246 mostraron restos de la envuelta de colágeno; no obstante, la envuelta estaba menos descompuesta en el animal tratado con citocalasina B (1248) que en el control (1246). Este retardo en la reabsorción de la envuelta puede deberse a la inhibición de citocalasina B de la migración y función de los macrófagos. Tanto el tratado con el control tuvieron un grado moderado de hiperplasia de la íntima a las 3 semanas, por lo que no fue significativo el grado de inhibición de la íntima de citocalasina B cuando se administró en el gel pluronic. Se apreciaron focos de mineralización distrófica en la arteria tratada con citocalasina B. Así, no se observó efecto inhibidor sobre la íntima en estos animales (Grupo 3) a 1, 2 ó 3 semanas después de iniciarse el tratamiento.
Las arterias de los animales del Grupo 4a y b que se habían tratado con 100 mg de citocalasina B (10% peso/peso) en la envuelta de silicona de 1 g tuvieron una inhibición significativa de la proliferación de la íntima en todos los tiempos. En la arteria tratada con envuelta y citocalasina B del animal 1259, no hubo proliferación de la íntima o fibrosis de la adventicia presente una semana después del tratamiento. Había presentes vasos con ectasia en la adventicia y el coágulo perivascular estaba desorganizado y formado solo de fibrina. Hubo una acentuada pérdida celular de la túnica media, en especial en la zona externa. Se apreciaron heterófilos infiltrados en la túnica media. En la arteria control (1206) no hubo proliferación de la íntima a 1 semana; sin embargo, se produjo una rápida organización fibrosa del coágulo perivascular. La pérdida celular de la túnica media fue más difusa que en la envuelta de citocalasina B que fue más severa en la zona externa.
La arteria tratada con envuelta de citocalasina B del animal 1253 tuvo una proliferación de la íntima mínima a las dos semanas, comparado con la arteria tratada con envuelta control (1258) que tuvo la máxima proliferación de la íntima. La proliferación de la íntima en la arteria tratada con envuelta de citocalasina B fue irregular y parecía ser el resultado de trombos murales organizados por CML infiltradas. Solo había capas delgadas sueltas de plaquetas en la arteria tratada con envuelta de citocalasina B, con marginación de heterófilos. No se produjo endotelización en la arteria tratada con envuelta de citocalasina B y menos del 20% de endotelización en la arteria control. El coágulo perivascular era desorganizado y quedaba fibrinosa en la arteria tratada con envuelta de citocalasina B y bien organizado en la arteria control. La arteria control tuvo una mínima pérdida celular de la túnica media mientras que la arteria tratada con envuelta de citocalasina B tuvo una marcada pérdida celular.
A las tres semanas, la arteria tratada con envuelta de citocalasina B (1251) mostró una proliferación de mínima a nula de la íntima. La proliferación de la íntima parecía producirse cuando había menos pérdida celular de la túnica media. Hubo una reendotelización temprana en la arteria tratada con envuelta de citocalasina B, pero las células eran con frecuencia redondeadas y unidas de forma holgada y solo había presentes unos pocos focos dispersos (< 10%). El coágulo perivascular en la arteria tratada con envuelta de citocalasina B estaba desorganizado y todavía estaba formado de fibrina, mientras que la arteria control estaba bien organizada con fibroblastos y matriz de colágeno. La arteria control estaba totalmente trombosada, había una acentuada producción de íntima en áreas distales del trombo que estaban menos organizadas.
Las arterias en los animales en el Grupo 5a y b se trataron con 50 mg de taxol en 1 g de una envuelta de silicona (5% p/p). Este tratamiento mostró una marcada inhibición de la proliferación de la íntima en todos los tiempos. La arteria tratada con taxol (animal 1278 a 1 semana) no sufrió proliferación de la íntima o adventicia y el coágulo perivascular era fibrinoso y desorganizado. Hubo una marcada pérdida de células en la túnica media y no había presente revestimiento endotelial. El control (1279) tuvo una leve proliferación de la íntima con fibrosis muy prematura del coágulo perivascular fibrinoso. La luz se reendotelizó aproximadamente en un 85%. Tanto la arteria tratada como la control tuvieron una leve infiltración de heterófilos en la túnica media y adventicia.
La arteria del animal 1281, que se había tratado durante dos semanas con taxol, no sufrió proliferación de la íntima, fibrosis de la adventicia mínima y una marcada necrosis celular en la túnica media con una leve infiltración de heterófilos. Había presentes áreas focales de necrosis y mineralización distrófica en la adventicia y en el tejido del coágulo perivascular. La arteria del animal control (1280) tuvo una proliferación de la íntima moderada, con una marcada organización de la adventicia y el coágulo perivascular. La luz se reendotelizó un 100% y las células CML de la túnica media fueron viables en la arteria control.
A las tres semanas, la arteria tratada con envuelta de taxol (1242) no sufrió proliferación de la íntima y estaba reendotelizada un 50% con células endoteliales que aparecían hinchadas. Se produjo una organización mínima del coágulo perivascular y una pérdida celular marcada de la túnica media. Hubo una leve infiltración de heterófilos en la túnica media y marginación sobre la superficie luminal del vaso. La arteria control (1234) sufrió una acentuada proliferación de la íntima y fibrosis de la adventicia y coágulo perivascular. Las células en la túnica fueron viables.
En el Grupo 6a y 6b, las arterias tratadas con taxol también tuvieron una acentuada inhibición 2 semanas después de retirar la envuelta. El animal 1276 tubo una envuelta de taxol durante 2 semanas y luego se retiró la envuelta y se sacrificó el animal 3 semanas después. Después del período de recuperación de tres semanas desde la retirada de la envuelta de taxol (1276) solo se produjo una mínima proliferación de la intima, salvo en unas pocas áreas localizadas que parecieron estar engrosadas debido a organización de CML de trombos murales en esta arteria. La adventicia estuvo bien organizada y hubo una pérdida significativa en al túnica media pero las células presentes fueron viables. La luz se reendotelizó aproximadamente en un 90%. La arteria control (1277) tuvo una marcada proliferación de la íntima, tejido perivascular bien organizado y se reendotelizó en un 100%.
Los resultados observados para animales del Grupo 7a demostraron que las arterias tratadas con citocalasina B (10% peso/peso) no presentaron proliferación de la íntima durante 2 semanas. Sin embargo, la reducción en la velocidad de liberación de citocalasina B produjo una leve proliferación de la íntima a la semana tres después de la colocación de la envuelta. A la semana (1257) las arterias no mostraron proliferación de la íntima y una necrosis acentuada de CML de la túnica media con una moderada infiltración de heterófilos. No había endotelio y heterófilos y los macrófagos estaban marginados a lo largo de la superficie de la luz. Por otro lado, no hubo evidencia de agregados plaquetarios adheridos a la pared del vaso. A las dos semanas (1265), las arterias eran morfológicamente iguales a las arterias a una semana. A las tres semanas (1266), las arterias mostraron una leve proliferación de la íntima irregular. Además, los heterófilos fueron poco habituales en la túnica media, la luz se reendotelizó un 70% y hubo una fibrosis temprana en la adventicia con coágulo perivascular desorganizado todavía presente en las arterias tratadas. Esto indica que a las tres semanas, el nivel de agente terapéutico ha caído por debajo del nivel terapéutico en la pared arterial; sin embargo, todavía había suficiente fármaco para que existiera efecto inhibidor de la organización de coágulos inmediatamente adyacentes a la envuelta.
Las arterias de los animales del Grupo 8a se trataron con citocalasina B al 10% durante 2 semanas y luego se retiró la envuelta y se evaluaron los vasos 2 semanas después, tuvieron una proliferación de la íntima variable en y entre animales. La arteria del animal 1254 tuvo una proliferación de la íntima variable que oscilaba desde nula a leve, fibrosis de la adventicia bien desarrollada, marcada pérdida celular en la túnica media y áreas localizadas de mineralización distrófica en la túnica media y adventicia externa. Las áreas de leve proliferación de la íntima estuvieron en los extremos del área de la envuelta, sugiriendo una infiltración desde las regiones arteriales no tratadas adyacentes. La luz se reendotelizó aproximadamente en un 60%. La arteria del animal 1255 tuvo una proliferación de la íntima de leve a moderada, células viables en la túnica media y tejido bien organizado en la adventicia. La luz se reendotelizó en un 100%. La arteria del animal 1256 estaba totalmente trombosada. El trombo proximal a crónico en el área de la envuelta era un trombo agudo y hubo una proliferación moderada de la íntima.
Aunque existía una proliferación moderada de la íntima en las arterias de algunos animales, la proliferación en estas arterias fue todavía menor que en los controles del Grupo 9b. Las envueltas de silicona control con manitol se dejaron en la arteria durante dos semanas después del traumatismo con globo y luego se retiraron y se sacrificó el animal y evaluó la arteria histológicamente 1 semana después de la retirada de la envuelta. Dos de las arterias (1267 y 1268) tuvieron una moderada proliferación de la íntima con una reendotelización del 100% y una tuvo una proliferación máxima. La arteria con proliferación máxima de la íntima tuvo un trombo ocluyente agudo presente.
Las arterias en los animales de los Grupos 10 y 11 se trataron con 10 mg de citocalasina B cargada en 1 g de una envuelta de silicona (1% peso/peso) que se aplicó a la arteria durante 2 semanas, se retiró quirúrgicamente y se evaluó histológicamente 2 ó 4 semanas después, respectivamente. No se apreciaron diferencias significativas en una evaluación cualitativa entre los animales de ensayo y control. Los animales 1304 y 1305 tuvieron una envuelta de citocalasina B (1%) durante 2 semanas que luego se retiró. Dos semanas después de la retirada se sacrificaron los animales. La arteria del animal 1304 mostró una moderada proliferación de la íntima en la mayoría de áreas de la envuelta, en áreas de necrosis celular de la túnica media acentuada y mineralización distrófica la proliferación fue leve. Hubo una reendotelización del 100% y no había presentes heterófilos en la túnica media o íntima. El área de la adventicia y del coágulo perivascular estaba bien organizada. La arteria del animal 1305 fue similar a la arteria del animal 1304 morfológicamente. La arteria del animal 1306 mostró una marcada proliferación de la íntima, sin heterófilos infiltrados en la intima o túnica media y estaba reendotelizado al 100%.
Los animales 1307, 1308 y 1309 estuvieron expuestos a una envuelta de citocalasina B (1%) durante 2 semanas que se retiró posteriormente. Cuatro semanas después de la retirada se sacrificaron los animales. La arteria del animal 1307 tuvo una moderada proliferación de la íntima con áreas localizadas de engrosamiento debido a organización de trombo mural por CML. Hubo una pérdida significativa de células de la túnica media y la lámina elástica parecía colapsar. Había unos pocos heterófilos presentes en la adventicia. Había secciones o áreas en la zona de la envuelta con una proliferación mínima de la íntima. La arteria del animal 1308 mostró una moderada proliferación de la íntima con áreas de acentuada pérdida celular en la túnica media y mineralización distrófica en la zona externa de la túnica media. El vaso estaba reendotelizado al 100%. La arteria del animal 1309 tuvo una marcada proliferación de la intima con una región adventicia y perivascular bien organizada. EL animal 1311 no se evaluó debido a trombosis. Los resultados de la arteria del animal 1312 fueron bastante variables, con secciones que mostraban una gama de proliferación de la íntima, desde leve a moderada. La endotelización parecía ser completa en estas arterias.
Las arterias de los animales del Grupo 12 (arterias femorales de cerdo) que se trataron con envuelta de silicona cargada con citocalasina B al 30% peso/peso mostraron una proliferación de la íntima significativamente inhibida durante las dos primeras semanas. Aunque hubo una proliferación de la íntima en las arterias tres semanas después, la proliferación fue todavía menor que la proliferación observada para los controles.
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En resumen, la proliferación de la íntima de arterias de cerdo traumatizadas se inhibió de forma significativa con citocalasina B y taxol en forma de dosificación de liberación sostenida. La liberación sostenida de agente terapéutico mejor controlada, sin la estimulación de reacción inflamatoria secundaria, se obtuvo con un material de envuelta adventicia formado por silicona. Las envueltas de silicona inhibieron proliferación de la íntima con cargas de citocalasina B de 30% y 10%; sin embargo, cuando el nivel de liberación caía entre 2 y 3 semanas se produjo inicio de proliferación de la íntima. Cuando las envueltas se dejaron en su posición durante 2 semanas y luego se retiraron quirúrgicamente y se examinaron las arterias de 1 a 4 semanas después apareció un efecto rebote de proliferación de la íntima. El efecto rebote se produjo cuando la proliferación de la íntima de la arteria tratada con el agente terapéutico se acercaba, aunque era todavía menor, que la proliferación de la intima en la arteria control. El animal tratado con taxol parecía tener menos efecto rebote que las arterias tratadas con citocalasina B.
Ejemplo 18 Liberación de citocalasina B cristalina o taxol
Se evaluó la distribución en tejido in vivo de citocalasina B administrada en forma cristalina en arterias femorales porcinas traumatizadas con un globo después de liberación local. Se traumatizó con un globo una arteria femoral de un cerdo cruzado de Yorkshire mediante inflado excesivo y rotación de un catéter de embolectomía de silicona Vascu-Flo™. Al traumatismo con globo siguió inmediatamente la liberación intravascular de cristales de ^{3}H-citocalasina B 10 \mug/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en solución salina (saturada) durante tres minutos a una atmósfera de presión. Se volvió a reanudar el flujo sanguíneo en la arteria durante cinco minutos antes de sacrificar el animal. Un análisis de la distribución en tejido de ^{3}H-citocalasina B mostró que este método era eficaz para liberar 31 ug de ^{3}H-citocalasina B que se localizaba fundamentalmente en la adventicia. La ^{3}H-citocalasina B se visualizó histológicamente mediante la presencia de granos plateados en una emulsión autorradiográfica. Así, estos resultados muestran que citocalasina B cristalina se puede liberar localmente en la pared de un vaso in vivo.
Otro estudio empleó veinte ratas macho Sprague-Dawley. Las ratas sufrieron traumatismo con globo en su arteria carótida izquierda, seguido por infusión interarterial de una solución que contenía 1 mg de citocalasina B cristalina en 300 ml de vehículo (solución salina estéril de Hanks con 0,5% de Chrmophor) o un diluyente control (solución salina). Los animales se sacrificaron inmediatamente después de la infusión y a los 2, 4, 7 y 14 días después del traumatismo e infusión. Después del sacrificio, se extirparon las arterias carótidas izquierda y derecha (control). Se obtuvieron muestras de arterias para la cuantificación de ^{3}H-citocalasina B por oxidación y recuento de centelleo, histopatología, autorradiografía y morfometría vascular. La histopatología demostró un traumatismo con globo circunferencial uniforme en la pared arterial de las arterias carótidas izquierdas.
Por autorradiografía, había presentes cristales de citocalasina B el día 0 en coágulos de fibrina intraluminales, adherentes a la íntima pero raramente presentes en la adventicia. El día 2, el número de cristales disminuyó con respeto al día 0 y el día 4 los cristales no fueron detectables por autorradiografía. Los resultados autorradiográficos estaban estrechamente correlacionados con la valoración cuantitativa de ^{3}H-citocalasina B por oxidación y recuento de centelleo en los que estaban presentes aproximadamente 8 ug de citocalasina B en la longitud de arteria tratada el día 0 y poco menos de 2 ng presentes el día 2. No obstante, uno de los dos animales sacrificados el día 4 todavía tenía niveles de citocalasina por encima del control. Los análisis morfométricos de arterías carótidas izquierdas de ratas tratadas con citocalasina B comparados con ratas tratadas con diluyente no mostraron reducción estadísticamente significativa en la formación de neoíntima. Sin embargo, las cinco ratas tratadas tuvieron una mayor área media luminal y una menor área neoíntima que el control tratado con diluyente.
La citocalasina B y el taxol se administraron periadventiciamente. Tres grupos de siete ratas adultas macho sufrieron traumatismo con globo de la arteria carótida izquierda inmediatamente seguido por colocación periadventicia de cristales de citocalasina B (7,8 - 11,8 mg/rata), cristales de taxol (3,4 - 6,5 mg/rata) o sin fármaco (control). Los cristales de citocalasina B y taxol se colocaron de una forma uniforme que cubría la superficie expuesta quirúrgicamente de la arteria carótida, seguido por cierre de la piel y tejidos subcutáneos circundantes mediante suturas. Catorce días después se sacrificaron las ratas y se procesaron sus arterias carótidas para el análisis histológico y morfométrico.
Dos animales tratados con citocalasina B murieron debido a hemorragia aguda en el sitio de cirugía y shock hipovolémico antes del momento del sacrificio el día 14. Dos animales más, uno tratado con citocalasina B y uno tratado con taxol se sacrificaron con inflamación subcutánea que crecía rápidamente y hemorragia en el sitio de cirugía antes del momento del sacrificio el día 14. Todos los animales tratados con cristales de citocalasina B o taxol sufrieron una toxicidad significativa en el sitio de cirugía que se caracterizó por grados variables de hemorragia, necrosis de la pared del vaso, necrosis del músculo esquelético adyacente e inflamación. Además, tanto los animales tratados con taxol como con citocalasina B tuvieron un retraso en el aumento de peso postquirúrgico.
Los tres animales tratados con citocalasina B, los 6 tratados con taxol y los 7 control que sobrevivieron al momento del sacrificio el día 14 se evaluaron morfométricamente. Los animales tratados con taxol tenían áreas luminales mayores estadísticamente significativas y no tuvieron proliferación de la íntima cuando se compararon con los animales control no tratados traumatizados con globo en una prueba t de dos vías con p < 0,05. Los animales tratados con citocalasina B no presentaron diferencia estadística de los controles en el área luminal, área de la neoíntima, área de la media, áreas unidas por la lámina elástica externa o en la relación íntima a media.
Para evaluar con más detalle la eficacia de taxol cristalino para inhibir la formación de neoíntima en ratas, se sometieron cuatro grupos de 5 a 6 ratas macho adultas a traumatismo con globo de la arteria carótida izquierda seguido inmediatamente por liberación periadventicia de 1, 0,1, 0,01 ó 0 mg de cristales de taxol en 500 mg de polímero pluronic en una matriz de gel. Catorce días después, se sacrificaron las ratas, se recogió el suero y se procesaron sus arterias carótidas para el análisis histológico y morfométrico.
Cinco animales (3 - 1 mg y 2 - 0,01 mg) murieron después de la cirugía debido a dificultades técnicas. A nivel macroscópico, estuvo presente mionecrosis del músculo esquelético adyacente (regiones blanco pálido de la musculatura) en 3/3, 1/5, 0/4 y 0/5 animales en los grupos de 1 mg, 0,1 mg, 0,01 mg y control, respectivamente. Desde el punto de vista histológico, se confirmó mionecrosis en el músculo esquelético adyacente y en algunas regiones de la túnica media de la arteria carótida izquierda en el grupo de tratamiento de 1 mg pero no en el resto de grupos.
Desde el punto de vista morfométrico, no hubo diferencia estadística en el área luminal, área de neoíntima, área unida por la lámina elástica interna, área de la túnica media, área unida por la lámina elástica externa o relación neoíntima/media cuando se compararon por análisis de varianza usando el paquete del programa de análisis de datos Excell.
El tratamiento periadventicio de arterias carótidas de rata con 1 mg de cristales de taxol en 500 mg de gel pluronic dio una mionecrosis macroscópica de la musculatura adyacente. Aunque el número de animales que sobrevivió en este grupo fue demasiado bajo para valorar la significación estadística en la reducción de formación de neoíntima, el área de la neoíntima fue un 38% menor que para los animales control.
Para animales tratados con 0,1 y 0,01 mg de taxol, se observó una reducción en su área de neoíntima y relación neoíntima/media cuando se compararon con animales control, aunque esta no alcanzó significación estadística dado el pequeño número de animales por grupo. Por otro lado, los animales en los grupos de dosis menores mostraron toxicidad nula (0,01 mg), mínima (0,1 mg) o limitada (1,0 mg), indicando que las dosis menores pueden ser eficaces y presentar menores efectos secundarios adversos que las dosis mayores que 1,0 mg.

Claims (34)

1. El uso de una forma de dosificación que comprende un inhibidor citoesquelético, en el que el inhibidor citoesquelético está en una forma sustancialmente cristalina y en el que los cristales tienen un tamaño que da como resultado una liberación sostenida del inhibidor citoesquelético, para la preparación de un medicamento para inhibir o reducir la disminución en el área de la luz del vaso de un vaso sanguíneo de mamífero traumatizado por un procedimiento quirúrgico, administrándose dicha forma de dosificación en el vaso sanguíneo de mamífero.
2. El uso según la reivindicación 1, en el que el inhibidor citoesquelético comprende taxol o uno de sus análogos o citocalasina o uno de sus análogos.
3. El uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el inhibidor citoesquelético comprende de aproximadamente 5 a 40 por ciento en peso de la forma de dosificación.
4. El uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el inhibidor citoesquelético comprende de aproximadamente 3 a 50 por ciento en peso de la forma de dosificación.
5. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el inhibidor citoesquelético se administra a través de un dispositivo implantable.
6. El uso según la reivindicación 5, en el que el inhibidor citoesquelético está inmerso en, revestido sobre, o inmerso en y revestido sobre, el dispositivo implantable de forma liberable.
7. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la forma cristalina se dispersa en un vehículo líquido y se administra a través de un catéter.
8. Una forma de dosificación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para usar como medicamento.
9. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la administración se realiza antes o durante el traumatismo vascular debido a un procedimiento quirúrgico.
10. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la administración se realiza después del traumatismo vascular debido a un procedimiento quirúrgico.
11. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el vaso sufre traumatismo por angioplastia, colocación de una endoprótesis vascular ("stent"), colocación de una derivación o injerto natural, o cualquiera de sus combinaciones.
12. El uso de una forma de dosificación que comprende una citocalasina o uno de sus análogos en forma sólida en una matriz no líquida para la preparación de un medicamento para inhibir o reducir la disminución en el área de la luz del vaso de un vaso sanguíneo de mamífero, administrándose dicha forma de dosificación en el vaso sanguíneo de mamífero y siendo la matriz no líquida un gel, pasta o membrana.
13. El uso según la reivindicación 12, en el que la citocalasina o uno de sus análogos constituye de 5 a 70 por ciento en peso de la forma de dosificación.
14. El uso según la reivindicación 12, en el que la forma de dosificación comprende un análogo de citocalasina.
15. El uso según la reivindicación 12, en el que la forma de dosificación comprende cristales o microcristales de citocalasina o uno de sus análogos.
16. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la citocalasina o uno de sus análogos se administra a través de un dispositivo implantable.
17. El uso según la reivindicación 16, en el que la citocalasina o uno de sus análogos está inmerso en, revestido sobre, o inmerso en y revestido sobre, el dispositivo implantable, la matriz o ambos.
18. El uso según la reivindicación 6 ó 17, en el que el dispositivo implantable es una envuelta adventicia, un injerto artificial, una endoprótesis vascular o una derivación.
19. Un kit que comprende un dispositivo implantable adaptado para la liberación de al menos un inhibidor citoesquelético en un sitio en la luz de un vaso de mamífero traumatizado y una forma de dosificación unitaria que comprende una forma de dosificación como la definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.
20. El kit según la reivindicación 19, en el que el dispositivo es un catéter.
\newpage
21. Una composición farmacéutica adecuada para la liberación a través de un dispositivo implantable, que comprende:
(a)
una cantidad de una citocalasina o uno de sus análogos en forma sólida, eficaz para inhibir o reducir la estenosis o reestenosis de un vaso sanguíneo de mamífero traumatizado por un procedimiento quirúrgico; y
(b)
una matriz de liberación no líquida farmacéuticamente aceptable para dicha citocalasina, siendo la matriz de liberación no líquida un gel, pasta o membrana;
siendo el dispositivo una derivación o una envuelta adventicia.
22. La composición según la reivindicación 21, en la que la forma sólida es cristalina.
23. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad de una citocalasina, o uno de sus análogos, sólida sustancialmente pura, eficaz para inhibir o reducir la estenosis o reestenosis de un vaso sanguíneo de mamífero traumatizado por un procedimiento quirúrgico, estando dicha citocalasina o uno de sus análogos en una forma cristalina.
24. La composición farmacéutica según la reivindicación 21 ó 23, en la que la citocalasina o uno de sus análogos constituyen de 5 a 70 por ciento en peso de la composición farmacéutica.
25. Una derivación terapéutica que comprende una cantidad de un inhibidor citoesquelético en forma sólida eficaz para inhibir o reducir la estenosis o reestenosis después de la colocación de la derivación terapéutica.
26. Una envuelta adventicia terapéutica que comprende una cantidad de un inhibidor citoesquelético en forma sólida eficaz para inhibir o reducir la estenosis o reestenosis después de la colocación de la envuelta terapéutica.
27. La derivación o envuelta adventicia terapéutica según la reivindicación 25 ó 26, en la que el inhibidor citoesquelético comprende una citocalasina o uno de sus análogos o taxol o uno de sus análogos.
28. La derivación o envuelta adventicia terapéutica según la reivindicación 25 ó 26, en la que la forma sólida es cristalina.
29. La derivación o envuelta adventicia terapéutica según la reivindicación 25 ó 26, en la que el inhibidor citoesquelético comprende de aproximadamente 5 a 70 por ciento en peso de la forma de dosificación.
30. Un dispositivo terapéutico que comprende una endoprótesis vascular que cubierta con un injerto artificial, comprendiendo el injerto artificial de aproximadamente 5 a 70 por ciento en peso de un inhibidor citoesquelético en forma sólida.
31. La derivación o envuelta adventicia terapéutica según la reivindicación 29, en la que el inhibidor citoesquelético comprende de 10 a 30 por ciento en peso de la forma de dosificación.
32. La derivación o envuelta adventicia terapéutica según la reivindicación 29, en la que el inhibidor citoesquelético comprende de 30 a 50 por ciento en peso de la forma de dosificación.
33. El dispositivo terapéutico según la reivindicación 30, en el que el inhibidor citoesquelético comprende de 10 a 30 por ciento en peso.
34. El dispositivo terapéutico según la reivindicación 30, en el que el inhibidor citoesquelético comprende de 30 a 50 por ciento en peso.
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