ES2350491T3 - Antígenos y vacunas para el streptococcus pneumonia. - Google Patents
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Abstract
Un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en (a) polinucleótidos que codifican el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en la SEQ ID NO: 56; (b) polinucleótidos que tienen la secuencia codificadora mostrada en la SEQ ID NO: 55 que codifica el polipéptido; (c) polinucleótidos que son idénticos en al menos 95% a la secuencia codificadora mostrada en la SEQ ID NO: 55, (d) polinucleótidos que codifican un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos 95% a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 56, (e) polinucleótidos que codifican una porción portadora de epítopo de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: Arg-10 a Arg-17; Lys-29 a Ser-39; Ser-140 a Ala-153; Arg-158 a Tyr-169; Asp-175 a Ala-183; Gly-216 a Asn-236; Ala-261 a Leu-270; Arg-282 a Phe-291; y Thr-297 a Ala-305; Pro-342 a Gln-362; Phe-455 a Asp-463 ; His-497 a Thr-511; Ala-521 a Gly-529; Ile-537 a Val-546; Ile-556 a Ala-568; Pro-581 a Ser-595; Glu-670 a Ala-685; Ser-696 a Ala-705 y Leu-782 a Ser-791 de la secuencia de aminoácidos deducida como se representa en SEQ ID NO:56; y (f) polinucleótidos que codifican fragmentos que comprenden al menos 50 aminoácidos contiguos de un polipéptido codificado por un polinucleótido de uno cualquiera de los apartados (a) a (d) o la cadena complementaria de dicho polinucleótido.
Description
Antígenos y vacunas para el Streptococcus
pneumonia.
La presente invención se refiere a nuevos
antígenos de Streptococcus pneumoniae para la detección de
Streptococcus y para la prevención o atenuación de
enfermedades provocadas por Streptococcus. La invención
también se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que
codifican polipéptidos antigénicos de S. pneumoniae. También
se proporcionan polipéptidos antigénicos, tales como vectores,
células hospedantes y métodos recombinantes para la producción de
los mismos. Adicionalmente, la invención se refiere a métodos
diagnósticos para la detección de expresión génica de
Streptococcus.
El Streptococcus pneumoniae ha sido uno
de los microorganismos más ampliamente estudiados desde la primera
vez que fue aislado en 1881. Fue el objetivo de muchas
investigaciones que condujeron a importantes descubrimientos
científicos. En 1928, Griffith observó que cuando se inyectaban en
ratones neumococos encapsulados muertos por calor y
concomitantemente cepas vivas que constitutivamente carecían de
cualquier cápsula, los no encapsulados pudieron convertirse en
neumococos encapsulados con el mismo tipo capsular que la cepa
muerta por calor. Años después, se demostró que la naturaleza de
este "principio de transformación", o portador de información
genética, era ADN. (Avery, O.T., y col., J. Exp. Med., 79:
137-157 (1944)).
A pesar del vasto número de publicaciones sobre
S. pneumoniae, aún quedan sin resolver muchas cuestiones
acerca de su virulencia, y dicho patógeno sigue siendo un
importante agente causante de enfermedades humanas graves,
especialmente la neumonía contagiosa. (Johnston, R.B., y col.,
Rev. Infect. Dis. 13 (Supl. 6): S509-517
(1991)). Además, en los países en vías de desarrollo, el neumococo
es el responsable de la muerte de un gran número de niños de menos
de 5 años por neumonía neumocócica. La incidencia de la enfermedad
neumocócica es mayor en niños con menos de 2 años y en adultos con
más de 60 años de edad. Los neumococos son la segunda causa más
frecuente (después del Haemophilus influenzae tipo b) de
meningitis bacteriana y de otitis media en niños. Con la reciente
introducción de vacunas conjugadas para el H. influenzae tipo
b, la meningitis por neumococos probablemente sea cada vez más
predominante. El S. pneumoniae es el agente etiológico más
importante de la neumonía contagiosa en adultos y es la segunda
causa más común de meningitis bacteriana detrás de la Neisseria
meningitidis.
El antibiótico que se prescribe normalmente para
tratar el S. pneumoniae es la bencilpenicilina, aunque
ocasionalmente se produce resistencia a éste y a otros
antibióticos. La resistencia del neumococo a la penicilina es el
resultado de las mutaciones en sus proteínas de unión a la
penicilina. En la neumonía neumocócica no complicada provocada por
una cepa sensible, el tratamiento con penicilina habitualmente tiene
éxito salvo que se comience demasiado tarde. También se puede usar
eritromicina y clindamicina para tratar la neumonía en pacientes
hipersensibles a la penicilina, pero existen cepas resistentes a
estos fármacos. Los antibióticos de amplio espectro (por ejemplo,
las tetraciclinas) también pueden ser eficaces, aunque las cepas
resistentes a tetraciclina no son raras. A pesar de la
disponibilidad de antibióticos, la mortalidad de bacteremia
neumocócica en las últimas cuatro décadas se ha mantenido estable
entre el 25 y el 29%. (Gillespie, S.H., y col., J. Med.
Microbiol. 28: 237-248 (1989)).
El S. pneumoniae se encuentra en la parte
superior del tracto respiratorio de muchos individuos saludables.
Se ha sugerido que la unión de los neumococos está mediada por un
receptor disacárido sobre fibronectina, presente en las células
epiteliales faríngeas humanas. (Anderson, B.J., y col., J.
Immunol. 142: 2464-2468 (1989). Los mecanismos
mediante los cuales los neumococos se trasladan desde la nasofaringe
hasta los pulmones, provocando con ello la neumonía, o migran a la
sangre, dando lugar a bacteremia o a septicemia, son poco conocidos.
(Johnston, R.B., y col., Rev. Infect. Dis. 13 (Supl. 6):
S509-517 (1991).
Se ha sugerido que varias proteínas están
involucradas en la patogenia del S. pneumoniae, sin embargo
sólo se ha confirmado que unas pocas de ellas son factores de
virulencia. Los neumococos producen una proteasa IgA1 que podría
interferir con la defensa del hospedante en las superficies mucosas.
(Kornfield, S.J., y col., Rev. Inf. Dis. 3:
521-534 (1981)). El S. pneumoniae también
produce neuraminidasa, una enzima que puede facilitar la unión a
células epiteliales mediante la ruptura de ácido siálico procedente
de los glicolípidos y gangliósidos del hospedante. Se observó que
la neuraminidasa parcialmente purificada inducía síntomas similares
a la meningitis en ratones; sin embargo la fiabilidad de este
descubrimiento ha sido cuestionada debido a que las preparaciones
de neuraminidasa usadas probablemente estuvieran contaminadas con
productos de la pared celular. Aparte de la neuraminidasa, existen
otras proteínas neumocócicas implicadas en la adhesión de los
neumococos a células epiteliales y endoteliales. Estas proteínas
neumocócicas todavía no han sido identificadas. Recientemente,
Cundell y col. publicaron que las permeasas de péptido pueden
modular la adherencia neumocócica a células epiteliales y
endoteliales. Sin embargo, no queda claro si dichas permeasas actúan
directamente como adhesiones o si potencian la adherencia modulando
la expresión de adhesiones neumocócicas. (DeVelasco, E.A., y col.,
Micro. Rev. 59: 591-603 (1995)). Es necesario
desarrollar un mejor entendimiento de los factores de virulencia
que determinan su patogenia para acabar con los efectos devastadores
de la enfermedad neumocócica en seres humanos.
\newpage
Irónicamente, a pesar del importante papel del
S. pneumoniae en el descubrimiento del ADN, poco se sabe
sobre la genética molecular del organismo. El genoma del S.
pneumoniae consiste en un ADN de cadena doble, circular,
cerrado covalentemente, y una colección de los denominados elementos
accesorios variables, tales como profagos, plásmidos, transposones
y otros similares. La mayoría de las características físicas y casi
todos los genes del S. pneumoniae siguen siendo
desconocidos. Entre los pocos que han sido identificados, la mayoría
no han sido mapeados físicamente o no han sido caracterizados en
detalle. Únicamente se han secuenciado unos pocos genes de este
organismo. (Véase, por ejemplo, las versiones actuales del GENBANK y
de otras bases de datos de ácidos nucleicos, y las referencias que
se refieren al genoma del S. pneumoniae, tales como las
presentadas a lo largo de la presente memoria). La identificación
de antígenos expresados in vivo, y ampliamente protectores,
del S. pneumoniae sigue siendo elusiva.
WO 96/16082 describe variantes de proteínas que
se unen a penicilina (PBPs) y, en particular, la proteína PBP 1A de
S. pneumoniae que tiene suprimidos los aminoácidos
1-38.
WO 95/06732 describe la identificación de
proteínas exportadas por bacterias Gram positivas y sus genes
correspondientes. Concretamente, WO95/06732 describe varios genes
que codifican proteínas exportadas de S. pneumoniae y vacunas
que proporcionan protección contra la infección por bacterias Gram
positivas.
Martin, C., et al. (EMBO J.,
11(11): 3831-3836 (1992)) describe genes de
la proteína 1a que se une a penicilina procedentes de diferentes
clones de Streptococcus pneumoniae resistente a
penicilina.
WO 95/31548 describe genes del polisacárido
capsular de Streptococcus pneumoniae y sus regiones
flanqueantes y describe que estas regiones se pueden emplear para
detectar S. pneumoniae.
WO 95/14712 describe varias proteínas de
Streptococcus pneumoniae que se unen a hemina/hemoglobina y
los correspondientes ensayos diagnósticos, vacunas y composiciones
farmacéuticas.
WO 96/05895 se refiere a conjugados inmunógenos
polisacárido-proteína que tienen un polisacárido
oxidado que se obtiene a partir del polisacárido capsular de
Streptococcus pneumoniae y la proteína neumolisina de S.
pneumoniae que se expresa de forma recombinante. Los conjugados
inmunógenos se describen para uso como vacunas para inmunizar
contra una enfermedad causada por S. pneumoniae.
La presente invención proporciona moléculas de
ácido nucleico aisladas que comprenden polinucleótidos que
codifican los polipéptidos de S. pneumoniae descritos en la
Tabla 1, y que presentan la secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEQ ID NO: 56.
Por tanto, un aspecto de la invención
proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden
polinucleótidos que presentan una secuencia de nucleótidos
seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia de
nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos del
polipéptido mostrado en la Tabla 1; y (b) una secuencia de
nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos presentada
en (a).
En la presente memoria se describen además
moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden un
polinucleótido que presenta una secuencia de nucleótidos que es
idéntica al menos en 90%, y más preferiblemente en al menos 95%,
96%, 97%, 98% o 99%, a cualquiera de las secuencias de nucleótidos
de los anteriores apartados (a) ó (b), o un polinucleótido que se
hibrida en condiciones severas de hibridación con un polinucleótido
de los anteriores apartados (a) ó (b). Dicho polinucleótido que se
hibrida, no se hibrida en condiciones severas de hibridación con un
polinucleótido que presenta la secuencia de nucleótidos que consiste
únicamente en restos de A o únicamente en restos de T. Otras
realizaciones adicionales de ácido nucleico de la invención se
refieren a moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden
polinucleótidos que codifican las secuencias de aminoácido de las
porciones portadoras de epítopos de un polipéptido de S.
pneumoniae que presenta una secuencia de aminoácido del
apartado (a) anterior.
La presente invención también se refiere a
vectores recombinantes, que incluyen las moléculas de ácido nucleico
aisladas de la presente invención, y a células hospedantes que
contienen los vectores recombinantes, así como a métodos de
obtención de dichos vectores y células hospedantes, y para el uso de
dichos vectores en la producción de polipéptidos o péptidos de
S. pneumoniae mediante técnicas recombinantes.
La invención además proporciona polipéptidos de
S. pneumoniae aislados que presentan una secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de
aminoácidos del polipéptido descrito en la Tabla 1.
Los polipéptidos que se describen en esta
memoria también incluyen polipéptidos que presentan una secuencia
de aminoácidos con una similitud de al menos 70%, y más
preferiblemente de al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%
ó 99%, con respecto a los descritos en la Tabla 1, así como
polipéptidos que presentan una secuencia de aminoácidos que es
idéntica en al menos 70%, más preferiblemente idéntica en al menos
75%, y aún más preferiblemente idéntica en al menos 80%, 85%, 90%,
95%, 96%, 97%, 98% ó 99%, a los anteriores; así como moléculas de
ácido nucleico que codifican dichos polipéptidos.
La presente invención proporciona además una
vacuna, preferiblemente una vacuna multicomponente, que comprende
el polinucleótido o polipéptido de S. pneumoniae descrito en
la Tabla 1, o fragmentos del mismo, junto con un diluyente,
vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, en la que se
encuentra(n) presente(s) el(los)
polipéptido(s) de S. pneumoniae en una cantidad eficaz
para provocar una respuesta inmune a miembros del género
Streptococcus en un animal. Los polipéptidos de S.
pneumoniae de la presente invención pueden combinarse
adicionalmente con uno o más inmunógenos de uno o más organismos
adicionales estreptocócicos o no estreptocócicos para producir una
vacuna multicomponente destinada a provocar una respuesta
inmunológica frente a miembros del género Streptococcus y,
opcionalmente, frente a uno o más organismos no estreptocócicos.
Las vacunas de la presente invención se pueden
administrar en una forma de ADN, por ejemplo, ADN "desnudo",
en la que el ADN codifica uno o más polipéptidos estreptocócicos y,
opcionalmente, uno o más polipéptidos de un organismo no
estreptocócico. El ADN que codifica uno o más polipéptidos se puede
construir de tal forma que dichos polipéptidos sean proteínas de
fusión expresadas.
Las vacunas de la presente invención también se
pueden administrar como un componente de un organismo diseñado
genéticamente. De este modo, un organismo diseñado genéticamente que
expresa uno o más polipéptidos de S. pneumoniae puede
administrarse a un animal. Por ejemplo, dicho organismo diseñado
genéticamente puede contener uno o más polipéptidos de S.
pneumoniae de la presente invención intracelularmente, en su
superficie celular o en su espacio periplasmático. Además, dicho
organismo diseñado genéticamente puede segregar uno o más
polipéptidos de S. pneumoniae.
Las vacunas de la presente invención pueden
co-administrarse a un animal con un modulador del
sistema inmune (por ejemplo, CD86 y GM-CSF).
En el contexto de la invención, también se
describe una vacuna como se ha descrito más arriba para uso en la
inducción de una respuesta inmunológica en un animal frente a uno o
más miembros del género Streptococcus, preferiblemente
frente a uno o más elementos aislados del género S.
pneumoniae.
En el contexto de la invención, se describe
además una composición que comprende uno o más de los
polinucleótidos o polipéptidos descritos en la Tabla 1, o de
fragmentos de los mismos, para uso en la inducción de una respuesta
inmune protectora en un animal, suficiente para prevenir o atenuar
una infección causada por los miembros del género
Streptococcus, preferiblemente al menos por S.
pneumoniae. Además, dichos polipéptidos, o fragmentos de los
mismos, se pueden conjugar con otro inmunógeno y/o administrar
mezclados con un adyuvante.
La invención se refiere además a anticuerpos
activados en un animal mediante la administración de uno o más
polipéptidos de S. pneumoniae de la presente invención. En la
presente memoria también se describen métodos para la producción de
dichos anticuerpos.
La invención también proporciona métodos
diagnósticos para la detección de la expresión de genes de miembros
del género Streptococcus en un animal. Uno de dichos métodos
incluye el ensayo para determinar la expresión de un gen que
codifica péptidos de S. pneumoniae en una muestra procedente
de un animal. Dicha expresión se puede determinar directamente (por
ejemplo, determinando los niveles de polipéptido usando anticuerpos
activados como respuesta a las secuencias de aminoácidos descritas
en la Tabla 1) o indirectamente (por ejemplo, determinando los
anticuerpos que presentan especificidad por las secuencias de
aminoácidos descritas en la Tabla 1). Un ejemplo de dicho método
incluye el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para
amplificar y detectar secuencias de ácido nucleico de
Streptococcus.
En la presente memoria también se describen
sondas de ácido nucleico que presentan toda o parte de una secuencia
de nucleótidos descrita en la Tabla 1 (mostrada como SEQ ID NO:
55), que son capaces de hibridarse en condiciones severas con uno o
más ácidos nucleicos de Streptococcus. La invención se
refiere además a un método para detectar uno o más ácidos nucleicos
de Streptococcus en una muestra biológica obtenida a partir
de un animal, donde dichos uno o más ácidos nucleicos codifican
polipéptidos de Streptococcus, que comprende: (a) poner en
contacto la muestra con una o más de las sondas de ácido nucleico
descritas más arriba, en condiciones tales que se produzca la
hibridación, y (b) detectar la hibridación de dichas una o más
sondas con el ácido nucleico de Streptococcus presente en la
muestra biológica.
La invención también incluye inmunoensayos,
incluyendo un inmunoensayo para la detección de
Streptococcus, preferiblemente al menos de elementos
aislados del género de S. pneumoniae, que comprende la
incubación de una muestra (que se sospecha está infectada con
Streptococcus) con un anticuerpo sonda dirigido contra un
antígeno/epítopo de S. pneumoniae, para ser detectado en las
condiciones que permitan la formación de un complejo
antígeno-anticuerpo; y la detección del complejo
antígeno-anticuerpo que contiene el anticuerpo
sonda. Un inmunoensayo para la detección de anticuerpos que están
dirigidos contra un antígeno de Streptococcus que comprende
la incubación de una muestra (que contiene anticuerpos procedentes
de un mamífero que se sospecha está infectado con
Streptococcus) con un polipéptido sonda que incluye un
epítopo de S. pneumoniae, en condiciones que permiten la
formación de complejos antígeno-anticuerpo que
contienen el epítopo sonda que contiene el antígeno.
Algunos aspectos de la invención que están
relacionados con kits son los correspondientes a: la investigación
de muestras en busca de la presencia de polinucleótidos derivados de
Streptococcus que comprenden una sonda de polinucleótido que
incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada de la Tabla 1, o
un fragmento de la misma de aproximadamente 15 o más nucleótidos,
en un recipiente adecuado; analizar las muestras en busca de la
presencia de anticuerpos dirigidos contra un antígeno de
Streptococcus constituido por un polipéptido que contiene un
epítopo de S. pneumoniae presente en el polipéptido, en un
contenedor adecuado; y analizar muestras en busca de la presencia
de antígenos de Streptococcus constituidos por un anticuerpo
anti-S. pneumoniae, en un contenedor adecuado.
La presente invención se refiere a polipéptidos
de S. pneumoniae antigénicos recombinantes y a fragmentos de
los mismos. La invención también se refiere a métodos para el uso de
dichos polipéptidos para producir respuestas inmunológicas y para
conferir protección inmunológica frente a enfermedades causadas por
los miembros del género de los Streptococcus, al menos por
elementos aislados del género de S. pneumoniae. La invención
se refiere además a secuencias de ácido nucleico que codifican
polipéptidos de S. pneumoniae antigénicos y a los métodos
para la detección de ácidos nucleicos y polipéptidos de S.
pneumoniae en muestras biológicas. La invención también se
refiere a anticuerpos específicos de S. pneumoniae y a
métodos para la detección de dichos anticuerpos producidos en un
animal hospedante.
En concreto, la presente invención se refiere a
las siguientes realizaciones:
Un polinucleótido seleccionado del grupo que
consiste en:
(a) polinucleótidos que codifican el polipéptido
que tiene la secuencia de aminoácidos deducida presentada en la SEQ
ID NO: 56;
(b) polinucleótidos que tienen la secuencia
codificadora presentada en la SEQ ID NO: 55 que codifica el
polipéptido;
(c) polinucleótidos que son idénticos en al
menos 95% a la secuencia codificadora mostrada en la SEQ ID NO:
55;
(d) polinucleótidos que codifican un polipéptido
que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos
95% a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 56;
(e) polinucleótidos que codifican una porción
portadora de epítopo de un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
Arg-10 a Arg-17;
Lys-29 a Ser-39;
Ser-140 a Ala-153;
Arg-158 a Tyr-169;
Asp-175 a Ala-183;
Gly-216 a Asn-236;
Ala-261 a Leu-270;
Arg-282 a Phe-291; y
Thr-297 a Ala-305;
Pro-342 a Gln-362;
Phe-455 a Asp-463;
His-497 a Thr-511;
Ala-521 a Gly-529;
Ile-537 a Val-546;
Ile-556 a Ala-568;
Pro-581 a Ser-595;
Glu-670 a Ala-685;
Ser-696 a Ala-705 y
Leu-782 a Ser-791 de la secuencia de
aminoácidos deducida como se indica en SEQ ID NO: 56; y
(f) polinucleótidos que codifican fragmentos que
comprenden al menos 50 aminoácidos contiguos de un polipéptido
codificado por un polinucleótido de un apartado cualquiera de (a) a
(d),
o la cadena complementaria de dicho
polinucleótido.
\vskip1.000000\baselineskip
El polinucleótido de la presente invención puede
ser ADN o ARN.
La presente invención se refiere además a un
método de fabricación de un vector recombinante que comprende
insertar un polinucleótido de la presente invención en un
vector.
Adicionalmente, la presente invención
proporciona un vector recombinante que contiene el polinucleótido de
la presente invención o el producido por el método descrito más
arriba.
En particular, en el vector de la invención, el
polinucleótido está ligado operativamente a una secuencia de
control de expresión, permitiendo la expresión en células
hospedantes procarióticas o eucarióticas.
La presente invención además se refiere a un
método para la fabricación de una célula hospedante recombinante,
que comprende introducir el vector de la invención en una célula
hospedante.
También se proporciona una célula hospedante
transformada con el vector de la invención o producida por el
método descrito más arriba.
Además, la invención proporciona un proceso para
la producción de un polipéptido codificado por el polinucleótido de
la invención que comprende: cultivar la célula hospedante de la
invención y recuperar el polipéptido codificado por dicho
polinucleótido procedente del cultivo.
Además, la presente invención se refiere un
polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos codificada por
un polinucleótido de la presente invención u obtenible mediante el
proceso descrito más arriba.
La presente invención también proporciona un
antígeno de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos
de una porción portadora de epítopo como se ha descrito más arriba
en (e), seleccionada del grupo que consiste en:
Arg-10 a Arg-17;
Lys-29 a Ser-39;
Ser-140 a Ala-153;
Arg-158 a Tyr-169;
Asp-175 a Ala-183;
Gly-216 a Asn-236;
Ala-261 a Leu-270;
Arg-282 a Phe-291; y
Thr-297 a Ala-305;
Pro-342 a Gln-362;
Phe-455 a Asp-463;
His-497 a Thr-511;
Ala-521 a Gly-529;
Ile-537 a Val-546;
Ile-556 a Ala-568;
Pro-581 a Ser-595;
Glu-670 a Ala-685;
Ser-696 a Ala-705 y
Leu-782 a Ser-791 de la secuencia de
aminoácidos deducida como se indica en SEQ ID NO: 56.
En una realización específica, una proteína
codificada por un polinucleótido de la presente invención carece de
la metionina N-terminal.
La presente invención también proporciona una
proteína de fusión que comprende el polipéptido de la invención y
una secuencia de polipéptido heteróloga, para un anticuerpo que se
une específicamente al polipéptido de la invención, y para un
hibridoma que produce el anticuerpo.
Además se proporciona una composición
farmacéutica que comprende el polinucleótido de la invención, el
polipéptido de la invención o un ADN codificante y capaz de
expresar dicho polipéptido in vivo o el anticuerpo de la
presente invención, y opcionalmente un vehículo, diluyente o
excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención se refiere además a una
composición diagnóstica que comprende el polinucleótido o el
anticuerpo de la presente invención.
La presente invención también proporciona el uso
del polinucleótido, del polipéptido o del anticuerpo de la
invención para la preparación de una composición farmacéutica para
la prevención o la atenuación de una infección provocada por un
miembro del género Streptococcus.
También se proporciona aquí una composición
farmacéutica que comprende el polinucleótido, el polipéptido o el
anticuerpo de la invención para prevenir o atenuar una infección
causada por un miembro del género Streptococcus.
Además, la presente invención proporciona un
proceso diagnóstico que comprende analizar la presencia del
polipéptido de la invención en una muestra obtenida a partir de un
hospedante.
En una realización específica, la composición
farmacéutica de la invención es una vacuna.
Por ejemplo, la vacuna de la invención
comprende:
(a) un polipéptido de S. pneumoniae de la
presente invención o un fragmento del mismo; y
(b) un vehículo, diluyente o excipiente
farmacéuticamente aceptable; en el que dicho polipéptido está
presente en una cantidad eficaz para activar anticuerpos
protectores en un animal frente a un miembro del género
Streptococcus.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, la presente invención proporciona un
método para la detección de ácidos nucleicos de Streptococcus
en una muestra biológica obtenida a partir de un animal, que
comprende:
(a) poner en contacto la muestra con una o más
sondas de ácido nucleico que comprenden el polinucleótido de la
invención en condiciones en las que se produce la hibridación; y
(b) detectar la hibridación de dichas una o más
sondas con una o más secuencias de ácido nucleico de
Streptococcus presentes en la muestra biológica.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona un
método para la detección de ácidos nucleicos de Streptococcus
en una muestra biológica obtenida a partir de un animal, que
comprende:
(a) amplificar una o más secuencias de ácido
nucleico de Streptococcus en dicha muestra usando el
polinucleótido de la invención y reacción en cadena de polimerasa;
y
(b) detectar dicho ácido nucleico amplificado de
Streptococcus.
\vskip1.000000\baselineskip
También se proporciona un kit para la detección
de anticuerpos de Streptococcus en una muestra biológica
obtenida a partir de un animal, que comprende:
(a) un polipéptido de la invención unido a un
soporte sólido; y
(b) un medio de detección.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.930000\baselineskip
La invención también se refiere a un método de
detección de anticuerpos contra Streptococcus en una muestra
biológica obtenida a partir de un animal, que comprende:
(a) poner en contacto la muestra con un
polipéptido de la invención, y
(b) detectar complejos
anticuerpo-antígeno.
Las siguientes definiciones se proporcionan para
aclarar la materia objeto que los inventores consideran que es la
presente invención.
Tal como se usa en la presente memoria, la frase
"agente patogéno" significa un agente que provoca un estado de
enfermedad o afección en un animal. Dentro de esta definición se
incluyen, por ejemplo, bacterias, protozoos, hongos, virus y
parásitos metazoicos, que producen un estado de enfermedad o hacen
que un animal infectado con dichos organismos sea susceptible a un
estado de enfermedad (por ejemplo, una infección secundaria). Además
se incluyen especies y cepas del género Streptococcus que
producen estados de enfermedad en animales.
Tal como se usa en la presente memoria, el
término "organismo" significa cualquier sistema biológico vivo,
incluyendo virus, independientemente de si es un agente patógeno o
no.
Tal como se usa en la presente memoria, el
término "Streptococcus" significa cualquier especie o
cepa de bacterias que es un miembro del género
Streptococcus. Dichas especies y cepas son conocidas por los
especialistas en la técnica, e incluyen los que son patógenos y los
que no.
Tal como se usa en la presente memoria, la frase
"polipéptidos de S. pneumoniae de la presente invención"
significa un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos
del polipéptido de S. pneumoniae descrita en la Tabla 1 y
presentada como SEQ ID NO: 56. Dicho polipéptido se puede expresar
como proteínas de fusión en las que el polipéptido de S.
pneumoniae de la presente invención está ligado a secuencias
adicionales de aminoácidos que pueden ser de origen estreptocócico
o no estreptocócico. Esta expresión también incluye fragmentos que
comprenden polipéptidos de los polipéptidos de S. pneumoniae
de la presente invención.
A lo largo de la memoria se proporcionan
definiciones adicionales.
Explicación de la Tabla
1
La Tabla 1, presentada más adelante, proporciona
información que describe marcos de lectura abiertos (ORFs) que
potencialmente codifican polipéptidos antigénicos de S.
pneumoniae de la presente invención. La Tabla muestra el
identificador de ORF, que consiste en las letras SP, que denotan
S. pneumoniae, seguidas inmediatamente por un código
numérico de tres dígitos, que numera de forma arbitraria el
polipéptido potencialmente antigénico de S. pneumoniae de la
presente invención y la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos
del ORF y del polipéptido codificado. La table también correlaciona
el identificador del ORF con un número de identificación de la
secuencia (SEQ ID No:). La secuencia real de nucleótidos o de
aminoácidos para cada identificador de ORF también se muestra en el
Listado de Secuencias con el correspondiente SEQ ID NO.
De este modo, por ejemplo, la designación
"SP036" se refiere tanto a secuencias de nucleótidos como a
secuencias de aminoácidos del polipéptido de S. pneumoniae
número 036 de la presente invención. Además, el "SP036" se
corresponde con la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID NO:
55 y con la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 56
tal como se presenta en la Tabla 1.
El marco de lectura abierto dentro del
"ORF" comienza con el segundo nucleótido mostrado. Por tanto,
el primer codón correspondiente a cada secuencia de nucleótidos
mostrada son las bases 2-4, el segundo las
5-7, el tercero las 8-10, y así
sucesivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Explicación de la Tabla
2
La Tabla 2 enumera los epítopos antigénicos
presentes en el polipéptido de S. pneumoniae descrito en la
Tabla 1 según la predicción de los inventores. El polipéptido de
S. pneumoniae mostrado en la Tabla 1 presenta uno o más
epítopos antigénicos descritos en la Tabla 2. Cabe destacar que
dependiendo de los criterios analíticos usados para predecir
determinantes antigénicos, la dirección exacta del determinante
puede variar ligeramente. La localización exacta del determinante
antigénico puede desplazarse en aproximadamente de 1 a 5 restos, con
mayor probabilidad de 1 a 2 restos, dependiendo de los criterios
usados.
También cabe señalar, hablando de forma general,
que se pueden añadir aminoácidos en el extremo de un péptido o
polipéptido que contiene un epítopo antigénico sin afectar a su
actividad, mientras que es mucho más probable que la deleción de
restos de un péptido o polipéptido que contenga únicamente un
determinante antigénico destruya su actividad. Cabe destacar que
los restos y localizaciones presentados y descritos en la Tabla 2 se
corresponden con las secuencias de aminoácidos correspondientes al
ORF mostrado en la Tabla 1 y en el Listado de Secuencias.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Explicación de la Tabla
3
La Tabla 3 muestra cebadores de la PCR
designados por los inventores para la amplificación de
polinucleótidos que codifican polipéptidos de la presente invención
de acuerdo con el método del Ejemplo 1. El diseño de cebadores PCR
es rutinario en la técnica, y los mostrados en la Tabla 3 se
proporcionan meramente para mayor comodidad del especialista. Cabe
destacar que se pueden usar otros cebadores con el mismo
resultado.
Para cada cebador, la tabla enumera la
correspondiente designación ORF a partir de la Tabla 1 seguida de
una "A" o de una "B". Los cebadores "A" son los
cebadores 5' y los cebadores "B" son los 3'. Se construyó un
sitio para enzima de restricción en cada cebador con objeto de
facilitar la clonación. La enzima de restricción que reconocerá y
escindirá una secuencia dentro de cada cebador se muestra asimismo
en la Tabla 3, bajo la nomenclatura "RE" de enzima de
restricción en inglés ("restriction enzyme"). Finalmente, en la
Tabla 3 se muestra el identificador de secuencia para cada cebador
para facilitar la correlación con el Listado de Secuencias.
La presente invención proporciona un número
selecto de ORFs de entre los presentados en los fragmentos del
genoma de S. pneumoniae que pueden resultar útiles para la
generación de una respuesta inmune protectora. El ADN genómico de
S. pneumoniae secuenciado se obtuvo a partir de elementos
aislados sub-cultivados de la Cepa de S.
pneumoniae 7/87 14.8.91, que ha sido depositada en la American
Type Culture Collection, para comodidad de los especialistas en la
técnica. El elemento aislado de S. pneumoniae se depositó el
10 de Octubre de 1996 en la ATCC, 12301 Park Lawn Drive, Rockville,
Maryland 20852, y se le dio el número de acceso 55840. También se
depositó una biblioteca genómica construida a partir de ADN aislado
a partir de elementos aislados de S. pneumoniae en la ATCC
el 11 de Octubre de 1996, y se le asignó el Nº de Depósito ATCC
97755. Un listado más completo de la secuencia obtenida a partir de
genoma de S. pneumoniae puede encontrarse en la Solicitud
Provisional de EE.UU. con Nº de Serie 60/029.960, presentada el
31-10-96, incorporada al completo a
la presente memoria a modo de referencia. Algunos ORFs contenidos
en el subconjunto de fragmentos del genoma de S. pneumoniae
descrito en la presente memoria fueron derivados a través del uso de
una serie de criterios de monitorización detallados más
adelante.
Los ORFs seleccionados no consistieron en ORFs
completos, Aunque un polipéptido que representa un ORF completo
puede constituir la mejor aproximación a una proteína nativa de un
organismo, no siempre se prefiere expresar un ORF completo en un
sistema heterólogo. Un reto sería expresar y purificar una proteína
altamente hidrofóbica mediante métodos comunes de laboratorio. Así,
los candidatos a vacunas de polipéptidos descritos en la presente
memoria pueden haber sido modificados ligeramente para simplificar
la producción de la proteína recombinante. Por ejemplo, las
secuencias de nucleótidos que codifican dominios altamente
hidrofóbicos, tales como los encontrados en la secuencia de señal
aminoterminal, han sido excluidas de algunas construcciones usadas
para la expresión in vitro de los polipéptidos. Además,
cualquier secuencia de aminoácidos altamente hidrofóbica que se
encuentre en el extremo carboxi también ha sido excluida de las
construcciones de expresión recombinante. Por tanto, en una
realización, se puede usar como antígeno un polipéptido que
representa un ORF truncado o modificado.
Aunque en la técnica se conocen numerosos
métodos para la selección de polipéptidos potencialmente
inmunogénicos, muchos de los ORFs descritos en la presente memoria
fueron seleccionados en base a un escrutinio de todos los ORFs
teóricos de S. pneumoniae en función de varios aspectos de
inmunogenicidad potencial. A continuación se presenta un conjunto
de criterios de selección:
1. Secuencia de señal de Tipo I: Una
secuencia de señal aminoterminal de tipo I normalmente dirige una
proteína naciente a través del plasma y fuera de las membranas
hasta el exterior de la célula bacteriana. La evidencia
experimental obtenida a partir de estudios con la Escherichia
coli sugiere que la secuencia de señal de tipo I típica
consiste en los siguientes atributos bioquímicos y físicos (Izard,
J.W. y Kendall, D.A., Mol. Microbiol. 13:
765-773 (1994)). La longitud de la secuencia de
señal de tipo I es de aproximadamente 15 a 25 restos de aminoácidos
principalmente hidrofóbicos con una carga neta positiva en el
extremo amino. Adicionalmente, la región central de la secuencia de
señal adopta un conformación alfa-helicoidal en un
entorno hidrofóbico. Finalmente, la región que rodea la posición
real de ruptura idealmente tiene una longitud de seis restos, con
pequeñas cadenas laterales de aminoácidos en las posiciones -1 y
-3.
2. Secuencia señal de Tipo IV: La
secuencia señal de tipo IV es un ejemplo de varios tipos de
secuencias de señal funcionales que existen además de la secuencia
de señal de tipo I detallada antes. Aunque funcionalmente están
relacionadas, la secuencia de señal de tipo IV posee una combinación
única de atributos bioquímicos y físicos (Strom, M. S. y Lory, S.,
J. Bacteriol. 174: 7345-7351 (1992)).
Normalmente son de seis a ocho aminoácidos con una carga neta
básica seguidos de otros dieciséis a treinta restos principalmente
hidrofóbicos adicionales. La posición de ruptura de una secuencia
de señal de tipo IV se encuentra normalmente después de los primeros
seis a ocho aminoácidos en el extremo amino. Adicionalmente, las
secuencias de señal de tipo IV generalmente contienen un resto de
fenilalanina en la posición +1 relativa a la posición de
ruptura.
3. Lipoproteína: Los estudios de las
posiciones de ruptura de veintiséis precursores de lipoproteína
bacteriana han permitido definir una secuencia de aminoácidos de
consenso para la ruptura de lipoproteína. Aproximadamente tres
cuartos de los precursores de lipoproteína bacteriana
pre-examinados contenían la secuencia
L-(A,S)-(G,A)-C en las posiciones -3 a +1,
relativas al punto de ruptura (Hayashi, S. y Wu, H.C., J.
Bioenerg. Biomembr. 22: 451-471 (1990)).
4. Estructura LPXTG: Se ha determinado
experimentalmente que la mayoría de las proteínas ancladas
encontradas sobre la superficie de bacterias gram positivas posee
una secuencia carboxiterminal altamente conservada. Más de
cincuenta de dichas proteínas procedentes de organismos tales como
S. pyogenes, S. mutans, E. faecalis, S.
pneumoniae, y otros, han sido identificadas en base a su
localización extracelular y a su secuencia de aminoácidos
carboxiterminal (Fischetti, V. A., ASM News 62:
405-410 (1996)). La región conservada consiste en
seis aminoácidos cargados en el término carboxi acoplados a
15-20 aminoácidos hidrofóbicos que se supone
funcionan como un dominio transmembrana. Inmediatamente adyacentes
al dominio transmembrana se encuentra una secuencia de seis
aminoácidos conservados en casi todas las proteínas examinadas. La
secuencia de aminoácidos de esta región es
L-P-X-T-G-X,
en la que X es cualquier aminoácido.
Se desarrolló un algoritmo para seleccionar
polipéptidos de S. pneumoniae antigénicos e inmunogénicos que
incluye los anteriores criterios. El uso del algoritmo por los
inventores para seleccionar polipéptidos de S. pneumoniae
inmunológicamente útiles dio como resultado la selección de una
serie de los ORFs descritos. Los polipéptidos que comprenden los
polipéptidos identificados en este grupo pueden producirse mediante
técnicas estándar en la técnica, descritas en la presente
memoria.
La presente invención proporciona moléculas
aisladas de ácido nucleico que comprenden polinucleótidos que
codifican los polipéptidos de S. pneumoniae que presentan las
secuencias de aminoácidos descritas en la Tabla 1 y que se muestran
como SEQ ID NO: 56, que se determinan mediante la secuenciación del
genoma de S. pneumoniae y se seleccionan como presuntos
inmunógenos.
A no ser que indique lo contrario, todas las
secuencias de nucleótidos determinadas mediante la secuenciación de
una molécula de ADN en la presente memoria fueron determinadas
usando un secuenciador de ADN automático (tal como el Modelo 373 de
Applied Biosystems, Inc.), y todas las secuencias de aminoácidos de
polipéptidos codificados por las moléculas de ADN determinadas en
la presente memoria fueron predichas mediante traducción de las
secuencias de ADN determinadas como se ha indicado antes. Por lo
tanto, tal como se conoce en la técnica para cualquier secuencia de
ADN determinada mediante esta estrategia automatizada, cualquier
secuencia de nucleótidos determinada en la presente memoria puede
contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos
determinadas automáticamente normalmente son idénticas en al menos
90%, más habitualmente en al menos aproximadamente entre 95% y
aproximadamente 99,9%, a la secuencia de nucleótidos real de la
molécula de ADN secuenciada. La secuencia real puede determinarse
con mayor precisión empleando otras estrategias, incluyendo los
métodos de secuenciamiento de ADN manual, bien conocidos en la
técnica. Asimismo, como es sabido en la técnica, una única
inserción o deleción en una secuencia de nucleótidos determinada en
comparación con la secuencia real provocará un desplazamiento de
marco en la traducción de la secuencia de nucleótidos, de tal modo
que la secuencia de aminoácidos predicha codificada por una
secuencia de nucleótidos determinada será completamente diferente a
la secuencia de aminoácidos codificada realmente por la molécula de
ADN secuenciada, comenzando en el punto en el que se haya realizado
dicha inserción o deleción.
A no ser que se indique lo contrario, cada
"secuencia de nucleótidos" establecida en la presente memoria
se presenta como una secuencia de desoxirribonucleótidos (en forma
abreviada: A, G, C y T). Sin embargo, por "secuencia de
nucleótidos" de una molécula de ácido nucleico o polinucleótido
se entiende, para una molécula o polinucleótido de ADN, una
secuencia de desoxirribonucleótidos, y para una molécula o
polinucleótido de ARN, la correspondiente secuencia de
ribonucleótidos (A, G, C y U), en la que cada desoxirribonucleótido
de timidina (T) en una secuencia de desoxirribonucleótidos
especificada es sustituido por un ribonucleótido de uridina (U).
Por ejemplo, en referencia a una molécula de ARN que presenta una
secuencia descrita en la Tabla 1 establecida usando abreviaturas de
desoxirribonucleótidos, se pretende indicar una molécula de ARN que
presenta una secuencia en la que cada desoxirribonucleótido A, G ó
C descrito en la Tabla 1 ha sido sustituido por el correspondiente
ribonucleótido A, G ó C, y cada desoxirribonucleótido T ha sido
sustituido por un ribonucleótido U.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente
invención pueden encontrarse en la forma de ARN, tal como mARN, o
en la forma de ADN, incluyendo, por ejemplo, cADN y ADN genómico
obtenido por clonación o producido sintéticamente. El ADN puede ser
de doble cadena o de cadena sencilla. El ADN ó ARN de cadena
sencilla puede ser la cadena codificadora, también conocida como
cadena sentido, o puede ser la cadena no codificadora, también
denominada cadena antisentido.
Por molécula(s) de ácido nucleico
"aislada(s)" se entiende una molécula de ácido nucleico,
ADN ó ARN, que ha sido separada de su entorno nativo. Por ejemplo,
las moléculas de ADN recombinante contenidas en un vector se
consideran aisladas para los propósitos de la presente invención.
Otros ejemplos de moléculas de ADN aisladas incluyen moléculas de
ADN recombinante mantenidas en células hospedantes heterólogas o
moléculas de ADN purificadas (parcial o sustancialmente) en
disolución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen tránscritos in
vivo o in vitro de las moléculas de ADN de la presente
invención. Las moléculas de ácido nucleico aisladas de acuerdo con
la presente invención incluyen además dichas moléculas producidas
sintéticamente.
Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la
presente invención incluyen moléculas de ADN que comprenden una
secuencia de nucleótidos descrita en la Tabla 1 y mostrada como SEQ
ID NO: 55;
las moléculas de ADN que comprenden las
secuencias codificadoras correspondientes a los polipéptidos
descritos en la Tabla 1 y mostradas como SEQ ID NO: 56;
y moléculas de ADN que comprenden secuencias
sustancialmente diferentes de las descritas más arriba pero que,
debido a la degeneración del código genético, todavía codifican los
polipéptidos de S. pneumoniae descritos en la Tabla 1. Por
supuesto, el código genético es bien conocido en la técnica. Por
tanto, sería rutinario para el especialista en la técnica generar
dichas variantes degeneradas.
La invención también proporciona moléculas de
ácido nucleico que tienen secuencias complementarias a cualquiera
de las descritas en la Tabla 1. Dichas moléculas aisladas,
particularmente moléculas de ADN, son útiles como sondas para la
detección de la expresión de genes de Streptococcus, por
ejemplo, empleando análisis por transferencia Northern o la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
También se describen en esta memoria fragmentos
de las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas en la
presente memoria. Por un fragmento de una molécula de ácido nucleico
aislada que tiene una secuencia de nucleótidos descrita en la Tabla
1, se entienden fragmentos de al menos aproximadamente 15 nt, y más
preferiblemente de al menos aproximadamente 17 nt, aún más
preferiblemente de al menos aproximadamente 20 nt, e incluso más
preferiblemente, de al menos aproximadamente 25 nt de longitud, que
son útiles como sondas diagnósticas y como cebadores, tal como se
discute en la presente memoria. Por supuesto, los fragmentos más
grandes, de 50-100 nt de longitud, también son
útiles de acuerdo con la presente invención, ya que son fragmentos
correspondientes a la mayoría, si no al total, de una secuencia de
nucleótidos descrita en la Tabla 1. Por un fragmento de al menos 20
nt de longitud, por ejemplo, se entiende un fragmento que incluye
20 o más bases contiguas de una secuencia de nucleótidos como la
descrita en la Tabla 1. Puesto que la secuencia de nucleótidos
identificada en la Tabla 1 se proporciona como SEQ ID NO: 55,
generar dichos fragmentos de ADN sería una tarea rutinaria para un
especialista en la técnica. Por ejemplo, dichos fragmentos podrían
ser generados de forma sintética.
Los fragmentos de ácido nucleico preferidos
también incluyen moléculas de ácido nucleico que comprenden
secuencias de nucleótidos que codifican porciones que portan
epítopos del polipéptido de S. pneumoniae identificado en la
Tabla 1. Dichos fragmentos de ácido nucleico de la presente
invención incluyen, por ejemplo, secuencias de nucleótidos que
codifican fragmentos de polipéptido que comprenden desde
aproximadamente el resto aminoterminal hasta aproximadamente el
resto carboxiterminal de cada fragmento mostrado en la Tabla 2. Los
más arriba referidos fragmentos de polipéptido son regiones
antigénicas del polipéptido de S. pneumoniae identificado en
la Tabla 1.
En otro aspecto, en la presente memoria también
se describen moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden
polinucleótidos que se hibridan en condiciones de hibridación
severas con una porción de un polinucleótido de una molécula de
ácido nucleico de la invención descrita más arriba, por ejemplo, una
secuencia de ácido nucleico identificada en la Tabla 1. Por
"condiciones de hibridación severas" se entiende una incubación
durante toda la noche a 42ºC en una disolución que comprende: 50%
de formamida, 5x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM),
fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5x disolución de Denhardt, 10% de
sulfato de dextrano y 20 g/mL de ADN de esperma de salmón
desnaturalizado, seguido de un lavado de los filtros con 0,1x SSC a
aproximadamente 65ºC.
Por polinucleótidos que se hibridan a una
"porción" de un polinucleótido se entiende polinucleótidos (ADN
ó ARN) que se hibridan con al menos aproximadamente 15 nucleótidos
(nt), y más preferiblemente con al menos aproximadamente 17 nt, aún
más preferiblemente con al menos aproximadamente 20 nt, e incluso
más preferiblemente con aproximadamente 25-70 nt
del polinucleótido de referencia. Éstos son útiles como sondas
diagnósticas y como cebadores, tal como se ha discutido más arriba
y como se discute más detalladamente a continuación.
Por supuesto, los polinucleótidos que se
hibridan con una porción mayor del polinucleótido de referencia,
por ejemplo, con una porción de 50-100 nt de
longitud, o incluso con la longitud completa del polinucleótido de
referencia, también son útiles como sondas de acuerdo con la
presente invención, como lo son los polinucleótidos
correspondientes a la mayoría, si no al total, de una secuencia de
nucleótidos como la identificada en la Tabla 1. Por una porción de
un polinucleótido de "al menos 20 nt de longitud", por ejemplo,
se entiende 20 o más nucleótidos contiguos procedentes de la
secuencia de nucleótidos del polinucleótido de referencia (por
ejemplo, las secuencias de nucleótidos descritas en la Tabla 1).
Como se ha indicado más arriba, dichas porciones son útiles para el
diagnóstico, como sondas de acuerdo con técnicas de hibridación de
ADN convencionales, y como cebadores para la amplificación de una
secuencia objetivo mediante PCR, tal como se describe en la
bibliografía (por ejemplo, en Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, 2ª edición, Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis,
T., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
N.Y. (1989), cuya descripción completa se incorpora a la presente
memoria a modo de referencia).
Puesto que la secuencia de ácido nucleico que
codifica el polipéptido de S. pneumoniae de la presente
invención está identificada en la Tabla 1 y se proporciona como SEQ
ID NO: 55, la generación de polinucleótidos que se hibriden con
porciones de dichas secuencias será una tarea rutinaria para el
especialista en la técnica. Por ejemplo, los polinucleótidos de
hibridación de la presente invención podrían ser generados
sintéticamente empleando técnicas conocidas.
Como se ha indicado, las moléculas de ácido
nucleico de la presente invención que codifican polipéptidos de
S. pneumoniae de la presente invención pueden incluir, aunque
sin que suponga una limitación, aquellas que codifican secuencias
de aminoácidos de los polipéptidos por sí mismos; y secuencias
codificadoras adicionales que codifican aminoácidos adicionales,
tales como los que proporcionan funcionalidades adicionales. De este
modo, las secuencias que codifican dichos polipéptidos pueden
fusionarse con una secuencia marcadora, tal como una secuencia que
codifica un péptido que facilita la purificación del polipéptido
fusionado. En determinadas realizaciones preferidas de este aspecto
de la invención, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido
de hexa-histidina, tal como la etiqueta
proporcionada en un vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otros, muchos
de los cuales se encuentran disponibles comercialmente. Por ejemplo,
según lo descrito por Gentz y colegas (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86: 821-824 (1989)), la
hexa-histidina proporciona una purificación
conveniente de la proteína de fusión resultante.
Por tanto, la presente invención también incluye
fusiones genéticas en las que la secuencia de ácido nucleico de
S. pneumoniae, que codifica secuencias identificadas en la
Tabla 1, está unida a secuencias adicionales de ácido nucleico para
producir proteínas de fusión. Dichas proteínas de fusión pueden
incluir epítopos de origen estreptocócico o no estreptocócico
diseñados para producir proteínas que presenten una inmunogenicidad
potenciada. Además, las proteínas de fusión de la presente invención
pueden contener determinantes antigénicos que proporcionen la
estimulación de células T colaboradoras, péptidos que codifiquen
posiciones para las modificaciones
post-translacionales que potencian la
inmunogenicidad (por ejemplo, acilación), péptidos que faciliten la
purificación (por ejemplo, "etiqueta" de histidina), o
secuencias de aminoácidos que dirijan la proteína de fusión hacia
una localización deseada (por ejemplo, una secuencia líder
heteróloga).
En todos los casos de expresión bacteriana, se
añade un resto de metionina N-terminal. Sin embargo,
en muchos casos, los restos de metionina N-terminal
son suprimidos post-translacionalmente. Por tanto,
la invención incluye polipéptidos presentados en la Tabla 1 con y
sin una metionina N-terminal.
De este modo la invención incluye moléculas y
secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas de fusión que
comprenden uno o más polipéptidos de S. pneumoniae de la
presente invención fusionados con una secuencia de aminoácidos que
permite la modificación post-translacional para
potenciar la inmunogenicidad. Esta modificación
post-translacional puede producirse in vitro
o cuando la proteína de fusión está expresada in vivo en una
célula hospedante. Un ejemplo de dicha modificación es la
introducción de una secuencia de aminoácidos que da como resultado
la unión de un resto de lípido.
Por tanto, como se ha indicado más arriba, la
presente invención incluye fusiones genéticas en las que una
secuencia de ácido nucleico de S. pneumoniae identificada en
la Tabla 1 se une a una secuencia de nucleótidos que codifica otra
secuencia de aminoácidos. Estas otras secuencias de aminoácidos
pueden ser de origen estreptocócico (por ejemplo, otra secuencia
seleccionada de la Tabla 1) o de origen no estreptocócico.
En la presente memoria también se describen
variantes de las moléculas de ácido nucleico de la presente
invención, que codifican porciones, análogos o derivados de los
polipéptidos de S. pneumoniae descritos en la Tabla 1. Las
variantes pueden existir de forma natural, tales como una variante
alélica natural. Por "variante alélica" se entiende una de
varias formas alternativas de un gen que ocupa una posición dada en
un cromosoma de un organismo (Genes II, Lewin, B., ed., John
Wiley & Sons, Nueva York (1985)). Las variantes que no existen
de forma natural se pueden producir usando técnicas de mutagénesis
conocidas.
Dichas variantes incluyen las producidas
mediante sustituciones, deleciones o adiciones de nucleótidos. Las
sustituciones, deleciones o adiciones pueden incluir uno o más
nucleótidos. Dichas variantes pueden alterarse en regiones
codificadoras, en regiones no codificadoras, o en ambas. Las
alteraciones en las regiones codificadoras pueden producir
sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos conservadoras o
no conservadoras. Entre ellas se prefieren especialmente las
sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran
las propiedades y las actividades de los polipéptidos de S.
pneumoniae descritos en la presente memoria, o de porciones de
los mismos. Las sustituciones silenciosas tienen más probabilidad de
producirse en regiones no epitópicas. En la presente memoria se
proporciona una guía acerca de las regiones que contienen epítopos,
por ejemplo, en la Tabla 2. También son especialmente preferidas en
este contexto las sustituciones conservadoras.
Otras realizaciones de la invención incluyen
moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden un
polinucleótido que presenta una secuencia de nucleótidos que es
idéntica en al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a: (a) la secuencia
de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos del
polipéptido identificado en la Tabla 1; y (b) una secuencia de
nucleótidos complementaria a las secuencias de nucleótidos del
apartado (a) anterior.
Por un polinucleótido que tiene una secuencia de
nucleótidos que es "idéntica" en al menos 95% a una secuencia
de nucleótidos de referencia que codifica un polipéptido de S.
pneumoniae descrito en la Tabla 1, se entiende que la secuencia
de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de
referencia excepto que la secuencia de polinucleótido puede incluir
hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la
secuencia de nucleótidos de referencia que codifica el polipéptido
de S. pneumoniae en cuestión. En otras palabras, para
obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos
idéntica en al menos 95% a una secuencia de nucleótidos de
referencia, hasta un 5% de los nucleótidos de la secuencia de
referencia pueden ser suprimidos o sustituidos por otro nucleótido,
o un número de nucleótidos de hasta un 5% del total de nucleótidos
de la secuencia de referencia pueden ser insertados en la secuencia
de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia
pueden producirse en las posiciones terminales 5' y 3' de la
secuencia de nucleótidos de referencia, o en cualquier lugar entre
dichas posiciones terminales, dispersadas individualmente entre los
nucleótidos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos
contiguos dentro de la secuencia de referencia.
Determinados nucleótidos dentro de algunas de
las secuencias de ácido nucleico mostradas en la Tabla 1 resultaron
ambiguos en la secuenciación. Las secuencias completamente
desconocidas se muestran como una "N". Se sabe que otros
nucleótidos no resueltos son una purina, mostrados como "R", o
una pirimidina, mostrados como "Y". Del mismo modo, cuando se
determina la identidad entre dos secuencias de nucleótidos, se
acepta la identidad cuando se encuentra cualquier nucleótido,
incluyendo un "R", "Y" ó "N", en una secuencia de
ensayo y en la correspondiente posición de la secuencia de
referencia (de la Tabla 1). Igualmente, una A, G ó "R" en una
secuencia de ensayo es idéntica a una "R" de la secuencia de
referencia; y una T, C ó "Y" en una secuencia de ensayo es
idéntica a una "Y" en la secuencia de referencia.
A modo práctico, el hecho de que una molécula
cualquiera de ácido nucleico en concreto sea idéntica en al menos
90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% a, por ejemplo, una secuencia de
nucleótidos descrita en la Tabla 1 puede determinarse
convencionalmente usando programas de ordenador conocidos como el
programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8
para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575
Science Drive, Madison, WI 53711). El Bestfit usa el algoritmo de
homología local de Smith y Waterman (Advances in Applied
Mathematics 2: 482-489 (1981)), para encontrar
el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa
el Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias
para determinar si una secuencia concreta es, por ejemplo, idéntica
en 95% a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente
invención, los parámetros se fijan, por supuesto, de tal modo que
el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de
la secuencia de nucleótidos de referencia, y se permite hasta un 5%
de huecos en la homología sobre el número total de nucleótidos de
la secuencia de referencia.
La presente solicitud está dirigida a moléculas
de ácido nucleico que son idénticas al menos en 95%, 96%, 97%, 98%
o 99% a las secuencias de ácido nucleico descritas en la Tabla 1. El
especialista en la técnica sabría como usar la molécula de ácido
nucleico, por ejemplo, como sonda de hibridación o como cebador de
reacción en cadena de polimerasa (PCR). Los usos de las moléculas
de ácido nucleico de la presente invención incluyen, entre otros,
(1) aislar genes estreptocócicos o variantes alélicas de los mismos
a partir de una biblioteca de cADN o genómica, y (2) análisis
Northern blot o PCR para la detección de expresión de mARN
estreptocócico.
Por supuesto, debido a la degeneración del
código genético, el especialista en la técnica reconocerá
inmediatamente que un elevado número de moléculas de ácido nucleico
que presentan una secuencia con una identidad de al menos 95%, 96%,
97%, 98% o 99% con una secuencia de ácido nucleico identificada en
la Tabla 1 codificará el mismo polipéptido. De hecho, puesto que
las variantes degeneradas de dichas secuencias de nucleótidos
codifican todas el mismo polipéptido, esto será evidente para un
especialista incluso sin realizar el ensayo de comparación descrito
más arriba.
También se reconocerá en la técnica que, para
las moléculas de ácido nucleico que no son variantes degeneradas,
un número razonable también codificarán proteínas que presentan
epítopos antigénicos de los polipéptidos de S. pneumoniae de
la presente invención. Esto se debe a que el especialista es
plenamente consciente de las sustituciones de aminoácidos que son
menos probables o que no son probables para afectar de forma
significativa a la antigenicidad de un polipéptido (por ejemplo, la
sustitución de un aminoácido en una región que no se cree que forme
un epítopo antigénico). Por ejemplo, puesto que se han identificado
epítopos antigénicos que contienen tan sólo seis aminoácidos (véase
Harlow, y col., Antibodies: A Laboratory Manual, 2ª Edición;
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York
(1988), página 76), en los casos en los que un polipéptido tiene
múltiples epítopos antigénicos no sería de esperar que una
alteración de varios restos de aminoácido eliminara todos los
epítopos antigénicos de dicho polipéptido. Esto se produce
especialmente cuando las alteraciones son en regiones que se cree
no constituyen epítopos antigénicos.
La presente invención también se refiere a
vectores que incluyen las moléculas aisladas de ADN de la presente
invención, a células hospedantes que son modificadas genéticamente
con los vectores recombinantes, y a la producción de polipéptidos
de S. pneumoniae o de fragmentos de los mismos mediante
técnicas recombinantes.
Las construcciones recombinantes pueden
introducirse en células hospedantes usando técnicas bien conocidas
tales como infección, transducción, transfección, transvección,
electroporación y transformación. El vector puede ser, por ejemplo,
un vector de fago, de plásmido, viral o retroviral. Los vectores
retrovirales pueden ser de replicación competente o de replicación
defectuosa. En el último caso, la propagación vírica normalmente se
produce únicamente en células hospedantes complementarias.
Los polinucleótidos se pueden unir a un vector
que contiene un marcador seleccionable para la propagación en un
hospedante. Generalmente, se introduce un vector de plásmido en un
precipitado, tal como un precipitado de fosfato de calcio, o en un
complejo con un lípido cargado. Si el vector es un virus, se puede
empaquetar in vitro usando una línea celular de
empaquetamiento apropiada y a continuación es transducido en células
hospedantes.
Se prefieren los vectores que comprenden
regiones de control que actúan como cis con respecto al
polinucleótido de interés. Los factores de actuación trans
apropiados pueden ser suministrados por el hospedante, suministrados
por un vector complementario, o suministrados por el mismo vector
al ser introducido en el hospedante.
En determinadas realizaciones preferidas a este
respecto los vectores proporcionan una expresión específica, que
puede ser inducible y/o específica del tipo de célula. En particular
se prefieren los vectores que son inducibles por factores
medioambientales que sean fáciles de manipular, tales como la
temperatura y los aditivos nutrientes.
Los vectores de expresión útiles en la presente
invención incluyen vectores derivados de cromosomas, episomas y
virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos,
bacteriófagos, episomas de levadura, elementos cromosómicos de
levadura, virus tales como los baculovirus, los papovavirus,
vacciniavirus, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de
seudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de
los mismos, tales como cósmidos y fagómidos.
El inserto de ADN debería ser ligado
operativamente a un promotor apropiado, tal como el promotor de fago
lambda PL, los promotores lac, trp y tac de E. coli, los
promotores temprano y tardío de SV40 y los promotores de LTRs
retrovirales, por nombrar unos pocos. El especialista en la técnica
conocerá otros promotores adecuados. Las construcciones de
expresión contendrán además posiciones para el inicio de la
transcripción, para la terminación y, en la región trascrita, una
posición de unión de ribosoma para la traducción. La porción
codificadora de los tránscritos maduros expresados por los
constructos incluirá preferiblemente una posición de inicio de la
traducción al principio y un codón de terminación (UAA, UGA ó UAG)
ubicado apropiadamente en el extremo del polipéptido que va a ser
traducido.
Tal como se ha indicado, los vectores de
expresión incluirán preferiblemente al menos un marcador
seleccionable. Dichos marcadores incluyen genes de resistencia a
neomicina o a dihidrofolato reductasa para el cultivo celular
eucariótico, y genes de resistencia a tetraciclina o a ampicilina
para el cultivo en E. coli y otras bacterias. Los ejemplos
representativos de hospedantes apropiados incluyen, aunque no están
limitados a ellos, células bacterianas, tales como células de E.
coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium;
células fúngicas, tales como células de levadura; células de
insecto tales como células de Drosophila S2 y de
Spodoptera Sf9; células de animales tales como células CHO,
COS y de melanoma de Bowes; y células vegetales. Los medios de
cultivo y las condiciones apropiadas para las anteriores células
hospedantes son bien conocidos en la técnica.
Entre los vectores preferidos para su uso en
bacterias se incluyen el pQE70, el pQE60 y el pQE-9,
disponibles en Qiagen; los vectores de pBS, los vectores de
Phasgescript, los vectores de Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A,
pNH46A disponibles en Stratagene; la serie de vectores pET
disponible en Novagen; y ptrc99a, pKK223-3,
pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles en Pharmacia.
Entre los vectores eucarióticos preferidos se encuentran pWLNEO,
pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG disponibles en Stratagene; y pSVK3,
pBPV, pMSG y pSVL disponibles en Pharmacia. El especialista en la
técnica podrá deducir fácilmente otros vectores adecuados.
Entre los promotores bacterianos conocidos
adecuados para su uso en la presente invención se incluyen los
promotores lacl y lacZ de E. coli, los
promotores T3 y T7, el promotor gpt, los promotores lambda PR y PL
y el promotor trp. Los promotores eucarióticos adecuados incluyen el
promotor temprano inmediato de CMV, el promotor de timidina quinasa
de HSV, los promotores temprano y tardío de SV40, los promotores de
LTRs retrovirales, tales como los del virus de sarcoma de Rous
(RSV), y los promotores de metalotioneína, tales como el promotor
de metalotioneína-I de ratón.
La introducción de la construcción dentro de la
célula hospedante se puede llevar a cabo mediante transfección de
fosfato cálcico, mediante transfección mediada por
DEAE-dextrano, mediante transfección mediada por
lípido catiónico, mediante electroporación, transducción, infección
u otros métodos. Dichos métodos se describen en multitud de
manuales de laboratorio estándares (por ejemplo, Davis, y col.,
Basic Methods In Molecular Biology (1986)).
La transcripción de ADN que codifica los
polipéptidos de la presente invención mediante eucariontes
superiores puede incrementarse insertando una secuencia
potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN
que actúan como cis, normalmente aproximadamente de 10 a 30 pb que
actúan para aumentar la actividad transcripcional de un promotor en
un tipo de célula hospedante dado. Los ejemplos de potenciadores
incluyen el potenciador SV40, que está localizado en el extremo
final del origen de replicación en los pb del 100 al 270, el
potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador
de polioma del extremo final del origen de replicación, y
potenciadores de adenovirus.
Para la secreción del polipéptido traducido en
el lúmen del retículo endoplasmático, en el espacio periplasmático
o en el entorno extracelular, se pueden incorporar señales de
secreción apropiadas en el polipéptido expresado. Las señales
pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales
heterólogas.
El polipéptido se puede expresar en una forma
modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no
sólo señales de secreción, sino también regiones funcionales
heterólogas adicionales. Por ejemplo, se puede añadir una región
adicional de aminoácidos, en concreto de aminoácidos cargados, al
extremo N del polipéptido para mejorar la estabilidad y la
persistencia en la célula hospedante, durante la purificación, o
durante el posterior manejo y almacenamiento. Asimismo, se pueden
añadir restos funcionales de péptido al polipéptido para facilitar
la purificación. Dichas regiones pueden eliminarse antes de la
preparación final del polipéptido. La adición de restos funcionales
de péptido a los polipéptidos para engendrar secreción o excreción,
para mejorar la estabilidad y para facilitar la purificación, entre
otras cosas, se realiza mediante técnicas rutinarias conocidas. Una
proteína de fusión preferida comprende una región heteróloga de
inmunoglobulina que es útil para solubilizar proteínas. Por
ejemplo, el documento EP-A-O 464 533
(contrapartida canadiense 2045869) describe proteínas de fusión que
comprenden varias porciones de región constante de moléculas de
inmunoglobulina junto con otra proteína humana o parte de la misma.
En muchos casos, la parte Fc de una proteína de fusión es muy
ventajosa para su uso en terapia y diagnosis y, por tanto, da como
resultado propiedades farmacocinéticas mejoradas
(EP-A 0232 262). Por otro lado, para determinados
usos sería deseable ser capaz de eliminar la parte Fc después de
que la proteína de fusión haya sido expresada, detectada y
purificada siguiendo el modo ventajoso descrito. Este es el caso
cuando la porción Fc demuestra ser un impedimento para el uso en
terapia y en diagnosis, por ejemplo cuando la proteína de fusión se
va a usar como antígeno para inmunizaciones. En el descubrimiento
de fármacos, por ejemplo, las proteínas humanas, tales como el
receptor hIL-5, han sido fusionadas con porciones
Fc con el propósito de realizar ensayos de escrutinio de alta
capacidad para identificar antagonistas de hIL-5.
Véase Bennett, D. y col., J. Molec. Recogn. 8:
52-58 (1995) y Johanson, K. y col., J. Biol.
Chem. 270 (16): 9459-9471 (1995).
Los polipéptidos de S. pneumoniae se
pueden recuperar y purificar a partir de cultivos celulares
recombinantes empleando métodos bien conocidos que incluyen la
precipitación en etanol o en sulfato amónico, la extracción con
ácidos, la cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, la
cromatografía con fosfocelulosa, la cromatografía de interacción
hidrofóbica, la cromatografía de afinidad, la cromatografía con
hidroxilapatita, la cromatografía de lectina, y para la
purificación se emplea cromatografía de líquidos de alta resolución
("HPLC"). Los polipéptidos de la presente invención incluyen
productos purificados de forma natural, productos de procedimientos
sintéticos químicos y productos obtenidos mediante técnicas
recombinantes a partir de un hospedante procarionte o eucarionte,
incluyendo, por ejemplo, células bacterianas, de levaduras, de
plantas superiores, de insecto y de mamífero.
La invención además proporciona polipéptidos
aislados que presentan las secuencias de aminoácidos descritas en
la Tabla 1, y mostradas como SEQ ID NO: 56, y péptidos y
polipéptidos que comprenden porciones de los anteriores
polipéptidos. Los términos "péptido" y "oligopéptido" se
consideran sinónimos (situación comúnmente reconocida) y cada
término puede ser usado de forma indiferente cuando el contexto
requiera indicar una cadena de al menos dos aminoácidos acoplados
por enlaces peptídicos. La palabra "polipéptido" se usa en la
presente memoria para cadenas que contienen más de diez restos de
aminoácido. Todas las fórmulas o secuencias de oligopéptidos y
polipéptidos usados en la presente memoria están escritas de
izquierda a derecha y en la dirección desde el extremo amino hasta
el extremo carboxi.
La secuencia de aminoácidos del polipéptido de
S. pneumoniae descrita en la Tabla 1 puede variar sin que se
produzca un efecto significativo sobre la antigenicidad del
polipéptido. Si se contemplan tales diferencias en la secuencia,
debería recordarse que existen áreas críticas en el polipéptido que
determinan la antigenicidad. En general, es posible sustituir
restos que no formen parte de un epítopo antigénico sin afectar de
forma significativa a la antigenicidad de un polipéptido. En la
Tabla 2 se proporciona una guía para dichas alteraciones ya que se
remarcan los epítopos de cada polipéptido.
Los polipéptidos de la presente invención se
proporcionan preferiblemente en forma aislada. Por "polipéptido
aislado" se entiende un polipéptido extraído de su entorno
nativo. Por tanto, un polipéptido producido y/o contenido dentro de
una célula hospedante recombinante se considera aislado para los
propósitos de la presente invención. También se entiende por
"polipéptido aislado" un polipéptido que ha sido purificado,
parcial o sustancialmente, a partir de una célula hospedante
recombinante. Por ejemplo, las versiones producidas
recombinantemente de los polipéptidos de S. pneumoniae
descritas en la Tabla 1 se pueden purificar sustancialmente
empleando un método de una sola etapa descrito por Smith y Jonson
(Gene 67: 31-40 (1988)).
Los polipéptidos de la presente invención
incluyen: (a) una secuencia de aminoácidos del polipéptido descrito
en la Tabla 1; y (b) una secuencia de aminoácidos de una porción
portadora de epítopo de los polipéptidos del apartado (a); así como
polipéptidos con al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de similitud con
los descritos en (a) o en (b), así como polipéptidos que tengan una
secuencia de aminoácidos que sea idéntica en al menos 95%, 96%,
97%, 98% o 99% a los anteriores.
Por "% de similitud" entre dos polipéptidos
se entiende una puntuación de similitud obtenida al comparar las
secuencias de aminoácidos de los dos polipéptidos usando el programa
Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix,
Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science
Drive, Madison, WI 53711) y los parámetros por defecto para
determinar la similitud. El Bestfit usa el algoritmo de homología
local de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics 2:
482-489 (1981)) para encontrar el mejor segmento de
similitud entre dos secuencias.
Cuando se dice que un polipéptido tiene una
secuencia de aminoácidos "idéntica" en al menos 95% a una
secuencia de aminoácidos de referencia de un polipéptido de S.
pneumoniae se entiende que la secuencia de aminoácidos del
polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia excepto en que
la secuencia del polipéptido puede incluir hasta cinco alteraciones
de aminoácido por cada 100 aminoácidos de la secuencia de
aminoácidos referencia. En otras palabras, para obtener un
polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos que sea idéntica
en al menos 95% a una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta
un 5% de los restos de aminoácido de la secuencia referencia pueden
ser suprimidos o sustituidos por otro aminoácido, o que se puede
insertar en la secuencia de referencia un número de aminoácidos de
hasta el 5% del total de restos de aminoácido de la secuencia de
referencia. Estas alteraciones en la secuencia de referencia pueden
producirse en las posiciones amino o
carboxi-terminales de la secuencia de aminoácidos
de referencia, o en cualquier posición entre dichas posiciones
terminales, dispersas individualmente entre los restos de la
secuencia de referencia o en uno o más grupos dentro de la
secuencia de referencia.
La secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla
1 puede tener uno o más restos "X". "X" representa resto
desconocido. Por tanto, para los propósitos de la definición de la
identidad, si cualquier aminoácido está presente en la misma
posición en una secuencia de aminoácidos de referencia (mostrada en
la Tabla 1), en la que aparece X, las dos secuencias son idénticas
en dicha posición.
A modo práctico, el hecho de que cualquier
polipéptido concreto sea idéntico en al menos 95%, por ejemplo 70%,
75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a la secuencia de
aminoácidos mostrada en la Tabla 1 puede determinarse
convencionalmente usando programas de ordenador conocidos tales como
el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8
para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575
Science Drive, Madison, WI 53711). Cuando se usa el Bestfit o
cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para
determinar si una secuencia en concreto es idéntica, por ejemplo, en
95% a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente
invención, se fijan los parámetros, por supuesto, de tal modo que el
porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud total de la
secuencia de aminoácidos de referencia y que se permitan huecos en
la homología de hasta un 5% del número total de restos de aminoácido
de la secuencia de referencia.
Tal como se describe más adelante, los
polipéptidos de la presente invención también se pueden usar para
activar anticuerpos policlonales y monoclonales, que son útiles en
los ensayos dirigidos a la detección de expresión proteica
estreptocócica.
En otro aspecto, la invención proporciona
péptidos y polipéptidos que comprenden porciones portadoras de
epítopos de los polipéptidos de S. pneumoniae de la
invención. Dichos epítopos son epítopos inmunogénicos o antigénicos
de los polipéptidos de la invención. Un "epítopo inmunogénico"
se define como una parte de una proteína que activa una respuesta
de anticuerpos cuando la proteína completa o el polipéptido completo
son el inmunógeno. Se cree que dichos epítopos inmunogénicos están
confinados en unas pocas posiciones de la molécula. Por otro lado,
se define una región de una molécula de proteína a la que se puede
unir un anticuerpo como un "determinante antigénico" o
"epítopo antigénico". El número de epítopos antigénicos en una
proteína generalmente es inferior al número de epítopos antigénicos
(Geysen, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:
3998-4002 (1983)). Los epítopos antigénicos
predichos se muestran en la Tabla 2, presentada más adelante.
En relación a la selección de péptidos o
polipéptidos que portan un epítopo antigénico (es decir, que
contienen una región de una molécula de proteína a la cual se puede
unir un anticuerpo), es bien sabido en la técnica que los péptidos
sintéticos relativamente cortos que emulan parte de una secuencia de
proteínas son capaces de provocar de forma rutinaria un antisuero
que reacciona con la proteína emulada parcialmente (por ejemplo,
Sutcliffe, J., y col., Science 219: 660-666
(1983)). Los péptidos capaces de provocar sueros reactivos con
proteínas se representan frecuentemente en la secuencia primaria de
una proteína, se pueden caracterizar por un conjunto de reglas
químicas sencillas, y no están confinados ni en regiones
inmunodominantes de proteínas intactas (es decir, epítopos
inmunogénicos) ni en los extremos amino o carboxi. Los péptidos que
son extremadamente hidrofóbicos y los de seis o menos restos
generalmente son ineficaces a la hora de inducir anticuerpos que se
unan con la proteína emulada; los péptidos de mayor longitud,
especialmente los que contienen restos de prolina, normalmente son
eficaces (Sutcliffe, y col., ver anterior, página 661). Por ejemplo,
18 de 20 péptidos diseñados de acuerdo con estas guías, que
contienen 8-39 restos que cubren 75% de la secuencia
de cadena del polipéptido de hemaglutinina HA1 del virus de la
gripe, indujeron anticuerpos que reaccionaron con la proteína HA1 o
con el virus intacto; y 12 de 12 péptidos procedentes de polimerasa
MuLV, y 18 de 18 procedentes de glicoproteína de la rabia,
indujeron anticuerpos que precipitaron las respectivas
proteínas.
Por lo tanto, los péptidos y polipéptidos
portadores de epítopos antigénicos de la invención son útiles para
activar anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, que se
unen específicamente a un polipéptido de la invención. De este
modo, una elevada proporción de hibridomas obtenidos mediante fusión
de células de bazo procedentes de donantes inmunizados con un
péptido portador de epítopo antígeno generalmente segregan
anticuerpos reactivos con la proteína nativa (Sutcliffe, y col.,
ver anterior, página 663). Los anticuerpos activados mediante
péptidos o polipéptidos portadores de epítopos son útiles para
detectar la proteína emulada, y se pueden usar anticuerpos de
diferentes péptidos para seguir la evolución de diversas regiones de
un precursor proteico que se ve sometido a un procesado
post-traducción. Los péptidos y los anticuerpos
antipéptido se pueden usar en una variedad de ensayos cualitativos
o cuantitativos para detectar la proteína emulada, por ejemplo,
ensayos de competición, ya que se ha demostrado que incluso los
péptidos cortos (por ejemplo, de aproximadamente 9 aminoácidos) se
pueden unir y desplazar los péptidos de mayor tamaño en los ensayos
de inmunoprecipitación (por ejemplo, Wilson, y col., Cell
37: 767-778 (1984), página 777). Los anticuerpos
antipéptido de la invención también son útiles para la purificación
de la proteína emulada, por ejemplo, mediante cromatografía de
adsorción usando métodos bien conocidos en la técnica.
Los péptidos y polipéptidos portadores de
epítopos antigénicos de la invención diseñados de acuerdo con las
anteriores guías preferiblemente contienen una secuencia de al menos
siete aminoácidos, más preferiblemente de al menos nueve y aún más
preferiblemente de entre unos 15 y unos 30, contenidos dentro de la
secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la invención. Sin
embargo, los péptidos o polipéptidos que comprenden una porción
mayor de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la
invención, que contiene aproximadamente de 30 a 50 aminoácidos, o
de cualquier longitud hasta la longitud completa de la secuencia de
aminoácidos de un polipéptido de la invención, también se
consideran péptidos o polipéptidos portadores de epítopos de la
invención y también son útiles para inducir anticuerpos que
reaccionen con la proteína emulada. Preferiblemente, la secuencia
de aminoácidos del péptido portador de epítopos se selecciona para
proporcionar una solubilidad sustancial en disolventes acuosos (es
decir, la secuencia incluye restos relativamente hidrofílicos, y
preferiblemente se evitan las secuencias altamente hidrofóbicas); y
se prefieren particularmente las secuencias que contienen restos de
prolina.
Los ejemplos no limitantes de polipéptidos o
péptidos antigénicos que se pueden usar para generar anticuerpos
específicos de Streptococcus incluyen porciones de la
secuencia de aminoácidos identificada en la Tabla 1. Más
específicamente, la Tabla 2 describe fragmentos específicos de
polipéptidos de la presente invención, fragmentos antigénicos que
comprenden secuencias de aminoácidos desde aproximadamente los
primeros restos de aminoácido indicados hasta aproximadamente el
último resto de aminoácido indicado para cada fragmento. Se cree
que los fragmentos de polipéptido descritos en la Tabla 2 son
regiones antigénicas del polipéptido de S. pneumoniae
descrito en la Tabla 1. Por tanto, la invención incluye además
péptidos y polipéptidos aislados que comprenden una secuencia de
aminoácidos de un epítopo mostrado en la Tabla 2 y polinucleótidos
que codifican dichos polipéptidos.
Los péptidos y polipéptidos que portan epítopos
de la invención se pueden producir mediante cualquier medio
convencional para la fabricación de péptidos o polipéptidos,
incluyendo medios recombinantes que usan moléculas de ácido
nucleico de la invención. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos
portadora de epítopo de la presente invención puede fusionarse a un
polipéptido de mayor tamaño que actúa como portador durante la
producción recombinante y la purificación, así como durante la
inmunización para producir anticuerpos antipéptido. Los péptidos
portadores de epítopos también se pueden sintetizar usando métodos
conocidos de síntesis química. Por ejemplo, Houghten ha descrito un
método sencillo para la síntesis de un gran número de péptidos,
tales como 10-20 mg de 248 péptidos diferentes de
13 restos, que representan variantes de aminoácido sencillas de un
segmento del polipéptido HA1 que fueron preparadas y caracterizadas
(mediante estudios de unión tipo ELISA) en menos de cuatro semanas
(Houghten, R. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:
5131-5135 (1985)). Este proceso de "Síntesis
Simultánea Múltiple de Péptidos (SMPS)" se describe con más
detalle en la Patente de EE.UU. Nº 4.631.211 a nombre de Houghten y
colaboradores (1986). En este procedimiento, las resinas
individuales correspondientes a la síntesis en fase sólida de
varios péptidos están contenidas en paquetes separados permeables a
disolvente, permitiendo un uso óptimo de las múltiples etapas
repetitivas idénticas implicadas en los métodos en fase sólida. Un
procedimiento completamente manual permite llevar a cabo de forma
simultánea 500-1000 ó más síntesis (Houghten, y
col., ver anterior, página 5134).
Los péptidos y polipéptidos portadores de
epítopos de la invención se usan para inducir anticuerpos de acuerdo
con métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Sutcliffe y
col., ver anterior; Wilson, y col., ver anterior; Chow, M., y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 910-914; y
Bittle, F. J., y col., J. Gen. Virol. 66:
2347-2354 (1985)). Generalmente, los animales se
pueden inmunizar con péptidos libres; sin embargo, el título de
anticuerpos anti-péptido puede mejorarse acoplando
el péptido a un vehículo macromolecular, tal como la hemacianina de
lapa de ojo de cerradura (KLH) o toxoide del tétanos. Por ejemplo,
se pueden acoplar péptidos que contienen cisteína a un vehículo
usando un ligando tal como el éster de
m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida
(MBS), mientras que otros péptidos pueden acoplarse a un vehículo
usando un agente ligante más general, tal como el glutaraldehído.
Animales tales como conejos, ratas y ratones se inmunizan tanto con
péptidos libres como con péptidos acoplados a un vehículo, por
ejemplo, mediante inyección intraperitoneal y/o intradermal de
emulsiones que contienen aproximadamente 100 \mug de péptido o de
proteína vehículo y de adyuvante de Freund. Pueden ser necesarias
varias inyecciones de activación, por ejemplo, a intervalos de
aproximadamente dos semanas, para proporcionar un título útil de
anticuerpos anti-péptido que pueda ser detectado,
por ejemplo, mediante un ensayo ELISA usando péptidos libres
adsorbidos sobre una superficie sólida. El título de anticuerpos
anti-péptido en suero de animal inmunizado puede
incrementarse mediante la selección de anticuerpos
anti-péptido, por ejemplo, mediante adsorción del
péptido sobre un soporte sólido y elución de los anticuerpos
seleccionados de acuerdo a métodos bien conocidos en la
técnica.
Los péptidos portadores de epítopos
inmunogénicos de la invención, es decir, aquellas partes de una
proteína que activan una respuesta de anticuerpos cuando la
proteína completa es el inmunógeno, se identifican de acuerdo a
métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Geysen, y col., ver
anterior, describe un procedimiento para la síntesis simultánea
rápida sobre soportes sólidos de cientos de péptidos de pureza
suficiente para reaccionar en un ensayo inmunosorbente ligado a una
enzima. De este modo, la interacción de los péptidos sintetizados
con anticuerpos se detecta con facilidad sin separarlos del soporte.
Así, un péptido que porta un epítopo inmunogénico de una proteína
deseada puede ser identificado de forma rutinaria por un
especialista de la técnica. Por ejemplo, el epítopo
inmunológicamente importante de la proteína de recubrimiento del
virus de la enfermedad aftosa fue localizado por Geysen y col., ver
anterior, con una resolución de siete aminoácidos mediante la
síntesis de un conjunto solapado de todos los 208 posibles
hexapéptidos que recubren la secuencia completa de 213 aminoácidos
de la proteína. A continuación, se sintetizó un conjunto completo de
sustitución de los péptidos, en el que todos los 20 aminoácidos
fueron sustituidos a su vez en cada posición dentro del epítopo, y
se determinaron los aminoácidos concretos que confieren
especificidad para la reacción con el anticuerpo. De este modo, se
pueden fabricar de forma rutinaria análogos peptídicos de los
péptidos que portan epítopos de la invención empleando este método.
La patente de EE.UU. Nº 4.708.781, a nombre de Geysen (1987),
describe con más detalle dicho método para la identificación de un
péptido que porta un epítopo inmunogénico de una proteína
deseada.
\newpage
Es más, la Patente de EE.UU. Nº 5.194.392, a
nombre de Geysen (1990), describe un método general para la
detección o la determinación de una secuencia de monómeros
(aminoácidos u otros compuestos) que es topológicamente equivalente
al epítopo (es decir, un "mimótopo") que es complementaria a un
parátopo concreto (posición de unión del antígeno) de un anticuerpo
de interés. De forma más general, la Patente de EE.UU. Nº 4.433.092,
también a nombre de Geysen (1989), describe un método para la
detección o la determinación de una secuencia de monómeros que es
un equivalente topográfico a un ligando que es complementario a la
posición de unión de ligando de un receptor particular de interés.
De forma similar, la Patente de EE.UU. Nº 5.480.971, a nombre de
Houghten, R. A., y col., (1996), describe oligopéptidos
prealquilados con
alquilo-C_{1}-C_{7} y conjuntos
y bibliotecas de dichos péptidos, así como métodos para usar dichos
conjuntos y bibliotecas de oligopéptidos para la determinación de
la secuencia de un oligopéptido prealquilado que se une
preferencialmente a una molécula aceptora de interés. Por tanto,
los análogos no peptídicos de los péptidos portadores de epítopos de
la invención también se pueden fabricar de forma rutinaria
empleando estos métodos.
Como apreciará el especialista en la técnica,
los polipéptidos de la presente invención y los fragmentos de los
mismos que sean portadores de epítopos descritos más arriba se
pueden combinar con partes del dominio constante de
inmunoglobulinas (IgG), dando como resultado polipéptidos
quiméricos. Estas proteínas de fusión facilitan la purificación y
muestran una vida media in vivo mejorada. Esto se ha
demostrado, por ejemplo, para las proteínas quiméricas que
consisten en los dos primeros dominios del polipéptido CD4 humano y
en diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas
pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de mamífero (EPA 0.394.827;
Traunecker y col., Nature 331: 84-86 (1988)).
Las proteínas de fusión que presentan una estructura dimérica
ligada por disulfuros, debido a la parte de IgG, también pueden ser
más eficaces en la unión y neutralización de otras moléculas que no
sean un polipéptido monomérico de S. pneumoniae, o un
fragmento del mismo (Fountoulakis y col., J. Biochem. 270:
3958-3964 (1995)).
La presente invención se refiere además a un
método para determinar la infección estreptocócica en un animal a
través de la detección de la expresión de genes que codifican
polipéptidos estreptocócicos (por ejemplo, los polipéptidos
descritos en la Tabla 1). Este método comprende analizar tejidos o
fluidos corporales del animal en busca de anticuerpos específicos
frente a Streptococcus o de ácidos nucleicos o proteínas
estreptocócicos. El análisis del ácido nucleico específico de
Streptococcus se puede realizar mediante PCR o mediante
técnicas de hibridación que usan secuencias de ácido nucleico de la
presente invención como sondas de hibridación o como cebadores
(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición,
editado por Sambrook, Fritsch y Maniatis, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1989; Eremeeva y col., J. Clin. Microbiol. 32:
803-810 (1994) que describe la diferenciación entre
especies de Rickettsiae de grupos de fiebre marcados mediante
el análisis del polimorfismo de la longitud del fragmento de
restricción de ADN amplificado mediante PCR). Los métodos para
detectar ácidos nucleicos de B. burgdorferi vía PCR se
describen, por ejemplo, en Chen y col., J. Clin. Microbiol.
32: 589-595 (1994).
En los casos en los que ya se ha realizado una
diagnosis de un estado de enfermedad relacionado con
Streptococcus, la presente invención es útil para
monitorizar la progresión o la regresión del estado de enfermedad,
ya que los pacientes que exhiban un aumento en la expresión génica
de Streptococcus experimentarán un resultado clínico peor en
comparación con los pacientes que expresen dicho(s)
gen(es) a un nivel inferior.
Con la expresión "determinar la infección
estreptocócica en un animal a través de la detección de genes que
codifican polipéptidos estreptocócicos" se pretende indicar la
medición, o la estimación, cualitativa o cuantitativa del nivel de
uno o más polipéptidos de Streptococcus o del nivel de ácido
nucleico que codifica polipéptidos de Streptococcus en una
primera muestra biológica directamente (por ejemplo, mediante la
determinación o estimación del nivel absoluto de proteína o de
ácido nucleico) o relativamente (por ejemplo, mediante la
comparación del nivel de polipéptido de Streptococcus o del
nivel de mARN en una segunda muestra biológica). El nivel de
polipéptido de Streptococcus o el nivel de ácido nucleico de
la segunda muestra usada para una comparación relativa puede ser
indetectable si se obtiene a partir de un animal que no está
infectado con Streptococcus. Cuando se monitoriza la
progresión o la regresión de un estado de enfermedad, el nivel de
polipéptido de Streptococcus o el nivel de ácido nucleico se
puede comparar con una segunda muestra obtenida a partir de un
animal infectado con Streptococcus o del mismo animal del
que se obtuvo la primera muestra, pero extrayéndola de dicho animal
a un tiempo distinto a cuando se extrajo la primera. Como se
apreciará en la técnica, una vez que se conoce un nivel estándar de
polipéptido de Streptococcus o de nivel de ácido nucleico que
se corresponde con una etapa concreta de una infección de
Streptococcus, se puede usar repetidamente como patrón para
la comparación.
Por "muestra biológica" se entiende
cualquier muestra biológica obtenida a partir de un animal, línea
celular, cultivo de tejido, u otra fuente que contenga polipéptido,
mARN ó ADN de Streptococcus. Las muestras biológicas
incluyen fluidos corporales (tales como plasma y fluido sinovial)
que contienen polipéptidos de Streptococcus, y tejidos
musculares, de piel y de cartílagos. Los métodos para obtener
biopsias de tejidos y fluidos corporales son bien conocidos en la
técnica.
La presente invención es útil para detectar
enfermedades relacionadas con infecciones de Streptococcus en
animales. Los animales preferidos incluyen monos, simios, gatos,
perros, vacas, cerdos, ratones, caballos, conejos y humanos.
El ARN total se puede aislar de una muestra
biológica usando cualquier técnica adecuada, tal como el método de
una etapa de
guanidinio-tiocianato-fenol-cloroformo
descrito en Chomczynski y Sacchi, Anal. Biochem. 162:
156-159 (1987). A continuación se evalúa el mARN que
codifica polipéptidos de Streptococcus que tienen una
homología suficiente con la secuencia de ácido nucleico identificada
en la Tabla 1, para permitir la hibridación entre las secuencias
complementarias, usando cualquier método apropiado. Esto incluye el
análisis Northern blot, el mapeado de nucleasa 1, la reacción en
cadena de polimerasa (PCR), la transcripción inversa en combinación
con la reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR), y
la transcripción inversa en combinación con la reacción en cadena
de ligasa (RT-LCR).
El análisis de Northern blot se puede realizar
como se describe en Harada y col., Cell 63:
303-312 (1990). Resumiendo, el ARN total se prepara
a partir de una muestra biológica tal como se ha descrito más
arriba. Para el Northern blot, el ARN se desnaturaliza en un tampón
apropiado (tal como tampón de glioxal/dimetilsulfóxido/fosfato
sódico), se somete a electroforesis en gel de agarosa, y se
transfiere a un filtro de nitrocelulosa. Después de que los ARNs
han sido ligados al filtro mediante un ligando UV, el filtro se
pre-hibrida en una disolución que contiene
formamida, SSC, disolución de Denhardt, esperma de salmón
desnaturalizado, SDS y tampón de fosfato sódico. Como sonda se usa
una secuencia de ADN de polipéptido de S. pneumoniae mostrada
en la Tabla 1, marcada de acuerdo con cualquier método apropiado
(tal como el sistema de marcado de ADN
multi-imprimado con ^{32}P (Amersham)). Tras
producirse la hibridación a lo largo de la noche, el filtro se lava
y se expone a película de rayos-X. El ADN para uso
como sonda de acuerdo con la presente invención se describe en las
anteriores secciones, y preferiblemente tendrá una longitud de al
menos 15 pb.
El mapeado de S1 se puede llevar a cabo como se
describe en Fujita y col., Cell 49: 357-367
(1987). Para preparar ADN sonda para su uso en el mapeado de S1, se
usa la cadena sentido de una secuencia de ADN de S.
pneumoniae descrita más arriba de la presente invención como
molde para sintetizar ADN antisentido marcado. A continuación, el
ADN antisentido puede ser digerido usando una endonucleasa de
restricción apropiada para generar más sondas de ADN con una
longitud deseada. Dichas sondas antisentido son útiles para
visualizar bandas protegidas correspondientes al mARN objetivo (es
decir, mARN que codifica polipéptidos de Streptococcus).
Preferiblemente, los niveles de mARN que
codifican polipéptidos de Streptococcus se determinan usando
el método RT-PCR descrito por Makino y col.,
Technique 2: 295-301 (1990). Empleando este
método, se relacionan linealmente las radiactividades de los
"amplicones" de las bandas de gel de poliacrilamida con la
concentración inicial del mARN objetivo. En resumen, este método
incluye la adición de ARN total aislado de una muestra biológica en
una mezcla de reacción que contiene un cebador RT y un tampón
apropiado. Tras realizar una incubación para reasociar el cebador,
la mezcla se puede complementar con un tampón RT, dNTPs, DTT,
inhibidor de ARNasa y transcriptasa inversa. Tras la incubación
para lograr la transcripción inversa del ARN, los productos RT son
sometidos a PCR usando cebadores marcados. De forma alternativa, en
lugar de marcar los cebadores, se puede incluir un dNTP marcado en
la mezcla de reacción de PCR. La amplificación por PCR se puede
llevar a cabo en un ciclador térmico de ADN siguiendo técnicas
convencionales. Tras un número adecuado de ciclos para lograr la
amplificación, la mezcla de reacción de PCR se somete a
electroforesis sobre gel de poliacrilamida. Tras secar el gel, se
cuantifica la radiactividad de las bandas apropiadas
(correspondientes al mARN que codifica los polipéptidos de
Streptococcus) usando un analizador de imágenes. En la
técnica se conocen bien los ingredientes y las condiciones de las
reacciones de RT y de PCR, y los reactivos y las concentraciones de
gel, y los métodos de marcado. El especialista en la técnica
apreciará las variaciones evidentes del método
RT-PCR.
La determinación de los niveles de polipéptido
de Streptococcus en una muestra biológica se puede realizar
usando cualquier método conocido en la técnica. Para la
determinación de niveles de polipéptido de Streptococcus de
una muestra biológica se prefieren las técnicas basadas en
anticuerpos. Por ejemplo, la expresión de polipéptido de
Streptococcus en tejidos se puede estudiar empleando métodos
inmunohistológicos clásicos. En dichos métodos, el reconocimiento
específico lo proporciona el anticuerpo primario (policlonal o
monoclonal), pero el sistema de detección secundario puede utilizar
anticuerpos fluorescentes, enzimáticos, u otros anticuerpos
secundarios conjugados. Como resultado, se obtiene una tinción
inmunohistológica de la sección de tejido correspondiente al examen
patológico. También se pueden extraer tejidos, por ejemplo, con urea
y detergente neutro, para la liberación de polipéptidos de
Streptococcus para el ensayo de Transferencia Western o de
manchas puntuales (Jalkanen, M., y col., J. Cell. Biol. 101:
976-985 (1985); Jalkanen, M. y col., J. Cell.
Biol. 105: 3087-3096 (1987)). En esta técnica,
que se basa en el uso de fases sólidas catiónicas, la cuantificación
de un polipéptido de Streptococcus se puede lograr usando un
polipéptido de Streptococcus aislado como patrón. Esta
técnica también se puede aplicar a fluidos corporales.
Otros métodos basados en anticuerpos útiles para
detectar la expresión génica de polipéptido de Streptococcus
incluyen los inmunoensayos, tales como los ensayos inmunoenzimáticos
(ELISA) y el radioinmunoanálisis (RIA). Por ejemplo, se pueden usar
anticuerpos monoclonales específicos de polipéptido de
Streptococcus como inmunosorbentes y como sonda marcada con
enzima para detectar y cuantificar un polipéptido de
Streptococcus. La cantidad de polipéptido de
Streptococcus presente en la muestra se puede calcular
haciendo referencia a la cantidad presente en una preparación
patrón usando un algoritmo de ordenador de regresión lineal. Un
ensayo ELISA para detectar un antígeno tumoral se describe en
Iacobelli y col., Breast Cancer Research y Treatment 11:
19-30 (1988). En otro ensayo ELISA, se pueden usar
dos anticuerpos monoclonales específicos distintos para detectar
polipéptidos de Streptococcus en un fluido corporal. En este
ensayo, uno de los anticuerpos se usa como inmunosorbente y el otro
como sonda marcada con enzima.
\newpage
Las anteriores técnicas se pueden llevar a cabo
esencialmente como un ensayo de "una etapa" o de "dos
etapas". El ensayo de "una etapa" implica poner en contacto
el polipéptido de Streptococcus con anticuerpo inmovilizado
y, sin lavar, poner en contacto la mezcla con el anticuerpo marcado.
El ensayo de "dos etapas" implica lavar antes de poner en
contacto la mezcla con el anticuerpo marcado. También se pueden
emplear otros métodos convencionales como adecuados. Normalmente es
deseable inmovilizar un componente del sistema de ensayo sobre un
soporte, permitiendo con ello que otros componentes del sistema
entren en contacto con el componente y sean fácilmente eliminados
de la muestra.
Los anticuerpos específicos de polipéptidos de
Streptococcus para su uso en la presente invención se pueden
activar contra un polipéptido intacto de S. pneumoniae de la
presente invención, o contra un fragmento del mismo. Dichos
polipéptidos y fragmentos pueden administrarse a un animal (por
ejemplo, un conejo o un ratón) con un vehículo proteico (por
ejemplo, albúmina) o, si son suficientemente largos (por ejemplo, de
al menos aproximadamente 25 aminoácidos), sin vehículo.
Tal como se usa en la presente memoria, el
término "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Mab)
pretende incluir moléculas intactas, así como fragmentos de
anticuerpos (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y
F(ab')_{2}), que son capaces de unirse específicamente a un
polipéptido de Streptococcus. Los fragmentos Fab y
F(ab')_{2} carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto,
se eliminan más rápidamente de la circulación, y pueden tener menos
unión a tejido no específica de un anticuerpo intacto (Wahl y col.,
J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)). Por
tanto, se prefieren dichos fragmentos.
Los anticuerpos de la presente invención se
pueden preparar mediante cualquiera de una serie de métodos. Por
ejemplo, los polipéptidos de S. pneumoniae identificados en
la Tabla 1, o los fragmentos de los mismos, se pueden administrar a
un animal con el fin de inducir la producción de sueros que
contengan anticuerpos policlonales. En un método preferido, se
prepara una preparación de polipéptido de S. pneumoniae de la
presente invención y se purifica para dejarla sustancialmente libre
de contaminantes naturales. A continuación, dicha preparación se
introduce en un animal con el propósito de producir antisueros
policlonales de actividad altamente específica.
En el método más preferido, los anticuerpos de
la presente invención son anticuerpos monoclonales. Dichos
anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando tecnología de
hibridoma (Kohler y col., Nature 256: 495 (1975); Kohler y
col., Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); Kohler y col., Eur.
J. Immunol. 6: 292 (1976); Hammerling y col., en: Monoclonal
Antibodies y T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y.,
(1981), páginas 563-681). En general, dichos
procedimientos implican inmunizar un animal (preferiblemente un
ratón) con un polipéptido antigénico de S. pneumoniae de la
presente invención. Las células adecuadas se pueden reconocer por su
capacidad para unirse a anticuerpos de polipéptido
anti-Streptococcus. Dichas células pueden cultivarse en
cualquier medio de cultivo de tejidos adecuado; sin embargo, es
preferible cultivar células en medio Eagle de Earle modificado
complementado con un 10% de suero fetal bovino (desactivado a
aproximadamente 56ºC), y complementado con aproximadamente 10 g/L
de aminoácidos no esenciales, aproximadamente 1.000 U/mL de
penicilina, y aproximadamente 100 \mug/mL de estreptomicina. Los
esplenocitos de dichos ratones se extraen y se fusionan con una
línea celular de mieloma adecuada. Se puede emplear cualquier línea
celular de mieloma adecuada de acuerdo con la presente invención;
sin embargo, es preferible emplear la línea celular de mieloma
original (SP_{2}O), disponible en la American Type Culture
Collection, Rockville, Maryland. Tras la fusión, las células de
hibridoma resultantes se mantienen selectivamente en medio HAT, y a
continuación se clonan limitando la dilución tal como se describe en
Wands y col. (Gastroenterology 80: 225-232
(1981)). Las células de hibridoma obtenidas a través de dicha
selección se evalúan entonces para identificar clones que segreguen
anticuerpos capaces de unirse al antígeno de polipéptido de
Streptococcus administrado al animal inmunizado.
De forma alternativa, se pueden producir
anticuerpos adicionales capaces de unirse a antígenos de polipéptido
de Streptococcus en un procedimiento de dos etapas mediante
el uso de anticuerpos anti-idiotípicos. Dicho
método se basa en el hecho de que los anticuerpos son en sí mismos
antígenos, y que, por tanto, es posible obtener un anticuerpo que
se una a un segundo anticuerpo. De acuerdo con este método, los
anticuerpos específicos de polipéptido de Streptococcus se
usan para inmunizar un animal, preferiblemente un ratón. Los
esplenocitos de dicho animal se usan a continuación para producir
células de hibridoma, y las células de hibridoma se monitorizan
para identificar clones que produzcan un anticuerpo cuya capacidad
para unirse al anticuerpo específico de polipéptido de
Streptococcus puede ser bloqueado por un antígeno de
polipéptido de Streptococcus. Dichos anticuerpos comprenden
anticuerpos anti-idiotípicos de los anticuerpos
específicos de polipéptido de Streptococcus y se pueden usar
para inmunizar a un animal para inducir la formación de más
anticuerpos específicos de polipéptido de Streptococcus.
Cabe destacar que el Fab y el
F(ab')_{2} y otros fragmentos de los anticuerpos de la
presente invención pueden usarse de acuerdo con los métodos
descritos en la presente memoria. Dichos fragmentos se producen
normalmente por ruptura proteolítica, usando enzimas tales como la
papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir
fragmentos F(ab')_{2}). De forma alternativa, se pueden
producir fragmentos de unión de polipéptido de Streptococcus
mediante la aplicación de tecnología recombinante de ADN o empleando
química sintética.
De especial interés para la presente invención
son los anticuerpos de antígenos de polipéptidos de
Streptococcus que se producen en humanos, o que son
"humanizados" (es decir, que son no inmunogénicos en un humano)
mediante tecnología recombinante o de otro tipo. Los anticuerpos
humanizados se pueden producir, por ejemplo, reemplazando una
porción inmunogénica de un anticuerpo con una porción
correspondiente que sea no inmunogénica (es decir, anticuerpos
quiméricos) (Robinson, R.R. y col., Publicación de Patente
Internacional PCT/US86/02269; Akira, K. y col., Solicitud de
Patente Europea 184.187; Taniguchi, M., Solicitud de Patente Europea
171.496; Morrison, S.L. y col., Solicitud de Patente Europea
173.494; Neuberger, M.S. y col., Solicitud PCT WO 86/01533; Cabilly,
S. y col., Solicitud de Patente Europea 125.023; Better, M. y col.,
Science 240: 1041-1043 (1988); Liu, A.Y. y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:
3439-3443 (1987); Liu, A.Y. y col., J. Immunol.
139: 3521-3526 (1987); Sun, L.K. y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218
(1987); Nishimura, Y., y col., Canc. Res. 47:
999-1005 (1987); Wood, C.R. y col., Nature
314: 446-449 (1985)); Shaw y col., J. Natl.
Cancer Inst. 80: 1553-1559 (1988). Revisiones
generales sobre anticuerpos quiméricos "humanizados" se pueden
encontrar en Morrison, S.L. (Science, 229:
1202-1207 (1985)) y en Oi, V.T. y col.,
BioTechniques 4: 214 (1986)). Los anticuerpos
"humanizados" adecuados se pueden producir de forma
alternativa mediante CDR o mediante sustitución CEA (Jones, P.T. y
col., Nature 321: 552-525 (1986); Verhoeyan
y col., Science 239: 1534 (1988); Beidler, C.B. y col., J.
Immunol. 141: 4053-4060 (1988)).
Los marcadores enzimáticos adecuados incluyen,
por ejemplo, los del grupo oxidasa, que catalizan la producción de
peróxido de hidrógeno reaccionando con el sustrato. Particularmente
se prefiere la glucosa oxidasa, ya que presenta una buena
estabilidad y su sustrato (glucosa) es fácilmente adquirible. La
actividad de un marcador oxidasa se puede determinar midiendo la
concentración de peróxido de hidrógeno formado en la reacción
anticuerpo marcado enzimáticamente/sustrato. Además de las enzimas,
otros marcadores adecuados incluyen marcadores radioisotópicos,
tales como el yodo (^{125}I, ^{121}I), el carbono (^{14}C), el
azufre (^{35}S), el tritio (^{3}H), el indio (^{112}In) y el
tecnecio ^{99m}Tc), y marcadores fluorescentes, tales como la
fluoresceína y la rodamina, y la biotina.
A continuación se presentan otros marcadores
adecuados para los anticuerpos específicos de polipéptido de
Streptococcus de la presente invención. Los ejemplos de
marcadores enzimáticos adecuados incluyen malato deshidrogenasa,
nucleasa estafilocócica,
delta-5-esteroide isomerasa, alcohol
deshidrogenasa de levadura, fosfato deshidrogenasa de
alfa-glicerol, isomerasa de fosfato de triosa,
peroxidasa, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa,
beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa,
deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato,
glucoamilasa y esterasa de acetilcolina.
Los ejemplos de marcas radioisotópicas adecuadas
incluyen ^{3}H, ^{111}In, ^{125}I, ^{131}I, ^{32}P,
^{35}S, ^{14}C, ^{51}Cr, ^{57}To, ^{58}Co, ^{59}Fe,
^{75}Se, ^{152}Eu, ^{90}Y, ^{67}Cu, ^{217}Ci, ^{211}At,
^{212}Pb, ^{47}Sc, ^{109}Pd, etc. El ^{111}In es un isótopo
preferido cuando se emplean imágenes in vivo ya que evita el
problema de la deshalogenización de los anticuerpos monoclonales
marcados con ^{125}I o con ^{131}In por el hígado. Además, este
radionucleótido tiene una energía de emisión gamma más favorable
para la captación de imágenes (Perkins y col., Eur. J. Nucl. Med.
10: 296-301 (1985); Carrasquillo y col., J.
Nucl. Med. 28: 281-287 (1987)). Por ejemplo, el
^{111}In acoplado a anticuerpos monoclonales con
1-(P-isotiocianatobencil)-DPTA
presenta poca captación en tejidos no tumorales, particularmente en
el hígado, y por tanto potencia la especificidad de la localización
del tumor (Esteban y col., J. Nucl. Med. 28:
861-870 (1987)).
Los ejemplos de marcadores isotópicos no
radiactivos incluyen ^{157}Gd, ^{55}Mn, ^{162}Dy, ^{52}Tr y
^{56}Fe.
Los ejemplos de marcadores fluorescentes
adecuados incluyen un marcador de ^{152}Eu, un marcador de
fluoresceína, un marcador de isotiocianato, un marcador de
rodamina, un marcador de ficoeritrina, un marcador de ficocianina,
un marcador de aloficocianina, un marcador de
o-ftalaldehído y un marcador de fluorescamina.
Los ejemplos de marcadores de toxina adecuados
incluyen la toxina de la difteria, el ricino y la toxina del
cólera.
Los ejemplos de marcadores quimioluminiscentes
incluyen un marcador luminal, un marcador isoluminal, un marcador
de éster de acridinio aromático, un marcador de imidazol, un
marcador de sal de acridinio, un marcador de éster de oxalato, un
marcador de luciferina, un marcador de luciferasa y un marcador de
aecuorina.
Los ejemplos de agentes de contraste de
resonancia magnética nuclear incluyen núcleos pesados tales como Gd,
Mn y hierro.
Las técnicas típicas para la unión de los
marcadores más arriba descritos a anticuerpos se proporcionan en
Kennedy y col., Clin. Chim. Acta 70: 1-31
(1976), y en Schurs y col., Clin. Chim. Acta 81:
1-40 (1977). Las técnicas de acoplamiento
mencionadas en la última referencia son el método del
glutaraldehído, el método del peryodato, el método de la
dimaleimida, el método del éster de
m-maleimidobencil-N-hidroxi-succinimida,
todos los cuales se incorporan a la presente memoria a modo de
referencia.
En un aspecto relacionado, la invención incluye
un kit de diagnóstico para su uso en el escrutinio de sueros que
contienen anticuerpos específicos contra la infección de S.
pneumoniae. Dicho kit puede incluir un antígeno de S.
pneumoniae aislado que comprende un epítopo que es
específicamente inmunorreactivo con al menos un anticuerpo
anti-S. pneumoniae. Dicho kit también incluye los medios
necesarios para detectar la unión de dicho anticuerpo al antígeno.
En realizaciones específicas, el kit puede incluir un antígeno de
péptido o de polipéptido sintetizado químicamente o producido
recombinantemente. El antígeno de péptido o de polipéptido puede
estar ligado a un soporte sólido.
En una realización más específica, el medio de
detección del kit anterior incluye un soporte sólido al cual se une
dicho antígeno de péptido o de polipéptido. Dicho kit también puede
incluir un anticuerpo anti-humano marcado con
informador no ligado. En esta realización, la unión del anticuerpo
con el antígeno de S. pneumoniae se puede detectar mediante
la unión del anticuerpo marcado con informador con el anticuerpo
anti-S. pneumoniae.
En un aspecto relacionado, la invención incluye
un método para detectar infección de S. pneumoniae en un
sujeto. Este método de detección incluye hacer reaccionar un fluido
corporal, preferiblemente suero, del sujeto con un antígeno de
S. pneumoniae aislado, y examinar el antígeno en busca de la
presencia de anticuerpos ligados. En una realización específica, el
método incluye un antígeno de polipéptido unido a un soporte sólido,
y se hace reaccionar suero con el soporte. Posteriormente, el
soporte se hace reaccionar con un anticuerpo
anti-humano marcado con informador. A continuación
el soporte es examinado en busca de la presencia de anticuerpos
marcados con informador.
El reactivo de superficie sólida empleado en los
anteriores ensayos y kits se prepara empleando técnicas conocidas
para la unión de material proteico a un material de soporte sólido,
tal como partículas poliméricas, barras de mojado, placas de 96
pocillos o material filtrante. Estos métodos de unión generalmente
incluyen la adsorción no específica de la proteína al soporte o la
unión covalente de la proteína, normalmente a través de un grupo
amino libre, a un grupo químicamente reactivo del soporte sólido,
tal como un grupo carboxilo, hidroxilo o aldehído activado. De
forma alternativa, se pueden usar placas recubiertas de
estreptavidina junto con el(los) antígeno(s)
biotinilado(s).
La presente invención también proporciona
vacunas que comprenden uno o más polipéptidos de la presente
invención. La heterogeneicidad en la composición de una vacuna
puede ser proporcionada mediante la combinación de polipéptidos de
S. pneumoniae de la presente invención. Las vacunas
multicomponentes de este tipo son deseables debido que es probable
que sean más eficaces a la hora de activar respuestas inmunes
protectoras contra especies múltiples y contra cepas del género
Streptococcus que las vacunas de polipéptidos sencillos. Por
tanto, tal como se discute más adelante en detalle, una vacuna
multicomponente de la presente invención puede contener uno o más,
preferiblemente de 2 a aproximadamente 20, más preferiblemente de 2
a aproximadamente 15, y aún más preferiblemente de 3 a
aproximadamente 8, de los péptidos de S. pneumoniae
identificados en la Tabla 1, o fragmentos de los
mismos.
mismos.
Las vacunas multicomponentes son conocidas en la
técnica para activar la producción de anticuerpos contra numerosos
componentes inmunogénicos. Decker, M. y Edwards, K., J. Infect.
Dis. 174: S270-275 (1996). Además,
recientemente se ha demostrado que una vacuna tetravalente, contra
la hepatitis B, la difteria, el tétanos y el pertussis, activa
niveles protectores de anticuerpos en infantes humanos contra los
cuatro agentes patógenos. Aristegui, J. y col., Vaccine 15:
7-9 (1997).
Por tanto, la presente invención también incluye
vacunas multicomponentes. Dichas vacunas comprenden más de un
polipéptido, inmunógeno o antígeno. Un ejemplo de dicha vacuna
multicomponente sería una vacuna que comprende más de uno
polipéptido de S. pneumoniae descrito en la Tabla 1. Un
segundo ejemplo es una vacuna que comprende uno o más, por ejemplo
2 a 10, del polipéptido de S. pneumoniae descrito en la Tabla
1 y uno o más, por ejemplo 2 a 10, polipéptidos adicionales de
origen ya sea estreptocócico o no estreptocócico. Así, también está
dentro del alcance de la invención una vacuna
multi-componente que confiere inmunidad protectora
frente a una infección estreptocócica así como frente a una
infección causada por otro agente patógeno.
Tal como se ha indicado más arriba, se espera
que las vacunas de la presente invención provoquen una respuesta
inmune protectora contra infecciones causadas por especies y cepas
de Streptococcus diferentes a la cepa de S.
pneumoniae depositada en la ATCC.
También dentro del alcance de la invención se
encuentran las células enteras y las vacunas víricas enteras.
Dichas vacunas pueden producirse recombinantemente e implican la
expresión de uno o más del polipéptido de S. pneumoniae
descrito en la Tabla 1. Por ejemplo, los polipéptidos de S.
pneumoniae de la presente invención pueden ser segregados o
localizados intracelularmente, sobre la superficie celular o en el
espacio periplasmático. Además, si se usa un virus recombinante,
los polipéptidos de S. pneumoniae de la presente invención
pueden localizarse, por ejemplo, en el envoltorio vírico, sobre la
superficie de la cápsida, o internamente dentro de la cápsida. Las
vacunas celulares enteras que emplean células que expresan proteínas
heterólogas son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo,
Robinson, K. y col., Nature Biotech. 15:
653-657 (1997); Sirard, J. y col., Infect.
Immun. 65: 2029-2033 (1997); Chabalgoity, J. y
col., Infect. Immun. 65: 2402-2412 (1997).
Estas células pueden administrarse vivas o pueden matarse antes de
la administración. Chabalgoity, J. y col., ver anterior, por
ejemplo, publicaron el uso con éxito en ratones de una cepa de
vacuna de Salmonella viva atenuada que expresa una porción
de una proteína de unión a ácido graso de platihelminto como una
proteína de fusión sobre su superficie celular.
También se puede preparar una vacuna
multi-componente usando técnicas conocidas mediante
la combinación de uno o más polipéptidos de S. pneumoniae de
la presente invención, o de fragmentos de los mismos, con
componentes no estreptocócicos adicionales (por ejemplo, toxina de
difteria o toxina del tétanos, y/u otros compuestos que provocan
una respuesta inmune). Dichas vacunas son útiles para activar
respuestas inmunes protectoras frente a miembros del género
Streptococcus y frente a agentes patógenos no
estreptocócicos.
Las vacunas de la presente invención también
incluyen vacunas de ADN. Actualmente, se están desarrollando
vacunas de ADN para una serie de enfermedades infecciosas. Boyer, J.
y col., Nat. Med. 3: 526-532 (1997);
revisado en Spier, R., Vaccine 14: 1285-1288
(1996). Dichas vacunas de ADN contienen una secuencia de nucleótidos
que codifica uno o más polipéptidos de S. pneumoniae de la
presente invención orientados de un modo que permite la expresión
del polipéptido sujeto. Se ha demostrado que la administración
directa de ADN plásmido que codifica OspA de B. burgdorgeri
provoca una inmunidad protectora en ratones frente a exposición
borrelial. Luke, C. y col., J. Infect. Dis. 175:
91-97 (1997).
La presente descripción también se refiere a la
administración de una vacuna que es administrada junto con una
molécula capaz de modular respuestas inmunes. Kim, J. y col.,
Nature Biotech. 15: 641-646 (1997), por
ejemplo, publican la potenciación de respuestas inmunes producidas
por inmunizaciones de ADN cuando se administran conjuntamente
secuencias de ADN que codifican moléculas que estimulan la respuesta
inmune. De un modo similar, las vacunas de la presente invención
pueden administrarse conjuntamente con ácidos nucleicos que
codifican moduladores inmunes o con los propios moduladores
inmunes. Estos moduladores inmunes incluyen el factor estimulador
de colonia de macrófagos de granulocito (GM-CSF) y
CD86.
Las vacunas de la presente invención se pueden
usar para conferir resistencia frente a la infección estreptocócica
mediante una inmunización pasiva o activa. Cuando las vacunas de la
presente invención se usan para conferir resistencia frente a la
infección estreptocócica a través de una inmunización activa, se
administra una vacuna de la presente invención a un animal para
provocar una respuesta inmune protectora que previene o atenúa una
infección estreptocócica. Cuando la vacuna de la presente invención
se usa para conferir resistencia frente a una infección
estreptocócica a través de una inmunización pasiva, la vacuna se
proporciona a un animal hospedante (por ejemplo, humano, perro o
ratón), y los antisueros activados por este antisuero se recuperan y
se proporcionan directamente a un receptor que se sospecha tiene
una infección causada por un miembro del género
Streptococcus.
La capacidad para marcar anticuerpos, o
fragmentos de anticuerpos, con moléculas de toxinas proporciona un
método adicional para tratar infecciones estreptocócicas cuando se
lleva a cabo una inmunización pasiva. En esta realización, los
anticuerpos, o los fragmentos de anticuerpos, capaces de reconocer
los polipéptidos de S. pneumoniae descritos en la presente
memoria, o fragmentos de los mismos, así como otras proteínas de
Streptococcus, se marcan con moléculas de toxina antes de ser
administrados al paciente. Cuando los anticuerpos derivados de
dicha toxina se unen a las células de Streptococcus, los
restos funcionales de toxina se localizarán en estas células y
provocarán su muerte.
Por tanto, la presente invención se refiere y
proporciona un medio para la prevención o la atenuación de una
infección estreptocócica que es originada por organismos que
presentan antígenos que son reconocidos y se unen a antisueros
producidos en respuesta a los polipéptidos de la presente invención.
Tal como se usa en la presente memoria, se dice que una vacuna
previene o atenúa una enfermedad si su administración a un animal
da como resultado la atenuación parcial o total (es decir, la
supresión) de un síntoma o condición de la enfermedad, o la
inmunidad total o parcial del animal frente a al enfermedad.
La administración de la vacuna (o del antisuero
que provoca) se puede realizar con un propósito "profiláctico"
o con uno "terapéutico". Cuando se proporciona
profilácticamente, el(los) compuesto(s) se
proporciona(n) antes de que aparezca cualquier síntoma de
infección estreptocócica. La administración profiláctica de
el(los) compuesto(s) sirve para prevenir o atenuar
cualquier infección posterior. Cuando se proporciona(n)
terapéuticamente, el(los) compuesto(s) se
proporcionan cuando se produce la detección de síntomas que indican
que un animal puede estar infectado con un miembro del género
Streptococcus. La administración terapéutica de
el(los) compuesto(s) sirve para atenuar cualquier
infección real. Por tanto, los polipéptidos de S. pneumoniae,
y los fragmentos de los mismos, de la presente invención se pueden
proporcionar antes del inicio de la infección (para prevenir o para
atenuar una infección anticipada) o después del inicio de una
infección real.
Los polipéptidos de la invención, tanto si
codifican una porción de una proteína nativa o un derivado funcional
de la misma, se pueden administrar en forma pura o pueden acoplarse
a un vehículo macromolecular. Ejemplos de dichos vehículos son las
proteínas y los carbohidratos. Las proteínas adecuadas que pueden
actuar como vehículo macromolecular para potenciar la
inmunogenicidad de los polipéptidos de la presente invención
incluyen el toxoide del tétanos de la hemacianina de lapa de ojo de
cerradura (KLH), la toxina pertussis, la albúmina de suero bovino y
la ovoalbúmina. Los métodos para acoplar los polipéptidos de la
presente invención a dichos vehículos macromoleculares se describen
en Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, 2ª
Edición; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, Nueva York (1988), cuya descripción completa se incorpora a
la presente memoria a modo de referencia.
Se dice que una composición es
"farmacológicamente aceptable" si su administración puede ser
tolerada por un animal receptor, y por lo demás es adecuada para la
administración a dicho animal. Se dice que dicho agente se va a
administrar en una "cantidad terapéuticamente eficaz" si la
cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Un agente
es fisiológicamente significativo si su presencia da como resultado
un cambio detectable en la fisiología de un paciente receptor.
Aunque en todos los casos la vacuna de la
presente invención se administra como un compuesto
farmacológicamente aceptable, el especialista en la técnica
reconocerá que la composición de un compuesto farmacológicamente
aceptable varía con el animal al que se administra. Por ejemplo, una
vacuna destinada a uso humano generalmente no será administrada
conjuntamente con un adyuvante de Freund. Además, el nivel de pureza
de los polipéptidos de S. pneumoniae de la presente
invención normalmente será superior cuando se administren a un
humano que cuando se administren a un animal no humano.
Como comprenderá el especialista en la técnica,
cuando la vacuna de la presente invención se proporciona a un
animal, puede estar en una composición que puede contener sales,
tampones, adyuvantes u otras sustancias que son deseables para
mejorar la eficacia de la composición. Los adyuvantes son sustancias
que pueden usarse para aumentar específicamente una respuesta
inmune específica. Generalmente, estas sustancias realizan dos
funciones: (1) protegen a el(los) antígeno(s) de ser
catabolizado(s) rápidamente después de la administración y
(2) estimulan respuestas inmunes de forma no específica.
Normalmente, el adyuvante y la composición se
mezclan antes de la presentación al sistema inmune, o se presentan
separadamente, pero en la misma zona del animal que es inmunizado.
Los adyuvantes se pueden clasificar a grandes rasgos en varios
grupos en base a su composición. Estos grupos incluyen los
adyuvantes oleaginosos (por ejemplo, el de Freund, completo e
incompleto), sales minerales (por ejemplo,
AlK(SO_{4})_{2},
AlNa(SO_{4})_{2}, AlNH_{4}(SO_{4}),
sílice, caolín y carbón), polinucleótidos (por ejemplo, ácidos poli
IC y pli AU), y determinadas sustancias naturales (por ejemplo,
cera D de Mycobacterium tuberculosis, así como sustancias
que se encuentran en Corynebacterium parvum, o en
Bordetella pertussis, y miembros del género Brucella).
Otras sustancias útiles como adyuvantes son las saponinas tales
como, por ejemplo, Quil A. (Superfos A/S, Dinamarca). Los
adyuvantes preferidos para su uso en la presente invención incluyen
sales de aluminio, tales como AlK(SO_{4})_{2},
AlNa(SO_{4})_{2} y AlNH_{4}(SO_{4}).
Los ejemplos de materiales adecuados para su uso en composiciones
de vacunas se proporcionan en Remington's Pharmaceutical
Sciences (Osol, A., Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA,
páginas 1324-1341 (1980), referencia que se
incorpora a la presente memoria a modo de referencia).
Las composiciones terapéuticas de la presente
invención se pueden administrar parenteralmente mediante inyección,
infusión rápida, absorción nasofaríngea (intranasofaríngeamente),
dermoabsorción, u oralmente. Las composiciones pueden administrarse
de forma alternativa intramuscularmente o intravenosamente. Las
composiciones para la administración parenteral incluyen
disoluciones, suspensiones y emulsiones esterilizadas acuosas o no
acuosas. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilénglicol,
polietilénglicol, aceites vegetales tales como el aceite de oliva,
y ésteres orgánicos inyectables tales como el oleato de etilo. Se
pueden usar vehículos o recubrimientos oclusivos para aumentar la
permeabilidad de la piel y potenciar la absorción del antígeno. Las
formas de dosis líquidas para administración oral pueden comprender
generalmente una disolución de liposomas que contiene la forma de
dosis líquida. Las formas adecuadas de suspender liposomas incluyen
emulsiones, suspensiones, disoluciones, jarabes y elixires que
contienen diluyentes inertes usados habitualmente en la técnica, tal
como agua purificada. Además de los diluyentes inertes, dichas
composiciones también pueden incluir adyuvantes, agentes
humectantes, agentes emulsificantes y de suspensión, o agentes
edulcorantes, aromatizantes o perfumes.
Las composiciones terapéuticas de la presente
invención también se pueden administrar en forma encapsulada. Por
ejemplo, la inmunización intranasal de ratones contra la infección
de Bordetella pertussis usando vacunas encapsuladas en
microesferas biodegradables compuestas por
poli(DL-lactido-co-glicólido)
ha demostrado estimular respuestas inmunes protectoras. Shahin, R.
y col., Infect. Immun. 63: 1195-1200 (1995).
De forma similar, los antígenos de Salmonella typhimurium
encapsulados administrados oralmente también han demostrado provocar
una inmunidad protectora en ratones.
Allaoui-Attarki, K. y col., Infect. Immun.
65: 853-857 (1997). Las vacunas encapsuladas de
la presente invención se pueden administrar mediante una serie de
rutas que incluyen las que implican poner en contacto la vacuna con
membranas mucosas (por ejemplo, intranasalmente, intracolónicamente,
intraduodenalmente).
Existen muchas técnicas diferentes para
controlar el tiempo de las inmunizaciones cuando se utiliza un
régimen de administración múltiple. Es posible usar las
composiciones de la invención más de una vez para incrementar los
niveles y la diversidad de la expresión del repertorio de
inmunoglobulina expresado por el animal inmunizado. Normalmente, si
se producen múltiples inmunizaciones, se administrarán con uno o dos
meses de diferencia.
De acuerdo con la presente invención, una
"cantidad eficaz" de una composición terapéutica es aquella que
es suficiente para lograr un efecto biológico deseado.
Generalmente, la dosis necesitada para proporcionar una cantidad
eficaz de la composición variará dependiendo de factores tales como
la edad, condición, sexo, y extensión de la enfermedad, si la hay,
del animal o humano, y de otras variables que pueden ser ajustadas
por el especialista en la técnica.
Las preparaciones antigénicas de la invención se
pueden administrar en dosis sencillas o múltiples de una cantidad
eficaz. Las cantidades eficaces de las composiciones de la invención
pueden variar entre 0,01 y 1.000 \mug/mL por dosis, más
preferiblemente entre 0,1 y 500 \mug/mL por dosis, y aún más
preferiblemente entre 10 y 300 \mug/mL por dosis.
Habiendo descrito ya la invención de forma
general, será más fácil comprenderla haciendo referencia a los
siguientes Ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no
pretenden limitar la presente invención, a no ser que se indique lo
contrario.
\newpage
El vector de expresión bacteriano pQE10 (QIAGEN,
Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311) se usa en este
Ejemplo para clonar las secuencias de nucleótido mostradas en la
Tabla 1, y para expresar los polipéptidos identificados en la Tabla
1. Los componentes del plásmido pQE10 se disponen de tal modo que la
secuencia de ADN insertada que codifica un polipéptido de la
presente invención exprese el polipéptido con los seis restos His
(es decir, un "marca 6 X His") ligada covalentemente al extremo
amino.
Las secuencias de ADN que codifican las
porciones deseadas de los polipéptidos de la Tabla 1 se amplifican
usando cebadores de oligonucleótido de PCR procedentes de una
biblioteca de ADN construida a partir de S. pneumoniae, tal
como la depositada por los inventores en la ATCC para mayor
comodidad, con Nº de Depósito ATCC 97755, o a partir de ADN aislado
del mismo organismo, tal como la cepa de S. pneumoniae
depositada con el Nº de Depósito ATCC 55840. En la Tabla 3 se
proporciona una lista de los cebadores de PCR que se pueden usar
para este fin. Los cebadores de PCR se combinan con las secuencias
de nucleótido que codifican las secuencias de aminoácidos
aminoterminal y carboxiterminal de la porción deseada de los
polipéptidos de la Tabla 1. Se añadieron nucleótidos adicionales
que contienen las posiciones de restricción para facilitar la
clonación en el vector pQE10 en las secuencias de cebador 5' y 3',
respectivamente. Dichas posiciones de restricción se enumeran en la
Tabla 3 para cada cebador. En cada caso, el cebador comprende,
empezando en el extremo 5', 4 nucleótidos aleatorios para evitar la
"respiración" durante el proceso de envejecimiento, una
posición de restricción (mostrada en la Tabla 3), y aproximadamente
15 nucleótidos de la secuencia ORF de S. pneumoniae (la
secuencia completa de cada cebador de clonación se muestra como SEQ
ID NO: 281 y SEQ ID NO: 222).
Para clonar los polipéptidos de la Tabla 1, se
seleccionaron los cebadores 5' y 3' para amplificar sus respectivas
secuencias codificadoras de nucleótidos. El especialista en la
técnica apreciará que el punto de la proteína que codifica la
secuencia en el que comienza el cebador 5' puede ser modificado para
amplificar un segmento de ADN que codifica cualquier porción
deseada de las secuencias de aminoácidos completas descritas en la
Tabla 1. De forma similar, el especialista en la técnica también
apreciará que el punto de la proteína que codifica la secuencia en
el que comienza el cebador 3' también puede modificarse para
amplificar un segmento de ADN que codifica cualquier porción
deseada de la secuencia completa de aminoácidos descrita en la Tabla
1.
El fragmento de ADN amplificado y el vector
pQE10 son digeridos con la(s) enzima(s) de
restricción
apropiada(s), y a continuación se ligan juntos los ADNs digeridos. La mezcla de ligadura se transforma en células de E. coli competentes usando procedimientos estándar tales como los descritos en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer a presión selectiva sobre placas LB. El ADN plásmido se aísla a partir de colonias resistentes y la identidad del ADN clonado se confirma mediante análisis de restricción, PCR y secuenciamiento de ADN.
apropiada(s), y a continuación se ligan juntos los ADNs digeridos. La mezcla de ligadura se transforma en células de E. coli competentes usando procedimientos estándar tales como los descritos en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer a presión selectiva sobre placas LB. El ADN plásmido se aísla a partir de colonias resistentes y la identidad del ADN clonado se confirma mediante análisis de restricción, PCR y secuenciamiento de ADN.
Los clones que contienen las construcciones
deseadas se cultivan durante la noche ("O/N") en cultivo
líquido en selección. El cultivo O/N se usa para inocular un gran
cultivo, con una dilución de aproximadamente 1:25 a 1:250. Las
células se cultivan hasta una densidad óptica a 600 nm
("OD600") de entre 0,4 y 0,6. A continuación se añade
isopropil-b-D-tiogalactopiranósido
("IPTG") con una concentración final de 1 mM para inducir la
transcripción del promotor sensible represor lac, mediante la
desactivación del represor lacl. Posteriormente las células son
incubadas otras 3-4 horas. A continuación se
recolectan las células mediante centrifugación.
Las células se agitan durante
3-4 horas a 4ºC en guanidina-HCl 6
M, pH 8. Los desechos celulares se eliminan mediante
centrifugación, y el sobrenadante que contiene la proteína de
interés se carga en una columna de resina de afinidad de ácido
níquel-nitrilo-triacético
("NiNTA") (disponible en QIAGEN, Inc., ver anterior). Las
proteínas con la marca 6x His se unen a la resina
NI-NTA con una elevada afinidad y se pueden
purificar en un procedimiento sencillo de una sola etapa (para más
detalles véase: The QIAexpressionist, 1995, QIAGEN, Inc., ver
anterior). En resumen, el sobrenadante se carga en la columna en
guanidina-HCl 6 M, pH 8, la columna se lava primero
con 10 volúmenes de guanidina-HCl 6 M, pH 8, a
continuación se lava con 10 volúmenes de
guanidina-HCl 6 M, pH 6, y finalmente se eluye el
polipéptido con guanidina-HCl 6 M, pH 5,0.
La proteína purificada se renaturaliza a
continuación dializándola frente a disolución salina tamponada con
fosfato (PBS) o frente a tampón de acetato de Na 50 mM, pH 6, más
NaCl 200 mM. De forma alternativa, la proteína puede ser replegada
con éxito mientras se mantiene inmovilizada sobre la columna
Ni-NTA. Las condiciones recomendadas son las
siguientes: renaturalizar usando un gradiente lineal de urea 6
M-1 M en NaCl 500 mM, glicerol al 20%, Tris/HCl 20
mM, pH 7,4, que contiene inhibidores de proteasa. La
renaturalización debería llevarse a cabo a lo largo de un periodo
de 1,5 horas o más. Después de la renaturalización, las proteínas se
pueden eluir mediante la adición de imidazol 250 mM. Se elimina el
imidazol mediante una etapa final de dialización frente a PBS o
frente a tampón de acetato sódico 50 mM, pH 6, más NaCl 200 mM. La
proteína purificada se almacena a 4ºC o se congela a -80ºC.
\newpage
Las secuencias de ADN que codifican la secuencia
de aminoácidos de la Tabla 1 también se pueden clonar y expresar
como proteínas de fusión empleando un protocolo similar al descrito
antes, en el que se usa preferentemente el vector
pET-32b(+) (Novagen, 601 Science Drive, Madison, WI
53711) en lugar del pQE10.
El polinucleótido mostrado en la Tabla 1 fue
amplificado y subclonado con éxito en pQE10, tal como se describe
más arriba, usando los cebadores de PCR mostrados en la Tabla 3.
Estos plásmidos pQE10 que contiene los ADNs de la Tabla 1 se
depositaron con la ATCC como un depósito combinado por conveniencia
para los expertos en la técnica. Este depósito combinado se
depositó el 16 de octubre de 1997 y se le asignó el número de
depósito dn la ATCC 209369. Los expertos en la técnica apreciarán
que el aislamiento de un plásmido individual a partir de un
depósito combinado es trivial, una vez conocida la información y los
reactivos descritos en la presente memoria. Cada uno de los clones
depositados es capaz de expresar su polipéptido de S.
pneumoniae codificado.
\vskip1.000000\baselineskip
La propagación y el almacenamiento de S.
pneumoniae, y la exposición al mismo, se realizan esencialmente
como se ha descrito en Aaberge, I.S. y col., "Virulence of
Streptococcus pneumoniae in mice: a standardized method for
preparation y frozen storage of the experimental bacterial
inoculum", Microbial Pathogenesis 18: 141 (1995),
incorporada a la presente memoria a modo de referencia.
En resumen, se usa caldo de cultivo de Todd
Hewitt (TH) (Difco Laboratories, Detroit, MI) con un 17% de FCS, y
placas de agar de sangre equina para cultivar las bacterias. El
caldo de cultivo y las placas de sangre son incubados a 37ºC en una
atmósfera de CO_{2} al 5%. Las placas de sangre son incubadas
durante 18 horas. El caldo de cultivo se diluye regularmente en un
factor de 10 en caldo TH mantenido a temperatura ambiente, y las
suspensiones bacterianas se mantienen a temperatura ambiente hasta
la exposición a los ratones.
Para las inmunizaciones activas se inyectan
intraperitonealmente (i.p.) ratones C3H/HeJ (The Jackson Laboratory,
Bar Harbor, ME) en la semana 0 con 20 g de proteína estreptocócico
recombinante, o con disolución salina tamponada con fosfato (PBS),
emulsificada con adyuvante de Freund completo (CFA), se les da una
inmunización similar en adyuvante de Freund incompleto (IFA) en la
semana 4, y se exponen en la semana 6. Para la exposición se diluye
S. pneumoniae procedente de cultivos de crecimiento
exponencial en caldo TH, y los ratones son inyectados
subcutáneamente (s.c.) en la base de la cola con 0,1 mL de dichas
disoluciones (se usan diluciones en serie para encontrar la dosis
infecciosa media). Los estreptococos usados para la exposición son
pasados menos de seis veces in vitro. Para determinar la
infección, se obtienen muestras sanguíneas de la parte distal de la
vena femoral lateral en tubos capilares heparinizados. Se diluye en
serie una muestra de 25 \muL de sangre en un factor de 10 en
caldo TH, y 25 \muL de sangre diluida y sin diluir se colocan en
placas de agar de sangre. Las placas se cultivan durante 18 horas y
se contabilizan las colonias.
En la técnica se conocen otros métodos, por
ejemplo, véase Langermann, S. y col., J. Exp. Med., 180: 2277
(1994), incorporada a la presente memoria a modo de referencia.
Se usan varios formatos de inmunoensayo para
cuantificar los niveles de anticuerpos específicos estreptocócicos
(ELISA e inmunotransferencia), y para evaluar las propiedades
funcionales de dichos anticuerpos (ensayo de inhibición del
crecimiento). Los ensayos ELISA y de inmunotransferencia también se
usan para detectar y cuantificar anticuerpos activados en respuesta
a una infección estreptocócica que reaccionan con antígenos
estreptocócicos específicos. Cuando se activan anticuerpos de
determinados antígenos estreptocócicos por infección, esto se toma
como evidencia de que las proteínas estreptocócicos en cuestión son
expresadas in vivo. La ausencia de anticuerpos derivados de
la infección (seroconversión) tras exposición estreptocócico es una
evidencia de que la infección se ha evitado o se ha suprimido. El
ensayo de inmunotransferencia también se utiliza para determinar si
los anticuerpos activados contra los antígenos estreptocócicos
recombinantes reconocen una proteína de tamaño similar en extractos
de estreptococos enteros. Cuando la proteína natural es de tamaño
similar, o idéntico, en el ensayo de inmunotransferencia a la
versión recombinante de la misma proteína, esto se toma como una
evidencia de que la proteína recombinante es el producto de un clon
de longitud completa del gen respectivo.
El ELISA se usa para cuantificar los niveles de
anticuerpos reactivos con antígenos de Streptococcus
activados en respuesta a la inmunización con dichos antígenos
estreptocócicos. Los pocillos de placas de microtitulación de 96
pocillos (Immunlon 4, Dynatech, Chantilly, Virginia, o equivalente)
se recubren con antígeno incubando 50 1 de 1 g/mL de disolución de
antígeno de proteína en un tampón adecuado, normalmente un tampón de
carbonato sódico 0,1 M a pH 9,6. Tras decantar el antígeno no
unido, se bloquean más posiciones de unión incubando 100 1 de leche
desnatada al 3% en tampón de lavado (PBS, Tween 20 al 0,2%, pH 7,4).
Tras lavar, se incuban durante 1 hora diluciones en serie en un
factor de 2 duplicadas de suero en PBS, Tween 20 y suero fetal
bovino al 1%, se eliminan, se lavan los pocillos tres veces, y se
incuban con IgG anti-ratón de cabra conjugada con
peroxidasa equina. Tras tres lavados, se detectan los anticuerpos
unidos con H_{2}O_{2} y con
2,2'-azino-di-(3-etilbenctiazoina
sulfonato) (Schwan, T.G., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92: 2909-2913 (1985)) (ABTS®, Kirkegaard &
Perry Labs., Gaithersburg, MD) y se cuantifica la A_{405} con un
lector de placas Vmax^{TM} de Molecular Devices, Corp. (Menlo
Park, California). Se asigna el título mínimo de 1:100 a un nivel de
IgG que es dos veces el nivel de ruido de fondo en sueros
procedentes de ratones naive.
Usando un formato de pocillo único, se llevan a
ebullición los extractos totales de proteína estreptocócico o de
antígeno estreptocócico recombinante en tampón de muestra
SDS/2-ME antes de someterse a electroforesis a
través de geles con un 3% de acrilamida, y de geles de resolución
con una mayor concentración de acrilamida, normalmente entre el 10
y el 15% de monómero de archilamida. Los geles son
electro-coagulados sobre membranas de nitrocelulosa
y se evalúan las bandas con diluciones de anticuerpo que se van
ensayar para determinar su reactividad frente a antígenos
estreptocócicos específicos, seguido del conjugado secundario
apropiado anticuerpo-enzima (peroxidasa equina).
Cuando se desea confirmar que la proteína se ha transferido después
de la electro-coagulación, las membranas se tiñen
con Ponceau S. Las señales de inmunotinción de los anticuerpos
unidos se detectan sobre película de rayos X como
quimioluminiscencia usando reactivos ECL^{TM} (Amersham Corp.,
Arlington Heights, Illinois).
\vskip1.000000\baselineskip
Se lleva a cabo un análisis Northern blot usando
los métodos descritos, entre otros, por Sambrook y col, ver
referencia anterior, para detectar la expresión de las secuencias de
nucleótidos de S. pneumoniae de la presente invención en
tejidos animales. Se marca una sonda de cADN que contiene una
secuencia completa de nucleótidos mostrada en la Tabla 1 con
^{32}P usando el sistema de marcado de ADN rediprime^{TM}
(Amersham Life Science), de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Tras el marcado, la sonda se purifica usando una columna
CHROMA SPIN-100TM (Clontech Laboratories, Inc.), de
acuerdo con el protocolo del fabricante número
PT1200-1. La sonda marcada purificada se usa a
continuación para detectar la expresión de mARN de
Streptococcus en una muestra de tejido animal.
Se examinan tejidos animales, tales como sangre
o fluido espinal, con la sonda marcada usando la disolución de
hibridación ExpressHyb^{TM} (Clontech) de acuerdo con el protocolo
del fabricante número PT1190-1. Tras la hibridación
y un lavado, se montan las manchas y se exponen a película a -70ºC
durante la noche, y las películas se tratan de acuerdo con los
procedimientos estándares.
Ha de quedar claro que la invención se puede
llevar a la práctica de otro modo distinto al particularmente
descrito en la anterior descripción y en los anteriores
ejemplos.
Es posible realizar numerosas modificaciones y
variaciones de la presente invención a la vista de la anterior
memoria, y, por tanto, también se encuentran dentro del alcance las
reivindicaciones anexas.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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SINGAPUR
El solicitante pide que la provisión de una
muestra de un microorganismo sea hecha solamente a un experto. La
petición a este efecto debe ser presentada por el solicitante en la
Oficina Internacional antes de completarse las preparaciones
técnicas para la publicación internacional de la solicitud.
\newpage
NORUEGA
El solicitante pide que, mientras la solicitud
no esté abierta a la inspección pública (por la Oficina Noruega de
Patentes), o si la Oficina Noruega de Patentes ha decidido
finalmente no abrir la solicitud a la inspección pública, la
provisión de una muestra sólo será efectuada a un experto en la
técnica. La petición a este efecto será presentada por el
solicitante en la Oficina Noruega de Patentes no después de que la
solicitud se haya hecho disponible al público bajo las Secciones 22
y 33(3) del Acta Noruega de Patentes. Si el solicitante ha
presentado una petición, cualquier petición hecha por terceros para
la provisión de una muestra indicará el experto que la va a usar.
Ese experto puede ser cualquier persona de una lista de expertos
reconocidos redactada por la Oficina Noruega de Patentes o
cualquier persona autorizada por el solicitante a título
individual.
\vskip1.000000\baselineskip
AUSTRALIA
El solicitante informa que la provisión de una
muestra de un microorganismo sólo puede ser efectuada antes de la
concesión de la patente, o antes del abandono, el rechazo, o la
retirada de la solicitud, a una persona que es un destinatario
experto sin interés en la invención (Regla 3.25(3) del
Reglamento australiano de patentes).
\vskip1.000000\baselineskip
FINLANDIA
El solicitante pide que, mientras la solicitud
no esté abierta a la inspección pública (por el Consejo Nacional de
Patentes y Registros), o si Consejo Nacional de Patentes y Registros
ha decidido finalmente no abrir la solicitud a la inspección
pública, la provisión de una muestra sólo será efectuada a un
experto en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
ISLANDIA
El solicitante pide que, mientras la solicitud
no esté abierta a la inspección pública (por la Oficina Islandesa
de Patentes), o si la Oficina Islandesa de Patentes ha decidido
finalmente no abrir la solicitud a la inspección pública, la
provisión de una muestra sólo será efectuada a un experto en la
técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
DINAMARCA
El solicitante pide que, mientras la solicitud
no esté abierta a la inspección pública (por la Oficina Danesa de
Patentes), o si la Oficina Danesa de Patentes ha decidido finalmente
no abrir la solicitud a la inspección pública, la provisión de una
muestra sólo será efectuada a un experto en la técnica. La petición
a este efecto será presentada por el solicitante en la Oficina
Danesa de Patentes no después de que la solicitud se haya hecho
disponible al público bajo las Secciones 22 y 33(3) del Acta
Danesa de Patentes. Si el solicitante ha presentado una petición,
cualquier petición hecha por terceros para la provisión de una
muestra indicará el experto que la va a usar. Ese experto puede ser
cualquier persona de una lista de expertos reconocidos redactada
por la Oficina Danesa de Patentes o cualquier persona autorizada por
el solicitante a título individual.
\vskip1.000000\baselineskip
SUECIA
El solicitante pide que, mientras la solicitud
no esté abierta a la inspección pública (por la Oficina Sueca de
Patentes), o si la Oficina Sueca de Patentes ha decidido finalmente
no abrir la solicitud a la inspección pública, la provisión de una
muestra sólo será efectuada a un experto en la técnica. La petición
a este efecto será presentada por el solicitante en la Oficina
Internacional antes de cumplirse 16 meses desde la fecha de
prioridad (preferiblemente usando el formulario PUT/RO/134
reproducido en el anejo Z del Tomo I de la Guía del Solicitante del
PCT). Si el solicitante ha presentado una petición, cualquier
petición hecha por terceros para la provisión de una muestra
indicará el experto que la va a usar. Ese experto puede ser
cualquier persona de una lista de expertos reconocidos redactada
por la Oficina Sueca de Patentes o cualquier persona autorizada por
el solicitante a título individual.
\vskip1.000000\baselineskip
GRAN BRETAÑA
El solicitante pide que la provisión de una
muestra de un microorganismo sea hecha solamente a un experto. La
petición a este efecto debe ser presentada por el solicitante en la
Oficina Internacional antes de completarse las preparaciones
técnicas para la publicación internacional de la solicitud.
\newpage
PAÍSES BAJOS
El solicitante pide que hasta la fecha de
concesión de una Patente en los Países Bajos o hasta la fecha en
que la solicitud es rechazada o retirada o abandonada, el
microorganismo pueda estar disponible bajo la Regla 31F(1)
del Reglamento de Patentes sólo mediante la provisión de una muestra
a un experto. La petición a este efecto debe ser presentada por el
solicitante en la Oficina de Propiedad Industrial de los Países
Bajos antes de la fecha en que la solicitud sea puesta a
disposición del público bajo la Sección 22C o la Sección 25 del
Acta de Patentes de los Países Bajos, lo que ocurra antes.
Claims (26)
-
\global\parskip0.930000\baselineskip
1. Un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en- (a)
- polinucleótidos que codifican el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en la SEQ ID NO: 56;
- (b)
- polinucleótidos que tienen la secuencia codificadora mostrada en la SEQ ID NO: 55 que codifica el polipéptido;
- (c)
- polinucleótidos que son idénticos en al menos 95% a la secuencia codificadora mostrada en la SEQ ID NO: 55,
- (d)
- polinucleótidos que codifican un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos 95% a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 56,
- (e)
- polinucleótidos que codifican una porción portadora de epítopo de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
- \quad
- Arg-10 a Arg-17; Lys-29 a Ser-39; Ser-140 a Ala-153; Arg-158 a Tyr-169; Asp-175 a Ala-183; Gly-216 a Asn-236; Ala-261 a Leu-270; Arg-282 a Phe-291; y Thr-297 a Ala-305; Pro-342 a Gln-362; Phe-455 a Asp-463 ; His-497 a Thr-511; Ala-521 a Gly-529; Ile-537 a Val-546; Ile-556 a Ala-568; Pro-581 a Ser-595; Glu-670 a Ala-685; Ser-696 a Ala-705 y Leu-782 a Ser-791 de la secuencia de aminoácidos deducida como se representa en SEQ ID NO:56; y
- (f)
- polinucleótidos que codifican fragmentos que comprenden al menos 50 aminoácidos contiguos de un polipéptido codificado por un polinucleótido de uno cualquiera de los apartados (a) a (d)
o la cadena complementaria de dicho polinucleótido.\vskip1.000000\baselineskip
- 2. El polinucleótido de la reivindicación 1, que es ADN.
- 3. El polinucleótido de la reivindicación 1, que es ARN.
- 4. Un método de fabricación de un vector recombinante que comprende insertar un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en un vector.
- 5. Un vector recombinante que contiene el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o producido mediante el método de la reivindicación 4.
- 6. El vector de la reivindicación 5, en el que el polinucleótido está ligado operativamente a una secuencia de control de expresión que permite la expresión en células hospedantes procarióticas o eucarióticas.
- 7. Un método para fabricar una célula hospedante recombinante que comprende introducir el vector de la reivindicación 5 ó 6 en una célula hospedante.
- 8. Una célula hospedante transformada con el vector de la reivindicación 5 ó 6, o producida mediante el método de la reivindicación 7.
- 9. Un proceso para producir un polipéptido codificado por el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende: cultivar la célula hospedante de la reivindicación 8 y recubrir el polipéptido codificado por dicho polinucleótido del cultivo.
- 10. Un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o que se puede obtener mediante el proceso de la reivindicación 9.
- 11. Un antígeno de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de una porción portadora de epítopo de la reivindicación 1 (e) seleccionada del grupo que consiste en: Arg-10 a Arg-17; Lys-29 a Ser-39; Ser-140 a Ala-153; Arg-158 a Tyr-169; Asp-175 a Ala-183; Gly-216 a Asn-236; Ala-261 a Leu-270; Arg-282 a Phe-291; y Thr-297 a Ala-305; Pro-342 a Gln-362; Phe-455 a Asp-463; His-497 a Thr-511; Ala-521 a Gly-529; Ile-537 a Val-546; Ile-556 a Ala-568; Pro-581 a Ser-595; Glu-670 a Ala-685; Ser-696 a Ala-705 y Leu-782 a Ser-791 de la secuencia de aminoácidos deducida como se representa en SEQ ID NO:56.
- 12. Una proteína codificada por un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que carece de metionina N-terminal.
- 13. Una proteína de fusión que comprende el polipéptido de la reivindicación 10, y una secuencia de polipéptido heteróloga.
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- 14. Un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de la reivindicación 10.
- 15. Un hibridoma que produce el anticuerpo de la reivindicación 14.
- 16. Una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el polipéptido de la reivindicación 10 o un ADN que codifica y que es capaz de expresar dicho polipéptido in vivo o el anticuerpo de la reivindicación 14, y opcionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
- 17. Una composición de diagnóstico que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o el anticuerpo de la reivindicación 14.
- 18. El uso del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, del polipéptido de la reivindicación 10, o del anticuerpo de la reivindicación 14, para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención o la atenuación de una infección provocada por un miembro del género Streptococcus.
- 19. Composición farmacéutica que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el polipéptido de la reivindicación 10, o el anticuerpo de la reivindicación 14 para prevenir o atenuar una infección causada por un miembro del género Streptococcus.
- 20. Un proceso diagnóstico que comprende analizar la presencia del polipéptido de la reivindicación 10 en una muestra obtenida a partir de un hospedante.
- 21. La composición farmacéutica de la reivindicación 16, que es una vacuna.
- 22. La vacuna de la reivindicación 20, que comprende:
- (a)
- un polipéptido de S. pneumoniae de la reivindicación 10, o un fragmento del mismo; y
- (b)
- un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, en el que está presente dicho polipéptido en una cantidad eficaz para activar anticuerpos protectores en un animal frente a un miembro del género Streptococcus.
\vskip1.000000\baselineskip
- 23. Un método para detectar ácidos nucleicos de Streptococcus en una muestra biológica obtenida a partir de un animal, que comprende:
- (a)
- poner en contacto la muestra con una o más sondas de ácido nucleico que comprenden el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en las condiciones en las que se produzca hibridación; y
- (b)
- detectar la hibridación de dichas una o más sondas con las una o más secuencias de ácido nucleico de Streptococcus presentes en la muestra biológica.
\vskip1.000000\baselineskip
- 24. Un método para detectar ácidos nucleicos de Streptococcus en una muestra biológica obtenida a partir de un animal, que comprende:
- (a)
- amplificar una o más secuencias de ácido nucleico de Streptococcus en dicha muestra usando el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y reacción en cadena de polimerasa; y
- (b)
- detectar dicho ácido nucleico de Streptococcus amplificado.
\vskip1.000000\baselineskip
- 25. Un kit para detectar anticuerpos de Streptococcus en una muestra biológica obtenida a partir de un animal, que comprende:
- (a)
- un polipéptido de la reivindicación 10 unido a un soporte sólido; y
- (b)
- un medio de detección.
\vskip1.000000\baselineskip
- 26. Un método para detectar anticuerpos de Streptococcus en una muestra biológica obtenida a partir de un animal, que comprende:
- (a)
- poner en contacto la muestra con un polipéptido de la reivindicación 10, y
- (b)
- detectar complejos anticuerpo-antígeno.
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