JP2002525101A - Ｍａｐ - Google Patents

Ｍａｐ

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JP2002525101A JP2000572255A JP2000572255A JP2002525101A JP 2002525101 A JP2002525101 A JP 2002525101A JP 2000572255 A JP2000572255 A JP 2000572255A JP 2000572255 A JP2000572255 A JP 2000572255A JP 2002525101 A JP2002525101 A JP 2002525101A
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マグダレーナ・サラカイン
サンジョイ・ビスワス
マーティン・ケイ・アール・バーナム
ジェイムズ・アール・ブラウン
カレン・エイ・イングラハム
アリソン・エフ・チョーカー
デイビッド・ジェイ・ホームズ
リチャード・エル・ウォーレン
トーマス・ビー・マジー
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SmithKline Beecham Corp
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ｍａｐポリペプチドおよびｍａｐポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに組換え技法によりかかるポリペプチドを産生する方法を提供する。さらに、抗菌化合物をスクリーニングするのにｍａｐポリペプチドを利用する方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド、その製造
および使用、ならびにその変種、アゴニストおよびアンタゴニスト、ならびにそ
の使用に関する。特に、本発明は、アミノペプチダーゼファミリーのポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドならびにそれらの変種（本明細書中、「ｍａｐ」、「
ｍａｐポリヌクレオチド」、および場合により「ｍａｐポリペプチド」という）
に関する。
【０００２】 （背景技術） ストレプトコッカス属（Streptococci）は、例えば、中耳炎、結膜炎、肺炎、
菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、胸腔蓄膿および心内膜炎、とりわけ、例えば髄液の
感染などの髄膜炎を含む、ヒトにおいていくつかの型の疾患を引き起こすことが
知られている医学的に重要な微生物属を形成している。その単離から１００年以
上が経過しているため、ストレプトコッカス・ニュモニエ（Streptococcus pneu
moniae）はより集中して研究されている微生物の一つである。例えば、ＤＮＡが
、事実、遺伝的物質であるという、初期の認識の多くは、この微生物を用いる、
Griffithの研究において、およびAvery、MacleodおよびMcCartyの研究において
推定された。エス・ニュモニエを用いる膨大な量の研究にも拘わらず、この微生
物の毒性に関する多くの問題がまだ残っている。抗生物質の開発のための標的と
して、ストレプトコッカス遺伝子および遺伝子産物を利用することが特に好まし
い。
【０００３】 ストレプトコッカス・ニュモニエ感染の頻度は過去２０〜３０年間に劇的に上
昇している。これは多重抗生物質耐性株の出現、および免疫系が低下した人口の
増加に起因している。いくつかのまたはすべての標準的な抗生物質に対して耐性
を有するストレプトコッカス・ニュモニエ株を単離することはもはやめずらしい
ことではない。この現象により、この生物に対する新しい抗菌剤、ワクチン、薬
物スクリーニング方法および診断試験に関して不適当な医薬上の要求があり、か
つ需要を形成している。
【０００４】 そのうえ、薬剤の発見方法は、現在のところ、「機能的遺伝学」、すなわち、
ハイスループットゲノムまたは遺伝子に基づく生物学を包含するため抜本的な改
革を受けている。この方法は、「位置的クローニング」に基づく初期のアプロー
チおよび他の方法に取って代わりつつある。機能的遺伝学は、現在利用可能な多
くの分子生物学的データベースならびに他のソースから問題となる可能性のある
遺伝子配列を同定するための種々の生物学的情報の手段に大きく依存している。
未だ、薬剤の発見の標的としての、さらなる遺伝子および他のポリヌクレオチド
配列ならびにそれらの関連ポリペプチドの同定および特徴づけをする必要がある
。
【０００５】 とりわけ、化合物を抗微生物活性についてスクリーニングするのに有用である
という利点を有する、本発明のｍａｐ具体例のごときポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドに対する要望があることは明白である。かかる因子はまた、感染、機
能不全および疾患の発生病理における役割を決定するのに有用である。感染、機
能不全および疾患を予防、改善または治癒するための方法を見出すために、かか
る因子ならびにそのアンタゴニストおよびアゴニストを同定および特徴づけする
必要もある。
【０００６】 （関連出願） 本願は、１９９８年９月２８日出願の米国仮出願第６０／１０２０９９号の優
先権の利益を主張する。 （発明の開示） 本発明は、ｍａｐ、詳細にはｍａｐポリペプチドおよびｍａｐポリヌクレオチ
ド、組み換え物質ならびにそれらの製造方法に関する。もう１つの態様において
、本発明は、かかるポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法に関し、と
りわけ、微生物による疾病の治療を包含する。さらなる態様において、本発明は
、本発明により提供される材料を用いるアゴニストおよびアンタゴニストの同定
方法、ならびに同定されたアゴニストまたはアンタゴニスト化合物を用いる微生
物による感染およびかかる感染に関連した症状の治療方法に関する。さらなる態
様において、本発明は、微生物による感染およびかかる感染に関連した症状の検
出のための診断アッセイ、例えば、ｍａｐ発現または活性の検出のためのアッセ
イに関する。 開示された本発明の精神および範囲内での種々の変更および修飾は、以下の説
明を読み、本開示の他の部分を読めば、当業者に容易に明らかになるであろう。
【０００７】 （発明を実施するための最良の形態） 以下により詳細に説明するように、本発明は、ｍａｐポリペプチドおよびポリ
ヌクレオチドに関する。詳細には、本発明は、ＡＭＰ１＿ＳＹＮＹ３推定メチオ
ニンアミノペプチダーゼＡポリペプチドに対するアミノ酸配列相同性により関連
づけられる、ストレプトコッカス・ニュモニエ（Streptococcus pneumoniae）の
ｍａｐのポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は、それ
ぞれ配列番号１および配列番号２として表１に示されるヌクレオチドおよびアミ
ノ酸配列を有するｍａｐに関する。「ＤＮＡ」として以下の配列表に示す配列は
、当業者であればかかる配列を、リボヌクレオチドを含む、一般のポリヌクレオ
チドに有効に用いることができると認識されるため、それを例示として示す。
【０００８】 表１ ｍａｐポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列 （Ａ）ストレプトコッカス・ニュモニエのｍａｐポリヌクレオチド配列［配列番
号１］ 5'-atgataacattaaaatcagctcgtgaaatcgaagctatggacaaggctggtgattttctagcaagtatt
catataggctt acgtgatttgattaaaccaggcgtagatatgtgggaagttgaagaatatgtccgccgtcgttgtaaagaaga
aaatttcc ttccacttcagattggggttgacggtgccatgatggactatccttatgctacctgttgctctcttaacgatg
aagtggct cacgctttccctcgtcattatatcttgaaagatggtgatttgctcaaagttgatatggttttgggaggtccc
attgctaa atctgacctgaatgtctcaaaattaaacttcaacaatgttgaacaaatgaaaaaatacactcagagctattc
tggtggtt tagcagactcatgttgggcttatgctgttggtacaccgtccgaagaagtcaaaaacttgatggatgtaacca
aagaagct atgtacaagggtattgagcaagctgttgttggaaatcgtatcggtgatatcggtgcggctattcaagaatac
gctgaaag tcgtggttacggtgtagtgcgtgatttggttggtcatggtgttggcccaactatgcacgaagaaccaatggt
tcctaact atggtattgcaggtcgtggactccgtcttcgtgaaggaatggtcttaaccattgaaccaatgatcaatacag
gcgattgg gaaattgatacagatatgaaaactggttgggcgcataagaccattgacggtggattgtcatgtcagtatgaa
caccaatt tgtcattacgaaagatggacctgttatcttgactagccaaggtgaagaaggaacttattaa-3'
【０００９】 （Ｂ）この表のポリヌクレオチド配列より推定されるストレプトコッカス・ニュ
モニエのｍａｐポリペプチド配列［配列番号２］ NH2-MITLKSAREIEAMDKAGDFLASIHIGLRDLIKPGVDMWEVEEYVRRRCKEENFLPLQIGVDGAMMDYP
YA TCCSLNDEVAHAFPRHYILKDGDLLKVDMVLGGPIAKSDLNVSKLNFNNVEQMKKYTQSYSGGLADSCW AYAVGTPSEEVKNLMDVTKEAMYKGIEQAVVGNRIGDIGAAIQEYAESRGYGVVRDLVGHGVGPTMHEEP MVPNYGIAGRGLRLREGMVLTIEPMINTGDWEIDTDMKTGWAHKTIDGGLSCQYEHQFVITKDGPVILTSQ
GEEGTY -COOH
【００１０】 寄託材料 ストレプトコッカス・ニュモニエ０１００９９３株を含む寄託株を、１９９６
年４月１１日に、スコットランド、ＡＢ２ １ＲＹ、アバディーン、マチャード
ライブ２３Ｓt.のナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド
・マリーン・バクテリア・リミテッド（本明細書にて「ＮＣＩＭＢ」という）に
、ＮＣＩＭＢ受託番号４０７９４の下で寄託した。その寄託株は寄託の際にスト
レプトコッカス・ニュモニエ０１００９９３と命名された。１９９６年４月１７
日に、イー・コリ中のストレプトコッカス・ニュモニエ０１００９９３のＤＮＡ
ライブラリーをＮＣＩＭＢに寄託し、受託番号４０８００が付与された。ストレ
プトコッカス・ニュモニエ寄託株を、本明細書では「寄託株」または「寄託株の
ＤＮＡ」と称する。
【００１１】 寄託株は全長のｍａｐ遺伝子を含んでいる。寄託株に含まれるポリヌクレオチ
ドの配列ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明
細書における配列の記載とのいずれの不一致においても支配的である。 寄託株の寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国際承認に関するブタペスト条
約の条件下で行われている。特許が発行されると何ら制限または条件もなく、最
終的に寄託株は分譲される。寄託株は当業者の便宜のためにのみ提供され、３５
Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２条の下に要求されるような、寄託が実施可能要件であることを
承認するものではない。寄託株、それに由来の化合物を製造、使用または販売す
るには、ライセンスが必要であるが、そのようなライセンスはここで付与される
ものではない。
【００１２】 本発明の一の態様は、寄託株に含まれるストレプトコッカス・ニュモニエ０１
００９９３株により発現可能な成熟ポリペプチドをコードする単離核酸分子を提
供することである。さらには、本発明は寄託株中のＤＮＡおよびＲＮＡのｍａｐ
ポリヌクレオチド配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列を提供する。
また、本発明は寄託株より単離されたｍａｐポリペプチド配列およびそれに由来
のポリヌクレオチド配列を提供する。
【００１３】 ポリペプチド 実質的に本発明のｍａｐポリペプチドは系統発生論的に他のアミノペプチドフ
ァミリーの蛋白に関連している。 本発明の１の態様において、ストレプトコッカス・ニュモニエのポリペプチド
（本明細書ではｍａｐおよびｍａｐポリペプチドという）、ならびに生物学的、
診断上、予防上、臨床的または治療上有用なその変種、ならびにそれを含む組成
物が提供される。 本発明のとりわけ好ましい具体例は、ｍａｐ遺伝子の自然発生対立遺伝子によ
りコードされるｍａｐポリペプチドの変種である。
【００１４】 さらに本発明は下記のものである単離ポリペプチド：（ａ）配列番号２の全長
にわたって配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性、最も
好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するかまたは全く同一であるア
ミノ酸配列を含むかまたはそれよりなるポリペプチド；（ｂ）配列番号１の全長
にわたって配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少な
くとも９７〜９９％の同一性を有するかまたは全く同一であるポリヌクレオチド
配列を含むかまたはそれよりなる単離ポリヌクレオチドによりコードされるポリ
ペプチド；（ｃ）配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配列に対し
て少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性
を有するかまたは全く同一であるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチ
ド配列を含むかまたはそれよりなる単離ポリヌクレオチドによりコードされるポ
リペプチド、を提供する。
【００１５】 本発明のポリペプチドは、表１［配列番号２］のポリペプチド（とりわけ成熟
ポリペプチド）ならびにポリペプチドおよびフラグメント、詳細には、ｍａｐの
生物活性を有し、表１［配列番号２］のポリペプチドと少なくとも９５％の同一
性を有するものを包含し、さらにかかるポリペプチドの部分も包含し、一般に、
ポリペプチドのかかる部分は少なくとも３０個のアミノ酸、より好ましくは、少
なくとも５０個のアミノ酸を含む。
【００１６】 本発明はまた、 Ｘ−（Ｒ1）m−（Ｒ2）−（Ｒ3）n−Ｙ ［式中、アミノ末端のＸは水素または金属、または本明細書において修飾ポリペ
プチドについて説明された他の残基であり、カルボキシル末端のＹは水素または
金属、または本明細書において修飾ポリペプチドについて説明された他の残基で
あり、Ｒ1およびＲ3はいずれかのアミノ酸残基または修飾アミノ酸残基であり、
ｍは１〜１０００の整数または０であり、ｎは１〜１０００の整数または０であ
り、Ｒ2は本発明のアミノ酸配列、特に表１のアミノ酸配列またはそれらの修飾
形態を意味する］ で示されるポリペプチドを包含する。上記の式中、Ｒ2はアミノ末端残基がその
左側でＲ1に結合し、そのカルボキシ末端残基がその右側でＲ3に結合するように
方向づけられる。ｍおよび／またはｎが１より大きい場合、Ｒ1またはＲ3のいず
れかで表されるアミノ酸残基の鎖は、ヘテロポリマーまたはホモポリマーのいず
れであってもよく、ヘテロポリマーが好ましい。本発明の他の好ましい具体例は
、ｍが１ないし５０、１００または５００の間の整数であり、ｎが１ないし５０
、１００または５００の間の整数のものである。 本発明のポリペプチドがストレプトコッカス・ニュモニエ由来のものであるの
が最も好ましいが、同じ分類学上の属の他の生物由来のものであっても好ましい
。また本発明のポリペプチドは、例えば、同じ科または目から得られるものであ
ってもよい。
【００１７】 フラグメントは、その全体が上記したポリペプチドのアミノ酸配列の全部では
ないが、一部と同じであるアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。ｍａ
ｐポリペプチドと同様、フラグメントは「独立している（free-standing）」で
あるか、またはそれらが一の部分または領域、最も好ましくは単一の連続した領
域、単一のより大きなポリペプチドを形成するより大きなポリペプチドの中に含
まれていてもよい。 好ましいフラグメントは、例えば、表１［配列番号２］のアミノ酸配列または
、アミノ−および／またはカルボキシル−末端アミノ酸配列を含む連続した一連
の残基のような、その変種の一部を有する末端切断ポリペプチドを包含する。宿
主細胞、特に、ストレプトコッカス・ニュモニエにより、またはそこにおいて産
生される本発明のポリペプチドの分解型も好ましい。さらに、アルファヘリック
スおよびアルファヘリックス形成領域、ベータシートおよびベータシート形成領
域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水領域、疎
水領域、アルファ両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、フレキシブル領域、表面
形成領域、基質結合領域、および高抗原指数領域を含むフラグメントのような、
構造的または機能的属性によって特徴づけられるフラグメントもまた好ましいフ
ラグメントである。
【００１８】 さらに好ましいフラグメントは、配列番号２のアミノ酸配列由来の少なくとも
１５、２０、３０、４０、５０または１００個の連続したアミノ酸を有するアミ
ノ酸配列を含む単離ポリペプチド、あるいは配列番号２のアミノ酸配列由来の末
端切断または欠失された少なくとも１５、２０、３０、４０、５０または１００
個の連続したアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを包含する
。 本発明のポリペプチドのフラグメントである変種は、ペプチド合成法により対
応する全長のポリペプチドの製造に使用することができる。したがって、これら
の変種は、本発明の全長ポリペプチドを製造するための中間体として使用できる
。
【００１９】 ポリヌクレオチド ｍａｐポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、詳細には、本明細書
でｍａｐと命名されるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを提供す
ることが本発明の一の目的である。 本発明の特に好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、全長の遺伝子を
含む、表１（配列番号１）に示す配列を含むｍａｐポリペプチド、またはその変
種をコードしている領域を含む。出願人らは、この全長の遺伝子は当該ポリペプ
チドを有する生物（例えば、ストレプトコッカス・ニュモニエ）の増殖および／
または生存に必須であると考える。
【００２０】 本発明のさらなる態様として、ｍａｐポリペプチドおよびポリヌクレオチド、
詳細には、ストレプトコッカス・ニュモニエのｍａｐポリペプチドおよびポリヌ
クレオチドをコードおよび／または発現する単離核酸分子が提供され、核酸分子
としては、例えば、未プロセッシングＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃ
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、Ｂ−およびＺ−ＤＮＡが挙げられる。本発明のさらなる
具体例は、生物学的、診断上、予防上、臨床的または治療上有用なポリヌクレオ
チドおよびポリペプチド、ならびにその変種、ならびにそれらを含む組成物を包
含する。 本発明のもう一つの態様は、表１［配列番号２］の推定アミノ酸配列を有する
ｍａｐポリペプチドをコードする、少なくとも１つの全長遺伝子を含む、単離ポ
リヌクレオチド、それに密接に関連するポリヌクレオチドおよびそれらの変種に
関する。 もう１つの特に好ましい本発明具体例において、表１（配列番号２）のアミノ
酸配列を含むかまたはそれよりなる、ストレプトコッカス・ニュモニエ由来のｍ
ａｐポリペプチドまたはその変種が提供される。
【００２１】 表１［配列番号１］に示すポリヌクレオチド配列のような本明細書の情報を使
用し、出発材料としてストレプトコッカス・ニュモニエ０１００９９３細胞を使
用し、細菌からの染色体ＤＮＡフラグメントをクローニングし、配列決定し、つ
づいて全長クローンを得る標準的クローニングおよびスクリーニング法を使用し
て、ｍａｐポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドを得ることがで
きる。例えば、表１［配列番号１］に示す配列のような本発明のポリヌクレオチ
ド配列を得るには、典型的には、エシェリシア・コリまたは他の適当な宿主中の
ストレプトコッカス・ニュモニエ０１００９９３の染色体ＤＮＡのクローンのラ
イブラリーを、部分配列から由来する放射標識したオリゴヌクレオチド、好まし
くは１７量体またはそれより長いオリゴヌクレオチドでプローブする。ついで、
該プローブと同じＤＮＡを有するクローンをストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件を使用して区別できる。該オリジナルポリペプチドまたはポリヌク
レオチド配列から設計された配列決定プライマーとハイブリダイゼーションする
ことで同定された個々のクローンを配列決定することにより、そのポリヌクレオ
チド配列を両方の方向に伸長し、全長遺伝子配列を決定することが可能である。
都合よくは、プラスミド・クローンから調製された変性二本鎖ＤＮＡを用いてか
かる配列決定を行う。適当な技法は、Maniatis,T.，Fritsch,E.F.およびSambroo
kら、MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，2nd Ed.；Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York（１９８９）（特に、ハイ
ブリダイゼーションによるスクリーニング１.９０および変性二本鎖ＤＮＡ鋳型
の配列決定１３.７０を参照のこと）により記載されている。直接ゲノムＤＮＡ
配列決定を行って全長の遺伝子配列を得てもよい。例えば、表１［配列番号１］
に示すポリヌクレオチドは、ストレプトコッカス・ニュモニエ０１００９９３か
ら由来するＤＮＡライブラリー中に見いだされたものである。
【００２２】 そのうえ、表１［配列番号１］のＤＮＡ配列は、表１［配列番号２］に示すの
とほぼ同数のアミノ酸残基を有し、当業者に周知のアミノ酸残基の分子量から計
算できる推定分子量を有する蛋白をコードするオープンリーディングフレームを
有する。配列番号１のヌクレオチド番号１と、ヌクレオチド番号８５９で始まる
停止コドンとの間の配列番号１のポリヌクレオチドが、配列番号２のポリペプチ
ドをコードする。
【００２３】 さらなる態様において、本発明は、下記のポリヌクレオチドを含むかまたはそ
れらよりなる単離ポリヌクレオチドを提供する：（ａ）配列番号１の全長にわた
って配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性、より好ましくは少なくとも
９７−９９％の同一性を有するかまたは全く同一であるポリヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくと
も９５％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９７〜９９％またはちょう
ど１００％の同一性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配
列。
【００２４】 本発明のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド（ストレプトコッカ
ス・ニュモニエ以外の種由来のホモログおよびオーソログを包含）を、ストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件において、配列番号１の配列またはそれ
らのフラグメントを含むかまたはそれらよりなる標識または検出可能プローブを
用いて適当なライブラリーをスクリーニングし、次いで、該ポリヌクレオチド配
列を含む全長遺伝子および／またはゲノムクローンを単離する工程を含む方法に
より得てもよい。
【００２５】 本発明は、表１［配列番号１］のコーディング配列（オープンリーディングフ
レーム）と、その全長にわたって同一であるポリヌクレオチド配列を提供する。
また、本発明は、成熟ポリペプチドまたはそのフラグメント用のコーディング配
列自体ならびにリーダーまたは分泌配列、プレ、プロまたはプレプロ蛋白配列を
コードするコーディング配列のような他のコーディング配列を有するリーディン
グ・フレーム中の成熟ポリペプチドまたはフラグメントのコーディング配列を提
供する。ポリヌクレオチドはまた、例えば、転写されるが翻訳されない配列、終
止シグナル（例えば、ｒｈｏ−依存的およびｒｈｏ−非依存的終止シグナル）、
リボソーム結合部位、Kozak配列、ｍＲＮＡを安定化する配列、イントロン、ポ
リアデニル化シグナルのごとき少なくとも１つの非コーディング５’および３’
配列を包含する非コーディング配列を含むが、これらに限定するものではない。
また、ポリヌクレオチド配列はさらなるアミノ酸をコードしているさらなるコー
ディング配列を含んでいてもよい。例えば、融合ポリペプチドの精製を促進する
マーカー配列をコードすることができる。本発明のある種の具体例において、マ
ーカー配列は、ｐＱＥベクター（Qiagen,Inc.）において提供され、Gentzら、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA（１９８９）８６：８２１−８２４に記載されるような、
ヘキサ−ヒスチジンペプチドであるか、またはＨＡペプチドタグ（Wilsonら、Ce
ll，３７：７６７（１９８４））であり、ともにそれらに融合したポリペプチド
配列の精製において有用である。本発明のポリヌクレオチドは、限定するもので
はないが、構造遺伝子および遺伝子の発現を調節する、本来的に結合している配
列からなるポリヌクレオチドを包含する。
【００２６】 本発明の好ましい具体例は、表１の配列番号１に示されるヌクレオチド１から
ヌクレオチド８５９のすぐ上流にあるヌクレオチドまたはそのヌクレオチドを含
むヌクレオチドまでを有するポリヌクレオチドであり、それは共にｍａｐポリペ
プチドをコードする。
【００２７】 本発明はまた、式： Ｘ−（Ｒ1）m−（Ｒ2）−（Ｒ3）n−Ｙ ［式中、分子の５’末端のＸは水素または金属、または修飾ヌクレオチド残基で
あるか、あるいはＹと一緒になって共有結合を形成し、分子の３’末端のＹは水
素または金属、または修飾ヌクレオチド残基であるか、あるいはＸと一緒になっ
て共有結合を形成し、Ｒ1およびＲ3は、各々、独立していずれかの核酸残基また
は修飾核酸残基であり、ｍは１〜３０００の整数または０であり、ｎは１〜３０
００の整数または０であり、Ｒ2は本発明の核酸配列または修飾核酸配列、特に
表１より選択される核酸配列またはその修飾核酸配列を意味する］ で示されるポリヌクレオチドからなるかまたは含むポリヌクレオチドを包含する
。上記した式のポリヌクレオチド中、Ｒ2は５’末端核酸残基がその左側でＲ1に
結合し、その３’末端核酸残基がその右側でＲ3に結合するように方向付けられ
る。ｍおよび／またはｎが１より大きい場合、Ｒ1および／またはＲ2のいずれか
で表される核酸残基の鎖は、ヘテロポリマーまたはホモポリマーのいずれであっ
てもよく、ヘテロポリマーが好ましい。好ましい具体例において、ＸおよびＹが
一緒になって共有結合を形成する場合、前記した式のポリヌクレオチドは閉じた
環状ポリヌクレオチドであり、それはその式が第２の鎖が相補性を有する第１の
鎖を示す二本鎖ポリヌクレオチドであり得る。もう一つ別の具体例において、ｍ
および／またはｎは１と１０００の間の整数である。他の好ましい本発明の具体
例は、ｍが１ないし５０、１００または５００の間の整数であり、ｎが１ないし
５０、１００または５００の間の整数である。
【００２８】 本発明のポリヌクレオチドはストレプトコッカス・ニュモニエ由来であるのが
最も好ましいが、分類学上同じ属の他の生物より得ることも好ましい。また、例
えば、本発明のポリヌクレオチドは、分類学上同じ科または目の生物から得ても
よい。 本明細書で使用する「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語
は、本発明のポリペプチド、特に、細菌性ポリペプチド、より詳細には、表１［
配列番号２］に示すアミノ酸配列を有するストレプトコッカス・ニュモニエ・ｍ
ａｐのポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。この
用語はコードおよび／非コーディング配列を含んでもよいさらなる領域と共に、
該ポリペプチドをコードする単一の連続または非連続領域（例えば、組み込まれ
たファージ、組み込まれた挿入配列、組み込まれたベクター配列、組み込まれた
トランスポゾン配列、またはＲＮＡエデティング（editing）もしくはゲノムＤ
ＮＡ再組織化により中断されている）を含むポリヌクレオチドを包含する。 本発明はさらに、表１［配列番号２］の推定アミノ酸配列を有するポリペプチ
ドの変種をコードする、本明細書に記載したポリヌクレオチドの変種に関する。
本発明のポリヌクレオチドのフラグメントである変種は本発明の全長ポリヌクレ
オチドの合成に使用できる。
【００２９】 さらに好ましい具体例は、数個、わずかな、５〜１０、１〜５、１〜３、２ま
たは１個あるいは０個のアミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで置換、修飾、
欠失または付加された表１［配列番号２］のｍａｐポリペプチドのアミノ酸配列
を有する、ｍａｐ変種をコードするポリヌクレオチドである。特に好ましくは、
ｍａｐポリペプチドの特性、活性を変化させないサイレント置換、付加および欠
失である。 また、好ましい単離されたポリヌクレオチドの具体例として、配列番号１のポ
リヌクレオチド配列からの、少なくとも１５、２０、３０、４０、５０または１
００個の連続した核酸を有する核酸配列を含むポリヌクレオチド、あるいは配列
番号１のポリヌクレオチド配列の５’および／または３’末端から少なくとも１
５、２０、３０、４０、５０または１００個の連続した核酸が末端切断または欠
失されている核酸配列を含むポリヌクレオチドなどの、ポリヌクレオチド配列が
挙げられる。
【００３０】 本発明のさらに好ましい具体例は、表１［配列番号２］に示すアミノ酸配列を
有するｍａｐポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全長にわたって少な
くとも９５％または９７％の同一性を有するポリヌクレオチドおよびそのような
ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである。少なくとも９５％の同一
性を有する領域を含むポリペプチドが最も好ましい。さらには、少なくとも９５
％の同一性を有するものの中で少なくとも９７％の同一性を有するものがより好
ましく、中でも少なくとも９８％および少なくとも９９％の同一性を有するもの
が特に好ましい。少なくとも９９.５％の同一性を有するものがより好ましい。
【００３１】 好ましい具体例は、表１［配列番号１］のＤＮＡによってコードされている成
熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドである。 本発明のある好ましい具体例によれば、特にストリンジェントな条件下で、例
えば表１のポリヌクレオチドのごときｍａｐポリヌクレオチド配列にハイブリダ
イズするポリヌクレオチドが提供される。
【００３２】 さらに本発明は、本明細書にて上記したポリヌクレオチド配列にハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドに関する。この点において、本発明は特に、本明細書に
て上記したポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
ポリヌクレオチドに関する。本明細書で用いる場合、「ストリンジェントな条件
」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語は、ハイ
ブリダイゼーションが、配列間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７
％の同一性がある場合にのみ起こることを意味する。ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件の一例として、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０
ｍＭ ＮaＣl、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（
pＨ７.６）、５ｘデンハート（Denhardt’s）溶液、１０％硫酸デキストランお
よび２０μｇ／ｍｌ変性切断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一夜インキ
ュベートし、ついでハイブリダイゼーション支持体を０.１ｘＳＳＣ（約６５℃
）で洗浄することが挙げられる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は公知
であり、Sambrookら、MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second Editi
on，Cold Spring Harbor, N.Y.（１９８９）、特に、第１１章に例示されている
。本発明により提供されるポリヌクレオチド配列に関して溶液ハイブリダイゼー
ションを用いてもよい。
【００３３】 本発明は、配列番号１に示したポリヌクレオチド配列の完全遺伝子を含む適当
なライブラリーを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、配列番
号１に示す該ポリヌクレオチド配列の配列を有するプローブまたはそのフラグメ
ントでスクリーニングし、該ポリヌクレオチド配列を単離することにより得るこ
とができるポリヌクレオチド配列を含むかまたはそれよりなるポリヌクレオチド
を提供する。そのようなポリヌクレオチドを得るのに有用なフラグメントには、
例えば、本明細書のいずれかの場所で十分に説明するプローブおよびプライマー
が包含される。
【００３４】 本明細書において本発明のポリヌクレオチドの分析についてさらに説明するよ
うに、例えば、上記したような本発明のポリヌクレオチドを、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ
およびゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用し、ｍ
ａｐをコードする全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離し、ｍａｐ遺伝子に
対して高い同一性、特に高い配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲ
ノムクローンを単離することができる。そのようなプローブは、一般に、少なく
とも１５ヌクレオチド残基または塩基対を含むであろう。好ましくは、そのよう
なプローブは少なくとも３０塩基からなり、少なくとも５０ヌクレオチド残基ま
たは塩基対を有してもよい。特に好ましいプローブは、少なくとも２０ヌクレオ
チド残基または塩基対を有し、３０以下のヌクレオチド残基または塩基対を有す
る。 ｍａｐ遺伝子のコード領域は、表１（配列番号１）のＤＮＡ配列を使用してス
クリーニングしてオリゴヌクレオチド・プローブを合成することにより単離でき
る。ついで、本発明の遺伝子の配列と相補性の配列を有する標識したオリゴヌク
レオチドを用いてｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスク
リーニングし、ライブラリーのどのメンバーがプローブとハイブリダイゼーショ
ンするか決定する。
【００３５】 全長のＤＮＡを得るための、あるいは短いＤＮＡを伸長させるための利用可能
で当業者によく知られたいくつかの方法があり、例えば、ｃＤＮＡ末端の迅速増
幅（ＲＡＣＥ）（例えば、Frohmanら、PNAS USA ８５、８９９８−９００２（１
９８８）を参照のこと）に基づく方法がある。ＭarathonTM法（Clontech Labora
tories Inc.）に例示される当該方法の最近の変法は、例えば、より長いｃＤＮ
Ａの検索を有意に簡単にしている。MarathonTM法において、ｃＤＮＡは選択組織
から抽出されたｍＲＮＡから調製され、各末端に「アダプター」配列が連結され
る。次いで、遺伝子特異的かつアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマー
を用いて核酸増幅（ＰＣＲ）を行ってＤＮＡの「失われた」５’末端を増幅する
。次いで、「ネステッド」プライマー、すなわち、増幅生成物の範囲ににアニー
ルするように設計されたプライマー（典型的には、アダプター配列中のさらなる
３’にアニールするアダプター特異的プライマーならびに選択された遺伝子配列
中のさらなる５’にアニールする遺伝子特異的プライマー）を用いてＰＣＲ反応
を繰り返す。次いで、この反応の生成物をＤＮＡ配列決定により分析し、次いで
、存在しているＤＮＡに生成物を直接結合して完全配列を得ること、あるいは５
’プライマーの設計に関する新たな配列の情報を用いて別個の全長ＰＣＲを行う
ことにより、全長のＤＮＡを構築する。
【００３６】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本明細書においてポリヌク
レオチド分析に関してさらに説明するように、例えば、疾患、特にヒトの疾患に
対する治療および診断の発見のための研究試薬および研究材料として用いること
ができる。 表１（配列番号１または２）の配列に由来するオリゴヌクレオチドである本発
明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の方法に使用できるが、好ましくはＰ
ＣＲに使用し、本明細書で同定したポリヌクレオチドが全体として、または部分
的に感染組織において細菌中で転写されるか否か測定する。そのような配列はま
た、病原体が達した感染の段階およびタイプの診断においても有用性がある。 また、本発明は、成熟蛋白に、さらなるアミノまたはカルボキシ末端アミノ酸
が加わるか、成熟ポリペプチドの内部にアミノ酸が加わった（例えば、成熟形態
が一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）ポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドを提供する。このような配列は、とりわけ、前駆体から成熟形態への蛋
白のプロセッシングにおいて役割を果たし、蛋白を運び、蛋白の半減期を長くし
たり、短くしたり、あるいは分析または生産のための蛋白の取り扱いを容易にす
ることができる。インビボで一般的なように、該付加アミノ酸は細胞酵素により
成熟蛋白からプロセッシングにより除かれる。
【００３７】 本発明の各ポリヌクレオチドおよび全ポリヌクレオチドについて、それに相捕
的なポリヌクレオチドが提供される。これらの相捕的ポリヌクレオチドが、相捕
的である各ポリヌクレオチドに対して十分に相捕的であることが好ましい。 一またはそれ以上のプロ配列に融合したポリペプチドの成熟形態を有する前駆
体蛋白は該ポリペプチドの不活性形でもよい。プロ配列がそのような不活性前駆
体から除かれると、一般に活性化される。プロ配列のいくらかまたは全体を、活
性化の前に除去できる。一般に、そのような前駆体はプロ蛋白と称される。 理解されているように、読み枠によりコードされるポリペプチド全体が活性に
必要でないことも多い。したがって、分子生物学においては、Ｎ−末端およびＣ
−末端欠失実験で活性に必要な一次構造の境界の地図作成を行うことが慣用的操
作となる。これらの実験は、コーディング核酸配列を切断するのに、エキソヌク
レアーゼ消化または都合のよい制限部位を利用する。例えば、Promega（マジソ
ン、ＷＩ）は欠失産物が容易に分析されるように設計されたエキソヌクレアーゼ
ＩＩＩ（ｗｗｗ.comで利用しうるプロトコル）を使用する。その消化された末端
は、読み枠を保存するのに必要な程度にまで（例えば、合成リンカーにライゲー
トすることで）修復することができる。このように、配列番号１の核酸は、酵素
、結合または抗体誘発活性などの活性を得るのに十分な配列番号２の連続的フラ
グメントを容易に提供する。配列番号２のかかるフラグメントをコード化する核
酸配列および本明細書に記載されているようなその変種は、本発明の範囲内にあ
り、本発明に従ってコードされるポリペプチドである。
【００３８】 要するに、本発明のポリヌクレオチドは成熟蛋白、リーダー配列の加わった成
熟蛋白（プレ蛋白とも称される）、プレ蛋白のリーダー配列ではない１またはそ
れ以上のプロ配列を有する成熟蛋白の前駆体、またはリーダー配列と、一般に、
ポリペプチドの活性な成熟形態を生成するプロセッシング工程の間に除去される
１またはそれ以上のプロ配列を有するプロ蛋白の前駆体であるプレプロ蛋白をコ
ードする。
【００３９】 ベクター、宿主細胞、発現系 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクター
で遺伝子操作される宿主細胞および組換え技術による本発明のポリペプチドの製
造に関する。さらに無細胞翻訳系を用い、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを
使用してかかる蛋白を製造することができる。 本発明の組み換えポリペプチドを、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞か
ら、当業者によく知られた方法により製造してもよい。したがって、さらなる態
様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現系、かかる発現系
で遺伝子操作された宿主細胞、ならびに組み換え法による本発明のポリペプチド
の製造に関する。
【００４０】 組換え体産生のために、宿主細胞を遺伝子操作し、発現系もしくはそれらの一
部、または本発明のポリヌクレオチドを取り込むことができる。ポリヌクレオチ
ドの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−
デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジ
ェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション
、トランスダクション、スクレープ・ローディング、弾道導入および感染のよう
な、Davisら、BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY（１９８６）およびSambroo
kら、MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，2nd Ed. Cold Spring Harbor
Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N.Y.（１９８９）のごとき複数の標準
的研究室マニュアルに記載されている方法によって行うことができる。
【００４１】 適当な宿主の代表例は、レンサ球菌（streptococcus）、ブドウ球菌（staphyl
ococcus）、腸球菌（enterococcus）、大腸菌（E.coli）、ストレプトマイセス
（streptomyces）、シアノバクテリア（cyanpobacteria）、枯草菌（Bacillus s
ubtilis）およびストレプトコッカス・ニュモニエ（Streptococcus pneumoniae
）のごとき細菌細胞；酵母、クルベロミセス（Kluveromyces）、サッカロミセス
（Saccharomyces）の細胞のごとき真菌細胞、担子菌、カンジダ・アルビカンス
（Candida albicans）およびアスペルギルス（Aspergillus）；ドロソフィラ（D
rosophila）S2およびスポドプテラ（Spodoptera）Sf9細胞のごとき昆虫細胞；CH
O、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293、CV-1およびボーウェス（Bowes）メラノー
マ細胞のごとき動物細胞；および裸子植物または被子植物のごとき植物細胞を包
含する。
【００４２】 本発明のポリペプチドを製造するために非常に多様な発現系を使用することが
できる。かかるベクターは、とりわけ、染色体、エピソームおよびウイルス由来
のベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランス
ポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント
由来、バキュロウイルス、ＳＶ４０のごときパポバウイルス、ワクシニアウイル
ス、アデノウイルス、ニワトリポックスウイルス、偽狂犬病ウイルス、ピコルナ
ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルス由来のベクター、およびコスミ
ドおよびファージミドなどのプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝因子由
来のベクターのごとき、それらの組み合わせに由来するベクターを包含する。発
現系構築物は、発現を制御ならびに引き起こす調節領域を有していてもよい。一
般に、宿主においてポリヌクレオチドを維持、増幅または発現し、および／また
はポリペプチドを発現するのに適した系またはベクターを、この点にて発現に使
用してもよい。適当なＤＮＡ配列を、例えば、Sambrookら、MOLECULAR CLONING
，A LABORATORY MANUAL（前掲）に示されている技術のごとき、種々のよく知ら
れた慣用的技術のいずれかによって、発現系に挿入してもよい。
【００４３】 真核細胞の組み換え発現系において、翻訳された蛋白を小胞体内腔、周辺腔ま
たは細胞外環境に分泌するために、適当な分泌シグナルを発現されるポリペプチ
ドに挿入してもよい。これらのシグナルは、ポリペプチドに固有のものであって
もよく、または異種のシグナルであってもよい。 本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、
アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグ
ラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフ
ィーを包含する、よく知られた方法によって組換え細胞培養物から回収および精
製できる。最も好ましくは、高品質液体クロマトグラフィーが精製に使用される
。ポリペプチドが単離および／または精製の間に変性する場合、蛋白を再生する
ための周知方法を用いて、再び活性な立体配座とすることができる。
【００４４】 診断、予後、セロタイピングおよび変異アッセイ また本発明は、診断試薬として使用するための本発明のｍａｐポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの使用にも関する。真核生物、とりわけ哺乳動物、特にヒ
トにおけるｍａｐポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの検出は、疾患
の診断、疾病の段階の決定、または薬剤に対する感染生物の応答に関する診断方
法を提供するであろう。ｍａｐ遺伝子または蛋白を含む生物に感染、または感染
の可能性がある真核生物、とりわけ哺乳動物、特にヒトを、種々のよく知られた
方法ならびに本明細書記載の方法により核酸レベルまたはアミノ酸レベルで検出
できる。
【００４５】 予後、診断または他の分析に供するポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、
感染していると思われる個体および／または感染した個体の身体材料から得られ
る。これらの源由来のポリヌクレオチド、特にＤＮＡまたはＲＮＡを検出に直接
用いてもよく、あるいは分析に付す前にＰＣＲもしくはその他の増幅法を用いる
ことにより酵素的に増幅できる。ＲＮＡ（詳細にはｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡおよび
ゲノムＤＮＡも同じようして使用できる。増幅を用いると、個体に存在する感染
または定住生物の種および株を、該生物の選択されたポリヌクレオチドの遺伝子
型の分析により特徴付けることができる。関連する生物、好ましくは同じ属の異
なる種または同じ種の異なる系統より選択された対照配列の遺伝子型と比較した
増幅生成物の大きさの変化により、欠失および挿入を検出できる。点突然変異は
、増幅ＤＮＡを標識したｍａｐポリヌクレオチド配列にハイブリダイズさせるこ
とにより同定できる。完全にまたは有意に対合した配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡ
についての、各々、ＤＮaseまたはＲＮase消化により、または融解温度または再
生速度の差により、不完全にまたはより有意に誤対合した二重らせんと区別でき
る。ポリヌクレオチド配列の差はまた、対照配列と比較した場合の、ゲル中のポ
リヌクレオチドフラグメントの電気泳動の移動度の変化により、または直接的な
ＤＮＡの配列決定により検出できる。これは変性剤と共にまたは無しで行うこと
ができる。ポリヌクレオチドの差異はまた、直接的ＤＮＡまあたはＲＮＡ配列決
定により検出することもできる。例えば、Myersら、Science，２３０：１２４２
（１９８５）を参照のこと。特異的な位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ
保護アッセイ、例えば、ＲＮase、Ｖ１およびＳ１保護または化学的切断法によ
っても明らかにすることができる。例えば、Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,US
A，８５：４３９７−４４０１（１９８５）を参照のこと。
【００４６】 もう１つの具体例において、ｍａｐヌクレオチド配列またはそのフラグメント
を含むオリゴヌクレオチドプローブの一群を構築して、例えば遺伝学的変異、セ
ロタイプ、分類学的分類または同定のための効果的なスクリーニングを行うこと
ができる。アレイ法は周知であり、適応範囲が広く、遺伝子発現、遺伝学的連関
、および遺伝学的変化を包含する分子遺伝学における種々の問題を解決するため
に用いられる（例えば、Cheeら、Science ２７４：６１０（１９９６）を参照の
こと）。
【００４７】 よって、もう１つの態様において、本発明は、（ａ）本発明のポリヌクレオチ
ド、好ましくは配列番号１のヌクレオチド配列、またはそのフラグメント；（ｂ
）（ａ）のヌクレオチド配列に対して相捕的なヌクレオチド配列；（ｃ）本発明
のポリペプチド、好ましくは配列番号２のポリペプチド、またはそのフラグメン
ト；あるいは（ｄ）本発明のポリペプチドに対する抗体、好ましくは配列番号２
のポリペプチドに対する抗体を含む診断キットに関する。かかるキットにおいて
、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が重要な成分を含んでいてもよいことが
理解されよう。かかるキットは、とりわけ疾病または疾病に対する感受性につい
ての診断において有用である。
【００４８】 また本発明は、診断試薬としての本発明のポリヌクレオチドの使用にも関する
。疾病または発病に関連した本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１
のポリヌクレオチドの変異形態の検出は、ポリヌクレオチドの発現低下、発現過
剰または発現の変化により生じる疾病の診断、疾病経過の予後、疾病段階の決定
、または疾病に対する感受性の決定に加えて用いる診断用道具、またはかかる診
断等の決定のための道具を提供するであろう。かかるポリヌクレオチドにおける
変異を有する生物、特に感染生物を、本明細書記載のいずれかの場所で説明する
ような種々の方法によりポリヌクレオチドレベルで検出してもよい。
【００４９】 第１の表現型を有する生物と、異なる第２の表現型を有する生物との間のポリ
ヌクレオチドおよび／またはポリペプチド配列の相違を調べることもできる。第
１の表現型を有する生物のいくつかまたは全部に変異が観察されるが、第２の表
現型を有する生物には変異が観察されない場合、変異は第１の表現型の発生原因
である可能性がある。 本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド中に変異または多型性
（対立遺伝子変異）を担持する生物由来の細胞を、例えばセロタイピングを可能
にするような種々の技術によりポリヌクレオチドまたはポリペプチドレベルで検
出できる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＲＮＡにおける変異を検出することが
できる。ＲＴ−ＰＣＲを自動検出系、例えばＧeneＳcan等と組み合わせて用いる
のが特に好ましい。ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡもまた同じ目的でＰＣ
Ｒに用いることができる。一例として、ｍａｐポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドに相補的なＰＣＲプライマーを用いて変異を同定および分析すること
ができる。さらに本発明は、５’および／または３’末端から１、２、３または
４個のヌクレオチドが除去されたプライマーを提供する。特に、これらのプライ
マーを、個体由来の試料、例えば身体材料から単離されたｍａｐＤＮＡおよび／
またはＲＮＡの増幅に用いることができる。プライマーを用いて感染個体から単
離されたポリヌクレオチドを増幅して、そのポリヌクレオチドをポリヌクレオチ
ド配列研究のための種々の方法に供してもよい。このようにして、ポリヌクレオ
チド配列中の変異を検出し、変異を用いて感染または感染段階もしくは経路を診
断および／または予後を行い、あるいは感染物のセロタイプおよび／または分類
を行ってもよい。
【００５０】 本発明はさらに、疾患、好ましくは細菌感染、さらに好ましくはストレプトコ
ッカス・ニュモニエによる感染の診断方法であって、表１［配列番号１］の配列
を有するポリヌクレオチドの発現レベルの上昇を、個体由来のサンプル、例えば
、肉体物質から決定することを特徴とする方法を提供する。ｍａｐポリヌクレオ
チドの発現の増加または低下は、ポリヌクレオチドの定量法として当該分野で周
知の方法である任意の方法、例えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮase保護
、ノーザンブロッティング、スペクトロメトリーおよびその他のハイブリダイゼ
ーション法を用いて測定できる。
【００５１】 加えて、正常対照組織サンプルと比較してｍａｐポリペプチドの過剰発現を検
出するための本発明による診断アッセイを用いて、例えば感染の存在を検出する
ことができる。宿主由来のサンプル中のｍａｐポリペプチドのレベルを決定する
ために用いることができるアッセイ技法は、当業者に周知である。このようなア
ッセイ法は、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウェスタンブロット
分析、抗体サンドイッチアッセイ、抗体検出およびＥＬＩＳＡアッセイを包含す
る。
【００５２】 アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセイおよび分子 さらに、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを用いて、例えば、細
胞、無細胞調製物、化学的ライブラリー、および天然産物の混合物中の、小分子
基質とリガンドとの結合を評価することもできる。これらの基質およびリガンド
は天然の基質およびリガンドでよく、または構造上もしくは機能上の模倣物でも
よい。例えば、Coliganら、Current Protocols in Immunology １（２）：第５
章（１９９１）を参照のこと。
【００５３】 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは多くの生物学的機能に関与し
ており、該機能には多くの疾病状態、詳細には上記疾病が包含される。それゆえ
、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの機能を作動（例えば、刺激）または拮
抗（例えば、阻害）する化合物を同定するためのスクリーニング法を工夫するこ
とが望ましい。したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明のポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドならびに関連ポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ドの機能を作動または拮抗する化合物を同定するためのスクリーニング方法を提
供する。一般的には、アゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、阻害剤）を上
記疾病の治療および予防のために用いてもよい。種々の源、例えば、細胞、無細
胞調製物、化学ライブラリーおよび天然産物の混合物から化合物を同定できる。
そのようにして同定されたかかるアゴニストおよびアンタゴニストは、天然また
は修飾基質、リガンド、受容体、酵素等であってもよく、場合によってはｍａｐ
ポリペプチドおよびポリヌクレオチド、あるいはそれらの構造上または機能上の
模倣物であってもよい（Coliganら、Current Protocols in Immunology １（２
）：第５章（１９９１）を参照のこと）。
【００５４】 スクリーニング法は、単に候補化合物のポリペプチドまたはポリヌクレオチド
への、あるいはポリペプチドまたはポリヌクレオチドを有する細胞もしくは膜へ
の、あるいはポリペプチド含む融合蛋白への結合を、直接的または間接的に候補
化合物に結合した標識により測定するものであってもよい。別法として、スクリ
ーニング法は標識競争物質との競争を用いるものであってもよい。さらに、これ
らのスクリーニング法は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む細胞に適
した検出系を用いて、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性化または阻害
により生じるシグナルを候補化合物が発生させるかどうかを試験するものであっ
てもよい。一般的には、既知アゴニスト存在下で活性化の阻害剤をアッセイし、
次いで、候補化合物存在下でのアゴニストによる活性化の効果を観察する。構成
的に活性のあるポリペプチドおよび／または構成的に発現されるポリペプチドお
よびポリヌクレオチドを、アゴニストまたはアンタゴニストの不存在下、アゴニ
ストの効果を逆転させる物質を探すスクリーニング法に用いてもよく、候補化合
物がポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性化を阻害するかどうかを試験す
ることによる。さらに、スクリーニング法は、単に、候補化合物を本発明のポリ
ペプチドまたはポリヌクレオチドを含有する溶液と混合して混合物を作成し、混
合物中のｍａｐポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド活性を測定し、次
いで、混合物中のｍａｐポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド活性を標
準に対して比較することを特徴とする。Ｆｃ部分および上記ｍａｐポリペプチド
から作成されるような融合蛋白を用いて高処理量アッセイを行って本発明のポリ
ペプチドのアンタゴニストならびに系統分類的および／または機能的に関連した
ポリペプチドを同定することもできる（D.Bennettら、J. Mol. Recognition, ８
：５２−５８（１９９５）；およびK.Johansonら、J. Biol. Chem. ２７０（１
６）：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）。
【００５５】 本発明のポリペプチドと結合および／または相互作用するポリヌクレオチド、
ポリペプチドおよび抗体を用いて、細胞中のｍＲＮＡおよび／またはポリペプチ
ドの精製に対する添加化合物の影響を検出するためのスクリーニング方法を組み
立ててもよい。例えば、ＥＬＩＳＡアッセイを構築して、モノクローナルおよび
ポリクローナル抗体を用いてポリペプチドの分泌または細胞結合レベルを、当該
分野において標準的な方法により測定してもよい。これにより、適当に操作され
た細胞または組織からのポリペプチドの生成を阻害または促進しうる作用剤（そ
れぞれ、アンタゴニストまたはアゴニストという）を見いだすことができる。
【００５６】 本発明はまた、ｍａｐポリペプチドまたはポリヌクレオチドの作用、特に静菌
および／または殺菌性である化合物の作用を亢進（アゴニスト）または遮断（ア
ンタゴニスト）する化合物を同定するための化合物のスクリーニング方法を提供
する。スクリーニング方法にはハイスループット技術が包含される。例えば、ア
ゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするために、ｍａｐポリペプチ
ドおよびかかるポリペプチドの標識基質またはリガンドを含む合成反応混合物、
膜、細胞エンベロープもしくは細胞壁のごとき細胞コンパートメント、またはそ
れらのいずれかの調製物を、ｍａｐアゴニストまたはアンタゴニストであるかも
しれない候補分子の存在下または不在下でインキュベートする。候補分子がｍａ
ｐポリペプチドに作動または拮抗する能力は、標識リガンドの結合の低下または
かかる基質からの生成物の生成低下に反映される。結合しても影響を及ぼさない
分子、すなわちｍａｐポリペプチドの効果を誘起しない分子は、ほとんどの場合
、良好なアンタゴニストであろう。よく結合し、基質からの生成物の生成速度を
高め、シグナルトランスダクションを増大させ、あるいは化学チャンネル活性を
増大させる分子はアゴニストである。基質からの生成物の生成速度、シグナルト
ランスダクション、あるいは化学チャンネル活性のレベルの検出はリポーターシ
ステムを用いることにより強調できる。この点に関して有用なリポーターシステ
ムは、生成物に転換される比色標識基質、ｍａｐポリヌクレオチドまたはポリペ
プチド活性の変化に応答するリポーター遺伝子、および当該分野で公知の結合ア
ッセイを包含するが、これらに限定するものではない。
【００５７】 本発明のポリペプチドを用いて膜結合または可溶性受容体を同定してもよく、
かかるポリペプチドは当該分野において標準的な受容体結合法により同定される
。これらの方法は、リガンド結合およびクロスリンキングアッセイを包含するが
、これらに限らない。これらの方法において、ポリペプチドを放射性標識（例え
ば125Ｉ）、化学修飾（例えばビオチン化）または検出および精製に適したペプ
チド配列に融合され、推定上の受容体（例えば細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽
出物、身体材料）の源とともにインキュベーションする。他の方法は表面プラス
モン共鳴および分光学的法法を包含する。これらのスクリーニング方法を用いて
、ポリペプチドのその受容体への結合と競争するポリペプチドのアゴニストおよ
びアンタゴニストを同定してもよい。かかるアッセイを行うための標準的方法は
当該分野においてよく知られている。
【００５８】 蛍光タグを付した分子に関する蛍光分極値は回転相関時間（rotational corre
lation time）または回転速度（tumbling rate）に依存する。別のｍａｐポリペ
プチドもしくは他のポリペプチドと結合したｍａｐポリペプチドのごとき蛋白複
合体であって蛍光標識分子を含むように標識されているものは、蛍光標識された
モノマー蛋白よりも高い分極値を有するであろう。この方法を用いて、ポリペプ
チド複合体を分裂させる小型分子を特徴づけるのが好ましい。 蛍光エネルギー転移を用いて、ｍａｐポリペプチドダイマー、トリマー、テト
ラマー、または高次構造、あるいは別のポリペプチドに結合したｍａｐポリペプ
チドにより形成される構造の形成を妨害する小型分子を特徴づけてもよい。ｍａ
ｐポリペプチドをドナーおよびアクセプター両方の蛍光発色団で標識することが
できる。２種の標識種を混合し、ドナー蛍光発色団を励起したならば、アクセプ
ターの蛍光を観察することにより蛍光エネルギー転移を検出することができる。
ダイマー化をブロックする化合物は蛍光エネルギー転移を阻害するであろう。
【００５９】 表面プラスモン共鳴を用いて、ｍａｐポリペプチドの自己結合ならびにｍａｐ
ポリペプチドと別のポリペプチドもしくは小型分子との結合に対する小型分子の
影響をモニターすることができる。低いサイト密度（site density）においてｍ
ａｐポリペプチドをセンサーチップにカップリングさせて、共有結合分子がモノ
マー性となるようにすることができる。次いで、溶液蛋白をｍａｐポリペプチド
被覆表面上に通し、局所屈折率の変化により生じる共鳴角の変化をモニターする
ことにより特異的結合をリアルタイムで検出することができる。この方法を用い
て、ｍａｐポリペプチドの自己結合ならびにｍａｐポリペプチドと別のポリペプ
チドもしくは小型分子との結合に関する反応速度および平衡結合定数に対する小
型分子の影響を特徴づけることができる。
【００６０】 シンチレーション近接アッセイを用いて、ｍａｐポリペプチドと別のｍａｐポ
リペプチドもしくは別のポリペプチドとの結合の間の相互作用を特徴づけること
ができる。ｍａｐポリペプチドをシンチレーション充填ビーズにカップリングさ
せることができる。放射性標識ｍａｐポリペプチドの添加は結合を生じ、放射性
源分子はシンチレーション液に極めて近接した状態となる。よって、ｍａｐポリ
ペプチドの結合によりシグナルが放出され、ｍａｐポリペプチドの自己結合また
はｍａｐポリペプチドと別のポリペプチドもしくは小型分子との結合を妨害する
化合物はシグナルを減少させるであろう。
【００６１】 本発明の他の具体例において、本発明のポリペプチドおよびまたはポリヌクレ
オチドと結合あるいは相互作用して、その活性または発現を阻害または活性化す
る化合物を同定する方法であって、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチ
ドへの結合、あるいはポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドと化合物と
の他の相互作用を可能にする条件下で本発明のポリペプチドおよび／またはポリ
ヌクレオチドをスクリーニングすべき化合物と接触させて、化合物との結合ある
いは他の相互作用を評価し（該方法において、好ましくは、かかる結合または相
互作用はポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドと化合物との結合あるい
は相互作用に応答した検出可能シグナルを提供しうる第２の化合物に関連したも
のである）、次いで、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドと化合物と
の結合あるいは相互作用から生じるシグナルの存在または不存在を検出すること
により、化合物がポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドと結合あるいは
相互作用し、その活性または発現を活性化または阻害するかどうかを決定する方
法が提供される。
【００６２】 ｍａｐアゴニストのアッセイのもう１つの例は、競争阻害アッセイに適した条
件下で、ｍａｐおよび潜在的なアゴニストを、ｍａｐ結合分子、組換えｍａｐ結
合分子、天然基質もしくはリガンド、または基質もしくはリガンド模倣物と混合
する、競合アッセイである。ｍａｐ分子を例えば放射活性または比色化合物によ
り標識し、結合分子に結合した、あるいは生成物に変換したｍａｐ分子の数を正
確に決定して、潜在的なアンタゴニストの効果を評価できる。
【００６３】 本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを、ポリペプチドおよ
び／またはポリヌクレオチドのアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の構造
に基づく設計方法に用いてもよいことが、当業者に容易に理解されよう。該方法
は：（ａ）最初にポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド、またはそれら
の複合体の３次元構造を決定し、（ｂ）アゴニストまたはアンタゴニストの反応
部位、結合部位またはモチーフである可能性のある部位の３次元構造を推定し、
（ｃ）推定された反応部位、結合部位および／またはモチーフと結合または反応
すると予想される候補化合物を合成し、次いで（ｄ）候補化合物が実際にアゴニ
スト、アンタゴニストまたは阻害剤であるかどうかを試験する、ことを含む。 これが繰り返しプロセスであり、自動およびコンピューター制御工程を用いて
この繰り返しプロセスを行ってもよいことが、さらに理解されよう。
【００６４】 さらなる態様において、本発明は、例えばｍａｐポリペプチドおよび／または
ポリヌクレオチドの過剰発現、発現不足、上昇した活性、または低下した活性に
関連した疾病のごとき異常な状態の治療方法を提供する。 ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの発現および／または活性が過
剰な場合、いくつかの方法を用いることができる。１の方法は、ポリペプチドお
よび／またはポリヌクレオチドの機能および／または発現を阻害（例えば、リガ
ンド、基質、受容体、酵素等の結合をブロックすることにより、あるいは２次的
シグナルを阻害することにより）するに有効な量の上記阻害化合物（アンタゴニ
スト）を医薬上許容される担体とともに対象に投与し、そのことにより異常な症
状を改善することを含む。もう１つの方法において、やはり内在性ポリペプチド
および／またはポリヌクレオチドと競争してリガンド、基質、受容体、酵素等に
結合することができる可溶性形態のポリペプチドを投与してもよい。かかる競争
物質の典型例はｍａｐポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドのフラグメ
ントを包含する。
【００６５】 さらにもう１つのアプローチにおいて、発現ブロッキング法を用いて内在性ｍ
ａｐポリペプチドをコードしている遺伝子の発現を阻害することができる。この
ブロッキングは遺伝子発現のいずれの工程を標的としてもよいが、好ましくは、
転写および／または翻訳を標的とする。この種の既知方法の例は、体内で生じる
かまたは別個に投与されるアンチセンス配列の使用を包含する（例えば、Oligod
eoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, B
occa Raton, FL（１９８８）中O'Connor、J. Neurochem（１９９１）５６：５６
０を参照のこと）。別法として、遺伝子とともに三重らせんを形成するオリゴヌ
クレオチドを提供してもよい。例えば、Leeら、Nucleic Acids Res（１９７９）
６：３０７３；Cooneyら、Science（１９８８）２４１：４５；Dervanら、Scien
ce（１９９１）２５１：１３６０を参照のこと。これらのオリゴヌクレオチドは
それ自体投与することができ、あるいは重要部分のオリゴマーをインビボで発現
させることもできる。
【００６６】 本明細書で得られるポリヌクレオチド配列は、各々、抗菌化合物の発見および
開発に用いることができる。発現でコードされた蛋白は、抗菌薬物をスクリーニ
ングするための標的として用いることができる。加えて、コードされた蛋白のア
ミノ末端領域をコードするポリヌクレオチド配列あるいはシャイン・ダルガノま
たは他の個々のｍＲＮＡの翻訳容易化配列を用いて、目的とするコーディング配
列の発現を調節するアンチセンス配列を構築することができる。
【００６７】 本発明はまた、感染の続発症に関与する、病原体および哺乳動物宿主間の最初
の物理的相互作用を妨害するための、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド
、アゴニストまたはアンタゴニストの使用を提供する。特に本発明の分子は、細
菌、特にグラム陽性菌が内在装置上の哺乳動物細胞外マトリックス蛋白、または
創傷部の細胞外マトリックス蛋白に付着することを防御するために；真核生物、
好ましくは哺乳動物細胞外マトリックス蛋白と組織損傷を媒介する細菌性ｍａｐ
蛋白との間の細菌付着を遮断するために；内在装置の埋め込みまたは他の外科的
手技以外により開始した感染における病因の通常の進行を遮断するために使用す
ることができる。
【００６８】 本発明のさらに別の態様によれば、ｍａｐのアゴニストおよびアンタゴニスト
、好ましくは静菌性または殺菌性アゴニストおよびアンタゴニストが提供される
。 本発明のアンタゴニストおよびアゴニストを用いて、例えば、疾患を阻害し、
治療することができる。 ヘリコバクター・ピロリ（Ｈelicobacter pylori）（本明細書中、エッチ・ピ
ロリともいう）菌は、胃癌、潰瘍、胃炎を発病している世界中の人々の３分の１
以上の胃に感染している（国際癌研究機関（International Agency for Researc
h on Cancer）（１９９４）Schistomoses，Liver Flukes and Helicobacter Pyl
ori（International Agency for Research on Cancer，Lyon，France；http：／
／www．uicc．ch／ecp／ecp２９０４．htm））。さらに、この国際癌研究機関は
、最近になって、ヘリコバクター・ピロリと胃腺癌の間の因果関係を認識し、そ
の細菌をグループＩ（限定的）発癌物質と分類した。本発明により提供されるま
たは当該分野にて知られているスクリーニング法を用いて見出される本発明の好
ましい抗菌化合物（ｍａｐポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドのアゴ
ニストおよびアンタゴニスト）、特に狭スペクトルの抗生物質は、ヘリコバクタ
ー・ピロリ感染の治療に有用である。このような治療はヘリコバクター・ピロリ
誘発性癌、例えば胃腸癌の出現を減少させる。かかる治療はまた胃潰瘍および胃
炎も予防、阻害および／または治癒する。
【００６９】 本明細書において引用したすべての刊行物および引用文献（特許および特許出
願に限らない）は、たとえ、個々の刊行物または引用文献が具体的および個別的
に完全に記載されている場合に出典明示により本明細書の一部とするとされてい
ても、出典明示によりその内容を本明細書の一部とする。本願が優先権を主張す
るいずれの特許出願もまた出典明示により本明細書の一部とする。
【００７０】 用語 本明細書中で頻繁に使用される特定の用語を、その理解を容易にするために以
下に定義する。 「肉体材料（複数でも可）」とは、個体または生物由来の材料を意味し、骨、
血液、血清、脳脊髄液、精液、唾液、筋肉、軟骨、器官組織、皮膚、尿、糞便ま
たは生検材料のごとき細胞、組織および排泄物等を包含するが、これらに限定さ
れるものではない。 「疾病（複数でも可）」は、例えば、中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎
、静脈洞炎、胸腔蓄膿および心内膜炎、とりわけ、例えば髄液の感染などの髄膜
炎を含む、細菌による感染により引き起こされる疾病、またはかかる細菌による
感染に関連した疾病を意味する。 「宿主細胞（複数でも可）」は外来性ポリヌクレオチド配列によって導入（例
えば、形質転換またはトランスフェクト）された、あるいは導入能（形質転換ま
たはトランスフェクション能）を有する細胞である。
【００７１】 「同一性」は、当該分野で公知であり、配列の比較で決定されるような、２ま
たはそれ以上のポリペプチド配列あるいは２またはそれ以上のポリヌクレオチド
配列の間の関係である。また、当該分野では、「同一性」は、場合によっては、
配列の鎖間の対合によって決定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオ
チド配列間の配列の関連性の度合を意味する。「同一性」は、Computational Mo
lecular Biology，Lesk，A.M.編，Oxford University Press，New York，１９８
８；Biocomputing：Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編，Academ
ic Press，New York，１９９３；Computer Analysis of Sequence Data，Part I
，Griffin, A.M.およびGriffin, H.G.編，Humana Press，New Jersey，１９９４
；Sequence Analysis in Molecular Biology，Von Heinje,G．Academic Press，
１９８７；およびSequence Analysis Primer，Gribskov,M.およびDevereux, J.
編，M Stockton Press，New York，１９９１；およびCarllio,HおよびLipman,D.
，SIAM J.Applied Math., ４８：１０７３（１９８８）に記載されている方法（
これらに限らない）を含め、公知方法により容易に決定することができる。同一
性を決定する好ましい方法は、テストする配列間に最大の対合を与えるように設
計されている。そのうえ、同一性を測定する方法は公に入手できるコンピュータ
・プログラムに集成されている。２つの配列の間の同一性を測定する好ましいコ
ンピュータ・プログラム方法は、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devere
ux,J.ら，Nucleic Acids Research（１９８４）１２（１）：３８７）、BLASTP
、BLASTNおよびFASTA（Atschul,S. F.ら, J.Molec.Biol.（１９９０）２１５：
４０３−４１０）を包含するが、これに限らない。BLAST XプログラムはNCBIお
よび他の源（BLAST Manual，Altshul, S．ら，NCBI NLM NIH Bethesda，MD２０
８９４；Altschul,S．ら，J．Mol．Biol.，２１５：４０３−４１０（１９９０
））から公に入手できる。また、周知のスミス・ウォーターマン（Smith Waterm
an)アルゴリズムを用いて同一性を決定することもできる。
【００７２】 ポリペプチド配列の比較のためのパラメーターは以下のものを包含する： １）アルゴリズム：NeedlemanおよびWunsch、J.Mol.Biol. ４８：４４３−４５
３（１９７０） 比較マトリックス：HentikoffおよびHentikoff、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.８９
：１０９１５−１０９１９（１９９２）からのＢＬＯＳＳＵＭ６２ ギャップペナルティー：１２ ギャップ長ペナルティー：４ これらのパラメーターに関して有用なプログラムは、Genetics Computer Grou
p, Madison WI.から「ギャップ」プログラムとして公に利用できる。上記パラメ
ーターはペプチド比較のための省略時パラメーターである（エンドギャップにつ
いてペナルティーを伴わない）。 ポリヌクレオチド比較のためのパラメーターは下記のものを包含する： １）アルゴリズム：NeedlemanおよびWunsch, J.Mol.Biol. ４８：４４３−４５
３（１９７０） 比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０ ギャップペナルティー：５０ ギャップ長ペナルティー：３ これらのパラメーターに関して有用なプログラムは、Genetics Computer Grou
p, Madison WI.から「ギャップ」プログラムとして公に利用できる。上記パラメ
ーターは核酸比較のための省略時パラメーターである。
【００７３】 ポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての「同一性」に関する好ましい意
味は、下記（１）および（２）に示される。 （１）さらにポリヌクレオチドの具体例は、配列番号１の対照配列に対して少な
くとも９５、９７または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む
単離ポリヌクレオチド配列を包含し、そのポリヌクレオチド配列は配列番号１の
対照配列と同一であってもよく、あるいは対照配列と比較してある程度の数まで
のヌクレオチドの変化を有していてもよい。かかる変化は、少なくとも１個のヌ
クレオチドの欠失、置換（トランジションおよびトランスバージョンを包含）ま
たは挿入からなる群より選択され、該変化は対照ヌクレオチド配列の５’または
３’末端の位置あるいはそれらの末端位置の間の位置において、対照配列中のヌ
クレオチドにおいて個々にまたは散在して、あるいは対照配列中の１またはそれ
以上の連続した群として生じてもよい。配列番号１中の全ヌクレオチド数と個々
の同一性パーセント値（１００で割ったもの）とをかけて、その積を配列番号１
中の全ヌクレオチド数から差し引くことによりヌクレオチド変化の数を決定する
。これを下式により説明する： ｎn≦ｘn−（ｘn・ｙ） 式中、ｎnはヌクレオチド変化の数であり、ｘnは配列番号１中の全ヌクレオチド
数であり、ｙは、例えば９５％ならば０.９５であり、９７％ならば０.９７であ
り、１００％ならば１.００であり、・は積の演算子であり、ｘnとｙとの整数で
ない積は切り捨てにより最も近い整数とした後、ｘnから差し引く。配列番号２
のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の変化は、好ましくはコ
ーディング配列中のナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト変異を引き起
こす可能性があり、それゆえ、かかる変化に随伴してポリヌクレオチドによりコ
ードされているポリペプチドが変化する。
【００７４】 （２）さらにポリペプチドの具体例は、配列番号２のポリペプチド対照配列に対
して少なくとも９５、９７または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む
単離ポリペプチドを包含し、該ポリペプチド配列は配列番号２の対照配列と同一
であってもよく、あるいは対照配列と比較してある程度の数までのアミノ酸の変
化を有していてもよい。かかる変化は、少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換
（保存的および非保存的置換を包含）または挿入からなる群より選択され、該変
化は対照ポリペプチド配列のアミノまたはカルボキシ末端の位置あるいはそれら
の末端位置の間の位置において、対照配列中のアミノ酸において個々にまたは散
在して、あるいは対照配列中の１またはそれ以上の連続した群として生じてもよ
い。配列番号２中の全アミノ酸数と同一性を示す整数を１００で割った値とをか
けて、その積を配列番号２中の全アミノ酸数から差し引くことによりアミノ酸変
化の数を決定する。これを下式により説明する： ｎa≦ｘa−（ｘa・ｙ） 式中、ｎaはアミノ酸変化数であり、ｘaは配列番号２中の全アミノ酸数であり、
ｙは、例えば９５％ならば０.９５であり、９７％ならば０.９７であり、１００
％ならば１.００であり、・は積の演算子であり、ｘaとｙとの整数でない積は切
り捨てにより最も近い整数とした後、ｘaから差し引く。
【００７５】 「個体（複数でも可）」とは多細胞真核生物を意味し、後生動物類、哺乳動物
、ヤギ類、ウシ類、類人猿、霊長類およびヒトを包含するが、これらに限らない
。 「単離された」とは、「ヒトの手により」、その天然の状態から変えられるこ
と、すなわち、天然物の場合、その本来的な環境から変化または除去あるいは両
方されたことを意味する。例えば、生体に天然に存在するポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態で共存する物質
から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書で用いる
用語としての「単離された」ものである。さらには、形質転換、遺伝的操作によ
り、または他のいずれかの方法により生物に導入されているポリヌクレオチドま
たはポリペプチドは、まだ生物内にあり、その生物が生きているまたは死んでい
るとしても、「単離された」ものである。
【００７６】 「生物（複数でも可）」は、（ｉ）Streptococcus、Staphylococcus、Bordete
lla、Corynebacterium、Mycobacterium、Neisseia、Haemophilus、Actinomyces
、Streptomyces、Nocardia、Enterobacter、Yersinia、Fancisella、Pasturella
、Moraxella、Acinetobacter、Erysipelothrix、Branhamella、Actinobacillus
、Streptobacillus、Listeria、Calymmatobacterium、Brucella、Bacillus、Clo
sterdium、Treponema、Escherichia、Salmonella、Kleibsiella、Vibrio、Prote
us、Erwinia、Borrelia、Leptospira、Spirillum、Campylobacter、Shigella、L
egionella、Pseudomonas、Aeromonas、Rickettsia、Chlamydia、Borreliaおよび
Mycoplasmaである属（これらに限らない）のメンバー、ならびにグループＡのSt
reptococcus、グループＢのStreptococcus、グループＣのStreptococcus、グル
ープＤのStreptococcus、グループＧのStreptococcus、Staphylococcus aureus
、Streptococcus pyrogenes、Streptococcus agalactiae、Streptococcus faeca
lis、Streptococcus faecium、Streptococcus durans、Neisseria gonorrheae、
Neisseria meningitidis、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidi
s、Corynebacterium diptheriae、Garnella vaginalis、Mycobacterium tubercu
losis、Mycobacterium bovis、Mycobacterium ulcerans、Mycobacterium leprae
、Actinomyces israelli、Listeria monocytogenes、Bordetella pretusis、Bor
detella parapretusis、Bordetella bronchiseptica、Esherichia coli、Shigel
la dysenteriae、Haemophilus influenzae、Haemophilus aegyptius、Haemophil
us parainfluenzae、Haemophilus ducreyi、Bordetella、Salmonella typhi、Ci
trobacter freundii、Proteus mirabilis、Proteus vulgaris、Yersinia pestis
、Klebsiella pneumoniae、Serratia marcessens、Serratia liquefaciens、Vib
rio cholera、Shigella dysenterii、Shigella flexneri、Pseudomonas aerugin
osa、Franscisella tularensis、Brucella abortis、Bacillus anthracis、Baci
llus cereus、Clostridium perfringens、Clostridium tetani、Clostridium bu
tulinum、Treponema pallidum、Rickettsia rickettsiiおよびChlamydia tracho
mitisである種またはグループ（これらに限らない）のメンバーを包含する原核
生物、（ｉｉ）Archaebacter（これに限らない）を包含する古細菌、および（ｉ
ｉｉ）原生動物、真菌類、Saccharomyces、KluveromycesまたはCandida属（これ
らに限らない）のメンバー、およびSaccharomyces cerevisiae、Kluveromyces l
actisまたはCandida albicans種のメンバー（これらに限らない）を包含する単
細胞または糸状真核生物を意味する。
【００７７】 「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、一般に、ポリリボヌクレオチドまた
はポリデオキシリボヌクレオチドのいずれをもいい、それらは非修飾ＲＮＡまた
はＤＮＡ、あるいは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。「ポリヌクレオチ
ド」は、単鎖および二本鎖ＤＮＡ、単鎖および二本鎖領域または単鎖、二本鎖お
よび三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、単鎖および二本鎖ＲＮＡ、単鎖および二
本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、および単鎖またはより典型的には二本鎖または
三本鎖領域または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡおよび
ＲＮＡを含むハイブリッド分子を包含するが、これに限定されない。さらに、本
明細書において用いる「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいは
ＲＮＡおよびＤＮＡの両方からなる三本鎖領域をいう。これらの領域の鎖は同じ
分子からのものでも、異なる分子からのものでもよい。該領域は、これら分子の
一またはそれ以上のすべてを含んでもよいが、より典型的には、分子のいくつか
の領域のみを含む。三本螺旋領域の分子の一つは、しばしば、オリゴヌクレオチ
ドである。本明細書において用いる場合、「ポリヌクレオチド（複数でも可）」
なる用語はまた、一つまたはそれ以上の修飾された塩基を含有する上記ＤＮＡま
たはＲＮＡを包含する。すなわち、安定性または他の理由で修飾された骨格を有
するＤＮＡまたはＲＮＡも、該用語が本明細書で意図するところの「ポリヌクレ
オチド（複数でも可）」である。さらに、イノシンなどの通常でない塩基、また
はトリチル化された塩基などの修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ（２つの例だ
けを示す）も、その用語を本明細書で用いる場合のポリヌクレオチドである。多
種の修飾がＤＮＡおよびＲＮＡになされており、当業者に公知のように多くの有
用な目的に使用されていることが理解されよう。本明細書で用いる「ポリヌクレ
オチド」なる語は、ポリヌクレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝的
に修飾された形態、ならびにウイルスおよび、例えば、単純型細胞および複雑型
細胞などの細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリ
ヌクレオチド（複数でも可）」はまた、しばしばオリゴヌクレオチド（複数でも
可）と称される比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【００７８】 「ポリペプチド（複数でも可）」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合で
互いに結合した２つまたはそれ以上のアミノ酸を含むいずれのペプチドまたは蛋
白をもいう。「ポリペプチド（複数でも可）」は、通常、ペプチド、オリゴペプ
チドまたはオリゴマーと称される短い鎖、および一般に蛋白と称される長い鎖の
両方をいう。ポリペプチドは、遺伝子によりコードされている２０個のアミノ酸
以外のアミノ酸を含有してもよい。「ポリペプチド（複数でも可）」は、プロセ
ッシングおよび他の翻訳後の修飾のごとき自然の工程、または化学修飾技法のい
ずれかによって修飾されたものを有する。かかる修飾は、基本テキストにて、お
よびより詳細な研究論文にて、ならびに膨大な研究文献にて詳しく記載されてお
り、それらは当業者に周知である。同じ型の修飾が、所定のポリペプチド中、い
くつかの部位で、同じまたは異なる程度にて存在してもよいことは明らかであろ
う。また、所定のペプチドは多くの型の修飾を有していてもよい。修飾は、ペプ
チド骨格、アミノ酸側鎖、アミノまたはカルボキシル末端を含め、ポリペプチド
のどこででも起こりうる。修飾は、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リ
ボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド
またはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホス
ホチジルイノシトールの共有結合、交差結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱
メチル化、共有交差結合の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホ
ルミル化、ガンマーカルボキシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨ
ード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白分解的プロセッシング、リン酸
化、プレニル化、ラセミ化、糖鎖形成、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基の
ガンマーカルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化、セレノイ
ル化、硫酸化、アルギニル化のごとき転移ＲＮＡにより媒介される蛋白へのアミ
ノ酸付加、およびユビキチネーションを包含する。例えば、PROTEINS−STRUCTUR
E AND MOLECULAR PROPERTIES, 第２版，Ｔ.Ｅ.Ｃreighton，Ｗ.Ｈ.Ｆreeman and
Ｃompany，New York（１９９３）およびＷold,Ｆ.，POSTTRANSLATIONAL COVALE
NT MODIFICATION OF PROTEINS，Posttranslational Protein Modifications：Pe
rspectives aｍａｐrospects, １-１２頁，B.C.Johnson編，Academic Press，Ne
w York（１９８３）；Seifterら,Meth Enzymol.（１９９０）１８２：６２６−
６４６、およびRattanら, Protein Synthesis：Posttranslational Modificatio
ns and Aging，Ann N.Y. Acad Sci（１９９２）６６３：４８−６２を参照のこ
と。ポリペプチドは、分枝してもよく、分枝を伴ったまたは伴わない環状であっ
てもよい。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後の天然のプロセッ
シングの結果であり、同様に全く合成的な方法で合成できる。
【００７９】 「組換え発現系（複数でも可）」は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペ
プチドの製造のために宿主細胞または宿主細胞溶解物中に導入または形質転換さ
れた発現系またはその部分または本発明のポリヌクレオチドをいう。
【００８０】 本明細書中で使用される「変種（複数でも可）」なる語は、各々、対照標準の
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、本質的な特性を保持している
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変種
は、別の対照標準のポリヌクレオチドとヌクレオチド配列において異なっている
。変種のヌクレオチド配列における変化は、対照標準のポリヌクレオチドによっ
てコードされたポリペプチドのアミノ酸配列と変わっていてもよいし、または変
わっていなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、後述するように、対照標準の配
列によってコードされたポリペプチドにおいて、アミノ酸置換、付加、欠失、融
合および切断をもたらしうる。ポリペプチドの典型的な変種は、別の対照標準の
ポリペプチドとはアミノ酸配列において異なっている。一般に、差異は、対照標
準のポリペプチドとその変種の配列が全体的に非常に類似しており、多くの領域
においては同一であるように限定される。変種および対照標準のポリペプチドは
、一またはそれ以上の置換、付加、欠失のいずれかの組み合わせによって、アミ
ノ酸配列において異なってもよい。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝
コードによってコードされたものであってもなくてもよい。また本発明は、本発
明の各ポリペプチドの変種、すなわち保存的アミノ酸置換により対照標準とは異
なっており、そのことにより残基が同様の特性を有する別の残基に置換されてい
るものを包含する。典型的なかかる置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌ
ｅ間；ＳｅｒおよびＴｈｒ間；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕ間；ＡｓｎおよびＧ
ｌｎ間；塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇ間；あるいは芳香族残基ＰｈｅおよびＴ
ｙｒ間のものである。数個、５〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個または
１個のアミノ酸がいずれかの組み合わせで置換、欠失、または付加されている変
種が特に好ましい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変種は、対立遺伝子
変種のような天然に存在するものであってもよく、または天然に存在することが
知られていない変種であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天
然に存在しない変種は、変異誘発法または直接合成あるいは当業者に公知の他の
組換え法によって作られてもよい。
【００８１】 （実施例） 以下の実施例は、別に詳細に記載したこと以外は、当業者に周知で慣用的な標
準的な技法を用いて実施する。実施例は例示であって、本発明を限定するもので
はない。 実施例１ 株の選択、ライブラリーの製造および配列決定 表１（配列番号１）に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドは、エシェリ
シア・コリ中のストレプトコッカス・ニュモニエの染色体ＤＮＡのクローンライ
ブラリーより得た。重複するストレプトコッカス・ニュモニエＤＮＡを含有する
２個またはそれ以上のクローンからの配列データを用いて、配列番号１の連続し
たＤＮＡ配列を構築した。ライブラリーは常套手段、例えば以下の方法１および
２により製造してもよい。 全細胞ＤＮＡをストレプトコッカス・ニュモニエ０１００９９３より、標準法
に従って単離し、以下に示す二つの方法のいずれかによりサイズ分画する。
【００８２】 方法１ 標準的方法に従ってサイズ分画するために、全細胞ＤＮＡをニードル（needle
）に通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの大きさのＤＮＡフラグメントを
エキソヌクレアーゼおよびＤＮＡポリメラーゼで処理することによって末端切断
し、ＥｃｏＲＩリンカーを付加する。フラグメントを、ＥｃｏＲＩで切断したベ
クター、ラムダＺａｐＩＩに連結し、標準的方法によりライブラリーをパッケー
ジングし、次いでパッケージングしたライブラリーでエシェリシア・コリを感染
させる。ライブラリーを標準方法により増幅する。
【００８３】 方法２ 全細胞ＤＮＡをライブラリーベクターにクローニングするための一連のフラグ
メントを得るのに適当な１つの制限酵素（例えば、ＲｓａＩ、ＰａｌＩ、Ａｌｕ
Ｉ、Ｂｓｈｌ２３５Ｉ）またはその組み合わせで部分的に加水分解し、かかるフ
ラグメントを標準的方法に従ってサイズ分画する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡ
に連結し、次いでそのフラグメントをＥｃｏＲＩで切断したベクター、ラムダＺ
ａｐＩＩに連結し、標準的方法によりライブラリーをパッケージングし、パッケ
ージングしたライブラリーでエシェリシア・コリを感染させる。ライブラリーを
標準方法により増幅する。
【００８４】 実施例２ ｍａｐの特徴付け 感染中のストレプトコッカス・ニュモニエからの遺伝子の発現の決定 ストレプトコッカス・ニュモニエ０１００９９３に感染した４８時間経過後の
マウス気道から切除した肺をカオトロピック剤およびＲＮＡ阻害剤の存在下で効
果的に粉砕し、処理して動物および細菌ＲＮＡの混合物を得る。安定した調製物
および高収量の細菌ＲＮＡを得るための粉砕および処理の最適条件は、ノーザン
ブロットにおけるストレプトコッカス・ニュモニエ１６ＳＲＮＡに特異的な放射
性標識したオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにも使用される。得
られたＲＮＡについてのＲＮＡａｓｅ不含、ＤＮＡａｓｅ不含、ＤＮＡおよび蛋
白不含の調合物は、ストレプトコッカス・ニュモニエ０１００９９３の各遺伝子
の配列から設計された独特なプライマー対を用いる逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ
）に適している。この操作を用いると、ｍａｐが感染の間に転写されることを説
明することが可能であった。
【００８５】 ａ）マウスの感染動物実験からのストレプトコッカス・ニュモニエ０１００９９
３に感染した組織（肺）の単離 ストレプトコッカス・ニュモニエ０１００９９３を、ＴＳＡ／５％ウマ血小板
上で、またはＡＧＣＨ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２中にて一夜培養する。つい
で、細菌を集め、リン酸緩衝セイラインに約０.４のＡ６００まで再び懸濁させ
る。マウスをイソフルオランで麻酔し、５０ｍｌの細菌懸濁液（約２ｘ１０５細
菌）をピペットマン（pipetman）を用いて鼻内投与する。マウスを回復させ、食
べ物および水を自由に与える。４８時間後、二酸化炭素を過剰に吸入させてマウ
スを殺し、肺を無菌状態で取り出し、液体窒素中に急激凍結させる。 ｂ）感染組織試料からのストレプトコッカス・ニュモニエ０１００９９３ＲＮＡ
の単離 ２ｍｌの凍結保存管中の感染組織試料を−８０℃の貯蔵庫からドライアイス−
エタノール浴に取り出す。微生物安全キャビネット中で試料を８部までに破砕し
、その際の残りの試料をドライアイス−エタノール浴で保存する。組織試料中の
細菌を破砕するために、５０−１００ｍｇの組織をシリカ／セラミックマトリッ
クス（ＢＩＯ１０１）を含有するＦａｓｔＲＮＡ管に移す。直ちに、１ｍｌの抽
出試薬（ＦａｓｔＲＮＡ試薬、ＢＩＯ１０１）を加え、試料の試薬に対する容量
割合を２０に対して１とする。その管を往復式振盪機（ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ
１２０、ＢＩＯ１０１）を用いて６０００ｒｐｍで２０−１２０秒間振盪させる
。粗製ＲＮＡ調製物をクロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、ＤＥＰＣ
処理／イソプロパノール溶液（ＢＩＯ１０１）を用いて沈降させる。必要ならば
、ＲＮＡ調製物をこのイソプロパノール溶液に−８０℃で貯蔵する。ＲＮＡをペ
レット状にし（１２０００ｇで１０分間）、７５％エタノール（ＤＥＰＣ−処理
水中でのｖ／ｖ）で洗浄し、５−１０分間風乾させ、０.１ｍｌのＤＥＰＣ処理
水に再び懸濁させ、つづいて５５℃に５−１０分間置く。最後に、氷上に少なく
とも１分間置いた後、２００単位のＲｎａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加える。
【００８６】 ＲＮＡ調製物を−８０℃で一ヶ月までの間貯蔵する。長期貯蔵には、プロトコ
ルの洗浄工程にあるＲＮＡ沈降物は７５％エタノール中に少なくとも１年間、−
２０℃で貯蔵することができる。 試料を１％アガロースゲルに泳動させることで単離したＲＮＡの特性を評価す
る。臭化エチジウムで染色した１ｘＴＢＥゲルを用いてＲＮＡの全収量を可視化
する。感染組織からの細菌ＲＮＡの単離を示すために、１ｘＭＯＰＳ、２.２Ｍ
ホルムアルデヒドゲルで泳動を行い、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に
減圧ブロッティングする。ついで、ブロットを、ストレプトコッカス・ニュモニ
エの１６Ｓ ｒＲＮＡに特異的な、配列５’ＡＡＣＴＧＡＧＡＣＴＧＧＣＴＴＴ
ＡＡＧＡＧＡＴＴＡ３’[配列番号：３]の、３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドプロ
ーブとハイブリダイズさせる。ハイブリダイズしているバンドの大きさをインビ
トロ増殖したストレプトコッカス・ニュモニエ０１００９９３から単離された対
照ＲＮＡの大きさとノーザンブロットにおいて比較する。全ＲＮＡ試料中におい
て正しい大きさの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡバンドが検出でき、ＴＢＥゲル上で可視
化した場合、哺乳動物ＲＮＡの分解が示される。
【００８７】 ｃ）ストレプトコッカス・ニュモニエ由来のＲＮＡからのＤＮＡの除去 最終容量が５７マイクロリットルの捕捉緩衝液中にある２０単位のＲＮＡａａ
ｓｅＩ（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ）を用いて３７℃で３０分間処理することにより、
５０マイクログラムのＲＮＡ試料からＤＮＡを除去した。 製造者のプロトコルに従ってＴＲＩｚｏｌ ＬＳ試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ, Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりＤＮＡａｓｅを不活化し除去した。
ＤＮＡａｓｅ処理したＲＮＡを、上記したようにＲｎａｓｉｎを添加したＤＰＥ
Ｃ処理水１００マイクロリットル中に再び懸濁させた。
【００８８】 ｄ）感染組織由来のＲＮＡ試料からのｃＤＮＡの調製 製造者の指示に従って、ＤＮＡａｓｅ処理したＲＮＡの試料３マイクロリット
ルを、Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット用のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐ
ｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ, Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて逆転写する。１５０ナノグラムの
ランダムヘキサマーを用いて各反応を開始する。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆
転写酵素を添加しない対照も反応させる。＋／−両方のＲＴ試料をＲＮａｓｅＨ
で処理し、次いで、ＰＣＲ反応に供する。
【００８９】 ｅ）細菌ｃＤＮＡ種の存在を測定するためのＰＣＲの使用 下記成分を添加することにより氷上で０.２ｍｌの試験管においてＰＣＲ反応
物をセットアップする：４３マイクロリットルのＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（
Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ.）；１マクロリッ
トルのＰＣＲプライマー（最適には、長さが１８〜２５塩基対で、類似のアニー
リング温度を有するように設計されたもの）（各プライマーは初濃度１０ｍＭ）
；および５マイクロリットルのｃＤＮＡ。
【００９０】 Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００に
おいてＰＣＲ反応を以下のように行った：９４℃で２分、次いでそれぞれ９４℃
、５０℃そして７２℃で３０秒を５０サイクル、その後７２℃で７分、次いで、
保持温度２０℃とする（最適には、ＰＣＲ産物の出現または欠乏を決定するため
のサイクル数は３０〜５０回であり、ＲＴ反応からの出発ｃＤＮＡ量の評価を行
う場合には、最適には８〜３０サイクルである）。次いで、１０マイクロリット
ルのアリコートを１％１ｘＴＢＥゲルで泳動し、臭化エチジウム染色する。ＰＣ
Ｒ生成物については、存在するならば、１００ｂｐのＤＮＡラダー（Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ, Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）との比較により大きさを評価す
る。別法として、都合よくは、標識ＰＣＲプライマー（例えば、染料で５’末端
を標識したもの）を用いてＰＣＲ産物を標識し、ＰＣＲ産物の適当なアリコート
をポリアクリルアミドゲルで泳動し、適当なゲルスキャンニングシステム（例え
ば、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒにより提供されるＧｅｎｅＳｃａｎＴＭソフトウ
ェアを用いたＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ３７７Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用いてその
存在および量を検出する。
【００９１】 ＲＴ／ＰＣＲ対照は＋／−逆転写酵素反応物、非転写ストレプトコッカス・ニ
ュモニエ０１００９９３ゲノム配列からＰＣＲ産物を生じるように設計された１
６Ｓ ｒＲＮＡプライマーもしくはＤＮＡ特異的プライマー対を含んでいてもよ
い。 プライマー対の効率を試験するために、それらをストレプトコッカス・ニュモ
ニエ０１００９９３全ＤＮＡを用いるＤＮＡ ＰＣＲに使用する。ＰＣＲ反応を
セットアップし、ｃＤＮＡの代わりに約１マイクログラムのＤＮＡを用いて上記
のごとく反応を行う。 ＤＮＡ ＰＣＲまたはＰＴ／ＰＣＲのいずれにおいても予想された大きさの産
物を生じないプライマー対はＰＣＲ反応できず、そのようなものとしては不均一
である。ＤＮＡ ＰＣＲで正しい大きさの産物を生じるものは、ＲＴ／ＰＣＲで
２つのクラスに分類される：１．インビボで転写されない遺伝子であって、ＲＴ
／ＰＣＲにおいて産物を生じる再現性がないもの；および２．インビボで転写さ
れる遺伝子であって、ＲＴ／ＰＣＲにおいて正しい大きさの産物を再現性をもっ
て生じ、＋ＲＴ試料において−ＲＴ対照におけるシグナル（生じた場合には）よ
りも強力なシグナルを生じるもの。
【００９２】 実施例３ 細菌の生存に不可欠な遺伝子の決定 対立遺伝子置換カセットをＰＣＲ技法を用いて生成した。該カセットはエリス
ロマイシン耐性遺伝子を側面に有する一対の５００ｂｐの染色体ＤＮＡフラグメ
ントからなる。染色体ＤＮＡ配列は、配列番号１に含まれるｍａｐをコードする
ＤＮＡ配列の前後の５００ｂｐである。 対立遺伝子置換カセットを形質転換によりストレプトコッカス・ニュモニエＲ
６に導入する。公知プロトコルに従って感応細胞を調製した。ナノグラム量の対
立遺伝子置換カセットを１０６細胞と３０℃で３０分間インキュベートすること
でＤＮＡを導入した。細胞を３７℃で９０分間置き、エリスロマイシン耐性遺伝
子を発現させる。細胞を１ｍｌ当たり１μｇのエリスロマイシンを含有する寒天
に置いた。３７℃で３６時間インキュベーションした後、コロニーを取り、０.
５％イースト抽出物を捕捉したＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロスに一夜増殖させた
。典型的には、適当な対立遺伝子置換体を含有する１０００個の形質転換体を得
る。形質転換体が３回の別々の形質転換実験で得られない場合、この遺伝子ｍａ
ｐのケースでは、その遺伝子はインビトロにて必須であると考えられる。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 ４Ｃ０８４ 31/04 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｃ０８６ Ｃ０７Ｋ 16/40 9/52 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9/52 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 33/569 Ｃ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/569 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 サンジョイ・ビスワス アメリカ合衆国19301ペンシルベニア州パ オリ、サウス・バレー・ロード77番、アパ ートメント・ビー４ (72)発明者 マーティン・ケイ・アール・バーナム アメリカ合衆国19504ペンシルベニア州バ ート、フォージデイル・ロード565番 (72)発明者 ジェイムズ・アール・ブラウン アメリカ合衆国19312ペンシルベニア州バ ーウィン、ロビンズ・レイン９番 (72)発明者 カレン・エイ・イングラハム アメリカ合衆国17922ペンシルベニア州オ ーバーン、ルーラル・ルート２・ボックス 108エイ (72)発明者 アリソン・エフ・チョーカー アメリカ合衆国19426ペンシルベニア州ト ラッペ、カレッジ・ウッズ、ハーバード・ ドライブ137番 (72)発明者 デイビッド・ジェイ・ホームズ アメリカ合衆国19380ペンシルベニア州ウ エスト・チェスター、ウッドミント・ドラ イブ126番 (72)発明者 リチャード・エル・ウォーレン アメリカ合衆国19422ペンシルベニア州ブ ルー・ベル、キャスカート・ロード825番 (72)発明者 トーマス・ビー・マジー アメリカ合衆国19408ペンシルベニア州イ ーグルビル、コネストガ・ロード303番、 アパートメント・ビー−23 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 FB03 4B024 AA01 AA13 BA14 BA61 CA04 CA09 DA06 GA11 HA14 HA17 4B050 CC04 DD02 LL01 LL03 4B063 QA01 QA05 QA18 QA19 QQ03 QQ36 QR55 QR62 QR67 QS03 QS25 QS33 QX02 4B065 AA26 AA49 AB01 BA02 CA33 CA44 CA46 4C084 AA01 AA02 AA27 BA44 DA41 NA14 ZB322 ZB352 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB32 ZB35 4H045 AA11 AA30 CA11 DA75 EA22 EA50 EA52 FA72

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ｉ）配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配列に対して少なく
    とも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド； （ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド； （ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列である単離ポリペプチド；および （ｉｖ）配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドに
    よりコードされるポリペプチド からなる群より選択される単離ポリペプチド。
  2. 【請求項２】 （ｉ）配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配列に対して少なく
    とも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配
    列を含む単離ポリヌクレオチド； （ｉｉ）配列番号２のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列に対し
    てその全長にわたって少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド配列
    を含む単離ポリヌクレオチド； （ｉｉｉ）配列番号１の全長にわたって配列番号１のヌクレオチド配列に対し
    て少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオ
    チド； （ｉｖ）配列番号２のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む
    単離ポリヌクレオチド； （ｖ）配列番号１のポリヌクレオチドである単離ポリヌクレオチド； （ｖｉ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１の配
    列または長さが少なくとも３０のヌクレオチドのそのフラグメントの配列を有す
    る標識プローブを用いて適当なライブラリーをスクリーニングすることにより得
    ることのできる長さが少なくとも３０のヌクレオチドの単離ポリヌクレオチド； （ｖｉｉ）ストレプトコッカス・ニュモニエ中に含まれるｍａｐ遺伝子により
    発現される成熟ポリペプチドをコードしている単離ポリヌクレオチド；および （ｖｉｉｉ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）ま
    たは（ｖｉｉ）の該単離ポリヌクレオチドに対して相捕的なポリヌクレオチド配
    列 からなる群より選択される単離ポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 個体の治療方法であって、 （ｉ）請求項１のポリペプチドに対する治療上有効量のアゴニストを個体に投
    与することを含む、請求項１のポリペプチドの活性または発現あるいはその免疫
    学的応答の促進を必要とする個体の治療方法；あるいは （ｉｉ）（ａ）請求項１のポリペプチドに対する治療上有効量のアンタゴニス
    トを個体に投与すること； （ｂ）請求項１のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の発
    現を阻害する核酸分子を個体に投与すること； （ｃ）リガンド、基質、または受容体を求めて請求項１のポリペプチドと競
    争する治療上有効量のポリペプチドを個体に投与すること；または （ｄ）個体中にて請求項１のポリペプチドに対する免疫学的応答を誘発する
    量のポリペプチドを個体に投与すること を含む、請求項１のポリペプチドの活性または発現の阻害を必要とする個体 の治療方法。
  4. 【請求項４】 個体における請求項１のポリペプチドの発現または活性に関
    連した、個体における疾病または疾病に対する感受性の診断または予後の方法で
    あって、下記工程： （ａ）該個体の生物中の該ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列に
    おける変異の存在または不存在を決定すること；または （ｂ）該個体由来の試料中の該ポリペプチドの発現の存在または量を分析する
    こと を含む方法。
  5. 【請求項５】 （ｉ）配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配列に対して少なく
    とも９５％の同一性を有する群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプ
    チド； （ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、または （ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列である単離ポリペプチド；および （ｉｖ）配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドに
    よりコードされるポリペプチド からなる群より選択されるポリペプチドの製造方法であって、ポリペプチドの生
    成に十分な条件下で宿主細胞を培養することを含む方法。
  6. 【請求項６】 （ｉ）配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配列に対して少なく
    とも９５％の同一性を有する群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプ
    チド； （ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド； （ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列である単離ポリペプチド；および （ｉｖ）配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドに
    よりコードされるポリペプチド からなる群より選択されるポリペプチドを発現する発現系を含む宿主細胞または
    その膜の製造方法であって、適合宿主中に存在する場合に上記ポリペプチド（ｉ
    ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）を生成可能なポリヌクレオチドを含む
    発現系で細胞を形質転換またはトランスフェクションして、適当な培養条件下で
    宿主細胞が上記ポリペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）を生
    成するようにすることを含む方法。
  7. 【請求項７】 （ｉ）配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配列に対して少なく
    とも９５％の同一性を有する群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプ
    チド； （ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、または （ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列である単離ポリペプチド；および （ｉｖ）配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む組み換えポリヌクレオチド
    によりコードされるポリペプチド からなる群より選択されるポリペプチドを発現する、宿主細胞またはその膜。
  8. 【請求項８】 請求項１のポリペプチドに対して免疫特異的な抗体。
  9. 【請求項９】 請求項１のポリペプチドの機能を活性化または阻害する化合
    物を同定するためのスクリーニング方法であって、 （ａ）候補化合物に直接または間接的に結合した標識を用い、候補化合物の、
    ポリペプチド（またはポリペプチドを有する細胞もしくは膜）またはその融合蛋
    白への結合を測定すること； （ｂ）標識競争物質の存在下で、候補化合物の、ポリペプチド（またはポリペ
    プチドを有する細胞もしくは膜）またはその融合蛋白への結合を測定すること； （ｃ）ポリペプチドを有する細胞もしくは細胞膜に適する検出系を用いて、候
    補化合物がポリペプチドの活性化または阻害により発生するシグナルを生じさせ
    るかどうかを試験すること； （ｄ）候補化合物と、請求項１のポリペプチドを含む溶液とを混合して混合物
    を作成し、混合物中のポリペプチドの活性を測定し、次いで、混合物の活性を標
    準と比較すること； （ｅ）例えば、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて細胞中で該ポリペプチドをコード
    しているｍＲＮＡおよび該ポリペプチドの生成に対する候補化合物の影響を検出
    すること、 からなる群から選択される方法を含む方法。
  10. 【請求項１０】 請求項１のポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタ
    ゴニスト。
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