JPH08116973A - 新規アミノペプチダーゼとそれをコードするアミノペプチダーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ラクトコッカス(Lactococcus) 属乳酸菌に由
来し、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列または該
アミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸残基が
欠失、付加あるいは置換されたアミノ酸配列を有する新
規アミノペプチダーゼ並びに配列表の配列番号２記載の
塩基配列またはそれと実質的に同一の機能を有するアミ
ノペプチダーゼ遺伝子。 【効果】 本発明によりラクトコッカス属乳酸菌の新規
なアミノペプチダーゼの精製と、それをコードする新規
なアミノペプチダーゼ遺伝子が明らかになった。また、
本発明により遺伝子工学的な手法で乳酸菌のアミノペペ
プチダーゼを効率よく大量生産する方法が提供された。
さらに、本発明のＤＮＡ配列をもつＤＮＡ断片をプロー
ブとして他の乳酸菌から相同のアミノペプチダーゼ遺伝
子をクローニングすることも可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、乳酸菌由来の新規アミ
ノペプチダーゼとそれをコードする遺伝子、該遺伝子を
含む形質転換体及びそれを用いる乳酸菌アミノペプチダ
ーゼの生産方法に関し、詳しくはラクトコッカス(Lacto
coccus) 属に属する乳酸菌が生産するアミノペプチダー
ゼ及びそれをコードする塩基配列、該塩基配列を含有す
る微生物及び該微生物を用いて当該アミノペプチダーゼ
を生産する方法に関するものである。

【０００２】本発明のアミノペプチダーゼは、チーズ製
造に用いる乳酸菌に由来し、極めて安全であると期待で
きる。本酵素は、リシルアミノペプチダーゼ(Lysylamin
opeptidase) に分類され、広い基質特異性を有し、特に
苦みペプチドを効率よく分解する。そのため、本酵素は
食品加工用酵素として極めて有用なものである。

【０００３】

【従来の技術】ラクトコッカス属乳酸菌のアミノペプチ
ダーゼ及びその遺伝子は既にいくつか報告されている。
しかし、我々はチーズスターター用の菌株の中から新規
アミノペプチダーゼを精製し、本酵素が、効果的に苦み
ペプチドを分解することを明らかにした。そして、さら
に鋭意検討を重ねた結果、そのアミノペプチダーゼをコ
ードする遺伝子を分離することに成功した。また、その
遺伝子の塩基配列を決定したところ、従来報告されてい
ない新規の遺伝子であることを明らかにすることができ
た。このことによって、効果的に苦みを低減するアミノ
ペプチダーゼを遺伝子工学的に効率よく生産することが
可能となった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ラクトコッカス属乳酸
菌のアミノペプチダーゼは、チーズの苦みの主要原因で
ある苦みペプチドを効率的に分解し、チーズの欠陥の中
で最も多い苦みの問題を減少するために用いることが期
待できる。また、カゼインや乳清タンパクなどを酵素分
解すると生じる苦みを低減するためにも用いることがで
きる。しかし、ラクトコッカス属乳酸菌のアミノペプチ
ダーゼはほとんどの場合、菌体内あるいは細胞壁に微量
しか存在せず、その分離、精製には多大の労力を有する
ため、実際には酵素剤としての利用はなされていなかっ
た。

【０００５】そこで、本発明の目的は、苦みを低減する
効果の明らかなアミノペプチダーゼをラクトコッカス属
乳酸菌から完全に精製し、その性質を常法によって決定
し、特に苦みを低減する効果があることを証明すること
である。また、アミノペプチダーゼをコードする全ＤＮ
Ａ配列を決定し、遺伝子工学的に効率よくアミノペプチ
ダーゼを生産する方法を確立することである。また、本
発明により明らかにされたラクトコッカス属乳酸菌のア
ミノぺプチダーゼ遺伝子は従来報告されているものと相
同性が低く、新規な酵素遺伝子と考えられた。そこで、
本酵素をコードするＤＮＡ断片をプローブ（探索子）と
して用いて、苦みを低減する効果を期待できる他のラク
トコッカス属に属する乳酸菌及び近縁の他属の生物のア
ミノペプチダーゼ遺伝子もクローニングすることが可能
となった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、まずチー
ズ製造に用いられる乳酸菌株の中から、アミノペプチダ
ーゼ活性が相対的に強い株を選択した。そして、そのア
ミノペプチダーゼを十分に精製し、諸性質を決定すると
ともに、そのＮ−末端アミノ酸配列を決定することに成
功した。次いで、本酵素について相同性検索の結果、従
来報告されているラクトコッカス属のアミノペプチダー
ゼＮと５８％の相同性しかない新規の酵素であることを
確認した。よって、本明細書において本酵素を単にアミ
ノペプチダーゼあるいはアミノペプチダーゼＹＲＣと呼
ぶ。さらに、我々はこの精製酵素が脱脂乳のトリプシン
分解物の苦みを有意に低減させることを証明した。この
ように、本酵素が新規で、しかも有用であることが明ら
かとなったので、決定したアミノ酸配列を参考にして本
アミノペプチダーゼをコードするＤＮＡ断片をクローニ
ングすることができた。

【０００７】また、クローニングしたＤＮＡ断片の全配
列を決定し、本酵素の遺伝子を完全に決定することがで
きた。さらに、この断片を組み込んだプラスミドを作成
し、これを大腸菌に組込んで形質転換し、得られた形質
転換体を用いて本アミノペプチダーゼを効率よく生産で
きることを見いだした。本発明はかかる知見により完成
されたものである。

【０００８】請求項１記載の本発明は、ラクトコッカス
属乳酸菌に由来し、配列表の配列番号１記載のアミノ酸
配列または該アミノ酸配列に対して１もしくは数個のア
ミノ酸残基が欠失、付加あるいは置換されたアミノ酸配
列を有する新規アミノペプチダーゼであり、請求項２記
載の本発明は、配列表の配列番号２記載の塩基配列また
はそれと実質的に同一の機能を有するアミノペプチダー
ゼ遺伝子である。さらに、請求項３記載の本発明は、請
求項２記載の塩基配列にハイブリッドする塩基配列であ
り、かつアミノペプチダーゼ活性を有するタンパク質を
コードするＤＮＡ配列である。請求項４記載の本発明
は、請求項２記載の塩基配列を含むＤＮＡ断片を有する
プラスミドで形質転換したエシェリヒア(Escherichia)
属細菌であり、請求項５記載の本発明は、請求項４記載
の形質転換体を培養し、培養物からアミノペプチダーゼ
を採取することを特徴とするアミノペプチダーゼの生産
方法である。

【０００９】本発明に用いるラクトコッカス属乳酸菌株
としては、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシズ
・クレモリス(Lactococcus lactis subsp. cremoris)，
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシズ・ラクチス
(L. lactis subsp. lactis)などのラクトコッカス・ラ
クチス菌があり、その他本菌と同等の菌株は、本発明の
ＤＮＡ配列をプローブとして用いることにより、チーズ
スターター等から何人も容易に分離することができる。
また、ここで用いられた手法は既に一般的なものであ
り、何人も実施可能である。さらに、本発明に適用され
る遺伝子工学的な手法は、例えばJ.Sambrook,E.F.Frits
ch,T.Maniatis (ed.) "Molecular Cloning: A Laborato
ry Manual, 2nd edition", Cold Spring Harbor Labora
tory Press, 1989等に詳細に説明されているので、何人
も実施可能である。

【００１０】本発明のアミノペプチダーゼの精製と性質
の決定及びＤＮＡ配列の決定は、次のようにして行うこ
とができる。まず、ラクトコッカス属乳酸菌の菌体を培
養し、Ｌｅｕ−ＭＣＡ基質(L-Leucine 4-Methyl-Coumar
yl-7-Amide、蛍光基質）に対する酵素活性を指標とし
て、常法にしたがってアミノペプチダーゼを精製する。
完全に精製後、常法に従って酵素の諸性質を決定する。
次に、プロテインシーケンサーでＮ−末端アミノ酸配列
を決定する。また、この精製酵素をリシルエンドペプチ
ダーゼで分解し、その断片を逆相ＨＰＬＣで精製し、各
断片のアミノ酸配列を同様にプロテインシーケンサーで
決定する。これらのアミノ酸配列からそれをコードする
ＤＮＡ配列を推定し、オリゴヌクレオチドを合成する。
これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い
て、ラクトコッカス属乳酸菌の染色体ＤＮＡを鋳型とし
て、精製したアミノペペプチダーゼをコードするＤＮＡ
の一部を遺伝子増幅法で増幅する。この増幅したＤＮＡ
断片をプローブとして全遺伝子を含むＤＮＡ断片を常法
に従ってクローニングする。クローニングされたＤＮＡ
断片の塩基配列を常法に従って決定する。

【００１１】本発明のアミノペペプチダーゼは、配列表
の配列番号１記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列
に対して１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、付加あ
るいは置換されたアミノ酸配列を有する。また、本発明
のアミノペプチダーゼ遺伝子は、配列表の配列番号２記
載の塩基配列またはそれと実質的に同一の機能を有する
ものである。ここで、実質的に同一の機能を有するとは
コドンの縮重という事実により、同じアミノ酸残基をコ
ードする塩基配列であれば、その配列が全体にわたって
配列番号２記載の塩基配列と異なっている場合でも、実
質的に同一であるということを意味する。本発明には、
上記の塩基配列にハイブリッドする塩基配列であり、か
つアミノペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコード
するＤＮＡ配列も包含される。何故ならば、全体の相同
性が約８５％以上の場合、上記の配列番号１あるいは配
列番号２の配列を参考にして、ＤＮＡハイブリダイゼー
ションや遺伝子増幅法等の公知の遺伝子工学的手法を用
いて容易に本発明と相同の遺伝子をクローニングするこ
とが可能だからである。

【００１２】配列表の配列番号２記載の塩基配列を含む
ＤＮＡ断片を有するプラスミドを用いてエシェリヒア属
細菌、例えばエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)を
常法（例えば、J. Sambrook らの文献（既出））により
形質転換することによって形質転換体を得ることができ
る。さらに本発明は、該形質転換体を培地に培養し、培
養物からアミノペプチダーゼを採取することを特徴とす
るアミノペプチダーゼの生産方法を提供するものであ
る。ここで、形質転換体であるエシェリヒア属細菌の培
養は、J. Sambrook らの文献（既出）に従って行い、培
養物から目的とするアミノペプチダーゼを分離する。こ
のアミノペプチダーゼの精製は、後記の実施例に示す方
法と全く同様の方法により行うことができる。

【００１３】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明するが、これらによって本発明は何ら制限されな
い。なお、活性及び比活性の決定は以下の様にして実施
した。まず、精製段階でのアミノペプチダーゼ活性は次
のように測定した。測定するフラクションから１０μｌ
あるいは１００μｌを９６ウエルマイクロプレートにと
り、次に１００μｌのバッファー（５０ｍＭ トリス-H
Cl（ｐＨ7.５）、１ｍＭ CoCl₂)を加えた。連続ピペッ
ターで５μｌの基質（１０ｍＭ Ｌｅｕ−ＭＣＡ ＤＭ
ＳＯ溶液）をすばやく加えた。３２℃のインキュベター
内に５分から１０分おき、Millipore 社の蛍光マイクロ
プレートリーダー Cytofluor２３５０で蛍光強度を測定
した。測定条件は次の通りである。 励起フィルター：３６０／４０ エミッションフィルター：４６０／４０ 感度：２

【００１４】精製段階での活性は相対活性として示し
た。精製酵素標品と各精製段階でプールした粗酵素の活
性は基質としてＬｅｕ−ＭＣＡで測定した。Ｌｅｕ−Ｍ
ＣＡを用いたときは、次のように行った。 装置：日立Ｆ２０００型蛍光分光光度計 励起波長：３７０ｎｍ 蛍光波長：４４０ｎｍ バンドパス：励起１０ 蛍光１０ 光電子増倍管：４００ 恒温セルホルダー使用（３２℃）撹拌子付き

【００１５】あらかじめ３２℃に保温した５０ｍＭ ト
リス-HCl（ｐＨ7.５）バッファー２９６０μｌに基質溶
液３０μｌ（１０ｍＭ Ｌｅｕ−ＭＣＡ ＤＭＳＯ溶
液）を加え、酵素溶液１０μｌを加えた（セル内にはス
ターラーを入れ常時撹拌した）。５秒後から１分間の蛍
光強度の変化を観測した。ＡＭＣ (7-Amino-4-Methyl-C
oumarin)の標準濃度溶液の蛍光強度を検量線を作製し、
１分間あたりの遊離したＡＭＣの濃度から活性を算出し
た。１ユニット（Ｕ）は１分間に１μｍｏｌの基質を遊
離する酵素量とした。この条件での計算式は以下の通り
である。 活性（U/ml)=ΔI(1 分間あたりの蛍光強度変化）×３．
５１×１０^-3 また、比活性は含まれるタンパク量ｍｇあたりの活性で
示した。

【００１６】実施例１ ＜ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシズ・クレモ
リスYRC001株の大量培養＞供試菌株としてラクトコッカ
ス・ラクチス・サブスピーシズ・クレモリスYRC001株を
用い、９０リットル容ジャーファーメンターに入れた下
記組成の培地７０リットル（１２１℃、２０分間滅菌）
に種菌を1.６リットル接種し、通気せずに撹拌（５０ｒ
ｐｍ）しながら３２℃で１９時間培養した。

【００１７】リン酸２アンモニウム0.４％を含むLactic
broth（トリプトン ２０ｇ, 酵母エキス ５ｇ, ゼラ
チン 2.５ｇ，グルコース ５ｇ，ラクトース ５ｇ，
シュークロース ５ｇ，NaCl ４ｇ，酢酸ナトリウム
1.５ｇ，アスコルビン酸 0.５ｇ，リン酸アンモニウム
４ｇ／ｌ、ｐＨ7.０）培養終了後、遠心分離を行い培
養液を回収した。

【００１８】実施例２ ＜菌体の超音波破砕＞実施例１で得られた菌体ペースト
１６０ｇ（湿物重）を全量２リットルに５０ｍＭ トリ
ス-HClバッファー（ｐＨ7.５）で懸濁し、超音波破砕装
置 Sonifier４５０型で５℃以下に冷却しながらポンプ
で全量を循環し、連続的に破砕した。次いで、８０００
ｒｐｍ（１万×ｇ）で１０分間遠心して未破砕菌体を除
去したのち、８０％飽和になるように硫酸アンモニウム
を加え４℃で２日間おき、１万ｇで１０分間遠心し、沈
殿物を回収した。これを少量の水に分散させ、透析チュ
ーブで６０リットルの１０ｍＭ トリス-HClバッファー
（ｐＨ7.５）で透析した。この方法により最終的に４８
５ｍｌの溶液を得た。

【００１９】実施例３ ＜Q-Sepharose Fast Flow による分画＞実施例２の超音
波破砕菌体の硫安沈殿透析溶液４８５ｍｌを３回にわけ
てQ-Sepharose FF（ファルマシア社製）陰イオンクロマ
トグラフィーで分画した。条件は以下の通りである。 カラム：Pharmacia Q-Sepahrose Fast Flow カラムサイズ：ＸＫ50 （ファルマシア社製）５０ｍｍ
×１５０ｍｍ バッファー： Ａ：0.０２％ NaN₃を含む50ｍＭ トリ
ス-HCl（ｐＨ8.３） Ｂ：１Ｍ NaClを含むＡバッファー グラジエント条件：十分に吸着させてからＢバッファー
を１２０分間で０〜１Ｍにグラジエントをかけて溶出し
た。 流速：4.０ｍｌ／ｍｉｎ フラクションサイズ：８ｍｌ

【００２０】次いで、活性画分を回収し、Q-Sepharose
活性画分とした。その結果を図１に示す。

【００２１】実施例４ ＜Sephacryl S-300 ゲルクロマトグラフィーによる分画
＞Q-Sepharose 活性画分約５４９ｍｌをそのまま凍結乾
燥し、できるだけ少量の水に溶解した（約６４ｍｌ）。
これを約４ｍｌずつ次の条件でSephacryl S-300ゲルク
ロマトグラフィーで分画した。 カラム：Pharmacia Sephacryl S-300 カラムサイズ：ＸＫ26/1000 (ファルマシア) ２６ｍｍ
×１０００ｍｍ バッファー：0.０２％ NaN₃と１５０ｍＭ NaClを含む
５０ｍＭ トリス-HCl（ｐＨ7.３） 流速：４ｍｌ／ｍｉｎ フラクションサイズ：８ｍｌ

【００２２】次いで、活性画分を回収し、Sephacryl S3
00活性画分とした。その結果を図２に示す。

【００２３】実施例５ ＜MonoQHR10/10陰イオンクロマトグラフィーによる分画
＞Sephacryl S300活性画分約１１１４ｍｌを約５０ｍｌ
ずつに分けて次の条件でMonoQ HR10/10 陰イオンクロマ
トグラフィーで分画した。 カラム：Pharmcia MonoQ HR10/10 カラムサイズ：１０ｍｍ×１００ｍｍ バッファー： Ａ：0.０２％ NaN₃を含む50ｍＭ トリ
ス-HCl（ｐＨ8.３） Ｂ：１Ｍ NaClを含むＡバッファー 流速：３ｍｌ／ｍｉｎ グラジエント条件：十分サンプルを吸着させてからＢバ
ッファーを３０分間で０〜１Ｍまでグラジエントをかけ
て溶出した。活性画分を回収してMonoQ 活性画分とし
た。その結果を図３に示す。

【００２４】実施例６ ＜ハイドロキシアパタイトカラムでの分画＞実施例５の
MonoQ 活性画分を１ｍｌずつとり、次の条件で分画し
た。 カラム：三井東圧製ＨＣＡ（ハイドロキシアパタイト）
カラムA-7610 カラムサイズ：7.６ｍｍ×１００ｍｍ バッファー： Ａ：１０ｍＭ KH₂PO₄-K₂HPO₄バッファ
ー (ｐＨ7.０） Ｂ：0.０２％ NaN₃ を含む５００ｍＭ KH₂PO₄-K₂HPO₄
バッファー (ｐＨ7.０） グラジエント条件：２０分間でｂ：０〜４０％にグラジ
エントをかけて溶出。その結果、単一のピークのみが活
性を示したので、このピークを回収してＨＣＡ活性画分
とした。その結果を図４に示す。また、第１表に各精製
段階の精製過程をまとめた。表中、−で示した部分はデ
ータの欠損を示す。

【００２５】

【表１】

【００２６】実施例７ ＜酵素の諸性質の決定＞酵素の基質特異性、最適温度、
最適ｐＨ、金属イオンの活性に対する影響、各種阻害剤
の影響などは常法に従って決定した。こうして得られた
酵素の性質について次に説明する。 （１）第２表に本酵素の各種合成基質に対する基質特異
性を示した。本酵素はＬｙｓ−ＭＣＡを最も良く分解
し、リシルアミノペプチダーゼ（Lysylaminopeptidase)
と呼ぶべき酵素であることが明らかとなった。

【００２７】

【表２】

【００２８】また、本酵素はＬｅｕ−ＭＣＡ，Ａｒｇ−
ＭＣＡにも良く作用した。この他、Ｍｅｔ−ＭＣＡ，Ａ
ｌａ−ＭＣＡ，Ｐｈｅ−ＭＣＡにも作用し、広い基質特
異性をもつことが明らかとなった。さらに、本酵素はＬ
ｙｓ−Ａｌａ−ＭＣＡにも作用した。しかし、Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ−ＭＣＡには全く作用しなかった。本酵素は、そ
の他のエンドペプチダーゼ用の合成基質には作用しなか
った。第３表にＬｙｓ−Ｌｙｓに対する活性を１００と
して各種オリゴペプチドに対する相対活性を示した。

【００２９】

【表３】

【００３０】表から明らかなように、試験した基質の中
でジペプチドではＬｙｓ−Ｌｙｓに対する活性が最も高
く、次いでＬｙｓ−Ｌｅｕ，Ｌｙｓ−Ｍｅｔ，Ｈｉｓ−
Ｌｅｕ，Ａｒｇ−Ｐｈｅ，Ａｒｇ−Ｌｅｕ，Ｌｅｕ−Ａ
ｌａであった。トリペプチドではＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ，Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ，Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙなどに活性があった。これ
らの結果から、本酵素は広い基質特異性をもつと考えら
れた。また、比活性はＬｅｕ−ＭＣＡを基質に用いたと
き約2.１５Ｕ／ｍｇであった。

【００３１】（２）図５に本酵素の最適温度を示した。
図から明らかなように、最も活性が高かったのは３５℃
であった。また、１０℃で約１７％、５℃でも８％の相
対活性があり、チーズの一般的な熟成温度である７℃前
後でも強い活性を有していることが明らかとなった。こ
れはチーズに添加するかあるいはスターターに組み込む
場合に有利な性質であると考えられた。

【００３２】（３）図６に本酵素の最適ｐＨを示した。
本酵素は５０ｍＭリン酸バッファーでｐＨ6.５のときに
最大の活性を示した。 （４）第４表に本酵素の各種プロテアーゼ阻害剤の影響
を示した。表から明らかなように、特にＥＤＴＡ、ｏ−
フェナンスロリン、ＰＣＭＢなどによって強く阻害さ
れ、本酵素がＳＨ酵素であることが明らかになった。

【００３３】

【表４】

【００３４】（５）第５表に本酵素の活性に対する金属
イオンの影響を示した。本酵素は特にＦｅ²⁺イオンで活
性が阻害された。

【００３５】

【表５】

【００３６】（６）図７に本酵素の分子量を決定するた
めのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真を
示した。その結果、分子量は約９万と算出された。ま
た、ここでは示さないが、ゲル濾過での分子量も約１０
万で、モノマーの酵素であることが明らかになった。

【００３７】実施例８ ＜脱脂乳のトリプシン分解物に対する脱苦味効果＞硫酸
キニーネを苦味の対照物質として用いた。また、アミノ
ペプチダーゼＹＲＣとして実施例６で得たＨＣＡ画分
（0.５３ｍｇ／ｍｌ）を用い、かつトリプシン：１０ｍ
ｇ／ｍｌ水溶液を用いて以下の条件で反応させた。 反応条件：２０％（W/V)還元脱脂乳50ｍｌにトリプシン
溶液２００μｌを加えたもの（Ａ）、トリプシン溶液２
００μｌとアミノペプチダーゼＹＲＣ溶液２００μｌを
加えたもの（Ｂ）をそれぞれ３５℃で２時間反応させて
から、１０分間煮沸して酵素活性を失活させた。

【００３８】以上のように調製したサンプルＡ、Ｂの苦
味を１１人のパネラーによって比較した。なお、苦味の
対照として第６表に示した濃度で硫酸キニーネの水溶液
を調製した。この苦味の標準液は苦味の強度を２から１
０に分け、点数化した。各パネラーはＡとＢのサンプル
をこれらの標準液のどれに相当する苦味を持つかで点数
化した。官能検査の結果を第７表に示した。還元脱脂乳
（苦味はない）をトリプシン分解したＡサンプルは、は
っきりと苦いと評価された（平均6.８）。一方、トリプ
シンとアミノペプチダーゼＹＲＣの両方を作用させたＢ
サンプルでは僅かに苦い（平均4.３）という評価であっ
た。これらの結果から、本発明により有意に苦味を低減
できることが判った。また、アミノペプチダーゼ処理に
よってトリプシン分解物にはない旨味が見られ、特にチ
ーズ等の分解に効果的であると考えられた。

【００３９】

【表６】

【００４０】

【表７】

【００４１】実施例９ ＜逆相ＨＰＬＣによる分画とＮ−末端アミノ酸配列の決
定＞実施例６で得られたＨＣＡ活性画分から微量に含ま
れている不純物を除くために、次の条件で逆相ＨＰＬＣ
で分画した。 カラム：YMC AP814 カラム（C4) バッファー： Ａ：0.１％ＴＦＡ、 Ｂ：１００％アセ
トニトリル グラジエント条件：Ｂバッファーを２０から１００％に
グラジエントをかけて溶出させた。溶出したメインピー
クを回収し逆相ＨＰＬＣ画分とした。これを常法に従っ
てそのままＡＢＩ４７３Ａプロテインシーケンサー（ア
プライドバイオシステム社）で３８残基まで分析した。

【００４２】分析の結果、Ｎ−末端の配列は下記の通り
であった。 Thr-Ala-Ser-Val-Ala-Arg-Phe-Ile-Glu-Ser-Phe-Ile-Pr
o-Glu-Asn-Tyr-Asn-Leu-Phe-Leu-Asp-Ile-Asn-Arg-Ser-
Glu-Lys-Lys-Phe-Lys-Gly 相同性検索の結果、この配列はすでにクローニングがな
されているラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシズ
・クレモリス(Lactococcus lactis subsp. cremoris) M
G1363 のアミノペプチダーゼＮ（P.S.Tan ら、未公表、
GenBank アセッションNo.M87840)のＮ−末端アミノ酸配
列と決定した３１残基中１８残基が一致していることが
明らかとなった。すなわち５８％の一致である。このよ
うに相同性が低いため、本発明のアミノペプチダーゼＹ
ＲＣは新規な酵素であることが明らかとなった。しか
し、これらの酵素がともに菌体内酵素であること、分子
量も約９万前後であることと一致することから、本発明
の酵素はアミノペプチダーゼＮグループに属した酵素で
あると考えられる。

【００４３】実施例１０ ＜リシルエンドペプチダーゼ消化による内部アミノ酸配
列の決定＞内部プライマーを作製するためにアミノペプ
チダーゼの内部の配列を一部決定した。すなわち、ハイ
ドロキシアパタイト精製画分１ｍｌに１Ｍ トリス−HC
l(ｐＨ9.０）１００μｌを加え、これにリシルエンドペ
プチダーゼ（１μｇ／ｍｌ、0.１Ｍ トリス-HCl（ｐＨ
9.０）溶液）２０μｌを加えて３７℃で２時間反応させ
た。そのうち１ｍｌを次の条件で逆相ＨＰＬＣで分画し
た。

【００４４】カラム：YMC AP503 s-5, ODS CN 300A バッファー：Ａ： 0.１％ＴＦＡ Ｂ： 0.１％ＴＦＡ in Acetonitrile 流速：１ｍｌ／ｍｉｎ グラジエント：４０分間でＢバッファーを１００％にあ
げて溶出した。

【００４５】独立したピークをチューブに回収してそれ
ぞれその全量をＡＢＩ４７３Ａプロテインシーケンサー
で分析した。そのうちいくつかのピークについて次のよ
うにアミノ酸配列を決定することができた。なお、Ｘは
決定できなかった残基、Ｋは切断部位のLys 残基を示
す。 ピーク８：(K)-Gly-Arg-Leu-Trp-Glu-Ile-Pro-Leu-Asn-
Thr-Trp-Asn-Gly-Leu-Pro-Asp- ピーク４：(K)-Asp-Val-Ser-X-Phe-Met-Asp-Thr-Trp-Le
u-Glu-Gln-Pro-Gly-Tyr-Pro-Val-Val-X-Ala- ピーク10：(K)-Trp-Asp-Asp-Leu-Trp-Leu-Asn-Glu-Ser-
Phe-Ala-Asn-Met-Met-X-Tyr-

【００４６】実施例１１ ＜ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシズ・クレモ
リス YRC001 株からの全ＤＮＡの抽出＞アミノペプチダ
ーゼ遺伝子のクローニングのためにラクトコッカス・ラ
クチス・サブスピーシズ・クレモリス YRC001 株からＤ
ＮＡをSaito and Miura (Biochim. Biophys. Acta., 7
2,619-629 (1963))の方法をやや改変して抽出した。Ｄ
ＮＡは１μｇ／ｍｌの濃度に調整してＴＥバッファー
（ｐＨ8.０）に溶解し、−３０℃に保存した。

【００４７】実施例１２ ＜ＰＣＲでのアミノペプチダーゼ遺伝子の部分的増幅＞
アミノペプチダーゼ遺伝子のコード領域の一部をプロー
ブ用に増幅するためにピーク８のアミノ酸配列から次の
オリゴヌクレオチドを合成した。 プライマー PK8C: 5'-TTCAATGGAAT(TC)TCCCACAAACGTCCT
TT-3' また、先に決定したアミノペプチダーゼのＮ−末端のア
ミノ酸配列から プライマーYRCN32: 5'-CGTTTTATTGAAAGTTTTATTCCGGAAAA
(TC)TA-3' を合成した。各々１００ｐｍｏｌ／μｌの濃度に調整し
た。この２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て、常法によりYRC001株の染色体ＤＮＡを鋳型として遺
伝子増幅を実施した。なお、ＰＣＲ条件は次の通りであ
る。

【００４８】装置：パーキンエルマーシステム9600 反応条件：変性温度９６℃、アニール温度４８℃ エクステンション温度７２℃、１分３０秒 ３０サイクル反応後、７２℃に５分おき、分析まで４℃
においた。反応液のうち５μｌを0.８％アガロースで電
気泳動して確認した。プライマーPK8Cはアミノペプチダ
ーゼＮとの相同性から約４７６アミノ酸残基に相当する
領域（すなわち４７６×３＝約1.４ｋｂｐ）を増幅する
筈である。ＰＣＲ産物の電気泳動の結果、予想に完全に
一致する1.４ｋｂｐの増幅が見られた。そこで、このＰ
ＣＲ産物をゲルから抽出し、プローブとして用いサザン
ハイブリダイゼーションを行った。

【００４９】実施例１３ ＜サザンハイブリダイゼーション＞ラクトコッカス・ラ
クチス・サブスピーシズ・クレモリスYRC001株の全菌体
ＤＮＡ２０μｇを各種制限酵素で分解後、８μｇを0.８
％アガロースゲル電気泳動し、ナイロンメンブラン（ア
マシャム社、Hybond N+)に真空ブロッテイングした。0.
４Ｎ NaOHで固定後、２×ＳＳＣで５分洗浄し、ＥＣＬ
遺伝子検出システム（アマシャム社）で検出した。プロ
ーブはＰＣＲで増幅した実施例１２のＤＮＡ断片を用
い、１０ｎｇ／ｍｌの濃度でハイブリダイズさせた。こ
の方法の詳細はマニュアルに従った。検出のときの１次
洗浄は0.１×ＳＳＣ，６Ｍ尿素を用いた。その他の条件
は標準通りである。

【００５０】サザンハイブリダイゼーションの結果を図
８に示した。EcoRI 断片は２本のバンドにハイブリダイ
ズした。4.７Ｋｂと3.７Ｋｂである。XbaI断片はややバ
ンドが乱れているが約2.９Ｋｂにハイブリダイズした。
XbaIサイトはプローブに用いたＰＣＲ産物の内部に存在
しないから、必ず１本にハイブリダイズすると考えら
れ、予想と一致した。HindIII 断片は1.９Ｋｂと0.８Ｋ
ｂにハイブリダイズした。これらのうち、約2.９Ｋｂの
XbaI断片はアミノペプチダーゼ−ＹＲＣの全領域を含ん
でいると考えられたので、この断片のクローン化を中心
にさらに実験を進めた。

【００５１】実施例１4 ＜XbaI及びEcoRI 断片のZAPII ベクターでのクローニン
グ＞ＸbaI 断片のクローン化は次のように行った。未分
解のZAPII ベクター（クローンテック社）１μｇをXbaI
で完全消化し、末端を脱リン酸化（ＣＩＰ）後、ゲルか
ら抽出した約2.９Ｋｂ前後のXbaI断片約1.２μｇをライ
ゲーションし、その全量をインビトロパッケージング
（クローンテック社、Gigapack II Goldを使用した。）
した。適度なプラーク密度でプラークハイブリダイゼー
ションを実施した。なお、プローブは1.４ｋｂｐのＰＣ
Ｒ産物を用いた。実験条件はＥＣＬシステムのプロトコ
ルに従った。陽性のプラークは２次スクリーニング後、
ZAPII のプロトコルに従ってプラスミド化し、アミノペ
プチダーゼ−ＹＲＣ全遺伝子を含むプラスミドを得て、
pXB11 と命名した。ABI373A DNA シーケンサー（アプラ
イドバイオシステム社) でpXB11 に含まれるXbaI断片の
全塩基配列を決定した。その制限酵素地図を図９に示し
た。

【００５２】XbaI断片の全塩基配列と推定されるアミノ
酸配列を配列表２に示した。このXbaI断片は２９４０ｂ
ｐからなり、アミノペプチダーゼＹＲＣ遺伝子はXbaIサ
イトから２１４塩基目のATG を開始コドンとして２５４
７ｂｐにコードされていた。終止コドンはTAA であっ
た。推定されるアミノ酸配列から本酵素は開始メチオニ
ンを含め８４９アミノ酸からなり、成熟酵素は開始メチ
オニンのみがプロセッシングを受けて除去されていた。
また、プロテインシーケンサーで分析したアミノ酸配列
は推定アミノ酸配列と一致した。

【００５３】実施例１５ ＜アミノペプチダーゼＹＲＣ遺伝子の大腸菌での発現＞
アミノペプチダーゼＹＲＣ全遺伝子を含むプラスミド：
pXB11 とpXB11R（pXB11 のインサートが逆向きに挿入さ
れているもの）、対照としてベクターのみのpBluescrip
t 、宿主は大腸菌(E. coli) MV1184を使用した。アンピ
シリンを含むＬ−ブロス１０ｍｌにそれぞれのプラスミ
ドを保持したE. coli MV1184株を接種し、３７℃で１８
時間培養した。IPTGのインダクションは行わなかった。
1.５ｍｌの培養液をチューブにとり、８０００ｒｐｍで
１分間遠心分離してから上澄液を完全に捨て、これに２
００μｌの0.１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ7.０）を加え
た。次いで、約２秒間超音波で菌体を破砕した。１５０
００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄液を別のチューブ
にとり、粗酵素液とした。アミノペプチダーゼ活性はＬ
ｅｕ−ＭＣＡを基質として既述の通り行った。粗酵素の
濃度の違いを補正するために２８０ｎｍでの吸収で同一
になるように調整した。

【００５４】pXB11 をもつ大腸菌株E. coli MV1184(pXB
11) はIPTG等の誘導がなくても非常によくアミノペプチ
ダーゼＹＲＣを発現した。各組換え体の活性は第８表に
示した。アミノペプチダーゼＹＲＣ遺伝子を含むプラス
ミドpXB11 及びpXB11Rともにそのままで非常に良く大腸
菌で発現していることが明らかになった。粗酵素液で1.
３３Ｕ／ｍｌにも達した。これらの粗酵素液のSDS-ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（クマーシーブリリアント
ブルー染色）の結果は図１０に示した。pXB11あるいはp
XB11Rを有する大腸菌は菌体タンパクの中でアミノペプ
チダーゼＹＲＣが最も多くメインバンドとして現われる
ほどであった。そのため、本酵素のプロモーター領域は
大腸菌でもよく機能し、プロモーター領域自体利用価値
があると思われた。図中、レーン２とレーン３において
約９万の分子量のところにはっきりとしたバンドが見ら
れ、レーン４の精製アミノペプチダーゼＹＲＣと一致す
る。

【００５５】

【表８】

【００５６】

【発明の効果】本発明によりラクトコッカス属乳酸菌の
新規なアミノペプチダーゼを精製すること、それをコー
ドする新規なアミノペプチダーゼの遺伝子を明らかにす
ることができた。また、本発明により遺伝子工学的な手
法で乳酸菌のアミノペペプチダーゼを大量生産する製造
方法がはじめて提供され、従来よりも極めて効率よく、
かつ経済的に生産することが可能となった。さらに、本
発明のＤＮＡ配列をもつＤＮＡ断片をプローブとして他
の乳酸菌から相同のアミノペプチダーゼ遺伝子をクロー
ニングすることも可能となった。

【００５７】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：８４８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 Thr Ala Ser Val Ala Arg Phe Ile Glu Ser Phe Ile Pro Glu Asn Tyr 1 5 10 15 Asn Leu Phe Leu Asp Ile Asn Arg Ser Glu Lys Thr Phe Thr Gly Asn 20 25 30 Val Ala Ile Thr Gly Glu Ala Ile Asp Asn His Ile Ser Leu His Gln 35 40 45 Lys Asp Leu Thr Ile Asn Ser Val Leu Leu Asp Asn Glu Ser Leu Asn 50 55 60 Phe Gln Met Asp Asp Ala Asn Glu Ala Phe His Ile Glu Leu Pro Glu 65 70 75 80 Thr Gly Val Leu Thr Ile Phe Ile Glu Phe Ser Gly Arg Ile Thr Asp 85 90 95 Asn Met Thr Gly Ile Tyr Pro Ser Tyr Tyr Thr Tyr Asn Gly Glu Lys 100 105 110 Lys Glu Ile Ile Ser Thr Gln Phe Glu Ile Ser His Phe Ala Arg Glu 115 120 125 Ala Phe Pro Cys Val Asp Glu Pro Glu Ala Lys Ala Thr Phe Asp Leu 130 135 140 Ser Leu Lys Phe Asp Ala Glu Glu Gly Asp Thr Ala Leu Ser Asn Met 145 150 155 160 Pro Glu Ile Asn Ser His Leu Arg Glu Glu Thr Gly Val Trp Thr Phe 165 170 175 Glu Thr Thr Pro Arg Met Ser Thr Tyr Leu Leu Ala Phe Gly Phe Gly 180 185 190 Ala Leu His Gly Lys Thr Ala Lys Thr Lys Asn Gly Thr Glu Val Gly 195 200 205 Val Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Glu Asn Ser Phe Asp Phe Ala Leu 210 215 220 Asp Ile Ala Val Arg Val Ile Glu Phe Tyr Glu Asp Tyr Phe Gln Val 225 230 235 240 Lys Tyr Pro Ile Pro Leu Ser Tyr His Leu Ala Leu Pro Asp Phe Ser 245 250 255 Ala Gly Ala Met Glu Asn Trp Gly Leu Val Thr Tyr Arg Glu Val Tyr 260 265 270 Leu Leu Val Asp Glu Asn Ser Ser Ala Ala Ser Arg Gln Gln Val Ala 275 280 285 Leu Val Val Ala His Glu Leu Ala His Gln Trp Phe Gly Asn Leu Val 290 295 300 Thr Met Lys Trp Trp Asp Asp Leu Trp Leu Asn Glu Ser Phe Ala Asn 305 310 315 320 Met Met Glu Tyr Val Ser Val Asn Ala Ile Glu Pro Ser Trp Asn Ile 325 330 335 Phe Glu Gly Phe Pro Asn Lys Leu Gly Val Pro Asn Ala Leu Gln Arg 340 345 350 Asp Ala Thr Asp Gly Val Gln Ser Val His Met Glu Val Ser His Pro 355 360 365 Asp Glu Ile Asn Thr Leu Phe Asp Ser Ala Ile Val Tyr Ala Lys Gly 370 375 380 Ser Arg Leu Met His Met Leu Arg Arg Trp Leu Gly Asp Glu Ala Phe 385 390 395 400 Ala Lys Gly Leu Lys Ala Tyr Phe Glu Lys His Gln Tyr Asn Asn Thr 405 410 415 Val Gly Arg Asp Leu Trp Asn Ala Leu Ser Glu Ala Ser Gly Lys Asp 420 425 430 Val Ser Ser Phe Met Asp Thr Trp Leu Glu Gln Pro Gly Tyr Pro Val 435 440 445 Val Ser Ala Glu Val Val Asp Asp Thr Leu Ile Leu Ser Gln Lys Gln 450 455 460 Phe Phe Ile Gly Glu His Glu Asp Lys Gly Arg Leu Trp Glu Ile Pro 465 470 475 480 Leu Asn Thr Asn Trp Asn Gly Leu Pro Asp Thr Leu Ser Gly Glu Arg 485 490 495 Ile Glu Ile Pro Asn Tyr Ser Gln Leu Ala Thr Glu Asn Asn Gly Val 500 505 510 Leu Arg Leu Asn Thr Ala Asn Thr Ala His Tyr Ile Thr Asp Tyr Gln 515 520 525 Gly Gln Leu Leu Asp Asn Ile Leu Glu Asp Phe Ala Asn Leu Asp Thr 530 535 540 Val Ser Lys Leu Gln Ile Leu Gln Glu Arg Arg Leu Leu Ala Glu Ser 545 550 555 560 Gly Arg Ile Ser Tyr Ala Ser Leu Val Gly Leu Leu Asp Leu Val Glu 565 570 575 Lys Glu Glu Ser Phe Phe Leu Ile Ser Gln Ala Lys Ser Gln Ile Leu 580 585 590 Ala Gly Leu Lys Arg Phe Ile Asp Glu Asp Thr Glu Ala Glu Val His 595 600 605 Tyr Lys Ala Leu Val Arg Arg Gln Phe Gln Asn Asp Phe Glu Arg Leu 610 615 620 Gly Phe Asp Ala Lys Glu Gly Glu Ser Asp Glu Asp Glu Met Val Arg 625 630 635 640 Gln Thr Ala Leu Ser Tyr Leu Ile Glu Ala Asp Tyr Gln Pro Thr Val 645 650 655 Leu Ala Ala Ala Asn Val Phe Gln Ala His Lys Glu Asn Ile Glu Ser 660 665 670 Ile Pro Ala Ser Ile Arg Gly Leu Val Leu Ile Asn Gln Met Lys Gln 675 680 685 Glu Asn Ser Leu Ser Leu Val Glu Glu Tyr Ile Asn Ala Tyr Val Ala 690 695 700 Thr Asn Asp Ser Asn Phe Arg Arg Gln Leu Thr Gln Ala Leu Ser Tyr 705 710 715 720 Leu Lys Asn Gln Glu Gly Leu Asp Tyr Val Leu Gly Gln Leu Lys Asp 725 730 735 Lys Asn Val Val Lys Pro Gln Asp Leu Tyr Leu Trp Tyr Met Asn Phe 740 745 750 Leu Ser Lys Ser Phe Ala Gln Glu Thr Val Trp Asp Trp Ala Lys Glu 755 760 765 Asn Trp Glu Trp Ile Lys Ala Ala Leu Gly Gly Asp Met Ser Phe Asp 770 775 780 Ser Phe Val Asn Ile Pro Ala Gly Ile Phe Lys Asn Gln Glu Arg Leu 785 790 795 800 Asp Gln Tyr Ile Ala Phe Phe Glu Pro Gln Thr Ser Asp Lys Ala Leu 805 810 815 Glu Arg Asn Ile Leu Met Gly Ile Lys Thr Ile Ala Ala Arg Val Asp 820 825 830 Leu Ile Glu Lys Glu Lys Ala Ala Val Glu Ser Ala Leu Lys Asp Tyr 835 840 845

【００５８】配列番号：２ 配列の長さ：２９４０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lact
is） 株名：YRC001 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：214..2768 特徴を決定した方法：E TCTAGAACGT ATTGGTGATT ATGCCCGTAA TCTTTGTGAA TGGGTTGTCT ACCTCAAGTC 60 TGGAAAAATC ATTGAATTAT AGGCAAAGTT TAATCTATGT TATAATGAGC CTGTATTGAA 120 TAATTCAGGC TCATTTCTTT TGTTAAAGTA CCTGATAGCG AAACAAATAT CAGTCTGTTT 180 CGATACGAAA AGTTAGATTA GGAGTATTTA CAT ATG ACA GCA TCT GTT GCT CGT 234 Met Thr Ala Ser Val Ala Arg 1 5 TTT ATC GAA AGT TTC ATC CCT GAA AAT TAC AAT CTT TTC TTG GAC ATT 282 Phe Ile Glu Ser Phe Ile Pro Glu Asn Tyr Asn Leu Phe Leu Asp Ile 10 15 20 AAT CGT TCT GAA AAG ACC TTT ACA GGG AAT GTT GCC ATT ACT GGT GAA 330 Asn Arg Ser Glu Lys Thr Phe Thr Gly Asn Val Ala Ile Thr Gly Glu 25 30 35 GCC ATT GAT AAT CAC ATC TCT CTT CAC CAA AAA GAC CTT ACC ATT AAT 378 Ala Ile Asp Asn His Ile Ser Leu His Gln Lys Asp Leu Thr Ile Asn 40 45 50 TCA GTT CTC TTG GAT AAT GAA TCC TTG AAC TTC CAA ATG GAT GAT GCC 426 Ser Val Leu Leu Asp Asn Glu Ser Leu Asn Phe Gln Met Asp Asp Ala 55 60 65 70 AAT GAG GCT TTT CAT ATT GAA CTT CCA GAA ACT GGG GTT CTA ACA ATT 474 Asn Glu Ala Phe His Ile Glu Leu Pro Glu Thr Gly Val Leu Thr Ile 75 80 85 TTC ATA GAA TTT TCT GGC CGC ATC ACA GAT AAT ATG ACT GGT ATT TAT 522 Phe Ile Glu Phe Ser Gly Arg Ile Thr Asp Asn Met Thr Gly Ile Tyr 90 95 100 CCA TCA TAT TAC ACT TAC AAT GGT GAA AAG AAG GAA ATT ATT TCA ACA 570 Pro Ser Tyr Tyr Thr Tyr Asn Gly Glu Lys Lys Glu Ile Ile Ser Thr 105 110 115 CAG TTT GAG ATC TCT CAT TTC GCT CGT GAA GCT TTT CCT TGT GTT GAT 618 Gln Phe Glu Ile Ser His Phe Ala Arg Glu Ala Phe Pro Cys Val Asp 120 125 130 GAA CCA GAA GCA AAA GCA ACT TTT GAT CTT TCA TTG AAA TTT GAC GCT 666 Glu Pro Glu Ala Lys Ala Thr Phe Asp Leu Ser Leu Lys Phe Asp Ala 135 140 145 150 GAA GAG GGC GAT ACT GCC TTG TCA AAC ATG CCA GAA ATC AAT AGC CAT 714 Glu Glu Gly Asp Thr Ala Leu Ser Asn Met Pro Glu Ile Asn Ser His 155 160 165 TTG CGT GAA GAA ACT GGA GTT TGG ACA TTC GAG ACA ACA CCT CGC ATG 762 Leu Arg Glu Glu Thr Gly Val Trp Thr Phe Glu Thr Thr Pro Arg Met 170 175 180 TCT ACA TAC CTT CTC GCC TTT GGT TTC GGT GCT CTT CAT GGT AAA ACA 810 Ser Thr Tyr Leu Leu Ala Phe Gly Phe Gly Ala Leu His Gly Lys Thr 185 190 195 GCT AAA ACA AAA AAC GGC ACT GAA GTT GGT GTC TTC GCT ACA GTT GCA 858 Ala Lys Thr Lys Asn Gly Thr Glu Val Gly Val Phe Ala Thr Val Ala 200 205 210 CAA GCA GAA AAT AGC TTC GAC TTC GCT CTT GAT ATT GCC GTT CGT GTC 906 Gln Ala Glu Asn Ser Phe Asp Phe Ala Leu Asp Ile Ala Val Arg Val 215 220 225 230 ATC GAA TTC TAT GAA GAC TAC TTC CAA GTC AAG TAT CCT ATT CCA TTA 954 Ile Glu Phe Tyr Glu Asp Tyr Phe Gln Val Lys Tyr Pro Ile Pro Leu 235 240 245 TCA TAC CAC CTT GCT CTT CCT GAC TTT TCA GCG GGT GCC ATG GAA AAC 1002 Ser Tyr His Leu Ala Leu Pro Asp Phe Ser Ala Gly Ala Met Glu Asn 250 255 260 TGG GGT CTT GTT ACC TAT CGT GAA GTT TAC CTC CTT GTA GAT GAA AAT 1050 Trp Gly Leu Val Thr Tyr Arg Glu Val Tyr Leu Leu Val Asp Glu Asn 265 270 275 AGC TCA GCT GCA AGC CGT CAA CAA GTT GCC CTT GTT GTT GCT CAC GAA 1098 Ser Ser Ala Ala Ser Arg Gln Gln Val Ala Leu Val Val Ala His Glu 280 285 290 TTG GCT CAC CAA TGG TTC GGT AAC CTT GTT ACC ATG AAA TGG TGG GAT 1146 Leu Ala His Gln Trp Phe Gly Asn Leu Val Thr Met Lys Trp Trp Asp 295 300 305 310 GAT TTA TGG CTT AAC GAA AGT TTC GCC AAC ATG ATG GAG TAT GTT TCA 1194 Asp Leu Trp Leu Asn Glu Ser Phe Ala Asn Met Met Glu Tyr Val Ser 315 320 325 GTG AAT GCT ATT GAA CCA AGC TGG AAC ATC TTT GAA GGA TTT CCA AAC 1242 Val Asn Ala Ile Glu Pro Ser Trp Asn Ile Phe Glu Gly Phe Pro Asn 330 335 340 AAA CTG GGT GTA CCT AAT GCT CTT CAA CGT GAC GCA ACA GAC GGC GTA 1290 Lys Leu Gly Val Pro Asn Ala Leu Gln Arg Asp Ala Thr Asp Gly Val 345 350 355 CAG TCT GTC CAC ATG GAA GTC AGT CAT CCA GAC GAG ATT AAC ACC CTC 1338 Gln Ser Val His Met Glu Val Ser His Pro Asp Glu Ile Asn Thr Leu 360 365 370 TTT GAT AGT GCT ATT GTT TAT GCC AAG GGT AGC CGT CTT ATG CAT ATG 1386 Phe Asp Ser Ala Ile Val Tyr Ala Lys Gly Ser Arg Leu Met His Met 375 380 385 390 CTC CGC CGT TGG TTA GGC GAT GAA GCC TTT GCC AAA GGG CTT AAA GCT 1434 Leu Arg Arg Trp Leu Gly Asp Glu Ala Phe Ala Lys Gly Leu Lys Ala 395 400 405 TAC TTT GAA AAA CAC CAA TAT AAC AAT ACT GTT GGA CGT GAC CTT TGG 1482 Tyr Phe Glu Lys His Gln Tyr Asn Asn Thr Val Gly Arg Asp Leu Trp 410 415 420 AAT GCT CTT TCA GAG GCT TCA GGT AAG GAT GTC TCT AGC TTC ATG GAC 1530 Asn Ala Leu Ser Glu Ala Ser Gly Lys Asp Val Ser Ser Phe Met Asp 425 430 435 ACA TGG TTA GAG CAA CCA GGA TAC CCA GTG GTT AGT GCA GAA GTT GTT 1578 Thr Trp Leu Glu Gln Pro Gly Tyr Pro Val Val Ser Ala Glu Val Val 440 445 450 GAT GAT ACG CTT ATC CTT AGT CAA AAA CAA TTC TTC ATT GGT GAA CAT 1626 Asp Asp Thr Leu Ile Leu Ser Gln Lys Gln Phe Phe Ile Gly Glu His 455 460 465 470 GAA GAC AAA GGG CGG CTT TGG GAG ATT CCA TTG AAT ACA AAC TGG AAT 1674 Glu Asp Lys Gly Arg Leu Trp Glu Ile Pro Leu Asn Thr Asn Trp Asn 475 480 485 GGG CTT CCA GAT ACA CTT TCA GGA GAG CGT ATT GAG ATT CCA AAT TAT 1722 Gly Leu Pro Asp Thr Leu Ser Gly Glu Arg Ile Glu Ile Pro Asn Tyr 490 495 500 AGC CAG CTT GCT ACT GAA AAT AAT GGA GTT CTC CGT CTT AAT ACA GCT 1770 Ser Gln Leu Ala Thr Glu Asn Asn Gly Val Leu Arg Leu Asn Thr Ala 505 510 515 AAT ACA GCA CAT TAC ATC ACA GAC TAT CAA GGA CAA CTC TTG GAC AAT 1818 Asn Thr Ala His Tyr Ile Thr Asp Tyr Gln Gly Gln Leu Leu Asp Asn 520 525 530 ATC TTA GAA GAT TTT GCA AAC CTT GAT ACT GTA AGT AAA CTT CAA ATC 1866 Ile Leu Glu Asp Phe Ala Asn Leu Asp Thr Val Ser Lys Leu Gln Ile 535 540 545 550 TTA CAA GAA CGC CGT CTT CTA GCG GAA AGT GGA CGT ATC TCG TAT GCA 1914 Leu Gln Glu Arg Arg Leu Leu Ala Glu Ser Gly Arg Ile Ser Tyr Ala 555 560 565 AGC CTA GTT GGT CTT CTT GAT CTT GTC GAA AAA GAA GAA AGC TTC TTC 1962 Ser Leu Val Gly Leu Leu Asp Leu Val Glu Lys Glu Glu Ser Phe Phe 570 575 580 TTG ATT TCT CAA GCT AAA TCT CAA ATC CTT GCT GGT TTG AAA CGC TTT 2010 Leu Ile Ser Gln Ala Lys Ser Gln Ile Leu Ala Gly Leu Lys Arg Phe 585 590 595 ATC GAT GAA GAT ACA GAA GCC GAA GTG CAT TAT AAA GCC TTG GTA CGT 2058 Ile Asp Glu Asp Thr Glu Ala Glu Val His Tyr Lys Ala Leu Val Arg 600 605 610 CGT CAA TTC CAA AAT GAC TTT GAA CGC CTT GGT TTC GAT GCC AAA GAA 2106 Arg Gln Phe Gln Asn Asp Phe Glu Arg Leu Gly Phe Asp Ala Lys Glu 615 620 625 630 GGG GAG TCT GAT GAA GAT GAA ATG GTC CGT CAA ACA GCT CTC AGC TAC 2154 Gly Glu Ser Asp Glu Asp Glu Met Val Arg Gln Thr Ala Leu Ser Tyr 635 640 645 TTG ATT GAA GCA GAC TAT CAA CCA ACA GTC CTT GCA GCC GCA AAT GTT 2202 Leu Ile Glu Ala Asp Tyr Gln Pro Thr Val Leu Ala Ala Ala Asn Val 650 655 660 TTC CAA GCC CAT AAA GAA AAC ATA GAA AGC ATT CCA GCA AGT ATC CGT 2250 Phe Gln Ala His Lys Glu Asn Ile Glu Ser Ile Pro Ala Ser Ile Arg 665 670 675 GGC CTT GTC CTC ATC AAC CAA ATG AAA CAA GAA AAC AGT CTT TCT CTT 2298 Gly Leu Val Leu Ile Asn Gln Met Lys Gln Glu Asn Ser Leu Ser Leu 680 685 690 GTT GAA GAG TAT ATT AAT GCA TAC GTG GCA ACA AAC GAC AGT AAC TTC 2346 Val Glu Glu Tyr Ile Asn Ala Tyr Val Ala Thr Asn Asp Ser Asn Phe 695 700 705 710 CGT CGT CAA TTG ACC CAA GCA CTT TCA TAT CTT AAA AAT CAA GAA GGT 2396 Arg Arg Gln Leu Thr Gln Ala Leu Ser Tyr Leu Lys Asn Gln Glu Gly 715 720 725 CTT GAC TAC GTA CTA GGT CAG CTA AAA GAT AAA AAC GTT GTT AAA CCG 2442 Leu Asp Tyr Val Leu Gly Gln Leu Lys Asp Lys Asn Val Val Lys Pro 730 735 740 CAA GAT TTG TAT CTC TGG TAT ATG AAC TTC CTC AGC AAA TCT TTT GCT 2490 Gln Asp Leu Tyr Leu Trp Tyr Met Asn Phe Leu Ser Lys Ser Phe Ala 745 750 755 CAA GAG ACC GTT TGG GAC TGG GCT AAA GAA AAC TGG GAG TGG ATT AAA 2538 Gln Glu Thr Val Trp Asp Trp Ala Lys Glu Asn Trp Glu Trp Ile Lys 760 765 770 GCA GCT CTT GGT GGC GAT ATG AGC TTT GAT AGT TTT GTT AAT ATC CCA 2586 Ala Ala Leu Gly Gly Asp Met Ser Phe Asp Ser Phe Val Asn Ile Pro 775 780 785 790 GCA GGA ATC TTT AAA AAT CAA GAA CGT CTT GAC CAA TAT ATT GCA TTT 2634 Ala Gly Ile Phe Lys Asn Gln Glu Arg Leu Asp Gln Tyr Ile Ala Phe 795 800 805 TTC GAG CCA CAA ACA AGT GAC AAA GCT TTG GAA CGT AAT ATT TTG ATG 2682 Phe Glu Pro Gln Thr Ser Asp Lys Ala Leu Glu Arg Asn Ile Leu Met 810 815 820 GGA ATT AAA ACA ATT GCT GCA CGC GTA GAC TTA ATT GAA AAA GAA AAA 2730 Gly Ile Lys Thr Ile Ala Ala Arg Val Asp Leu Ile Glu Lys Glu Lys 825 830 835 GCT GCG GTT GAA TCA GCT CTT AAA GAT TAT TAATATAAAA AACAAGCT 2778 Ala Ala Val Glu Ser Ala Leu Lys Asp Tyr 840 845 TTCCATGAAG GAGAGTTTGT TTTTATTTAC AATGATTTAC ATAATTTTAG TTCTGCTAAC 2838 AATCGTAAAT AAAATTATCA TCACATAATT AAATTTATGT ATAATAAAAA TAATCAACCT 2898 AAATCGGAAT GGTTTTGATT GGTTAATTAT AAATTATCTA GA 2940

【図面の簡単な説明】

【図１】 Q-Sepharose FF カラムでのアミノペプチダー
ゼの精製のクロマトグラムを示す。黒丸はアミノペプチ
ダーゼの相対活性を示す。破線は２８０nmでの吸光度す
なわちタンパクの濃度を示す。より細かい破線はグラジ
エントの塩濃度を示す。

【図２】 Sephacryl S300 ゲルクロマトグラフィーでの
精製のクロマトグラムを示す。黒丸はアミノペプチダー
ゼの相対活性を示す。破線は２８０nmでの吸光度すなわ
ちタンパクの濃度を示す。

【図３】 Mono Ｑカラムでの精製のクロマトグラムを示
す。黒丸はアミノペプチダーゼの相対活性を示す。破線
は２８０nmでの吸光度すなわちタンパクの濃度を示す。
実線はグラジエントの塩濃度を示す。

【図４】 ハイドロキシアパタイトカラムでの精製のク
ロマトグラムを示す。矢印はアミノペプチダーゼ活性が
単一のピークと一致して、ほぼ完全に精製されたことを
示す。実線は２８０nmでの吸光度すなわちタンパクの濃
度を示す。活性のあったピークは図中に示してある。

【図５】 酵素の活性に対する温度の影響を示すグラフ
である。黒丸はアミノペプチダーゼの相対活性を示す。

【図６】 酵素の活性に対するｐＨの影響を示すグラフ
である。実線はクエン酸リン酸バッファーを用いたとき
の結果を、破線はリン酸バッファーを用いたときの結果
を示す。

【図７】 精製各段階のサンプルをSDS-ポリアクリルア
ミド電気泳動の図である。

【図８】 サザンハイブリダイゼーションの結果を示
す。矢印で示した数字はそれぞれのバンドのだいたいの
大きさ（塩基対）を示す。

【図９】 アミノペプチダーゼ遺伝子を含むXbaI断片の
制限酵素地図と塩基配列決定の戦略を示す。特にアミノ
ペプチダーゼ遺伝子の位置と方向は白ぬきの矢印で示し
た。制限酵素切断部位のカッコ内の数字はアミノペプチ
ダーゼ遺伝子の開始コドン側の上流に存在するXbaIサイ
トからの距離（塩基対）を示す。

【図１０】 大腸菌でのアミノペプチダーゼの発現をSD
S-ポリアクリルアミド電気泳動で確認した図である。

【符号の説明】

図７において、レーン１は全菌体の抽出液、レーン２は
Q-Sepharose で分画した活性画分、レーン３はSephacry
lS300 カラムで分画した活性画分、レーン４はMonoQ カ
ラムで分画した活性画分、レーン５はハイドロキシアパ
タイトカラムで分画した活性画分、レーン６は分子量マ
ーカーを示す。図１０において、レーン１は対照である
ベクターのみを含む大腸菌菌体抽出液、レーン２はpXB1
1 を有する大腸菌菌体抽出液、レーン３はpXB11Rを有す
る大腸菌菌体抽出液、レーン４は比較のために精製した
アミノペプチダーゼＹＲＣ標品を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 司城 不二 北海道札幌郡広島町輪厚465−１番地 よ つ葉乳業株式会社リサーチセンター内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ラクトコッカス(Lactococcus) 属乳酸菌
   に由来し、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列また
   は該アミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸残
   基が欠失、付加あるいは置換されたアミノ酸配列を有す
   る新規アミノペプチダーゼ。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号２記載の塩基配列また
   はそれと実質的に同一の機能を有するアミノペプチダー
   ゼ遺伝子。
3. 【請求項３】 請求項２記載の塩基配列にハイブリッド
   する塩基配列であり、かつアミノペプチダーゼ活性を有
   するタンパク質をコードするＤＮＡ配列。
4. 【請求項４】 請求項２記載の塩基配列を含むＤＮＡ断
   片を有するプラスミドで形質転換したエシェリヒア(Esc
   herichia) 属細菌。
5. 【請求項５】 請求項４記載の形質転換体を培養し、培
   養物からアミノペプチダーゼを採取することを特徴とす
   るアミノペプチダーゼの生産方法。