ES2327709T3 - Conjugados inyectables de hialuronato-polisacarido sulfatado. - Google Patents

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Abstract

Compuesto inyectable para favorecer el crecimiento óseo en un hueso o cartílago objetivo, comprendiendo ácido hialurónico reticulado mediante grupos de enlace a un polisacárido sulfatado en el que se seleccionan grupos de enlace a partir del grupo que consiste en diaminas y diamina-polialquilenglicoles y dicho polisacárido sulfatado es unido a dichos grupos de enlace con intermedio de enlaces amina o imina.

Description

Conjugados inyectables de hialuronato-polisacárido sulfatado.
La presente invención está dirigida a un compuesto inyectable para la reparación terapéutica de tejidos de cartílagos óseos, a métodos para la producción de dichos compuestos y a métodos para su utilización para favorecer el crecimiento de tejidos.
En particular, la invención esta dirigida a un gel inyectable que reúne factores de crecimiento, de diferenciación y otros factores para inducir la proliferación celular y diferenciación in Vitro o in Vivo en un lugar deseado de crecimiento óseo o de cartílago.
Antecedentes de la invención
El desarrollo de productos terapéuticos para restablecer o sustituir la función de tejidos conectivos dañados ha sido estimulado por el envejecimiento de la población, escasez de donantes de hueso y el potencial de transmisión de enfermedades infecciosas. Debido a la capacidad autoregenerativa de huesos y cartílagos, se han realizado extensas investigaciones para el desarrollo de biomateriales que soportan la inducción de tejido a partir del tejido que rodea aquellos que se deben reparar.
Un enfoque para la reparación de tejidos comporta la administración de factores de crecimiento en solución con un sistema de suministro apropiado en el lugar deseado de los tejidos. Ver Kenley y otros, Pharm. Res. 10:1393 (1993); Anderson y otros, Curr. Opin. Ther. Patents, 4:17 (1994). Un inductor primario de formación de mesodermo en embriogénesis, bFGF, juega aparentemente un papel en la osteogénesis. Las proteínas morfogénicas del hueso (BMPs), elementos de la superfamilia de proteínas del factor de crecimiento transformante, son inductores de hueso. Sampath y otros, J. Biol. Chem., 267:20352 (1992); Wozney y otros, Science, 242:1528 (1988). Estas moléculas están involucradas en la proliferación celular y diferenciación tanto in vitro como in vivo. Las funciones biológicas de estos factores de crecimiento están mediadas por la interacción de los factores de crecimiento con receptores de células superficiales de alta afinidad y subsiguientes alteraciones en expresión de genes dentro de las células estimuladas.
No obstante, el desarrollo de sistemas de suministro efectivos para estos factores de crecimiento ha sido un obstáculo principal. El desarrollo de un sistema de suministro efectivo y eficaz es crucial para la utilización viable de factores de crecimiento en la reparación de huesos o cartílagos. Se han investigado prótesis de polímeros sintéticos, cerámicas inorgánicas, hidrogeles y vehículos inyectables de polímeros naturales o sintéticos con la intención de localizar y mantener agentes activos en el lugar de administración, pero ha sido difícil crear un sistema de suministro que incorpore estabilidad del factor de crecimiento y perfiles de liberación óptimos. Ver Hollinger y otros, J. Craniofac. Surg. 4:115 (1993); J. Control. Red. 39:287 (1996); Miyamoto y otros, Clin. Orthop. Red. Res., 274:266 (1992). El ácido hialurónico es un componente natural de la matriz extracelular de la mayor parte de tejidos y se esteriliza con facilidad, es biodegradable y puede ser producido en una amplia gama de consistencias y formatos. En general es soluble en agua, biocompatible y sus características de resorción pueden ser controladas por la manipulación de monómeros. Es un polímero lineal constituido por unidades de disacáridos repetitivas de glicosaminoglicano (GAG) de ácido D-glucurónico y N-acetilglicosamina en enlaces \beta(1-3) y \beta(1-4).
Los GAG sulfatados, tales como sulfato de dermatán, sulfato de heparán, sulfato de condroitina y sulfato de queratán se encuentran principalmente en la matriz extracelular y sobre la superficie celular en forma de proteoglicanos. Estas macromoléculas son segregadas por células y juegan un papel tanto en la transducción de señal como en almacenamiento de algunos factores de crecimiento, tales como FGFs, TGF-\beta y BMPs. Ver Viodavsky y otros, PNAS, 84:2292 (1987); Nakagawa y otros, Exp. Cell Res. 182:572 (1989). El ácido hialurónico y los GAG sulfatados son fácilmente esterilizados, son biodegradables y pueden ser producidos en una amplia gama de consistencias y formatos. Ver Robinson y otros, Calcif. Tissue Int., 46:246 (1990). Se dan a conocer en el documento WO 99/01143, publicado el 14 de enero de 1999, portadores de medicamentos de polisacáridos enlazados a enlazadores con intermedio de enlaces amida e imina.
Resumen de la invención
La presente invención está dirigida a un compuesto inyectable para inducir crecimiento de tejidos en lugares objetivo de huesos o cartílagos, comprendiendo ácido hialurónico (HA) enlazado a polisacárido sulfatado (SP) con intermedio de grupos de enlace. El grupo de enlace es, preferentemente, una diamina o un polialquilenglicol con terminación amino. Los polisacáridos sulfatados son sulfatos orgánicos, tales como heparina, sulfato de dermatán, sulfato de condroitina, sulfato de heparán, sulfato de dextrano, sulfato de queratán y polisacáridos sulfatados similares, tales como sulfato de hexuronil hexosaminoglicano, hexasulfato de inositol y octasulfato de sacarosa, que tienen afinidad de unión para los factores de crecimiento. Preferentemente, el peso molecular de los polisacáridos sulfatados es menor de 10^{4} Daltons.
Se dan a conocer métodos para la producción de dichos compuestos por oxidación del ácido hialurónico en condiciones tales que se forman grupos aldehído en el ácido hialurónico, reaccionando a continuación el ácido hialurónico oxidado con el grupo de enlace con terminación amino. El polisacárido sulfatado oxidado contiene también grupos aldehído y es obligado a reaccionar con el otro extremo amino del grupo de enlace formando el compuesto reticulado.
También se dan a conocer métodos para la utilización del compuesto inyectable por mezcla del compuesto reticulado con uno o varios factores de crecimiento e inyectando la mezcla en el lugar de un sujeto en el que se desea crecimiento óseo.
Tal como se utiliza en la presente solicitud, se define reparación como crecimiento de tejidos nuevos. Las características celulares básicas involucradas en la reparación comprenden adherencia, proliferación, emigración y diferenciación. Por conducción, se comprende que el tejido crece por extensión sobre células existentes del mismo tipo.
Breve descripción del dibujo
La figura 1 es un esquema de síntesis de compuestos de la invención.
La figura 2 es un perfil de liberación de FGF-2 descrito en el ejemplo 3.
La figura 3 es un gráfico de bioactividad de los compuestos de la invención con respecto a un control para estimulación de crecimiento de células de fibroblastos descrito en el ejemplo 4.
La figura 4 es un gráfico de crecimiento celular como función de la concentración tal como se describe en el ejemplo 4.
La figura 5 es un perfil de liberación de un compuesto de la invención con respecto a varios controles tal como se describe en ejemplo 3.
Descripción de las realizaciones preferentes
Un método para la preparación de un compuesto inyectable, según la presente invención, comporta la oxidación de anillos de azúcar sobre el ácido hialurónico para formar grupos extremos de formaldehído utilizando, por ejemplo, periodato sódico o potásico como agente oxidante selectivo. La cantidad de grupos de aldehído producidos de esta manera puede ser controlada estequiométricamente. De manera típica, desde aproximadamente uno a 50% de los anillos pueden ser abiertos de esta manera sobre una molécula de ácido hialurónico. Los grupos aldehído son obligados a reaccionar, a continuación, con un grupo reticulante de diamina. En presencia de un agente reductor, una amina secundaria o terciaria se forma constituyendo puente entre el grupo de enlace con el ácido hialurónico. El polisacárido sulfatado es preparado de manera similar para oxidar anillos de azúcar para formar grupos aldehído. El polisacárido sulfatado oxidado es obligado a reaccionar, a continuación, en presencia o ausencia de un agente reductor con el ácido hialurónico que lleva el grupo de enlace formando conjugado reticulado de polisacárido sulfatado-ácido hialurónico. En ausencia de un agente reductor, el aldehído y un grup amina del grupo reticulante se condensan formando una imina.
Los inventores han descubierto que los factores de crecimiento, tales como bFGF, pueden unirse específicamente a geles de conjugado de heparina-hialuronato (HAHP), así como otros geles de hialuronato-polisacárido sulfatado (HAHP), en los que la heparina estaba acoplada a hialuronato con intermedio de un enlace lábil de imina. La unión de bFGF a HAHP, por ejemplo, es reversible y la liberación de bFGF a partir del gel tiene lugar de manera controlada que es dependiente de la densidad del gel y de la cantidad de heparina conjugada en el gel. Si bien los inventores no desean quedar ligados a una teoría, la liberación de un complejo más activo bFGF/heparina a partir de geles de HASP puede formar parte del mecanismo por el cual el bFGF estimula la proliferación celular y el aumento de los tejidos. Otros parámetros, tales como la absorción por intercambio de factores de crecimiento entre los geles y la heparina autógena u otros componentes de la matriz extracelular existente en el fluido de la herida de los tejidos dañados, pueden jugar también un papel significativo.
De manera típica, el peso molecular del ácido hialurónico en el polisacárido sulfatado se encontrará en un intervalo aproximado de 1.000 a 10.000.000 daltons.
Los polisacáridos sulfatados preferentes son heparina y sulfato de heparán.
Además de la heparina y sulfato de heparán, los geles formados por la conjugación de hialuronato y glicosaminoglicanos sulfatados o productos orgánicos sulfatados, tales como sulfato de dermatán, sulfato de condroitina, sulfato de hexuronil hexosaminoglicano, sulfato de queratán, hexasulfato de inositol y octasulfato de sacarosa, también potencian la actividad mitogénica y la estabilidad del bFGF. Otros factores de crecimiento, tales como los de la familia de factores de crecimiento de tipo insulina, familia EGF, familia FGF, familia GDF, factores de transformación de crecimiento -\betas(TGF-\betas) y su superfamilia relacionada de factores de crecimiento (por ejemplo, los BMP) que se unen a heparina, sulfato de heparán u otros glicosaminoglicanos sulfatados son también útiles.
Los reactivos para abrir los anillos de azúcar en el ácido hialurónico y el polisacárido sulfatado pueden ser cualquier agente oxidante selectivo que oxida el grupo hidroxil terminal pasando a un aldehído, tal como periodato potásico o sódico. Otros reactivos comprenden oxidasas específicas de azúcar.
Haciendo referencia a la figura 1, se ha mostrado un esquema de síntesis para la preparación de los conjugados. El ácido hialurónico (HA) es oxidado con periodato sódico para formar aldehídos (HA=O). A continuación, se hace reaccionar con el grupo de enlace diamina en presencia de un agente reductor para formar HA que está unido mediante amina a los extremos del grupo de enlace. La heparina (HP) es oxidada de manera similar con periodato sódico para formar aldehídos (HP=O). El HA que contiene un grupo de enlace es obligado a reaccionar, a continuación, con la heparina oxidada (HP=O), en presencia o ausencia de un agente reductor, para formar, respectivamente, el conjugado enlazado a amina, HAHPa, o el conjugado enlazado a imina, HAHPi.
Si bien los inventores no desean quedar unidos por ninguna teoría, se cree que el ácido hialurónico imparte básicamente la característica de viscosidad al hacer inyectable el compuesto y dándole capacidad de retención en el lugar en el que se desea crecimiento de tejido. Preferentemente, el ácido hialurónico tendrá un peso molecular en un intervalo de 1 a 2 x 10^{6} daltons que es suficiente para proporcionar la viscosidad deseada.
El agente de enlace puede ser hidrofóbico, hidrofílico o puede tener cadena larga o cadena corta. De manera típica estos tendrán las siguientes fórmulas:
H_{2}N(CH_{2})_{n} NH_{2}; \hskip0.5cm n = 1 a 1000
\vskip1.000000\baselineskip
H_{2}N(CH_{2})_{n}[0(CH_{2})_{s}]_{t}0(CH_{2})_{u} NH_{2};
r, s, u son 1 a 10;
t es 1 a 100
\vskip1.000000\baselineskip
Si bien el agente de enlace se supone que afecta en cierta medida a la viscosidad y a la hidrofilicidad del gel inyectable, también tiene efectos sobre la actividad y la estabilidad enzimática del polisacárido sulfatado conjugado. Son grupos preferentes reticulantes etilenediamina, hexanediamina, dodecandiamina, y diamina-polietilenglicol (PEG-(amina_{2}), típicamente con un peso molecular de 1.000 a 6.000 daltons.
El polisacárido sulfatado tendrá una capacidad de unión específica o no específica al factor de crecimiento.
Los factores de crecimiento pueden ser cargados en geles HASP simplemente por mezcla mecánica de las dos partes a temperatura ambiente. De manera típica, se pueden utilizar bFGF al 9% (peso/volumen) de sacarosa, 1 mm EDNA, citrato sódico 20 mM a pH 5,0, y GDF-5 en ácido acético 20 mM, pH 4. En una formulación típica, 50 \mul de solución de factor de crecimiento con una cantidad conocida de GF (10ng-5mg/ml) es mezclada con 950 \mul del gel disuelto en un tampón correspondiente con la densidad de 5-20 mg/ml en un tubo micrófugo de polipropileno a temperatura ambiente. Dado que la absorción de proteína en el polipropileno es despreciable, el contenido de factor de crecimiento en los geles HASP se considera como la cantidad inicial de factores de crecimiento añadidos.
La proporción de ácido hialurónico con respecto al polisacárido sulfatado en el compuesto se puede caracterizar en base de proporción molar o de peso. De manera típica, la proporción en peso de ácido hialurónico con respecto al polisacárido sulfatado es de 99:1 a 1:99. Esto representa una proporción molar aproximada de 99,9:0,1 a 1:9 respectivamente, suponiendo un peso molecular promedio de 10^{6} daltons para el ácido hialurónico y 10^{5} daltons para el polisacárido sulfatado. La proporción molar puede variar dependiendo del peso molecular real del polisacárido sulfatado y del ácido hialurónico utilizados.
Los compuestos son formados como gel viscoso y pueden ser aplicados directamente o inyectados en el lugar en el que se desea el crecimiento de un nuevo tejido óseo tal como, por ejemplo, llenando defectos óseos, reparación de fracturas o defectos de injerto periodontal.
Tal como se comprenderá por los expertos de la materia, la cantidad de gel a administrar para llevar a cabo crecimiento óseo depende de la extensión del defecto óseo a tratar. Los siguientes ejemplos tienen finalidad demostrativa y no están destinados a limitar la invención en modo alguno.
Ejemplo 1 Síntesis del polisacárido activo
Se formaron geles por la conjugación de HA portador de grupos de amina primaria con heparina HP que llevaba grupos de aldehído activos, tal como se ha mostrado en la figura 1. Los geles enlazados con imina se han identificado como HAHPi y los geles enlazados con amina se han identificado como HAHPa en la tabla 1. Los polisacáridos que llevan aldehídos activos fueron preparados por oxidación con periodato sódico, tal como se ha descrito anteriormente (Biomaterials, 20: 1097-1108, 1999). El grado de oxidación fue controlado alterando el tiempo de reacción y fue monitorizado midiendo la incorporación de 14C-metilamina. La concentración de aldehídos generados de este modo, fue calculada basándose en la radioactividad específica de polisacáridos marcados con 14C-metilamina que se encuentra en fracciones de volumen vacío en filtración de gel. Los grupos de amina primaria fueron introducidos en el HA oxidado por reacción con un exceso de etilendiamina (-CHO/-NH_{2'} = 1/60, mol/mol), y fueron cuantificados utilizando un reactivo de trinitrofenilación (Anal. Biochem., 207:129-133. 1992).
La conjugación de HA a heparina fue confirmada por espectroscopia de infrarrojos (FT-IR) con transformada de Fourier y análisis por cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC). El contenido de heparina fue determinado por un método de fluorescencia por rayos X utilizando mezclas de HA y heparina de concentraciones conocidas como estándares.
TABLA 1
1
Ejemplo 2 Incorporación de FGF-2 en geles
Se cargó el FGF-2 (Scios, Inc., Mountain View, USA) en geles del ejemplo 1 justamente antes de la utilización por mezcla a temperatura ambiente. Se utilizó FGF-2 marcado mediante ^{125}I como trazador para los experimentos de cinética de liberación y se mezcló con factor de crecimiento sin marcar y gel de HAHP en 9% (p/v) de sacarosa, 1 nM EDNA, citrato sódico 20 mM tamponado a pH 5,0. Para los estudios de actividad y estabilidad, se utilizó como disolvente 0,2% de colágeno, 50 nM HC1 a pH 4,0.
Ejemplo 3 Liberación controlada de FGF-2 a partir de geles
Se llevaron a cabo pruebas de liberación por un método que se ha descrito con anterioridad (J. Control. Rel, 43:65-74, 1997), utilizando una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos dotada de un inserto de membrana porosa (dimensión de los poros 0,4 \mu). Se cargaron muestras de gel en la parte superior de la membrana y se añadió 5,0 ml de media de liberación (9%(p/v) de sacarosa, 1 mM EDNA, citrato sódico 20 nM tamponado a pH 5,0) en la cámara inferior. En los momentos de tiempo deseados, el volumen medio restante en las cámaras fue calculado y se cuantificó la cantidad de FGF-2 liberada al medio por contagio de centelleo. La cantidad de polisacáridos retenidos y liberados fue medida utilizando un ensayo de ácido urónico previamente descrito (Anal. Biochem., 4:330-334, 1962).
La liberación acumulativa de FGF-2 a partir de los geles de amina enlazada e imina enlazada en comparación con HA se muestra en la figura 2 con concentraciones de 1 mg/ml FGF-2 y 10 mg/ml gel. La liberación fue retrasada en los geles en comparación con la liberación en HA.
La figura 5 muestra el perfil de liberación de bFGF a partir de varias combinaciones de HA, HP y HAHP. La liberación queda indicada como C_{t}/C_{o} x 100, siendo C_{t} la cantidad de bFGF en el medio de liberación y C_{o} la cantidad original de bFGF. Los datos son facilitados como la media con desviación estándar (n=5). La incorporación de bFGF en conjugado de HAHP resultó en un perfil de liberación de crecimiento más sostenido en comparación con gel de HA, HP en tampón, tampón solo (sacarosa/EDTA/citrato, pH 5), o HA no conjugado y combinaciones de HP. En ausencia de conjugación de componentes de HA y HP, el perfil de liberación de bFGF fue proporcional a la viscosidad de la solución portadora.
Ejemplo 4 Efecto de HAHP sobre la bioactividad y estabilidad de FGF-2
Se midió la bioactividad de FGF-2 en varias formulaciones por cuantificación de la estimulación de crecimiento de células de fibroblastos in Vitro. Se cultivaron células NIH 3T3 en medio DMEM conteniendo 10% de suero bovino fetal (v/v) (FBS) o medio DMEM libre de sulfato conteniendo 0,5% de FBS durante tres días en condiciones estándar. Se añadieron FGF-2 y HAHP en las proporciones deseadas en el momento de la siembra de las células. El número de células fue medido utilizando un reactivo MTS/PMS (Cancer Commun., 3:207, 1991). Los resultados se muestran en la figura 3. La muestra (A) era el control. En las muestras (B a D) se añadieron 500 ng/ml de FGF-2. En la muestra (C) se añadieron también 1,0 \mug/ml de HAHPi. En la muestra (D) se añadieron también 1,0 \mug/ml de HAHPa. En la figura 4 se añadieron concentraciones crecientes de HAHPi en las muestras (B) hasta (F) a 0,6, 1,2, 2,0, 10 y 100 \mug/ml, respectivamente. Se añadieron HAHPa (2 \mug/ml) en la muestra (G). La muestra (A) era el control.
Para la evaluación de la estabilidad del factor de crecimiento, se incubaron FGF-2 en solución o incorporado en geles conjugados de HAHP a 37ºC durante 1, 3, 7 y 14 días en tubos de polipropileno prerrecubierto con BSA. En cada momento de tiempo, se retiró una cantidad alícuota de cada muestra y se evaluó la actividad de FGF-2, tal como se ha descrito en lo anterior. Los resultados se indican en la tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2
2
Ejemplo 5 Modelo animal y evaluación in Vivo
Se examinó el efecto de geles de HAHP conteniendo FGF-2 sobre la formación de hueso periostial en ratas
Sprague-Dawley (4-6 semanas de edad, 140-160 g, macho). Se inyectaron porciones de 50 \mul de formulaciones gel conteniendo FGF-2 (10 ng a 1,0 mg por ml), o solución portadora de control en bolsas creadas bajo el periostio del hueso parietal de las ratas. Los animales fueron sacrificados después de 14 días, y los huesos de la bóveda craneal fueron fijados con formalina neutra al 10%, descalcificados y embebidos en parafina. Las secciones corona (grosor 3-5 \mum) fueron preparadas y teñidas con hermatoxilina y eosina para la evaluación con microscopio óptico. El grosor del hueso parietal (excluyendo el grosor del periostio) se midió utilizando imágenes fotográficas capturadas por medio de una cámara de vídeo. Las secciones fueron calibradas con un micrómetro en tres puntos separados, aproximadamente a 500 \mum entre sí. El valor promedio fue calculado y utilizado como grosor medio de cada uno de los huesos parietales.
La significación estadística de los datos fue evaluada por una prueba T no apareada. Los resultados se muestran en la tabla 3.
TABLA 3
4

Claims (23)

1. Compuesto inyectable para favorecer el crecimiento óseo en un hueso o cartílago objetivo, comprendiendo ácido hialurónico reticulado mediante grupos de enlace a un polisacárido sulfatado en el que se seleccionan grupos de enlace a partir del grupo que consiste en diaminas y diamina-polialquilenglicoles y dicho polisacárido sulfatado es unido a dichos grupos de enlace con intermedio de enlaces amina o imina.
2. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que dicho compuesto es un gel viscoso soluble en el agua.
3. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que dicho polisacárido sulfatado es seleccionado entre el grupo que consiste en heparina, sulfato de condroitina, sulfato de dextrano, sulfato de dermatán, sulfato de heparán, sulfato de queratán, sulfato de hexuronil hexosaminoglicano, hexosulfato de inisitol y octosulfato de sacarosa.
4. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que dicho grupo de enlace es seleccionado entre el grupo que consiste en etilendiamina, hexanodiamina, dodecanodiamina y diamina-polietilenglicol.
5. Compuesto, según la reivindicación 4, en el que el peso molecular de dicho grupo moleculante se encuentra en el intervalo de 1.000 a 6.000 daltons.
6. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que el peso molecular de dicho ácido hialurónico se encuentra en el intervalo de 1 a 2 x 10^{6} daltons.
7. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que el peso molecular de dicho polisacárido sulfatado es menor de 10^{4} daltons.
8. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que dicho ácido hialurónico es unido a dicho grupo de enlace por una amina.
9. Compuesto, según la reivindicación 1, que comprende además un factor de crecimiento.
10. Método para la preparación de un gel inyectable para colaborar en la reparación de hueso o cartílago que comprende las etapas de oxidación de ácido hialurónico para formar un ácido hialurónico modificado que tiene grupos aldehído, haciendo reaccionar dicho ácido hialurónico modificado con un agente de enlace que tiene grupos amina extremos para formar un ácido hialurónico que tiene grupos de enlace colgantes con grupos de amina terminales y haciendo reaccionar a dicho ácido hialurónico que tiene grupos de enlace colgantes con un polisacárido sulfatado que tiene grupos aldehído para enlazar de forma covalente dicho polisacárido sulfatado a dichos grupos de enlace.
11. Utilización del compuesto de la reivindicación 1 en la fabricación del medicamento para inducción de crecimiento de tejidos óseos o de cartílagos in Vivo.
12. Utilización, según la reivindicación 11, en la que dicho grupo de enlace es seleccionado entre el grupo que consiste en etilendiamina, hexanodiamina, dodecanodiamina y diamina-polietilenglicol.
13. Utilización, según la reivindicación 11, en la que el peso molecular de dicho grupo de enlace se encuentra en el intervalo de 1.000 a 6.000 daltons.
14. Utilización, según la reivindicación 11, en la que el peso molecular de dicho ácido hialurónico está comprendido en el intervalo de 1 a 2 x 10^{6} daltons.
15. Utilización, según la reivindicación 11, en la que el peso molecular de dicho polisacárido sulfatado es menor de 10^{4} daltons.
16. Utilización, según la reivindicación 11, en la que dicho ácido hialurónico está unido a dicho grupo de enlace mediante una amina.
17. Utilización, según la reivindicación 11, en la que dicho polisacárido sulfatado es unido a dicho grupo de enlace con intermedio de una amina o imina.
18. Compuesto, según la reivindicación 3, en el que dicho polisacárido sulfatado comprende heparina.
19. Compuesto, según la reivindicación 9, en el que dicho factor de crecimiento es seleccionado entre el grupo que comprende las familias de factores IGF, TGF-\beta, BMP, EGF, FGF y GDF.
20. Compuesto, según la reivindicación 19, en el que dicho factor de crecimiento comprende un FGF.
21. Utilización, según la reivindicación 11, en la que dicho polisacárido sulfatado comprende heparina.
22. Utilización, según la reivindicación 11, en la que dicho factor de crecimiento es seleccionado entre el grupo que consiste en las familias de factores IGF, TGF-\beta, BMP, EGF, FGF y GDF.
23. Utilización, según la reivindicación 22, en la que dicho factor de crecimiento comprende un FGF.
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