ES2322890T3 - Procedimiento y cubeta de analisis. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de determinación cuantitativa de hemoglobina en sangre entera no diluida que consta de las siguientes etapas: Introducir una muestra de sangre entera no diluida mediante acción capilar en una microcubeta desechable que presenta por lo menos una cavidad para recibir la muestra, incluyendo la cavidad un agente hemolizante esencialmente no higroscópico, seleccionado de entre el grupo que consiste en sustancias tensioactivas iónicas y no-iónicas, en una forma seca, en la que se disuelve el agente hemolizante, se hemolizan los glóbulos rojos y se libera la hemoglobina contenida en los glóbulos rojos; Llevar a cabo una primera medición por absorción a una longitud de onda en el intervalo de entre 490 nm y 520 nm directamente sobre la muestra hemolizada en la cubeta; y Adicionalmente llevar a cavo una segunda medición por absorción a una longitud de onda en el intervalo de entre 850 nm y 910 nm para compensar las interferencias de fondo, en la que el periodo de hemolización de dicha sangre entera no diluida es inferior a 40 segundos.
Description
Procedimiento y cubeta de análisis.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de análisis y a una cubeta para la realización de este
análisis. Concretamente la invención se refiere a un procedimiento
para la determinación de hemoglobina en sangre entera no diluida y a
una cubeta desechable que puede utilizarse en dicha
determinación.
Con anterioridad se conoce de la patente
estadounidense US nº 4.088.448 una cubeta desechable para tomar
muestras de un líquido, mezclar la muestra con un reactivo y
directamente realizar un análisis óptico de la muestra mezclada.
Esta cubeta ya conocida presenta varias ventajas ya que, entre otras
cosas, simplifica el procedimiento de tomar muestras, reduce el
número de utensilios y mejora de forma considerable la precisión del
análisis llevando a cabo el procedimiento de análisis
independientemente de la técnica de operación del operario que lleva
a cabo el análisis. Se describe una construcción de una cubeta
basada en el mismo principio y con características de flujo
mejoradas en la patente estadounidense US 5 674 457.
Actualmente se utiliza extensamente una cubeta
desechable desarrollada según estas patentes para la medición de la
hemoglobina (determinación de Hb) de la sangre entera no diluida.
Con este fin, la cavidad de la cubeta ha sido tratada previamente
con un reactivo, de manera que cuando entra una muestra de sangre en
la cubeta, las paredes de los glóbulos rojos se desintegran y se
inicia una reacción química. El resultado de la reacción permite la
determinación de Hb mediante medición por absorción directamente a
través de las paredes transparentes de la cubeta que, en la zona de
medición, también denominada ventana óptica, tiene una distancia
predeterminada y definida con precisión entre las superficies
interiores de las paredes planas opuestas. El procedimiento de
medición está basado en un procedimiento modificado de
azidmetahemoglobina según Vanzetti, G., Am. J. Lab. & Clin. Med.
67, 116
(1966).
(1966).
Las mediciones espectrofotométricas se han
realizado a 570 nm y 880 nm. Este procedimiento de medición
cuantitativa basado en la química seca ha tenido un éxito
considerable como puede verse en, por ejemplo, el artículo de von
Schenck et al. en Clinical Chemistry, vol 32, No 3, 1986 ya
que el procedimiento proporciona unos resultados iguales e incluso
mejores comparándolos con los resultados obtenidos con
procedimientos estándares húmedos para la determinación de Hb. El
reactivo utilizado está compuesto por desoxicolato de sodio que
hemoliza los glóbulos rojos, azida sódica y nitrito sódico, que
convierte la hemoglobina en azidmetahemoglobina.
Debido a las propiedades higroscópicas de los
reactivos utilizados, la durabilidad es limitada y es necesario
almacenar las cubetas en paquetes precintados que incluyen un agente
secante. Incluso más problemático es el hecho de que, en climas con
una alta humedad, la cubeta debe utilizarse en el transcurso de unos
pocos minutos tras haber sido retirada del paquete, ya que de lo
contrario los reactivos resultarán destruidos y la medición será
imprecisa y por lo tanto no tendrá utilidad alguna.
Es un propósito de la presente invención
proporcionar un procedimiento rápido y cuantitativo para la
determinación de hemoglobina en sangre entera.
Un segundo propósito es proporcionar un
procedimiento para la determinación de hemoglobina en sangre entera,
que puede llevarse a cabo en una microcubeta desechable.
Un tercer propósito es proporcionar una
microcubeta para la determinación de la hemoglobina en sangre entera
no diluida en cuyo procedimiento quedan eliminados los problemas
originados a partir de las propiedades higroscópicas de los
reactivos.
Otros objetivos quedarán aparentes a partir de
la siguiente descripción y de las reivindicaciones que la
acompañan.
La presente invención es definida por las
reivindicaciones anexas.
Por lo tanto se ha descubierto de forma
inesperada que las determinaciones cuantitativas de la hemoglobina
pueden llevarse a cabo sin los reactivos químicos azida sódica y
nitrito sódico anteriormente indicados. Más concretamente, se ha
descubierto que las determinaciones cuantitativas puede llevarse a
cabo directamente sobre la sangre hemolizada a condición de que se
seleccione un agente hemolizante adecuado o una mezcla de los
mismos.
De acuerdo con la presente invención se ha
descubierto de tal manera que los reactivos higroscópicos pueden ser
eliminados. Además, se ha descubierto que el tiempo para obtener la
determinación analítica se podría reducir. Como los análisis se
llevan a cabo en grandes cantidades, es decir, en hospitales y en
bancos de sangre, la característica de la duración es
importante.
La microcubeta desechable utilizada según la
presente invención puede ser del tipo descrito en la patente
estadounidense US 4 088 488 o preferentemente en la patente
estadounidense US 5 674 457. Puede definirse como un cuerpo unitario
que incluye por lo menos una cavidad con una ventana óptica (zona de
medición) en la que se sitúan dos superficies planas o curvas de
cara a la cavidad a una distancia predeterminada entre las dos y de
esa manera definir una longitud de trayectoria óptica
predeterminada. Esta distancia entre las superficies que definen la
zona de medición es un parámetro crítico en proporcionar la longitud
de trayectoria óptica adecuada para la medición de la hemoglobina y
en una forma de realización preferente, esta distancia es de entre
0,05 mm y 0,2 mm. La distancia entre las superficies interiores del
resto de la cavidad es preferentemente del orden de entre 0,1 mm y 2
mm, lo que es efectivo para permitir la entrada de la muestra en la
cavidad por fuerza capilar a través de la entrada de la cavidad, que
está en comunicación con el exterior del cuerpo. Además, la cavidad
tiene un volumen fijo predeterminado inferior a aproximadamente 25
\mul. La superficie de la cavidad está recubierta con un agente
hemolizante seco. El agente hemolizante se encuentra preferentemente
presente en una cantidad superior a la cantidad requerida para la
reacción de hemolización. No se necesitan más aditivos para la
determinación según el procedimiento de la invención.
Las cubetas según la presente invención pueden
formarse mediante cualquier material adecuado, que permita la
formación de los niveles de tolerancia restringida necesarios.
Preferentemente, la cubeta se fabrica mediante moldeo por inyección
de un material polimérico transparente.
Una característica crítica de la presente
invención es el agente hemolizante. Concretamente, este agente
debería ser esencialmente no higroscópico y fácilmente soluble en
agua o más exactamente sangre entera no diluida. Además, como es
importante que el procedimiento ofrezca resultados reproducibles,
este agente debería tener preferentemente una estructura química
bien definida. Como el agente hemolizante se introduce
preferentemente en la cavidad de la cubeta como una solución, que es
posteriormente cuidadosamente secada mediante el uso de calor,
también es adecuado que el agente hemolizante sea fácilmente soluble
en solventes orgánicos que no destruyan el agente hemolizante y que
puedan evaporarse con facilidad a bajas temperaturas. Por lo tanto
resulta preferente que el agente hemolizante sea fácilmente soluble
en alcoholes, como el metanol.
Otro aspecto importante al seleccionar el agente
hemolizante es que este agente en su forma seca, que está presente
en la microcubeta lista para usar, permita una introducción rápida e
uniforme de la sangre entera a la cubeta. En particular, el periodo
de tiempo para la introducción de la sangre entera a la microcubeta
debería ser inferior al periodo de tiempo requerido por esta sangre
para disolver el agente hemolizante en la microcubeta.
Un grupo particularmente preferente de agentes
hemolizantes es el de las sustancias tensioactivas iónicas y no
iónicas con propiedades hemolizantes. Ejemplos de dichas sustancias
son las sales de amonio cuaternario seleccionadas de entre el grupo
de la sales de alquil trietilamonio, sales de
alquildimetilbencilamonio, y sales de alquilpiridio que consisten
en: bromuro de tetradeciltrimetilamonio (TTAB), cloruro de
dodeciltrimetilamonio, bromuro de cetiltrimetilamonio, bromuro de
hexadeciltrimetilamonio, cloruro de benzalconio, cloruro de
cetilpiridio y otras sales de amonio cuaternario, lauril sulfato
sódico, y sales de ácido desoxicólico. En particular, agentes
hemolizantes adecuados a utilizar según la invención son
desoxicolato de sodio, desoxicolato de potasio, desoxicolato de
calcio, desoxicolato de morfolina, desoxicolato de ciclohexilamonio
y desoxicolato de amonio o combinaciones de los mismos. El agente
hemolizante más preferente en la actualidad que cumple con el
requisito de proporcionar una determinación rápida y cuantitativa de
la hemoglobina es una combinación de desoxicolato de sodio y
desoxicolato de amonio. La cantidad de desoxicolato de amonio es
preferentemente de entre el 20% y el 80% en peso de esta
combinación.
Durante los experimentos resultaron en la
presente invención se descubrió que tal vez el grupo de agentes más
comúnmente utilizado para la hemolización de la sangre, es decir,
las saponinas que son productos naturales extensamente distribuidos
por plantas y que son mezclas de diferentes estructuras químicas, no
proporcionan resultados reproducibles en el procedimiento de la
invención. Las saponinas son unos agentes hemolizantes potentes
incluso a concentraciones muy bajas.
Una característica crítica del procedimiento de
la invención y una diferencia importante comparado con el
procedimiento conocido y actualmente utilizado comercialmente para
la determinación de Hb en microcubetas, es también que la medición
por absorción debe llevarse a cabo a otra longitud de onda. De esta
manera, se ha descubierto que la determinación por absorción debería
llevarse a cabo en un intervalo de entre 490 nm y 520 nm,
preferentemente de entre 500 nm y 510 nm. La medición por absorción
secundaria compensatoria se lleva preferentemente a cabo en el
intervalo de entre 850 nm y 910 nm, preferentemente de entre 860 nm
y 900 nm.
Las mediciones para la determinación de la
sangre a estas longitudes de onda se describen en la patente
estadounidense US 5 064 282. De acuerdo con esta patente la medición
se lleva a cabo en una cubeta reutilizable, que contiene sangre que
ha sido anteriormente hemolizada con saponina. En particular este
procedimiento implica la colocación de una gota de sangre en una
placa de vidrio, agitar la sangre hasta que quede translúcida con un
bastoncillo que contiene saponina e introducir la sangre hemolizada
en la cubeta.
En lo que respecta a la potencial alteración de
la determinación debida a la presencia de metahemoglobina según la
presente invención se aprecia que se puede producir tal alteración
en pacientes con una anormalidad enzimática congénita poco
frecuente, en algunas variantes poco frecuentes de la hemoglobina
normal y tras la exposición a determinados fármacos y químicos, como
la fenacetina, los nitratos, las quinonas, el clorato. Tal vez en
estos casos habrá una cantidad de metahemoglobina en la sangre de
entre el 10% y el 20%, pero cuando suceden resultará lo
suficientemente obvio clínicamente para indicar la necesidad de
utilizar el procedimiento con azida, es decir, el procedimiento
actual en las microcubetas, o en su lugar, el procedimiento de
hemoglobincianuro (un procedimiento de referencia del ICSH). En este
contexto, hay que añadir que este problema, en caso de haberlo,
también se da con el procedimiento tradicional y universalmente
aceptado que utiliza la oxihemoglobina. También elevadas
concentraciones de carboxihemoglobina en personas que fuman mucho y
las sulfohemoglobina pueden causar alteraciones.
Se pueden obtener fotómetros adecuados para la
realización de estas mediciones modificando fotómetros existentes
con filtros adecuados y diodos emisores de luz (LED). Según una
forma de realización preferente de la invención un fotómetro mide la
absorbancia que hay en las dos longitudes de onda y un embebido
microprocesador calcula, de acuerdo con un algoritmo programado, la
concentración total de hemoglobina en sangre.
El siguiente ejemplo no limitativo ilustra el
procedimiento de la invención.
Se disolvió un agente hemolizante que consta de
partes iguales de desoxicolato de sodio y de amonio en metanol y se
introdujo el mismo en una microcubeta desechable de una construcción
como la anteriormente indicada. A continuación se evaporó el
metanol.
En una comparación entre el procedimiento de la
invención llevado a cabo en microcubetas que contenían únicamente la
mezcla seca de desoxicolato de sodio y de amonio y el procedimiento
de determinación de hemoglobina en las conocidas y utilizadas
actualmente microcubetas HemoCue® que contienen el reactivo de
nitrito sódico/azida sódica así como desoxicolato de sodio, se
descubrió que el periodo de tiempo para hemolizar la sangre era de
aproximadamente 15 segundos menos utilizando el agente hemolizante
preferente según la presente invención. En particular el periodo
para hemolizar la sangre presente en la microcubeta debería ser
inferior a 40 segundos. Esto permite una reducción adicional de
hasta el 25% del tiempo total para la determinación de la
hemoglobina lo que puede resultar ventajoso en hospitales con una
gran tasa de ocupación y en otras situaciones en las se llevan a
cabo muchas determinaciones.
En una correspondiente comparación que refiere a
la estabilidad con respecto a la humedad, se descubrió que la
estabilidad de las microcubetas que incluían la mezcla de
desoxicolato anteriormente indicada era de 24 horas en una atmósfera
de 45ºC y humedad relativa del 80%, lo que debería compararse con
aproximadamente 2 minutos para las microcubetas HemoCue®
comercialmente disponibles en las mismas condiciones.
Una evaluación del nuevo procedimiento con esta
mezcla hemolizante (y sin ningún otro químico) en comparación con el
procedimiento estándar del ICSH se describe en la figura 1. La
evaluación fue llevada a cabo en condiciones de laboratorio. Como
puede observarse la concordancia entre los procedimientos es muy
buena.
Las mediciones por absorción espectrofotométrica
fueron llevadas a cabo a aproximadamente 570 nm para el
procedimiento conocido y a aproximadamente 505 nm para el nuevo
procedimiento. Para ambos procedimientos se realizaron mediciones
compensatorias a 880 nm.
Lo anteriormente indicado ha sido una
descripción de una forma de realización preferente determinada de la
presente invención, pero no pretende en modo alguno ser limitativo
de la invención. Al contrario, pueden llevarse a cabo muchas
modificaciones, variaciones y cambios de detalle dentro del alcance
de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante es solamente para conveniencia del lector. La misma no
forma parte del documento de patente europea. A pesar de que se ha
tenido mucho cuidado durante la recopilación de las referencias, no
deben excluirse errores u omisiones y a este respecto la OEP se
exime de toda responsabilidad.
- \bullet US 4088448 A
- \bullet US 5064282 A
\bullet US 5674457 A
VANZETTI, G. Am. J. Lab.& Clin.
Med., 1966, vol. 67, 116
SCHENCK et al. Clinical Chemistry,
1986, vol. 32 (3
Claims (12)
1. Procedimiento de determinación cuantitativa
de hemoglobina en sangre entera no diluida que consta de las
siguientes etapas:
- Introducir una muestra de sangre entera no diluida mediante acción capilar en una microcubeta desechable que presenta por lo menos una cavidad para recibir la muestra, incluyendo la cavidad un agente hemolizante esencialmente no higroscópico, seleccionado de entre el grupo que consiste en sustancias tensioactivas iónicas y no-iónicas, en una forma seca, en la que se disuelve el agente hemolizante, se hemolizan los glóbulos rojos y se libera la hemoglobina contenida en los glóbulos rojos;
- Llevar a cabo una primera medición por absorción a una longitud de onda en el intervalo de entre 490 nm y 520 nm directamente sobre la muestra hemolizada en la cubeta; y
- Adicionalmente llevar a cavo una segunda medición por absorción a una longitud de onda en el intervalo de entre 850 nm y 910 nm para compensar las interferencias de fondo, en la que el periodo de hemolización de dicha sangre entera no diluida es inferior a 40 segundos.
2. Procedimiento según la reivindicación 1 en el
que el agente hemolizante es soluble en solventes orgánicos.
3. Procedimiento según la reivindicación 2 en el
que el solvente orgánico es un alcohol como, por ejemplo,
metanol.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 en el que el tiempo para la introducción de
la sangre entera en la microcubeta es menor que el tiempo requerido
para disolver el agente hemolizante.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 en el que el agente hemolizante se selecciona
de entre el grupo que consiste en sales de ácido desoxicólico y
sales de amonio cuaternario.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que el agente hemolizante se
selecciona de entre el grupo que consiste en desoxicolato de sodio,
desoxicolato de potasio, desoxicolato de calcio, desoxicolato de
morfolina, desoxicolato de ciclohexilamonio y desoxicolato de amonio
o combinaciones de los mismos.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que el agente hemolizante
esencialmente consiste en una mezcla de desoxicolato de sodio y
desoxicolato de amonio.
8. Procedimiento según la reivindicación 7 en el
que la cantidad de desoxicolato de amonio es de entre el 20 por
ciento y el 80 por ciento en peso.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que la primera medición por
absorción se lleva a cabo en el intervalo de entre 500 nm y 510
nm.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que la segunda medición por
absorción se lleva a cabo en el intervalo de entre 860 nm y 900
nm.
11. Microcubeta desechable que presenta por lo
menos una cavidad para la determinación espectrofotométrica de la
hemoglobina en sangre entera no diluida, caracterizada porque
la cavidad incluye un agente hemolizante seco, no higroscópico, a
condición de que la cavidad esté básicamente libre de azida y de
nitrito, y de cualquier otro aditivo, en la que el agente
hemolizante se adapta para hemolizar sangre entera no diluida en
menos de 40 segundos.
12. Microcubeta según la reivindicación 11
caracterizada porque el agente hemolizante es como se define
en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8.
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