CN100480675C - 分析方法和用于该方法中的比色杯 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种血红蛋白测定的方法，它包括以下步骤：将未稀释的全血样本通过毛细作用引入到具有至少一个用于接受样本的腔的一次性微量比色杯中，该腔内包含有干燥状态的基本上非吸湿性的溶血剂；溶血剂被血液溶解，从而溶解红细胞并释放包含于血细胞内的血红蛋白；直接在微量比色杯中溶血的样本上于490-520nm波长范围内进行第一次吸光度测定；和进行第二次吸光度测定以补偿背景干扰。

Description

分析方法和用于该方法中的比色杯
发明领域
本发明涉及一种分析方法和用于执行该分析的比色杯。具体地说，本发明涉及一种在未稀释的全血样本中测定血红蛋白的方法，和可用于该测定中的一次性比色杯。
发明背景
美国专利号4,088,448中公开了一种用于采集样本、将样本与试剂混合并直接将该与试剂混合的样本进行光学分析的一次性比色杯。这种已知的一次性比色杯具有几个优点，因为它简化了采样程序、减少了所需的器具并通过使分析程序独立于进行该分析的操作员的操作技术而极大地改善了分析的准确率。在美国专利5 674 457中也提供了一种基于同样原理构建的并具有改善的流动特性的比色杯。
目前，根据这些专利研制的一次性比色杯正广泛用于未稀释全血中的血红蛋白(Hb测定)的测定。出于这种目的的比色杯腔预先用试剂处理过，这样当抽取的血样注入到杯中时，红细胞的壁碎裂并触发化学反应。这种反应的结果使得可以经由直接通过比色杯的透明壁的吸光度的测定来确定Hb，其中比色杯的透明壁位于测定带，又称作光学窗，在比色杯的相对平面壁的内表面之间具有预定的并准确限定的距离。该测定方法是基于Vanzetti，G.，Am.J.Lab.& Clin.Med.67,116(1966)的改进的叠氮高铁血红蛋白方法。
光谱光度计测定是在570-880nm进行的。这种基于干式化学的定量测定方法获得了极大的成功，这可以从例如由von Schenck等在《临床化学》第32卷，第3期，1986年的一篇文章中看出，因为与用于测定Hb的标准的湿式方法相比，该方法获得了相等甚至更优的结果。所用的试剂由使红细胞溶血的脱氧胆酸钠、叠氮化钠和亚硝酸钠构成，它将血红蛋白转化成叠氮高铁血红蛋白。
由于所用试剂的吸湿特性，储藏期受到限制，并且需要比色杯在包含干燥剂的密封包装内储藏。甚至更麻烦的是对于高湿性的气候，必须在从包装中取出后的几分钟内使用比色杯，否则试剂将会被破坏，导致测定不准确因此无效。
发明目的
本发明的一个目的是提供一种在全血中测定血红蛋白浓度的快速、准确的方法。
本发明的第二个目的是提供一种可以在一次性微量比色杯中进行的测定全血中血红蛋白浓度的方法。
本发明第三个目的是提供一种用于测定未稀释的全血样本中血红蛋白浓度的微量比色杯，这种方法克服了试剂的吸湿特性引起的问题。
从下面的描述和所附的权利要求中将会很容易理解本发明的其它目的。
发明概述
根据本发明，提供这种血红蛋白测定的方法包括以下步骤：将未稀释的全血样本通过毛细作用引入到具有至少一个用于容纳样本的腔的一次性微量比色杯中；在该腔内包含有一种基本上干燥的非吸湿性溶血试剂，该试剂溶于全血中，使红细胞溶解并释放出包含于血细胞中的血红蛋白；然后直接在微量比色杯中的血样上进行490-520nm波长范围内的吸光度测定；进行第二次吸光度测定以补偿背景干扰。
如此，出人意料的发现在没有上面提到的叠氮化钠和亚硝酸钠化学试剂存在的情况下可以定量测定血红蛋白的浓度。更具体地说，发现在有适当选定的溶血试剂或其混合物存在的条件下，可以直接在溶血的血样上进行血红蛋白的定量测定。
根据本发明，还发现可因此省略吸湿性试剂。另外，可以缩短获得分析结果的时间。在分析大量样本，例如在医院和血库的情况下，这一时间特性显得尤为重要。
发明的详细描述
根据本发明所用的一次性微量比色杯可以是美国专利4 088 448中公开的那种类型或优选是美国专利5 674 457中公开的那种类型，这些文献并入此作为参考。可以限定这种比色杯为单一主体部分，它包括至少一个具有光学窗(测定带)的腔，其中设置相对腔的两个平面或弯曲的表面彼此间隔一定距离，从而限定一个预定的光程长度。在限定测定带的两个表面之间的这个距离在提供用于血红蛋白测定的适宜光程长度方面是一个重要的参数，在一个优选实施方案中该距离介于0.05-0.2mm之间。在该腔的其余部分的内表面之间的距离优选在0.1-2mm级，这使得样本能够通过毛细作用力经过腔的入口进入到腔内，所述入口与主体部分的外部相通。再者，该腔具有小于大约25微升的固定的预定体积。将干燥的溶血剂涂敷在腔的内表面。优选溶血剂存在的量超过溶血反应所需的量。根据本发明的方法进行测定不再需要其它添加剂。
根据本发明的比色杯可以用任何适宜的材料构成，它允许必要的致密容差水平的形成。优选该比色杯由透明的聚合材料通过注模制造。
本发明的关键特征在于溶血剂。具体地说，这种溶血剂应该基本上是不吸湿的并且容易溶于水或更准确地说溶于未稀释的全血中。再者，由于对于一个方法而言具有重现性结果是很重要的，因此该试剂应该优选具有定义明确的化学结构。由于溶血剂优选作为溶液引入到比色杯的腔内，接着优选通过加热很小心地使其干燥，因此合适的是该溶血剂很容易溶于不会使其破坏的有机溶剂中，并且该有机溶剂在低温下应该很容易蒸发。因此优选该溶血剂应该很容易溶于醇类，例如甲醇。
在选择溶血剂时还有一个重要的特征是在该试剂以干燥形式存在于方便使用的微量比色杯中时，允许使全血快速并均匀地引入到比色杯中。特别是，将全血引入到微量比色杯中所用的时间应该比这个血样溶解比色杯中的溶血剂所用的时间要短。
溶血剂的特别优选的基团是离子和非离子、具有溶血特性的表面活性物质。这种物质的例子是选自下组的季铵盐：烷基三乙铵盐、烷基二甲基苄铵盐和由以下物质组成的烷基吡啶盐：十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)、氯化十二烷基三甲铵、十六烷基三甲基溴化铵、溴化十六碳烷基三甲铵、氯化苄烷铵、十六烷基氯化吡啶鎓和其它季铵盐类；十二烷基硫酸钠、和脱氧胆酸盐类。可用于本发明的特别适合的溶血剂是脱氧胆酸钠、脱氧胆酸钾、脱氧胆酸钙、脱氧胆酸吗啉(morfolin)、脱氧胆酸环己铵盐和脱氧胆酸铵或它们的组合物。本发明最优选的能满足定量并快速测定血红蛋白的要求的溶血剂是脱氧胆酸钠和脱氧胆酸铵的组合物。在该组合中脱氧胆酸铵的量优选占该组合物重量的20-80％。
在产生本发明的试验期间发现，可能血红蛋白测定中最常用的试剂组，即皂角苷类，一种天然的广泛分布于植物中的为不同化学结构的混合物的产品，不能够得到本发明方法中的重现性。即使是在非常低浓度的情况下，皂角苷也是强有力的溶血剂。
与已知的和目前市售的用于在微量比色杯中测定Hb的方法相比，本发明方法的重要特征和显著的不同在于该方法的吸光度测定是在另一波长下进行的。因此，已经发现在490-520nm，优选在500-510nm的波长范围内测定吸光度。第二次的补偿吸光度测定优选在850-910，更优选在860-900nm波长范围内进行。
在美国专利5 064 282中公开了在这些波长范围内进行血样测定的方法。根据该专利，测定是在可重复使用的比色杯中进行的，该比色杯中包含有预先用皂角苷溶血的血样。具体地说，该方法包括以下步骤：将一滴血置于载玻片上，用上面涂敷有皂角苷的搅棒搅动血样直到透明，然后将这种溶血的血样引入到比色杯中。
根据本发明的方法，由于存在高铁血红蛋白而导致可能出现的对测定的干扰问题，可以理解的是这种干扰将发生在带有极罕见的先天性异常的酶的病人当中，在一些罕见的正常血红蛋白的变体当中，和在暴露于某些药物和化学品，如非那西汀、硝酸盐、醌类和氯酸盐之后。在这些情况下，血样中可能存在高达10-20％的高铁血红蛋白，但是当出现这种情况时，应该会有非常明显的临床征兆以指示需要使用叠氮方法，即，目前用于微量比色杯中的方法，或用氰化血红蛋白方法(称作ICSH方法)来替代。如果需要的话，在本文中应该加上这种问题还存在于传统的和普遍接受的氧合血红蛋白方法中。在烟瘾很大的高浓度碳氧血红蛋白患者和在高浓度硫血红蛋白的患者中也可能出现干扰。
适用于这些测定中的光度计可以通过改进现有的光度计使具有适宜的滤波器和发光二极管而获得。根据本发明的一个优选实施方案，光度计测定在两个波长处的吸光度，并且一个内置的微处理器根据程序算法计算血样中的血红蛋白总浓度。
下面的非限制性实施例来具体说明本方法。
将由等分的脱氧胆酸钠和脱氧胆酸铵组成的溶血剂溶于甲醇并引入到具有上述结构的一次性比色杯中。然后蒸发掉甲醇。
在将现有的、目前使用的包含亚硝酸钠/叠氮化钠以及脱氧胆酸钠的HemoCue微量比色杯中进行的血红蛋白测定的方法，与本发明的在仅包含干燥的脱氧胆酸钠和脱氧胆酸铵混合物的微量比色杯中进行的方法相比，发现根据本发明的方法的优选的溶血剂溶解全血的时间要缩短15秒。特别是溶血存在于微量比色杯中的干燥的溶血试剂的时间小于40秒。这将使测定血红蛋白的总时间进一步减少25％，这一点在繁忙的医院和其它进行测定的地方显得非常有利。
在关于湿度对稳定性影响的方面的相应比较中发现，包含上面提到的脱氧胆酸盐混合物的微量比色杯在空气中、45°C和80％相对湿度的条件下的稳定性是24小时，可以比得上市售的HemoCue微量比色杯在相同条件下约2分钟所得的结果。
在图1中显示了使用这种溶血混合物(没有其它任何化学物质)的新方法与标准的ICSH方法比较后的结果。该评估是在实验室条件下进行的。可以看出这两种方法之间的一致性非常好。
用光谱光度计的吸光度测定，已知方法是在约570nm，该新方法是在大约505nm波长处进行的。这两种方法的补偿测定均是在880nm处进行的。
前面已经描述了本发明的某些优选实施方案，但这绝不是要限制本发明。而且在本发明范围内的某些细节的修改、变化和改进都是允许的。

Claims (24)

1.一种在未稀释的全血样本中定量测定血红蛋白浓度的方法，包括以下步骤：
将未稀释的全血样本通过毛细作用引入到具有至少一个用于接受样本的腔的一次性微量比色杯中，该腔内包含有干燥状态的基本上非吸湿性的溶血剂；溶血剂被溶解，从而溶解红细胞并释放包含于血细胞内的血红蛋白；
直接在比色杯中溶血的样本上于490-520nm波长范围内进行第一次吸光度测定；和
再于850-910nm波长范围内进行第二次吸光度测定以补偿背景干扰；条件是所述微量比色杯的腔内没有叠氮化物和亚硝酸盐。
2.根据权利要求1的方法，其中所述溶血剂可溶于有机溶剂。
3.根据权利要求2的方法，其中所述有机溶剂是醇。
4.根据权利要求3的方法，其中所述有机溶剂是甲醇。
5.根据权利要求1-4任一项的方法，其中所述溶血剂是以下述方式选择的：溶血剂以干燥状态存在于待使用的微量比色杯中，允许快速将全血样本引入该比色杯中。
6.根据权利要求5的方法，其中用于将全血样本引入微量比色杯中所用的时间短于溶解溶血剂所用的时间。
7.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述溶血剂选自由离子或非离子表面活性物质组成的组。
8.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述溶血剂选自由脱氧胆酸盐和季铵盐组成的组。
9.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述溶血剂选自下组：脱氧胆酸钠、脱氧胆酸钾、脱氧胆酸钙、脱氧胆酸吗啉、脱氧胆酸环己铵和脱氧胆酸铵或它们的组合物。
10.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述溶血剂是由脱氧胆酸钠和脱氧胆酸铵的混合物构成。
11.根据权利要求10所述的方法，其中基于脱氧胆酸钠和脱氧胆酸铵的组合，所述脱氧胆酸铵的量占重量的20-80％。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一次吸光度测定是在500-510nm波长范围内进行的。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述第二次吸光度测定是在860-900nm波长范围内进行的。
14.用于光谱光度计在未稀释的全血样本中测定血红蛋白浓度的具有至少一个带光学窗的腔的一次性微量比色杯，其特征在于在其腔内包含干燥的、基本上非吸湿性的溶血剂，条件是所述微量比色杯的腔内没有叠氮化物和亚硝酸盐。
15.根据权利要求14的一次性微量比色杯，其特征在于所述溶血剂可溶于有机溶剂。
16.根据权利要求15的一次性微量比色杯，其中所述有机溶剂是醇。
17.根据权利要求16的一次性微量比色杯，其中所述有机溶剂是甲醇。
18.根据权利要求14-17任一项的一次性微量比色杯，其中所述溶血剂是以下述方式选择的：该溶血剂以干燥状态存在于待使用的微量比色杯中，允许快速将全血样本引入该比色杯中。
19.根据权利要求18的一次性微量比色杯，其中用于将全血样本引入微量比色杯中所用的时间短于溶解溶血剂所用的时间。
20.根据权利要求14-17中任一项的一次性微量比色杯，其中所述溶血剂选自由离子或非离子表面活性物质组成的组。
21.根据权利要求14-17中任一项的一次性微量比色杯，其中所述溶血剂选自由脱氧胆酸盐和季铵盐组成的组。
22.根据权利要求14-17任一项所述的一次性微量比色杯，其中所述溶血剂选自下组：脱氧胆酸钠、脱氧胆酸钾、脱氧胆酸钙、脱氧胆酸吗啉、脱氧胆酸环己铵和脱氧胆酸铵或它们的组合物。
23.根据权利要求14-17任一项所述的一次性微量比色杯，其中所述溶血剂是由脱氧胆酸钠和脱氧胆酸铵的混合物构成。
24.根据权利要求23所述的一次性微量比色杯，其中基于脱氧胆酸钠和脱氧胆酸铵的组合，所述脱氧胆酸铵的量占重量的20-80％。
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