JP2004502167A - 分析方法およびそのためのキュベット - Google Patents
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Abstract
Description
発明の分野
本発明は分析方法およびこの分析を行うためのキュベット(cuvette)に関する。特に、本発明は未希釈全血の中のヘモグロビンを測定する方法およびこの測定に使用できる使い捨てキュベットに関する。
【0002】
背景技術
流体をサンプリングし、サンプルを試薬と混合し、そして試薬と混合されたサンプルの光学分析を直接に行うための使い捨てキュベットは以前から米国特許第4,088,448号から知られている。この既知キュベットは幾つかの利点を有する、すなわち、それはサンプリングを簡単にし、用具の数を減らし、かつ分析を行うオペレーターの操作技術から分析の手続を独立させることによって、分析の正確さをかなり改良する。同じ原理に基づく改良されたフロー特性を有するキュベット構造は米国特許第5 674 457号に開示されている。
【0003】
これら特許に従って開発された使い捨てキュベットは未希釈全血のヘモグロビン測定(Hb測定)用に現在では広く使用されている。この目的のために、キュベットキャビティは試薬によって予め処理されているので、血液サンプルがキュベットの中へ吸い込まれると、赤血球の壁が崩壊されそして化学反応が開始される。反応の結果は光学ウィンドウとも呼ばれる測定ゾーンに互いに対向する平坦壁の内面間の予め定められた正確に規定された距離を有しているキュベットの透明壁を介して直接に吸収測定によるHb測定を可能にする。測定方法はVanzetti, G., Am. J. Lab. & Clin. Med. 67, 116 (1966)による変形アジドメトヘモグロビン法に基づいている。
【0004】
分光光度測定は570と880nmで行われている。乾式化学に基づいたこの定量法は、Hbを測定するための標準化された湿式法によって得られた結果に比べて同等以上の結果を与え、例えばClinical Chemistry, Vol 32, No 3, 1986におけるvon Schenck他による記事の中に見出せる通りかなりの成功をみている。使用される試薬は赤血球を溶血させるデオキシコール酸ナトリウムと、アジ化ナトリウムと亜硝酸ナトリウムとから構成されており、それはヘモグロビンをアジドヘモグロビンに転化させる。
【0005】
使用される試薬の吸湿性のせいで、貯蔵寿命は制限され、そして乾燥剤を含む密封包装内でのキュベットの貯蔵が要求される。更なる問題は高湿の気候ではキュベットを包装から取り出した後数分以内に使用しなければならず、さもないと試薬が破壊されて測定が不正確になり従って役にたたないものになるという事実である。
【0006】
発明の目的
本発明の目的は全血中のヘモグロビンを測定するための迅速な定量方法を提供することである。
【0007】
第二の目的は使い捨てマイクロキュベットの中で遂行されてもよい全血中ヘモグロビン測定方法を提供することである。
【0008】
第三の目的は試薬の吸湿性から生じる問題が解消されている未希釈全血中ヘモグロビン測定用マイクロキュベットを提供することである。
【0009】
他の目的は以下の記述および図面から明らかになろう。
【0010】
発明の概要
本発明によれば、かかるヘモグロビン測定を提供する方法は、未希釈全血のサンプルを、サンプルを受容するための少なくとも一つのキャビティを有する使い捨てマイクロキュベットの中に、毛管作用(capillary action)によって導入する工程を含む。キャビティは乾燥した本質的に非吸湿性の溶血剤を含んでおり、溶血剤は血液によって溶解され、赤血球を溶血させ、そして血球中に含有されていたヘモグロビンを解放する。次いで、波長範囲490〜520nmでの第一吸収測定が直接にマイクロキュベット中のサンプルに対して行われ、そして第二吸収測定がバックグランドの干渉を補償するために遂行される。
【0011】
従って、ヘモグロビン量測定が予想外にも上記の化学試薬アジ化ナトリウムと亜硝酸ナトリウムを用いずに遂行できるということが判明した。より詳しくは、適切な溶血剤またはそれらの混合物が選ばれることを条件に定量測定は直接に溶血血液に対して遂行できるということが判明した。
【0012】
従って、本発明によれば、吸湿性試薬を省略できるということが判明した。さらに、分析測定を得るための時間が削減されることが判明した。分析はたとえば病院や血液銀行では大量に行われるので、時間的側面は重要である。
【0013】
発明の詳細
本発明に従って使用される使い捨てマイクロキュベットは本願明細書の中に組み入れられる米国特許第4 088 448号または好ましくは米国特許第5 674 457号に開示されたタイプのものであってもよい。それはキャビティに面して2つの平坦なまたは湾曲した表面が互いから予め定められた距離で配置されている従って予め定められた光路長(optical path length)を規定しているところの光学ウィンドウ(測定ゾーン)をもつ少なくとも一つのキャビティを含む統一された本体部材として規定されてもよい。測定ゾーンを規定しているこの表面間距離はヘモグロビン測定に適する光路長の提供には臨界的なパラメーターであり、そして好ましい態様においては、この距離は0.05〜0.2mmである。キャビティの残りの内面間距離は好ましくは0.1〜2mmのオーダーであり、それは本体部材の外部と連絡しているキャビティ入口から毛管力(capillary force)によってサンプルがキャビティの中へ入るのを許すのに有効である。また、キャビティは約25μL未満の予め定められた固定容積を有する。乾燥溶血剤がキャビティ表面に塗布されている。溶血剤は好ましくは溶血反応に必要な量より過剰に存在する。他の添加剤は本発明の方法による測定には必要ない。
【0014】
本発明によるキュベットは必要な厳格な許容差レベルの形成を可能にするいずれか適する材料によって形成されてもよい。好ましくは、キュベットは透明な高分子材料の射出成形によって製造される。
【0015】
本発明の臨界的特徴は溶血剤である。特に、この薬剤は本質的に非吸湿性で且つ水またはより厳密には未希釈全血の中に易溶性であるべきである。さらに、方法が再現可能な結果を与えることは重要であるので、好ましくは、この薬剤は十分に規定された化学的構造を有すべきである。溶血剤は後で好ましくは熱を使用することによって注意深く乾燥される溶液としてキュベットキャビティの中へ好ましく導入されるので、溶血剤は溶血剤を破壊せず且つ低温で容易に蒸発できる有機溶剤の中に易溶性であるということも適している。従って、溶血剤がメタノールのようなアルコールの中に易溶性であるべきであるということは好ましい。
【0016】
溶血剤を選択するときのもう一つの重要な側面は直ぐ使用できるマイクロキュベットの中に存在する乾燥形態でのこの薬剤がキュベットの中への全血の急速かつ一様な導入を可能にするということである。特に、マイクロキュベットの中へ全血を導入するための時間はこの血がマイクロキュベットの中の溶血剤を溶解するのに要する時間よりも短くすべきである。
【0017】
溶血剤の特に好ましい群は溶血特性を有するイオン性および非イオン性の界面活性物質である。かかる物質の例は、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド(TTAB)、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンズアルコニウムクロリド、セチルピリジウムクロリドおよびその他の第四アンモニウム塩からなる、アルキルトリエチルアンモニウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩およびアルキルピリジウム塩からなる群から選ばれた第四アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム、およびデオキシコール酸の塩である。本発明に従って使用されるべき特に適する溶血剤はデオキシコール酸ナトリウム、デオキシコール酸カリウム、デオキシコール酸カルシウム、デオキシコール酸モルホリン、デオキシコール酸シクロヘキシルアンモニウムおよびデオキシコール酸アンモニウムまたはそれらの組合せである。ヘモグロビンの定量的かつ迅速な測定を提供する要件を満たす現時点で最も好ましい溶血剤はデオキシコール酸ナトリウムとデオキシコール酸アンモニウムの組合せである。デオキシコール酸アンモニウムの量は好ましくは、この組合せの20〜80重量%である。
【0018】
本発明を生じる実験中に、次のことが判明した: 血液を溶血させるための薬剤の多分最も普遍的に使用されてきた群、すなわち、植物に中に広く分布されている天然産物であって様々な化学構造の混合物であるサポニン類、は本発明の方法では再現できる結果を与えない。サポニン類は非常に低濃度でさえ強力な溶血剤である。
【0019】
本発明の臨界的特徴およびマイクロキュベットでHbを測定するための既知の現在商業的に使用されている方法と比較しての重大な差異は吸収測定が別の波長で行われなければならないということでもある。従って、吸収測定は490〜520nm、好ましくは500〜510nm、の範囲内で実施されるべきであるということが判明した。第二の補償吸収測定は850〜910nm、好ましくは860〜900nm、の範囲内で好ましく遂行される。
【0020】
これら波長における血液の測定のための測定法は米国特許第5 064 282号に開示されている。この特許によれば、測定はサポニンによって前もって溶血された血液を含有する再使用可能なキュベットで行われている。特に、この方法はガラススライド上に1滴の血液を置き、サポニンをその上につけた棒で血液を半透明になるまで攪拌し、そして溶血血液をキュベットの中に導入することを伴う。
【0021】
本発明によるメトヘモグロビンの存在による測定障害の可能性に関しては、かかる障害が非常に稀な先天性酵素異常を有する患者に起こったり、正常ヘモグロビンのいくつかの稀な変異体に起こったり、および特定の薬物や化学物質たとえばフェナセチン、硝酸塩類、キノン類、塩素酸塩に曝露された後に起こったりするであろうということは認められる。これら事例における血中には多分10〜20%もの高いメトヘモグロビンが存在するであろうが、それらが起こるときには、アジ化物法すなわち広くマイクロキュベットで使用される方法、またはヘモグロビンシアン化物法(参照ICSH法)を代わりに使用する必要があることは客観的に十分明白であろう。この関連では、この問題はあるとしてもそれは伝統的かつ普遍的に許容されているオキシヘモグロビン法をもってしても存在するということが付け加えられるべきである。また、ヘビースモーカーの高濃度カルボキシヘモグロビン、およびスルファヘモグロビンも障害の原因になるかも知れない。
【0022】
これら測定を行うのに適する光度計は存在する光度計を適切なフィルターおよび発光ダイオードで改造することによって得てもよい。本発明の好ましい態様によれば、光度計は2つの波長における吸収を測定し、そして内臓マイクロプロセッサーはプログラムされたアルゴリズムに従って血中ヘモグロビンの総濃度を算出する。
【0023】
次の非限定的な実施例は本発明の方法を例証する。
【0024】
デオキシコール酸ナトリウムとアンモニウムの等量からなる溶血剤をメタノールの中に溶解し、そして上記構造を有する使い捨てマイクロキュベットの中に導入した。それから、メタノールを蒸発させた。
【0025】
デオキシコール酸ナトリウムとアンモニウムの乾燥混合物だけを含有するマイクロキュベットで遂行された本発明と、デオキシコール酸ナトリウムばかりでなく亜硝酸ナトリウム/アジ化ナトリウム試薬を含有する既知の広く使用されているHemoCueマイクロキュベットでのヘモグロビン測定方法との比較では、溶血に要した時間は本発明による好ましい溶血剤では約15秒も短かったことが判明した。特に、マイクロキュベットの中に存在する乾燥溶血剤が溶血を起こさせる時間は40秒未満であるべきである。これはヘモグロビン測定の全時間の25%までの更なる減少を可能し、それは多忙な病院において及び測定が行われるであろうその他状況において有益であろう。
【0026】
湿度に関しての安定性に関する対応比較において、上記のデオキシコール酸塩混合物を含有するマイクロキュベットの安定性は45℃および相対湿度80%の空気中で24時間であったことが判明し、それは同じ条件下での市販のHemoCueマイクロキュベットでの約2秒と比較されるべきである。
【0027】
この溶血性混合物を用いた(そして他の化学薬品を全く用いない)新規方法の、基準ICSH法との比較における評価が図1に開示されている。評価は実験室条件下で行われた。理解できる通り、方法間の一致は非常によい。
【0028】
分光光度吸収測定は既知方法では約570nmで、そして新規方法では約505nmで行われた。両方法とも、補償測定は880nmで行われた。
【0029】
以上、本発明の或る好ましい態様を記述したが、本発明をいかなる仕方でも限定することは意図されていない。むしろ、本発明の範囲内で、多数の修飾、変形および細部変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図1】
基準ICSH法との比較における本発明の方法の溶血評価を示すグラフである。
Claims (14)
- 未希釈全血中のヘモグロビン量測定方法であって、
未希釈全血のサンプルを、サンプル受容するための少なくとも一つのキャビティを有する使い捨てマイクロキュベットの中に、毛管作用によって導入し、キャビティは本質的に非吸湿性の溶血剤を乾燥形態で含んでおり、それによって、溶血剤が溶解され赤血球を溶血させ血球中に含有されていたヘモグロビンを解放し;
第一吸収測定を490〜520nmの波長範囲において直接にキュベット中の溶血サンプルに対して行い、そして
さらに、バックグランドの干渉を補償するための第二吸収測定を行う、
諸工程を含む前記方法。 - 溶血剤が有機溶剤に可溶性である、請求項1の方法。
- 有機溶剤がメタノールのようなアルコールである、請求項2の方法。
- 溶血剤はすぐ使用できるマイクロキュベットの中に乾燥形態で存在するこの薬剤がキュベットの中への全血の迅速な導入を許すというような観点で選択される、請求項1〜3のいずれか一項の方法。
- マイクロキュベットの中への全血の導入時間は溶血剤を溶解するのに必要な時間より短い、請求項4の方法。
- 溶血剤がイオン性および非イオン性の界面活性物質からなる群から選ばれる、請求項1〜5のいずれか一項の方法。
- 溶血剤がデオキシコール酸の塩および第四アンモニウム塩からなる群から選ばれる、請求項1〜6のいずれか一項の方法。
- 溶血剤がデオキシコール酸ナトリウム、デオキシコール酸カリウム、デオキシコール酸カルシウム、デオキシコール酸モルホリン、デオキシコール酸シクロヘキシルアンモニウム、およびデオキシコール酸アンモニウムまたはそれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項1〜7のいずれか一項の方法。
- 溶血剤が本質的にデオキシコール酸ナトリウムとデオキシコール酸アンモニウムの混合物からなる、請求項1〜8のいずれか一項の方法。
- デオキシコール酸アンモニウムの量が20〜80重量%である、請求項9の方法。
- 第一吸収測定が490〜520nm、好ましくは500〜510nm、の範囲内で行われる、請求項1〜10のいずれか一項の方法。
- 第二吸収測定が850〜910nm、好ましくは860〜900nm、の範囲内で行われる、請求項1〜11のいずれか一項の方法。
- 未希釈全血中のヘモグロビンを分光光度測定するための使い捨てマイクロキュベットであって、キャビティが本質的にアジ化物と亜硝酸塩を含まないことを条件にキャビティが乾燥した非吸湿性の溶血剤またはその組合せを含んでいることを特徴とする前記マイクロキュベット。
- 溶血剤が請求項2〜10のいずれか一項に定義されている通りである、請求項13のマイクロキュベット。
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