ES2253163T3 - Procedimiento y reactivo parcial para la determinacion de hierro en el suero. - Google Patents
Procedimiento y reactivo parcial para la determinacion de hierro en el suero.Info
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Abstract
Reactivo parcial para la determinación de hierro en suero o en plasma de heparina, que contiene de 0,5 a 50 mmoles/l de colorante y de 40 a 1000 mmoles/l de reductor en solución acuosa, caracterizado porque el reactivo parcial no está tamponado.
Description
Procedimiento y reactivo parcial para la
determinación de hierro en el suero.
La invención se refiere a un reactivo parcial
para la determinación de hierro en el suero o en plasma de heparina,
que consta de 0,5 a 50 mmoles/l de colorante y de 40 a 1000 mmoles/l
de reductor en solución acuosa. El reactivo parcial se caracteriza
por no estar tamponado.
El reactivo parcial puede utilizarse en un
procedimiento para la determinación de hierro en el suero, por
liberación del hierro no fijado por adición de un agente
desnaturalizador de proteínas, reducción del hierro liberado a
Fe^{2+}, adición de una solución de reactivo colorante (reactivo
parcial) y medición fotométrica del complejo de color formado. El
reactivo parcial puede utilizarse en una combinación de reactivos,
que es idónea incluso sin la adición de mezclas de tensioactivos
aclarantes para la medición de sueros lipémicos.
Los trastornos del metabolismo del hierro, en
especial la carencia de hierro y los trastornos de resorción del
hierro, son muy frecuentes sobre todo entre la población femenina.
La detección del hierro en los líquidos corporales, en especial en
el suero, forma parte por tanto de las determinaciones estándar de
la analítica médica. El hierro se aporta con la alimentación y se
absorbe a través de la mucosa del intestino. Se fija en estado
3-valente sobre la transferrina y entonces se
transporta hasta la médula ósea, donde se incorpora principalmente a
la hemoglobina. Si se absorbe poco hierro, entonces aparecen
síntomas anémicos.
La determinación del hierro en el suero forma
parte de los análisis más frecuentes realizados para determinar los
oligoelementos en el diagnóstico clínico. En el artículo Clin. Chem.
26, 327-331, 1980, se describe un
procedimiento en el que el hierro 3-valente fijado
sobre la transferrina en forma de un complejo de tipo carbonato se
libera en medio muy ácido. El inconveniente de este procedimiento
estriba en que los reactivos muy ácidos tienen propiedades
cáusticas y corrosivas. Para descartar este inconveniente, ya es
conocido por ejemplo por los artículos de Clin. Chem. 23,
237-240, 1977 y Z. Clin. Chem. 3,
96-99, 1965, el uso de agentes desnaturalizadores de
proteínas, por ejemplo el cloruro de guanidinio concentrado, o de
detergentes aniónicos, para liberar el hierro.
En las formas conocidas de ejecución de este
procedimiento, durante la determinación del hierro surgen mediciones
erróneas en sueros lipémicos turbios. Ni el cloruro de guanidinio
ni los detergentes aniónicos poseen suficiente poder de aclarado
para lograr eliminar por completo esta turbidez.
Para solucionar este problema se propone en el
documento EP-A-0 130 537 el uso de
una mezcla de detergentes no iónicos y aniónicos para liberar el
hierro en medio ligeramente ácido. Sin embargo, se ha encontrado que
es cierto que, cuando se utilizan estos detergentes, se produce un
aclarado rápido y total de los sueros lipémicos, pero cuando los
sueros tienen un contenido elevado de inmunoglobulina (sueros de
gammapatía) se observa una turbidez, que puede falsear el resultado
del análisis. Por otro lado, la recuperación no es totalmente
satisfactoria en el caso de sueros muy hemolíticos.
Para solucionar este problema en el documento
EP-A-0 343 592 se propone tratar el
suero con una primera solución de un agente desnaturalizador en una
concentración de 1-8 moles/l, realizar una medición
de la turbidez después de la adición de la primera solución, añadir
después una segunda solución, que contiene el reactivo colorante y
eventualmente un agente desnaturalizador en una concentración de 1 -
8 moles/l y después determinar el complejo de color y para
determinar la cantidad de hierro se resta el valor de la turbidez
del valor medido en la solución del complejo de color. Un
inconveniente de este método consiste en que, en la segunda
solución, pueden ocurrir precipitaciones que probablemente son un
complejo del colorante y del agente desnaturalizador. Por ello se
tiene que bajar la concentración del colorante en esta solución, a
raíz de lo cual pueden surgir interferencias por contaminaciones del
EDTA y mediciones erróneas debidas a una curva de reacción no lineal
en el caso de muestras que tengan un contenido bajo de hierro.
Existe, pues, la necesidad de desarrollar un
procedimiento y un reactivo para la determinación de hierro en el
suero, en el que por un lado no tengan que emplearse componentes
agresivos y por otro lado puedan evitarse las interferencias
atribuibles a sueros lipémicos, sin que la medición resulte
perturbada por muestras hemolíticas o sueros de alto contenido en
hemoglobina. Por motivos de automatización y de racionalización es
deseable además que no sea necesaria la desalbuminación previa de
la muestra.
Esta necesidad se satisface según la invención
con un procedimiento para la determinación de hierro en el suero
con liberación del hierro fijado por adición de un agente
desnaturalizador de proteínas, reducción del hierro liberado a
Fe^{2+}, adición de una solución de un reactivo colorante y
medición fotométrica del complejo de color formado, el
procedimiento está caracterizado porque se trata el suero con un
agente desnaturalizador que contenga urea o un derivado de urea y
con un poliglicoléter de alcoholes grasos. Como muestra biológica
se utiliza con preferencia el suero sanguíneo. Además del suero
pueden utilizarse también el plasma, sobre todo el plasma de
heparina.
La invención se basa en la constatación de que
con la combinación de un agente desnaturalizador que contenga urea
o un derivado de urea y un único detergente muy concreto, un
poliglicoléter de alcoholes grasos, se puede evitar el
enturbiamiento en el momento de la adición del reactivo colorante.
De este modo es posible realizar una medición sin interferencias
tanto de sueros lipémicos como de sueros de gammapatía. Para evitar
las turbideces que surgen en el caso de suero lipémicos ya no es
necesario emplear combinaciones de detergentes, como las descritas
en los documentos EP-A-0 130 537,
DE-A-27 24 757 o
DE-A-37 29 502.
Para soltar el hierro de las proteínas que lo
fijan, sobre todo de la ferritina, ya es conocida la adición de
diversos reactivos desnaturalizadores de proteínas. En el marco de
la invención, son idóneos para la desnaturalización de proteínas la
urea y los derivados de urea, por ejemplo las sales del catión
guanidinio, con preferencia especial las sales cloruro de
guanidinio, acetato de guanidinio, tiocianato de guanidinio y
sulfato de guanidinio.
El agente desnaturalizador se emplea en una
primera solución del ensayo de hierro de esta invención en
combinación con el poliglicoléter de alcoholes grasos. La
concentración del agentes desnaturalizador en la primera solución
del ensayo de hierro de la invención tiene que ser relativamente
elevada y situarse entre 1 y 8 moles/l. Los mejores resultados se
obtienen con concentraciones comprendidas entre 4 y 6 moles/l. En
concentraciones inferiores a 1 mol/l, el hierro se suelta de la
transferrina de forma cada vez más lenta. Para el cloruro de
guanidinio, especialmente preferido, el intervalo preferido de
concentraciones se sitúa entre 1 y 6 moles/l, con preferencia
especial entre 4 y 5 moles/l.
Como poliglicoléter de alcoholes grasos se
emplean aquellos, cuyo grado de etoxilación es superior a 4 y
presentan hasta 7 unidades etoxi y para cuya fabricación se emplea
un alcohol graso ramificado o sin ramificar. Se emplea con
preferencia un alcohol graso que tiene en promedio de 9 a 11 átomos
de carbono. Los poliglicoléter de alcoholes grasos especialmente
preferidos son por ejemplo el Lutensol® ON 50 (polietilenglicoléter
de decilo con un promedio de 5 unidades etoxi), el Lutensol® ON 60
(polietilenglicoléter de decilo con un promedio de 6 unidades
etoxi), el Imbentin-C/91/35 (polietilenglicoléter de
alquilo con 9-11 unidades de C), el
Imbentin-AG/100/050 (polietilenglicoléter de decilo
con un promedio de 5 unidades etoxi). Cuando se indica el grado de
etoxilación se entiende el grado medio de etoxilación de una
partida, porque los poliglicoléteres de alcoholes grasos suelen ser
mezclas de sustancias de grados de etoxilación ligeramente
distintos.
La concentración del poliglicoléter de alcoholes
grasos en la primera solución del ensayo del hierro de la invención
tiene que situarse por lo menos en 10 g/l. La concentración se
situará con preferencia por lo menos en 30 g/l, porque con ella
tiene lugar un aclarado más rápido de las muestras lipémicas. La
concentración superior del poliglicoléter de alcoholes grasos
resulta del límite superior condicionado por la técnica, es decir,
la concentración en la que el detergente ya no se disuelve por
completo. Es preferida en especial una concentración del detergente
de 50 a 100 g/l. Con el uso de los poliglicoléter de alcoholes
grasos mencionados es posible conseguir un aclarado completo de las
muestras lipémicas en pocos minutos. Por lo general basta con cinco
minutos para el aclarado. De este modo, el reactivo puede utilizarse
también en máquinas automáticas de análisis que efectúan mediciones
rápidas.
Los tensioactivos con grados de etoxilación más
bajos o más elevados que el poliglicoléter de alcoholes grasos
empleado según la invención, por ejemplo el Tween® 20, el Genapol
X-080, el Oxetal ID 104, el Thesit®, el Lutensol®
ON 30, el Tritón® X-100, no son idóneos para el
aclarado de muestras lipémicas en un reactivo de urea o de
derivados de urea.
Para la puesta en práctica del procedimiento de
la invención se tampona la solución de la muestra en un intervalo
ligeramente ácido, con preferencia especial en un intervalo de pH
3,5 a pH 6. Como sustancias tampón son idóneos los compuestos que
presentan un valor pK de 3,5 a 6 y no complejan al hierro. Son
idóneos por ejemplo los tampones acetato, fosfato o succinato. Otra
variante preferida consiste en ajustar en primer lugar el pH a un
valor ácido para liberar el hierro, con preferencia especial a un pH
entre 2 y 6 y después reajustar el tampón a un valor de pH que
permita obtener un rendimiento colorimétrico óptimo con el sistema
de colorante elegido para la detección del hierro. Los valores de
pH idóneos para ello ya son conocidos de los técnicos y se describen
por ejemplo en el manual Fielding, Methods in Hematology 1 (hierro),
15-49, 1980.
Como sustancia tampón se emplea con preferencia
el tampón acetato. El tampón se utiliza con preferencia en una
concentración de 20 a 500 mmoles/l, con preferencia especial entre
50 y 150 mmoles/l. La sustancia tampón puede estar presente en la
primera solución del ensayo de hierro de la invención, que contiene
el agente desnaturalizador y el poliglicoléter de alcoholes grasos.
Además pueden tamponarse también otras soluciones o la segunda
solución del ensayo de hierro de la invención.
Para la determinación del hierro se añade a la
solución de la muestra, como ya es sabido, un reductor, por ejemplo
el ácido ascórbico, un ditionito o una hidroxilamina, con el fin de
reducir el hierro liberado en forma 3-valente y
pasarlo a la forma 2-valente. El reductor puede
añadirse a la primera solución junto con el agente desnaturalizador,
o bien a la segunda solución que contiene además el sistema de
colorante idóneo para la detección del hierro. El reductor se añade
con preferencia a la segunda solución.
Los sistemas de colorantes para la detección del
hierro se describen por ejemplo en el documento
EP-A-0 228 060 o en los artículos
Clin. Biochem. 14, 311-315, 1981 y Clin.
Chem. 23, 237-240, 1979. Son especialmente
indicados los formadores de complejos del tipo ferroína, que con el
hierro proporcionan un colorante, que puede evaluarse
fotométricamente. Como sustancias idóneas cabe mencionar la
batofenantrolina y la ferrozina (sal disódica del ácido
3'-(2'-piridil)-5,6-difenil-1,2,4-triazina-sulfónico).
La formación del colorante tiene lugar de forma proporciona al
contenido en hierro de la muestra y puede evaluarse fotométricamente
de modo de por sí conocido.
Con esta invención se logra por primera vez,
prescindiendo de un sistema completo de detergentes y utilizando
solamente un tensioactivo único, fabricar un reactivo idóneo para la
determinación fotométrica del hierro incluso en muestras biológicas
muy lipémicas.
Otro objeto de la invención es, pues, el uso de
una mezcla de agente desnaturalizador de urea o de un derivado de
urea y un poliglicoléter de alcoholes grasos para impedir las
interferencias de la lipemia o de la gammapatía en la determinación
fotométrica del hierro en una muestra.
La comprobación de la eficacia del reactivo para
aclarar las muestras lipémicas puede realizarse fotométricamente en
una proporción de muestra-reactivo de 1:5 a 1:25,
con preferencia de 1:10 a 1:15. Para ello se define como aclarado
completo cuando una solución de Intralipid® del 20% (Kabi Pharmacia
GmbH, Alemania), una emulsión de grasa basada en aceite de soja,
diluida posteriormente con agua en una proporción de 1:20, se mide a
37ºC con una longitud de onda de 578 nm y un grosor de capa de 1 cm
frente a la solución del reactivo como valor en blanco y al cabo de
cinco minutos da como valor de extinción como máximo 5 mE.
El aclarado puede comprobarse también en muestras
biológicas lipémicas por medición de la curva de la extinción frente
al tiempo (E/t), para ello se considerará completo según la
definición cuando la extinción medida después de cinco minutos se
diferencia en menos de 5 mM de la extinción medida al cabo de 10
minutos.
Para la evaluación de la interferencia de la
lipemia se compara el contenido en hierro de una muestra biológica
guardada con Intralipid® del 20% con el contenido de la misma
muestra, pero tratada con agua (de modo similar al descrito por
Glick, Clin. Chem. 32, 470-475, 1986). Existe
una interferencia de la lipemia cuando el contenido de hierro medido
en una mezcla de una parte en volumen de Intralipid® del 20% y 19
partes en volumen de suero y el contenido de hierro medido en una
parte en volumen de agua y 19 partes en volumen del mismo suero
difieren en más de 5 \mug/dl.
Otro objeto de la invención es una combinación de
reactivos para la determinación de hierro en el suero, caracterizado
por un primer reactivo, que contiene de 1 a 8 moles/l de agente
desnaturalizador y por lo menos 10 g/l de poliglicoléter de
alcoholes grasos y, separado del anterior, un segundo reactivo que
contiene de 0,5 a 50 mmoles/l de colorante en forma de solución
acuosa o en forma de mezcla seca idónea para la preparación de una
solución acuosa. Ambos reactivos o bien solo el primer reactivo
pueden contener además de 20 a 500 mmoles/l de una sustancia
tampón.
El segundo reactivo puede contener además un
reductor, por ejemplo el ácido ascórbico, ditionito o hidroxilamina,
en una concentración de 40 a 200 mmoles/l. Se ha constatado de modo
sorprendente que el reductor es estable dentro del segundo reactivo
en forma de solución acuosa. En las combinaciones de reactivos
habituales hasta el presente para la determinación de hierro en el
suero, el reductor tenía que añadirse al reactivo líquido poco
antes de la utilización.
Los ejemplos siguientes ilustran la invención con
mayor detalle.
Para la determinación de hierro en el suero se
utilizan los reactivos siguientes.
Reactivo
1
- 4 moles/l de cloruro de guanidinio
- 0,15 moles/l de tampón acetato, pH 5,0
- 0,100 moles/l de tiourea
El poliglicoléter de alcoholes grasos en la
concentración correspondiente que se indica a continuación.
Reactivo
2
- 15 mmoles/l de ferrozina
- 0,1 mol/l de ácido ascórbico
La realización de los ensayos puede efectuarse en
un aparato Hitachi 717, Boehringer Mannheim GmbH.
Se mezclan 20 \mul de muestra y 250 \mul de
reactivo 1. Después de 4,6 min de incubación a 37ºC se añaden con
pipeta 50 \mul del reactivo 2. Se determina la extinción 1 al poco
de haber añadido el reactivo 2. La extinción 2 se mide al cabo de 6
minutos. A partir de estos dos valores puede hallarse la diferencia
de extinciones \DeltaE = E2 - E1. Como alternativa puede trazarse
el diagrama E/t para una mejor representación del aclarado.
En el primer ejemplo se determina mediante los
diagramas E/t el aclarado con distintos detergentes en el reactivo 1
utilizando como ejemplo un suero humano que se ha guardado con
Intralipid® 20. El contenido en triglicéridos de la muestra de suero
humano guardado es aprox. de 2000 mg/dl. Como detergentes se
utilizan un poliglicoléter de alcohol graso con 3 unidades etoxi
(Lutensol® ON 30), 5 unidades etoxi (Lutensol® ON 50) y 8 unidades
etoxi (Genapol X-080). Como control se emplea el
reactivo 1 sin detergente. Los resultados se representan en la
figura 1. Se advierte claramente que solamente el reactivo de la
invención con un poliglicoléter de alcohol graso con 5 unidades
etoxi produce el aclarado de la muestra lipémica. Ya al cabo de unos
dos minutos, la extinción ha bajado hasta el valor cero. Un
poliglicoléter de alcohol graso con 8 unidades etoxi no conduce al
aclarado de la muestra. El poliglicoléter de alcohol graso con 3
unidades etoxi provoca incluso un mayor enturbiamiento de la
muestra.
La ejecución del ensayo tiene lugar de modo
similar al descrito en el ejemplo 1. Se emplean diversos
poliglicoléteres de alcoholes grasos de la invención con
4,5-6 unidades etoxi
(Imbentin-E/V-177: 4,5 unidades
etoxi; Lutensol® ON 50: 5 unidades etoxi;
Imbentin-AG/100/50: 5 unidades etoxi;
Imbentin-C/91/35: 5 unidades etoxi; Lutensol® ON 60:
6 unidades etoxi).
Los resultados se representan en la figura 2. Se
advierte claramente que todos los poliglicoléter de alcoholes grasos
de la invención en un suero humano guardado con Intralipid
(contenido en triglicérido: aprox. 2000 mg/dl) conducen a un rápido
aclarado de la muestra. Todas las muestras quedan claras al cabo de
aprox. dos minutos. El
Imbentin-E/V-177 y el
Imbentin-AG/100/50 conducen ya al aclarado completo
de la muestra al cabo de un minuto.
Tomando como ejemplo el Lutensol® ON 50 se
determina el efecto de la concentración del detergente en el
aclarado del suero humano, que se ha guardado con Intralipid hasta
un contenido de triglicéridos de aprox. 2000 mg/dl. Los resultados
se representan en la figura 3. Una concentración de Lutensol® ON 50
del 4% conduce ya al aclarado completo de la muestra al cabo de unos
tres minutos, el Lutensol® ON 50 al 5% al cabo de unos dos minutos
y el Lutensol® ON 50 al 10% al cabo de 1 minuto.
Se observa claramente que una concentración muy
elevada, como es el 10%, no afecta a la producción de color después
de la adición del reactivo 2.
Los ensayos se realizan de modo similar al
descrito en el ejemplo 1.
En este ejemplo se pone de manifiesto que con el
reactivo de la invención se pueden aclarar no solo las muestras
artificiales guardadas con Intralipid, sino también los sueros
lipémicos humanos de origen natural. En este se emplea suero
lipémico humano, que contiene aprox. 1000 mg/dl de triglicéridos. La
realización de los ensayos es similar a la descrita en el ejemplo 1.
El reactivo 1 contiene como detergente un 5% de Lutensol® ON 50.
De la figura 4 se desprende claramente que la
adición del reactivo 1 ya conduce al aclarado completo del suero
lipémico humano al cabo de dos minutos.
Claims (7)
1. Reactivo parcial para la determinación de
hierro en suero o en plasma de heparina, que contiene de 0,5 a 50
mmoles/l de colorante y de 40 a 1000 mmoles/l de reductor en
solución acuosa, caracterizado porque el reactivo parcial no
está tamponado.
2. Reactivo parcial según la reivindicación 1,
caracterizado porque el reductor está presente en una
concentración de 40 a 200 mmoles/l.
3. Reactivo parcial según una de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque como colorantes
se emplean complejantes del tipo ferroína.
4. Reactivo parcial según la reivindicación 3,
caracterizado porque como colorantes se emplea la
batofenantrolina, el fereno o la ferrozina.
5. Reactivo parcial según una de las
reivindicaciones de 1 a 4, caracterizado porque como reductor
se emplea el ácido ascórbico, ditionito o hidroxilamina.
6. Uso del reactivo parcial según una de las
reivindicaciones de 1 a 5 en un procedimiento para la determinación
de hierro en suero o en plasma de heparina.
7. Procedimiento para la determinación de hierro
en suero o en plasma de heparina, caracterizado porque se
emplea un reactivo parcial según una de las reivindicaciones de 1 a
5.
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