CS269399B1 - Způsob standardizace stanovení selektivního vypadávání albuminu z roztoku krevního séra - Google Patents

Abstract

Způsob standardizace stanovení selektivního vypadávání albuminu z roztoku krevního séra v ústrojném roztoku při pH 3,9 až 4,5 spočívá v tom, že se srážení albuminu provádí v přítomnosti 0,0001 až 0,1 molu sloučeniny dvojmocné mědi na 1000 mlQreakčního roztoku při teplotě 0 až 54UC. Selektivní vypadávání albuminu se používá k laboratornímu vyšetřová­ ní pacientů, nemocných zánětlivými a degenerativními chorobami, u nichž vypadá­ vání albuminu probíhá pomaleji a v men­ ším množství než u zdravých lidí.

Description

CS 269 399 B1 1

Vynález spadá do oblasti lékařských laboratorních vyšetřování krevního séra. Řešena je standardizace stanovení selektivního vypadáváni albuminu z roztoku krevníhoséra (Turek S.: Schopnost selektivní flokulace albuminu krevního séra u jaterních cho-rob. Čs. Gastroent. Výž., 42, 1988, s. 215 až 216), známé též pod názvy albuminovázákalová a albuminová vločkovací reakce krevního séra (Turek S.: Albumin TurbidityReaction of Blood Sérum. Z. kliň. Chem. kliň. Biochem., 5, 1967, s. 187 až 188. -Turek S.: Albuminová vločkovací reakce krevního séra, Čas. Lék. čs., 118, 1979, s.89až 90). Selektivním vypadáváním albuminu se rozumí flokulace albuminu z roztoku krev-ního séra v ústrojném roztoku s obsahem vsolovací koncentrace sole při pH 3,9 až 4,5,zatímco sérové globuliny zůstávají v roztoku. Tato reakce je urychlována záhřevem roz-toku na teplotu 30 až 54 °C. Rychlost vypadávání albuminu, intenzita zákalu roztokuaž flokulace albuminu, jsou dále závislé na látkovém složení a iontové síle reakčníhoroztoku a nepřímo závislé na stupni zředění séra při reakci. Za stejných reakčníchpodmínek je však selektivní vypadávání albuminu z roztoku séra signifikantně méně in-tenzívní u sér lidí nemocných zánětlivými nebo degenerativními chorobami, a to v závis-losti na intenzitě, případně rozsáhlosti, patologického procesu. Tento jev je proto vy-užitelný v klinické diagnostice a prognostice.

Dosud popsané způsoby tohoto stanovení však nepřihlížejí k rušivým katalytickýmvlivům stopových nečistot kovů, jmenovitě mědi, na výsledky reakce. Obsah těchto stopo-vých nečistot v činidlech kolísá podle různých způsobů přípravy čisté vody, podle použi-tí různých šarží chemikálií a různého materiálu k odběru krevních vzorků. Proto dosudpopsané způsoby stanovení nezaručují dostatečnou míru opakovatelnosti, zejména prosrovnání výsledků, dosažených na různých pracovištích nebo v delších časových odstupechna tomtéž pracovišti.

Uvedené nevýhody odstraňuje standardizace stanovení selektivního vypadávání albumi-nu z roztoku krevního séra při pH 3,9 až 4,5 podle vynálezu, který spočívá v tom, že sesrážení provádí v přítomnosti 0,0001 až 0,1 molu sloučeniny dvojmocné mědi na 1 000 mlreakčního roztoku, při teplotě 0 až 54 °C.

Tato koncentrace činí vliv stopových kvant kovových nečistot reakčních roztoků zce-la zanedbatelný. Tím jsou eliminovány možnosti chyb ze stopových katalyticky účinných ne-čistot a je dosaženo dostatečné opakovatelnosti stanovení. Zároveň skýtá přídavek mědnatésole výhody katalyticky řízené reakce. Reakce selektivního vypadávání albuminu z roztokuséra, katalyzovaná přídavkem dvojmocné mědi, probíhá rychleji než bez přídavku. Protoje možno použit i nižších reakčních teplot než dosud použitých, tj. i teplot v rozsahu0 až 30 °C. K měření výsledků stanovení lze používat nejen měřeni zákalu roztoku nebokvantity bílkovinného flokulátu, jako dosud, ale i měření času, potřebného ke tvorběa sedimentaci flokulátu. Katalytické urychlení reakce je přímo úměrné kvantu přidanésloučeniny dvojmocné mědi. Přídavek mědnaté sole do reakčního roztoku umožňuje standar-dizaci metodických postupů. Přídavku mědnaté sole je možno použít v rozsahu koncetrace0,0001 až 0,1 mol/1000 ml reakčního roztoku. Lze použít síran nebo chlorid nebo bro-mid nebo dusičnan nebo octan mědnatý anebo citronan mědnato-amonný nebo vinan mědnato-draselný.

Jako ústrojné roztoky při použití katalýzy sloučeninou dvojmocné mědi jsou vhodnépufry citrátové a octanové pufry. U octanových pufrů je nutná přísada síranu sodnéhonebo síranu amonného ve vsolovací koncentraci. Místo octanových pufrů lze použít ipufry mravenčanové nebo jantaranové. Lze použít koncentrace pufrů v rozsahu 0,025 až0,5 mol/1 000 ml, koncentrace přidávané sole rovněž v rozsahu 0,025 až 0,5 mol/1 000ml. Použitelné rozmezí aktuální koncentrace vodíkových iontů reakčních roztoků je vrozsahu pH 3,9 až 4,2. Poměr zředění séra reakčním roztokem je v rozmezí 1 : 5 až1 : 500. Reakční teplotu lze použit v rozsahu 0 až 54 °C. Doba reakce, potřebná pro 2 CS 269 399 B1 dosažení výsledků, činí podle ostatních reakčních podmínek 5 sec až 24 hod. Měření vý-sledků reakce je možné známými postupy turbidimetrickými nebo nefelometrickými. Při mě-ření výsledků flokulační reakce se měří čas v minutách, za který se vytvoří nepfůhled-ný sediment vyvločkovaného albuminu; přitom se vizuálně hodnotí objem sedimentovanéhoflokulátu anebo lze použít stanoveni bílkoviny v odstředěném sedimentu známými postupy -polarografickým, fotometrickým či kolorimetrickým. Příklad 1 Činidla: X. Citrátový nárazník 0,2 mol/1 000 ml, pH = 4,0 .: 25,010 g kyseliny ci-trónové (monohydrát) p. a. a 23,808 g citronanu sodného normálního (trihydrát) p. a.se rozpustí v destilované a deionizované vodě, doplní se na cca 950 ml, přidá se 0,5 mlchloroformu p. a., dobře se promíchá a za kontroly, případně úpravy pH se doplní na ob-jem 1 000 ml. Roztok se zfiltruje papírovým analytickým filtrem. Připravuje se nejdéleza 1 měsíc čerstvý. II. Mědnaté činidlo: ve 180 ml roztoku I. se rozpustí 0,300 g síranu mědnatého(pentahydrát) p. a. a doplní se na objem 200 ml tímtéž roztokem. Promíchá se.

Provedení: Do zkumavek se odměří po.0,075 ml krevního séra, přidá se po 2,50 mlčinidla I., promíchá se, přidá se po 0,50 ml činidla II. a opět se promíchá. Zkumavkyse postaví do vodní lázně temperované na 37 - 0,1 °C na dobu 60 min. Pak se zkumavkyvyjmou z vodní lázně, zevně se osuší a nechají se stát 15 min. Potom se změří intenzitazákalu roztoku proti slepé zkoušce, obsahující vodu místo séra. Při turbidimetrickémměření v kyvetách 1 cm délky na spektrofotometru při vlnočtu 16 x 1 000 cm je prů-měrná hodnota zdánlivě absorbance u zdravých lidí 0,980 se střední kvadratickou odchyl-kou í 0,180. Séra lidi nemocných dávají hodnoty nižší než 0,450. U nemocných závažnýmichorobami jsou hodnoty nižší než 0,300, v těžkých patologických případech nižší než0,100. Opakovatelnost výsledků, zjištěná výpočtem podle testu párových hodnot z výsled-ku duplicitních vyšetření je v rozmezí - 5 %. Příklad 2 činidla: 1. Octanový nárazník 0,2 mol/1 000 ml podle Walpolea, s obsahem síranusodného v koncentraci 0,3 mol/1 000 ml, pH roztoku = 4,0 : 820 ml 0,2 mol/1 000 mlkyseliny· octové čistoty p. a. se doplní na objem 1 000 ml roztokem 0,2 mol/1 000 mloctanu sodného p. a. Pak se ve 450 ml ro.ztoku rozpustí 21,3062 g síranu sodného bezvo-dého p. a. a za kontroly, případněúpravy pH na 4,0 se doplní na objem 500 ml. Připravujese hejdéle za 1 měsíc čerstvý. 2. Mědnaté činidlo: 5,2 g síranu mědnatého pentahydrátu p.a. se rozpustí v cca90 ml činidla 1 a doplní se tímtéž roztokem na 100 ml a promíchá se.

Provedení: do zkumavek o vnitřním průměru 12 mm se zaobleným dnem se odměří po0,075 ml krevního séra a přidá se po 2,0 ml činidla 1, promíchá se a přidá se po 0,25ml činidla 2. Promíchá se. Zapne se časoměřič a zkumavky se postaví do vodní lázně tem-perované na 37 - 0,1 °C na dobu .20. min.Pak se zkumavky vyjmou z vodní lázně, zevněse osuší a postaví se v jedné řadě do suchého stojanu. Pozoruje se vizuálně tvorbaflokulátu albuminu a sedimentao&flokulátu, průhledem roztoků ve zkumavkách proti oknunebo osvětlovacímu tělesu. Měří se čas v minutách od přidání mědnatého činidla do vy-tvoření neprůsvitné, nahoře zřetelně ohraničené vrstvy sedimentu a posuzuje se téžkvantita sedimentovaného řlokulátu. Séra zdravých lidí vytvoří neprůsvitný sediment,vyplňující celé zaoblené dno zkumavky, nejpozději do 50. min od přidání mědnatého či-nidla. Vytvoří-li se takovýto sediment mezi 50. a 55. minutou od přidání mědnatéhočinidla do reakčního roztoku, dává tento výsledek podezření na onemocnění. Vytvořeníuvedeného sedimentu po 55. min je patologickým příznakem. Séra lidí nemocných závažnouchorobou vytvářejí zákal roztoku s tvorbou sedimentu až po 100 min. U nejtěžších pato-logických případů se vytvoří jen opalescence roztoku, nezakalující se ani během 120 min.

Claims (2)

1. CS 269 399 B1 3 Rozdíly v chování sér zdravých a nemocných lidí jsou zřetelné. I vytvoření silnéhozákalu roztoku, který jeví zpomalenou tvorbu uvedeného ohraničeného neprůevltného se-dimentu, je vždy patologickým příznakem. Roztok při reakci je třeba pozorovat hlavněv 50 až 60 min. a pak ve 100 až 120 min. Přiklad 3 Činidla: Činidlo 1. a činidlo 2. jsou stejné jako v příkladu
2. 2. Provedení: Zpočátku se postupuje stejně jako v příkladu 2 s tím rozdílem, že sezkumavky ponechají ve vodní lázni nikoli 20, ale 30 min. Pak se zkumavky nechají stát15 min při teplotě místnosti. Poté se roztoky ve zkumavkách odstředí po dobu 15 min při1500 x g. Supernatant se odlije a zkumavky se sedimentem se nechají stát 15 min dnemvzhůru na vrstvě buničiny. Pak se sediment bílkoviny rozpustí v 1,5 ml roztoku amoniakuo koncentraci 2 mol/1 000 ml, přidá se 3,0 ml destilované vody a promíchá se. Z tohotoroztoku se odměří 0,25 ml do jiné zkumavky a přidá se 4,0 ml Brdičkovy kobaltité pola-rografické soluce. Roztok se vyšetřuje klasickou polarografickou metodou od - 0,8 do- 1,8V. Zaznamená se Brdičkova bílkovinná polarografická vlna, odečte se intenzitakatalytického proudu ve vrcholu křivky a přepočte se na plochu rtutové kapky. Sérazdravých lidi dala při tomto postupu hodnoty v rozmezí 10,5 až 17,5 A/m2. Séra lidíprokázané nemocných vykázala hodnoty v rozmezí 0 až 8,5 A/m2. Opakovatelnost výsledkůmetody, vypočtená testem párových hodnot z výsledků duplicitních vyšetření je v rozmezí Stanovení selektivního vypadávání albuminu z roztoku krevního séra, zdokonalenépoužitím katalýza dvojmocnou mědí, je citlivým indikátorem patologického procesu ijeho intenzity a to u zánětlivých nemocí baktriálního i virového původu, při chorobáchreumatických, u polyserositid, u poruch imunitních regulací, u zánětlivých i degenerativ-ních chorob jaterních a gastroenterologických, u ledvinových a urologických nemocí,u anemií a metabolických chorob, u nekrobiotických procesů, jako srdeční a plicní zá-hatě, u zhoubného bujení, u tyreotoxikosy, u mukoviscidosy, u roztroušené sklerosymozkomíšní, zánětlivých afekcí neurologických i u zátěží organismu různého druhu včet-ně nepříznivých vlivů životního a pracovního prostředí. Stanovení má pro svou jedno-duchost význam jako skríninkový test různých zdravotních poruch a pro svou význačnoucitlivost je vyšetření vhodné jakožto prognostické při sledování průběhu choroby, je-jí progrese nebo naopak ústupu hojení á rekonvalescence i úzdravy. Toto vyšetření sejeví universálnějším a citlivějším ukazatelem, nežli je stanovení sedimentace erytrocytů. PŘEDMÉT VYNÁLEZU Způsob standardizace stanovení selektivního vypadávání albuminu z roztoku krevníhoséra v ústrojném roztoku při pH 3,9 až 4,5, vyznačující se tím, že se srážení albuminuprovádí v přítomnosti 0,0001 až 0,1 molu sloučeniny dvojmocné mědi, například síranu,octanu, chloridu, bromidu, dusičnanu mědnatého, citronanu měánato-amonného nebo vinanumědnato-draselného, na 1 000 ml reakčního roztoku při teplotě 0 až 54 °C.