ES2244009T3 - Procedimiento de produccion de semillas con elevado contenido en aceite mediante modificacion de los contenidos en almidon. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNOS PROCEDIMIENTOS QUE PERMITEN LA OBTENCION DE UNA CONCENTRACION DE ACEITE SUPERIOR A LA NORMAL EN LA SEMILLA DE UNA PLANTA. DICHO PROCEDIMIENTO CONSISTE EN MODIFICAR EL METABOLISMO DEL CARBONO DE LA SEMILLA, LO QUE LLEVA A UNA MODIFICACION DE LA DISTRIBUCION DE LOS ASIMILADOS PROCEDENTES DE LA BIOSINTESIS DEL ALMIDON QUE PERMITEN INCREMENTAR LA BIOSINTESIS Y LA ACUMULACION DE ACEITE, PREFERENTEMENTE SIN MODIFICACION IMPORTANTE DEL TAMAÑO DEL ORGANO DE ALMACENAMIENTO QUE PODRIA TENER UN EFECTO DESFAVORABLE SOBRE EL VALOR COMERCIAL DE LA MATERIA. ESTA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A LAS SEMILLAS OBTENIDAS DE ACUERDO CON EL PROCEDIMIENTO DESCRITO ANTERIORMENTE.

Description

Procedimientos de producción de semillas con elevado contenido en aceite mediante modificación de los contenidos en almidón.

Campo técnico

La presente invención se relaciona, en general, con la modificación de la composición de las semillas del maíz. Concretamente, la presente invención se relaciona con el aumento en la concentración de aceite en las semillas del maíz.

Antecedentes de la invención

Como media, un 20% del maíz producido en los EE.UU. es utilizado para alimento doméstico y con fines industriales, incluyendo la molienda en húmedo. En 1995, los granjeros Americanos produjeron 7,4 billones de fanegas de maíz, un 20,6% de los cuales fue refinado por la industria de la molienda en húmedo del maíz en más de 51 billones de libras de producto.

El rendimiento de material del proceso de molienda en húmedo del maíz incluye almidón para uso directo o para modificación química, almidón utilizado como alimentos degradativos para la fabricación de una abundancia de productos secundarios y coproductos/subproductos, tales como alimento de gluten, harina de gluten y aceite de maíz. Al crecer la lista de productos que contienen ingredientes derivados del maíz, también lo hace el porcentaje de cultivo EE.UU. utilizado por la industria de la molienda en húmedo.

El componente central crítico en el uso directo o indirecto del maíz para muchos productos es el almidón. Es interesante, sin embargo, que en algunos casos el valor unitario de los coproductos excede al del almidón. Éste es el caso del aceite de maíz, que tiene un valor de aproximadamente \textdollar0,23/lb, en comparación con \textdollar0,126/lb para el almidón (ERS 1995, ERS 1995). Los molineros de la molienda en húmedo del maíz dependen de créditos obtenidos del aislamiento y la venta de coproductos para minimizar el coste neto del maíz que muelen para la recuperación de almidón. El valor monetario conseguido por el aislamiento y la venta de aceite o de productos que contienen aceite (por ejemplo, germen seco) es una importante porción de estos créditos de coproductos. Más aún, debido al alto valor unitario del aceite, el crédito de coproducto para este material es más sensible a cambios en el rendimiento del refinado que todos los demás coproductos.

Al reconocer la importancia y el valor de los constituyentes aislados del grano en el proceso de la molienda en húmedo, es útil conocer la composición de partida del grano y sus partes. En base al peso seco del grano completo (bs), el maíz está compuesto por los siguientes constituyentes primarios de importancia económica: 4,0% de aceite, 9,7% de proteína, 69,8% de almidón, 3,5% de azúcares y 5,9% de fibra. De forma similar, la composición media de partes componentes del grano no procesado es como sigue: (1) el germen (definido como el órgano que incluye el escutelo y el propio embrión) constituye un 11,9% de la totalidad de la almendra y contiene un 34% de aceite, un 8,2% de almidón, un 18,8% de proteína, un 10,8% de azúcar y un 10,1% de ceniza y (2) el endospermo constituye un 82% de la totalidad de la almendra y contiene un 86% de almidón, un 9,4% de proteína, un 0,8% de aceite y un 0,6% de azúcar (Earle, F.R., J.J. Curtis y col., "Composition of The Component Parts of The Corn Kernel", Cereal Chem., Vol. 23(5), pp. 504-511, 1946). Mediante cálculo, Earle y col. (1946) han determinado que un 84% del aceite de la semilla se encuentra en el germen y un 98% del almidón de la almendra se localiza en el endospermo.

La finalidad del procedimiento de molienda en húmedo es fraccionar la almendra y aislar constituyentes químicos de valor económico en sus partes componentes. Esto corresponde específicamente al almidón, que se fracciona en una forma altamente purificada. Otros materiales son típicamente aislados en formas brutas (por ejemplo, aceite no refinado) o como una amplia mezcla de materiales que comúnmente reciben de poco a ningún procesado más allá de la desecación. Por ello, en el proceso de molienda en húmedo se reblandece el grano por maceración y se rompe por trituración para liberar el germen de las almendras. Se separa el germen de la mezcla de mayor densidad de almidón, cáscaras y fibra "haciendo flotar" los segmentos de germen para liberarlos de las otras substancias en un proceso de centrifugación. Esto permite una limpia separación de la fracción que lleva aceite del grano de los fragmentos de tejidos que contienen la masa del almidón. Como no es económico extraer aceite a pequeña escala, muchas plantas de molienda en húmedo envían el germen a grandes instalaciones de producción de aceite centralizada. Se saca o extrae el aceite con solventes de los gérmenes secos y se mezcla comúnmente la harina de germen que queda en alimento de maíz de gluten (AMG), un coproducto de la molienda en húmedo. La composición típica de la torta de maíz gastada, el material de germen que queda después de extraer el aceite, es un 20% de almidón, un 25% de proteína, un 1% de grasa, un 10% de fibra bruta y un 25% de pentosanos (Anderson, R.A. y S.A. Watson, "The Corn Milling Industry", CRC Handbook of Processing and Utilization in Agriculture; A. Wolff, Boca Ratón, FL, CRC Press, Inc., Vol. 11, Parte 1, Plant Products: 31-61, 1982). Por ello, el almidón contenido en el germen no es recuperado como tal en el procedimiento de molienda en húmedo y se canaliza a AMG. El valor unitario del AMG es de aproximadamente el 20% del aceite de maíz y el 50% del del almidón de maíz. Aun aumentando el contenido de aceite de la semilla, es deseable que no se reduzca el tamaño del endospermo, y, por lo tanto, el contenido de almidón, ya que es útil que también se mantengan los beneficios del almidón.

La investigación actual indica que la selección genética del maíz puede dar lugar a un mayor contenido de aceite en el embrión, pero que el genotipo resultante se asocia a una reducida producción de almidón. Véase, por ejemplo, Doehlert y Lanibert, "Metabolic Characteristics Associated with Starch, Protein and Oil Deposition in Developing Maize Kernels", Crop Sci., Vol. 32, pp. 151-157 (1991).

La importancia central del almidón para el desarrollo de las plantas y para los mercados de los alimentos, de los piensos y de la industria ha motivado a los investigadores a través de muchos años a investigar los mecanismos que controlan la biosíntesis del almidón. Los mutantes de maíz que afectan a la deposición de almidón en la semilla han sido un instrumento en la caracterización de la bioquímica de la síntesis del almidón. Un considerable esfuerzo de investigación continúa explorando los sistemas metabólicos implicados en la síntesis del almidón, pero, además, se están usando técnicas moleculares para disecar genes que codifican enzimas que se sabe son críticas en la biosíntesis del almidón. Para descubrir qué regiones de los genes codifican aspectos controladores del metabolismo de las enzimas, los científicos están empezando a manipular el metabolismo del almidón a través de ingeniería genética. El interés en el control de la biosíntesis de almidón por técnicas moleculares y genéticas se ha intensificado significativamente en los últimos años y varias publicaciones recientes describen aspectos fundamentales de la biosíntesis de almidón y/o cómo pueden ser manipulados en plantas transgénicas; véanse, por ejemplo, Hannah, L.C., M. Giroux y col., "Biotechnological Modification of Carbohydrates for Sweet Corn and Maize Improvement", Scientia Horticulturae, Vol. 55, pp. 177-197, 1993; Smith, A.M. y C. Martin, "Starch Biosynthesis and The Potential for Its Manipulation", Biosyn. and Manipulation of Plant Products, D. Grierson, Vol. 3, pp. 1-54, 1993; Visser, R.G.F. y E. Jacob, "Towards Modifying Plants for Altered Starch Content and Composition", Trends in Biotechnology, Vol. 11, pp. 63-68, 1993; Muller-Rober, B. y J. Kossmann, "Approaches to Influence Starch Quantity and Starch Quality in Transgenic Plants", Plant Cell Environ., Vol. 17, pp. 601-613, 1994; Bhullar, S.S., "Bioregulation of Starch Accumulation in Developing Seeds", Current Science, Vol. 68(5), pp. 507-516, 1995; Morell, M.K., S. Rahan y col., "The Biochemistry and Molecular Biology of Starch Synthesis in Cereals", Aust. J. Plant. Physiol., Vol. 647-660, 1995; Nelson, O. y D. Pan, "Starch Synthesis in Maize Endosperms", Plant Physiol., Vol. 46, pp. 475-496, 1995; Wasserman y col., "Biotechnology: Progress toward Genetically Modified Starches", Cereal Foods World, Vol. 40(11), pp. 810-817, 1995.

La sacarosa es considerada como el metabolito primario utilizado en la síntesis de almidón, aunque la semilla cultivada in vitro con los azúcares reductores, glucosa o fructosa, también produce almidón. En términos simples, los azúcares se convierten en los nucleótidos de azúcares, ADP-glucosa y UDP-glucosa, ya sea directamente o a través de intermediarios carbohidratados fosforilados. Los nucleótidos de azúcares son substratos para las enzimas sintasas, que polimerizan la porción glucosílica de las moléculas para formar largas cadenas de glucosa. Los polímeros permanecen esencialmente lineales (amilosa) o se ramifican (amilopectina) y se combinan de una forma específica para convertirse en gránulos de almidón. El mecanismo de iniciación de la síntesis del polímero glucosílico no es conocido con certeza, aunque existe la hipótesis de que una proteína, la amilogenina, puede tener un papel nucleante en el proceso (Singh, D.G., J. Lomako y col., "\beta-Glucosylarginine: A New Glucose-Protein Bond in A Self-Glucosylating Protein from Sweet Corn", FEBS Lett., Vol. 376, pp. 61-64, 1995.

El uso de mutantes de almidón de semillas en diversas plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, guisante) y la producción de plantas transgénicas que sobre- o sub-expresan proteínas específicas ha indicado que muchas proteínas/enzimas son capaces de afectar a la biosíntesis de almidón en los órganos de almacenamiento. Esto puede producirse directamente, por impacto sobre las proteínas, que: (1) producen el/los substrato(s) para la síntesis de almidón, (2) inician el proceso de polimerización de la glucosa y alargan la estructura en macromoléculas o (3) alteran la estructura de los polímeros una vez se ha iniciado el proceso de alargamiento. Entre las enzimas que se sabe, o piensa, que participan en estos procesos, se incluyen, aunque sin limitación, ADP-glucosa y UDP-glucosa pirofosforilasas, almidón sintasas unidas y solubles, almidón fosforilasas, enzimas ramificantes unidas a gránulos de almidón y solubles, enzimas desramificantes, isoamilasas y enzimas desproporcionadoras. Además de un impacto directo sobre el metabolismo del almidón, la producción de almidón puede tener también un impacto negativo por disfunción o deficiencia de proteínas que son catalizadoras en el metabolismo de los azúcares o que actúan como transportadores de compuestos intermedios. Como ejemplos de las implicadas en el metabolismo de los azúcares, se incluyen, aunque sin limitación, sacarosa sintasas, sacarosa fosfato sintasa, sacarosa fosfato fosforilasa, hexokinasas, fosfoglucomutasas y fosfoglucoisomerasas. Proteínas implicadas en el transporte de asimilados, tales como la proteína brittle-1 de las membranas de los amiloplastos del endospermo del maíz (Cao, H.P., T.D. Sullivan y col., "Bt1, A Structural Gene for The Mayor 39-44 kDa Amyloplast Membrane Polypeptides", Physiol. Plant, Vol. 95(2), pp. 177-186, 1995; Shannon, J.C., F.M. Pien y col., "Nucleotides and Nucleotide Sugars in Developing Maize Endosperms - Synthesis of ADP-Glucose in Brittle-1", Plant Physiology, Vol. 110(3), pp. 835-843, 1996, ambas aquí incorporadas en su totalidad como referencia), proteínas transportadoras de sacarosa (Weig y col., "An Active Sucrose Carrier (Scr1) That Is predominantly Expressed in The Seedlings of Ricinus communis L.", Journal of Plant Physiology, Vol. 147(6), pp. 685-690 (1990) u otros homólogos del transportador de hexosas del cloroplasto (Fitzpatrick y col., "The Hexose Translocator of The Chloroplast Envelope", J. Exp. Bot., Vol. 47, pp. 79 (1996), pueden también afectar a la síntesis de almidón restringiendo la disponibilidad de substratos para el metabolismo normal del almidón y/o de los azúcares.

Una enzima que ha mostrado ser particularmente importante en la biosíntesis del almidón, así como en la síntesis de glicógeno bacteriano, es la ADP-glucosa pirofosforilasa (AGP). En bacterias, la AGP es una proteína homotetramérica, mientras que en plantas es un complejo heterotetramérico de dos diferentes subunidades proteicas. La disfunción o la ausencia de cualquiera de las subunidades reduce gravemente la síntesis de almidón. Los mutantes de almidón del maíz que afectan a las subunidades de AGP en el endospermo son brittle-2 (bt2, subunidad pequeña) y shrunken-2 (sh2, subunidad grande) (Giroux, M. y L. Hannah, "ADP-Glucose Pyrophosphorylase in Shrunken-2 and Brittle-2 Mutants of Maize", Mol. Gen. Genet., Vol. 243, pp. 400-408, 1994). La reducción de almidón acumulado coincidente con una menor actividad AGP en el embrión de guisante mutante (Hylton, C. y A.M. Smith, "The rb Mutation of Peas Causes Structural and Regulatory Changes in ADP-Glucose Pyrophosphorylase from Developing Embryos", Plant Physiol., Vol. 99, pp. 1626-1634, 1992, en la hoja de Arabidopsis (Neuhaus, H.E. y M. Stitt, "Control Analysis of Photosynthate Partitioning. Impact of Reduced Activity of ADP-Glucose Pyrophosphorylase or Plastid Phosphoglucomutase on The Fluxes to Starch and Sucrose in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh", Planta, Vol. 182, pp. 445-454, 1990) o en el tubérculo de plantas de patata antisentido (Muller-Rober, B., U. Sonnewald y col., "Inhibition of The ADP-Glucose Pyrophosphorylase in Transgenic Potatoes Leads to Sugar-Storing Tubers and Influences Tuber Formation and Expression of Tuber Storage Protein Genes", EMBO, Vol. 11(4), pp. 1229-1238, 1992) demuestra el papel dominante de AGP en el control de la deposición de almidón en una amplia variedad de tejidos y plantas.

Se han descrito numerosos genes codificantes de las subunidades pequeña y grande de la AGP de plantas (Smith-White, B.J. y J. Preiss, "Comparison of Proteins of ADP-Glucose Pyrophosphorylase from Diverse Sources", J. Mol. Evol., Vol. 34, pp. 449-464, 1992). Los correspondientes genes que se han descrito para el maíz son los genes específicos de endospermo Bt2 y Sh2 (Bae, J.M., M. Giroux y col., "Cloning and Characterization of the Brittle-2 Gene of Maize", Maydica, Vol. 35, pp. 317-322, 1990; Bhave, M.R., S. Lawrence y col., "Identification and Molecular Characterization of Shrunken-2 cDNA Clones of Maize", Plant Cell, Vol. 2, pp. 581-588, 1990) y AGP1 (Giroux, M. y B. Smith-White y col., "The Large Subunit of the Embryo Isoform of ADP Glucose Phosphorylase from Maize", Plant Physiol., Vol. 108, pp. 1333-1334, 1995). Aunque se le hace referencia como una isoforma embrionaria debido a su predominancia en el germen de la semilla, AGP1 se expresa también en el endospermo (Giroux, M. y L. Hannah, "ADP-Glucose Pyrophosphorylase in Shrunken-2 and Brittle-2 Mutants of Maize", Mol. Gen. Genet., Vol. 243, pp. 400-408, 1994). AGP1 representa la subunidad grande de la isoforma embrionaria, mientras que AGP2, hasta la fecha un gen incaracterizado, corresponde a la subunidad pequeña (Giroux y Hannah, 1994).

AGP es una enzima alostérica y, en plantas, se activa por el ácido 3-fosfoglicérico (3-PGA) y se inhibe por el fosfato inorgánico (Pi) en grados variables, dependiendo de la especie y de la fuente de órgano (Preiss, J., "Biosynthesis of Starch: ADP-Glucose Pyrophosphorylase, The Regulatory Enzyme of Starch Synthese: Structure-Function Relationships", Denpun Kagaku: Vol. 40(2), pp. 117-131, 1993). Se ha demostrado recientemente la importancia de las propiedades alostéricas de la AGP cuando plantas transgénicas que expresaban una forma bacteriana de AGP (glgC16), que se "desregula" alostéricamente en comparación con la AGP de la planta nativa, acumulaban un 35% más de almidón que los controles (Stark, D.M., K.P. Timmerman y col., "Regulation of The Amount of Starch in Plant Tissues by ADP-Glucose Pyrophosphorylase", Science, Vol. 258, pp. 287-292, 1992). Más aún, la modificación alostérica del gen Sh2 nativo del maíz puede aumentar el peso de la semilla, presumiblemente debido, al menos en parte, a un efecto sobre la deposición de almidón (Giroux, M.J., J. Shaw y col., "A Single Gene Mutation That Increases Maize Seed Weight", Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 93, pp. 5824-5829, 1996). Se describe que aparecen variantes alostéricas de AGP, que responden menos a 3-PGA y Pi, de forma natural en plantas (Kleczkowski, L.A., P. Villand y col., "Insensitivity of Barley Endosperm ADP-Glucose Pyrophosphorylase to 3-Phosphoglycerate and Orthophosphate Regulation", Plant Physiol., Vol. 101, pp. 179-186, 1993) y también pueden ser sometidas a ingeniería en plantas por manipulación génica y transformación de las plantas.

Como el germen del maíz es conocido por su capacidad de almacenamiento de aceite, la síntesis de almidón en este órgano ha sido estudiada mucho menos que el metabolismo comparable en el endospermo. Los gránulos de almidón del germen son morfológicamente distintos de los del endospermo (Adkins, G.K. y C.T. Greenwood, "The Isolation of Cereal Starches in The Laboratory", Starch, Vol. 7, pp. 213-218, 1966), pero, con toda probabilidad, las diferencias metabólicas en la biosíntesis de almidón en el endospermo y en el germen no son fundamentalmente extensas. De hecho, muchas de las actividades enzimáticas importantes en el metabolismo de azúcares y de almidón en el endospermo son también muy activas en el germen (Lee, E.Y.C., "Multiple Forms of 1,4-a-Glucan Phosphorylase in Sweet Corn", FEBS Letters, Vol. 27(2), pp. 341-345, 1972; Doehlert, D., T. Kuo y col., "Enzymes of Sucrose and Hexose Metabolism in Developing Kernels of Two Inbreds of Maize", Plant Physiol., Vol. 86, pp. 1013-1019, 1988). Más concretamente, se sabe que la actividad AGP aparece en el germen de maíz (Tsai, C. y O. Nelson, "Starch-Deficient Maize Mutant Lacking Adenosine Diphosphate Glucose Pyrophosphorylase Activity", Science, Vol. 151, pp. 341-343, 1966; Dickinson, D.B. y J. Preiss, "Presence of ADP-Glucose Pyrophosphorylase in Shrunken-2 and Brittle-2 Mutants of Maize Endosperm", Plant Physiol., Vol. 44, pp. 1058-1062, 1969), aunque sigue un perfil de desarrollo diferente a la actividad AGP en el endospermo (Prioul, J.L., E. Jeannette y col., "Expression of ADP-Glucose Pyrophosphorylase in Maize (Zea mays L.) Grain and Source Leaf During Grain Filling", Plant Physiol., Vol. 104, pp. 179-187, 1994). Se espera que ocurra una situación análoga para el almidón.

En base a lo anterior, se necesita disponer de una semilla de maíz con una mayor concentración de aceite.

Es, por lo tanto, un objeto de la presente invención proporcionar una semilla de maíz con una mayor concentración de aceite.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar una semilla de maíz con una mayor concentración de aceite en comparación con el tipo salvaje sin un aumento en el peso de la semilla o en el tamaño del endospermo.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar una semilla de maíz con una mayor concentración de aceite en comparación con el tipo salvaje.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar métodos de producción de una semilla de maíz con una mayor concentración de aceite sin reducción en el tamaño del endospermo.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar métodos de producción de una semilla de maíz con una mayor concentración de aceite sin aumento en el peso de la semilla.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar métodos de producción de una semilla de maíz con una mayor concentración de aceite sin que el genotipo resultante esté asociado con una reducida producción de almidón en el endospermo.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona métodos para alterar discriminadamente el equilibrio natural entre el almacenamiento del almidón y del aceite en las semillas de maíz. Existe una alteración en el reparto de asimilados procedentes de la biosíntesis de almidón para aumentar la biosíntesis y la acumulación de aceite en el embrión de la semilla. El resultado fundamental es un intercambio de composición entre la deposición de almidón y de aceite en el embrión. Se consigue esto sin afectar el tamaño familiar del embrión de una forma que afecta significativamente al uso comercial ordinario del material.

Por consiguiente, la invención proporciona un método de obtención de concentraciones de aceite superiores a las normales en el embrión de una semilla de una planta de maíz alterando el metabolismo del carbono en dicha semilla de maíz, consistiendo la alteración en el reparto de asimilados para inhibir la biosíntesis de almidón y aumentar la biosíntesis y la acumulación de aceite en dicho embrión sin afectar significativamente al tamaño del embrión de un modo que comprometa al valor comercial de la semilla, mediante reducción de la actividad ADP-glucosa pirofosforilasa (AGP) en el embrión, pero no en otros tejidos de dicha semilla de maíz.

La invención proporciona también una semilla de maíz que tiene una concentración superior a la normal de aceite en su embrión en virtud del metabolismo alterado del carbono en el embrión, consistiendo la alteración en repartir los asimilados para inhibir la biosíntesis de almidón y aumentar la biosíntesis de aceite en dicho embrión sin afectar al tamaño del embrión de un modo que comprometa el valor comercial de la semilla, por reducción de la actividad ADP-glucosa pirofosforilasa (AGP) en el embrión, pero no en otros tejidos de dicha semilla de maíz.

Se consigue la alteración de la composición química de la semilla de maíz, es decir, alcanzar un mayor contenido en aceite en el embrión. por inhibición de los niveles normales de la biosíntesis de almidón en el embrión. Se reduce la biosíntesis de almidón por reducción de la ADP-glucosa pirofosforilasa en el embrión, pero no en otros tejidos de la semilla de maíz. Por ejemplo, se puede reducir la biosíntesis de almidón en el embrión por un método seleccionado entre: co-supresión de un gen para la AGP, antisentido de un gen para la AGP, modificación de la actividad de la AGP, eliminación de un gen para la AGP y mutación de un gen para la AGP, que dan lugar a una expresión reducida de la actividad de la AGP.

La presente invención proporciona también semillas producidas mediante los métodos de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. I proporciona una ruta para la biosíntesis de almidón relevante para la presente invención.

Descripción detallada de la invención

Se ha descubierto inesperadamente que, cuando se altera la biosíntesis del almidón en un tejido que ordinariamente acumula predominantemente un aceite, por ejemplo el embrión de una semilla de maíz, habrá una mayor acumulación de aceite más allá de los niveles normales. Preferiblemente, esto ocurrirá sin reducción en el tamaño del órgano de almacenamiento (por ejemplo, semilla, germen, escutelo, cotiledón), es decir, el embrión en una semilla de maíz, de tal forma que se produzca un impacto significativo sobre el uso comercial ordinario del material, es decir, la semilla de maíz, según se indica en la técnica. El aumento de la acumulación de aceite por manipulación de la síntesis de almidón no ha sido descrito hasta la fecha.

Tal como se usa aquí, "almidón" significa un material que es un polímero de glucosa y normalmente consiste en amilosa, amilopectina o una mezcla de estos dos tipos poliméricos. Como compuestos químicos funcionalmente análogos, también incluidos en la definición de almidón, se incluyen fitoglicógeno (que aparece en tipos selectos de maíz) y polisacáridos hidrosolubles (polímeros de glucosa que carecen de la estructura cristalina de los gránulos de almidón).

Tal como se usa aquí, "aceite" significa un constituyente o mezcla de constituyentes que, en formas naturales, son fácilmente solubles en solventes no polares, tales como hexano o éter dietílico, y algo solubles en solventes menos polares, tales como mezclas acuosas de alcoholes. Los aceites incluyen lípidos neutros, glicolípidos y fosfolípidos comunes a la construcción de tejidos, tales como las semillas de cereales, pero especialmente de soja, girasol, algodón y canola.

Como tipos de tejidos que ordinariamente acumulan aceite prevalentemente, se incluyen las semillas de cultivos que llevan aceite, tales como el girasol, el algodón, la soja y la canola, y tejidos vegetales de otros tipos de plantas, tales como el germen de las plantas de cultivo de cereales. El germen de la semilla de los cereales realmente incluye el propio embrión y el escutelo, pero, en conjunto, es rico en aceite en comparación con otros materiales almacenados en el órgano.

La alteración de la composición química de la semilla del maíz, es decir, un mayor contenido de aceite en el embrión, es conseguida en la presente invención por inhibición de los niveles normales de la biosíntesis de almidón. Existe una serie de enzimas y/o proteínas implicadas en el metabolismo de los azúcares y del almidón que interfieren con la biosíntesis de almidón. La presente invención incorpora la interferencia con la biosíntesis de almidón de tal forma que la enzima AGP, que está implicada en ella, se hace disfuncional por ausencia, reducción en la cantidad o disminución y/o mitigación de la actividad catalítica normal. La manipulación de la AGP en el embrión de una semilla de maíz con el fin de restringir la biosíntesis de almidón conduce a aumento neto contrarrestante en la deposición de aceite en el embrión sin reducción en el tamaño del endospermo.

La presente invención afecta a semillas que contienen una concentración mayor de la normal de aceite y una concentración o biosíntesis inferior a la normal concomitante de almidón en el germen o el embrión de las semillas de cereales o portadoras de aceite, respectivamente. Se consigue el resultado alterando el metabolismo del carbono en el embrión. La aplicación de la invención se relaciona con usos de granos que se benefician de una mayor concentración de aceite en la semilla. Como ejemplos en los que se produciría una ventaja comercial con un grano de mayor contenido en aceite, se incluyen: (1) la industria de la molienda en húmedo del maíz, donde un mayor rendimiento de aceite, un coproducto de alto valor, puede impactar significativamente sobre los beneficios de los refinadores; (2) la industria de la trituración de semillas oleosas, donde una mayor concentración de aceite en la semilla (por ejemplo, soja, canola) aumentaría la producción de aceite en el proceso de extracción, y (3) la industria alimentaria, donde un mayor contenido en aceite da lugar a una mayor densidad de energía y un mayor valor del alimento del material alimenticio.

En la presente invención, el equilibrio natural entre el almacenamiento de almidón y de aceite es alterado discriminadamente en el embrión de la semilla del maíz, que normalmente tiene una composición que predomina en aceite y materiales lipídicos relacionados que comúnmente sirven como material de reserva para el crecimiento de la planta. El principio conceptual se basa en la producción de una alteración en el reparto de asimilados de la biosíntesis de almidón para tener una mayor biosíntesis y acumulación de aceite. El resultado fundamental es un intercambio de composición entre la deposición de almidón y de aceite en el órgano de la planta. El intercambio de estos materiales de reserva no afectará al tamaño familiar del embrión de un modo que tenga un impacto significativo sobre el uso comercial ordinario del material.

Una realización en la que disminuiría la biosíntesis de almidón sería mediante aplicación de técnicas de ADN recombinante a la enzima AGP y la expresión ectópica de una versión sentido o antisentido del gen de la AGP podría dar lugar a ausencia o disfunción del gen y la proteína nativos.

A diferencia de la semilla almacenadora de aceite de las dicotiledóneas, la semilla de los cereales contiene tejidos que son muy diferentes en su composición química. El endospermo es rico en almidón y el germen tiene una predominancia de aceite. Sería indeseable afectar negativamente a la biosíntesis de almidón en el endospermo y el intento de esta invención es sólo alterar la síntesis de almidón en tejidos que ya tienen un alto contenido en aceite, es decir, el embrión de la semilla de maíz. Por ello, es necesario seleccionar un promotor que sólo proporcione expresión génica en el tejido rico en aceite, es decir, el embrión de una semilla de maíz. El promotor del gen de la globulina-1 (glb1) del maíz es un ejemplo en el que el promotor puede restringir la expresión génica en la semilla de maíz al germen solo. Además, el promotor glb1 dirige la expresión del gen de la \beta-glucuronidasa más específicamente al escutelo del germen. Esto ofrece un mayor refinamiento de la aplicación deseada, en el sentido de que la composición química del tejido de almacenamiento primario del germen, el escutelo (Styer, R.C. y D.J. Cantliffe, "Dependence of Seed Vigor during Germination on Carbohydrate Source in Endosperm Mutants of Maize", Plant Physiol., Vol. 76, pp. 196-200, 1984), puede ser modificada sin cambiar significativamente la composición del propio embrión (es decir, eje).

La producción de almidón en el embrión de la semilla de maíz puede disminuir según la presente invención mediante un método seleccionado entre: co-supresión de un gen para la AGP, antisentido de un gen para la AGP, modificación de la actividad de la AGP, eliminación de un gen para la AGP y mutación de un gen para la AGP, que dan lugar a una expresión reducida de la actividad de la AGP.

Preferiblemente, el método de elección es seleccionado entre co-supresión, antisentido y mutación.

La aplicación de tecnologías del ADN recombinante y de transformación de plantas ofrece una amplia elección de mecanismos para abatir la síntesis de almidón por reducción de la actividad de la AGP en el embrión. El abatimiento es conseguido disminuyendo o aboliendo la actividad de la AGP, directa o indirectamente.

Co-supresión

El término general silenciación génica dependiente de homología abarca el fenómeno de cis-inactivación, trans-inactivación y co-supresión. Véase Finnegan y col., "Transgene Inactivation": Plants Fight Back!'', Biotech., Vol. 12, pp. 883-888 (1994), y Matzke y col., "How and why Do Plants Inactivate Homologous (Trans)genes?", Plant Physiol., Vol. 107, pp. 679-685 (1995)). Estos mecanismos describen casos de silenciación génica que implican interacciones transgén/transgén o transgén/gen endógeno que conducen a una expresión reducida de proteínas en plantas. En el presente caso, se usa la silenciación génica dependiente de homología para disminuir la síntesis de almidón a través de una expresión reducida de genes que producen proteínas que normalmente sirven como catalizadores enzimáticos o transportadores de asimilados implicadas en la biosíntesis de almidón. La aplicación de cualquiera de los mecanismos propuestos para funcionar en la silenciación génica dependiente de homología es utilizada para interferir con el gen de la biosíntesis de almidón, ADP-glucosa pirofosforilasa.

Antisentido

Se puede utilizar la incorporación de ARN antisentido en plantas para inhibir la expresión de genes endógenos y producir una mutación funcional en el genoma. El efecto es conseguido introduciendo en la(s) célula(s) ADN que codifica para ARN que es complementario a la secuencia de ARNm del gen diana. Véase, por ejemplo, Bird y col., "Manipulation of Plant Gene Expression by Antisense RNA", Biotech. and Gene. Eng. Rev., Vol. 9, pp. 207-226 (1991). Se utiliza la manipulación de la expresión génica en plantas por ARN antisentido para interferir con el gen de la biosíntesis del almidón, ADP-glucosa pirofosforilasa.

Modificación de la actividad de la AGP

Una de las formas predominantes en que se controla la actividad enzimática en células es por regulación alostérica, en la que se unen metabolitos reguladores a sitios reguladores sobre la enzima. La unión del substrato a un sitio activo puede afectar a las propiedades de otros sitios activos en la misma molécula enzimática. La regulación alostérica por pequeñas moléculas es profundamente significativa en el control de la actividad enzimática. Por ejemplo, dos enzimas alostéricas bien comprendidas son la fosfofructikinasa y la aspartato transcarbamoilasa bacterianas. Véase Creighton, T.E., "Protein Structures and Molecular Properties", Freeman & Co., pp. 444-452 (1993).

La AGP es una enzima alostérica. En plantas, se activa por el ácido 3- fosfoglicérico ("3-PGA") y se inhibe por el fosfato inorgánico (Pi) en grados variables dependiendo de la especie y de la fuente del órgano. Véase, por ejemplo, Preiss, "Biosynthesis of Starch: ADP Glucose Pyrophosphorylase, The Regulatory Enzyme of Starch Synthesis: Structure-Function Relationships", Denpun. Kagaku, Vol. 40(2), pp. 117-131 (1993).

Se ha demostrado recientemente la importancia de las propiedades alostéricas de la AGP cuando plantas transgénicas que expresan una forma bacteriana de AGP (glgC16), que se desregula alostéricamente en comparación con la AGP de plantas nativas, acumulaban un 35% más de almidón que los controles. Véase Starck y col., "Regulation of The Amount of Starch in Plant Tissues by ADP Glucose Pyrophosphorylase", Science, Vol. 258, pp. 287-292 (1992). Más aún, la modificación alostérica del gen Sh2 nativo del maíz puede aumentar el peso de la semilla, presumiblemente debido, al menos en parte, a un efecto sobre la deposición de almidón. Véase Giroux y col., "A Single Gene Mutation That Increases Maize Seed Weight", Proc. Nat'l. Acad. Sci., Vol. 93, pp. 5824-5829 (1996). Aparecen de forma natural variantes alostéricas de AGP que responden peor a 3-GPA y Pi en plantas. Véase Kleczkowski y col., "Insensitivity of Barley Endosperm ADP-Glucose Pyrophosphorylase to 3-Phosphoglycerate and Orthophosphate Regulation", Plant Physiol., Vol. 101, pp. 179-186 (1993). Estas variantes pueden ser también sometidas a ingeniería en plantas a través de manipulación génica y de transformación de plantas.

Como se ha indicado anteriormente, la reducción de la actividad de la ADP-glucosa pirofosforilasa en la célula, plastídica y/o citoplásmica (Kim y col., "Immunocytochemical Localization of ADP-Glucose Pyrophosphorylase in Developing Potato Tuber Cells", Plant Physiol., Vol. 91, pp. 217-220 (1989), y Miller y col., "Intracellular Immunolocalization of Adenosine 5'-Diphosphoglucose Pyrophosphorylase in Developing Endosperm Cells of Maize (Zea mays L.)", Planta, Vol. 197, pp. 522-527 (1995)), reducirá también la síntesis de almidón. Se puede conseguir esto por ausencia o reducción de la función de cualquiera de las dos subunidades que normalmente interaccionan para formar la holoenzima activa. Sin embargo, esta enzima puede también ser explotada gracias a sus propiedades alostéricas. La actividad de la ADP-glucosa pirofosforilasa es inhibida por Pi. Si la(s) subunidad(es) de la enzima se vuelven más sensibles a Pi por ingeniería molecular y proteica, entonces la expresión de este gen produciría una proteína que compite con la subunidad nativa para formar una holoenzima. La actividad de la ADP-glucosa pirofosforilasa podría reducirse proporcionalmente a la fracción de holoenzima que contiene la subunidad que se vuelve más sensible a Pi.

Eliminación de la acción del gen de la AGP y deposición de almidón por mutación

Se puede conseguir la restricción de la biosíntesis de almidón en un órgano portador de aceite de muchas formas. Una puede ser seleccionar un mutante que produzca menos almidón en el tejido de interés, suponiendo que el tejido esté normalmente enriquecido de aceite. Dichos mutantes pueden ser generados en la semilla de muchas formas conocidas para el experto en la técnica, tal como mutagénesis química, mutagénesis inducida por rayos X, mutagénesis inducida por transposones o mutagénesis por medios naturales. Véase Denyer y col., "The Isolation and Characterization of Novel Low-Amylose Mutants of Pisum sativum L.", Plant, Cell and Environment, Vol. 18, pp. 1019-1026 (1995). Se pueden identificar los mutantes que producen menos almidón por diferentes métodos conocidos en la técnica. La concentración de aceite en dichos mutantes es mayor que la encontrada en un material vegetal comparable de un estado no mutagénico.

Describiendo ahora la invención más en general, será más fácilmente comprendida haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen únicamente con fines de ilustración y no pretenden limitar la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Clonación del gen de la ADP-glucosa pirofosforilasa AGP1 y construcción de vectores de expresión

Se obtiene un clon de ADNc de longitud completa correspondiente a AGP1, la subunidad grande de la isoforma embrionaria de la ADP-glucosa pirofosforilasa (Giroux, M., B. Smith-White y col., "The Large Subunit of the Embryo Isoform of ADP Glucose Phosphorylase from Maize", Plant Physiol., Vol. 108, pp. 1333-1334, 1995, aquí incorporado como referencia en su totalidad), usando la reacción en cadena de polimerasa ("PCR"). Se prepara una plantilla generando ADNc de primera hebra a partir del ARN total aislado de almendras de maíz de 16 días de edad. Se diseñan cebadores en base a la secuencia publicada de AGP1 y se designan como N12333 (5'-ATCCATCCGTCCCTAGGTGTGCTTCA-3') y N12339 (5'-CGCGCCTCAAACTAAGTCTCAACTCTC-3'). Estos cebadores son usados en una reacción de PCR para amplificar el ADNc de AGP1 por métodos convencionales. Se purifica el producto resultante de la PCR y se subclona en el vector pCRII (Invitrogen) y se secuencia en ambas hebras para confirmar su identidad. Este clon es designado como p9734. Se construye un cassette de expresión específico de embrión digiriendo p9734 con EcoRI, tratando con enzima Klenow para generar extremos romos y purificando luego en gel el ADNc de AGP1 de aproximadamente 1,6 kb resultante. Se liga éste entre las secuencias promotora y finalizadora de la globulina-1 (glb1) del vector p3303. Se hace un mapeo amplio con enzimas de restricción sobre el clon resultante, p9733, para asegurarse de que el ADNc de AGP1 está en una orientación antisentido en relación a las secuencias promotora y finalizadora de glb1. En la preparación para la transformación del maíz, se une p9733 en cis a dos cassettes de expresión de marcador seleccionable separados por posteriores ligaciones con p3528 (2X CAMV::BAR::PinII) y p8092 (Ubi::Pat::35S) para generar los plásmidos p10000 y p9763, respectivamente. Estos plásmidos son usados en el bombardeo con partículas de embriones de maíz inmaduros.

Ejemplo 2 Preparación de plantas transgénicas

El método general de transformación genética usado para producir plantas de maíz transgénicas está mediado por bombardeo de embriones inmaduros que responden embriogénicamente con partículas de tungsteno asociadas a plásmidos de ADN, cuyos plásmidos consisten en un gen marcador seleccionable y uno no seleccionable.

(1) Preparación del tejido

El blanco para la transformación mediada por bombardeo con partículas son embriones inmaduros del "Tipo Alto II". Este genotipo es la F_{1} de dos líneas genéticas puras, el parental A y el parental B, derivadas de A188 X B73. Ambos parentales son seleccionados en cuanto a la alta competencia de la embriogénesis somática. Véase Armstrong y col., "Development and Availability of Germplasm with High Type II Culture Formation Response", Maize Genetics Cooperation Newsletter, Vol. 65, pp. 92 (1991).

Se autofecundan o se hacen cruces consanguíneos de espigas de plantas F_{1} y se disecan los embriones asépticamente de las cariópsides en desarrollo cuando el escutelo se vuelve opaco por vez primera. El estadío apropiado aparece aproximadamente 9-13 días después de la polinización y, más en general, aproximadamente 10 días después de la polinización, y depende de las condiciones de crecimiento. Los embriones tienen aproximadamente de 0,75 a 1,5 mm de longitud. Se esterilizan las espigas en superficie con Clorox al 20-50% durante 30 minutos, seguido de 3 lavados con agua destilada estéril.

Se cultivan los embriones inmaduros, con el escutelo orientado hacia arriba, en medio de inducción embriogénica constituido por sales basales N6 (Chu y col., "Establishment of An Efficient Medium for Anther Culture of Rice through Comparative Experiments on The Nitrogen Sources", Scientia Sinica (Peking), Vol. 18, pp. 659-668 (1975), aquí incorporada en su totalidad como referencia), vitaminas de Eriksson (véase Ericksson, T., "Studies on The Growth Requirements and Growth Measurements of Haplopappus gracilis", Physiol. Plant, Vol. 18, pp. 976-993 (1965), 0,5 mg/l de tiamina HCl, 30 g/l de sacarosa, 2,88 g/l de L-prolina, 1 mg/l de ácido 2,4-di-clorofenoxiacético, 2 g/l de Gelrite y 8,5 mg/l de AgNO_{3}. Se esteriliza el medio autoclavando a 121ºC durante 15 minutos y se dispensa en placas de Petri de 100 x 25 mm. Se esteriliza por filtración el AgNO_{3} y se añade al medio después del autoclavado. Se cultivan los tejidos en obscuridad completa a 28ºC. Después de aproximadamente 3 a 7 días, más habitualmente aproximadamente 4 días, el escutelo del embrión se ha hinchado aproximadamente al doble de su tamaño original y las protuberancias en la superficie coleorrizal del escutelo indican la incepción de tejido embriogénico. Hasta un 100% de los embriones exhiben esta respuesta, pero, más comúnmente, la frecuencia de respuesta embriogénica es de aproximadamente el 80%.

Cuando se observa la respuesta embriogénica, se transfieren los embriones a un medio consistente en medio de inducción modificado para contener 120 g/l de sacarosa. Se orientan los embriones con el polo coleorrizal, el tejido que responde embriogénicamente, hacia arriba del medio de cultivo. Se localizan diez embriones por placa de Petri en el centro de una placa de Petri en un área de aproximadamente 2 cm de diámetro. Se mantienen los embriones en este medio durante 3-16 horas, preferiblemente 4 horas, en completa obscuridad a 28ºC justo antes del bombardeo con partículas asociadas a ADN plasmídicos que contienen los genes marcadores seleccionables y no seleccio-
nables.

Para efectuar el bombardeo de partículas de los embriones, se aceleran los aglomerados de partículas-ADN usando un dispositivo de aceleración de partículas PDS-1000 de DuPont. Se sonica brevemente la aglomeración de partículas-ADN y se depositan 10 \mul en macrotransportadores y se deja que se evapore el etanol. Se acelera el macrotransportador sobre una pantalla de detención de acero inoxidable por la ruptura de un diafragma polimérico (disco de ruptura). Se efectúa la ruptura mediante helio presurizado. Dependiendo de la presión de ruptura del disco de ruptura, se puede variar la velocidad de la aceleración de las partículas-ADN. Se usan comúnmente presiones del disco de ruptura de 200 a 1.800 psi, siendo más preferidas de 650 a 1.100 psi y siendo más altamente preferidas de aproximadamente 900 psi. Las presiones de ruptura del disco de ruptura son aditivas, por lo que se pueden usar múltiples discos para efectuar un rango de presiones de ruptura.

Preferiblemente, la estantería que contiene la placa con los embriones está 5,1 cm por debajo del fondo de la plataforma del macrotransportador (estantería #3), pero puede localizarse a otras distancias. Para efectuar el bombardeo con partículas de embriones inmaduros cultivados, se instalan en el dispositivo un disco de ruptura y un macrotransportador con aglomerados secos de partículas-ADN. Se ajusta la presión de He administrada al dispositivo a 200 psi por encima de la presión de ruptura del disco de ruptura. Se pone una placa de Petri con los embriones objeto en la cámara de vacío y se localiza en el trayecto proyectado de partículas aceleradas. Se crea un vacío en la cámara, preferiblemente de aproximadamente 28 pulgadas de Hg. Tras la operación del dispositivo, se relaja el vacío y se retira la placa de Petri.

Los embriones bombardeados permanecen sobre el medio osmóticamente ajustado durante el bombardeo y preferiblemente durante dos días a continuación, aunque los embriones pueden permanecer en este medio durante 1 a 4 días. Se transfieren los embriones a medio de selección consistente en sales basales N6, vitaminas de Eriksson, 0,5 mg/l de tiamina HCl, 30 g/l de sacarosa, 1 mg/l de ácido 2,4-diclorofenoxiacético, 2 g/l de Gelrite, 0,85 mg/l de AgNO_{3} y 3 mg/l de bialafós. Se añade el bialafós esterilizado por filtración. Se subcultivan los embriones en medio de selección fresco a intervalos de 10 a 14 días. Después de aproximadamente 7 semanas, se ve que prolifera tejido embriogénico, putativamente transformado para genes marcadores tanto seleccionables como no seleccionables, a partir de aproximadamente un 7% de los embriones bombardeados. Se rescata el tejido transgénico putativo y se considera que el tejido derivado de embriones individuales es un acontecimiento y se propaga independientemente en medio de selección. Se consiguen dos ciclos de propagación clonal por selección visual de los fragmentos contiguos más pequeños de tejido embriogénico organizado.

Para la regeneración de plantas transgénicas, se subcultiva el tejido embriogénico en medio consistente en sales y vitaminas MS (Murashige, T. y F. Skoog, "A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures", Physiologia Plantarum, Vol. 15, pp. 473-497, 1962), 100 mg/l de mioinositol, 60 g/l de sacarosa, 3 g/l de Gelrite, 0,5 mg/l de zeatina, 1 mg/l de ácido indol-3-acético, 26,4 ng/l de ácido cis-trans-abscísico y 3 mg/l de bialafós en placas de Petri de 100 x 25 mm y se incuba en la obscuridad a 28ºC hasta que se puede visualizar el desarrollo de embriones somáticos maduros bien formados. Esto lleva aproximadamente 14 días. Los embriones somáticos bien formados son opacos y de color crema y están constituidos por un escutelo y un coleoptilo identificables. Se subcultivan los embriones individualmente en medio de germinación consistente en sales y vitaminas MS, 100 mg/l de mioinositol, 40 g/l de sacarosa y 1,5 g/l de Gelrite en placas de Petri de 100 x 25 mm y se incuban bajo un fotoperíodo de 16 h de luz:8 h de obscuridad y 40 \muEinsteinm^{-2}seg^{-1} con tubos fluorescentes blancos fríos. Después de aproximadamente 7 días, los embriones somáticos han germinado y producido un brote y una raíz bien definidos. Se subcultivan las plantas individuales en medio de germinación en tubos de vidrio de 125 x 25 mm para permitir un mayor desarrollo de la planta. Se mantienen las plantas bajo un fotoperíodo de 16 h de luz:8 h de obscuridad y 40 \muEinsteinm^{-2}seg^{-1} con tubos fluorescentes blancos fríos. Después de aproximadamente 7 días, las plantas están bien establecidas y se transplantan a suelo hortícola, endurecido, y se plantan en mezcla de suelo de invernadero comercial y se cultivan hasta la madurez sexual en un invernadero. Se usa una línea endogámica de élite como macho para polinizar las plantas transgénicas regeneradas.

Preparación de partículas

Se añaden 15 mg de partículas de tungsteno (General Electric), de 0,5 a 1,8 \mum, preferiblemente de 1 a 1,8 \mum y más preferiblemente de 1 \mum, a 2 ml de ácido nítrico concentrado. Se sonica esta suspensión a 0ºC durante 20 minutos (Sonicador Branson Modelo 450, 40% de rendimiento, ciclo de servicio constante). Las partículas de tungsteno forman una pella por centrifugación a 10.000 rpm (Biofuge) durante 1 minuto y se retira el sobrenadante. Se añaden 2 ml de agua destilada estéril a la pella y se sonica brevemente para resuspender las partículas. Se forma una pella con la suspensión, se añade 1 ml de etanol absoluto a la pella y se sonica brevemente para resuspender las partículas. Se lavan, se forma una pella y se resuspenden las partículas otras 2 veces más con agua destilada estéril y se resuspenden finalmente las partículas en 2 ml de agua destilada estéril. Se subdividen las partículas en alícuotas de 250 \mul y se guardan congeladas.

Preparación de asociación de partículas-ADN plasmídico

Se sonica brevemente el stock de partículas de tungsteno en un sonicador de baño de agua (Sonicador Branson Modelo 450, 20% de rendimiento, ciclo de servicio constante) y se transfieren 50 \mul a un tubo de microcentrífuga. Se añade ADN plasmídico a las partículas hasta una cantidad final de ADN de 0,1 a 10 \mug en 10 \mul de volumen total y se sonica brevemente. Preferiblemente, se usa un 1 \mug de ADN total. Específicamente, se añaden 10 \mul de P9764 (ubi_{p}::ubiint::MO-PAT::CaMV35_{St} + glb1_{p}:anti-AGP1::glb1_{I}) ó 10 \mul de P9763 (CaMV35_{St}::MO-PAT::ubiint::ubi_{p} + glb1_{p}:anti-AGP1::glb1_{t}) a 0,1 \mug/\mul en tampón TE a la suspensión de partículas. Se añaden 50 \mul de CaCl_{2} acuoso 2,5 M estéril y se sonica la mezcla brevemente y se agita vorticialmente. Se añaden 20 \mul de espermidina 0,1 M acuosa estéril y se sonica la mezcla brevemente y se agita vorticialmente. Se incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos con sonicación breve intermitente. Se centrifuga la suspensión de partículas y se retira el sobrenadante. Se añaden 250 \mul de etanol absoluto a la pella y se sonica brevemente. Se forma una pella con la suspensión, se retira el sobrenadante y se añaden 60 \mul de etanol absoluto. Se sonica brevemente la suspensión antes de cargar la aglomeración de particulas-ADN en macrotransportadores.

Ejemplo 3 Análisis de semillas de plantas de maíz transgénicas

Se procesa una muestra de tejido de cada acontecimiento para recuperar ADN. Se sonda el ADN con secuencias cebadoras diseñadas para ampliar secuencias de ADN que se solapan con el promotor glb1 y la porción AGP1 del plásmido y/o con el finalizador glb1 y la porción AGP1 del plásmido. Se avanza el tejido embriogénico con secuencia amplificable a la regeneración de la planta.

Se recogen las semillas de espigas maduras de plantas transgénicas que han mostrado ser positivas a la PCR y se secan hasta obtener una concentración de humedad similar de aproximadamente el 12%. Se mide la concentración de almidón, proteína y aceite en el grano entero por transmitancia en el infrarrojo próximo para determinar si la calidad composicional del grano entero ha resultado afectada por la inhibición antisentido de AGP1 en el germen.

Se realiza una determinación más crítica de cómo la expresión antisentido de AGP1 en el germen impacta sobre el metabolismo y la composición química de la semilla por estudios que implican a gérmenes aislados. Se recoge la semilla aproximadamente a los 25 días después de la polinización (DDP) y se aísla el germen por disección. Se mide la actividad de la ADP-glucosa pirofosforilasa (ATP:D-Glc-1-fosfato adeniltransferasa, EC 2.7.7.27) en embriones cortados frescos aislados por extracción (4ºC, Homogeneizador Virtishear, 25.000 rpm, 20 segundos) en tampón [1:10 p/v; Hepes-NaOH 50 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 5 mM, DTT 1 mM, 1 mg/ml de BSA]. Se centrifuga el homogenado (30.000 x g, 15 minutos, 4ºC) y se estudia el sobrenadante en cuanto a su actividad según se describe en Singletary y col., "Nitrogen-Induced Changes in The Growth and Metabolism of Developing Maize Kernels Grown in vitro", Plant Physiol., Vol. 92, pp. 160-167 (1980). Se lleva también el sobrenadante a geles de SDS-PAGE al 4-20% y se deposita sobre nitrocelulosa. Se realiza un ensayo Western para la detección de proteína AGP1 usando un anticuerpo producido contra una porción de la proteína AGP1. Se siguen los métodos para la deposición de manchas y el desarrollo Western según las recomendaciones de Bio-Rad (Hercules, CA).

Se aíslan los gérmenes de almendras maduras para la determinación de las concentraciones de almidón y aceite de la parte de la semilla. Se empapan semillas secas individuales durante la noche a 4ºC en 1 ml de solución que contiene acetato 20 mM (pH 6,5) y cloruro mercúrico 10 mM (Adkins, G.K. y C.T. Greenwood, "The Isolation of Cereal Starches in The Laboratory", Starch, Vol. 7, pp. 213-218, 1966). Se diseca el germen intacto de la semilla, se seca por liofilización y se registra su peso seco. Se tritura el germen individual durante 10 segundos en una mezcladora de amalgama Silamet y se transfiere con lavado mediante hexano a un tubo de microcentrífuga. Se extrae el tejido agitando con 1 ml de hexano 3 x 60 minutos y se centrifuga después de cada período de extracción. Se recoge el sobrenadante de las extracciones y se pone en una bandeja de aluminio pre-pesada. Después de la evaporación del hexano de las bandejas de pesada en una campana de humos, se eliminan las trazas finales de solvente en un horno de aire forzado a 105ºC durante 15 minutos. Se vuelven a pesar las bandejas de pesada enfriadas para determinar el peso total de aceite extraído del germen. Se lava dos veces la harina que queda tras la extracción del aceite con agua y se centrifuga (10 minutos, 1.000 x g) y se analiza en cuanto al almidón por un procedimiento modificado para la medición de almidón total (McClary, B.V., V. Solah y col., "Quantitative Measurement of Total Starch in Cereal Flours and Products", Journal of Cereal Science, Vol. 20, pp. 51-58, 1994). Se eliminan los azúcares libres por extracción con etanol al 80% y se disuelve el almidón en sulfóxido de dimetilo al 90%. Se usan \alpha-amilosa termoestable y amiloglucosidasa de alta pureza (muy baja en actividades \beta-glucanasa) para degradar el almidón a carbohidrato monomérico. La glucosa resultante será cuantificada según Jones, M.G.K., W.H. Outlaw y col., "Enzymic Assay of 10^{-7} to ^{-14} Moles of Sucrose in Plant Tissues", Plant Physiol., Vol. 60, pp. 379-383, 1977, con modificación a un formato de microplacas.

Claims (6)

1. Un método de obtención de concentraciones superiores a las normales de aceite en el embrión de una semilla de una planta de maíz alterando el metabolismo del carbono en dicha semilla de maíz, cuya alteración consiste en el reparto de asimilados para inhibir la biosíntesis de almidón y aumentar la biosíntesis y la acumulación de aceite en dicho embrión sin afectar significativamente al tamaño del embrión de un modo que comprometa el valor comercial de la semilla, mediante reducción de la actividad de la ADP-glucosa pirofosforilasa (AGP) en el embrión, pero no en otros tejidos de dicha semilla de maíz.

2. Un método según la reivindicación 1, donde se reduce la biosíntesis de almidón en el embrión por un método seleccionado entre: co-supresión de un gen para la AGP, antisentido de un gen para la AGP, modificación de la actividad de la AGP, eliminación de un gen para la AGP y mutación de un gen para la AGP, que dan lugar a una expresión reducida de la actividad de la AGP.

3. Un método según la reivindicación 2, donde el método seleccionado para reducir la biosíntesis de almidón es el antisentido.

4. Una semilla de maíz que tiene concentraciones superiores a las normales de aceite en su embrión en virtud del metabolismo alterado del carbono en el embrión, cuya alteración consiste en el reparto de asimilados para inhibir la biosíntesis de almidón y aumentar la biosíntesis de aceite en dicho embrión sin afectar al tamaño del embrión de un modo que comprometa el valor comercial de la semilla, por reducción de la actividad de la ADP-glucosa pirofosforilasa (AGP) en el embrión, pero no en otros tejidos de la semilla del maíz.

5. Una semilla según la reivindicación 4, donde se reduce la biosíntesis de almidón en el embrión un método seleccionado entre: co-supresión de un gen para la AGP, antisentido de un gen para la AGP, modificación de la actividad de la AGP, eliminación de un gen para la AGP y mutación de un gen para la AGP, que dan lugar a una expresión reducida de la actividad de la AGP.

6. Una semilla según la reivindicación 5, donde se reduce la biosíntesis de almidón por antisentido.