ES2243697T3

ES2243697T3 - Combinacion de probioticos.

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Publication number: ES2243697T3
Application number: ES02710896T
Authority: ES
Inventors: Annika Mayra-Makinen; Tarja Suomalainen; Outi Vaarala
Original assignee: Valio Oy
Current assignee: Valio Oy
Priority date: 2001-01-25
Filing date: 2002-01-17
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2022-01-17
Also published as: DE60204662T2; WO2002060276A1; JP2004524836A; BR0206689A; FI109602B; HU225790B1; NZ527172A; WO2002060276A9; NO20033283L; CZ301673B6; PL204245B1; US8309073B2; PT1359816E; CN100400645C; NO20033283D0; RU2003125858A; ATE297664T1; KR20040012717A; DE60204662D1; CA2434337A1

Abstract

Es un objeto de la presente invención presentar un nuevo producto que contiene probióticos, cuyo efecto probiótico ha quedado claramente demostrado, que es agradable de usar y sano para el consumidor. Estos objetos fueron conseguidos con una nueva combinación de la invención, que consiste en un número plural de probióticos. La presente invención se basa, por lo tanto, en una nueva combinación consistente en (2) cepas de lactobacillus, una bacteria ácido-propiónica y una bifidobacteria. Además, la combinación contiene preferiblemente un prebiótico que soporta el crecimiento de los microbios antes mencionados. Según la invención, se usan principalmente dos cepas de lactobacilos, es decir, Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103) y Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061). La bacteria ácido-propiónica es Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS (DSM 7067). La bifidobacteria puede ser cualquier bifidobacteria que tenga un efecto probiótico; típicamente, se usan cepas pertenecientes alas especies Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum y Bifidobacterium adolescentis.

Description

Combinación de probióticos.

Campo de la invención

La invención se relaciona con una combinación de probióticos, cuya combinación consiste en lactobacilli, bacterias ácido-propiónicas y bifidobacterias. Los probióticos son preferiblemente combinados con un prebiótico adecuado para producir un sinbiótico. La combinación de la invención puede ser consumida como tal o puede combinarse con un alimento adecuado, tal como un producto lácteo o una bebida, y es terapéuticamente útil, por ejemplo, para estimular el sistema nervioso y para mejorar la salud en general.

Antecedentes de la invención

Los probióticos son microbios vivos que, cuando se administran al hombre o a los animales, promueven el bienestar del hospedador mejorando el equilibrio microbiano intestinal (Fuller, R., Probiotics in man and animals, 1989, J. Appl. Microbiol. 66: 365-378). Los probióticos mejor documentados incluyen L. Rhamnosus LGG, L. Johnsonii LAI, L. Casei Shirota y Bifidobacterium lactis Bbl2. Además, se ha descrito una serie de otros probióticos en la literatura de la técnica (véase, por ejemplo, M.E. Sanders y J.H. in't Veld 1999, Antonie van Leeuwenhoek 76: 293-315, Kluwer Academic Publishers). Los efectos promotores de la salud de los probióticos incluyen el equilibrio y el mantenimiento de la flora intestinal, la estimulación del sistema inmune y la actividad anticarcinogénica. Los efectos útiles de los probióticos en el intestino humano se basan en varios factores causados por las células bacterianas vivas, sus estructuras celulares y sus productos metabólicos. Los probióticos son normalmente administrados en nutrientes o como cápsulas.

Se puede hacer referencia a una bacteria como probiótico si cumple esencialmente los siguientes requerimientos (Lee, Y-K. y Salminen, S., 1995, The coming age of probiotics. Trend Food Sci. Technol., 6: 241-245): permanece viable en las condiciones exigentes que prevalecen en el tracto digestivo (bajo pH gástrico, ácidos en el sistema digestivo, etc.), se une a las paredes del intestino, se metaboliza en el intestino, es tecnológicamente aplicable (soporta el procesado), exhibe efectos para la salud clínicamente estudiados y descritos y es seguro de consumir.

Los prebióticos son ingredientes alimenticios no digestibles que promueven la salud de los humanos estimulando selectivamente el crecimiento y la actividad de una o más bacterias probióticas en el colon (Gibson, G.R. y Roberfroid, M.B., 1995. Dietary modulation of the human colonic microbiota - introducing a concept of prebiotics. J. Nutr. 125: 1401-1412). Un prebiótico es normalmente un carbohidrato (oligo- o polisacárido) no digestible o un alcohol azucarado que no se degrada ni absorbe en el tracto digestivo superior. Como prebióticos conocidos usados en productos comerciales, se incluyen la inulina (fructooligosacárido o FOS) y los transgalactooligosacáridos (GOS o TOS).

Se define un sinbiótico como una combinación de un prebiótico y un probiótico, promoviendo el prebiótico la viabilidad del microbio añadido y su unión al intestino, promoviendo así la salud (Gibson y Roberfroid, 1995, antes citado). Cuando los carbohidratos no digestibles que han pasado a través del intestino delgado fermentan en el colon, se forman ácidos grasos de cadena corta, otros ácidos orgánicos, alcoholes, hidrógeno y dióxido de carbono, por ejemplo (Gibson y Roberfroid, 1995, antes citado). Los ácidos grasos primarios producidos en la fermentación son ácido acético, ácido butírico y ácido propiónico (Cummings, J.H., Short-chain fatty acids, en: Human Colonic Bacteria: Role in Nutrition, Physiology and Pathology, G.R. Gibson y G.T. Macfarlane (eds.), pp. 101-130, CRC Press, Boca Ratón, 1995). Sería generalmente ventajoso un aumento en el número de ácidos grasos de cadena corta. Los carbohidratos no digestibles son el principal substrato para microbios colónicos, aunque también pueden incluir compuestos cuya fermentación intestinal sea desventajosa (Gibson y Roberfroid, 1995, antes citado).

El tracto digestivo humano se acomoda a un número plural de bacterias que viven en simbiosis con el hospedador. Existen grandes diferencias en el contenido microbiano entre las diferentes partes del tracto, apareciendo aproximadamente un 95% de todas las bacterias intestinales en el colon, que es la parte más importante del intestino. Se ha calculado que más de 400 especies bacterianas proliferan en el colon. Además de éstas, el intestino contiene microbios conocidos como microbios transitorios (G.R. Gibson y M.B. Roberfroid (eds.), Colonic Microbiota; Nutrition and Health, Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, 1999). Las especies dominantes son las siguientes: Bacteroides, Bifidobacterium, Coprococcus, Peptostretococcus, Eubacterium y Ruminococcus. El número de especies de Lactobacillus, Streptococcus, Fusobacterium, Veillonella, Propionibacterium y Enterobacteriaceae es ligeramente menor. Algunas de las especies representan microbios útiles, mientras que otras pueden ser incluso perjudiciales. El contenido microbiano medio en las heces es de 10^{12} cfu/g (por materia seca). Las bacterias degradan y fermentan aquellos componentes del alimento en el colon que no se absorben en el intestino delgado, absorbiéndose los productos finales de la fermentación en el intestino para su uso por parte del organismo. Además de la nutrición, el equilibrio microbiano del colon tiene una significación fundamental para el estado de salud de un hombre (Tannock, G.W., 1998, Studies of the intestinal microflora: A prerequisite for the development of probiotics, Int. Dairy J., 8: 527-533). Los cambios en la composición de la flora intestinal o una reducción repentina en la cantidad de ésta (debido a diarrea grave, tratamiento con antibióticos, etc.) aumentan la infectividad de especies potencialmente patógenas, lo que puede tener graves consecuencias (aparición de alergias, enfermedades intestinales, cáncer).

Se supone que las enzimas \beta-glucuronidasa producidas por las bacterias intestinales contribuyen a la formación de compuestos carcinogénicos, por ejemplo. Los esteroides y otros compuestos carcinogénicos se metabolizan en el hígado y se conjugan después con el ácido glucurónico. La bilis conduce el compuesto de glucurona conjugado al intestino delgado y allí el compuesto pasa al colon, donde las enzimas glucuronidasa pueden hidrolizar el compuesto, liberando así compuestos tóxicos en el colon (Rowland, I.R., 1995, Toxicology of the colon: role of the intestinal microflora, en: Human Colonic Bacteria, Role in Nutrition, physiology and pathology, Editores: Gibson, G.R. y Macfarlane, G.T., pp. 155-174, Boca Ratón: CRC Press). Se supone que especies de Eubacterium, Bacteroides y Clostridium liberan cantidades mayores de estas enzimas perjudiciales al intestino que los representantes de especies de Bifidobacterium y Lactobacillus. Esto proporcionaría, por lo tanto, una razón por la cual sería ventajoso que la flora intestinal estuviera compuesta por bifidobacterias y lactobacilos.

Además, los glicósidos que se originan de vegetales y del té, por ejemplo, no se absorben en el intestino delgado y pasan al colon, donde pueden hidrolizarse por la acción de las \beta-glucosidasas para formar compuestos de aglicona tóxicos o mutagénicos (Goldin, B.R., 1990, Intestinal Microflora: metabolism of drugs and carcinogens, Annals of Medicine 22: 43-48).

Más aún, la flora intestinal produce enzima ureasa, que degrada la urea a amoníaco. Altas cantidades de amoníaco pueden resultar tóxicas para las células epiteliales del intestino (Mobley, H.L.T. y Hausinger, R.P.,1989, Microbial ureases: significance, regulation and molecular characterization, Microbiological Reviews 53: 85-108).

La flora intestinal humana se forma durante los primeros años de vida y no se producen cambios importantes en su composición con posterioridad. Sólo pueden tener lugar cambios menores dentro de las especies (en bifidobacterias, por ejemplo).

Junto con la mayor comprensión de la importancia de la flora intestinal, la investigación ha estado así activamente enfocada sobre el descubrimiento de los factores que pueden utilizarse para influir en la composición de la flora y su operación (viabilidad), de tal forma que se reforzarían las especies bacterianas beneficiosas y se reducirían las perjudiciales. Se supone que la operación de microbios puede estar influida por prebióticos que promueven las bacterias beneficiosas. Se ha llevado a cabo una amplia investigación en oligosacáridos (GOS) que son di-, tri-, tetra-, penta- y hexasacáridos y que contienen primariamente unidades de galactosa. Se preparan enzimáticamente a partir de lactosa y el contenido del producto final depende de la enzima usada (Matsumoto, K. y col., 1993, Galactooligosaccharides, en: Oligosaccharides. Production, properties and applications, Ed. Nakakuki, T., Japanese Technology Reviews, Vol. 3, Nº 2, pp. 90-116, Gordon and Breach Science Publishers, Suiza, Australia). Los GOS han demostrado con anterioridad exhibir, por ejemplo, propiedades bifidogénicas, es decir, aquéllas que promueven el crecimiento de bifidobacterias (Ito, M. y col., 1990, Effect of administration of galactooligosaccharides on the human faecal microflora, stool weight and abdominal sensation, Microb. Ecol. Health Dis. 3: 285-292).

Descripción de la técnica anterior

Se han descrito abundantemente en la literatura de la técnica productos que contienen tanto una cepa probiótica individual como combinaciones de un número plural de diferentes probióticos. También se han descrito sinbióticos en la literatura de la técnica.

La Publicación EP 904.784, N.V. Nutricia, por ejemplo, describe un producto probiótico que contiene Bifidobacterium, Enterococcus faecium y Lactobacillus. Además, el producto puede contener prebióticos, tales como polisacáridos o almidón no degradable, e inmunoglobulinas, vitaminas, etc. Según la publicación, el producto tiene un efecto promotor de la salud, en el sentido de que estimula el sistema inmune, por ejemplo. El efecto no ha sido mostrado, sin embargo, en pruebas clínicas, ni se ha estudiado ninguna otra actividad biológica.

WO 00/33854, N.V. Nutricia, describe un producto consistente en un probiótico y oligosacáridos. Los probióticos a los que se hace referencia en particular, son Lactobacillus y Bifidobacterium, aunque también se mencionan Pediococcus, Propionibacterium, Leuconostoc y Saccharomyces. Los prebióticos implicados incluyen transgalactooligosacáridos (TOS) y fructooligosacáridos (FOS). Según la publicación, una combinación particularmente ventajosa consiste en Lactobacillus rhamnosus y un transgalactooligosacárido o un producto de hidrólisis de galactano de patata, estando también ilustrada esta combinación y su preparación en los ejemplos. Según la publicación, el producto tiene efectos promotores de la salud y es particularmente útil en el tratamiento de trastornos intestinales. Sin embargo, su actividad no ha sido demostrada en modo alguno.

WO 97/34615, Universidad de New South Wales, describe una composición probiótica que contiene, además de uno o más probióticos, almidón resistente (no degradable) y oligosacárido, obteniéndose un efecto sinérgico entre los tres componentes. Los probióticos mencionados son Saccharomyces, Bifidobacterium, Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Propionibacterium, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Staphylococcus, Peptostreptococcus y Lactobacillus y los oligosacáridos incluyen, entre muchos otros, fructo- y galactooligosacáridos. Los ejemplos muestran el efecto sinérgico de las bifidobacterias, del almidón de maíz y de los fructooligosacáridos sobre la cantidad de bifidobacterias. No se ha descrito, sin embargo, ningún efecto terapéutico.

EE.UU. 5.895.648, Sitia-Yomo S.p.A., describe una composición probiótica que contiene, en forma liofilizada, bacterias vivas, al menos dos especies de bifidobacterias y al menos dos especies de lactobacilos o estreptococos combinados con uno o más oligosacáridos. La composición contiene en total de 4 a 20 partes en peso de probióticos y de 5 a 22 partes en peso de oligosacáridos, de los cuales, por ejemplo, se mencionan los galacto- y fructooligosacáridos, la inulina en particular. Los probióticos mencionados incluyen Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Streptococcus thermophilus y Streptococcus faecium. Según la publicación, se puede añadir una mezcla que contenga probióticos y prebióticos a postres a base de leche, leches o zumos para equilibrar el funcionamiento del intestino. No se ha descrito, sin embargo, ninguna actividad biológica de la combinación.

La publicación Milchwissenschaft (1988), Vol. 53, Nº 11, pp. 603-605, describe leche PAB, que contiene tres cepas bacterianas: Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii MTCC 1371, Lactobacillus acidophilus R. y Bifidobacterium bifidum NDRI. No se han añadido prebióticos al producto. Según la publicación, la leche PAB es adecuada para bebés y niños y también para quienes padecen de intolerancia a la lactosa.

WO 99/10476 describe el efecto simulador de cepas bacterianas específicas, es decir, de Lactobacillus rhamnosus HN001 (NM97/09514) y HN067 (NM97/01925) y Lactobacillus acidophilus HN017 (NM97/09515) y Bifidobacterium lactis HN019 (NM97/09513), sobre el sistema inmune, medido como un aumento en la fagocitosis. Las cepas pueden ser usadas individualmente o pueden ser añadidas a productos lácteos o preparaciones farmacéuticas.

EE.UU. 5.902.578, Abbott Laboratories, se relaciona con un método para evitar y tratar la diarrea con una mezcla de Lactobacillus reuterii, Lactobacillus acidophilus y Bifidobacterium infantis, siendo preparada la mezcla en polvo, líquido o píldoras.

También se han descrito efectos biológicos y terapéuticos de probióticos y sinbióticos del tipo anterior en la técnica antecedente. Como ejemplos, se pueden citar Gallagher, D. y col., Journal of Nutrition (1996), Vol. 126, Nº 5, pp. 1362-1371, que describen los efectos de bifidobacterias y Lactobacillus acidophilus sobre el cáncer de colon en ratas y dicen que se obtuvieron los mejores resultados usando ambas bacterias y un fructooligosacárido, y Kirjavainen, P. y col., Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology (Noviembre de 1999), Vol. 6, Nº 6, pp. 799-802, que describen los efectos positivos de dos cepas ácido-lácticas estudiadas por separado, Lactobacillus rhamnosus GG y Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii JS, sobre los niveles de linfocitos, y por lo tanto sobre la respuesta inmune, de ratones. La combinación de estas dos bacterias no ha sido descrita ni estudiada.

La combinación de probióticos con otras substancias que tienen efectos terapéuticos ha sido también descrita en la literatura de la técnica. Por ejemplo, WO 97/29762 y WO 97/29763, Procter & Gamble Company, describen el uso de lactobacilos y bifidobacterias combinados con galacto- o fructooligosacáridos junto con una planta del género Ericaceae, o un extracto de la misma, para el tratamiento de infecciones del tracto urinario y de trastornos intestinales, y WO 00/29007, Reddy, describe la combinación de probióticos, tales como Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus, Propionibacterium, Brevibacterium, Penicillium y Saccharomyces, con productos naturales basados en hierbas y substancias de tipo fármaco.

Aunque los probióticos y sinbióticos han sido ampliamente estudiados, no se dispone de productos comerciales buenos y versátiles en ningún grado significativo. En consecuencia, existe una necesidad continua y evidente de ofrecer a los consumidores nuevos productos que tengan efectos probióticos claramente demostrados y producidos en una forma que permita su uso como una parte o suplemento conveniente, por ejemplo, de la dieta diaria.

Breve descripción de la invención

Es, por lo tanto, un objeto de la presente invención presentar un nuevo producto que contiene probióticos, cuyo efecto probiótico ha quedado claramente demostrado, que es agradable de usar y sano para el consumidor.

Estos objetos fueron conseguidos con una nueva combinación de la invención, que consiste en un número plural de probióticos. La presente invención se basa, por lo tanto, en una nueva combinación consistente en (2) cepas de lactobacillus, una bacteria ácido-propiónica y una bifidobacteria. Además, la combinación contiene preferiblemente un prebiótico que soporta el crecimiento de los microbios antes mencionados.

Según la invención, se usan principalmente dos cepas de lactobacilos, es decir, Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103) y Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061). La bacteria ácido-propiónica es Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS (DSM 7067). La bifidobacteria puede ser cualquier bifidobacteria que tenga un efecto probiótico; típicamente, se usan cepas pertenecientes a las especies Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum y Bifidobacterium adolescentis.

La combinación más preferida es una mezcla de cuatro cepas, Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103), Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061), Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS (DMS 7067) y Bifidobacterium infantis Bbi99 (DSM 13692). Sin embargo, se puede incluir cualquier bifidobacteria (tal como Bb12) en la combinación, si se desea. El prebiótico usado es preferiblemente galactooligosacárido (GOS).

La nueva combinación puede ser usada como tal o como parte de otro producto, tal como un producto farmacéutico o alimentario. La combinación de la invención tiene un efecto ventajoso sobre el equilibrio intestinal humano, ya que aumenta la producción de enterolactona y reduce un valor de pH inconvenientemente alto. La combinación influye también en la respuesta inmune aumentando la cantidad de linfocitos y la de \gamma-interferón (IFN) y reduciendo la formación de substancias carcinogénicas. La combinación de la invención es, por lo tanto, útil para la prevención y el tratamiento de trastornos, alergias y cáncer a nivel de intestino y para promover el estado general de salud.

Según la presente invención, la combinación es, por lo tanto, aplicable como substancia terapéutica y en la preparación de substancias terapéuticas.

Descripción detallada de la invención

De las cepas usadas en la invención, se han descrito Lactobacillus rhamnosus GG (LGG), Lactobacillus casei ssp. Rhamnosus LC705 y Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS (PJS) en la técnica anterior. Bifidobacterium infantis Bbi99, que puede ser incluida en la combinación, es una nueva cepa y será descrita con más detalle a continuación.

Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) está descrito, por ejemplo, en la Patente EE.UU. 5.032.399, Gorbach y Goldin. Se aísla la cepa de heces humanas, es capaz de crecer bien a pH 3 y sobrevive incluso a valores de pH inferiores, así como a altos contenidos en ácidos biliares. La cepa exhibe una excelente adhesión tanto a las células del mucus como a las epiteliales. El rendimiento de ácido láctico a partir de la glucosa es bueno: cuando se cultiva en caldo MRS, la cepa produce un 1,5-2% de ácido láctico. La cepa no fermenta la lactosa y, por lo tanto, no produce ácido láctico a partir de lactosa. La cepa emplea los siguientes carbohidratos: D-arabinosa, ribosa, galactosa, D-glucosa, D-fructosa, D-manosa, ramnosa, dulcitol, inositol, manitol, sorbitol, N-acetilglucosamina, amigdalina, arbutina, esculina, salicina, celobiosa, maltosa, sacarosa, trehalosa, melezitosa, gentibiosa, D-tagatosa, L-fucosa y gluconato. La cepa crece bien a +15-45ºC, siendo la temperatura óptima 30-37ºC. Lactobacillus rhamnosus GG está depositado en la autoridad depositaria American Type Culture Collection bajo el número de acceso ATCC 53103.

Se describe a Lactobacillus casei ssp. Rhamnosus LC705 con mayor detalle en la Patente FI 92498, Valio Oy. LC705 es un bacillo corto gram-positivo que aparece en cadenas; es homofermentativo; débilmente proteolítico; crece bien a +15-45ºC; no produce amoníaco a partir de arginina; es catalasa-negativo; cuando crece en caldo MRS (LABM), la cepa produce un 1,6% de ácido láctico con una actividad óptica de la configuración L(+); la cepa descompone el citrato (0,169%), produciendo así diacetilo y acetoína; la cepa fermenta al menos los siguientes carbohidratos (azúcares, alcoholes de azúcares): ribosa, galactosa, D-glucosa, D-fructosa, D-manosa, L-sorbosa, ramnosa, manitol, sorbitol, metil-D-glucósido, N-acetilglucosamina, amigdalina, arbutina, esculina, salicina, celobiosa, maltosa, lactosa, sacarosa, trehalosa, melezitosa, gentiobiosa, D-turanosa y D-tagatosa. LC705 se adhiere débilmente a las células del mucus, pero moderadamente a las células epiteliales. La viabilidad de la cepa es buena a bajos valores de pH y a altos contenidos en ácidos biliares. La cepa sobrevive bien a una salinidad del 5% y bastante bien a una salinidad del 10%. Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC705 está depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) bajo el número de acceso DSM 7061.

También se describe Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS (PJS) con mayor detalle en la Patente FI 92498, Valio Oy. PJS es un bacilo corto gram-positivo, fermenta la glucosa, la fructosa, la galactosa y la lactosa; fermenta bien el lactato y su temperatura óptima de crecimiento es 32ºC. La viabilidad de la cepa a bajos valores de pH y altos contenidos de ácidos biliares es excelente. Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS está depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) bajo el número de

\hbox{acceso DSM
7067.}

Bifidobacterium infantis Bbi99 ha sido aislado de heces de un recién nacido sano. B. Infantis Bbi99 es un bacilo pleomórfico gram-positivo. La cepa es catalasa-negativa, fructosa-6-fosfato-fosfocetolasa-posi-tiva (F6PPK) y tanto \beta-galactosidasa como \beta-glucosidasa-positiva. B. Infantis Bbi fermenta los siguientes carbohidratos: ribosa, galactosa, D-glucosa, D-fructosa, D-manosa, metil-D-manosa, N-acetilglucosamina, esculina, salicina, celobiosa, maltosa, lactosa, melibiosa y gentiobiosa. La temperatura óptima de crecimiento es 30-40ºC y el pH 6,5-7,0. Cuando crece en caldos que contienen hexosa, la cepa produce ácido L-láctico y ácido acético (en una proporción de 2:3). El contenido en G+C del ADN es del 55-67% molar. Bifidobacterium infantis Bbi99 fue depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), según el Tratado de Budapest, bajo el número de acceso DSM 13692 el 28 de Agosto de 2000.

La combinación de la invención puede incluir también otros microorganismos, tales como microorganismos y probióticos contenidos en iniciadores usados en la industria láctea. Hay una serie de cepas bien documentadas de iniciadores, que pueden ser comercialmente adquiridas de productores tales como Hansen A/S, Dinamarca, y Danisco/Wiesby GmbH, Alemania.

Para preparar las combinaciones de la invención, se cultivan los microorganismos usando procedimientos convencionales en la técnica. Pueden ser cultivados como cultivos puros o como diferentes cultivos mixtos. Los cultivos pueden ser usados como tales o pueden ser procesados como se desee, por ejemplo, purificándolos, concentrándolos, liofilizándolos o acabándolos para producir diversas preparaciones.

Se usa una cantidad suficiente de probióticos en la combinación para producir el efecto probiótico deseado. La cantidad de cada probiótico puede variar, por lo tanto, dentro de un amplio rango, dependiendo, por ejemplo, de las cepas usadas y de su número, de la cantidad total de células de los probióticos, de la dosis diaria total y de otras propiedades e ingredientes del producto. Una dosis diaria de la combinación contiene normalmente aproximadamente 10^{6}-10^{10} cfu de probióticos.

Se añaden preferiblemente uno o más prebióticos a la combinación para formar un sinbiótico. Se selecciona el prebiótico según los microorganismos incluidos en la combinación en cuestión, de tal forma que soporte el crecimiento de los microorganismos. Como prebióticos adecuados, se pueden incluir, por ejemplo, oligosacáridos, particularmente galactooligosacáridos (GOS), palatinosaoligosacáridos, oligosacáridos de soja, gentiooligosacáridos, xilioligómeros, almidón no degradable, lactosacarosa, lactulosa, lactitol, maltitol, polidextrosa o similares. Se añade una cantidad suficiente del prebiótico al sinbiótico para producir un efecto prebiótico. Lo que constituye una cantidad suficiente, es determinado, por ejemplo, según la cepa en cuestión, la cantidad de los prebióticos incluidos y los otros contenidos y la aplicación del producto. La cantidad varía también, por lo tanto, en un amplio margen; puede ser de 0,5 a 5 g en una dosis diaria, por ejemplo.

El prebiótico no necesita forzosamente ser incluido en la combinación. Dependiendo del producto final y de la finalidad de uso, puede ser mejor consumir el prebiótico por separado, aunque aproximadamente al mismo tiempo que la combinación probiótica. En algunos casos, puede ser suficiente consumir sólo la combinación probiótica, no necesitándose así el prebiótico en absoluto. Un ejemplo de esto es el caso en que las condiciones intestinales del hospedador son adecuadas para el crecimiento de probióticos sin necesidad de añadir un prebiótico y cuando el prebiótico está contenido en la dieta normal (si se consume en papilla o pan de centeno, por ejemplo).

La presente invención ha mostrado que los microorganismos usados cumplen los criterios establecidos para los probióticos: sobreviven bien en las condiciones exigentes del tracto digestivo, se adhieren bien a las células intestinales y se multiplican bien en el intestino. También han mostrado exhibir excelentes efectos biológicos; por ejemplo, aumentan el número de microorganismos deseables desde el punto de vista de la salud y reducen el número de microorganismos perjudiciales en el intestino, reducen la actividad de enzimas perjudiciales y de este modo la formación de substancias perjudiciales o incluso carcinógenas y tienen un efecto estimulante sobre la respuesta
inmune.

La combinación de la invención puede ser usada como tal o en forma de cápsulas, píldoras o tabletas, por ejemplo, fabricadas en procedimientos convencionales de preparación de productos farmacéuticos. La combinación de la invención puede ser también añadida a diversos productos comestibles, tales como alimentos, productos de la industria de la bebida o de la pastelería, productos promotores de la salud, productos naturales, etc. En el contexto de la presente invención, se prefieren productos que contienen la combinación de la invención, tales como productos lácteos, particularmente yogures y otros productos lácteos fermentados; quesos y extensiones; alimento para niños; zumos y sopas, y cápsulas. Un producto en forma de cápsula normalmente contiene sólo la combinación probiótica, siendo consumido el prebiótico por separado.

Los productos finales son preparados en procedimientos convencionales, siendo añadida la combinación en relación con la preparación o a continuación durante el acabado del producto final.

La invención es descrita con mayor detalle en relación a los siguientes ejemplos, que sólo pretenden ilustrar la invención y no restringir su alcance en modo alguno.

Ejemplo 1 Preparación de la combinación

La combinación fue preparada a partir de una mezcla bacteriana, añadiendo, cuando se deseara, galactooligosacárido (GOS) como prebiótico. Se formó la mezcla bacteriana a partir de cultivos bacterianos (concentrados o polvos liofilizados) de cuatro cepas, es decir, Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103), Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061), Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS (DSM 7067) y Bifidobacterium infantis Bbi99 (DSM 13692).

Tanto LGG como la bifidobacteria son cultivados individualmente.

LGG fue cultivado en un medio consistente en un 5,0% de permeado de suero (Valio Oy), un 0,5% de hidrolizado de caseína (Valio Oy), un 0,5% de levadura técnica y un 0,0015% de MnSO_{4} x H_{2}O. Se disolvieron los componentes del medio en agua y se esterilizó el medio (durante 20 minutos a 120ºC). Se realizó el cultivo a una temperatura de 37ºC y un pH de 5,8 (ajustado con NH_{4}OH) durante aproximadamente 18 h y a una velocidad de mezcla de 100 rpm. Tras el cultivo, se concentraron las células bacterianas, se lavaron y se liofilizaron usando un suplemento de agente protector al 10% (v/v), tal como un caldo de sacarosa del 46% o una alternativa similar conocida para los expertos en la técnica. El contenido bacteriano final era >1 x 10^{9} cfu/ml en el cultivo, >1 x 10^{10} cfu/g en el concentrado y >1 x 10^{11} cfu/g en el polvo liofilizado.

La composición del medio de crecimiento de bifidobacterias era la siguiente: permeado de suero 4% (Valio Ltd.), hidrolizado de caseína 1,0% (Valio Ltd.), extracto de levadura técnica 1,0% (LAB M) y cisteína-HCl 0,03% (Merck, Darmstadt, Alemania). Se disolvieron primeramente otros ingredientes del medio en agua, se añadió luego la cisteína-HCl y se esterilizó el medio (durante 20 minutos a 120ºC). Se realizó el cultivo en aproximadamente 18-20 horas a una temperatura de 37ºC y un pH de 6,7 (ajustado con NH_{4}OH) y una velocidad de mezcla de 100 rpm. El contenido bacteriano del cultivo era >1 x 10^{9} cfu/ml. Después del cultivo, se concentraron las células bacterianas, se lavaron y se liofilizaron usando un suplemento de agente protector al 10% (v/v), tal como caldo de sacarosa del 46%, o una alternativa similar conocida para los expertos en la técnica. El contenido bacteriano en el concentrado era >1 x 10^{10} cfu/g y el polvo liofilizado >1 x 10^{11} cfu/g.

Se cultivaron conjuntamente LC705 y PJS inoculando células bacterianas en un caldo de cultivo basado en suero lácteo en una proporción de 1:2. El medio de crecimiento basado en suero contenía un 3,5-5% de permeado de suero (Valio Oy), un 1,0% de hidrolizado de caseína y un 1,0% de extracto de levadura (Valio Oy). Se cultivaron las cepas durante tres días a 30ºC manteniendo el pH a 4,5 por medio de un ajuste de pH automatizado. Después del cultivo, el contenido de cada cepa bacteriana era de >1 x 10^{9} cfu/ml. Después del cultivo, se concentraron las células bacterianas, se lavaron y se liofilizaron usando un suplemento de agente protector al 10% (v/v), tal como caldo de sacarosa del 46% o una alternativa similar conocida para un experto en la técnica. El contenido de cada una de las bacterias en el concentrado era >1 x 10^{10} cfu/g y en el polvo liofilizado >1 x 10^{11} cfu/g.

Las cepas pueden ser también cultivadas por separado. En ese caso, se cultiva LC705 como se ha descrito antes en relación al cultivo conjunto, sólo que el tiempo de cultivo es de 1 día a 30ºC. Se cultiva PJS en un medio de cultivo basado en suero lácteo que contiene un 2% de permeado de suero, un 1,0% de hidrolizado de caseína y un 1% de extracto de levadura. Se cultiva la cepa durante 3 días a 30ºC a un valor de pH de 6,3, después de lo cual se lleva a cabo el proceso como antes.

Se mezclan los concentrados de los polvos en una proporción de 1:1:1. Cuando se han cultivado LC705 y PJS por separado, la proporción de mezcla es 1:1:1:1. Se usa la mezcla obtenida de concentrados o polvos liofilizados como porción probiótica en las diferentes aplicaciones de producto de la combinación. Se añade la mezcla a la aplicación de producto para obtener el siguiente contenido bacteriano final en el producto:

	LGG	>10^{6} cfu/g del producto
	LC705	>10^{6} cfu/g del producto
	PJS	>10^{6} cfu/g del producto
	Bifidobacterium	>10^{6} cfu/g del producto

Se añadió GOS (Valio Oy), cuando fuera deseable, como un producto independiente a la aplicación de producto para obtener una concentración de GOS e aproximadamente 0,5-5 g/dosis en el producto.

Ejemplo 2 Propiedades adhesivas de las cepas y su tolerancia en condiciones intestinales

Se estudió la adhesión de las cepas probióticas al mucus según Ouweland y col. (Ouweland, A.C., Kirjavainen, P.V., Grönlund, M.-M., Isolauri, E. y Salminen, S.J., 1999, Adhesion of probiotic micro-organisms to intestinal mucus, Int. Dairy J. 9: 623-630). LGG y la bacteria propiónica PJS se adherían excelentemente al mucus intestinal, Bbi99 moderadamente y LC705 débilmente. La adhesión es un prerrequisito para que el microbio produzca efectos beneficiosos en el intestino. Por otra parte, se sabe que LC705 se adhiere bien a las células epiteliales, de forma similar a LGG (Lehto, E. y Salminen, S., 1997, Adhesion of two lactobacillus strains, one lactococcus strain and one propionibacterium strain to cultured human intestinal CaCO-2 cell lines, Bioscience Microflora 16: 13-17). Esta propiedad es beneficiosa cuando existe un equilibrio en el intestino y se ha debilitado el mucus protector.

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TABLA 1 Propiedades autoadhesivas de cepas probióticas

Cepa	Adhesión (+Est.) %
LGG	26,3 \pm 1,3
LC705	0,7 \pm 0,2
PJS	24,9 \pm 2,2
Bbi99	4,6 \pm 2,3

Las pruebas in vitro han mostrado que las cepas pueden soportar los contenidos fisiológicos de sales biliares y el bajo pH del estómago.

Se estudiaron las cepas a diferentes valores de pH en caldos MRS cuyo pH había sido ajustado con ácido láctico a valores de pH 4, pH 3 y pH 2. Se inoculó la cepa de estudio (cultivo fresco) en un caldo de pH del 1% y se cultivó a 37ºC durante 3 horas, después de lo cual el contenido en células vivas fue determinado usando un agar adecuado para la cepa (véase la Tabla 5). Las cepas mantenían su viabilidad en el proceso de 3 horas a un valor de pH de 3 excelentemente. La bacteria propiónica permanecía viable incluso a pH 2. En la prueba, las bacterias no estaban protegidas por los componentes llevados por el alimento (tales como grasa) y, por lo tanto, se puede suponer que se conservarán incluso mejor cuando se consuman in vivo junto con alimento.

TABLA 2 Contenidos celulares de cepas cultivadas en caldos MRS con pH ajustado

	Contenido inicial	pH 4 cfu/ml	pH 3 cfu/ml	pH 2 cfu/ml
	cfu/ml
Bbi99	1 x 10^{7}	2 x 10^{7}	<10	<10
PJS	1 x 10^{8}	9 x 10^{7}	3 x 10^{7}	1 x 10^{4}
LGG	1 x 10^{7}	2 x 10^{7}	1 x 10^{7}	<10^{2}
LC705	6 x 10^{7}	2 x 10^{8}	4 x 10^{7}	<10^{2}

Con respecto a la tolerancia a las sales biliares, se estudiaron las cepas en caldos MRS que contenían un 0,3% y un 0,5% de sal biliar Oxgal (Sigma) inoculando un 1% del cultivo fresco en el caldo MRS de sales biliares que había de ser estudiado. Se cultivaron las cepas en los caldos durante 3 horas a 37ºC, después de lo cual se determinó el contenido en células vivas usando un agar adecuado para la cepa (véase la Tabla 5). Todas las cepas sobrevivieron al tratamiento excelentemente.

TABLA 3 Contenidos celulares de cepas cultivadas con contenidos de sales biliares del 0,3% y del 0,5%

	Contenido inicial	Sales biliares 0,3%	Sales biliares 0,5%
	(cfu/ml)
Bbi99	3 x 10^{7}	1 x 10^{7}	1 x 10^{7}
PJS	6 x 10^{7}	6 x 10^{7}	5 x 10^{7}
LGG	1 x 10^{7}	2 x 10^{7}	9 x 10^{6}
LC705	1 x 10^{7}	2 x 10^{7}	1 x 10^{7}

Ejemplo 3 Selección de un prebiótico adecuado para la combinación

Se estudiaron prebióticos alternativos en cepas individuales cultivando cada cepa en un caldo MRS libre de azúcar al que se añadió un 1% del prebiótico de estudio. Se cultivó cada cepa durante 1-2 días a su temperatura óptima. Se observó el crecimiento bacteriano durante la prueba determinando la turbidez del cultivo por espectrofotometría. Como se muestra en la Tabla 4, el mejor promotor para el crecimiento en las cuatro cepas era un suplemento de galactooligosacárido (GOS) al 1%.

TABLA 4 Efecto de prebióticos sobre el crecimiento bacteriano

Prebiótico	LGG	LC705	PJS	Bbi99
GOS	++	++	++	+
FOS	-	-	-	-
Xilooligómeros	+	++	+	+
Polidextrosa	++	++	+	-
Arabinooligómeros	-	-	-	-
Pectinooligómeros	-	-	-	-
Xilitol	-	-	-	-
Maltitol	-	++	-	-
Lactitol	-	++	-	-

Ejemplo 4 Preparación del producto final

Se usó una bebida funcional (en Finlandés, "tehojuoma", Valio Oy) como base para preparar un zumo (dosificación 65 ml/día) al que se añadió 0,1 g de mezcla liofilizada de bacterias/dosis (= 65 ml) y 3,8 g de un jarabe de GOS al 70%/dosis (= 65 ml). Se usó un zumo correspondiente sin adición de jarabe de GOS o mezcla bacteriana como
control.

Los contenidos bacterianos del zumo acabado eran los siguientes:

	LGG	>10^{7} cfu/ml
	LC705	>10^{7} cfu/ml
	PJS	>10^{8} cfu/ml
	Bbi99	>10^{7} cfu/ml

Se usó el producto en las siguientes pruebas clínicas, en donde por = zumo + suplemento probiótico y sin = zumo + probiótico + suplemento prebiótico.

Ejemplo 5 Efectos clínicos de la combinación de la invención

Se estudió clínicamente en 20 varones la bebida descrita en el ejemplo 4, que contenía la combinación probiótica antes descrita (Pro) o la combinación probiótica y un prebiótico (Sin). Las personas del ensayo tomaron la bebida diariamente según el plan de estudio y durante el estudio no se les dejó consumir ningún otro producto que contuviera probióticos. El esquema del estudio era tal que la prueba se inició con un período de introducción seguido de un período de probióticos de dos semanas y un posterior período de sinbióticos y acabó con lo que es conocido como un período de lavado.

Esquema y programa del estudio

Semana 8	N(semana 11)	N(semana 13)	N(semana 15)	N(semana 17)
I 3 semanas	*I 2 semanas	*I 2 semanas	*I 2 semanas	*I
introducción sin	Pro	Sin	dieta normal sin
probiótico			probiótico

Al final de cada período, las personas del estudio dieron una muestra de heces y una muestra de sangre (= N).

Se analizaron los microbios y las enzimas de las muestras de heces y el contenido en enterolactona y la respuesta inmune a partir de la sangre.

5.1. Microbios Cantidad de microbios

El contenido total de bacterias ácido-lácticas, LGG y LC705, el contenido total de bacterias ácido-propiónicas, PJS, y el contenido total de bifidobacterias fueron determinados aplicando métodos conocidos en la técnica y los parámetros mostrados en la Tabla 5.

TABLA 5 Métodos para la determinación de microbios

Determinación	Agar	Temperatura/tiempo de cultivo
Lactobacilos	MRS	37ºC/3 días	Anaerobios
LGG	MRS + vancomicina	37ºC/3 días
	al 0,005% (Sigma)

TABLA 5 (continuación)

Determinación	Agar	Temperatura/tiempo de cultivo
LC705	MRS + vancomicina	37ºC/3 días
	al 0,005%
Bacterias propiónicas	Mod. YEL	30ºC/7 días	Anaerobios
PJS	Mod. YEL	30ºC/7 días	Anaerobios
Bifidobacterias	Agar rafinosa (RB)	37ºC/2 días	Anaerobios

Efecto sobre el contenido intestinal de células bacterianas in vivo

Los contenidos en LGG, LC705 y PJS aumentaron significativamente en las muestras de las personas del estudio durante el período en que utilizaron el producto que contiene probióticos (Tabla 6). Como los contenidos en bifidobacterias eran altos desde el mismísimo comienzo de la prueba, los cambios presumiblemente sólo tuvieron lugar entre las especies.

TABLA 6 Contenidos bacterianos (log, cfu/g de heces; \pm est.)

	Contenido inicial cfu/g	Después de ingerir el	Después de ingerir el	Lavado cfu/g
		probiótico, cfu/g	sinbiótico, cfu/g
MHB (tot.)	6,0 (\pm1,2)	6,1 (\pm1,2)	6,1 (\pm1,0)	4,5 (\pm1,6)
LGG	2,3 (\pm1,0)	4,7 (\pm1,7)	5,3 (\pm1,2)	3,0 (\pm1,6)
LC705	2,0 (\pm0)	5,2 (\pm1,3)	5,4 (\pm1,0)	2,8 (\pm1,1)
Propion.	2,7 (\pm1,4)	5,7 (\pm1,6)	5,6 (\pm1,4)	2,4 (\pm1,7)
Bifidobacterias	8,2 (\pm1,5)	8,6 (\pm2,1)	8,8 (\pm2,2)	8,3 (\pm2,1)

La adición de sinbiótico al producto consumido en la prueba de ingestión mejoró la viabilidad de los probióticos añadidos en el intestino. Se ve esto por el aumento en el contenido en LGG durante el período de sinbióticos, por ejemplo.

Efecto del valor del pH

El nivel de pH de las personas que tenían un nivel inicial de pH de más de 7 disminuyó en los grupos que tomaron la mezcla de probióticos y el sinbiótico, mientras que no se observó disminución en personas con un valor inicial de pH inferior a 7 (Tabla 7).

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TABLA 7 Cambio en el pH después del suplemento con probióticos y sinbióticos

	Control	Probiótico solo	Sinbiótico
pH >7	7,2	6,9	6,7
pH < 7	6,6	6,7	6,6

5.2. Enzimas

Se procesaron las muestras de heces como describen Ling y col. (Ling, W-H., Korpela, R., Mykkänen, H., Salminen, S. y Hänninen, O., 1994, Lactobacillus GG supplementation decreases colonic hydrolytic and reductive activities in healthy female adults, Journal of Nutrition 124, 18-24).

Se determinaron la \beta-glucuronidasa y la \beta-glucosidasa como describen Freeman (Freeman, H.J., 1986, Effects of differing purified cellulose pectin and hemicellulose fibre on faecal enzymes in 1,2-dimethylhidrazine-induced rat colon carcinogenesis, Cancer Research 46: 5529-5532) y la ureasa según las instrucciones del fabricante (Boehringer Mannheim, Nº de catálogo 542946).

Durante los períodos de ensayo, hubo un descenso en los contenidos de \beta-glucuronidasa, ureasa y \beta-glucosidasa durante la ingestión del probiótico y la ingestión del sinbiótico (Tabla 8). Después de la ingestión, los niveles enzimáticos volvieron a la normalidad. El sinbiótico tenía un efecto reductor más potente sobre los niveles enzimáticos que la mezcla de probióticos.

TABLA 8 Cambios en los contenidos enzimáticos (nmol/min/g de heces)

	Ureasa	Glucuronidasa	Glucosidasa
		% Cambio		% Cambio		% Cambio
Nivel	1080		292		746
inicial
Probiótico	895	-17	214	-27	673	-9,8
Sinbiótico	592	-45	186	-36	448	-40
Lavado	980		227		640

El metabolismo de la glucosidasa y de la glucuronidasa produce compuestos carcinogénicos. La reducción significativa en la actividad enzimática producida por las combinaciones de probióticos y sinbióticos de la invención demuestra claramente un efecto positivo con respecto a la reducción de la formación de substancias carcinógenas.

5.3. Contenido en enterolactona

Se determinó el contenido en enterolactona usando el método de Adlercreutz y col. (Adlercreutz, H., Fostis, T., Lampe, J., Wähälä, K., Mäkelä, T., Brunow, G. y Hase, T., 1993, Quantitative determination of lignans and isoflavonoids in plasma of omnivorous and vegetarian women by isotope dilution gas-chromatography mass-spectrometry, Scan. J. Clin. Lab. Invest. 53: 5-18).

Los niveles de enterolactona de las personas del estudio con un nivel inicial de enterolactona de <10 nmol/l aumentaron significativamente como resultado de la ingestión de sinbiótico (a un nivel de 11,2).

No se observaron cambios durante la prueba en los niveles de enterolactona de personas cuyo nivel de enterolactona en suero era normal (10<x>30) ya al comienzo de la prueba. Los resultados son mostrados en la Tabla 9.

TABLA 9 Contenidos de enterolactona durante los períodos de ensayo (agrupación en base al nivel inicial)

	10<x<30 nmol/l	<10 nmol/l
Nivel inicial	24,4	3,2
Probiótico	19,8	2,6
Sinbiótico	23,9	11,2

El contenido en enterolactona ha mostrado correlacionarse claramente con el riesgo de adquirir cáncer: cuanto mayor es el contenido, menor es el riesgo. Este resultado muestra también, por lo tanto, el efecto beneficioso de las combinaciones de probióticos y sinbióticos de la invención para un menor riesgo de cáncer.

5.4. Estudios inmunológicos Efectos sobre la función de los linfocitos

Se estudió la función de los linfocitos antes de iniciar la ingestión del producto sinbiótico y después de 4 semanas de haberse iniciado la ingestión.

Se estudió la función de los linfocitos como sigue:

Se aislaron linfocitos de sangre periférica usando gradiente de Ficoll. Se estimularon los linfocitos con mitógeno PHA (Sigma) en caldo de cultivo RPMI (National Public Health Institute, departamento de caldos nutrientes) que contenía un 5% de AB inactivado + suero (Cruz Roja Finlandesa) y L-glutamina. A las 48 horas, se recogió el medio del cultivo celular para la determinación de citokinas de cuatro pocillos de cultivo adyacentes que tenían una densidad celular de 200.000 células por 200 \mul de caldo de cultivo en el pocillo, con o sin el mitógeno. Se recogieron las células 16 horas después de la adición de timidina y se midió la incorporación al ADN (cpm) de timidina radiactiva. Se determinaron los contenidos en citokinas IL-4, IL-5, TGF-\beta1 e IFN-\gamma de los caldos de cultivo celular usando el método ELISA.

Durante el seguimiento, no se detectaron cambios en los contenidos en IL-4, IL-5 y TGF-\beta1 segregados por los linfocitos. El contenido en IFN-\gamma segregado por linfocitos estimulados con PHA aumentó significativamente durante el seguimiento (p=0,009, prueba de Wilcoxon, véase la Figura 1). Tanto la proliferación de linfocitos espontánea como la inducida con PHA aumentaron durante el seguimiento (p=0,0002 en ambos casos, prueba de Wilcoxon, Figuras 1 y 2).

Según los resultados del estudio, el uso del producto sinbiótico aumenta, por lo tanto, la proliferación de los linfocitos y la secreción de la citokina IFN-\gamma en las personas del estudio. El IFN-\gamma pertenece a lo que se conoce como citokinas Th1, que refuerzan la función citotóxica de los linfocitos y son antagonistas de las citokinas IL-4 y TGF-\beta1. Se ha descrito una baja secreción de IFN-\gamma para personas propensas a alergias. Además, se supone que los niños con una predisposición a la atopia y a las reacciones alérgicas sufren de una lenta maduración de la secreción de IFN-\gamma. El efecto estimulante significativo de las combinaciones de la invención sobre la secreción de IFN-\gamma demuestra así su eficacia en la prevención y el tratamiento de las alergias.

Claims

1. Una combinación caracterizada por consistir en los microorganismos Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103), Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061), Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS (DSM 7067) y una bifidobacteria.

2. Una combinación según la reivindicación 1, caracterizada por ser la bifidobacteria Bifidobacterium infantis Bbi99 (DSM 13692).

3. Una combinación según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada por contener además microbios iniciadores convencionales.

4. Una combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por contener también un prebiótico o por usarla junto con un prebiótico.

5. Una combinación según la reivindicación 4, caracterizada por ser el prebiótico un oligosacárido.

6. Una combinación según la reivindicación 5, caracterizada por ser el prebiótico un galactooligosacárido (GOS).

7. Una combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para uso como substancia terapéutica.

8. Uso de una combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un producto alimenticio, un producto farmacéutico, un producto para promover la salud o un producto natural.

9. Uso según la reivindicación 8, caracterizado por añadir la combinación a un producto lácteo, una bebida, un zumo, una sopa o un alimento para niños.

10. Uso según la reivindicación 8, caracterizado por preparar la combinación en forma de una sola dosis.

11. Uso según la reivindicación 10, caracterizado por ser la forma de dosis una cápsula.