«COMPOSIÇÃO DE PROBIÓTICOS E USO DISTA".
CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção refere-se a uma combinação de probióticos, a combinação compreendendo lactobacilo, bactérias provenientes do ácido propiônico e/ou bifidobactérias em várias combinações. Os probióticos são preferencialmente combinados com um prebiótico adequado para produzir um simbiótico. A combinação da invenção pode ser consumada como tal ou combinada com um gênero alimentício adequado, tal como um produto de laticínio ou uma bebida, e é terapeuticamente útil, por exemplo, para estimular o sistema imunológico e para melhora da saúde no geral.
DESCRIÇÃO DA TÉCNICA ANTERIOR [002] Os probióticos são micróbios vivos, os quais quando administrados no homem ou animais, promovem o bem estar do hospedeiro por melhorar o equilíbrio microbiano intestinal (Fuiler, R, Probióticos in mau and animais, 1989, J. Appl. MicrobioL 66: 365-378). Os melhores probióticos documentados incluem L. rhamnosm LGG, L. johmmii LÂI, L casei Shírota e Bifidobacterium iaciis Bbl2. Em adição, vários outros probióticos têm sido descritos na técnica anterior (ver, por exemplo, Μ. E. Sanders & J. H. in’t Veld 1999. Antonie Van Leeuwenhoek 76: 293-315, Kluwer Academic Publishers). Os efeitos que os probióticos promovem a saúde incluem o balanceamento e manutenção da flora intestinal, estimulação do sistema imunológico e atividade anticarcinogênica. Os efeitos proveitosos de probióticos nos intestinos humanos estão baseados em vários fatores causados por células bacterianas vivas, suas estruturas celulares e produtos metabóltcos.Os probióticos são normalmente administrados em nutrientes ou como cápsulas. [003] Uma bactéria pode ser referida como um probiótico se satisfizer essencialmente os seguintes requerimentos (Lee, Y-K e Salminen, S. 1995 The coming age of probiotics. Trend Food Sei Technoi, 6,: 241-245): permanece viável nas condições exigentes que prevalecem no trato digestivo (baixo pH do estômago, ácidos do sistema digestivo, etc.); liga-se às paredes do intestino; metaboliza no intestino; é tecnologicamente aplicável (suporta processo); manifesta efeitos reportados e clinicamente testados na saúde; e é seguro consumir. [004] Prebióticos são ingredientes de alimentos nio digeríveis* os quais promovem a saúde de humanos por estimular seletivamente o crescimento e atividade de uma ou algumas bactérias de probiótico no cólon (Gíbson, G. R. e Roberfroid, Μ, B. 1995, Dietary modulation of the human colonic microbiota - introducing a concept of prebiotics. J. Nutr. 125: 1401-1412), Ura prebiódco é normalmente um carboidrato não digerível (oligo- ou polissacarídeo) ou um álcool do açúcar* o qual nâo está degradado ou absorvido no trato digestivo superior, Prebióticos conhecidos usados era produtos comerciais incluem inulina (fhito-oligossacarídeo, ou FOS) e transgalacto-oligossacarídeos (GOS ou TOS). [005] Um simbiótico é definido como uma combinação de um prebiôtico e um probiótico, o prebiôtico promovendo a viabilidade do micróbio adicionado e sua ligação ao intestino, promovendo assim saúde (Gibson e Roberfroid 1995, supracitado), Quando carboidratos não digeríveis que passam peto intestino delgado são fermentados no cólon, ácidos graxos de cadeia curta, outros ácidos orgânicos, álcoois, hidrogênio e dióxido de carbono, por exemplo, são formados (Gibson e Roberfroid 1995, supracitados). Os ácidos graxos primários produzidos na fermentação são ácido acéíico, ácido butírico e ácido propiônico (Cummings, J. H. Short-chain fatty adds, in: Human Colonic Bactéria: Role in Nutrition, Physíology and Pathology, G. R. Gibson e G. T. Macfarlane (eds,), pp. 101-130, CRC Press, Boca Raton, 1995). Um aumento no número dos ácidos graxos de cadeia curta geralmente seria vantajoso. Carboidratos não digeríveis são o principal substrato para micróbios colônicos, embora eles também possam incluir compostos, a fermentação intestinal destes é desvantajosa (Gíbson e Roberfroid, 1995, supracitados). [006] O trato digestivo humano acomoda um grande número de bactérias, as quais vivem em simbiose com o hospedeiro. Existem grandes diferenças no conteúdo mícrobiano entre as diferentes partes do trato, aproximadamente 95% de todas as bactérias intestinais que aparecem no cólon, o qual é a parte mais importante dos intestinos, foram estimadas mais de 400 espécies bacterianas que prosperaram no cólon, Além destas, os intestinos contêm micróbios conhecidos como micróbios transíentes (G. R. Gibson e Μ. B. Roberfroid (eds.) Colonic Microbiota; Nutirition and Health. Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, 1999). As espécies dominantes são as seguintes: Bacteroides, Bifidobacterium, Coprococcm, Peptostreptococcus, Eubacterium e Ruminococcus. O número das espécies Lactobacillus, Streptococcus, Fusobacterium, Veiílomlla, Propionibacterium e Enterobacteriaceae é ligeiramente menos dominante. Algumas das espécies representam micróbios úteis, considerando que outras podem ser até mesmo prejudiciais, O conteúdo médio microbiano em fezes é n 10 cfu/g (por quantidade seca). Bactérias degradam e fermentam aqueles ingredientes do alimento no cólon, os quais não são absorvidos no intestino delgado, os produtos finais da fermentação sendo absorvidos pelo intestino para ser utilizado pelo corpo. Em adição a nutrição, o equilíbrio microbiano do cólon é de grande importância ao estado de saúde de um homem (Tannock, G. W. 1998 Studies of the intestinal microflora: A prerequisite for the development of probiotics, Int. Daily J, 8: 527-533). Mudanças na composição da flora intestinal ou uma redução súbita na quantidade desta (devido i diarréia severa, tratamento de antibióticos, etc.) aumenta o grau de infecciosidade de espécies potencialmente patogênicas, as quais podem ter sérias consequências (erupção de alergias, doenças intestinais, câncer). [007] Presume-» que as enzimas de β-gLicuronidase produzidas por bactérias intestinais contribuem para a formação de compostos carcínogênicos, por exemplo. Esteróides e outros compostos carcinogêmcos metaboliztm-se no fígado e então conjugam com ácido glicurônico. A bílis entrega o composto glicurona conjugada ao intestino delgado e de lá o composto passa novamente para o cólon, onde as enzimas de glicuronidase podem hidrolisar o composto, desse modo liberando compostos tóxicos no cólon (Rowíand, I. R. 1995. Toxicology of the Colon : role of the intestinal microflora, in: Human Colonic Bactéria, Role in nutrition, physiology, and pathology. Editors: Gibson, G. R. and Macfarlane, G. T., pp. 155-174, Boca Raton,: CRC Press). É assumido que espécies de Eubacterium, Bacteroides e Clostridium liberam maiores quantidades destas enzimas prejudiciais nos intestinos que os representantes das espécies de Bifidobacteríum e Lactobacillus. Desse modo, proporcionando uma razão do por quê seria vantajoso que a flora intestinal fosse composta de Mfidobaetérías e lactobacilo. [008] Em adição, glicosídeos originando-se a partir de legumes e chá, por exemplo, não slo absorvidos no intestino delgado e passam para o cólon, onde eles podem, ser hidrolisados pela ação de β-gücosidases para formarem compostos de aglícona mutagênica ou tóxicos (Goldin, B. R. 1990, Intestinal Microflora: metabolism of drugs and carcinogens. Annals of Medicine 22:43-48), [009} Além disso, a flora intestinal produz enzima orease, a qual degrada uréia em amônia, Quantidades elevadas de amÔnía podem ser tóxicas às células do epitéllo do intestino (Mobley, H. L. T. and Hausinger, R. P, 1989. Microbiaí ureases: significance, regulation and molecular characterization. Microbiological Reviews 53: 85-108). [0010] A flora intestinal humana é formada durante os primeiros anos de vida e nenhuma mudança grande aconteça em sua composição depoís disso. Só mudanças secundárias dentro das espécies podem acontecer (em bifidobactérias, por exemplo). [0011] Junto com o crescente entendimento da importância da flora intestinal, pesquisa tem sido desse modo focalizada attvamente em descobrir os fatores que podem ser usados para influenciar a composição da flora e sua atividade (viabilidade) de tal modo que espécies bacterianas benéficas seriam reforçadas e espécies bacterianas prejudiciais seriam reduzidas. Assume-se que a atividade dos micróbios pode ser influenciada por prebióftcos que promovem bactéria benéfica, [0012] Pesquisa abrangente tem sido realizada em galacto-oligossacarídeos (GOS), os quais são di tri tetra penta- e hexassacarídeos e os quais contêm principalmente unidades de galactose. Eles são preparados enzimatícamente de lactose e o conteúdo do produto final depende da enzima usada (Matsumoto, K. et. AL 1993, Galactooligosaccharides, in: Oligosaccharides, Production, properties and applications. Ed. Nakakuki, T., Japanese Technology Reviews. Vol. 3. No. 2., pp. 90-116, Gordon and Breach Science Publishers, Switzerland, Austral ia). GOS tem anteriormente sido demonstrado exibir propriedades bifidogênicas, por exemplo, isto é, aqueles que promovem o crescimento de bifidobactérias (Ito, M. et al, 1990. Efect of administration of galactooligosaccharides on the human faecal microflora, stool weight, and abdominal sensation. Microb, Ecol Health Dís. 3:285-292), DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [0013] Tanto os produtos contendo uma cepa de probiótico individual quanto as combinações de um grande número de diferentes probióticos têm sido descritas abundantemente na técnica anterior. Simbióticos também foram descritos na técnica anterior. [0014] A publicação EP 904 784, N, V. Nutricia, por exemplo, descreve um produto de probiótico contendo Bifidobactermm, Enterococcus, faecium e Lactobacillus. Em adição, o produto pode conter prebiótícos, tais como polissacarídeos ou amido nâo degradável, e imunoglobulinas, vitaminas, etc. De acordo com a publicação, o produto tem um efeito de promover saúde a medida que estimula o sistema imunolôgico, por exemplo. Entretanto, o efeito nâo tem sido mostrado em testes clínicos, assim como também nâo tem sido estudada qualquer outra atividade biológica. [0015] WO 00/33854, N. V. Nutricia, descreve um produto compreendendo um probiótico e oligossacarídeos. Os probióticos particularmente referidos são Lactobacillus e Bifidobactermm, embora Pediococcus, Propionibaeterium, Leuconostoc e Saccharomyces também sejam mencionados. Os prebiótícos envolvidos incluem transgalacto-oligossacarídeos (TOS) e fruto-oligossacarídeos (FOS). De acordo com a publicação, uma combinação vantajosa em particular compreende Lactobacillus rhamnosus e um transgalacto-olígossacarídeo ou um produto da hidrólise de galactana da batata, esta combinação e sua preparação sendo também ilustradas nos exemplos. De acordo com a publicação, o produto possui efeitos promotores da saúde e é particularmente útil no tratamento de distúrbios intestinais. Entretanto, sua atividade não tem sido de qualquer forma demonstrada. [0016] WO 97/34615, University of New South Wales, descreve uma composição probiótica contendo, em adição a um ou mais probióticos, amido resistente (nâo degradável) e oligossacarfdeo, um efeito sinergístico sendo obtido entre os três componentes. Os probióticos mencionados São Saccharomyces, Bifidobactermm, Bacteroides, Clostridium, Fusobocterium, Propionibacterium, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Staphylococcus, Peptostreptococcus e Lactobacillus, e os oligossacarídeos incluem, entre muitos outros, fruto- e galacto-oligossacartdeos. Os exemplos mostram o efeito sinergístico de bifidobactérias, amido de milho e fruto-oligossacarídeos na quantidade de bifidobactérias. Porém, qualquer efeito terapêutico não tem sido descrito. [0017] US 5.895.648, Sítia-Yomo S.p.A., descreve uma composição probíótica compreendendo, na forma de bactérias vivas liofilízadas, pelo menos duas espécies de bifidobactérias e pelo menos duas espécies de lactobacilo ou estreptococo combinadas com um ou mais oligossacarídeos. A composição compreende no total de 4 a 20 partes em peso de probíóticos e 5 a 22 partes em peso de oligossacarídeos, dos quais, por exemplo, gilacto- e fruto-ol igossacarídeos, inulina em particular, são mencionados. O probíóticos mencionados incluem Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium iongum, Bifidobacterium bifidum, LactobaciUus acidophUus, Lactobacillus bulgarícus, LactobaciUus casei, LactobaciUus plantarum, Streptococcus thermophiius e Streptococcus faecium, De acordo com a publicação, uma mistura contendo probíóticos e prebióticos pode ser acrescentada a sobremesas derivadas de leite, leites ou sucos para equilibrar o funcionamento do intestino. Qualquer atividade biológica da combinação nâo tem, entretanto, sido descrita. [0018] Â publicação Milchwissenschaft (1988) Vol. 53, No. II, pp, 603-605, descreve leite PAB (Propiono-Acido-Bifido), o qual compreende três cepas bacteríanas: Pmpionibacterium freudenreichii subsp. shermanii MTCC 1371, LactobaciUus acidophUus R. e Bifidobacterium bifidum NDRI. Prebióticos não têm sido acrescentados ao produto. De acordo com a publicação, leite PAB é adequado para os bebês e crianças, também por esses sofrerem de intolerância a lacto.se. [0019] WO 99/10476 descreve o efeito estimulante de cepas bacteríanas específicas, isto é, LactobaciUus rhamnosus HNWI (NM97/09514) e HN067 (NM97/01925), e LactobaciUus acidophUus HN017 (NM97/09515) e Bifidobacterium lactis UNO 19 (NM97/09513), no sistema imunotógico, medido como fagocitose aumentada. As cepas podem ser usadas individualmente, ou acrescentadas a produtos de laticínios ou preparações farmacêuticas. [0020] US 5,902,578, Abbott Laboratories, refere-se a um método de prevenir e tratar diarréia com uma mistura de LactobaciUus reuteríi, LactobaciUus acidophUus e Bifidobaeterium infantis, a mistura sendo preparada como um pó, líquido ou pílulas. [0021] Efeitos biológicos e terapêuticos de probióticos e simbióticos do tipo acima também têm sido descritos tia técnica anterior, Como exemplos podem ser mencionados Gallagher, D. et al. Journal ofNutrítion (1996) Vol. 126, No. 5, pp. 1362-1371, o qual descreve os efeitos de bifidobactérias e Lactobacillus acidophilus em câncer de cólon em ralos e declara que os melhores resultados foram obtidos por usar tanto as bactérias quanto um fruto-oügossacarfdeo, e Kirjavainen, P. et al. Clinicai and Diagnostic Laboratory Immunology (Nov 1999) Vol. 6, No. 6, pp. 799-802, o qual descreve os efeitos positivos de duas, estudadas separadamente, cepas de ácido láctico, Lactobacillus rhamnosus GG e Pmpionibacterium fireudenreichü subsp. shermanü JS, nos níveis dos linfócítos, e desse modo a resposta imunológica, de ratos. A combinação destas duas bactérias não tem sido descrita ou estudada. [0022] A combinação de probióticos com outras substâncias possuindo efeitos terapêuticos também tem sido descrita na técnica anterior. Por exemplo, WO 97/29762 e WO 97/29763, Companhia Procter & Gamble, descreve o uso de lactobacilo e bifidobactérias combinado com galacto- ou fruto-oligossacarídeos junto com uma planta do gênero Erícaceae, ou um extrato desta para o tratamento de infecções do trato urinário e distúrbios intestinais, e WO 00/29007, Reddy, descreve a combinação de probióticos, tais como Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcm, Streptococcus, Propionibacteríum, Brevibacterium, Pmkiltíum e Saccharomyces com produtos naturais derivados de ervas e substâncias similares a remédios. [0023] Embora probióticos e simbióticos têm sido extensivamente estudados, produtos comerciais bons e versáteis não estão disponíveis a qualquer extensão significante. Consequentemente, existe uma necessidade evidente e continua de oferecer aos consumidores novos produtos possuindo efeitos probióticos claramente demonstrados e produzidos em uma forma que lhes permita ser usado como um suplemento ou parte conveniente, por exemplo, na dieta do dia a dia.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [0024] Portanto, é um objeto da presente invenção proporcionar um novo produto contendo probiótico, o efeito do probiótico do qual tem sido claramente demonstrado, o qual é agradável ao uso, e saudável para o consumidor. 10025] Estes objetivos foram alcançados com uma nova combinação da invenção, a qual compreende um grande número de probióticos. A presente invenção está, desse modo, baseada em uma nova combinação compreendendo (2) cepas de lactobacilo, uma bactéria proveniente do ácido propiônico e/ou bifidobactéria. Em adição, a combinação preferivelmente compreende um prebiótico suportando o crescimento dos micróbios acima mencionados. [0026] De acordo com a invenção, duas cepas de lactobacilo são principal mente usadas, isto é, Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103) e Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061). A bactéria proveniente do ácido propiônico normalmente é Propionibacterium Jreudenreichii ssp. shermanii PiS (DSM 7067). A bifidobactéria pode ser qualquer bifidobactéria possuindo um efeito probiótico, tipicamente se forem usadas cepas pertencentes às espécies Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longttm, Bifidobacterium bifidum e Bifidobacterium adolescentis. [0027] Pelo menos três destas bactérias são normal mente incluídas, e a combinação preferivelmente incluí Lactobacillus rhamnosus LGG e/ou Propionibacterium Jreudenreichii ssp. shermanii PIS. [0028] A combinação preferida é uma mistura de quatro cepas, Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103), Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061), Propionibacterium Jreudenreichii ssp. shermanii PIS (DSM 7067) e Bifidobacterium infantis Bbi99 (DSM 13692). Entretanto, qualquer bifidobactéria (como Bbl2) pode ser incluída na combinação, se desejado. O prebiótico usado é preferivelmente galacto-oligossacarídeo (GOS). [0029] Outra composição preferida é uma combinação de uma bifidobactéria e uma bactéria proveniente do ácido propiônico, na qual qualquer bifidobactéria pode ser usada junto com Propionibacterium Jreudenreichii ssp. shermanii PJS (DSM 7067). [0030] A nova combinação pode ser usada como tal ou como uma parte de outro produto, tal como um farmacêutico ou um produto alimentar. A combinação da invenção possui um efeito vantajoso no equilíbrio intestinal humano a medida que aumenta a produção de entero-lactona e reduz, um valor de pH desvantajosamente alto. A combinação também influencia a resposta imunológica por aumentar a quantidade de linfócitos e este de y-interferon (IFN) e por reduzir a formação de substâncias carcinogênicas. A combinação da invenção é, desse modo, útil para a prevenção e tratamento de distúrbios intestinais, alergias e câncer e por promover saúde em geral. [0031 ] De acordo com a presente invenção, a combinação é também, desse modo, aplicável como uma substância terapêutica e na preparação de substâncias terapêuticas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0032] Das cepas usadas na invenção, Lactobacillus rhammsus GG (LGG), Lactobacillus casei ssp. rhammsus LC705 e Propionibacterium freudenrekhii ssp. shermami JS (PJS) têm sido descritas na técnica anterior. Bifidobacterium infantis Bbi99, a qual pode ser incluída na combinação, é uma cepa nova e será descrita em maior detalhe abaixo. [0033] Lactobacillus rhammsus GG (LGG) está descrita, por exemplo, na Patente norte-americana US 5.032.399, Gorbach & Goldín, A cepa é isolada das fezes humanas, é capaz de crescer bem em pH 3 e sobrevive era valores de pH até mais baixos assim como altas quantidades de ácidos biliares. A cepa exibe excelente adesão tanto no muco quanto nas células epiteliais. O rendimento do ácido láctico da glicose é bom: quando crescido em caldo MRS, a cepa produz 1,5 - 2% de ácido láctico, A cepa não fermenta nenhuma lactose e, desse modo, não produz ácido láctico a partir da lactose. A cepa emprega os seguintes carboidratos: D-arabinose, ribose, galactose, D-glicose, D-frutose, D-manose, ramnose, duleitol, inositol, manitol, sorbitol, N-acetilglicosamina, amigdalitta» arbutina, esculina, salícina» celobíose, maltose, sacarose, trealose, melezitose, gentiobiose, D-tagatose, L-fuco.se, e gliconato. A cepa cresce bem a +| 5 - 45° C, a temperatura ótima sendo 30 - 37° C. Lactobacillus rhammsus GG está depositada na autoridade responsável americana pelo banco de depósito “American Type Cuiture Collectíon” sob o número de acesso ATCC 53103. [0034] Lactobacillus casei ssp. rhammsus LC705 é descrito em maior detalhe na Patente finlandesa FI 92498, Valío Oy. LC7Ü5 é um pequeno bastonete gram* positivo ocorrendo em cadeias; é homofermentativo; proteolítico fraco; cresce bem a +15 - 45° C; não produz amônia a partir da arginina; é catalase-negativa; quando crescido em caldo MRS (LAB M), a cepa produz 1,6% de ácido láctico possuindo uma atividade óptica da configuração L (+); a cepa decompõe citrato (0,169%), desse modo, produzindo diacetila e acetoína; a cepa fermenta pelo menos os seguintes carboidratos {açúcares, álcoois de açúcar): ribose, galactose, D-glicose, D-frutose, D-manose, L-sorbose, ramnose, manitol, sorbitol, metil-D-glicosídeo, N-acetilglicosamina, amigdalina, arbutina, esculina, salictna, celobiose, maltose, lactose, sacarose, trealose, melezitose, gentiobíose, D-turanose e D-tagatose. LC705 adere fracamente a células do muco, mas moderadamente as células epiteliais. A viabilidade da cepa é boa em valores baixos de pH e altas quantidades de ácido biliar. A cepa sobrevive bem em uma salinidade de 5% e muito bem em uma salinidade de 10%. Lactobacillus casei ssp. rhammsus LC705 está depositado em Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) sob o número de aceso DSM 7061. [0035] Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS (PJS) também é descrito em maior detalhe na Patente finlandesa FI 92498, Valio Oy. PJS é um pequeno bastonete gram-posítivo; fermenta glicose, frutose, galactose e lactose; fermenta bem lactato; e sua temperatura ótima de crescimento é 32° C. A viabilidade da cepa em baixos valores de pH e altas quantidades de ácido biliar é excelente. Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS está depositado em Deutsche von Sammlung Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) sob o número de acesso DSM 7067. [0036] Bifidobactertum infantis Bbi99 tem sido isolada das fezes de um recém-nascido saudável B. infantis Bbi99 é um bastonete pleomôrfico gram-positivo. A cepa é catalase-negativa, frutose-6-fosfato-fosfocetolase-positiva (F6PPK) e tanto «- e J3-galactosidase- quanto a- e β-gücosidase-posttiva. B infantis Bbi fermenta os seguintes carboidratos: ribose, galactose, D-glicose, D-frutose, D-manose, metil-D-manose, N-acetilglicosamina, esculina, salicina, celobiose, maltose, lactose, melibtose, e gentiobíose. A temperatura ótima de crescimento é 30- 40° C e pH 6,5 - 7,0. Quando crescido em caldos compreendendo hexose, a cepa produz ácido L-láctíco e ácido acético ( na razão de 2:3). A quantidade de G+C de DNA é 55 - 67% em moles.
Bifidobacterium infantis BbÍ99 está depositada em Deutsche Sammlung von Míkroorganismen und Zelikulturen GmbH (DSM) sob o número de aceso DSM 13692, conforme o Tratado de Budapeste dia 28 de agosto de 2000. [0037] A combinação da invenção pode também incluir outros microorganismos, tais como microorganismos e probiôticos contidos em iniciadorcs usados na indústria de laticínios. Existem inúmeras cepas bem documentadas de iniciadorcs que estão comercial mente disponíveis de produtores como Hansen A/S, Dinamarca, e Danisco/Wiesby GmbH, Alemanha. [0038] Para preparar as combinações da invenção, os microorganismos são cultivados usando processos convencionais da técnica. Eles podem ser cultivados como culturas puras ou como diferentes culturas misturadas. As culturas podem ser usadas como tal ou elas podem ser processadas como desejado, por exemplo, por purificar, concentrar, lioftlizar ou finalizar com as culturas para produzir várias preparações. [0039] Uma quantidade suficiente de probiôticos é usada na combinação para produzir o efeito de probiótico desejado. A quantidade de cada probiótico pode, desse modo, variar dentro de uma ampla faixa, dependendo, por exemplo, das cepas usadas e de seu número, a quantidade total de células dos probiôticos, a dose diária total, e de outras propriedades e ingredientes do produto. Uma dose diária da combinação normal mente compreende aproximadamente 106-1010 efu de probiôticos. [0040] Um ou maís prebióticos são preferivelmente acrescentados à combinação para formar um simbiótico. O prebíótíco é selecionado de acordo com os microorganismos incluídos na combinação relacionada de modo que irá suportar o crescimento dos microorganismos. Prebióticos adequados podem incluir, por exemplo, oligossacarídeos, particularmente galacto-oligossacarídeo (GOS), palatinose-oligossacarideo, oligossacarídeo derivado da soja, gentio-oligossacarideo, xilo-oligômeros, amido não degradável, lacto-sacarose, lactulose, lactitol, maliitol, polidextrose, ou similares. Uma quantidade suficiente do prebiótico é acrescentada ao simbiótico para produzir um, efeito de prebiótico. O que é uma quantidade suficiente é determinado, por exemplo, de acordo com a concernente cepa, a quantidade dos prebióticos incluídos e os outros conteúdos e a aplicação do produto. Portanto, a quantidade também varia dentro de uma ampla faixa; pode ser de 0,5 a 5 g em uma dose diária, por exemplo. [0041] O prebiótico não precisa necessariamente estar incluído na combinação. Dependendo do produto final e o propósito do uso, pode ser melhor consumir o prebiótico separadamente, embora aproximadamente ao mesmo tempo com a combinação de probiótico. Em alguns casos pode bastar consumir apenas a combinação de probiótico, o prebiótico, desse modo, não sendo necessário de nenhuma maneira. Um exemplo disto é um caso onde as condições intestinais do hospedeiro estão adequadas para o crescimento de probióticos sem um prebiótico adicionado sendo necessário, e quando o prebiótico está contido na dieta normal (se é consumido em mtagau de aveia ou pão de centeio, por exemplo). [0042] A presente invenção tem mostrado que os microorganismos usados encontram-se dentro dos critérios (padrão de comparação) ajustados para probióticos: eles sobrevivem bem nas condições exigentes do trato digestivo, aderem bem a células intestinais e multiplicam bem nos intestinos. Eles também mostraram exibir excelentes efeitos biológicos; por exemplo, eles aumentam o número de microorganismos desejáveis do ponto de vista da saúde e reduzem o número de microorganismos prejudiciais no intestino, eles reduzem a atividade de enzimas prejudiciais e, desse modo, a formação de substâncias prejudiciais, ou até mesmo carcinogênicas, e eles possuem um efeito estimulante na resposta imunológica. [0043] A combinação da invenção pode ser usada como tal ou na forma de cápsulas, pílulas ou tabletes, por exemplo, fabricada em processos convencionais de preparação de produtos farmacêuticos. A combinação da invenção também pode ser acrescentada a diversos produtos comestíveis, tais como gêneros alimentícios, produtos da indústria de bebida ou de confeitaria, produtos que promovem a saúde, produtos naturais, etc. No contexto da presente invenção, produtos contendo a combinação da invenção, tais como produtos de laticínio, particulannente iogurtes e outros produtos de leite fermentados; queijos e pastas; alimento de crianças; sucos e sopas; e cápsulas são preferidas. Um produto na forma de uma cápsula normalmente só contém a combinação de probiótico, o prebiótico sendo consumido separadamente. [0044] Os produtos finais estão preparados em processos convencionais, a combinação sendo adicionada ou em conexão com preparação ou depois disso, durante a finalização do produto final. [0045] A invenção está descrita em maior detalhe com referência aos exemplos seguintes, os quais pretendem apenas ilustrar a invenção e não restringir seu escopo de qualquer forma.
Exemplo 1 Preparação da combinação [0046] A combinação foi preparada de uma mistura bâeteriana» adicionando, quando desejado, galacto-oligossacarfdeo (GOS) como um prebiótico. A mistura bacteriana foi formada de culturas bacterianas (concentrados ou pós secos congelados) de quatro cepas, isto é, LactobaciUm rhamnosus LGG (ATCC 53103), Lactobacillus rhammsm LC705 (DSM 7061), Propionibocterium freudenreichii ssp. shermanii PJS (DSM 7067) e Bifidobacterium infantis BB 199 (DSM 13692). [0047] Tanto LGG quanto bifidobactéria foram cultivadas individualmente. [0048] LGG foi cultivada em um meio compreendendo 5,0% soro permeado (Valío Oy), 0,5% de caserna hidrolisada (Valio Oy), 0,5% de levedura técnica, e 0,0015% de MnSÜ4 x H^O. Os componentes do meio foram dissolvidos em água e o meio foi esterilizado (por 20 min a 120° C), O cultivo foi realizado a uma temperatura de 37a C e um pH de 5,8 (ajustado com NH4OH) por aproximadamente 18 h e a uma taxa de mistura de 100 rpm. Após o cultivo as células bacterianas foram concentradas, lavadas e secas a frio usando um suplemento de agente protetor a 10% (v/v), tal como um caldo de sacarose de 46%, ou uma alternativa semelhante conhecida para aqueles habilitados na técnica, O conteódo bacteriano final foi > lxlO9 cfu/ml no cultivo, > IxlO10 cfu/g no concentrado e> lxlO11 cfu/g no pó seco congelado.
[0049] A composição do meio de crescimento de bifidobactéria era a seguinte: 4% de soro permeado (Valio Ltd.), 1,0% de caseína hidrolisada (Valío Ltd.), 1,0% de extrato de levedura técnica (LAB M), 0,03% de cisteína-HCI (Merck, Darmstadt, Alemanha). Outros ingredientes do meio foram primeiramente dissolvidos em água, então a cisteína-HCI foi adicionada e o meio foi esterilizado (por 20 min a 120° C), O cultivo foi realizado em, aproximadamente 18-20 horas a uma temperatura de 37® C e um pH de 6,7 (ajustado com NH4OH) e a uma taxa de místura de 100 rpm, O conteúdo bacteriano do cultivo foi > 1x109 cfu/ml. Após 0 cultivo, as células bacteríanas foram concentradas, lavadas e secas a frio usando um suplemento de agente protetor a 10% (v/v), tal como um caldo de sacarose de 46%, ou uma alternativa semelhante conhecida por aqueles habilitados na técnica. O conteúdo bacteriano no concentrado foi > 1x1010 cfu/g e no pó seco congelado > 1x10' 'cfu/g. [0050] LC705 e PJS foram cultivados juntos por inocular células bacteríanas a um caldo de crescimento baseado em soro em uma razão de 1:2. O meio de crescimento baseado em soro contendo 3,5-5% de soro permeado (Valio Oy), 1,0% de caseína hídrolisada e 1,0% de extrato de Jevedo (Valio Oy). As cepas foram cultivadas durante três dias a 30° C com 0 pH mantido a 4,5 por meio de um, ajuste de pH automatizado. Após 0 cultivo, o conteúdo de cada. cepa bacteriana foi > 1x109 cfu/ml. Após o cultivo, as células bacteríanas foram concentradas, lavadas e secas a frio usando um suplemento de agente protetor a 10% (v/v), tal como um caldo de sacarose de 46% ou uma alternativa semelhante conhecida para um técnico habilitado na técnica, O conteúdo de cada uma das bactérias no concentrado foi > 1x16'° cfu/g e no pó seco congelado > 1 x, 10 cfu/g. [0051] As cepas também podem ser cultivadas separadamente. Neste caso LC 705 é cultivada como descrito acima em conexão com cultivo em comum,, apenas 0 tempo de cultivo é de 1 dia a 30° C. PJS é cultivado em um meto de crescimento baseado em soro compreendendo 2% de soro permeado, 1,0% de caseína hídrolisada e 1% de extrato de levedura. A cepa é cultivada durante 3 dias a 30® C em um valor de pH de 6,3, após os quais o processo é realizado como acima. [0052] Os concentrados ou os pós são misturados em uma proporção de 1: l: 1. Quando LC705 e PJS foram cultivados separadamente, a proporção da mistura é 1: 1: I; 1. A mistura obtida de concentrados ou pós secos congelados é usada como uma porção de probiótico nas diferentes aplicações de produto da combinação. A mistura é acrescentada à aplicação de produto para obter o conteúdo de bactéria final seguinte no produto: LGC > IO6 cfu/g do produto LC705 > IO6 cfii/g do produto PJS > 106 cfti/g do produto Bifidobactéria > IO6 cfii/g do produto [0053] GOS (Valio Oy) foi adicionado» quando desejado» como um produto separado para a aplicação de produto para obter uma concentração de GOS de cerca de 0,5-5 g/dose no produto* Exemplo 2 Propriedades adesivas das cepas e suas tolerâncias nas condições intestinais [0054] A adesão da cepa probtótica ao muco foi testada de acordo com Guweland et al. (Ouwehand, A. C.» Kirjavainen, P, V.» Grõniund, Μ. -M., Isolauri, E.» e Salminen, S. J. 1999, Adheston of Probíotic mtcro-organisms to intestinal mucus. Int. Dairy J. 9: 623-630), LGG e bactéria probiônica PIS aderiram excelentemente ao muco intestinal» Bbi99 moderadamente e LC705 debilmente. A adesão é um pré-requisito para o micróbio produzir efeitos benéficos nos intestinos. Por outro lado, LC705 é conhecido por aderir bem as células epiteliais» semelhantemenle como LGG (Lehto, E. and Salmtnen S. 1997. Adhesion oftwo laciobaciUm strains, one lactococcus straín and one propionibacterium strain to cultured human intestinal CaCO-2 cell lines. Biosctence Microflora 16; 13-17). Esta propriedade é benéfica quando houver um desequilíbrio no intestino e o muco protetor estiver debilitado.
Tabela L Propriedades Adesivas das cepas probiótieas [0055] Testes in vitro têm mostrado que as cepas suportara conteúdos de sais biliares fisiológicos e o baixo pH do estômago. [0056] As cepas foram testadas em diferentes valores de pH em caldos MRS, o pH dos quaís tinham sido ajustados com ácido láctico para valores de pH 4, pH 3 e pH 2. A cepa a ser estudada (cultura fresca) foi inoculada em um caldo de pH de 1% e crescida a 37° C durante 3 horas, depois das quais o conteúdo das células vivas foi determinado usando um ágar adequado para a cepa (ver Tabela 5), As cepas mantiveram sua viabilidade no processo de 3 horas em um valor excelente de pH de 3. A bactéria propiônica permaneceu viável até mesmo em pH 2. No teste, as bactérias não foram protegidas por componentes realizados por alimento (tal como gordura) e portanto podem ser consumidas para preservarem até melhor quando consumidas m vivo junto com alimento.
Tabela 2. conteúdos de Célula de cepas cultivadas em caldos MRS cotnpHajustado _ __ _____________ ______________ [0057] Com respeito à tolerância dos sais biliares, as cepas foram testadas em caldos MRS que continham 0,3% e 0,5% de sais biliares Oxgal (Sigma) por inocular 1% da cultura fresca do caldo MRS tios sais biliares a serem estudado. [0058] As cepas foram cultivadas nos caldos durante 3 horas a 37° C, após as quais o conteúdo de células foi determinado usando um ágar adequado para a cepa (ver Tabela 5), Todas as cepas sobreviveram o tratamento excelentemente.
Tabela 3. Conteúdos de célula de cepas cultivadas em sais biliares de 0,3% e 0,5% Exemplo 3 Selecionando um prebiótíco adequado para a combinação [0059] Prebióticos alternativos foram estudados em cepas individuais por cultivar cada cepa em um caldo MRS livre de açúcar, pelo qual foi adicionado 1% do prebiótíco a ser estudado. Cada cepa foi cultivada durante 1-2 dias a sua temperatura ótima. Crescimento bacteriano foí observado durante o teste para determinar a turvaçâo do cultivo por espectrofotometria. Como é mostrado na Tabela 4, o melhor promotor para crescimento em todas as quatro cepas era um suplemento de galacto-oligossacarídeo (GOS) a 1%, Tabela 4. O efeito de prebióticos no crescimento bacteriano Exemplo 4 Preparação do produto final [0060] Uma bebida funcional (em Finnish tehojuoma'; Valio Oy) foi usada como uma base por preparar um suco (dosagem 65 ml/dia), ao qual foi adicionado 0,1 g de mistura seca congelada de bactérias/dose (- 65 ml) e 3,8 g de 70% de xarope de GOS / dose (- 65 ml). Correspondente sem xarope de GOS adicionado ou mistura bacteriana foí usado como um controle. (006í) Os conteúdos bacterianos do suco finalizado foram como segue: LGG > I07cfú/ml LC705 > IO7 cfij/m PJS >10scfu/ml Bbi99 > I07cfu/ml [0062] O produto foi usado nos testes clínicos seguintes, nos quais pro - suco + suplemento de probiótico e sin = suco + probiótico + suplemento de prebiótico.
Exemplo 5 Efeitos clínicos da combinação da invenção [0063] A bebida descrita no exemplo 4, a qual continha a combinação probiótico descrita acima (Pro) ou a combinação de probiótico e um prebiótico (Sín), foi testada clinícamente em 20 machos. As pessoas testadas tomaram a bebida diariamente conforme o plano de estudo e durante o estudo não foram permitidas a elas consumir qualquer outro produto contendo probiótico. O esquema de estudo foi tal que o teste começou com um ensaio continuado por um período de probióticos de duas semanas e um período de simbióticos subseqüente, e terminou com o que é conhecido como um período de lavagem. O esquema de estudo e o planejamento Semana 8 N (semana II) N (semana 13) N (semana 15) N (semana 17) I 3 *1 2 *12 *12 *1 semanas semanas _______semanas_______ semanas _________ ensaio Pro Sin dieta normal sem sem probiótico probiótico [0064] No final de cada período, as pessoas testadas deram uma amostra de fezes e uma amostra de sangue (= N). [0065] Micróbios e enzimas foram analisados das amostras de fezes e o conteúdo de enterolactona e resposta imunológica a partir do sangue. 5.1. Micróbios Quantidade de micróbios [0066] O conteúdo total bacteriano proveniente do ácido láctico, LGG, LC705, o conteúdo total bacteriano proveniente do ácido propiônico, PJS, e o conteúdo total de bifidobactérias foram determinados aplicando métodos conhecidos na técnica e os parâmetros mostrados na Tabela 5.
Tabela 5. Métodos por determinar micróbios ________________________ Efeito no conteúdo de célula bacteríana intestinal itt vivo [0067] Os conteúdos de LGG, LC705 e PJS aumentaram significativamente nas amostras das pessoas testadas durante o período que elas usaram o produto contendo probiótico (Tabela 6). Desde que conteúdos de bifidobactérias foram altos do mesmo começo do teste, mudanças aconteceram presumivelmente apenas dentro das espécies.
Tabela 6. Conteúdos Bactéria nos (!ogt cfu/g de fezeM= std.) [0068] Adição de simbiótico ao produto consumido no leste de entrada melhorou a viabilidade dos probióticos adicionados no intestino. Isto é mostrado pelo aumento no conteúdo de LGG durante o período de simbtóticos» por exemplo.
Efeito no nível de pll [0069] O nível de pH de pessoas possuindo um nível de pH inicial de aproximadamente 7 diminuiu nos grupos que levaram a mistura de probiótico e o simbiótico, considerando que nenhuma diminuição foi observada em pessoas com um valor pH inicial menor que 7 (Tabela 7).
Tabela 7 Mudança no pH apás suplemento de probiótico e de simbiótico 5,2, Enzimas [0070] As amostras de fezes foram processadas como descrito por Ltng et al. (Ling, W-H,, Korpela, R., MykkSrten, H.» Salminen, S., e HSnninen, O, 1994 Lactobacillus GG supplementation decreases colon ic hydrolytic and reduetive actities in healthy íemale adults. Journal ofNutrition 124, 18-24). [0071] β-glícurontdase e β-glicosidase foram determinados como descrito por Freeman (Freeman» H. 1, 1986. Efects of differing purifted cellulose pectin, and hemicellulose libre on faecal enzymes in 1,2-dimethyl-hydrazine-induced rat colon carcinogenesis. Câncer Research 46: 5529-5532) e urease de acordo com as instruções do fabricante (Boehringer Mannheim. cat. no, 542946), [0072] Durante os períodos de teste, houve uma diminuição nos conteúdos de -β-glicuronidase, urease e β-glicosidase durante a entrada de probiótíeo e a entrada de simbiótico (Tabela 8), Após a entrada, os níveis de enzima voltaram ao normal. O simbiótico leve um efeito decrescente mais forte nos níveis de enzima que a mistura de probiótíeo.
Tabela 8. Mudanças nos conteúdos de enzima (nmol/ntin/g de fezes) [0073] Metabolismo de glícosídase e glicuronidase produz compostos carcinogênicos. A diminuição signiíleante na atividade da enzima produzida pelas combinações de probiótíeo e de simbiótico da invenção claramente demonstra um efeito positivo com respeito à diminuição da formação de substâncias carcinogênicas. 5.3 Conteúdo de Ente rola ctona [0074] Conteúdo de Enterolactona foi determinado usando o método de Adlercreutz et al. (Adlercreutz, II., Fostis, T., Latnpe, J., WihilI, K., Mãkelã, T», Brunow, C. and Hase, T. 1993, Quantitative determinatíon of lignaos and tsoflavonoids tn plasma of ómnivorous and vegetarian women by isotope diiution gas-chromatography mass-spectrometry. Scan J. Clin Lab Invest 53:5-18. [0075] Os níveis de enterolactona de pessoas testadas com um nível inicial de enterolactona de <10 rtmol/l aumentaram significativamente como um resultado da entrada de simbiótico (para um nível de 11,2). [0076] Nenhuma mudança foi observada durante o teste nos níveis de enterolactona de pessoas cujo nível de enterolactona do soro foi normal (10 <x> 30) já no começo do teste. Os resultados estão mostrados na Tabela 9, Tabela 9. Conteúdos de Enteronclaetona durante os períodos de teste (agrupando-se em base de nível de inicial) [0077] Conteúdo de ente rol actona tem sido mostrado correlatar claramente com o risco de adquirir câncer; quanto mais alto o conteúdo» mais baixo o rísco. 1¾¾½ modo, este resultado também mostra o efeito benéfico das combinações de probiótico e simbiótico da invenção para um risco de câncer diminuído. 5.4» Estudos imitnotógicos Efeitos na função do linfócito [0078] A função do linfócito foi estudada antes da entrada do produto simbiótico ter sido iniciada e depois de 4 semanas» após a entrada ter sido iniciada. [0079] A função do linfócito foi estudada como segue; [0080] Os linfócitos foram isolados do sangue periférico usando gradiente FicolL Os linfócitos foram estimulados com mitógeno PHA (Sigma) em caldo de cultivo RPM1 (National Public Health Instituto; department of nutrient broths), o qual continha 5% de AB inativo + soro (Cruz Vermelha finlandesa) e L-glutamina. Após 48 horas» o meio de cultura de célula foi coletado para determinação de citocina a partir de quatro cavidades adjacentes de cultura possuindo uma densidade de célula de 200 000 células por 200 μΐ de caldo de cultura na cavidade» ou com ou sem o mitógeno. As células foram colhidas depois de 16 horas do acréscimo de timidina e a incorporação no DNA (cptn) de timidina radioativa foi medida. Os conteúdos de citocinas IL-4» IL-5» TGF-βΙ e ÍFN-γ foram determinados dos caldos de cultura de célula por usar o método ELISA. [0081] Durante o segu ime nto, nen h uma mudança fo i detectada nos conteúdos de IL-4» IL-5 e TGF-βΙ secretados pelos linfócitos. O conteúdo de IFN-γ secretado por linfócitos estimulado por PHA aumentou signifleativamente durante o seguimento (p = 0,009» teste de Wilcoxon, ver figura 1), Tanto a proliferação estimulada por PHA quanto a proliferação espontânea de linfôcitos aumentaram durante o seguimento (p -0,0002 em ambos os casos, teste de Wilcoxon, Figuras I e 2). [0082] De acordo com os resultados de estudos, o uso do produto símbiôtico» desse modo, aumenta a proliferação dos linfôcitos e a secreção de citocina IFN-γ das pessoas testadas. IFN-γ pertence ao que é conhecido como citoctnas de Thl, as quais fortalecem a função do linfócito citotôxico e são antagonistas de cítodnas IL-4 e TGF-Pl. Baixa seereçlo de IFN-γ tem sido relatada para pessoas propensas a alergias. Em adição, presume-se que crianças com uma predisposição para atopía e reações alérgicas sofrem maturação lenta de seereçlo de IFN-γ. O significante efeito estimulante das combinações da invenção em seereçlo de IFN-γ prova, desse modo, sua eficiência na prevenção e tratamento de alergias.