ES2234065T3 - Procedimiento para la obtencion en vivo de contenidos de celulas. - Google Patents
Procedimiento para la obtencion en vivo de contenidos de celulas.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA LA RECUPERACION IN VIVO DE SUSTANCIAS INTERNAS DE CELULAS, EN DONDE LAS CELULAS SUSODICHAS EXISTEN EN UN PRIMER ESTADO, EN EL CUAL HAY UNAS CONDICIONES CUASI ESTACIONARIAS ENTRE CELULAS Y MEDIO AMBIENTE, BRUSCAMENTE SE CAMBIA A UN SEGUNDO ESTADO, EN EL CUAL SE OBLIGA A LAS CELULAS, A QUE REACCIONEN CON EL EXTERIOR EXCRETANDO SUSTANCIAS INTERNAS, PARA CONSEGUIR UNA ADAPTACION DE LAS CELULAS A LAS CONDICIONES DEL SEGUNDO ESTADO.
Description
Procedimiento para la obtención en vivo de
contenidos de células.
Es objeto de la presente invención el uso
hidroxiectoína y/o ectoína en cosmética.
A partir de E. A. Galinski, K. Lippert, NATO ASI
Ser., Ser. A 1991, 201 (Gen. Appl. Aspects Halophilic Microorg.)
351-8 se conoce la presencia de ectoínas en
microorganismos halófilos, la estructura del compuesto así como su
extracción de los microorganismos halófilos. Además, a partir de la
publicación se conoce el uso de ectoínas para la estabilización de
enzimas lábiles. Además se estudia la crioprotección de
lactatodeshidrogenasa mediante ectoína.
En E. A. Galinski, K. Lippert, Appl. Microbiol.
Biotechnol. 1992, 37(1), 61-5 se estudia el
efecto de los solutos compatibles ectoína e hidroxiectoína en la
estabilización de los enzimas lactatodeshidrogenasa y
fosfofructoquinasa sensibles al calor, al frío y a la
desecación.
Por ejemplo, son compuestos con el elemento
estructural de fórmula I, los compuestos naturales que se pueden
aislar de los cultivos correspondientes. Los compuestos que
contienen el elemento estructural
IR^{1} - N =
C(R^{2}) -
NHR^{3}
se pueden encontrar en forma
protonada con las estructuras prototrópicas (II) y
(III),
\hskip0,8cmR^{1+}NH = C(R^{2}) -- NHR^{3}
\hskip1.cmII
\hskip2cm<->
\hskip2cmR^{1}-- N = C(R^{2}) -- ^{+}NH_{2}R^{3}
\hskip1cmI
Además, R^{1} y/o R^{3} son derivados de
alquilo, cicloalquilo o sustituidos o funcionalizados con
heteroátomos, en los que la derivatización se realiza con derivados
hidroxílicos, de ácido sulfónico, de ácido carboxílico, como amidas,
ésteres, etc., carbonilo, éter, alcoxilo y otros derivados de grupos
hidroxílicos y en los que R^{1} y R^{3} pueden formar un anillo
junto con el elemento estructural según la fórmula I, así como
R^{2} es hidrógeno o posee uno de los significados mencionados
para R^{1}, R^{3}.
Los compuestos se pueden usar para la
estabilización de enzimas y otras biomoléculas en disoluciones
acuosas y disolventes orgánicos, así como para la estabilización
frente a condiciones desnaturalizantes.
Junto a los enzimas entran en consideración como
biomoléculas, por ejemplo, proteínas u otros biopolímeros. Como
reactivos desnaturalizantes se mencionan sales, valores de pH
extremos, detergentes, ureas, cloruro de guanidinio y otros
compuestos. El uso de las sustancias mencionadas con el elemento
estructural I permite la obtención de la estructura compleja de las
propias biomoléculas bajo las condiciones mencionadas.
Con preferencia se emplean compuestos que
contienen el elemento estructural I en un sistema de 6 a 8 miembros.
Como sustancias especialmente preferibles han dado buen resultado
las sustancias de la clase de las ectoínas, especialmente ectoína e
hidroxiectoína.
Además, entran en consideración los compuestos
que están derivatizados en los grupos funcionales de los compuestos
de ectoína mencionados. En el caso de la hidroxiectoína, a partir
del grupo hidroxilo se pueden formar éteres o ésteres. A partir del
grupo carboxilo se pueden formar amidas o ésteres. El grupo
carboxilato se puede reemplazar por un grupo carbonilo o un grupo
ácido sulfónico y/o sus ésteres y amidas.
Como sustancias naturales extraíbles de cultivos
bacterianos entran en consideración especialmente los osmóticos de
los grupos siguientes: ectoínas, especialmente ectoína e
hidroxiectoína, que se pueden emplear como compuestos higroscópicos;
aminoácidos y sus derivados, especialmente diaminoácidos
N-acetilados, como
N-acetil-lisina y
N-acetil-ornitina, dicarboxamidas
N-modificadas; azúcar y sus derivados, por ejemplo
trehalosa (estabilizador de secado), polioles, betaínas, péptidos y
proteínas.
La hidroxiectoína óptimamente activa de la
fórmula siguiente es formada especialmente por Halomonas elongata y
Marinococcus halophilus.
S,S-\alpha-amino-\beta-hidroxiectoína
Esta sustancia, junto a otros derivados de
ectoína, se puede emplear por ejemplo para la crioprotección de
principios activos biológicos, células, frascos de sangre, etc. y
puede encontrar uso en la técnica médica, cosmética y la industria
farmacéutica.
La ectoína y los derivados de ectoína como la
hidroxiectoína se pueden usar también en medicamentos. Especialmente
la hidroxiectoína se puede usar para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de enfermedades de la piel. Otras
áreas de aplicación de la hidroxiectoína y otros derivados de
ectoína son típicamente áreas en las que, por ejemplo, se usa
trehalosa como aditivo. Así, los derivados de ectoína, como la
hidroxiectoína, pueden encontrar uso como aditivo en células secas
de levaduras y bacterias. También se pueden proteger productos
farmacéuticos como péptidos y proteínas farmacéuticamente activos no
glicosilados, por ejemplo, t-PA, con ectoína o sus
derivados.
Por eso, un primer objeto de la presente
invención es el uso de hidroxiectoína y/o ectoína como aditivo
efectivo en la crioprotección de células en la industria
cosmética.
Un segundo objeto de la presente invención es el
uso de ácido
(S)-1,4,5,6-tetrahidro-2-metil-4-pirimidin-carboxílico
(ectoína) o ácido
(S,S)-1,4,5,6-tetrahidro-5-hidroxi-2-metil-4-pirimidin-carboxílico
para la fabricación de una preparación cosmética.
Un objeto no reivindicado de la presente
invención son las preparaciones farmacéuticas que contienen ácido
(S)-1,4,5,6-tetrahidro-2-metil-4-pirimidin-carboxílico
(ectoína) o ácido
(S,S)-1,4,5,6-tetrahidro-5-hidroxi-2-metil-4-pirimidin-carboxílico
con la condición de que se excluyen las preparaciones que se
componen de ectoína o hidroxiectoína, que se componen de ectoína o
hidroxiectoína y agua, o que contienen agua, ectoína o
hidroxiectoína y un enzima seleccionado entre lactatodeshidrogenasa
y fosfofructoquinasa.
Además se da a conocer que el procedimiento para
la obtención in vivo de contenidos de células depende de que
las células cultivadas previamente que han crecido en un primer
medio determinado, se transfieren a un segundo medio. Mediante este
choque se obliga a las células a reaccionar, mediante aportación de
contenidos celulares en el entorno, para alcanzar una adaptación de
las células a las condiciones existentes en el segundo medio.
Además, los pasos del procedimiento antes mencionados se tienen que
realizar al menos dos veces (choque de cambio).
El cambio en el entorno de las células en el
primer medio se puede alcanzar por ejemplo, mediante el cambio de la
presión, de la temperatura, de la concentración de sustancias, del
valor de pH o combinaciones de estas condiciones.
Así, por ejemplo, es posible provocar un choque
mediante cambios de las condiciones osmóticas en el medio de
cultivo.
El procedimiento se puede combinar con
preferencia con otras condiciones, como aquellas que provocan un
aumento de la permeabilidad de las membranas celulares, como por
ejemplo el procedimiento de electroporación. La permeabilidad de las
membranas celulares se puede cambiar también mediante sustancias
permeabilizantes. A éstas pertenecen especialmente los antibióticos
péptidicos y depsipeptídicos formadores de poros y/o estimulantes de
la difusión, por ejemplo, valinomicina, polimixina, gramicidina,
nisina, así como detergentes como por ejemplo dodecilsulfato sódico,
Triton X, bromuro de cetiltrimetilamonio. El crecimiento de las
células en medios pobres también puede conducir a un aumento de la
permeabilidad celular. Esto sucede especialmente cuando las células
retienen determinados nutrientes, como biotina o manganeso. La
membrana celular de las células respectivas también puede ser
permeable por el uso de mutantes cuyo metabolismo lipídico está
alterado.
A causa del hecho de que las células no se
destruyen sino que solamente ceden contenidos celulares al medio a
través de derrames, que pueden existir en forma de poros específicos
o inespecíficos o sistemas de transporte activos, el procedimiento
según la invención se puede organizar de forma continua mediante
regeneración del primer medio y cambio de nuevo en el segundo medio.
Esto se realiza según la invención en forma de los llamados choques
de cambio en un control cíclico del proceso. Entre los choques de
cambio las células se mantienen con preferencia a condiciones
constantes hasta que entre las células y el entorno existen
condiciones casi estacionarias.
Como células que se pueden someter al
procedimiento según la invención entran en consideración
microorganismos, especialmente bacterias, hongos, levaduras, algas,
algas rojas o células de organismos superiores, tejidos animales o
vegetales; u órganos.
En determinadas configuraciones puede ser
ventajoso emplear células manipuladas genéticamente que sintetizan
determinadas sustancias y ceden éstas al entorno como consecuencia
del choque.
Según el procedimiento se trabaja en una de las
formas de realización preferible, como se describe a continuación.
Por ejemplo, eubacterias halotolerantes aclimatadas a salinidad
elevada producen sustancias naturales de bajo peso molecular
(osmóticos), que estabilizan enzimas nativos en un medio de baja
actividad en agua. Se pueden emplear como sustancias protectoras en
tecnología enzimática y también como sustancias protectoras frente
al calor, la congelación y el secado. Muchos de estos
"solutos", como por ejemplo compuestos de la clase de los
ácidos tetrahidropirimidincarboxílicos, son fácilmente accesibles
biotecnológicamente en la aplicación del procedimiento. El
procedimiento aprovecha la capacidad de los organismos
halotolerantes de exportar rápidamente grandes cantidades de
osmóticos orgánicos en un estrés de dilución, para evitar lugares de
las células condicionados osmóticamente. Es ventajoso en el
procedimiento el hecho de que la eliminación de sustancias
acumuladas citoplasmáticamente también se puede inducir en cepas
salvajes, y que el producto se encuentra en forma relativamente pura
en un medio acuoso diluido. De esta manera se facilita esencialmente
la purificación problemática de compuestos orgánicos de bajo peso
molecular. Ya que por ejemplo la producción de los solutos se
realiza de forma prioritaria e independientemente del crecimiento
celular, en el procedimiento de incorporación a menudo se repite a
discreción la extracción in vivo y se puede seguir en un
procedimiento continuo de bio-conversión con
reciclado de
biomasa.
biomasa.
En una forma de realización preferible del
procedimiento se emplean microorganismos como proteobacterias,
especialmente Halomonadaceas, o Firmicutes, por ejemplo,
Micrococci.
Mediante la dilución gradual de un cultivo
celular denso, el análisis del contenido celular segregado y la
determinación final del número de células vivas se puede identificar
un organismo apropiado que también tolera estrés de dilución
extremo.
Las células se transfieren con preferencia de un
entorno con una osmolaridad de hasta 30 Osmol a un entorno con la
menor osmolaridad posible. La osmolaridad se puede variar también
entre 5 y 1 Osmol.
Un organismo preferible también debería crecer
rápidamente sin nutrientes complejos, poder enriquecer el producto
deseado a concentración elevada (hasta 2 M) en el citoplasma dado el
caso a causa de la manipulación genética, y soportar sin perjuicio
choques de cambio, con preferencia entre disolución de cloruro
sódico al 20% y agua pura. Mediante la incubación en medio nutriente
de baja osmolaridad (idealmente agua) las células se ven forzadas a
la cesión de sus osmóticos. El medio de baja osmolaridad eliminado
de las células contiene los osmóticos (disolución del producto). El
control cíclico del proceso permite un control más económico del
proceso, ya que las células cultivadas una vez se pueden emplear
varias veces para la producción de osmóticos. Una apertura de las
células se desarrolla del mismo modo que la separación del producto
y los restos celulares.
La separación necesaria para el intercambio de
los medios nutrientes de las células del medio exterior se puede
realizar de formas diferentes. Abajo se mencionan métodos como la
centrifugación, la filtración, la floculación o la inmovilización de
las células. Sin embargo, el cambio de la osmolaridad se puede
alcanzar mediante una solubilidad variable de los osmóticos en el
medio exterior, por ejemplo, a través de temperatura, a través de su
grado de polimerización o complejación. Según la selección del
procedimiento de separación, la construcción de instalaciones para
el cultivo de células presenta determinadas diferencias. Es
ventajosa una carga elevada de la instalación con células, ya que de
esta manera se puede aumentar el rendimiento. La densidad celular
elevada se puede alcanzar, por ejemplo, mediante una fermentación de
elevada densidad celular o un procedimiento de inmovilización, que
conduce a una elevada proporción de células en el inmobilizado.
A continuación se describe un transcurso típico
del procedimiento en el ejemplo del cultivo de Halomonas
elongata.
El cultivo previo de Halomonas elongata se
introduce en el biorreactor en el procedimiento de lote. La
fermentación de lote se realiza hasta que se ha usado una gran parte
de la fuente de carbono, por ejemplo en forma de glucosa.
Muchos componentes importantes de la disolución
de nutriente, como por ejemplo glucosa o metanol, se pueden emplear
sólo en cantidades limitadas, ya que en concentración demasiado
elevada inhiben además el crecimiento de los microorganismos. Sin
embargo, para alcanzar elevadas densidades celulares se puede
alimentar continuamente con aquellas sustancias limitantes del
crecimiento durante la duración de la fermentación compacta
("cultivo fed-batch"). Si la alimentación se
realiza a velocidades de alimentación crecientes exponencialmente,
se mantiene de forma óptima el crecimiento exponencial de los
microorganismos y se alcanza un máximo rendimiento
espacio-tiempo. Si se seleccionan bien los
parámetros, a cada instante de tiempo del crecimiento exponencial se
puede alimentar con las cantidades correspondientes de sustrato. Si
los parámetros no se equilibran de forma óptima, en el caso extremo
pueden aparecer acumulaciones de sustrato en el reactor y con ello
se inhibe el crecimiento de los microorganismos hasta la muerte de
los microorganismos.
La estrategia de alimentación óptima se efectúa
por ejemplo según el algoritmo de Keller y Dunn (Keller R. y Dunn I.
J. Fed-batch microbial culture: models, errors and
applications. J. appl. Chem. Biotechnol., 28: 508 a 514,
(1978)).
En la fermentación de densidad celular elevada se
incluye el paso de procedimiento del concentrado de la suspensión de
células. Para extraer a continuación los solutos de las células es
recomendable, en primer lugar eliminar gran parte del medio
exterior. Este concentrado de la suspensión de células se puede
realizar especialmente mediante filtración de flujo transversal.
Para ello la suspensión de células se impulsa mediante un
dispositivo de impulsión, como una bomba, a través de un dispositivo
de filtración, por ejemplo un cartucho de filtro.
Las filtraciones de flujo transversal encuentran
variada aplicación desde hace algunos años, por ejemplo:
- -
- en la obtención de enzimas de homogeneizados celulares
- -
- para la cosecha de células tanto de bacterias como de cultivos celulares animales
- -
- en fermentaciones con soportes celulares para el aumento de la densidad celular (densidad del catalizador) y al mismo tiempo purgado del producto (inhibidor) en el filtrado.
Tras la concentración de las células éstas se
exponen a un choque hipo-osmótico. El estrés de
dilución es provocado por ejemplo, por adición de agua destilada
estéril hasta el volumen de partida de líquido del cultivo. Con
preferencia se añade el agua durante un periodo de tiempo de menos
de 30 minutos.
Después de esto se realiza con preferencia una
segunda concentración de la suspensión de células, que se puede
llevar a cabo de forma análoga a la primera filtración. El medio
exterior filtrado desde ahora contiene el producto y es absorbido.
La disolución de producto se puede procesar entonces según los
procedimientos conocidos.
A continuación de esto se practica un choque
hiper-osmótico con preferencia para el control
continuo del procedimiento, en el que además se añade hasta el
volumen de partida una disolución de nutrientes de elevada
concentración con elevado contenido en sal. Se recomienda realizar
la adición en un intervalo de tiempo largo como en la realización
del choque hipo-osmótico.
Tras el choque hiper-osmótico
puede ser ventajoso mantener las células en una fase de regeneración
para facilitar una síntesis completa de los solutos compatibles en
el interior de las células. Después, la disolución de cultivo
celular está preparada para otro ciclo que consta de los pasos de
concentración de las células, choque hipo-osmótico,
filtración de la disolución del producto, choque
hiper-osmótico y fase de regeneración.
Las figuras 1 y 2 muestran representaciones
esquemáticas del control del proceso en el modo de filtración
(figura 1) y en el procedimiento de cuerpo sólido (figura 2).
La figura 1 describe una disposición compuesta
por un fermentador 1, en el que se introduce el cultivo de
bacterias. El fermentador está provisto de un sistema de medida del
enturbiamiento 2, un sistema de medida de la conductividad 80, un
agitador 3 y las conducciones y derivaciones 4, 5, 6 y 7. El
recipiente contenedor 10 está conectado a través de la conducción 4
con el fermentador y además presenta con preferencia una conexión 11
con la unidad de filtración de flujo transversal 20 a través de una
válvula de varias vías, especialmente 3 vías.
Mediante la bomba 8 se recibe el medio a través
de la unidad de filtración de flujo transversal 20 y se concentra el
contenido del reactor. Entonces, a través de la conducción 15 el
medio recibido, a través de la válvula de 3 vías se puede
transportar (posición A) o recoger en al recipiente contenedor 10 y
dado el caso se puede reutilizar tras el procesado (purificación)
(posición C). A través de la conducción de entrada 5 se alcanza
después del choque hipo-osmótico, en el que se
introduce agua hasta que se vuelve a producir el volumen original en
el recipiente de reacción 1. Después, el medio de cultivo desde
ahora osmótico se puede eliminar de nuevo a través de la derivación
7 y la unidad de filtración de flujo transversal 20 y entonces se
transfiere a través de una conexión alternativa de la válvula de 3
vías 30 (posición B) hacia el lado del producto en un recipiente de
recogida 40 correspondiente.
Las relaciones osmóticas originales se pueden
restablecer mediante la adición del medio del recipiente contenedor
10 y/o medio muy salino.
En otra forma de realización que se representa en
la figura 2 el cultivo de cuerpo sólido o lecho fluidificado 60 está
provisto de las conducciones 65, 66. El cultivo 60 consta de los
correspondientes organismos inmovilizados. La conducción 65 está
unida con el recipiente contenedor 70, en el que se almacena la
disolución nutritiva. A través de la conducción 66 se conduce el
medio para el choque hipo-osmótico.
A través de la bomba 8 se puede extraer
respectivamente el medio y según el paso del procedimiento se
introduce en el recipiente contenedor 70 a través de la válvula de 3
vías 30, se recoge y se procesa (posición C) o la disolución de
producto se recoge en la posición B de la válvula de 3 vías. Con
preferencia, en la derivación 7 se disponen dispositivos de medida
como sistemas de medida de la conductividad 80 o fotómetros de
caudal 90 para el control de la salinidad y/o monitorización del
producto.
También pueden ser otras sondas, antenas de
medida. Opcionalmente también se pueden incluir respectivamente
unidades de control.
Ejemplo de
prueba
Biorreactor de 1,5 l: Biostat M (B. Braun,
Melsungen) con componente de medida HE6. En el biorreactor se
recogieron datos de medida a través de un gran número de sondas:
sondas de pH, sondas de pO_{2}, sondas OD, sondas de espuma,
sondas de temperatura y sondas de conductividad. Los datos de medida
se transmiten al segundo componente esencial de la instalación, el
sistema de control del fermentador.
Sistema de control del fermentador:
(Münzer & Dile, Overath), compuesto por un controlador de lote
(para la recogida y digitalización de datos, así como para el
control y regulación de la extensión del proceso) y un ordenador
industrial IBM AT 286 con el programa FAS (software de aplicación al
fermentador) (para la visualización y registro de los datos, así
como para la programación de los controladores del lote).
Filtración de flujo transversal: Unidad de
filtración de flujo transversal Minisette Sanitary Call System con
cartucho de filtración (SS994C02, tamaño de los poros 0,16 \mum,
superficie de filtración 700 cm^{2}, FILTRON, Northborough, MA,
USA).
En este procedimiento sirve la filtración de
flujo transversal de la concentración de la suspensión de bacterias
en el fermentador. La presión en la unidad de flujo transversal se
controla con ayuda de manómetros y se regula mediante válvulas.
Otros aparatos:
- -
- Aparato de medida del enturbiamiento AS 82 y sonda de medida del enturbiamiento AF 44 S (IMA, Neu-Isenburg-Zeppelinheim) según el principio de la medición de la luz dispersa.
- -
- Aparato de medida de la conductividad LF 537 y sonda de medida de la conductividad Tetracon 96 (WTW, Weilheim)
- -
- Bomba peristáltica 2006 (VERDER, Dusseldorf)
- -
- Bomba peristáltica MV-CA 4 (ISMATEC, Glattbrugg, CH)
- -
- 2 bombas de membrana FE 211 (B.Braun, Melsungen).
Disoluciones: Cada fermentación se inició
con 200 ml de cultivo previo y 1000 ml de VVM15 (Medio VREELAND
VVM15 cambiado, modificado: NaCl (145,8 g), KCl (1,0 g),
MgSO_{4}\cdot7 H_{2}O (6,5 g), NH_{4}Cl (3,0 g),
K_{2}HPO_{4} (0,5 g), CaCl_{2}\cdot2H_{2}O (0,01 g),
FeSO_{4}\cdot7 H_{2}O (0,01 g), glucosa monohidrato (11,0 g),
TES (1,0 ml), 1000 ml de agua destilada, pH 7,0 (con HCl 1 N), como
medio de cultivo con 6 g/l de TRIS y HCl 1N tamponado a pH 7,5, TES:
disolución de elemento traza, medio nº 141, DSM 1989).
Para la regulación del valor de pH, durante la
prueba se emplearon NaOH y HCl. Para la realización de la
fermentación de densidad celular elevada y los pasos de choque por
cambio se necesitaron medio FBL (glucosa monohidrato (297,3 g),
NH_{4}Cl (66,9 g), K_{2}HPO_{4} (43,5 g), HCl 1 N (100 ml),
500 ml de agua destilada), y medio KS30 para la regulación de la
salinidad (NaCl (300 g), KCl (2 g), MgSO_{4}\cdot7 H_{2}O (13
g), CaCl_{2}\cdot2 H_{2}O (0,02 g), FeSO_{4}\cdot7
H_{2}O (0,02 g), TES (2 ml), 1000 ml de agua dest., pH 7), así
como agua dest.
Cultivo de lote: El primer paso del
procedimiento fue la introducción de Halomonas elongata en el
biorreactor en el procedimiento de lote. Las condiciones de
fermentación durante la fermentación compacta fueron: pH 7,5, 25ºC,
velocidad de aireación 0,16 l/min de aire, NaCl 15%. La fermentación
de lote se realizó hasta que se utilizó una gran parte de la
glucosa.
La estrategia de alimentación se puede
averiguar según Keller & Dunn.
Se deben buscar los valores apropiados para los
parámetros producidos concentración de biomasa inicial (Xo), volumen
inicial (Vo); la velocidad de crecimiento, el coeficiente de
producción y la concentración de sustrato. El parámetro inicial
concentración de biomasa (Xo) y el volumen inicial (Vo) se averiguan
al final de la fase de lote. El coeficiente de producción Y_{xs}
asciende a 0,5 para el crecimiento de Halomonas elongata en medio
glucosa/sal mineral. La concentración de sustrato S_{in} en el FBL
ascendió a 540 g/l; la concentración de sustrato S en el fermentador
fue al final de la fase de lote cercana a 0 y mediante la estrategia
de alimentación no debería crecer. Por eso se despreció S para el
cálculo de la velocidad de alimentación. El último parámetro inicial
de la estrategia de alimentación, la velocidad de crecimiento, se
determinó empíricamente.
La estrategia de alimentación se programó en el
FAS y la velocidad de alimentación se calculó con ayuda de un compás
de tiempo también programado para cada punto de tiempo de la
fermentación de densidad celular elevada. A través del controlador
de lote se transmitió la velocidad de alimentación a una bomba de
membrana y la disolución de lote de alimentación se bombeó en el
fermentador con la velocidad de flujo correspondiente. Se obtuvieron
densidades celulares de hasta 120 g/l de peso fresco (corresponde a
40 g/l de peso seco).
Concentración de la suspensión de células:
Para extraer a continuación los solutos de las células se tuvo que
eliminar una gran parte del medio exterior. Este concentrado de la
suspensión de células se realizó con una instalación de filtración
de flujo transversal. Para ello se bombeó la suspensión de células
con una bomba peristáltica a través del cartucho del filtro. La
presión en el cartucho del filtro se reguló de manera que a la
salida del módulo del filtro era aproximadamente 0,5 bar menor que a
la entrada. Sin embargo, no debía sobrepasar 3 bar. La duración de
la filtración dependió del estado del cartucho del filtro y varió
entre 30 min para cartucho nuevos y 2 h para más viejos. Para la
duración de la filtración se redujo el número de giros del agitador
en el fermentador a 300 rpm y se paró completamente la entrada de
aire, para evitar la penetración de burbujas de aire en el filtro.
Mediante la filtración el volumen de la suspensión de células se
redujo a 1/5 del volumen de partida (esto corresponde a una densidad
celular de hasta 600 g/l de peso fresco).
Choque hipo-osmótico: el
estrés de dilución fue provocado por la adición de agua destilada
estéril hasta el volumen de partida. El agua se añadió durante un
periodo de tiempo de 10 a 30 min.
Filtración de la disolución de producto:
El segundo concentrado de la suspensión de células se realizó para
separar la disolución de producto de las células. Transcurrió de
forma análoga a la primera filtración, con la diferencia de que el
medio exterior filtrado sólo contuvo el producto. Se pudo obtener
una concentración de hasta 3,7 g de ectoína/l en la disolución del
producto.
Choque hiper-osmótico: el
estrés salino se alcanzó mediante la adición de VM18 (medio
glucosa/sal mineral con 18% (p/v) de sal) hasta el volumen de
partida. La adición se realizó durante un periodo de tiempo de 2 h
con velocidad de flujo constante, de donde resultó un gradiente
temporal en la concentración de sal del medio.
Fase de regeneración: A continuación del
choque hiper-osmótico siguió una fase de
regeneración de aproximadamente 24 h para la síntesis completa de
los solutos compatibles. Durante este tiempo se alimentó la
disolución de lote de alimentación con una velocidad de flujo
constante, de manera que se alimentaron 1,3 g de glucosa por
hora.
Ciclos de choque de cambio: Tras la fase
de regeneración se pudo empezar de nuevo con el choque de cambio
osmótico.
La figura 3 muestra un curso típico del
procedimiento, en el que se han realizado 5 choques de cambio. Los
instantes de tiempo de los choques de cambio individuales se
caracterizan por las flechas indicadas en la figura. En la figura 3
se indican en las abscisas el tiempo en días y en las ordenadas la
masa bacteriana en % de enturbiamiento. Se cultivaron células de
Halomona elongata en una fermentación de densidad celular
elevada.
Claims (2)
1. Uso de hidroxiectoína y/o ectoína como aditivo
efectivo para la crioprotección de células en la industria
cosmética.
2. Uso de
(S)-1,4,5,6-tetrahidro-2-metil-4-pirimidin-carboxílico
(ectoína) o ácido
(S,S)-1,4,5,6-tetrahidro-5-hidroxi-2-metil-4-pirimidin-carboxílico
para la fabricación de una preparación cosmética.
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