JPH05502165A - プロピオン酸をベースにした生物学的混合体を特に工業的規模で製造するための半連続発酵法およびその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プロピオン酸をベースにした生物学的混合体を特に工業的規模で製造するための 半連続発酵法およびその装置 免豆旦１１ １、の１ この発明の分野はプロピオン酸をベースにした生物学的混合体を製造するための 炭酸塩源を半連続的に発酵させる分野に関する。

より詳細には、この発明はプロピオン酸を製造するためのプロピオンバクテリア により基質を半プロピオン発酵させるための方法とその装置に関する。

プロピオン酸およびプロピオン酸塩は抗かび特性を有するものとして知られてい る。これらの物質はパンの製造とビスケットの製造において特に使用されている 。これらの物質は一部はエメンタール（Ｅｍｍｅｎｔａｌ）タイプの調理用硬質 チーズの風味の原理となる。

多くの国で食料品の成分となるプロピオン酸またはプロピオン酸塩が添加剤とし て化学的に製造されている。現在、ある国では法律により人間が消費する食料品 を製造するための合成品の使用が禁止されている。

更に、消費者の多（は合成品より天然品を食品の成分に加えることを好んでいる 。それ故、生物学的な原理による代用品を提案することには価値がある。

生物学的なプロピオン酸はプロピオンバクテリアによる発酵により食料品に取り 入れられている。

発酵が行われることによりほんの少量の酢酸が生ずるが、この酢酸は多用途の保 存薬品となる。

チーズの調理に加えられる天然の製品にはこのように芳香塩基と保存薬品として の２つの機能があり、更にこの天然の製品により製造時間、とりわけ熟成時間の 短縮が図られるが、この熟成時間は特に芳香を発生させる役割をしている。

Ｌ−１困二上Ｉ プロピオン酸を製造するのに特に応用できる発酵の方法として周知の３つの方法 がある二回分発酵、連続発酵、非連続発酵である。しかしこれらの方法は現在と れも以下の理由から工業的規模ではプロピオン発酵として行われていない。

回分発酵は発酵容器に発酵の基質とバクテリアにより生成される接種材料を入れ ることから行われる。例えば、バクテリアを再生する期間の終りに相当する基質 の発酵が終れば、完全に発酵した製品は発酵容器から取り比され、更にバクテリ アは製品から分離される。この方法は発酵容器に新しい基質と新しい接種材料を 入れることにより行われる。バッチ発酵の大きな利点は実現の装置が簡単であり 、分離処理を行った製品の品質が高いことである。回分分離の大きな欠点は発酵 時間、特にプロピオン発酵が非常に長いことである。

発酵に対する他の方法は連続発酵の方法である。この方法では発酵した基質は製 品をバクテリアから分離するため発酵容器から連続的に取り出し、しかも容器に は常に同じ量の基質が含まれているように一定量の新しい基質が発酵培地に連続 的に加えられる。この発酵の利点は製造する製品が連続して得られることである 。しかし連続的な発酵を工業的な規模で行うことは今の所非常に難かしい。

更に、得られた物質を濾過により取り出す時、この方法を行うには一方のフィル タを使用している間は他方のフィルタを清掃するためと、発酵作用の中断を避け るために２つのフィルタ用モジュールが必要である。この欠点は各フィルタのユ ニット価格に対し大きな欠点がある。

連続発酵法は特にウェイマン（ＷＡＹＶＡＮ）他による米国特許出願筒３．０６ ７、１０７号およびチェリアン（ＣＨＥＲＹＡＮ）他によるＰＣＴ出願第８５１ ０１．０６４号に記載されている。

３番目の発酵法は半連続発酵法である。この方法は発酵培地の少なくとも一部が 発酵容器から周期的に取り除かれる間連続的なサイクルで発酵を行うことがら成 り、製造された製品は発酵容器から取り出され、更に取り除かれた量に相当する 量の新しい基質が発酵容器の中に入れられる。必要があれば、ゲル状のバクテリ アを含ませ、石灰、ケイソウ土または炭酸カルシウムのような浸透性または粉末 状の塩基に吸収させることができる。

プロピオン酸の半連続発酵の方法は特にステレス（ＳＴＩＬＥＳ）による米国特 許番号第２．０２０．２５１号に記載されている。この特許では糖みつ、活性ア ルミナおよびベントナイトにより生成される基質の使用を提案している。半連続 発酵は５０％の発酵物質を同量の新しい基質と置き換えることにより行われる。

しかし発酵時間は非常に長く、この場合は７日であるが活性アルミナおよびベン トナイトは触媒のように作用する。

プロピオン酸の半連続発酵に関する他の特許はステレス他による米国特許番号第 １，９３２，７５５号であり、この特許では発酵の速度を早めるためプロピオン バクテリアに乳バクテリアを加えることを提案している。しかしこの場合も発酵 は非常に長く、この方法で多量のプロピオン酸を製造することは期待できない。

プロピオンの製造に関する文献（アプライド　アンド　エンバイロメント　マイ クロバイオロジイ、１９８６年２月、ｐｐ、　４２７−４２８、ｖｏｌ　５１． 　Ｎｏ、２　；アプライドマイクロバイオロジイ　アンド　バイオチクノロシイ 、１９８７年、２５、ｐｐ、　４３４−４３７　；ジャーナル　オブアプライド バクテリオロジイ、１９８９年、６６、ｐｐ、　１７５−［１４）の全ての記載 にはプロピオンバクテリアの再生の速度が遅いことによる問題点がある。

プロピオン発酵に対しては工業的な競争が少ないが、これは次の理由による： （１）　プロピオンバクテリアの増殖の速度が低い；（２）　通常の成長のサイ クルの終りで得られる細胞の濃度が低い： （３）１伏時間が長い： （４）　品種の再生要素が大きくなることによりバクテリア汚染に対する抵抗が 低い。

この理由により、既知の方法では触媒剤または乳バクテリアで培養菌を作ること によりプロピオンバクテリアの新陳代謝を刺激することの他に、特に他の品種を 使用することを提案している。

この方法は実際にはプロピオンバクテリアにより限定されて作られたバイオマス を用いた工業的な条件のもとでは多量の生物的プロピオン酸を製造する基準を満 たさない。

この発明の目的は特にこれらの欠点を解決することである。

より詳細には、この発明の１番目の目的は工業的に利用できるプロピオン酸を発 酵させる方法および装置を提供することである。

この発明の他の目的は、例えば再生スピードが遅（しかも併発バクテリアにより 培地の感度が劣化するようなプロピオン発酵に対する種々の欠点および制限を解 決する方法および装置を与えることである。

この発明の他の目的は、発酵培地の測定（ｐＨ１温度等）を容易にする発酵装置 を提供することである。

この発明の更に他の目的は、製造量例えばバクテリアに対し塩基を使用しないで 単位量および単位時間当たりのプロピオン酸の量を増やすため細胞の濃度を増や すことである。

二ＩＩＬ杓 これらの目的は他の目的と同じく以下の説明により明らかになり培地の半連続発 酵法により達成されるが、この培地は炭酸塩源、特にプロピオンタイプで接種材 料のバクテリアから製造されたバイオマスを用いたプロピオン酸塩基生物学的混 合体を工業的規模で製造するための乳糖塩基物質から構成されており、前記の方 法は発酵／取出しの連続サイクルを実施することから成るが、各サイクルには次 のことが含まれている： （１）　前記のバイオマスが閉じた環境内で前記炭酸塩源の新しい部分と相互作 用を及ぼしている発酵の第１段階； （２）次の発酵のサイクルの間、前記の製造された生物学的混合体を周期的に引 出すことと、生物学的混合体を製造するため接種材料から製造されるバイオマス をリサイクルするための第２段階。

（３）１番目の連続した発酵／取出しサイクルにより形成される１番目の期間で 、所定量のバイオマス（Ｘｌ）が得られるまで、前記プロピオンタイプのバクテ リアから成るバイオマスの成長を確実に行うように設計され、全てのバイオマス があるサイクルから次のサイクルまでリサイクルされる；（４）２番目の連続し た発酵／取出しサイクルにより形成される２番目の期間で、前記バイオマスの量 をバイオマスの対応した部分のみリサイクルすることによりほぼ所定量の（Ｘ、 ）に保つことが行われる。

好ましい実施例では、前記の発酵の段階から前記の取出しの段階への移行は前記 のプロピオン酸塩基生物学的混合体を製造する出力量を最大にすることと、前記 プロピオンタイプバクテリアの成長速度を最大にすることから成るグループに属 する基準の１つを最適にするように行われる。

好都合なことに、前記の発酵の段階から前記の取出しの段階への移行が行われる のは次の基準の少な（とも１つが満たされた時である： （１）残留炭酸塩源が、導入された炭酸塩源の１０％より少ない時で５％未満で あることが好ましい；（２）作られたプロピオン酸の濃度が炭酸塩源の初期の濃 度の約４０％のスレッショルドを越える時。

酸濃度がスレッショルドを越えることはｐＨを保つため生物学的混合体に中和剤 を加える速さをモニタすることにより検出することが好ましい。

この発明によれば、バクテリアの濃度と、発酵培地の酢酸およびプロピオン酸と の両方または一方は、前記サイクルの少なくとも１回取出し段階の部分と発酵段 階の部分の両方または一方の間、少なくとも一度所定の抗バクテリアスレッショ ルドを越えることが好ましい。

この発明は更に発酵基質を循環させるため次の２つの外部ループを有する発酵容 器により構成される方法に適応できる装置にも関する： （１）　発酵基質を撹拌するループで、前記の発酵の容器から前記の発酵基質を 取り除き、前記の発酵基質を前記の発酵容器の中に再度入れること；（２）前記 の製造されたプロピオン酸塩基の生物学的混合体を取り出すループで、製造され た生物学的混合体をバクテリアから分離するモジュールを含む； 更に前記発酵基質の循環に対し半連続発酵法の作用として制御される前記ループ の一方に交互に選択的にルートを決める装置から成る。

この発明による方法は多量にバイオマスを製造するため使用することと、更に例 えばこの方法の２つの期間の最初の期間を実施するため最適期間を使用すること に対し好都合である。更に２番目の期間の間、この方法を実施することにより独 立に使用できる過度の量のバイオマスを各サイクルで回収できることに注目する 必要がある。

の　な・ 本発明の他の特徴は、添付図面を参照した下記の説明により明らかとなる。ここ で、 第１図はこの発明による装置の好ましい実施例を示す。

第２Ａ図は第１図のプロトタイプの装置で２５０時間測定したバイオマス濃度の 値の変化を示し、これにより所定のバイオマスの量Ｘ、が得られる。

第２Ｂ図は第１図のプロトタイプの装置で２５０時間測定したプロピオン酸の値 の変化を示し、これにより所定のバイオマスの量Ｘ１が得られる。

第３図はこの発明により実現されるバクテリア制御の原理を示すため、発酵培地 内のプロピオン酸の濃度により微生物汚染剤の成長のコースを示す。

支土旦 以下図面に基づきこの発明を更に詳しく説明するが、この発明はこの実施例には 制限されない。

第１図にはプロピオン酸塩基生物学的混合体を製造するためこの発明による装置 の好ましい実施例を示している。脱たんぽ（質炭酸塩源１は強化モジュール２に 入れられ窒素補充物３と一緒にされる。その結果得られた培地３は殺菌４され、 ポンプ５により発酵容器６に入れられる。発酵容器６は底が円錐で断熱用被覆材 の容器であり、回転撹拌器を有しないことが好都合である。

容器６にはプロピオンバクテリアから成る接種材料７の供給装置がある。若干過 圧状態で動き、アネロビック（ａｎｅｒｏｂｉｃ）状態に近づけるため、窒素２ ０は発酵容器６のドームの中に吹き込まれる。

容器６には更に中和剤を入れる装置６があることが好ましく、この中和剤により 発酵培地８のｐＨは一定レベルに保つようにされている。

発酵は接種材料が容器６に入れられた培地２７に加えられた時開始する。

発酵容器６の中にある発酵基質８は撹拌ループ９と呼ばれる１番目の外側のルー プ９により一定に撹拌される。２つのバルブ１２．１３により連続的に循環され 通路Ａに沿って回収される。容器６の中にある発酵基質８の一部は撹拌ループ９ に向かって容器６の低い部分からくみ上げられ１０、発酵培地に再度入れられる 。泡が過度に生じないようにするため、培地はチューブ１１を通り発酵容器６の 中に戻るが、このチューブ１１は発酵培地のレベルより下に入れられている。

この循環により発酵培地に撹拌が生ずる。攪拌ループ９があることにより取扱い の間、人間かまたは洗浄が難かしい撹拌器があることにより生ずる攪拌処理に対 する汚染の危険を取り除（費用を減少させることができる。更に、撹拌器は比較 的費用が高く、しつかり密封する問題が生ずる。

撹拌ループ９により更に容器６の外側で部分１８の上にｐＨ１４、温度１５、バ イオマスコンテント２８のセンサを設定できる。

ｐＨはガス状または液体状のＮＨ４、更には他のあらゆるガス状または液体状の 中和剤（ソーダ、炭酸カリウム、石灰、カセイソーダ、等）を加えること１６に より約６．５の値に保たれる。

温度は加熱または冷却を行う管状の熱交換器１７により、更に必要ならば外側の ループ９．１９の共通部分１８を循環させるものにより２０℃から４０℃の間、 できれば３０℃に保たれる。２番目のループ１９の役割の詳細は以下に記載する 通りである。

バイオマスコンテント測定センサ２８は発酵容器６のプロピオンバクテリアの濃 度を確かめるのに使用される。

撹拌ループ９があることによりセンサ２８を設置できることに注意する必要があ るが、この種のセンサを取付けることができるのはオンラインであるからである 。実際今の所、混濁度を測定するため発酵容器内に取付けられる測定センサはな い。

容器６は簡単な幾何学的形状を取ることができ、膨張することなく、また発酵容 器の内側にセンサを置くことに必要な平坦な形を有することができる：これによ りセンサと撹拌器を有した容器よりも価格が安くなる。

他の利点は例えば汚れが生じた時、センサ１４．１５をきれいにすることができ る点にある。殺菌剤をセンサ１４．１５を含んだチューブ１８の中で圧力をかけ て簡単に循環させることによりセンサをきれいにできる。

その他の利点は発酵容器６での処理の間、測定を行うため容器６への直接の作用 を避けるため、汚れの危険を減少させることである。

この発明による方法の実施にはプロピオンバクテリアに対する塩基の存在が必要 でないことが判る。これにより容器６の単位体積当たりのバイオマスコンテント 値が高くなる。

通路Ａに沿って発酵基質８を循環させることは以下に説明する発酵の１番目の段 階に対応している。

この発明により行われるサイクルの２番目の段階は混合体２１からバクテリア２ ３を取出すことから成る。このようにすることにより、バルブ１２（第１図）に より取り出された製品は容器から、濾過モジュール２２を有する取出しループと 呼ばれる２番目の外側ループ１９の方向に向かう。

容器から取り出された製品は通路Ｂに沿って流れる。濾過モジュール２２により 得られた混合体２１からバクテリア２３が分離される。このモジュールは薄膜の 形態の種類（平面、中空ファイバ、管状等）、使用した薄膜、得られた製品によ り限外濾過モジュールである場合もあるし、精密濾過モジュールである場合もあ る。

混合体２１は回収され、バクテリア２３はバルブ２４の位置により発酵容器６の 全体か、または一部の中でリサイクルされる。バルブ１３はバクテリア２３のリ サイクルが容器６の中で行われるような位置にある。

リサイクルされないバクテリアは装置の比０２６で回収される。この発明による 発酵装置の構造に対する著しい利点は濾過モジュール２２が運転状態でない時、 すなわち細胞の成長期間（Ａに沿って循環）、きれいにされ、磨かれ、または消 毒されていることに注目する必要があるが、この時撹拌ループと共通の転換バル ブ１２があることにより、発酵の処理が妨害されることはない。

バルブ１２．１３．２４は発酵および取り出し段階が以下に記載する半連続発酵 法に応じて交互に変わるように動く　。

発酵は炭酸塩源に対して行われる。この炭酸塩源は特に乳糖のようなミルク誘導 体である。乳糖には乾燥状態の乳液たんばく質を１４％まで含有する利点があり 、これは洗浄後の使用が非常に経済的になる見込みを有している。

この理由は、この発明の好ましい実施例によれば、プロピオン発酵は限外濾過に よりタンパク質が取り除かれた乳糖１について行われるが、この乳糖にはバクテ リアを生存させるため僅かな窒素補充３が行われる。

好都合なことに、浸透物は特にフリーアミノ酸またはペプチドの形で２０％から ６０％の窒素物により形成された補充物３により０．５％から１％の割合（重量 ／重量）で濃縮２される。

これらの窒素物は例えば刻んだ藻の水、コーンシード（ｃｏｒｎｓｅｅｄ）洗浄 水の溶解エキス、または他のあらゆる窒素補充物（イーストのエキスまたは加水 分解物、動物性または植物性タンパク質の加水分解物、等）である。

例として全体の構成は次の通りとなる 更に乳酸化したミルクにより得られる乳糖を使用することには利点がある。これ は、発酵培地に乳酸塩があることによりバクテリアの成長に好ましい影響を及ぼ すからである。

全ての発酵方法に対して、基質には腐敗バクテリアを乗せる必要がある。この殺 菌処理４は種々の方法、特に薄膜の上に濾過４により行われるが、これによりバ クテリアが保たれる。これにより熱処理が標準的に行われている間に生ずる基質 の変性を避けることができる。出願にあたり作ったサイズグレーディングスレッ ショルドがほぼ０．２２ミクロンである精密濾過は適当なものである。

ポンプ５により殺菌基質が予め殺菌された発酵タンク６の中に入れられる。

１番目の発酵サイクルを行うため、接種材料７は容器６の中にある基質８に加久 られる。接種材料７はプロピオンバクテリアから構成されている。プロピオンバ クテリアには炭酸塩源８（基質）をプロピオン酸、酢酸およびＣＯ□に変換する 作用がある。

プロピオン酸を製造する為広く用いられている品種にはブロビオンバクテリアシ ャーマニイ（ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）とフロイデンライハイ（ｆｒｅｕｄｅｎｒｅ ｉｃｈｅｉｉ）がある。この発明を実施する好ましいモードは基質８の発酵に対 しブロビオンバクテリアテオニイ（ｔｈｅｏｎｉｉ）を使用することから成る。

しかしプロピオンバクテリアの他のあらゆるタイプの品種もこの発明の実施に使 用できる。

第２Ａ図と第２Ｂ図はこの発明の方法の基本的な特性を示すのに使用される。こ れらの図は２５０時間にわたり測定したバイオマス濃度３】（第２Ａ図）と、そ れにより作られたプロピオン酸１度３２（第２Ｂ図）の値の変化を示しており、 これにより所定量のバイオマス（Ｘ＋）が得られるが、この量を越えては種の製 造はもはや行われない。

第２Ａ図と第２Ｂ図の曲線には定性的な値を本質的に有してる；これらの曲線は 非最適状態で局所的に行われるトライアルに対応している。他のトライアルは以 下に示すが良好な定量的状態と、炭酸塩源、バイオマス等が加えられた良好な濃 度に特に関して行われている。

この発明による発酵には次の２つの期間に分けられる連続した３つの段階がある ； （１）バイオマス（３０＋３３１の成長に対する１番目の期間； （２）一定の規則によるモード（３４）で処理される２番目の期間。

１番目の期間（３０＋３３）は連続した２つの段階に分けられる。１番目の段階 （３０）は発酵容器への注入に対応しているがこの容器は発酵の全ての処理に役 立っている。原理的には、いかなる接種材料も発酵培地に加えられる必要がない 。発酵容器は例えば７％から１０％までが好ましいが３％から１５％の割合（容 積／容積）でバクテリアが入れられると発酵が開始する。

第１段階３０は不連続発酵の段階である。この段階は期間ｔ１の期間、前述の例 では７０時間続く。潜伏期間りはプロピオン発酵の特性により定まるが、この期 間に注意する必要がある。

１番目の期間（３０÷３３）の第２段階（３３）は期間ｔ１から始まり期間ｔ６ まで続く。

期間ｔ１の終りで、容器６の中にある容器８の一部は取り除かれ、バクテリア２ ３のリサイクルで得られる（プロピオン酸＋酢酸）混合体２Ｉを取り出す処理が 行われる。

この取り出しは種々の方法、特に次の方法で行われる： （１）濾過（限外濾過または精密濾過）（２）遠心分離 （３）溶媒による化学的分離 成分エレメントの取り出しは限外濾過２２により行われることが好ましい。

得られた濾過液２１にはプロピオン酸を含んだ混合体があり、濾過の残留物２３ にはプロピオンバクテリアがある。この残留物２３は２番目の段階（３３）の各 サイクルの中にあるが、発酵容器６の中で完全にリサイクルされ発酵培地６の中 でバクテリアの濃度が増加し、更に次の発酵に対する接種材料の役目をする。こ のリサイクルはバルブ１３と２４を通して行われる。新しい基質２７の量は収集 された混合体２１の量に等しいが、発酵容器６の中に入れられ、発酵処理が再開 される。

いかなる取り出し操作でも、プロピオンバクテリアにより発酵容器６の中にある バイオマスの濃度が増加（Ｅ）する。新しい基質２７を入れることによりこの濃 度は減少する（Ｆ）。

この処理は３回から５回繰り返されるが、容器６の大きさと、装置の未使用の容 積の大きさにより更に多くの回数が繰り返される。第２図の例では、この操作は 期間ｔ２、ｔ５、ｊ４．ｔｓで繰り返され、各期間は発酵容器６の部分排出と、 フィルタ内で持続するバクテリアの全サイクルに対応している。

１番目の期間（３０＋３３）の第２段階（３３）は一連の連続したサイクルによ り構成され、バクテリアの濃度が増加するサイクルと製造された酢酸およびプロ ピオン酸を取り出すサイクルが交互に行われる。原理的には（必ずこのようにす る必要はない） ｔｔ＞　（ｔｚ　ｔｔ）　＞　（ｔｓ　ｔｚ）　＞−−−＞　（ｔｓ　ｔｓ）と なる。

容器６の中でバクテリアの全体または部分的なリサイクルは例えばバイオマスコ ンテントを測定するセンサ２８により与えられる測定により自動的に行われる。

プロピオン酸を含む混合体２１は蓄積され濃縮される。好都合なことに、濃縮液 はたんばく質、マルトデキストリン（ｍａＬｔｏｄｅｘｔｒｉｎｅ）、でんぷん 、または他のタイプの塩基を有した状態で乾燥される。

プロピオン酸は更に混合体から取り出され、きれいにされる。

一定数のサイクルの終りに、第２Ａ図と第２Ｂ図の例では６サイクルの終りにバ イオマスの濃度は４５ｇ＃２から５５ｇ／Ａの間が好ましいが、３０ｇ／４２か ら６０ｇ＃２の範囲の値Ｘ１を取るが、この値を越えると製造はもはや行われな い。

次に２番目の期間（３４）　（第３段階）が生ずる。この段階にはバクテリアの 部分的なサイクル以外のものを行うものは何もない。これは分離２２で得られた バクテリア２３の一部分２６が発酵容器６の中ではもはやリサイクルされないこ とを意味しており、バクテリアの濃度は所要の最適濃度ｘ１に近い値に保たれる 。この濃度Ｘ、は抗バクテリアスレッショルドより大きくすることが好ましい。

この２番目の期間（３４）の間では各サイクルの期間はほぼ一定で非常に短かい 。期間ｔ６がら後方に向かい、発酵／取り出しサイクルはほぼ一定であり（ｔ７ ｔｓ）七（ｔ、１−ｔｔ）である。汚れが現われるまで、または品種の活動が少 なくなるまでいつまでも続く　。

非リサイクルのバクテリアにあるバイオマスは例えばこの発明による他の装置で は接種材料として働くことができ、または後述の例２に記載するように使用でき る。

各サイクルにおいで発酵の段階から取り出しの段階への移行は、特に生物学的混 合体２１の出力またはバクテリアの成長速度のいずれかを最大にするため、所定 の作用論理に従って行われる。

より詳細には、前記の発酵段階から前記の取出し段階への移行は次の基準の少な くとも１つが満たされる時打われることが好ましい： （１）残留炭酸塩源コンテントが入れられた炭酸塩源の量の１０％より小さく、 できれば５％より小さいことが好ましい； （２）製造されたプロピオン酸の濃度が炭酸塩源の初期の濃度の約４０％だけス レッショルドを越える。

各サイクルのスタートでは、炭酸塩源は液体培地の反応に対する所定の濃度によ り供給される。

炭酸塩源は効果を抑圧する最初の成長の間、バイオマスを余分に取らないように 最初は低い濃度で供給される。

好都合なことに、各サイクルで入れられたそれぞれの量の炭酸塩源の濃度は次の レベルを有している（１）はぼ３５ｇ／ρから４５ｇ／ρの間で、前記１番目の 期間３０．３３の少なくともスタートに対するもの。

（２）できれば６５ｇ／ｆｆから８０ｇ／βまでが好ましいが、６０ｇ／βから １．１０　ｇ／ｊ２までの間で少なくとも前記２番目の期間３４に対するもの。

入れられた炭酸塩源の９０％から９５％まで消費されると、プロピオン酸の製造 曲線３２はそれて、２番目の取り出し段階へ移行する瞬間を示す兆候を生ずる。

製造されたプロピオン酸の量を測定することは、発酵の段階から取り出しの段階 への変化に対するスレッショルドとして使用される。バクテリアの品種に対して 、トライアルとして使用したプロピオン酸菌は入れられた１００ｇの炭酸塩ａ（ 乳糖）により最大約４５ｇの酸が得られることが実験的に確かめられている。こ のバクテリアの品種は最良の変換レートを有する品種の中から選ばれる。発酵段 階から取り出し段階への変化は例えばプロピオン酸濃度が４７％が好ましいが炭 酸塩源の最初の濃度に対する４０％のスレッショルドを越える時打われる。

発酵培地内のプロピオン酸と酢酸の両方または一方の瞬間の濃度に追従させるた め、例えばクロマトグラフ法（ＨＰＬＣタイプの）のような直接法を使用するこ とができる。これらの方法はしばしば煩わしく、リアルタイムで実施することが 難かしい。むしろ、使用できる方法は中和剤１６を容器に入れる曲線をトラッキ ングする方法である（第１図参照）。中和剤は発酵培地のｐＨをほぼ一定の値に 保つのに使用される。酸の製造が停滞し始めると（曲線３２からそれると）、中 和剤を入れる速度は減少し、取り出し段階への転換がスレッショルドを適応する ことにより行われる。

この発明による方法により抗バクテリアスレッショルドを越えることが可能な限 り早くなる。この抗バクテリアスレッショルドは発酵基質がプロピオンバクテリ アの成長速度より大きい成長速度を有した非プロピオンバクテリアにより汚され るスレッショルドより低い。

抗バクテリアのスレッショルドは次の基準の少なくとも１つが実証される時越え る： （１）プロピオン酸菌タイプのバクテリアの濃度はあるスレッシシルトを越える 時、すなわち約４０ｇ／ｆ２のオーダーの時； （２）培地内のプロピオン酸の濃度があるスレッショルドを越える時、すなわち 約２０ｇ／βのオーダーの時。

この発明によれば、抗バクテリアのスレッショルドのいずれか一方、すなわちバ クテリア濃度のスレッショルドか、または製造されたプロピオン酸の、濃度のス レッショルドのいずれかが取り出しの段階の一部分の間、できれば少なくとも１ つのサイクルの間の発酵の段階の一部分の間に、少なくとも越える必要がある。

第２Ａ図に示すスレッショルド３５ば２５ｇ／Ｉ２より大きくすることが好都合 であり、できれば４０ｇ／ｊ２より大きくすることが好ましい。実際、このバイ オマス濃度を越えると、プロピオンバクテリアは併発バクテリアの成長を受ける ことが少ない。

この発明の好都合は特徴の１つは、バイオマス濃度が各サイクルの取り出しの段 階の間、頻繁に非常に高レベルになることである。併発バクテリアに対する殺菌 効果は最大となる。

同様に第２Ｂ図において、２０ｇ＃２の領域内にスレッショルドをプロットする ことができるが、このプロットは以下に特に示すようにプロピオン酸濃度に対応 しており、この濃度を越えて抗バクテリア効果が検出される。第２Ｂ図で行われ しかも第２Ｂ図に示されるトライアルにおいて、プロピオン酸は実験の状態によ り２０ｇ／ｆｆのスレッショルドを若干越えて製造される。これに対応するトラ イアルは炭酸塩源の添加が少ない状態で行われている。これらの実験の状態によ り非常に多量に製造することができ、しかも以下に述べる例２の表に示すように 特別に製造することができる。

他のトライアルも実施したが、その中で炭酸塩源の供給は若干高くバイオマスの 成長段階では４０ｇ／ｆｆから５０ｇ／ρのオーダーであり、安定段階（期間３ ４）では９０ｇ／ｆ２にもなる。プロピオン酸の製造に対し、３０ｇ／Ｉ２を越 える濃度、更には４０ｇ／βのオーダーの濃度まですることができる。抗バクテ リアスレッショルドはかなりオーバーしでいる。

第３図にはこの発明の方法によるバクテリア制御特性の原理を示しており、この 基準には製造されたプロピオン酸の濃度の基準を使用している。図は微生物の汚 染剤の成長における変化を調べる実験室での実験に対応しており、この変化は発 酵の培地、調整されたｐＨを有する培地のプロピオン酸の濃度に基づいている。

微生物汚染剤としてはストレブトココス（ｓｔｒｅｐｔ。

−ｃｏｃｃｕｓ）乳糖がある。この汚染剤はしばしばプロピオンバクテリアの発 酵サイクルで使用されている。

ｙ軸は微生物汚染剤の成長に対して行った測定に対応した数　（ｍ４２当たりの 生存セルの数）であり、ｙ軸は時間で目盛っである。プロピオン酸のないストレ ブトココス乳糖微生物の成長は曲線４０で示している。この曲線は中性培地内で の微生物の成長の変化を示しており、参考文献の曲線に対応している。

１０ｇ／ρ、２０ｇ／９．．３０ｇ／尼、４０ｇ／ρの濃度のプロピオン酸がそ れぞれあることにより微生物の成長が遅くなる。

曲線４１には約１０ｇ／、９の濃度のプロピオン酸に対する微生物の成長が遅く なることを示しており、併発バクテリアの量は６ないし７時間後に減少し始める 。

２０ｇ／β（曲線４３）から後方では、バクテリオスタティック（ｂａｃｔｅｒ ｉｏｓｔａｔｉｃ）効果が直接生ずる、すなわちプロピオン酸の濃度が十分あり （微生物または他の）汚染剤の成長が妨げられる。数字間接に、有効バイオマス の濃度は殺菌性を帯びる。

曲線４２は約３０ｇ／ｎのプロピオン酸の濃度に相当している。

３０ｇ／ｌの濃度により２０ｇ／ｌの濃度で得られる製品に近い結果が得られる が殺菌効果を得る時間が減少している。

曲線４４は４０ｇ／ρの濃度に相当しており、殺菌効果を直接得ることができる 。

以下の例は発酵培地の量が５００ｍρから７５０リツトルまでの基質の殺菌およ び接種について記載している。

（１）　５００ｍｎ狭ロフラスコと６リツトルの容器これらの容器にはそれぞれ ２５０ｍｊ２と３．５リツトルが入っている。培地のｐＨはソーダ４Ｎで調整さ れてから圧力がまで、狭口フラスコに対しては１１５℃で２５分間、容器に対し ては１２０℃で３０分間処理される。

培養は毎日ｐｕの調整液で若干振りながら３０℃で行われる。接種材料は５０時 間から７０時間かけた培養を１０％の割合で加えられる。

（２）２リツトル発酵容器 加熱殺菌するため、１リツトルから１．６リツトルの培養基を含んだ発酵容器は １１５℃で３０分間圧力がまで処理される。

冷殺菌に対しては、１リツトルの水を含んだ発酵容器は最初１１５℃で３０分間 圧力がまで処理され、次に殺菌した窒素圧力を加えて排水する。最後に限外濾過 培地または精密濾過培地は殺菌反応装置を通る。

シーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）は４０時間から６０時間培養の１０％の割合（ ｖｏｌ／ｖｏｌ）で行われる。

発酵の条件は３０℃、１５０ｒｐｍ％ｐＨ６，５でありＮａＯＨ４Ｎ、　ＮＨ４ ＯＨ、ガス状のアンモニア、または他の塩基により調整される。

（３）　７５０リツトルの発酵容器 培養基は薄膜で濾過されるが、この薄膜の壁には直径が０．２ミクロン以下の細 孔があり、この壁は発酵容器に入っているが、この容器は予め害虫が駆除され１ ０２℃で３０分間殺菌されている。

接種材料は有効容積が５００リツトルに対し５０リツトルの割合で加えられた４ ０−５０時間培養体、できれば４５時間培養体である。この材料は２リツトル発 酵容器と同じ条件で準備され、加熱殺菌されている。

培養体の条件は３０°Ｃ，ｐＨ６，５で濃縮塩基により調製されている。

発酵に対する次の３つの例はこの発明による発酵法に関している： 例１、回分培養：参照法： ２リツトルの発酵容器には５％の乾燥材で限外濾過された１、１　リットルの酸 乳糖を含んでおり１％の刻み１水が補充され１１５℃で３０分間殺菌される。

培地は同一の培地に予め培養された６０時間培養体を１００ｍ　Ｑ用いて接種さ れる。

７０時間後に、乳糖は全て消費され１７．８ｇ／ρのプロピオン酸と７．１　ｇ ／ｆ２の酢酸が作られる。

２５時間から４０時間までの間で得られる最大量はプロピオン酸に対し０．４０ ｇ、　ｆｆ　−’ｈ−’　となる。プロピオネート／アセタートの比は発酵の終 りで２．５である。

例２・品種が純粋である半連続培養体ニア５０リツトルの発酵容器の中で６５０ リツトルの°“回分゛は酸乳糖で作られ、１％の刻まれた１水が補充され、０． ２ミクロンの穴があいた薄膜で精密濾過することにより殺菌されている。

反応体は予め同一の培地の中で培養された５０リツトルに５５時間かけた古い培 養体により種がまかれ、１１５℃で２５分間殺菌される。６０時間の培養の後、 １番目の細胞／培地の分離が生ずる。１８．８ｇ／ｆ２のプロピオン酸と８．５ 　ｇ／ρの酢酸を含んだ５５０リツトルの培地が集められるが、細胞は全体が発 酵容器の中でリサイクルされている。１％の１水を含んだ５５０リツトルの新し い培地は冷殺菌の後に反応体に加えられる。その後、この操作は２４時間毎に繰 り返される。

３００時間後、細胞の濃度は５０ｇ／ρとなる（乾燥材により表わされる）。こ の後、各サイクルの終りでバイオマスの一部は残留レベルをきれいにすることに より除去され、４０ｇ／βと５５ｇ／ｆｆの間に濃度が保たれる。

この１縮された細胞の懸濁液はチーズ状に作られたイースト（エメンタール（Ｅ ｍｍｅｎｔａｌ）タイプの固く調理されたチーズ）として、またプロピオテック ス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）として、更には動物のえさ、あるいは液体懸Ａ　１ （ＪＦの形としてプロピオンバクテリアのバイオマスに対する他の用途として、 または防腐処理（乾燥、冷凍、凍結乾燥、または微生物の細胞を保存する他のあ らゆる手段）の役に用いられる。

３００時間を越えると、半連続培養体は無制限に広がり、汚れが生ずることによ り、または品種が改良されなくなる時に中断される。

得られた結果を次の表に示す； プロピオン濃度は各細胞のリサイクルの間６ｇ／ｆｆから１８−１８−２Ｏまで 変化する。プロピオネート／アセタートの比は３００時間の半連続培養の後２倍 になる。

標準的なバッチ発酵と比較すると、容積の生産性と同じ（細胞の濃度は係数を６ として増加するが種の生産性に注目すべき減少がなく、これが保持されるのは乾 燥細胞／時間に対するプロピオン酸／ｇが０．０５５ｇの領域である。

この発明を実施した方法により得られる製品の構成の例をｇ／１００ｇの表示で 次の表に与える例３：混合培養体中の半連続培養体： 例２に記載した方法に従って乳糖の発酵はコーンシード（ｃｏｒｎｓｅｅｄ）の 洗浄水の溶解エキスが補充されるが、これはプロピオン酸菌ソエニ（Ｐｒｏｐｉ ｏｎｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｔｈｏｅｎｉｉ）とラクトバクラスケイセイ（Ｌａｃ ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）　との共同培養により行われる。ラクトバク ラスケイセイがあることによりプロピオン酸菌の活動が刺激される。他の乳バク テリアまたはプロピオンバクテリアの新陳代謝を刺激する他の微生物を使用する ことが理解できる。

要　約　書 この発明はプロピオン酸をベースにした生物学的混合体を製造するための炭酸塩 源を半連続的に発酵させる技術に関する。開示された装置は、発酵基質を循環さ せる２つの外部ループをもった発酵容器を有し、ひとつのループは発酵基質を発 酵容器から取り出しそして発酵容器の中に再入して撹拌し、ひとつのループは製 造されたプロピオン酸塩基生物学的混合体を取りζし、製造された生物学的混合 体をバクテリアから分離するモジュールを含む。完成した方法は、半連続形で、 バイオマスの一体リサイクル及びバイオマスの所定の濃度に達した後の部分的リ サイクルによる連続的な発＃／取出しサイクルの連続により構成される。

図１ 国際調査報告 １″＋′ｆ″ｍ１ｌｏｎｅｌＡｅｏｋ＋１ｌａｓ）Ｉｓｐ、■、「ｐｑ、、ｎ、 、、ｎ。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）プロピオン酸菌タイプのバクテリアの接種材料から作られたバイオマスを 用いてプロピオン酸をべースにした生物学的混合体を工業的規模で製造するため に、炭酸塩源特に乳糖ベースの物質から成る培地を半連続的に発酵させる方法で 、前記の方法は連続した発酵／取出しのサイクルを実施することから成り、サイ クルのそれぞれは次のことから構成されている： （１）前記のバイオマスが閉じた環境内で前記炭酸塩源の新しい量と相互に作用 を及ぼしている間の発酵の第１段階； （２）次のサイクルの発酵の段階の間に生物学的混合体を製造するため前記の製 造された生物学的混合体から周期的に取り出すためと、接種材料から作られたバ イオマスをリサイクルさせるための第２段階、 前記の方法は更に次のことから成る： （１）１番目の連続した発酵／取出しサイクルにより形成される１番目の期間で 、所定の量のバイオマス（Ｘｉ）が得られるまで前記のプロピオン酸菌タイプの バクテリアにより作られるバイオマスの成長を確実なものにするため計画され、 バイオマスは全体があるサイクルから他のサイクルヘリサイクルされている、（ ２）２番目の連続した発酵／取出しサイクルにより形成される２番目の期間で、 バイオマスの対応した部分のみリサイクルすることにより前記のバイオマスの量 を前記の所定の量（Ｘｉ）に保つ。 （２）前記のバイオマスの量Ｘｉが３０ｇ／ｌから６０ｇ／ｌの間で、できれば ４５ｇ／ｌから５５ｇ／ｌの間が好ましい請求項１に記載の方法。 （３）前記の取り出しの段階が次の方法の少なくとも１つの手段により行われる 請求項１に記載の方法：（１）濾過（限外濾過または精密濾過）；（２）遠心分 離； （３）溶媒による化学的分離。 （４）各サイクルで入れられた炭酸塩源の濃度が次の通りである請求項１に記載 の方法： （１）前記１番自の期間の少なくともスタートでほぼ３５ｇ／ｌから４５ｇ／ｌ までの間； （２）少なくとも前記２番目の期間に対し、６０ｇ／ｌから１１０ｇ／ｌの間で 、できれば６５ｇ／ｌから８０ｇ／ｌまでの間。 （５）前記の発酵の段階から前記の取り出しの段階への移行が、前記プロピオン 酸をベースとした生物学的混合体の製造出力量を最大にすることと、プロピオン 酸菌タイプのバクテリアの成長速度を最大にすることから成るクループに属する 基準の１つを最適にするために行われる請求項１に記載の方法。 （６）前記の発酵の段階から前記の取り出しの段階への移行が次の基準の少なく とも１つを満たす時行われる請求項５に記載の方法： （１）残留炭酸塩源コンテントが入れられた炭酸塩源の量の１０％未満であるこ と、できれば５％未満が好ましい、 （２）作られたプロピオン酸の濃度が炭酸塩源の最初の濃度の約４０％のスレッ ショルドを越える。 （７）酸濃度がスレッショルドを越えることを、ｐＨを保つため中和剤を生物学 的混合体に加える速さをモニタすることにより検出する請求項６に記載の方法。 （８）バクテリアの濃度と、酢酸および発酵培地内のプロピオン酸の濃度との両 方または一方が、取り出し段階の一部と前記サイクルの少なくとも１つの発酵の 段階の一部との両方または一方の間に少なくとも一度所定の抗バクテリアスレッ ショルドを越える請求項１に記載の方法。 （９）前記の抗バクテリアスレッショルドが、バイオマス濃度と発酵培地のプロ ピオン酸濃度との両方または一方に対応し、汚染併発品種に対する静菌と殺菌の 両方または一方の効果を表示する請求項８に記載の方法。 （１０）前記バクテリアスレッショルドがプロピオン酸と酢酸の両方または一方 の濃度の約２０ｇ／ｌ以上である請求項８に記載の方法。 （１１）前記抗バクテリアスレッショルドがプロピオン酸菌タイプのバクテリア の濃度の約４０ｇ／ｌ以上である請求項８に記載の方法。 （１２）バイオマスを製造するために請求項１から１１のいずれか１つに記載の 方法を使用すること。 （１３）発酵基質を循環させるため次の２つの外部ループを有する発酵容器によ り構成される半連続発酵装置： （１）前記の発酵基質を前記の発酵容器から取り出し、更に前記の発酵基質を前 記の発酵容器の中に再度入れる発酵基質を撹拌するための１つのループ、 （２）前記の製造されたプロピオン酸塩基生物学的混合体を取り出すための１つ のループで、製造された生物学的混合体をバクテリアから分離するためのモジュ ールを含んでいる、 更に前記の発酵基質の循環を、請求項１から１１までのいずれかによる方法を作 用として制御される前記のループの一方または他方に交互に選択的にルートを変 えるための装置が含まれている。 （１４）前記の発酵容器に、窒素補充物で満たされ限外濾過された乳糖により構 成された培地を殺菌するための装置を用いて新しい基質を供給する請求項１３に 記載の装置。 （１５）前記の撹拌および取り出しのループが、前記の発酵基質の循環ルートを 選択的に決める装置を有する共通部分と、更に前記の発酵基質とバイオマスコン テントの両方または一方のｐＨと温度の両方または一方を測定するための装置と ポンプを有している請求項１３に記載の装置。 （１６）ガス状または液体状の中和剤を容器の中に入れるための装置から成り、 前記発酵容器の中にあるもののｐＨを所定の値に保つためｐＨを測定するための 装置で制御されている請求項１５に記載の装置。 （１７）前記の共通の部分に、前記発酵基質を加熱および冷却できる熱交換機を 有する請求項１５に記載の装置。