ES2226891T3 - Nuevos analogos biciclonucleosidos. - Google Patents

Nuevos analogos biciclonucleosidos.

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ES2226891T3
ES2226891T3 ES00949882T ES00949882T ES2226891T3 ES 2226891 T3 ES2226891 T3 ES 2226891T3 ES 00949882 T ES00949882 T ES 00949882T ES 00949882 T ES00949882 T ES 00949882T ES 2226891 T3 ES2226891 T3 ES 2226891T3
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Takeshi Imanishi
Satoshi Obika
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Sankyo Co Ltd
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Abstract

Compuesto de **fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde, R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo protector de un grupo hidroxi en la síntesis de ácido nucleico, un grupo ácido fosfórico, un grupo ácido fosfórico protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, o un grupo representado por la fórmula ¿P(R4a)R4b (en donde R4a y R4b son iguales o diferentes y cada uno de ellos representa un grupo hidroxi, un grupo hidroxi protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo mercapto, un grupo mercapto protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo amino, un grupo amino protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo alcoxi de 1-6 átomos de carbono, un grupo alquiltio de 1-6 átomos de carbono, un grupo cianoalcoxi de 1-7 átomos de carbono, o un grupo amino sustituido por un grupo alquilo de 1-6 átomos de carbono.

Description

Nuevos análogos biciclonucleósidos.
Campo técnico
Esta invención se refiere a nuevos análogos biciclonucleósidos que son útiles para la síntesis de análogos oligonucleótidos que muestran una excelente actividad anti-sentido o anti-gen y estabilidad in vivo.
Esta invención se refiere a nuevos análogos de oligonucleótidos que tienen una o más de dichas mitades de biciclonucleósido.
Además, esta invención se refiere a nuevos análogos biciclonucleósidos modificados que muestran una actividad anti-SIDA.
Estado de la técnica
Es de esperar que los oligonucleótidos que tienen excelentes actividades anti-sentido o anti-gen y estabilidad in vivo sean medicamentos útiles.
Sin embargo, es bien conocido que los oligonucleótidos naturales se descomponen rápidamente por varias nucleasas en la sangre o células.
Para solucionar estos problemas, se han sintetizado numerosos análogos de oligonucleótidos no naturales, y se ha intentado su desarrollo como medicamentos. Por ejemplo, son conocidos los oligonucleótidos en los que el átomo de oxígeno unido al átomo de fósforo de la unión fosfodiéster está sustituida por un átomo de azufre, un grupo metilo, o un átomo de boro. Además, también son conocidos los oligonucleótidos cuyas mitades azúcar y/o base están químicamente modificadas.
Más concretamente, ISIS Co. ha desarrollado un oligonucleótido tioato, el ISIS2922, como un agente terapéutico para la retinitis infectada por citomegalovirus humano y éste ha sido comercializado como Vitravene (nombre comercial) en Estados Unidos.
Sin embargo, cualquiera de los análogos de oligonucleótidos descritos anteriormente, no ha sido completamente satisfactorio debido a su potencia insuficiente de actividad anti-sentido o anti-gen, (es decir, la capacidad de formar hebras complementarias con mRNA o DNA) y la estabilidad a varias nucleasas, y debido a los efectos secundarios causados por la unión no selectiva a varias proteínas in vivo. Por ello ha sido deseable desarrollar análogos de oligonucleótidos no naturales que tengan antividades anti-sentido o anti-gen más potentes, estabilidad in vivo, y menores efectos secundarios.
Los compuestos que tienen una mitad de dioxabiciclo[2,2,1]heptano que está relacionada con la de la presente invención y que se muestran a continuación están descritos en la patente WO98/39352. Estos compuestos difieren de los compuestos de la presente invención en el sustituyente en la posición 3' de la ribosa. Además, no es conocido que estos compuestos muestren una actividad anti-SIDA.
1
en donde B^{0} indica una base de ácido nucleico de pirimidina o purina o sus análogos, X y Y son iguales o diferentes y cada uno de ellos representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo cicloalquilo, un grupo aralquilo, un grupo arilo, un grupo acilo o un grupo sililo.
Constituye un objetivo de la presente invención el proporcionar nuevos análogos de biciclonucleósidos que son útiles para la síntesis de oligonucleótidos no naturales que muestran una excelente actividad anti-sentido o anti-gen y estabilidad in vivo.
Constituye también un objetivo de la presente invención el proporcionar nuevos análogos de oligonucleótidos que tienen 1 o más mitades de biciclonucleósidos relevantes.
Además, otro objetivo de la presente invención es el proporcionar nuevos análogos de biciclonucleósidos que tengan actividad anti-SIDA.
Los presentes inventores han realizado una investigación laboriosa para completar estos objetivos, y han encontrado que los nuevos análogos de biciclonucleósidos que tienen una mitad 2'-O,4'-C-metileno son compuestos intermedios importantes para sintetizar oligonucleótidos no naturales que tienen una excelente actividad anti-sentido o anti-gen, así como estabilidad in vivo. Además, los presentes inventores encontraron que los nuevos análogos de oligonucleótidos que tienen una o más de dichas mitades de biciclonucleósido muestran una excelente actividad anti-sentido o anti-gen así como estabilidad in vivo. Además, dichos análogos de biciclonucleósidos tienen una excelente actividad anti-SIDA. De este modo los presentes inventores han completado la presente invención.
Descripción de la invención
1) Los nuevos análogos de biciclonucleósidos son los compuestos representados por la fórmula general (1) o sus sales farmacéuticamente aceptables,
2
[en donde R^{1} representa un átomo de hidrógeno, un grupo protector de un grupo hidroxi en la síntesis de ácido nucleico, un grupo ácido fosfórico, un grupo ácido fosfórico protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, o un grupo representado por la fórmula -P(R^{4a})R^{4b} (en donde R^{4a} y R^{4b} son iguales o diferentes y cada uno de ellos representa un grupo hidroxi, un grupo hidroxi protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo mercapto, un grupo mercapto protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo amino, un grupo amino protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo alcoxi de 1-6 átomos de carbono, un grupo alquiltio de 1-6 átomos de carbono, un grupo cianoalcoxi de 1-7 átomos de carbono, o un grupo amino sustituido por un grupo alquilo de 1-6 átomos de carbono),
R^{2} representa un grupo azido, un grupo amino, o un grupo representado por la fórmula -NH-R^{3} (en donde R^{3} representa un grupo protector de un grupo amino en la síntesis de ácido nucleico, un grupo ácido fosfórico, un grupo ácido fosfórico protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, o un grupo representado por la fórmula -P(R^{4a})R^{4b} (en donde R^{4a} y R^{4b} son iguales o diferentes y cada uno de ellos representa un grupo hidroxi, un grupo hidroxi protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo mercapto, un grupo mercapto protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo amino, un grupo amino protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo alcoxi de 1-6 átomos de carbono, un grupo alquiltio de 1-6 átomos de carbono, un grupo cianoalcoxi de 1-7 átomos de carbono o un grupo amino sustituido por un grupo alquilo de 1-6 átomos de carbono).
B representa un grupo purina-9-ilo o a 2-oxo-1,2-dihidropirimidin-1-ilo estando cada uno de ellos opcionalmente sustituido con 1 o más sustituyentes seleccionado entre el siguiente grupo \alpha].
(Grupo \alpha)
un grupo hidroxi,
un grupo hidroxi protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico,
un grupo alcoxi de 1-6 átomos de carbono,
un grupo mercapto,
un grupo mercapto protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico,
un grupo alquiltio de 1-6 átomos de carbono,
un grupo amino,
un grupo amino protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico,
un grupo amino sustituido por un grupo alquilo de 1-6 átomos de carbono,
un grupo alquilo de 1-6 átomos de carbono, y
un átomo de halógeno.
Entre los compuestos de la presente invención, los compuestos preferidos son los siguientes;
2) Compuestos en donde R^{1} representa un átomo de hidrógeno, un grupo acilo alifático, un grupo acilo aromático, un grupo sililo, un grupo metilo sustituido por 1 y 3 grupos arilo, o un grupo metilo sustituido por 1 y 3 grupos arilo en donde los anillos arilo están sustituidos por un grupo alquilo inferior, un grupo alcoxi inferior, un átomo de halógeno o un grupo ciano.
3) Compuestos en donde R^{1} representa un átomo de hidrógeno, un grupo sililo, un grupo metilo sustituido por 1 y 3 grupos arilo, o un grupo metilo sustituido por 1 y 3 grupos arilo en donde los anillos arilo están sustituidos por un grupo alquilo inferior, un grupo alcoxi inferior, un átomo de halógeno o un grupo ciano.
4) Compuestos en donde R^{1} representa un átomo de hidrógeno, un grupo trimetilsililo, un grupo t-butildimetilsililo, un grupo t-butildifenilsililo, un grupo bencilo, un grupo trifenilmetilo, un grupo 4-metoxibencilo, un grupo
4-metoxifenildifenilmetilo, un grupo 4,4'-dimetoxitrifenilmetilo, o un grupo 4,4',4''-trimetoxitrifenilmetilo.
5) Compuestos en donde R^{2} representa un grupo azido, un grupo amino, o un grupo representado por la fórmula -NH-R^{3} (en donde R^{3} representa un grupo acilo alifático, un grupo acilo aromático, un grupo metilo sustituido por 1 y 3 grupos arilo, un grupo metilo sustituido por 1 y 3 grupos arilo en donde los anillos arilo están sustituidos por un grupo alquilo inferior, un grupo alcoxi inferior, un átomo de halógeno, o un grupo ciano, un grupo sililo, un grupo fosforoamidito, un grupo fosfonilo, un grupo ácido fosfórico o un grupo ácido fosfórico sustituido por un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico),
6) Compuestos en donde R^{2} representa un grupo azido, un grupo amino, o un grupo representado por la fórmula -NH-R^{3} (en donde R^{3} representa un grupo acetilo, un grupo trifluoroacetilo, un grupo benzoilo, un grupo bencilo, un grupo p-metoxibencilo, un grupo tert-butildifenilsililo, un grupo representado por la fórmula -P(OC_{2}H_{4}CN)(N(CH(CH_{3})_{2})_{2}), un grupo representado por la fórmula -P(OCH_{3})(N(CH(CH_{3})_{2})_{2}), un grupo fosfonilo, o un grupo ácido
2-clorofenil- o a 4-clorofenilfosfórico),
7) Compuestos en donde R^{2} representa un grupo azido o un grupo amino,
8) Compuestos en donde B representa un grupo 6-aminopurin-9-ilo (es decir, adeninilo), 6-amino-purin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 2,6-diaminopurin-9-ilo en donde uno o ambos grupo(s) amino están protegidos con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 2-amino-6-cloropurin-9-ilo, 2-amino-6-cloropurin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 2-amino-6-fluoropurin-9-ilo, 2-amino-6-fluoropurin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 2-amino-6-bromopurin-9-ilo, 2-amino-6-bromopurin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 2-amino-6-hidroxipurin-9-ilo (es decir, guaninilo), 2-amino-6-hidroxipurin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 6-amino-2-metoxipurin-9-ilo, 6-amino-2-metoxipurin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 6-amino-2-cloropurin-9-ilo, 6-amino-2-cloropurin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 6-amino-2-fluoropurin-9-ilo, 6-amino-2-fluoropurin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 2,6-dimetoxipurin-9-ilo, 2,6-dicloropurin-9-ilo, 6-mercaptopurin-9-ilo, 6-mercaptopurin-9-ilo en donde el grupo mercapto está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 2-oxo-4-amino-1,2-dihidropirimidin-1-ilo (es decir, citosinilo), 2-oxo-4-amino-1,2-dihidropirimidin-1-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 4-amino-2-oxo-5-fluoro-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, 4-amino-2-oxo-5-fluoro-1,2-dihidropirimidin-1-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 4-amino-2-oxo-5-cloro-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, 4-amino-2-oxo-5-cloro-1,2-dihidropirimidin-1-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 2-oxo-4-metoxi-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, 2-oxo-4-mercapto-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, 2-oxo-4-mercapto-1,2-dihidropirimidin-1-ilo en donde el grupo mercapto está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo 2,4-dihidroxipirimidin-1-ilo (es decir, uracililo), 2,4-dihidroxi-5-metilpirimidin-1-ilo (es decir, timinilo), 4-amino-5-metil-2-oxo-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, o 4-amino-5-metil-2-oxo-1,2-dihidropirimidin-1-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico,
9) Compuestos en donde B representa 6-benzoilaminopurin-9-ilo, adeninilo, 2-benzoilamino-6-hidroxipurin-9-ilo, guaninilo, 2-oxo-4-benzoilamino-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, citosinilo, uracililo o timinilo.
También son preferidos los compuestos en los que R^{1} está seleccionado entre los anteriores 2) a 4) y R^{2} está seleccionado entre los anteriores 5) a 7) y B está seleccionado entre los anteriores 8) o 9). Son particularmente preferidos los compuestos en donde R^{1} está seleccionado entre 2), R^{2} está seleccionado entre 5), y B está seleccionado entre 8), y en donde R^{1} está seleccionado entre 3), R^{2} está seleccionado entre 6), y B está seleccionado entre 8), y donde R^{1} está seleccionado entre 4), R^{2} está seleccionado entre 6), y B está seleccionado entre 9).
Los nuevos análogos de oligonucleótidos de la presente invención son:
(1) Los análogos de los oligonucleótidos y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos que tienen 1 o más unidades estructurales de fórmula (1a), siempre que cuando un oligonucleótido tenga dos o más unidades estructurales de fórmula (1a), cada B sea igual o diferente.
3
[en donde,
B representa un grupo purin-9-ilo o un grupo 2-oxo-1,2-dihidropirimidin-1-ilo que puede estar sustituido con sustituyentes seleccionados entre el grupo \alpha que se muestra a continuación].
(grupo \alpha)
un grupo hidroxi,
un grupo hidroxi protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico,
un grupo alcoxi de 1-6 átomos de carbono,
un grupo mercapto,
un grupo mercapto protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico,
un grupo alquiltio de 1-6 átomos de carbono,
un grupo amino,
un grupo amino protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico,
un grupo amino sustituido por un grupo alquilo de 1-6 átomos de carbono,
un grupo alquilo de 1-6 átomos de carbono, y
un átomo de halógeno.
En la presente invención, "análogos de oligonucleótidos" representan oligonucleótidos en los que las unidades de nucleósido de un oligonucleótido natural están sustituidos con 1 o más mitades de nucleósido que tienen la anterior estructura (1a). Por ejemplo, los análogos de oligonucleótidos suponen derivados de azúcares modificados, derivados de tioato en los que los sitios de unión del fosfodiéster están tioados, los ésteres en los que la mitad de ácido fosfórico está esterificada, y derivados de amida en los que un grupo amino en una base de purina está amidada como otras mitades de nucleósido o de nucleótido.
Entre los nuevos análogos de oligonucleótidos de la presente invención, los análogos preferidos son compuestos y sus sales farmacéuticamente aceptables, en donde:
2) B es un grupo 6-aminopurin-9-ilo (es decir, un grupo adenilo), un grupo 6-aminopurin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo 2,6-diaminopurin-9-ilo, un grupo 2-amino-6-cloropurin-9-ilo, un grupo 2-amino-6-cloropurin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo 2-amino-6-fluoropurin-9-ilo, un grupo 2-amino-6-fluoropurin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo 2-amino-6-bromopurin-9-ilo, un grupo 2-amino-6-bromopurin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo 2-amino-6-hidroxipurin-9-ilo (es decir, un grupo guaninilo), un grupo 2-amino-6-hidroxipurin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo 2-amino-6-hidroxipurin-9-ilo en donde el grupo amino y el grupo hidroxi están protegidos con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo 6-amino-2-metoxipurin-9-ilo, un grupo 6-amino-2-cloropurin-9-ilo, un grupo 6-amino-2-fluoropurin-9-ilo, un grupo 2,6-dimetoxipurin-9-ilo, un grupo 2,6-dicloropurin-9-ilo, un grupo 6-mercaptopurin-9-ilo, un grupo 2-oxo-4-amino-1,2-dihidropirimidin-1-ilo (es decir, un grupo citosinilo), un grupo 2-oxo-4-amino-1,2-dihidropirimidin-1-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo 2-oxo-4-amino-5-fluoro-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, un grupo 2-oxo-4-amino-5-fluoro-1,2-dihidropirimidin-1-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo 4-amino-2-oxo-5-cloro-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, un grupo 2-oxo-4-metoxi-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, un grupo 2-oxo-4-mercapto-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, un grupo 2-oxo-4-hidroxi-1,2-dihidropirimidin-1-ilo (es decir, un grupo uracinilo), un grupo 2-oxo-4-hidroxi-5-metil-1,2-dihidropirimidin-1-ilo (es decir, un grupo timinilo), un grupo 4-amino-5-metil-2-oxo-1,2-dihidropirimidin-1-ilo (es decir, un grupo 5-metilcitosinilo), o un grupo 4-amino-5-metil-2-oxo-1,2-dihidropirimidin-1-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, y
3) compuestos y sus sales farmacéuticamente aceptables en los que B es un grupo 6-benzoilaminopurin-9-ilo, un grupo adeninilo, un grupo 2-isobutirilamino-6-hidroxipurin-9-ilo, un grupo guaninilo, un grupo 2-oxo-4-benzoilamino-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, un grupo citosinilo, un grupo 2-oxo-5-metil-4-benzoilamino-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, un grupo 5-metilcitosinilo, un grupo uracinilo o un grupo timinilo.
El "grupo protector de un grupo hidroxi en la síntesis de ácido nucleico" en la definición del anterior R^{1} no tiene limitación, en tanto en cuanto como grupo protector puede proteger el grupo hidroxi de forma estable en la síntesis de ácido nucleico. Ejemplos de grupos protectores son
"Un grupo acilo alifático", por ejemplo, un grupo alquilcarbonilo tal como un grupo formilo, acetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo, pentanoilo, pivaloilo, valerilo, isovalerilo, octanoilo, decanoilo, 8-metilnonanoilo, 3-etiloctanoilo, 3,7-dimetiloctanoilo, undecanoilo, tridecanoilo, hexadecanoilo, 14-metilpentadecanoilo, 13,13-dimetiltetradecanoilo, 1-metilheptadecanoilo, nonadecanoilo, eicosanoilo y henicosanoilo, un grupo alquilcarbonilo carboxilado tal como succinoilo, glutaroilo, y adipoilo, un grupo halógeno-alquilcarbonilo inferior tal como cloroacetilo, dicloroacetilo, tricloroacetilo, y trifluoroacetilo, un grupo alcoxi inferior alquilcarbonilo inferior tal como metoxiacetilo, y un grupo alquilcarbonilo insaturado tal como (E)-2-metil-2-butenoilo;
"un grupo acilo aromático", por ejemplo, un grupo arilcarbonilo tal como benzoilo, \alpha-naftoilo, y \beta-naftoilo, un grupo halógenoarilcarbonilo tal como 2-bromobenzoilo, 4-clorobenzoilo, un grupo arilcarbonilo inferior alquilado tal como 2,4,6-trimetilbenzoilo, y 4-toluoilo, un grupo arilcarbonilo alcoxilado inferior tal como 4-anisoilo, un grupo arilcarbonilo carboxilado tal como 2-carboxibenzoilo, 3-carboxibenzoilo, y 4-carboxibenzoilo, un grupo arilcarbonilo nitrado tal como 4-nitrobenzoilo, y 2-nitrobenzoilo; un grupo arilcarbonilo alcoxicarbonilado inferior tal como
2-(metoxicarbonil)benzoilo, un grupo arilcarbonilo arilado tal como 4-fenilbenzoilo;
"un grupo tetrahidropiranilo o tetrahidrotiopiranilo" tal como tetrahidropiran-2-ilo, 3-bromotetrahidropiran-2-ilo, 4-metoxitetrahidropiran-4-ilo, tetrahidrotiopiran-2-ilo, y 4-metoxitetrahidrotiopiran-4-ilo;
"un grupo tetrahidrofuranilo o tetrahidrotiofuranilo" tal como tetrahidrofuran-2-ilo, y tetrahidrotiofuran-2-ilo;
"grupos sililo", por ejemplo, un grupo tri-alquilo inferior sililo tal como trimetilsililo, trietilsililo, isopropildimetilsililo, t-butildimetilsililo, metildiisopropilsililo, metildi-t-butilsililo, y triisopropilsililo, un grupo tri-alquilo inferior sililo sustituido por 1-2 grupos arilo tal como difenilmetilsililo, t-butildifenilsililo, difenilisopropilsililo, y fenildiisopropilsililo;
"un grupo alcoximetilo inferior" tal como metoximetilo, 1,1-dimetil-1-metoximetilo, etoximetilo, propoximetilo, isopropoximetilo, butoximetilo, y t-butoximetilo;
"un grupo alcoximetilo inferior alcoxilado inferior" tal como 2-metoxietoximetilo;
"un grupo halógeno-alcoximetilo inferior" tal como 2,2,2-tricloroetoximetilo, y bis(2-cloroetoxi)metilo;
"un grupo etilo alcoxilado inferior" tal como 1-etoxietilo, y 1-(isopropoxi)etilo;
"un grupo etilo halogenado" tal como 2,2,2-tricloroetilo;
"un grupo metilo sustituido por 1 y 3 grupos arilo" tal como bencilo, \alpha-naftilmetilo, \beta-naftilmetilo, difenilmetilo, trifenilmetilo, \alpha-naftildifenilmetilo, y 9-antrilmetilo;
"un grupo metilo sustituido por 1 y 3 grupos arilo en donde el anillo de arilo está sustituido por grupos alquilo inferior, alcoxi inferior, halógeno o ciano" tal como 4-metilbencilo, 2,4,6-trimetilbencilo, 3,4,5-trimetilbencilo,
4-metoxibencilo, 4-metoxifenildifenilmetilo, 4,4'-dimetoxitrifenilmetilo, 4,4',4''-trimetoxitrifenilmetilo, 2-nitrobencilo, 4-nitrobencilo, 4-clorobencilo, 4-bromobencilo, y 4-cianobencilo;
"un grupo carbonilo alcoxi inferior" tal como metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, t-butoxicarbonilo, y isobutoxicarbonilo;
"un grupo carbonilo alcoxi inferior sustituido por un átomo de halógeno o un grupo tri-alquilo inferior sililo" tal como 2,2,2-tricloroetoxicarbonilo, y 2-trimetilsililetoxicarbonilo,
"un grupo alqueniloxicarbonilo" tal como viniloxicarbonilo, y ariloxicarbonilo; "un grupo aralquiloxicarbonilo en donde el anillo de arilo puede estar sustituido por 1 ó 2 grupos alcoxi inferior o nitro" tal como benciloxicarbonilo, 4-metoxibenciloxicarbonilo, 3,4-dimetoxidibenciloxicarbonilo, 2-nitrobenciloxicarbonilo, y 4-nitrobenciloxicarbonilo.
Los grupos protectores preferidos son un grupo acilo alifático, un grupo acilo aromático, un grupo metilo sustituido por 1 y 3 grupos arilo, un grupo metilo sustituido por 1 y 3 grupos arilo en donde el anillo de arilo está sustituido por alquilo inferior, un grupo alcoxi inferior, un átomo de halógeno o un grupo ciano, o un grupo sililo. Los grupos más preferidos son el grupo acetilo, grupo benzoilo, grupo bencilo, grupo p-metoxibencilo, grupo dimetoxitritilo, grupo monometoxitritilo o grupo tert-butildifenilsililo.
Los grupos protectores en la síntesis de ácido nucleico descritos como "un grupo ácido fosfórico protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico" en la anterior definición de R^{1} y R^{3} no tienen limitación, en tanto en cuanto el grupo protector puede proteger el grupo ácido fosfórico en la síntesis de ácido nucleico. Ejemplos de los grupos protectores son "un grupo alquilo inferior" tal como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo,
s-butilo, tert-butilo, n-pentilo, isopentilo, 2-metilbutilo, neopentilo, 1-etilpropilo, n-hexilo, isohexilo, 4-metilpentilo, 3-metilpentilo, 2-metilpentilo, 1-metilpentilo, 3,3-dimetilbutilo, 2,2-dimetilbutilo, 1,1-dimetilbutilo, 1,2-dimetilbutilo, 1,3-dimetilbutilo, 2,3-dimetilbutilo, y 2-etilbutilo; "un grupo alquilo inferior cianurado" tal como 2-cianoetilo, y 2-ciano-1,1-dimetiletilo; "un grupo etilo sustituido por un grupo sililo" tal como 2-metildifenilsililetilo, 2-trimetilsililetilo, y 2-trifenilsililetilo; "un grupo alquilo inferior halogenado" tal como 2,2,2-tricloroetilo, 2,2,2-tribromoetilo, 2,2,2-trifluoroetilo, y 2,2,2-tricloro-1,1-dimetiletilo; "un grupo alquenilo inferior" tal como etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo, 1-metil-2-propenilo, 1-metil-1-propenilo, 2-metil-1-propenilo, 2-metil-2-propenilo, 2-etil-2-propenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, 1-metil-2-butenilo, 1-metil-1-butenilo, 3-metil-2-butenilo, 1-etil-2-butenilo, 3-butenilo, 1-metil-3-butenilo, 2-metil-3-butenilo, 1-etil-3-butenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 1-metil-2-pentenilo, 2-metil-2-pentenilo, 3-pentenilo, 1-metil-3-pentenilo, 2-metil-3-pentenilo, 4-pentenilo, 1-metil-4-pentenilo, 2-metil-4-pentenilo, 1-hexenilo, 2-hexenilo, 3-hexenilo, 4-hexenilo, y 5-hexenilo; "un grupo cicloalquilo" tal como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, norbornilo, y adamantilo;
"un grupo alquenilo inferior cianurado" tal como 2-cianobutenilo;
"un grupo aralquilo" tal como bencilo, á-naftilmetilo, \beta-naftilmetilo, indenilmetilo, fenantrenilmetilo, antracenilmetilo, difenilmetilo, trifenilmetilo, 1-fenetilo, 2-fenetilo, 1-naftiletilo, 2-naftiletilo, 1-fenilpropilo, 2-fenilpropilo, 3-fenilpropilo, 1-naftilpropilo, 2-naftilpropilo, 3-naftilpropilo, 1-fenilbutilo, 2-fenilbutilo, 3-fenilbutilo, 4-fenilbutilo, 1-naftilbutilo, 2-naftilbutilo, 3-naftilbutilo, 4-naftilbutilo, 1-fenilpentilo, 2-fenilpentilo, 3-fenilpentilo, 4-fenilpentilo, 5-fenilpentilo, 1-naftilpentilo, 2-naftilpentilo, 3-naftilpentilo, 4-naftilpentilo, 5-naftilpentilo, 1-fenilhexilo, 2-fenilhexilo, 3-fenilhexilo, 4-fenilhexilo, 5-fenilhexilo, 6-fenilhexilo, 1-naftilhexilo, 2-naftilhexilo, 3-naftilhexilo, 4-naftilhexilo, 5-naftilhexilo, y 6-naftilhexilo, "un grupo aralquilo en donde el anillo de arilo está sustituido por un grupo nitro, y/o un átomo de halógeno" tal como 4-clorobencilo, 2-(4-nitrofenil)etilo, o-nitrobencilo, 4-nitrobencilo, y 2,4-dinitrobencilo, 4-cloro-2-nitrobencilo,
"un grupo arilo" tal como fenilo, indenilo, naftilo, fenantrenilo, y antracenilo;
"un grupo arilo sustituido por un grupo alquilo inferior, un átomo de halógeno, y/o un grupo nitro" tal como 2-metilfenilo, 2,6-dimetilfenilo, 2-clorofenilo, 4-clorofenilo, 2,4-diclorofenilo, 2,5-diclorofenilo, 2-bromofenilo,
4-nitrofenilo, 4-cloro-2-nitrofenilo.
Los grupos protectores preferidos son "un grupo alquilo inferior", "un grupo alquilo inferior sustituido por un grupo ciano", "un grupo aralquilo", "un grupo aralquilo en donde el anillo de arilo está sustituido por un grupo nitro y/o un átomo de halógeno", o "un grupo arilo sustituido por un grupo alquilo inferior, un átomo de halógeno, y/o un grupo nitro".
Los grupos más preferidos son un grupo 2-cianoetilo, un grupo 2,2,2-tricloroetilo, un grupo bencilo, un grupo 2-clorofenilo o un grupo 4-clorofenilo.
"Grupos alquilo de 1-6 átomos de carbono" en la definición de los anteriores grupos \alpha son, por ejemplo, un grupo alquilo de 1-6 átomos de carbono de cadena lineal o ramificada tal como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, s-butilo, tert-butilo, pentilo, y hexilo. Los grupos preferidos son los grupos alquilo de 1-4 átomos de carbono, y los grupos alquilo más preferidos son los grupos alquilo de 1-2 átomos de carbono, y el grupo más preferido es un grupo metilo.
El "grupo protector de un grupo amino en la síntesis de ácido nucleico" descrito en la anterior definición de R^{2} no tiene limitación, en tanto en cuanto puede proteger grupos amino en la síntesis de ácido nucleico. Estos grupos protectores son, "Un grupo acilo alifático", por ejemplo, un grupo alquilcarbonilo tal como formilo, acetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo, pentanoilo, pivaloilo, valerilo, isovalerilo, octanoilo, decanoilo, 8-metilnonanoilo, 3-etiloctanoilo, 3,7-dimetiloctanoilo, undecanoilo, tridecanoilo, hexadecanoilo, 14-metilpentadecanoilo, 13,13-dimetiltetradecanoilo, 1-metilheptadecanoilo, nonadecanoilo, eicosanoilo y henicosanoilo; un grupo alquilcarbonilo carboxilado tal como succinoilo, glutaroilo, y adipoilo; un grupo halógeno-alquilo inferior carbonilo tal como cloroacetilo, dicloroacetilo, tricloroacetilo, y trifluoroacetilo; un grupo alcoxi alquilo inferior carbonilo tal como metoxiacetilo, un grupo alquilo insaturado carbonilo tal como (E)-2-metil-2-butenoilo;
"Un grupo acilo aromático", por ejemplo, un grupo arilcarbonilo tal como benzoilo, \alpha-naftoilo, y \beta-naftoilo; un grupo halógeno-arilcarbonilo tal como 2-bromobenzoilo, y 4-clorobenzoilo; un grupo arilcarbonilo alquilado con un alquilo inferior tal como 2,4,6-trimetilbenzoilo, y 4-toluoilo;
un grupo arilcarbonilo alcoxilado con alcoxi inferior tal como 4-anisoilo;
un grupo arilcarbonilo carboxilado tal como 2-carboxibenzoilo, 3-carboxibenzoilo, y 4-carboxibenzoilo; un grupo arilcarbonilo nitrado tal como 4-nitrobenzoilo, y 2-nitrobenzoilo; un grupo alcoxi inferior carbonilado-arilcarbonilo tal como 2-(metoxicarbonil)benzoilo, un grupo arilado-arilcarbonilo tal como 4-fenilbenzoilo;
"un grupo alcoxi inferior carbonilo" tal como metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, t-butoxicarbonilo, y isobutoxicarbonilo;
"un grupo alcoxi inferior carbonilo sustituido por un átomo de halógeno o un grupo tri-alquilo inferior sililo" tal como 2,2,2-tricloroetoxicarbonilo, y 2-trimetilsililetoxicarbonilo;
"un grupo alqueniloxicarbonilo" tal como viniloxicarbonilo, y ariloxicarbonilo;
"un grupo aralquiloxicarbonilo en donde el anillo de arilo puede estar sustituido por 1-2 grupos alcoxi inferior o nitro" tal como benciloxicarbonilo, 4-metoxibenciloxicarbonilo, 3,4-dimetoxibenciloxicarbonilo, 2-nitrobenciloxicarbonilo y 4- nitrobenciloxicarbonilo.
Entre estos, los grupos preferidos son "un grupo acilo alifático", "un grupo acilo aromático", o "un grupo aralquiloxicarbonilo en donde el anillo de arilo puede estar sustituido por 1-2 grupos alcoxi inferior o nitro".
Los grupos más preferidos son "un grupo acilo alifático" o "un grupo aralquiloxicarbonilo en donde el anillo de arilo puede estar sustituido por 1-2 grupos alcoxi inferior o nitro".
Un grupo preferido de forma particular es un grupo trifluoroacetilo o benciloxicarbonilo.
"El grupo fosforamidita" descrito anteriormente representa un grupo de fórmula -P(OR^{3a})(NR^{3b}_{2}) (en donde R^{3a} representa un grupo alquilo de 1-6 átomos de carbono o un grupo ciano alquilo de 1-7 átomos de carbono, mientras que R^{3b} representa un grupo alquilo de 1-6 átomos de carbono).
Los grupos preferidos son aquellos representados por la fórmula -P(OC_{2}H_{4}CN)(N(CH(CH_{3})_{2})_{2}) o la fórmula
-P(OCH_{3})(N(CH(CH_{3})_{2})_{2}).
"Un átomo de halógeno" descrito en la anterior definición del grupo \alpha es un átomo de flúor, cloro, bromo, o yodo y los átomos preferidos son los átomos de flúor o cloro.
"Un grupo alquilo de 1-6 átomos de carbono" descrito en la anterior definición de R^{4a}, R^{4b} y del grupo \alpha es, por ejemplo, un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada de 1-6 átomos de carbono, tal como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, s-butilo, tert-butilo, pentilo y hexilo. Los grupos preferidos son los grupos metilo o etilo.
"Un grupo hidroxi protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico" descrito en la anterior definición de R^{4a}, R^{4b} y un grupo \alpha es un grupo similar al descrito previamente en el "grupo protector de un grupo hidroxi en la síntesis de ácido nucleico" en la anterior definición de R^{1}. Los grupos preferidos son "un grupo acilo alifático" y "un grupo acilo aromático", y el grupo más preferido es un grupo benzoilo.
"Un grupo mercapto protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico" descrito en las anteriores definiciones de R^{4a}, R^{4b} y del grupo \alpha es, por ejemplo, "un grupo formador de disulfuro", por ejemplo un grupo alquiltio tal como metiltio, etiltio y tert-butiltio, y un grupo ariltio tal como benciltio, además de los grupos descritos en el "grupo protector de un grupo hidroxi en la síntesis de ácido nucleico" en la definición de R^{1}.
Entre estos, los grupos preferidos son "un grupo acilo alifático" o "un grupo acilo aromático", y el grupo más preferido es un grupo benzoilo.
El "grupo amino protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico" descrito en las anteriores definiciones de R^{4a}, R^{4b} y del grupo \alpha es un grupo similar a los descritos en el "grupo protector de un grupo amino en la síntesis de ácido nucleico", que ya ha sido descrito en la definición de R^{2}. Los grupos preferidos son "los grupos acilo alifáticos" o "los grupos acilo aromáticos", y el grupo más preferido es un grupo benzoilo.
El "grupo alcoxi de 1-6 átomos de carbono" descrito en las anteriores definiciones de R^{4a}, R^{4b} y del grupo \alpha es, por ejemplo, un grupo alcoxi de cadena lineal o ramificada de 1-6 átomos de carbono, tal como metoxi, etoxi,
n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, isobutoxi, s-butoxi, tert-butoxi, pentiloxi, y hexiloxi. Los grupos preferidos son los grupos metoxi o etoxi.
El "grupo alquiltio de 1-6 átomos de carbono" descrito en los anteriores definiciones de R^{4a}, R^{4b} y del grupo \alpha es, por ejemplo, un grupo metiltio, etiltio, propiltio, isopropiltio, butiltio, isobutiltio, s-butiltio, tert-butiltio, pentiltio o hexiltio. Los grupos preferidos son los grupos metiltio o etiltio.
El "grupo amino sustituido por un grupo alquilo de 1-6 átomos de carbono" descrito en las anteriores definiciones de R^{4a}, R^{4b} y del grupo \alpha es, por ejemplo, un grupo metilamino, etilamino, propilamino, isopropilamino, butilamino, isobutilamino, s-butilamino, tert-butilamino, pentilamino, hexilamino, dimetilamino, dietilamino, dipropilamino, diisopropilamino, dibutilamino, diisobutilamino, di(s- butil)amino, di(tert-butil)amino, dipentilamino, o dihexilamino. Los grupos preferidos son los grupos metilamino, etilamino, dimetilamino o dietilamino.
El "grupo cianoalcoxi de 1-7 átomos de carbono" descrito en la anterior definición de R^{4a} y R^{4b} es, por ejemplo, un grupo cianometoxi, cianoetoxi, cianopropiloxi, cianobutiloxi, cianopentiloxi, o cianohexiloxi, y el grupo preferido es un grupo 2-cianoetoxi.
Las "sales farmacéuticamente aceptables de los mismos" descritas anteriormente indican las sales de los análogos de los oligonucleósidos (1) y los análogos de los oligonucleótidos de la anterior estructura química (1a). Entre estas sales, las sales preferidas son, por ejemplo, las sales de metales tales como las sales de metales alcalinos, por ej., las sales de sodio, sales de potasio, sales de litio; sales de metales alcalino térreos, por ej. sales de calcio y sales de magnesio; sales de aluminio, sales de hierro, sales de zinc, sales de cobre, sales de níquel y sales de cobalto; sales de amina tales como sales inorgánicas, por ej. sales de amonio; sales orgánicas, por ej., sales de t-octilamina, sales de dibencilamina, sales de morfolina, sales de glucosamina, sales de alquil ésteres de fenilglicina, sales de etilendiamina, sales de N-metilglucamina, sales de guanidina, sales de dietilamina, sales de trietilamina, sales de diciclohexilamina, sales de N,N'-dibenciletilendiamina, sales de cloroprocaina, sales de procaina, sales de dietanolamina, sales de N-bencil-fenetilamina, sales de piperacina, sales de tetrametilamonio y sales de tris(hidroximetil)aminometano; sales de ácido inorgánicos tales como sales de ácido hidrohalogenoico, por ej., sales de ácido hidrofluórico, sales de ácido hidroclórico, sales de ácido hidrobrómico y sales de ácido hidroiódico; sales de ácido nítrico, sales de ácido perclórico, sales de ácido sulfúrico y sales de ácido fosfórico; sales de ácidos orgánicos tales como sales de ácidos alcanosulfónico inferior, por ej., sales de ácido metanosulfónico, sales de ácido trifluorometanosulfónico y sales de ácido etanosulfónico; sales de ácido arilsulfónico, por ej., sales de ácido bencenosulfónico y sales de ácido p-toluenosulfónico; sales de ácido acético, sales de ácido málico, sales de ácido fumárico, sales de ácido succínico, sales de ácido cítrico, sales de ácido tartárico, sales de ácido oxálico y sales de ácido maleico; y sales de amino ácidos tales como sales de glicina, sales de lisina, sales de arginina, sales de ornitina, sales de ácido glutámico y sales de ácido aspártico.
Entre estas sales, las preferidas son la sal de sodio, sal de potasio y sal de trietilamina para los análogos de oligonucleótidos que contienen la estructura de nucleósido (1a), y se prefiere la forma libre de nucleósido para los análogos de nucleósidos (1).
Los análogos de nucleósidos (1) y los análogos de oligonucleótidos de la anterior estructura (1a) en la presente invención absorben o adsorben agua para formar hidratos cuando se dejan en la atmósfera. Estos hidratos se incluyen en la presente invención.
Los análogos de nucleósidos (1) y los análogos de oligonucleótidos de la anterior estructura (1a) en la presente invención absorben ciertos disolventes para formar solvatos. Estos solvatos están incluidos en la presente inven-
ción.
Algunos ejemplos típicos del compuesto (1) de la presente invención pueden ser ejemplificados por las Tablas 
\hbox{1 y 2.}
Las abreviaturas utilizadas en la Tabla 1 y Tabla 2 son las siguientes;
Bn: un grupo bencilo, Bz: un grupo benzoilo, Me: un grupo metilo, PMBn: un grupo p-metoxibencilo, MMTr: un grupo 4-metoxitrifenilmetilo, DMTr: un grupo 4,4'-dimetoxitrifenilmetilo, TMTr: un grupo 4,4'4''-trimetoxitrifenilmetilo, TMS: un grupo trimetilsililo, TBDMS: un grupo tert-butildimetilsililo, TBDPS: un grupo tert-butildifenilsi-
lilo.
\newpage
TABLA 1 
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4 
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5
6
7
8
TABLA 2
9
10
11
12
13
Entre los compuestos listados en estas Tablas, los compuestos preferidos son los siguientes (números de los compuestos ejemplificados):
1-3, 1-4, 1-7, 1-9, 1-10, 1-16, 1-17, 1-19, 1-20, 1-21, 1-22, 1-23, 1-27, 1-28, 1 y 31, 1 y 33, 1 y 34, 1-40, 1-41, 
\hbox{1-43,}
1-44, 1-45, 1-46, 1-47, 1-49, 1-50, 1-56, 1-57, 1-82, 1-83, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8, 2-9, 2-10, 2-13, 2-14,
2-15, 2-16, 2-17, 2-18, 2-19, 2-20, 2-21, 2-22, 2-48, 2-59, 2-60, y 2-61.
Los compuestos más preferidos son los siguientes (números de los compuestos de ejemplificación):
1-4, 1-22, 1-28, 1-46, 1-49, 1-50, 1-56, 1-57, 1-82, 1-83, 2-3, 2-4, 2-6, 2-13, 2-14, 2-16, 2-21, 2-22, 2-48, 2-59,
2-60, y 2-61.
Los compuestos particularmente preferidos son los siguientes (números de los compuestos ejemplificados):
2-4: 3'-amino-3'-deoxi-2'-O,4'-C-metilen-5-metiluridina,
2-14: 3'-azido-3'-deoxi-2'-O,4'-C-metilen-5-metiluridina,
2-36: 3'-azido-3'-deoxi-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O,4'-C-metilen-5-metiluridina,
2-48: 3'-azido-5'-O-tert-butildifenilsilil-3'-deoxi-2'-O,4'-C-metilen-5-metiluridina y
2-60: 3'-amino-3'-deoxi-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O,4'-C-metilen-5-metiluridina.
Los compuestos de la presente invención pueden ser sintetizados de acuerdo con el método A descrito a continuación.
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14
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18 
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En los procedimientos descritos anteriormente, R^{1}, R^{2} y B son tal como se han definido previamente.
R^{7} representa un grupo protector de un grupo hidroxi, y los grupos preferidos son los grupos acilo aromáticos, por ejemplo, grupos arilo carbonilo tales como benzoilo, \alpha-naftoilo, y \beta-naftoilo; grupos arilcarbonilo alquilados con alquilo inferior tales como los grupos 2,4,6-trimetilbenzoilo, y 4-toluoilo, y grupos arilcarbonilo arilados tales como el 4-fenilbenzoilo. El grupo más preferido es un grupo benzoilo.
R^{8} representa un grupo protector de un grupo hidroxi y los grupos preferidos son
"grupos sililo", por ejemplo, un grupo tri-alquilo inferior sililo tal como trimetilsililo, trietilsililo, isopropildimetilsililo, t-butildimetilsililo, metildiisopropilsililo, metildi-t-butilsililo y triisopropilsililo; y un grupo tri-alquilo inferior sililo sustituido por 1-2 grupos arilo tal como difenilmetilsililo, t-butildifenilsililo, difenilisopropilsililo y fenildiisopropilsililo;
"un grupo metilo sustituido por 1 y 3 grupos arilo" tal como bencilo, \alpha-naftilmetilo, \beta-naftilmetilo, difenilmetilo, trifenilmetilo, \alpha-naftildifenilmetilo y 9-antrilmetilo;
"un grupo metilo sustituido por 1 y 3 grupos arilo en donde el anillo de arilo está sustituido por alquilo inferior, alcoxi inferior, un átomo de halógeno o un grupo ciano" tal como 4-metilbencilo, 2,4,6-trimetilbencilo, 3,4,5-trimetilbencilo, 4-metoxibencilo, 4-metoxifenildifenilmetilo, 4,4'-dimetoxitrifenilmetilo, 4,4',4''-trimetoxitrifenilmetilo, 2-nitorobencilo, 4-nitrobencilo, 4-clorobencilo, 4-bromobencilo y 4-cianobencilo.
Los grupos más preferidos son un grupo trimetilsililo, un grupo t-butildimetilsililo, un grupo t-butildifenilsililo, un grupo bencilo, un grupo trifenilmetilo, un grupo 4-metoxibencilo, un grupo 4-metoxifenildifenilmetilo, un grupo 4,4'-dimetoxitrifenilmetilo o un grupo 4,4',4''-trimetoxitrifenilmetilo.
R^{9} representa un grupo saliente y los grupos preferidos son un grupo alquilo inferior sulfonilo tal como los grupos metanosulfonilo y etanosulfonilo, un grupo alquilo inferior sulfonilo sustituido por un átomo de halógeno tal como un grupo trifluorometanosulfonilo, y un grupo arilsulfonilo tal como un grupo p-toluenosulfonilo.
Entre estos grupos los grupos más preferidos son el grupo metanosulfonilo o el grupo p-toluenosulfonilo.
R^{10} representa un grupo protector de un grupo hidroxi y los grupos preferidos son
"grupos acilo alifáticos", por ejemplo, grupos alquilcarbonilo tales como formilo, acetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo, pentanoilo, pivaloilo, valerilo, isovalerilo, octanoilo, decanoilo, 1-metilheptadecanoilo, nonadecanoilo, eicosanoilo y henicosanoilo, grupos alquilcarbonilo carboxilados tales como los grupos succinoilo, glutaroilo y adipoilo, grupos halógeno-alquilo inferior carbonilo tales como los grupos cloroacetilo, dicloroacetilo, tricloroacetilo y trifluoroacetilo, grupos alcoxi inferior-alquilo inferior carbonilo tales como un grupo metoxiacetilo, y grupos alquilcarbonilo insaturados tales como un grupo (E)-2-metil-2-butenoilo;
"grupos acilo aromáticos", por ejemplo, grupos arilcarbonilo tales como benzoilo, \alpha-naftoilo y \beta-naftoilo, grupos halógenoarilcarbonilo tales como los grupos 2-bromobenzoilo y 4-clorobenzoilo, grupos arilcarbonilo alquilados con alquilo inferior tales como los grupos 2,4,6-trimetilbenzoilo y 4-toluoilo, grupos arilcarbonilo alcoxilados con alcoxi inferior tales como el grupo 4-anisoilo, grupos arilcarbonilo carboxilados tales como los grupos 2-carboxibenzoilo, 3-carboxibenzoilo y 4-carboxibenzoilo, grupos arilcarbonilo nitrados tales como los grupos 4-nitrobenzoilo y 2-nitrobenzoilo, grupos arilcarbonilo alcoxicarbonilados con alcoxi inferior tales como el grupo 2-(metoxicarbonil)benzoilo, y grupos arilcarbonilo arilados tales como el grupo 4-fenilbenzoilo.
Entre estos grupos, los grupos más preferidos son "los grupos acilo alifáticos" y un grupo particularmente preferido es un grupo acetilo.
B^{1} representa un grupo purin-9-ilo o 2-oxo-1,2-dihidropirimidin-1-ilo que puede tener 1 o más sustituyentes seleccionados entre el grupo \alpha1 a continuación.
(grupo \alpha1)
un grupo hidroxi,
un grupo hidroxi protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico,
grupos alcoxi de 1-6 átomos de carbono,
un grupo mercapto,
un grupo mercapto protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico,
un grupo alquiltio de 1-6 átomos de carbono,
un grupo amino protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico,
grupos amino sustituidos por un grupo alquilo de 1-6 átomos de carbono,
un grupo alquilo de 1-6 átomos de carbono y
átomos de halógeno.
El Método A es un procedimiento para sintetizar los compuestos de las fórmulas (1a), (1b) y (1c) a partir del compuesto de partida (2) mediante la introducción de un sustituyente B y el cierre del anillo.
Aquí el compuesto de partida (2) es sintetizado a partir de la diacetona-D-glucosa disponible utilizando un método similar al descrito en la literatura (O. T. Schmidt, Methods en Carbohydr. Chem., 4, 318 (1964); J. S. Brimacombe y O. A. Ching, Carbhyd. Res., 8, 82 (1968); T.F. Tam y B. Fraser-Reid, Can. J. Chem., 57, 2818 (1979); S. A. Suzhkov, Nucleosides & Nucleotides, 13, 2283 (1994)].
Los detalles de cada procedimiento del método A se describirán a continuación.
Método A
Procedimiento A-1
En esta etapa se preparó un compuesto (3), que comprende la desprotección de un grupo protector de alcohol primario del compuesto de partida (2) en presencia de una base en un disolvente inerte.
El disolvente utilizado no tiene limitación, en tanto que sea uno de los disolventes normalmente utilizados para hidrólisis, y puede ser agua; disolventes orgánicos, por ejemplo alcoholes tal como metanol, etanol y n-propanol, y éteres tal como tetrahidrofurano y dioxano; o una mezcla de agua y los disolventes orgánicos descritos anteriormente. Los disolventes preferidos son los alcoholes.
La base utilizada no tiene limitación a no ser que afecte a las otras mitades del compuesto. Las bases preferidas son alcóxidos metálicos tales como el metóxido de sodio; carbonatos de metales alcalinos tales como el carbonato de sodio, carbonato de potasio y carbonato de litio; hidróxidos de metales alcalinos tales como hidróxido de sodio, hidróxido potásico, hidróxido de litio e hidróxido de bario, o amoníaco tal como solución de amoníaco acuoso y amoníaco concentrado-metanol. Las bases preferidas son los carbonatos de metales alcalinos.
La temperatura de reacción y el tiempo de reacción dependen del producto de partida, del disolvente y de la base utilizada y no tienen limitación. De forma ordinaria la temperatura de la reacción está comprendida entre 0ºC y 15ºC y el tiempo de reacción está comprendido entre 1hr y 10 hrs.
Después de la finalización de la reacción, se separa el compuesto deseado (3) de la mezcla de reacción por los métodos convencionales. Por ejemplo, se neutraliza la mezcla de reacción y se concentra, y sobre el residuo se añade agua y un disolvente orgánico inmiscible en agua, tal como acetato de etilo. Después del lavado con agua, se aísla la fase orgánica incluyendo el compuesto deseado, y se seca sobre sulfato sódico anhidro o similar. Se obtuvo el compuesto deseado por evaporación de los disolventes.
El compuesto obtenido es purificado, en el caso en que sea necesario, por los métodos convencionales, tales como recristalización y/o cromatografía de columna sobre gel de sílice.
Procedimiento A-2
Se prepara un compuesto (4) en este procedimiento que comprende la reacción del compuesto (3) obtenido en el procedimiento A-1 con un agente protector de hidroxi en presencia de una base en un disolvente inerte.
El disolvente utilizado no tiene limitación, siempre que éste no inhiba la reacción y disuelva los productos de partida en alguna extensión y es, por ejemplo, un hidrocarburo alifático tal como hexano y heptano; un hidrocarburo aromático tal como benceno, tolueno y xileno; un hidrocarburo halogenado tal como cloruro de metileno, cloroformo, tetracloruro de carbono, dicloroetano, clorobenceno y diclorobenceno; un éster tal como formiato de etilo, acetato de etilo, acetato de propilo, acetato de butilo y carbonato de butilo; un éter tal como éter de dietilo, éter de diisopropilo, tetrahidrofurano, dioxano, dimetoxietano y dietilen glicol dimetil éter; un nitrilo tal como acetonitrilo y isobutironitrilo; una amida tal como formamida, N,N-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida, N-metil-2-pirrolidona, N-metil-pirrolidinona, y hexametilfosforotriamida. El disolvente preferido es cloruro de metileno.
La base utilizada no tiene limitación, siempre que se utilice como una base en las reacciones convencionales. Por ejemplo, puede ser una base orgánica tal como N-metilmorfolina, trietilamina, tributilamina, diisopropiletilamina, diciclohexilamina, N-metilpiperidina, piridina, 4-pirolidinopiridina, picolina, 4-(N,N-dimetilamino) piridina, 2,6-di(tert-butil)-4-metilpiridina, quinolina, N,N-dimetilanilina y N,N-dietilanilina. La base preferida es trietilamina.
Los reactivos protectores de hidroxilo son; por ejemplo, haluros de sililo tales como cloruro de t-butildimetilsililo, cloruro de trimetilsililo, cloruro de trietilsililo, bromuro de trietilsililo, cloruro de triisopropilsililo, cloruro de dimetilisopropilsililo, cloruro de dietilisopropilsililo, cloruro de t-butildifenilsililo, cloruro de difenilmetilsililo, y cloruro de trifenilsililo; tritilhaluros tales como cloruro de 4-metoxitrifenilmetilo, cloruro de 4,4'-dimetoxitrifenilmetilo y cloruro de 4,4',4''-trimetoxitrifenilmetilo; y haluros de aralquilo tales como cloruro de bencilo, bromuro de bencilo y bromuro de p-metoxibencilo. El reactivo protector de hidroxilo preferido es el cloruro de t-butildifenilsililo.
La temperatura de reacción está normalmente comprendida entre -20ºC y la temperatura de reflujo del disolvente utilizado. La temperatura preferida está comprendida entre 0ºC y la temperatura de reflujo del disolvente utilizado.
El tiempo de reacción depende principalmente de la temperatura de reacción, del compuesto de partida, de la base y del disolvente utilizado. De forma ordinaria, está comprendido entre 10 min y 3 días, y el tiempo de reacción preferido está comprendido entre 1 hr y 24 hrs.
Después de que la reacción haya finalizado, el compuesto deseado (4) en la presente reacción es separado de la mezcla de reacción, de acuerdo con los métodos convencionales. Por ejemplo, la mezcla de reacción es neutralizada, y se añade agua y un disolvente orgánico inmiscible en agua, tal como acetato de etilo, sobre la mezcla de reacción neutralizada. Después del lavado con agua, se separa la fase orgánica incluyendo el compuesto deseado, y se seca sobre sulfato sódico anhidro o similar. El compuesto deseado es obtenido por evaporación del disolvente.
El compuesto obtenido, en el caso en que sea necesario, y de forma particular si se obtiene un producto en el que R^{8} es introducido sobre el grupo hidroxi en posiciones indeseadas, es purificado de forma adicional por los métodos convencionales, tal como recristalización y cromatografía de columna sobre gel de sílice.
Procedimiento A-3
Se preparó un compuesto (5) en este procedimiento que comprende la reacción del compuesto (4) obtenido en el procedimiento A-2 con un grupo saliente introduciendo el reactivo en presencia de una base en un disolvente inerte.
El disolvente utilizado es, por ejemplo, un hidrocarburo alifático tal como hexano, heptano, ligroína y éter de petróleo; un hidrocarburo aromático tal como benceno, tolueno y xileno; un hidrocarburo halogenado tal como cloruro de metileno, cloroformo, tetracloruro de carbono, dicloroetano, clorobenceno y diclorobenceno; un éster tal como formiato de etilo, acetato de etilo, acetato de propilo, acetato de butilo y carbonato de butilo; un éter tal como éter de dietilo, éter de diisopropilo, tetrahidrofurano, dioxano, dimetoxietano, y dietilen glicol dimetil éter; una cetona tal como acetona, metilo etilo cetona y metil isobutil cetona, isoforona, y ciclohexanona; un compuesto nitro tal como nitroetano y nitrobenceno; un nitrilo tal como acetonitrilo y isobutironitrilo; una amida tal como formamida, N,N-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida, N-metil-2-pirrolidona, N-metilpirrolidinona, y hexametilfosforotriamida; un sulfóxido tal como sulfolano; o una piridina.
Entre estos disolventes, el disolvente preferido es cloruro de metileno.
Los catalizadores básicos utilizados son bases tales como trietilamina, piridina y dimetilaminopiridina.
El reactivo que introduce el grupo salientes, por ejemplo, un haluro de alquilsulfonilo tal como cloruro de metanosulfonilo y bromuro de etanosulfonilo; o un haluro de arilsulfonilo tal como cloruro de p-toluenosulfonilo.
Los reactivos preferidos para introducir el grupo saliente son cloruro de metanosulfonilo y cloruro de p-toluenosulfonilo.
La temperatura de reacción depende del compuesto de partida, del disolvente, del reactivo que introduce el grupo saliente y de la base utilizada. Normalmente la temperatura está comprendida entre 0ºC y 50ºC, y la temperatura preferida está comprendida entre 10ºC y 40ºC.
El tiempo de reacción depende del compuesto de partida, del disolvente, del reactivo que introduce el grupo saliente y de la base utilizada. Normalmente el tiempo de reacción está comprendido entre 10 min y 24 hrs, y el tiempo de reacción preferido está comprendido entre 1 hr y 15 hrs.
Una vez finalizada la reacción, se separa el compuesto deseado (5) de esta reacción de la mezcla de reacción de acuerdo con los métodos convencionales. Por ejemplo, la mezcla de reacción es neutralizada y concentrada. Se añade al residuo agua y un disolvente orgánico inmiscible en agua, tal como acetato de etilo. Después del lavado con agua, se separa la fase orgánica incluyendo el compuesto deseado, se seca sobre sulfato sódico anhidro o similar, y a continuación el compuesto deseado puede ser obtenido por evaporación de los disolventes.
El compuesto obtenido es purificado, en el caso en que sea necesario, por los métodos convencionales, tal como recristalización, cromatografía de columna sobre gel de sílice y similar.
Procedimiento A-4
Se preparó un compuesto (6) en este procedimiento que comprende la reacción del compuesto (5) obtenido en el procedimiento A-3 con un anhídrido de ácido en presencia de un catalizador ácido en un disolvente.
El disolvente utilizado es, por ejemplo, un éter tal como dietiléter, dioxano y tetrahidrofurano; un nitrilo tal como acetonitrilo y isobutironitrilo; una amida tal como formamida, N,N-dimetilformamida, N,N-dimetil-acetamida,
N-metil-2-pirrolidona, N-metilpirrolidinona y hexametilfosforotriamida; o un ácido orgánico tal como ácido acético. El disolvente preferido es ácido acético.
El catalizador ácido utilizado en el procedimiento A-4 es, por ejemplo, un ácido inorgánico tal como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, o ácido nítrico. El ácido preferido es ácido sulfúrico (de forma particular ácido sulfúrico concentrado).
El anhídrido de ácido utilizado es, por ejemplo, un anhídrido de ácido alifático inferior tal como anhídrido de ácido acético, anhídrido de ácido propiónico y similar. El anhídrido de ácido preferido es anhídrido acético.
La temperatura de reacción depende del compuesto de partida, del disolvente, del catalizador ácido y del anhídrido de ácido utilizado. Normalmente la temperatura de reacción está comprendida entre 0ºC y 50ºC, y la temperatura de reacción preferida está comprendida entre 10ºC y 40ºC.
El tiempo de reacción depende del compuesto de partida, del disolvente, del catalizador ácido, del anhídrido de ácido y de la temperatura de reacción utilizada. Normalmente el tiempo de reacción está comprendido entre 10 min y 12 hrs, y el tiempo de reacción preferido está comprendido entre 30 min y 6 hrs.
Una vez finalizada la reacción, se separa el compuesto deseado (6) de esta reacción de la mezcla de reacción de acuerdo con los métodos convencionales. Se añade a la mezcla de reacción, por ejemplo, agua y un disolvente orgánico inmiscible en agua, tal como acetato de etilo. Después del lavado con agua, se aísla la fase orgánica incluyendo el compuesto deseado, se seca sobre sulfato sódico anhidro o similar, y a continuación el compuesto deseado puede ser obtenido por evaporación del disolvente.
El compuesto obtenido es, en el caso en que sea necesario, purificado de forma adicional por los métodos convencionales, tal como recristalización, cromatografía de columna sobre gel de sílice y similar.
Procedimiento A-5
Se preparó un compuesto de (7) en este procedimiento que comprende la reacción del compuesto (6) obtenido en el procedimiento A-4 con un derivado de trimetilsililo de una purina o pirimidina opcionalmente sustituida, que se preparó de acuerdo con la literatura (H. Vorbrueggen, K. Krolikiewicz y B. Bennua, Chem Ber., 114, 1234-1255 (1981)), en presencia de un catalizador ácido en un disolvente inerte.
El disolvente utilizado es un hidrocarburo aromático tal como benceno, tolueno y xileno; un hidrocarburo halogenado tal como cloruro de metileno, cloroformo, tetracloruro de carbono, 1,2-dicloroetano, clorobenceno y diclorobenceno; un nitrilo tal como acetonitrilo y isobutironitrilo; una amida tal como formamida, N,N-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida, N-metil-2-pirrolidona, N-metil-pirrolidinona y hexametilfosforotriamida; o disulfuro de carbono. El disolvente preferido es 1,2-dicloroetano.
El catalizador ácido utilizado es, por ejemplo, un catalizador del tipo ácido de Lewis tal como AlCl_{3}, SnCl_{4}, TiCl_{4}, ZnCl_{2}, BF_{3} y trifluorometanosulfonato de trimetilsililo. El catalizador ácido preferido es tetracloruro de estaño (SnCl_{4}).
La temperatura de reacción depende del compuesto de partida, del disolvente y del catalizador ácido utilizado. Normalmente la temperatura de reacción está comprendida entre 0ºC y 100ºC, y la temperatura de reacción preferida está comprendida entre 30ºC y 80ºC.
El tiempo de reacción depende del compuesto de partida, del disolvente, del catalizador ácido, y de la temperatura de reacción utilizada. Normalmente el tiempo de reacción está comprendido entre 1 hr y 3 días, y el tiempo de reacción preferido está comprendido entre 1 hr y 2 días.
Una vez finalizada la reacción, se separa el compuesto deseado (7) de esta reacción de la mezcla de reacción de acuerdo con los métodos convencionales. Por ejemplo, se neutraliza la mezcla de reacción, y se añade agua y un disolvente orgánico inmiscible en agua, tal como acetato de etilo o cloruro de metileno, sobre la mezcla resultante. Después del lavado con agua, se separa la fase orgánica incluyendo el compuesto deseado, se seca sobre sulfato sódico anhidro o similar, y a continuación el compuesto deseado puede ser obtenido por evaporación del disolvente.
El compuesto obtenido es purificado, en el caso en que sea necesario, por los métodos convencionales, por ejemplo recristalización, cromatografía de columna sobre gel de sílice, y similar.
Procedimiento A-6
Se preparó un compuesto (1c) en este procedimiento que comprende una reacción de ciclación del compuesto (7) obtenido en el procedimiento A-5 en presencia de un catalizador básico en un disolvente inerte.
El disolvente utilizado no tiene limitación en tanto en cuanto no inhiba la reacción y disuelva el compuesto de partida en alguna extensión. Los disolventes preferidos son alcoholes tal como metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, t-butanol, alhol isoamílico, dietilen glicol, glicerina, octanol, ciclohexanol y metil celosolve. El disolvente más preferido es metanol.
El catalizador básico utilizado es, por ejemplo, un hidróxido de metal alcalino tal como hidróxido sódico e hidróxido potásico; un carbonato de metal alcalino tal como carbonato de sodio y carbonato de potasio; un alcóxido de metal alcalino tal como metóxido sódico y etóxido sódico; o una solución de amoníaco acuoso y similar. Los catalizadores básicos preferidos son carbonatos de metal alcalinos y el catalizador básico más preferido es el carbonato de so-
dio.
La temperatura de reacción depende del compuesto de partida, del disolvente, y del catalizador básico utilizado. Normalmente la temperatura de reacción está comprendida entre 0ºC y 50ºC, y la temperatura de reacción preferida está comprendida entre 10ºC y 30ºC.
El tiempo de reacción depende del compuesto de partida, del disolvente, del catalizador básico, y de la temperatura de reacción utilizada. Normalmente el tiempo de reacción está comprendido entre 1 hr y 3 días, y el tiempo de reacción preferido está comprendido entre 3 hr y 2 días.
Una vez finalizada la reacción, se separa el compuesto deseado (1a) de esta reacción de la mezcla de reacción de acuerdo con los métodos convencionales. Por ejemplo, se concentra la mezcla de reacción, y se añade al residuo agua y un disolvente orgánico inmiscible en agua, tal como acetato de etilo. Después del lavado con agua, se separa la fase orgánica incluyendo el compuesto deseado, se seca sobre sulfato sódico anhidro o similar, y a continuación el compuesto deseado puede ser obtenido por evaporación del disolvente.
El compuesto obtenido es purificado, en el caso en que sea necesario, por los métodos convencionales, por ejemplo, recristalización, cromatografía de columna sobre gel de sílice, y similar.
Procedimiento A-7
Se preparó un compuesto (1b) en este procedimiento que comprende la reacción del compuesto (1a) obtenido en el procedimiento A-6 con un agente de desprotección en un disolvente inerte. En el caso en que la desprotección no sea necesaria, el siguiente procedimeinto puede ser llevado a cabo sin este procedimiento.
El procedimiento de desprotección depende de los grupos protectores utilizados, y el reactivo de desprotección no tiene limitación a no ser que tenga un efecto adverso en la reacción. Por ejemplo, la desprotección puede ser llevada a cabo de acuerdo con los métodos descritos en la literatura "Protective Groups en Organic Synthesis" (Theodora W. Greene, 1981, A Wiley-Interscience Publication).
Cuando existen diferentes tipos de grupos protectores, algunos de estos métodos se combinan de forma apropiada y cada uno de ellos se lleva a cabo en orden.
De forma particular cuando los grupos protectores son (1) "grupos acilo alifáticos o grupos acilo aromáticos", (2) "un grupo metilo sustituido por 1 y 3 grupos arilo" o "grupos metilo sustituido por entre 1 y 3 anillos de arilo en donde el anillo de arilo está sustituido por un grupo alquilo inferior, alcoxi inferior, ciano o un átomo de halógeno", (3) "grupos sililo", los grupos protectores pueden ser desprotegidos con los métodos siguientes.
(1) Cuando los grupos protectores son grupos acilo alifáticos o acilo aromáticos, éstos son normalmente desprotegidos por reacción con bases en disolventes inertes.
Los disolventes utilizados no tienen limitación en tanto en cuanto son utilizados de forma habitual en las hidrólisis. Por ejemplo, se utilizan agua; disolventes orgánicos, por ejemplo, alcoholes tal como metanol, etanol, y n-propanol; éteres tal como tetrahidrofurano y dioxano, o una mezcla de agua y los anteriores disolventes orgánicos. Los disolventes preferidos son los alcoholes.
Las bases utilizadas no tienen limitación a no ser que afecten a las otras mitades de los compuestos. Las bases preferidas son los alcóxidos metálicos tales como el metóxido de sodio; los carbonatos de metales alcalinos tales como carbonato de sodio, el carbonato potásico y el carbonato de litio; hidróxidos de metales alcalinos tales como hidróxido sódico, hidróxido potásico, hidróxido de litio e hidróxido de bario; o amoníaco-etanol. Las bases preferidas son los carbonatos de metales alcalinos.
La temperatura de reacción y el tiempo de reacción dependen del compuesto de partida, del disolvente, de la base utilizada. Normalmente la temperatura de reacción está comprendida entre 0ºC y 150ºC y el tiempo de reacción está comprendido entre 1 hr. y 10 hrs. Con el fin de suprimir la producción de sub-productos.
Una vez finalizada la reacción, se separa el compuesto deseado (1b) de esta reacción de la mezcla de reacción de acuerdo con los métodos convencionales. Por ejemplo, se concentra la mezcla de reacción y se añaden sobre el residuo agua y un disolvente orgánico inmiscible en agua, tal como acetato de etilo. Después del lavado con agua, se separa la fase orgánica incluyendo el compuesto deseado, se seca sobre sulfato sódico anhidro o similar, y a continuación el compuesto deseado puede ser obtenido por evaporación del disolvente.
El compuesto obtenido es purificado, en el caso en que sea necesario, por los métodos convencionales, por ejemplo recristalización, cromatografía de columna sobre gel de sílice y similar.
(2) En el caso en que el grupo protector es "un grupo metilo sustituido por 1 y 3 grupos arilo" o "un grupo metilo sustituido por 1 y 3 grupos arilo en donde el anillo de arilo está sustituido por un grupo alquilo inferior, un grupo alcoxi inferior, un átomo de halógeno o un grupo ciano", se lleva a cabo la desprotección con un reactivo de reducción en un disolvente inerte.
Los disolventes preferidos utilizados son alcoholes tales como metanol, etanol y isopropanol; éteres tal como éter de dietilo, tetrahidrofurano y dioxano; hidrocarburos aromáticos tales como tolueno, benceno y xileno; hidrocarburos alifáticos tales como hexano y ciclohexano; ésteres tales como acetato de etilo y acetato de propilo; ácidos orgánicos tales como ácido acético; o mezclas de estos disolventes orgánicos y agua.
Los reactivos de reducción utilizados no tienen limitación si son utilizados normalmente en reacciones catalíticas. Los agentes de reducción preferidos son paladio sobre carbón, níquel Raney, óxido de platino, negro de platino, óxido de rodio y aluminio, trifenilfosfina-cloruro de rodio y paladio-sulfato de bario.
La presión de la reacción no tiene limitación. Normalmente este procedimiento se lleva a cabo bajo una presión de entre 1 y 10 atmósferas.
La temperatura de reacción está comprendida entre 0ºC y 60ºC, y la temperatura de reacción preferida está comprendida entre 20ºC y 40ºC.
El tiempo de reacción está comprendido entre 10 min. y 24 hrs. y el tiempo de reacción preferido está comprendido entre 1 y 3 hrs.
Una vez finalizada la reacción, se separa el compuesto deseado (1b) de esta reacción de la mezcla de reacción de acuerdo con los métodos convencionales. Por ejemplo, se elimina el reactivo de reducción, y se añade agua y un disolvente orgánico inmiscible en agua, tal como acetato de etilo, a la mezcla de reacción. Después del lavado con agua, se separa la fase orgánica incluyendo el compuesto deseado, se seca sobre sulfato sódico anhidro o similar, y a continuación el compuesto deseado puede ser obtenido por evaporación del disolvente.
El compuesto obtenido es purificado además, en el caso en que sea necesario, por los métodos convencionales, por ejemplo recristalización, cromatografía de columna sobre gel de sílice y similar.
Cuando el grupo protector es "un grupo metilo sustituido por 3 grupos arilo", es decir, cuando el grupo protector es un grupo tritilo, la desprotección también puede llevarse a cabo utilizando un ácido.
En este caso, se utilizan los siguientes disolventes, por ejemplo, hidrocarburos aromáticos tales como benceno, tolueno y xileno; hidrocarburos halogenados tales como cloruro de metileno, cloroformo, tetracloruro de carbono, 1,2-dicloroetano, clorobenceno y diclorobenceno; alcoholes tal como metanol, etanol, isopropanol y tert-butanol; nitrilos tal como acetonitrilo y isobutironitrilo; amidas tal como formamida, N,N-dimetilo formamida, N,N-dimetilacetamida, N-metil-2-pirrolidona, N-metil-pirrolidinona, y hexametilfosoforotriamida; y ácidos orgánicos tales como ácido acético. Los disolventes preferidos son ácidos orgánicos (de forma particular ácido acético) y alcoholes (de forma particular tert-butanol).
El ácido preferido a utilizar es el ácido acético o el ácido trifluoroacético.
La temperatura de reacción está comprendida entre 0ºC y 60ºC, y la temperatura de reacción preferida está comprendida entre 20ºC y 40ºC.
El tiempo de reacción está comprendido entre 10 min y 24 hrs y el tiempo de reacción preferido está comprendido entre 1 y 3 hrs.
Una vez finalizada la reacción, se separa el compuesto deseado (1b) de esta reacción de la mezcla de reacción de acuerdo con los métodos convencionales. Por ejemplo, se neutraliza la mezcla de reacción, y se añade a la mezcla resultante agua y un disolvente orgánico inmiscible en agua, tal como acetato de etilo. Después del lavado con agua, se separa la fase orgánica incluyendo el compuesto deseado, se seca sobre sulfato sódico anhidro o similar, y a continuación el compuesto deseado puede ser obtenido por evaporación del disolvente.
El compuesto obtenido es, en el caso en que sea necesario, purificado de forma adicional por los métodos convencionales, por ejemplo recristalización, cromatografía de columna sobre gel de sílice y similar.
(3) En el caso en que el grupo protector es "un grupo sililo", el grupo protector es normalmente desprotegido por tratamiento con compuestos que producen el anión flúor, tales como fluoruro de tetrabutilamonio, ácido hidrofluórico, ácido hidrofluórico-piridina, y fluoruro potásico, o ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido metanosulfónico, ácido para-toluenosulfónico, ácido trifluoroacético, y ácido trifluorometanosulfónico, o ácido inorgánicos tales como ácido clorhídrico.
Cuando es grupo protector es deprotegido con un anión flúor, la reacción es acelerada, en algunos casos, por la adición de un ácido orgánico tal como ácido fórmico, ácido acético o ácido propiónico.
Los disolventes utilizados no tienen limitación en tanto en cuanto no inhiben la reacción y disuelven los productos de partida en alguna extensión. Sin embargo, los disolventes preferidos son éteres tales como éter de dietilo, diisopropiléter, tetrahidrofurano, dioxano, dimetoxietano y dietilen glicol dimetil éter; nitrilos tales como acetonitrilo y isobutironitrilo; agua; ácidos orgánicos tales como ácido acético, y mezclas de estos disolventes descritos anteriormente.
La temperatura de reacción está comprendida entre 0ºC y 100ºC, y la temperatura de reacción preferida está comprendida entre 20ºC y 70ºC.
El tiempo de reacción está comprendido entre 5 min. y 48 hrs. y el tiempo de reacción preferido está comprendido entre 1 y 24 hrs.
Una vez finalizada la reacción, se separa el compuesto deseado (1b) de esta reacción de la mezcla de reacción de acuerdo con los métodos convencionales. Por ejemplo, los disolventes son evaporados y a continuación el compuesto es purificado por cromatografía de columna sobre gel de sílice.
Procedimiento A-8
Se preparó un compuesto (1c) en este procedimiento que comprende la reducción catalítica del grupo azido en el compuesto (1b) obtenido en el procedimiento A-7 a un grupo amino en presencia de hidrógeno y de un catalizador en un disolvente inerte y, en el caso en que sea necesario, la protección del grupo amino.
Los disolventes utilizados no tienen limitación en tanto en cuanto no tienen un efecto adverso en esta reacción. Los disolventes preferidos son alcoholes tales como metanol, etanol y isopropanol; éteres tal como dietiléter, tetrahidrofurano y dioxano; hidrocarburos aromáticos tales como tolueno, benceno y xileno; hidrocarburos alifáticos tales como hexano y ciclohexano; ésteres tales como acetato de etilo y acetato de propilo; amidas tales como formamida, dimetilformamida, dimetilacetamida, N-metil-2-pirrolidone y hexametilfosforotriamida; ácidos alifáticos tales como ácido fórmico y ácido acético; agua; o mezclas de estos disolventes descritos anteriormente.
Los catalizadores utilizados no tienen limitación si son normalmente utilizados en las reducciones catalíticas. Los catalizadores preferidos son paladio sobre carbón, negro de paladio, níquel Raney, óxido de platino, negro de platino, rodio-óxido de alumino, trifenilfosfina-cloruro de rodio, paladio-sulfato de bario.
La presión de la reacción no tiene limitación, pero normalmente está comprendida entre 1 y 10 atmósferas.
La temperatura de reacción y el tiempo de reacción dependen del compuesto de partida, del disolvente, y del catalizador utilizado. Normalmente la temperatura de reacción está comprendida entre 0ºC y 100ºC (la temperatura de reacción preferida está comprendida entre 20ºC y 40ºC), y el tiempo de reacción está comprendido entre 5 min. y 48 hrs. (el tiempo de reacción preferido está comprendido entre 30 min. y 10 hrs.).
Una vez finalizada la reacción, se separa el compuesto deseado (1c) de esta reacción de la mezcla de reacción de acuerdo con los métodos convencionales. Por ejemplo, el compuesto deseado puede ser obtenido por eliminación de los catalizadores por filtración y por evaporación del disolvente del filtrado.
En el caso en que se desee, el grupo amino puede ser protegido de acuerdo con los métodos descritos en la literatura anterior (Protective Groups in Organic Synthesis).
Puede prepararse un análogo oligonucleótido de tipo N3'-P5' en el que el átomo de nitrógeno en la posición 3' y el átomo de oxígeno en la posición 5' son combinados a través del ácido fosfórico utilizando el compuesto (1d) de esta invención de acuerdo con el método B descrito a continuación.
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En el procedimiento descrito anteriormente, B^{1} y R^{8} son tal como se han definido previamente. Sin embargo B^{1} en la fórmula (1d) y B^{1} en la fórmula (8) pueden ser iguales o diferentes.
R^{11} representa una resina tal como Cristal de Poro Controlado de tipo succinilo (Controlled Pore Glass) o Tentagel, que normalmente es utilizado para la síntesis de oligonucleótidos.
CEO representa un grupo 2-cianoetoxi.
Cada procedimiento del método B será descrito en detalle a continuación.
Procedimiento B-1
Se preparó un compuesto (9) en este procedimiento que comprende una reacción de acoplamiento por fosforilación oxidativa del compuesto (1d) con el compuesto (8). Este procedimiento se lleva a cabo tal como se ha descrito en la literatura (1) (Nucleic Acids Research, Vol. 23, No. 14, pp. 2661-2668, 1995).
Se protege el grupo hidroxi en la posición 5' del compuesto (1d) en el compuesto (1c) en el Procedimiento A-8, y en el caso de que exista un grupo amino en la base B, se protege dicho grupo amino del compuesto (1d).
Además, el compuesto (8) puede ser preparado a partir del compuesto (1c) obtenido en el "Procedimiento A-8", de acuerdo con la literatura (1).
Procedimiento B-2
Este procedimiento es para producir un oligonucleótido a partir del compuesto (9) obtenido en el "Procedimiento B-1".
El procedimiento comprende la desprotección del grupo protector de hidroxilo R^{8} del compuesto (9) por una manera de realizar el procedimiento A-7, fosforilación de acuerdo con la literatura (1), reacción con el compuesto (1d) en un método similar al descrito en el Procedimiento B-1, seguido por repetición de estas reacciones para dar el oligonucleótido deseado.
La longitud de la secuencia de los oligonucleótidos obtenida es normalmente de 2-50 unidades de nucleósidos, y la longitud preferida es de 10-30 unidades de nucleósidos.
Los análogos de oligonucleótidos obtenidos son resistentes a varias nucleasas. De este modo permanecen en el cuerpo durante un largo tiempo después de la administración. Además, por ejemplo, los análogos de oligonucleótidos, forman hebras dobles estables con mRNA, e inhiben la biosíntesis de proteínas que contribuyen a la patogénesis, o inhiben la transcripción a mRNA por formación de tripletes con las dobles hebras de DNA en genomas, o inhiben la proliferación de virus.
De este modo los análogos de oligonucleótidos de la presente invención pueden suprimir funciones del genoma especificadas, y se espera que sean agentes terapéuticos utilizados para el tratamiento de enfermedades, tales como agentes anti-neoplasma, agentes anti-virales, o similares.
Las formulaciones no-orales o las formulaciones en liposomas de los análogos de oligonucleótidos de esta invención pueden ser preparadas, por ejemplo, por adición de adyuvantes convencionales tales como tampones y/o estabilizantes. Los análogos de nucleótidos pueden ser mezclados con soportes farmacéuticos convencionales para preparar ungüentos, cremas, líquidos o emplastos.
Sus dosis son diferentes de acuerdo con los síntomas de la enfermedad, la edad del paciente, y la vía de administración. Por ejemplo, la menor dosis del análogo de oligonucleótido es de 0,001 mg/kg de peso corporal (preferiblemente 0,01 mg/kg de peso corporal), y la mayor dosis es de 100 mg/kg de peso corporal (preferiblemente 10 mg/kg de peso corporal como una dosis única). Es deseable administrar entre una y varias veces a lo largo del día dependiendo de los síntomas del paciente.
La presente invención será descrita a continuación en mayor detalle por vía de los siguientes Ejemplos y ejemplos de Referencia. Sin embargo, la presente invención no está limitada a dichos ejemplos.
Mejor modo de llevar a cabo la invención Ejemplo 1 3'-Azido-5'O-tert-butildifenilsilil-3'-deoxi-2'-0,4'-C-metilen-5-metiluridina
(Número de compuesto de ejemplificación 2-48)
Se añadió carbonato potásico (41 mg, 0,29 mmol) a una solución de metanol (7 ml) del compuesto obtenido en el ejemplo de Referencia 5 (200 mg, 0,27 mmol) a 0ºC y se agitó la mezcla durante 4,5 hrs a temperatura ambiente. Se añadió más carbonato potásico (34 mg, 0,25 mmol) a la mezcla, que se agitó durante 23 hrs. Después de que se evaporó el metanol, el residuo se repartió entre acetato de etilo y agua. Se lavó el extracto con solución acuosa saturada de cloruro sódico. Se secó la fase orgánica sobre sulfato sódico anhidro. Se evaporaron los disolventes y el residuo se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (acetato de etilo: n-hexano = 2:1) para dar el compuesto del título en forma de cristales incoloros (142 mg, 0,27 mmol, 100%).
Punto de fusión 93-95ºC.
IR \numax (KBr): 3169, 3047, 2956, 2888, 2859, 2117, 1696, 1275, 1109 cm^{- 1}.
RMN-H^{1} (CDCl_{3}) \delta: 1,12 (9H, s), 1,65 (3H, s), 3,78, 3,84 (2H, AB, J = 8 Hz), 3,90, 4,08 (2H, AB, J = 12,5 Hz), 4,02 (1H, s), 4,67 (1H, s), 5,67 (1H, s), 7,54 (1H, s), 7,39-7,48 (6H, m), 7,67-7,71 (4H, m), 8,46 (1H, s ancho).
RMN-C^{13} (CDCl_{3}) \delta: 12,3, 19,5, 27,0, 58,7, 60,3, 71,4, 77,2, 78,6, 87,2, 90,1, 110,8, 128,0, 130,1, 130,2, 131,7, 132,3, 133,7, 135,1, 135,4, 149,6, 163,6.
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Ejemplo 2 3'-Azido-3'-deoxi-2'-O,4'-C-metilen-5-metiluridina
(Número de compuesto de ejemplificación 2-14)
Se añadió fluoruro de tetrabutilamonio (10 M en THF, 290 \mul, 0,29 mmol) sobre una solución de tetrahidrofurano anhidro (5 ml) del compuesto obtenido en el Ejemplo 1 (140 mg, 0,26 mmol) en una corriente de nitrógeno gas y la solución se agitó 1 hr a temperatura ambiente. Se evaporó el disolvente y el residuo se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (acetato de etilo: n-hexano = 25:1) y se obtuvo el compuesto del título como un polvo blanco (65,7 mg, 0,22 mmol, 85%).
Punto de fusión 94-96ºC.
IR \numax (KBr): 3163, 3046, 2118, 1692, 1468, 1273, 1062 cm^{-1}.
RMN-H^{1} (CD_{3}OD) \delta: 1,89 (3H, s), 3,76, 3,86 (2H, AB, J = 8 Hz), 3,85, 3,95 (2H, AB, J = 13 Hz), 4,03 (1H, s), 4,58 (1H, s), 5,58 (1H, s), 7,70 (1H, s).
RMN-C^{13} (CD_{3}OD) \delta: 12,8, 57,3, 61,2, 72,4, 79,8, 88,3, 91,0, 110,8, 136,3, 151,5, 166,1.
Ejemplo 3 3'-Amino-3'-deoxi-2'-0,4'-C-metilen-5-metiluridina
(Número de compuesto de ejemplificación 2-4)
Se añadió una solución en etanol (3 ml) del compuesto obtenido en el Ejemplo 2 (64 mg, 0,22 mmol) sobre paladio sobre carbón al 10% (28 mg) suspendido en una solución de tetrahidrofurano anhidro (5 ml) en una corriente de hidrógeno gas, y se agitó la mezcla durante 0,5 hr a temperatura ambiente. Se filtró la mezcla de reacción y se evaporó el disolvente del filtrado y se obtuvo el compuesto del título como un polvo blanco (59 mg, 0,22 mmol, 100%).
Punto de fusión 243-246ºC.
IR \numax (KBr): 3459, 3365, 1699, 1447, 1273, 1054 cm^{-1}.
RMN-H^{1} (C_{5}D_{5}N) \delta: 1,83 (3H, s), 3,62 (1H, s), 3,92, 4,14 (2H, AB, J = 8 Hz), 4,24 (2H, s), 4,54 (1H, s), 5,97 (1H, s), 7,90 (1H, s).
RMN-C^{13} (C_{5}D_{5}N) \delta: 12,8, 54,2, 57,2, 71,6, 81,4, 91,1, 109,5, 150,8, 164,3.
Ejemplo 4 3'-Azido-3'-deoxi-5'-0-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-0,4'-C-metilen-5-metiluridina
(Número de compuesto de ejemplificación 2-36)
Se añadió cloruro de dimetoxitritilo (415 mg, 1,22 mmol) y dimetilaminopiridina (12,5 mg, 0,10 mmol) sobre una solución de piridina (6 ml) del compuesto obtenido en el Ejemplo 2 (300 mg, 1,02 mmol) en una corriente de nitrógeno gas y se agitó la solución durante 20,5 hr a temperatura ambiente. Se añadió una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico sobre la mezcla de reacción y se extrajo la mezcla resultante con diclorometano. Se lavó la fase orgánica con agua y con solución acuosa saturada de cloruro sódico, y se secó sobre sulfato sódico anhidro. Se evaporó el disolvente a presión reducida y el residuo se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (n-hexano: acetato de etilo = 2 : 1 \rightarrow 1:1) y se obtuvo el compuesto del título como una espuma de color amarillo pálido (462 mg, 0,78 mmol, 76%).
Punto de fusión 125-128ºC.
RMN-H^{1} (CDCl_{3}) \delta: 1,66 (3H, s), 3,32, 3,65 (2H, ABq, J = 11 Hz), 3,78 (2H, s), 3,80 (6H, s), 4,13 (1H, s), 4,63 (1H, s), 5,67 (1H, s), 6,86 (4H, dd, J = 2 Hz, 9 Hz), 7,23-7,45 (9H, m), 7,73 (1H, s), 8,04 (1H, s ancho).
Ejemplo 5 3'-Amino-3'-deoxi-5'-0-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-0,4'-C-metilen-5-metiluridina
(Número de compuesto de ejemplificación 2-60)
Se añadió trifenilfosfina (94,0 ml, 0,36 mmol) sobre una solución de piridina (2,5 ml) del compuesto obtenido en el Ejemplo 4 (110 mg, 0,18 mmol) en una corriente de nitrógeno y se agitó la mezcla durante 3,5 hr a temperatura ambiente. Se añadió una solución acuosa de amoníaco al 28% (5,5 ml) sobre la mezcla de reacción que se agitó 24 hrs a temperatura ambiente. El disolvente se evaporó a presión reducida y se purificó el producto crudo por cromatografía de columna sobre gel de sílice (cloroformo : etanol = 20 : 1) y se obtuvo el compuesto del título como una espuma de color amarillo pálido (462 mg, 0,78 mmol, 76%).
Punto de fusión 131-134ºC.
RMN-H^{1} (Piridina-d_{5}) \delta: 1,89 (3H, s), 3,71 (6H, s), 3,77 (1H, s), 3,84 (2H, s), 3,99, 4,10 (2H, ABq, J = 8 Hz), 4,69 (1H, s), 6,04 (1H, s), 7,03-7,87 (13H, m), 8,58 (1H, s).
Ejemplo 6 2-Cianoetil éster de la 3'-amino-3'-deoxi-5'-0-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-0,4'-C-metilen-5-metiluridinil-(3'\rightarrow5')-3'-O-(tert-butildimetilsililo)timidina
Se añadió una solución de tetracloruro de carbono (0,3 ml) del compuesto obtenido en el Ejemplo 5 (10,0 mg, 18 \mumol), y una solución de trietilamina (0,05 ml, 0,36 mmol) en acetonitrilo (0,2 ml), sobre una solución de acetonitrilo (0,3 ml) del compuesto obtenido en el ejemplo de Referencia 6 (14,5 mg, 0,28 \mumol) en una corriente de nitrógeno gas, y la solución se agitó durante 14,5 hr a temperatura ambiente. El disolvente se evaporó a presión reducida y se purificó el producto crudo por cromatografía de columna sobre gel de sílice (n-hexano : acetato de etilo = 1:1\rightarrow0:1) y se obtuvo el compuesto del título como un polvo blanco (13,0 mg, 12,5 \mumol, 71%).
Punto de fusión 101-105ºC.
RMN-P^{31} (CDCl_{3}) \delta: 7,68, 8,24, Mass(FAB): m/z 1043(M^{+}+H).
Ejemplo 7 Éster metílico de la 3'-amino-3'-deoxi-5'-0-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-0,4'-C-metilen-5-metiluridinil-(3'\rightarrow5')-3'-O-(tert-butildimetilsililo)timidina
Se añadió una solución de tetracloruro de carbono (0,3 ml) del compuesto obtenido en el Ejemplo 5 (10,0 mg, 18 \mumol), y una solución de trietilamina (0,05 ml, 0,36 mmol) en acetonitrilo (0,2 ml), sobre una solución de acetonitrilo (0,3 ml) del compuesto obtenido en el ejemplo de Referencia 7 (22,1 mg, 51 \mumol) en una corriente de nitrógeno gas, y se agitó la solución durante 18 hrs a temperatura ambiente. Se añadió agua a la mezcla de reacción y se extrajo la mezcla de reacción con acetato de etilo. Se lavó la fase orgánica con solución acuosa saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato sódico anhidro. Se evaporó el disolvente a presión reducida y se purificó el producto crudo por cromatografía de columna sobre gel de sílice (diclorometano : metanol = 20:1, 30:1) y se obtuvo el compuesto del título como un polvo blanco (6,9 mg, 6,87 \mumol, 39%).
Punto de fusión 118-122ºC.
RMN-P^{31} (CDCl_{3}) \delta: 11,20, 11,30, Espectro de Masas (FAB): m/z 1026(M^{+}+Na).
Ejemplo 8 Ester metílico de la 3'-amino-3'-deoxi-5'-0-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-0,4'-C-metilen-5-metiluridinil-(3'\rightarrow5')-timidina
Se añadió una solución en tetrahidrofurano de fluoruro de tetrabutilamonio (1,0 M, 15 \mul, 15 \mumol) sobre una solución en tetrahidrofurano (1 ml) del compuesto obtenido en el Ejemplo 7 (13,9 mg, 14 \mumol) en una corriente de nitrógeno gas, y se agitó la solución durante 3 hrs a temperatura ambiente. Se evaporó el disolvente a presión reducida y se purificó el producto crudo por cromatografía de columna sobre gel de sílice (acetato de etilo : etanol = 5:1) y se obtuvo el compuesto del título como un polvo incoloro (9,7 mg, 10,9 \mumol, 78%).
Punto de fusión 157-160ºC.
RMN-P^{31} (CDCl_{3}) \delta: 11,20, 11,30, Espectro de Masas (FAB): m/z 1026(M^{+}+Na).
Ejemplo 9 Ester metílico de la 3'-amino-3'-deoxi-5'-0-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-0,4'-C-metilen-5-metiluridinil-(3'\rightarrow5')-2'-[ciano-etoxi(diisopropilamino)fosphino]timidina
Se añadió tetrahidrofurano (0,2 ml) sobre una solución de acetonitrilo (0,6 ml) del compuesto obtenido en el Ejemplo 8 (10,0 mg, 11 \mumol) y tetrazolida de diisopropilamonio (15,5 mg, 77 \mumol), a continuación se añadió
2-cianoetildiisopropilclorofosforoamidita (39,8 mg, 132 \mumol), en una corriente de nitrógeno gas y se agitó la solución durante 25 hrs a temperatura ambiente. Se evaporó el disolvente a presión reducida. El residuo compuesto se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (acetato de etilo: trietilamina = 99:1\rightarrowacetato de etilo : etanol : trietilamina = 100 : 10 : 1). El producto se reprecipitó con dicloroetano y n-hexano y se obtuvo el compuesto del título como un polvo blanco (3,8 mg, 3,5 \mumol, 31%).
Punto de fusión 113-116ºC.
RMN-P^{31} (CD_{3}OD) \delta: 8,67, 8,77, 9,07, 9,28, 148,53, 148,93, 148,99, 149,03.
Ejemplo 10 Síntesis de análogos de oligonucleótidos
Se sintetizaron oligonucleótidos de forma automática, utilizando un sintetizador de DNA (fabricado por Pharmacia Co., Gen Assembler Plus), a una escala de 0,2 \mumol. Los disolventes y las concentraciones de reactivos y de fosforamidita en cada procedimiento de la producción son idénticos a los de la producción de oligonucleótidos naturales. Los disolventes, reactivos y fosforamiditas de los nucleósidos naturales utilizados fueron los suministrados por Pharmacia. El grupo DMTr de Universal QCPG (0,2 \mumol, fabricado por Glen Research) fue desprotegido con ácido tricloroacético, y el grupo hidroxi producido fue tratado con el compuesto obtenido en el Ejemplo 9 o las amiditas utilizadas en la síntesis de nucleótidos naturales. Este procedimiento de condensación fue repetido para obtener los análogos de oligonucleótidos de las secuencias deseadas. El ciclo sintético fue el siguiente;
Ciclo de Síntesis
1)
Desritilación con tricloroacetato / diclorometano; 60 sec.
2)
Acoplamiento con fosforamidita (25 eq) tetrazol / acetonitrilo; 2 min o 30 min.
3)
Coronación con 1-metilimidazol / acetonitrilo, ácido acético anhidro / 2,4,6-collidina/acetonitrilo; 36 sec.
4)
Oxidación con yodo / agua / piridina / acetonitrilo; 60 sec.
Cuando el compuesto obtenido en el Ejemplo 9 reaccionó en el anterior ciclo 2, el tiempo de reacción fue de 30 min, y cuando se utilizaron otras fosforamiditas, el tiempo de reacción fue de 2 min.
Después de que se sintetizara el oligonucleótido con la secuencia deseada, se llevó a cabo el ciclo sintético hasta el ciclo 1 descrito anteriormente, se desprotegió el grupo dimetoxitritilo de la posición 5', y a continuación, siguiendo los métodos convencionales, se separó el oligómero de su sustancia de soporte con una solución de amoníaco concentrado, se desprotegió el grupo protector del grupo cianoetilo en el átomo de fósforo, y se desprotegieron los grupos protectores en las bases de ácido nucleico.
Se purificó el oligómero por HPLC de fase reversa y se obtuvo el oligonucleótido deseado.
De acuerdo con este método, se obtuvo el análogo del oligonucleótido 5'-ttttttttttnt-3' (número de secuencia 1 en la tabla de secuencia), de la que n en el número de base 11 fue la 3'-amino-3'deoxi-2'-0,4'-C-metilen-5-metiluridina (llamada de aquí en adelante "oligonucleótido (1)").
(Rendimiento 8,5 nmol, 4,3%)
Los análogos de oligonucleótidos obtenidos fueron purificados por HPLC de fase reversa (HPLC : Modelo 302, columna fabricada por GILSON; CHEMCO CHEMCOBOND 5-ODS-H (7,8 \times 300 mm); gradiente lineal de una solución acuosa de acetato de trietilamina al 0,1 M (TEAA), pH7; 10\rightarrow12,5% CH_{3}CN / 40 min; 50ºC; 2,5 ml/min; 254 nm), y se recogió la fracción eluída a 25,4.
Ejemplo 11 Síntesis de análogos de oligonucleótidos
Mediante la utilización de la 5'O-dimetoxitritil-N-4-benzoil-5-metil-2'deoxicitidina-3'-O-(2-cianoetil)N,N-diisopropilfosforamidita (fabricada por Pharmacia CO.), se obtuvo un análogo de nucleótido de la secuencia representada como 5'-tttttmtntmtmtmt-3' (número de secuencia 2 en la tabla de secuencia), en la que m representa la 5-metilo 2'-deoxicitidina y n representa la 3'-amino-3'-deoxi-2'-O,4'-C-metilen-5-metiluridina, (llamado de aquí en adelante "oligonucleótido (2)") (rendimiento 7,1 nmol, 3,5%).
El análogo de oligonucleótido modificado que obtenido fue purificado con HPLC de fase reversa (HPLC: Modelo 302, Columna fabricada por GILSON; CHEMCO CHEMCOBOND 5-ODS-H (7,8 \times 300 mm); gradiente lineal de una solución acuosa de acetato de trietilamina 0,1 M (TEAA), pH7; 10\rightarrow12% CH_{3}CN / 40 min; 50ºC; 2,5 ml/min; 254 nm), y se recogió la fracción eluída a 22,5 min.
Ejemplo de Referencia 1
3-Azido-3-deoxi-4-hidroximetil-1,2-O-isopropilidene-\alpha-D-ribofuranosa
Se añadió carbonato potásico (380 mg, 2,75 mmol) y agua (15 ml) sobre una solución en metanol (85 ml) de
3-azido-4-benzoiloximetil-5-O-benzoil-3-deoxi-1,2-O-isopropiliden-\alpha-D-ribofuranosa (4,13 g, 9,15 mmol) preparada de acuerdo con la literatura (Surzhykov S.A., Krayevsky A.A., Nucleosides Nucleotides, 13, 2283-2305 (1994)) a 0ºC, y se agitó la mezcla durante 4,5 hrs a 0ºC. A continuación se neutralizó la mezcla de reacción con una solución de ácido clorhídrico al 10% a 0ºC, y se evaporó el metanol. Se añadió agua al residuo, y, a continuación, después de extracción con acetato de etilo, los extractos se lavaron con solución acuosa saturada de cloruro sódico. Se secó la fase orgánica sobre sulfato sódico anhidro. Se evaporó el disolvente. Se lavó el sólido blanco obtenido con n-hexano frío y se obtuvo el compuesto deseado como un polvo blanco (1,93 g, 7,87 mmol, 86%).
Punto de fusión 113-115ºC (tolueno).
IR \numax (KBr): 3460, 3417, 2989, 2951, 2907, 2111 cm^{-1}.
RMN-H^{1} (CDCl_{3}) \delta: 1,62 (3H, s), 1,35 (3H, s) 2,65 (2H, s ancho, 3,81, 3,65 (2H, AB, J = 12 Hz), 3,59, 4,00 (2H, AB, J = 12,5 Hz), 4,28 (1H, d, J = 5,5 Hz), 4,82 (1H, dd, J = 4 Hz, 5,5 Hz), 5,85 (1H, d, J = 4 Hz).
RMN-C^{13} (CDCl_{3}) \delta: 25,7, 26,2, 61,9, 62,1, 63,2, 79,9, 87,3, 104,4, 113,6.
Ejemplo de Referencia 2
3-Azido-5-O-tert-butildifenilsilil-3-deoxi-4-hidroxidimetil-1,2-O-isopropiliden-\alpha-D-ribofuranosa
Se añadió trietilamina (3,5 g, 4,82 ml, 34,6 mmol) y cloruro de t-butildifenilsililo (9,75 g, 9,22 ml, 35,46 mmol) sobre una solución de cloruro de metileno anhidro (73 ml) del compuesto obtenido en el ejemplo de Referencia 1 (2,56 mg, 10,5 mmol) y se agitó la solución durante 24 hrs a temperatura ambiente. A continuación se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio, y se extrajo la mezcla de reacción con acetato de etilo y los extractos se lavaron con una solución acuosa saturada de cloruro sódico. Se secó la fase orgánica sobre sulfato sódico anhidro. A continuación se evaporó el disolvente, el residuo se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (acetato de etilo: n-hexano = 1:6). Se obtuvo el compuesto deseado como un polvo blanco (3,13 g, 6,47 mmol, 62%).
Punto de fusión 99,5-100,5ºC (n-hexano).
IR \numax (KBr): 3504, 2936, 2852, 2111 cm^{-1}.
RMN-H^{1} (CDCl_{3}) \delta: 1,07 (9H, s), 1,36 (3H, s), 1,62 (3H, s), 3,62, 3,92 (2H, AB, J = 12 Hz), 4,38 (1H, d, J = 6 Hz), 4,84 (1H, dd, J = 4 Hz, 5,5 Hz), 3,82, 3,70 (2H, AB, J = 11 Hz), 4,84 (1H, dd, J = 4 Hz, 5,5 Hz), 5,86 (1H, d, J = 4 Hz), 7,36-7,44 (6H, m), 7,64-7,67 (4H, m).
RMN-C^{13} (CDCl_{3}) \delta: 19,2, 26,1, 26,3, 26,8, 62,2, 62,3, 65,2, 80,4, 88,0, 104,5, 113,7, 127,7, 127,8, 129,8, 129,9, 132,7, 132,8, 135,5.
Ejemplo de Referencia 3
3-Azido-5-O-tert-butildifenilsilil-3-deoxi-4-(p-toluenosulfoniloximetil)-1,2-O-isopropiliden-\alpha-D-ribofuranosa
Se añadió trietilamina (137 mg, 180 \mul, 1,29 mmol), cloruro de p-toluenosulfonilo (63,3 mg, 0,33 mmol) y
4-dimetilaminopiridina (4 mg, 0,03 mmol) sobre una solución en cloruro de metileno anhidro (2 ml) del compuesto obtenido en el ejemplo de Referencia 2 (100 mg, 0,21 mmol) a 0ºC en una corriente de nitrógeno gas, y se agitó la solución durante 14 hrs a temperatura ambiente. A continuación se añadió una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio sobre la mezcla de reacción, se extrajo la mezcla de reacción con acetato de etilo y se lavaron los extractos con solución saturada de cloruro sódico. Se secó la fase orgánica sobre sulfato sódico anhidro. A continuación se evaporó el disolvente, el residuo se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (acetato de etilo: 
\hbox{n-hexano =}
1:6). Se obtuvo el compuesto deseado como un polvo blanco (130 mg, 0,20 mmol, 98%).
Punto de fusión 122-124ºC (acetato de etilo-n-hexano).
IR \numax (KBr): 3069, 2935, 2114, 1366, 1183, 1109 cm^{-1}.
RMN-H^{1} (CDCl_{3}) \delta: 1,03 (9H, s), 1,27 (3H, s), 1,31 (3H, s), 2,41 (3H, s), 3,60, 3,72 (2H, AB, J = 10,5 Hz), 4,33, 4,40 (2H, AB, J = 10 Hz), 4,55 (1H, d, J = 5,5 Hz), 5,00 (1H, dd, J = 3,7 Hz, 5,5 Hz), 5,82 (1H, d, J = 3,7 Hz), 7,23 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,36-7,45 (6H, m), 7,61-7,63 (4H, m), 7,72 (2H, d, J = 8,5 Hz).
\newpage
RMN-C^{13} (CDCl_{3}) \delta: 19,1, 21,5, 25,9, 26,0, 26,7, 63,1, 64,7, 68,9, 80,1, 85,6, 104,4, 113,8, 127,8, 128,0, 129,6, 129,9, 132,4, 132,5, 135,4, 144,6.
Ejemplo de Referencia 4
3-Azido-5-O-tert-butildifenilsilil-3-deoxi-4-(p-toluenosulfoniloximetil)-1,2-di-O-acetil-D-ribofuranosa
Se añadió anhídrido acético (406 mg, 375 \mul, 3,98 mmol) y ácido sulfúrico concentrado (6,5 mg, 3,5 \mul, 0,066 mmol) sobre una solución en ácido acético (3,5 ml) del compuesto obtenido en el ejemplo de Referencia 3 (230 mg, 0,36 mmol) en una corriente de nitrógeno gas y se agitó la solución durante 5 hrs a temperatura ambiente. A continuación se añadió agua-hielo a la mezcla de reacción, y después de agitación durante 30 min, se añadió una solución acuosa saturada de cloruro sódico. Se extrajo la mezcla de reacción con acetato de etilo. Se secó la fase orgánica sobre sulfato sódico anhidro. A continuación se evaporó el disolvente, el residuo se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (acetato de etilo: n-hexano = 4:1). Se obtuvo el compuesto deseado, que es una mezcla de \alpha:\beta = aproximadamente 3:7, como un aceite incoloro (230 mg, 0,34 mmol, 94%).
IR \numax (KBr): 3048, 2935, 2864, 2117, 1756 cm^{-1}.
RMN-H^{1} (CDCl_{3}) [forma \beta] \delta: 1,06 (9H, s), 1,83 (3H, s), 2,08 (3H, s), 2,40 (3H, s), 3,54, 3,80 (2H, AB, J = 11 Hz), 4,12, 4,26 (2H, AB, J = 10 Hz), 4,37 (1H, d, J = 5,5 Hz), 5,32 (1H, d, J = 5,5 Hz), 5,98 (1H, s), 7,29 (2H, d, J = 8 Hz), 7,37-7,46 (6H, m), 7,59-7,65 (4H, m), 7,76 (2H, d, J = 8 Hz).
[forma \alpha] \delta: 1,05 (9H, s), 2,02 (3H, s), 2,13(3H, s), 2,39 (3H, s), 3,51, 3,68 (2H, AB, J = 11 Hz), 4,12, 4,21 (2H, AB, J = 10,5 Hz), 4,40 (1H, d, J = 7 Hz), 5,32 (1H, m), 6,31 (1H, d, J = 4,5 Hz), 7,25 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,37-7,46 (6H, m), 7,59-7,65 (4H, m), 7,70 (2H, d, J = 8,5 Hz).
RMN-C^{13} (CDCl_{3}) \delta: 19,0, 19,1, 20,0, 20,6, 20,9, 21,1, 21,5, 26,6, 61,0, 63,2, 65,1, 68,4, 68,8, 72,2, 75,5, 85,4, 86,5, 93,6, 96,0, 97,3, 127,8, 127,9, 128,0, 129,6, 129,9, 130,0, 132,0, 132,3, 132,4, 135,4, 144,7, 168,5, 169,2, 169,3, 169,4.
Ejemplo de Referencia 5
2'O-Acetil-3'-azido-5'-O-tert-butildifenilsilil-3'-deoxi-4'-(p-toluenosulfoniloximetil)-5-metiluridina
Se añadió O,O'-bis(trimetilsililo)timina (240 mg, 0,93 mmol) y tetracloruro de estaño (253 mg, 114 \mul, 0,97 mmol) sobre una solución anhidra de 1,2-dicloroetano (6 ml) del compuesto obtenido en el ejemplo de Referencia 4 (300 mg, 0,44 mmol) a 0ºC en una corriente de nitrógeno gas, y se agitó la solución durante 43 hrs a temperatura ambiente. A continuación se diluyó la mezcla de reacción con diclorometano en un baño de hielo, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico, y a continuación se extrajo con diclorometano. Se lavaron los extractos con una solución acuosa saturada de cloruro sódico. A continuación se secó la fase orgánica sobre sulfato sódico anhidro, se evaporó el disolvente y el residuo se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (acetato de etilo: n-hexano = 1:2\rightarrow1:0). Se obtuvo el compuesto deseado como un polvo blanco (300 mg, 0,4 mmol, 91%).
Punto de fusión 158,5-159,5ºC (acetato de etilo-n-hexano).
RMN-H^{1} (CDCl_{3}) \delta: 1,11 (9H, s), 1,59 (3H, s), 2,15 (3H, s), 2,41 (3H, s), 3,80, 3,84 (2H, AB, J = 11,5 Hz), 4,04, 4,10 (2H, AB, J = 11 Hz), 4,47 (1H, d, J = 6 Hz), 5,53 (1H, t, J = 6,5 Hz), 5,94 (1H, d, J = 7 Hz), 7,18 (1H, s), 7,28 (2H, d, J = 7,5 Hz), 7,37-7,47 (6H, m), 7,61-7,65 (4H, m), 7,71 (2H, d, J = 7,5 Hz), 9,68 (1H, s ancho).
RMN-C^{13} (CDCl_{3}) \delta: 11,8, 19,2, 20,9, 21,5, 26,9, 62,3, 65,9, 68,3, 74,2, 84,8, 86,1, 118,9, 127,9, 128,0, 129,7, 130,1, 131,5, 132,2, 135,2, 135,3, 135,5, 145,0, 150,4, 163,6, 169,9.
Ejemplo de Referencia 6
3'-O-(tert-Butildimetilsililo)timidina-5'-(2-cianoetil)fosfonato
Se añadió 2-cianoetiltetraisopropilfosforodiamidita (132 mg, 0,44 mmol) durante 5 min sobre una solución en acetonitrilo (4 ml) de 3'-O-(tert-butildimetilsililo)timidina (descrita en K.M. Fries, C. Joswing y R.F. Borch, J. Med. Chem., 38, 2672 (1995)) (100 mg, 0,34 mmol) en una corriente de nitrógeno gas y se agitó la solución durante 2,2 hrs a temperatura ambiente. A continuación, se añadió una solución en acetonitrilo (0,88 ml) de tetrazol (30,8 mg, 0,44 mmol) y se agitó la solución durante 1,5 hr a temperatura ambiente. Se añadió agua a la mezcla de reacción, y se extrajo con dicloroetano. Se lavó la fase orgánica con solución acuosa saturada de cloruro sódico, y a continuación se secó sobre sulfato sódico anhidro. Se evaporó el disolvente a presión reducida y se purificó el producto crudo por cromatografía de columna sobre gel de sílice (cloroformo: metanol = 30:1, n-hexano:acetato de etilo=1:5\rightarrow0:1). Se obtuvo el compuesto del título como un aceite incoloro (98,4 mg, 0,21 mmol, 70%).
\newpage
RMN-H^{1} (CDCl_{3}) \delta: 0,10 (6H, s), 0,90 (9H, s), 1,96 (3H, s), 2,16-2,28 (2H, m), 2,77-2,82 (2H, m), 4,09-4,41 (6H, m), 6,28 (1H, dd, J = 7 Hz, 11 Hz), 6,98 (1H, d, J = 720 Hz), 7,36 (1H, d, J = 8 Hz), 8,20(1H, s ancho). RMN-P^{31} (CDCl_{3}) \delta: 7,70, 8,94.
Ejemplo de Referencia 7
3'-O-(tert-butildimetilsililo)timidina-5'-metilfosfonato
Se añadió clorodiisopropilaminometoxifosfina (69,2 mg, 0,35 mmol) durante 5 min sobre una solución de diclorometano (2 ml) de 3'-O-(tert-butildimetilsililo)timidina (100 mg, 0,28 mmol) en una corriente de nitrógeno gas, y se agitó la solución durante 1 hrs a temperatura ambiente. A continuación, se añadió una solución en acetonitrilo (2 ml) de tetrazol (56,0 mg, 0,80 mmol) y se agitó la solución durante 40 min a temperatura ambiente. Se añadió agua a la mezcla de reacción, que se extrajo con dicloroetano, y se lavó la fase orgánica con solución acuosa saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato sódico anhidro. Se evaporó el disolvente a presión reducida y se purificó el producto crudo por cromatografía de columna sobre gel de sílice (n-hexano:acetato de etilo = 1:1\rightarrow0:1, n-hexano: acetato de etilo = 1:4). Se obtuvo el compuesto del título como un aceite incoloro (109 mg, 0,25 mmol, 91%).
RMN-P^{31} (CDCl_{3}) \delta: 9,13, 10,07.
Ejemplo del Ensayo 1
Medición del Tm para la Determinación de la Actividad de la Formación del Triplete
Se sumergió, en un baño de agua hirviendo, una solución de muestra de cantidades equimolares de oligonucleótido (2), que forma un triplete, y un oligonucleótido natural con doble hebra de DNA (la concentración final de cada nucleótido es de 1,5 \muM) en una solución tampón de fosfato sódico 7 mM (pH 7,0) conteniendo 140 mM de KCl y 10 mM de MgCl_{2} (o una solución sin 10 mM MgCl_{2}). A continuación se enfrió lentamente la solución a temperatura ambiente durante 12 hrs, y se enfrió de forma adicional a 4ºC y se dejó a 4ºC durante 1 hr. Se calentó gradualmente la solución muestra en una célula de un espectrofotómetro (Du650 fabricado por Beckman Instrument Inc.) desde 5ºC hasta 85ºC (0,5ºC/min) y se determinó la absorción ultravioleta de la muestra a 260 nm.
Se utilizaron los oligonucleótidos naturales que tienen DNA de doble hebra con la secuencia de 5'-gctaaaaagaaa
gagagatcg-3' (número de secuencia 3 en la tabla de secuencia) y su hebra complementaria con la secuencia de
5'-cgatctctctttctttttagc-3'.
Además, se utilizó un oligonucleótido natural que forma un triplete, con la secuencia de 5'tttttmtttmtmtmt-3', en la que m es 5-metil-2'deoxicitidina (llamada de aquí en adelante "oligonucleótido (3)").
Los resultados de las mediciones de Tm del DNA de doble hebra con el oligonucleótido (2) y (3) se muestran en la 3.
TABLA 3
Tm (ºC)
Oligonucleótido (2) Oligonucleótido (3)
Obtenido en el Ejemplo 11
Con MgCl_{2} 55 44
Sin MgCl_{2} 44 32
Tal como se ha demostrado claramente, los análogos de oligonucleótidos de la presente invención mostraron mayores valores de Tm en tripletes que los análogos de oligonucleótidos naturales. Esto indica que los análogos de oligonucleótidos de la presente invención mostraron elevada actividad en la formación del triplete.
Ejemplo del Ensayo 2
Determinación de la tolerancia a las nucleasas
Se añadieron 0,2 \mug de 3'-exonucleasa (fosfodiesterasa obtenida de Crotalus durissus (Boehringer Mannheim)) sobre 320 \mul de una solución tampón (50 mM Tris (pH 8,0) y 10 mM MgCl_{2}) conteniendo varios oligonucleótidos (10 \mug) y se mantuvo la mezcla a 37ºC. Después de un tiempo predeterminado, se extinguió la actividad de la enzima por calentamiento (90ºC) de una parte de la mezcla resultante durante 2 min. Se determinó la cantidad resultante del oligonucleótido en la mezcla resultante por HPLC de fase reversa y se determinó el cambio en la cantidad de oligonucleótido con el tiempo en presencia de nucleasas. Los resultados se muestran en la Figura 1.
Breve explicación de la figura
La Figura demuestra el curso de tiempo de los cambios en la cantidad de oligonucleótido en presencia de nuclea-
sas.
La Ordenada indica el porcentaje de la cantidad de oligonucleótido queda respecto a la cantidad a 0 min. La Abscisa indica el tiempo (min) después del inicio de la reacción.
Oligonucleótidos Utilizados en el Ensayo
1.
Oligonucleótido (1) obtenido en el Ejemplo 10,
2.
El nucleótido con una secuencia de 5'-ttttttttttnt-3' (número de secuencia 1 en la tabla de secuencia) en la que n es 2'O,4-C-metilen-5-metiluridina (de aquí en adelante llamado "oligonucleótido (4)").
3.
Oligonucleótido natural con una secuencia de 5'-tttttttttttt-3' (número de secuencia 6 en la tabla de secuencia) (de aquí en adelante llamado "oligonucleótido (5)").
Los análogos de oligonucleótidos de la presente invención demostraron una resistencia a la nucleasa destacable en comparación con los análogos de oligonucleótidos naturales. Además, los análogos de oligonucleótidos de esta invención mostraron ejercer una resistencia más potente a las nucleasas que los análogos de oligonucleótidos no naturales.
Fue posible determinar la actividad formadora de híbridos y actividad anti-HIV de los análogos de oligonucleótidos de la presente invención mediante la utilización de los métodos siguientes.
Método 1
Se determinaron las temperaturas de fusión (valores de Tm) de los productos de reasociación entre las hebras antisentido, que fueron los diferentes análogos de oligonucleótidos obtenidos, y las hebras con sentido (hebras codificantes) (hebras no molde) de DNA- o RNA- de origen natural para investigar la capacidad de hibridación de los análogos de oligonucleótidos de la presente invención para el DNA y el RNA complementario.
Se calentó cada solución de muestra (500 \mul) con concentraciones finales de 100 mM de cloruro sódico, 10 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 7,2), 4 \muM de hebra antisentido, y 4 \muM de hebra con sentido, respectivamente, en un baño de agua hirviendo, y se enfrió lentamente a temperatura ambiente durante 10 horas. Se enfrió gradualmente la solución de muestra en una cámara de la celda de un espectrofotómetro (UV-2100PC, fabricado por Shimadzu Cor.,) a 5ºC, se mantuvo a 5ºC durante un periodo adicional de 20 minutos, y a continuación se inició la medición, en una corriente de nitrógeno gas con el fin de prevenir la condensación de humedad. Se dejó subir la temperatura de la muestra a una velocidad de 0,2ºC/minuto hasta 90ºC, y se determinó la absorción al ultravioleta a 260 nm a intervalos de 0,1ºC. Con el fin de evitar cambios de la concentración de la muestra con los incrementos de temperatura, se utilizó una celda con una cubierta, y se aplicó una gota de un aceite mineral en la superficie de la solución de muestra durante la determinación.
Método 2 Determinación de la Actividad Anti-HIV
Se determinaron las actividades Anti-HIV de los análogos de la presente invención por un método similar al descrito por R. Pauwel y col. (J. Virological Method, 20, p. 309-321 (1988)). Se suspendió el precipitado de la celda en medio RPMI-1640 que no contenía suero. Se añadió a la suspensión HIV y se incubó la mezcla a 37ºC durante 1 hora. Al final de este tiempo se lavó la mezcla resultante con un medio RPMI-1640 conteniendo un 10% de suero bovino fetal (de aquí en adelante llamado "medio de suero") y se centrifugó (1000 x g, 5 min). Se suspendió la célula infectada por HIV así obtenida y las células no infectadas por HIV en el medio de suero de modo que se tuviera una concentración de 4 x 10^{5}/ml, respectivamente. Después de que se introdujeran 100 \mul de la suspensión en cada celda de la placa de 96 celdas por cultivo de tejido, se incubaron durante 5 días a 37ºC en presencia de dióxido de carbono gas sin agitación. Las células infectadas por HIV y las células no infectadas sin los compuestos de ensayo se incubaron de forma similar. Después de la incubación, las células vivas se contabilizaron utilizando MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) y se determinaron las actividades inhibitorias del daño celular de los compuestos de ensayo. Se confirmó que el Micoplasma no estaba contenido en la solución de la célula y la solución del virus incubado.
La actividad inhibitoria del daño celular en las células no infectadas por HIV sin un compuesto de ensayo se expresó como 100%, y la actividad inhibitoria del daño celular en células infectadas por HIV sin un compuesto de ensayo se expresó como 0%. Se determinó la concentración del compuesto para inhibir el daño celular en un 50% (EC_{50}).
Posibilidad de utilización industrial
Los nuevos análogos biciclonucleósidos de la presente invención muestran excelentes actividades anti-sentido o anti-gen y son útiles como intermedios para la producción de análogos de oligonucleótidos con estabilidad in vivo.
Además, los nuevos análogos de oligonucleótidos de la presente invención son estables in vivo y son útiles como agentes anti-sentido o anti-gen.
Además, los nuevos análogos biciclonucleósidos tienen una actividad anti-HIV y son útiles como agentes terapéuticos o profilácticos para el SIDA.
<110> Sankyo Company, Limited
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevos análogos Biciclo-Nucleósidos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> FP-200042
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP HEI11-207170
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999-07-22
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2,0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótidos sintetizados para el ensayo de la resistencia a la nucleasa
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> uridina modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttttttttt nt 
\hfill
12 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintetizado para ensayar la aptitud para la conformación de una triple hebra
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 5-metil 2'-deoxicitidina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 3'-amino-3'-deoxi-2'-O,
\hskip1cm
4'-C-metilen-5-metiluridina 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 5-metil 2'-deoxicitidina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
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<222> (12)
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<223> 5-metil 2'-deoxicitidina
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<220>
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<221> base modificada
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<222> (14)
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<223> 5-metil 2'-deoxicitidina
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskip
tttttntntn tntnt 
\hfill
15 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintetizado para ensayar la aptitud para la formación de una triple hebra
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskip
gctaaaaaga aagagagatc g 
\hfill
21 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:
\hskip1cm
Oligonucleótido sintetizado para ensayar la aptitud para la formación de una triple hebra 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskip
cgatctctct ttctttttag c 
\hfill
21 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 15
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintetizado para ensayar la aptitud para la formación de una triple hebra
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 5-metil 2'-deoxicitidina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 5-metil 2'-deoxicitidina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 5-metil 2'-deoxicitidina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 5-metil 2'-deoxicitidina
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttttntttn tntnt 
\hfill
15 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótido sintetizado para ensayar la resistencia a la nucleasa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttttttttt tt 
\hfill
12

Claims (19)

1. Un compuesto de fórmula general (1) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
21
en donde, R^{1} representa un átomo de hidrógeno, un grupo protector de un grupo hidroxi en la síntesis de ácido nucleico, un grupo ácido fosfórico, un grupo ácido fosfórico protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, o un grupo representado por la fórmula -P(R^{4a})R^{4b} (en donde R^{4a} y R^{4b} son iguales o diferentes y cada uno de ellos representa un grupo hidroxi, un grupo hidroxi protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo mercapto, un grupo mercapto protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo amino, un grupo amino protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo alcoxi de 1-6 átomos de carbono, un grupo alquiltio de 1-6 átomos de carbono, un grupo cianoalcoxi de 1-7 átomos de carbono, o un grupo amino sustituido por un grupo alquilo de 1-6 átomos de carbono),
R^{2} representa un grupo azido, un grupo amino, o un grupo representado por la fórmula -NH-R^{3} (en donde, R^{3} representa un grupo protector de un grupo amino en la síntesis de ácido nucleico, un grupo ácido fosfórico, un grupo ácido fosfórico protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, o un grupo representado por la fórmula -P(R^{4a})R^{4b} (en donde R^{4a} y R^{4b} son iguales o diferentes y cada uno de ellos representa un grupo hidroxi, un grupo hidroxi protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo mercapto, un grupo mercapto protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo amino, un grupo amino protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, un grupo alcoxi de 1-6 átomos de carbono, un grupo alquiltio de 1-6 átomos de carbono, un grupo cianoalcoxi de 1-7 átomos de carbono o un grupo amino sustituido por un grupo alquilo de 1-6 átomos de carbono).
B representa un grupo purin-9-ilo o un grupo 2-oxo-1,2-dihidropirimidin-1-ilo cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con 1 o más sustituyentes seleccionados entre los siguientes \alpha-grupos.
(Grupos \alpha)
un grupo hidroxi,
un grupo hidroxi protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico,
un grupo alcoxi de 1-6 átomos de carbono,
un grupo mercapto,
un grupo mercapto protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico,
un grupo alquiltio de 1-6 átomos de carbono,
un grupo amino,
un grupo amino protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico,
un grupo amino sustituido por un grupo alquilo de 1-6 átomos de carbono,
un grupo alquilo de 1-6 átomos de carbono, y
un átomo de halógeno.
2. Un compuesto de acuerdo con Reivindicación 1, en donde R^{1} representa un átomo de hidrógeno, un grupo acilo alifático, un grupo acilo aromático, un grupo sililo, un grupo metilo sustituido por 1 y 3 grupos arilo, o un grupo metilo sustituido por 1 y 3 grupos arilo en donde los anillos arilo están sustituidos por un grupo alquilo inferior, un grupo alcoxi inferior, un átomo de halógeno o un grupo ciano.
3. Un compuesto de acuerdo con Reivindicación 1, en donde R^{1} representa un átomo de hidrógeno, un grupo sililo, un grupo metilo sustituido por 1 y 3 grupos arilo, o un grupo metilo sustituido por 1 y 3 grupos arilo en donde los anillos arilo están sustituidos por un grupo alquilo inferior, un grupo alcoxi inferior, un átomo de halógeno o un grupo ciano.
4. Un compuesto de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde R^{1} representa un átomo de hidrógeno, un grupo trimetilsililo, un grupo t-butildimetilsililo, un grupo t-butildifenilsililo, un grupo bencilo, un grupo trifenilmetilo, un grupo 4-metoxibencilo, un grupo 4-metoxifenildifenilmetilo, un grupo 4,4'-dimetoxitrifenilmetilo, o un grupo 4,4',4''-trimetoxitrifenilmetilo.
5. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en donde R^{2} representa un grupo azido, un grupo amino, o un grupo representado por la fórmula -NH-R^{3} (en donde R^{3} representa un grupo acilo alifático, un grupo acilo aromático, un grupo metilo sustituido por 1 y 3 grupos arilo, un grupo metilo sustituido por 1 y 3 grupos arilo en donde los anillos arilo están sustituidos por un grupo alquilo inferior, un grupo alcoxi inferior, un átomo de halógeno, o un grupo ciano, un grupo sililo, un grupo fosforamidita, un grupo fosfonilo, un grupo ácido fosfórico o un grupo ácido fosfórico protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico).
6. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en donde R^{2} representa un grupo azido, un grupo amino, o un grupo representado por la fórmula -NH-R^{3} (en donde R^{3} representa un grupo acetilo, un grupo trifluoroacetilo, un grupo benzoilo, un grupo bencilo, un grupo p-metoxibencilo, un grupo tert-butildifenilsililo, un grupo representado por la fórmula -P(OC_{2}H_{4}CN)(N(CH(CH_{3})_{2})_{2}), un grupo representado por la fórmula -P(OCH_{3})(N(CH(CH_{3})_{2})_{2}), un grupo fosfonilo, o un grupo ácido 2-clorofenil- o un grupo 4-clorofenilfosfónico).
7. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en donde R^{2} representa un grupo azido o un grupo amino.
8. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7, en donde B representa un grupo
6-aminopurin-9-ilo (es decir, adeninilo), 6-amino-purin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 2,6-diaminopurin-9-ilo en donde uno o ambos grupo(s) amino están protegidos con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 2-amino-6-cloropurin-9-ilo, 2-amino-6-cloropurin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 2-amino-6-fluoropurin-9-ilo, 2-amino-6-fluoropurin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 2-amino-6-bromopurin-9-ilo, 2-amino-6-bromopurin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 2-amino-6-hidroxipurin-9-ilo (es decir, guaninilo), 2-amino-6-hidroxipurin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 6-amino-2-metoxipurin-9-ilo, 6-amino-2-metoxipurin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 6-amino-2-cloropurin-9-ilo, 6-amino-2-cloropurin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 6-amino-2-fluoropurin-9-ilo, 6-amino-2-fluoropurin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 2,6-dimetoxipurin-9-ilo, 2,6-dicloropurin-9-ilo, 6-mercaptopurin-9-ilo, 6-mercaptopurin-9-ilo en donde el grupo mercapto está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 2-oxo-4-amino-1,2-dihidropirimidin-1-ilo (es decir, citosinilo), 2-oxo-4-amino-1,2-dihidropirimidin-1-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 4-amino-2-oxo-5-fluoro-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, 4-amino-2-oxo-5-fluoro-1,2-dihidropirimidin-1-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 4-amino-2-oxo-5-cloro-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, 4-amino-2-oxo-5-cloro-1,2-dihidropirimidin-1-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 2-oxo-4-metoxi-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, 2-oxo-4-mercapto-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, 2-oxo-4-mercapto-1,2-dihidropirimidin-1-ilo en donde el grupo mercapto está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 2,4-dihidroxipirimidin-1-ilo (es decir, uracililo), 2,4-dihidroxi-5-metilpirimidin-1-ilo (es decir, timinilo), 4-amino-5-metil-2-oxo-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, o 4-amino-5-metil-2-oxo-1,2-dihidropirimidin-1-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico.
9. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7, en donde B representa 6-benzoilaminopurin-9-ilo, adeninilo, 2-benzoilamino-6-hidroxipurin-9-ilo, guaninilo, 2-oxo-4-benzoilamino-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, citosinilo, uracililo o timinilo.
10. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 9, que está seleccionado entre los siguientes:
3'-amino-3'deoxi-2'-O,4'-C-metilen-5-metiluridina,
3'-azido-3'deoxi-2'-O,4'-C-metilen-5-metiluridina,
3'-azido-5'-O-tert-butildifenilsilil-3'-deoxi-2'-O,4'-C-metilen-5-metiluridina,
3'-azido-3'deoxi-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O,4'-C-metilen-5-metiluridina y
3'-amino-3'-deoxi-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O,4'-C-metilen-5-metiluridina.
\newpage
11. Un análogo de oligonucleótido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que tiene 1 o más unidades estructurales representado por la siguiente fórmula general (1a),
\vskip1.000000\baselineskip
22
siempre que cuando el oligonucleótido tiene dos o más unidades estructurales de fórmula (1a), cada uno de ellas B sea igual o diferente.
[en donde, B representa un grupo purin-9-ilo o un grupo 2-oxo-1,2-dihidropirimidin-1-ilo que esté opcionalmente sustituido con sustituyentes seleccionados entre los grupos \alpha de a continuación.].
(grupo \alpha)
un grupo hidroxi,
un grupo hidroxi protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico,
un grupo alcoxi de 1-6 átomos de carbono,
un grupo mercapto,
un grupo mercapto protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico,
un grupo alquiltio de 1-6 átomos de carbono,
un grupo amino,
un grupo amino protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico,
un grupo amino sustituido por un grupo alquilo de 1-6 átomos de carbono,
un grupo alquilo de 1-6 átomos de carbono, y
un átomo de halógeno.
12. Un análogo de oligonucleótido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con Reivindicación 11, en donde B representa un grupo 6-aminopurin-9-ilo (es decir, adeninilo), 6-aminopurin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 2,6-diaminopurin-9-ilo, 2-amino-6-cloropurin-9-ilo, 2-amino-6-cloropurin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 2-amino-6-fluoropurin-9-ilo, 2-amino-6-fluoropurin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 2-amino-6-bromopurin-9-ilo, 2-amino-6-bromopurin-9-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 2-amino-6-hidroxipurin-9-ilo (es decir, guaninilo), 2-amino-6-hidroxipurin-9-ilo en donde los grupos amino y hidroxilo están protegidos con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 6-amino-2-metoxipurin-9-ilo, 6-amino-2-cloropurin-9-ilo, 6-amino-2-fluoropurin-9-ilo, 2,6-dimetoxipurin-9-ilo, 2,6-dicloropurin-9-ilo, 6-mercaptopurin-9-ilo, 2-oxo-4-amino-1,2-dihidropirimidin-1-ilo (es decir, citosinilo), 2-oxo-4-amino-1,2-dihidropirimidin-1-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 2-oxo-4-amino-5-fluoro-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, 4-amino-2-oxo-5-fluoro-1,2-dihidropirimidin-1-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico, 4-amino-2-oxo-5-cloro-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, 2-oxo-4-metoxi-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, 2-oxo-4-mercapto-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, 2-oxo-4-hidroxi-1,2-dihidropirimidin-1-ilo (es decir, uracinilo), 2-oxo-4-hidroxi-5-metil-1,2-dihidropirimidin-1-ilo (es decir, timinilo), 4-amino-5-metil-2-oxo-1,2-dihidropirimidin-1-ilo (es decir, 5-metilcitosinilo), o 4-amino-5-metil-2-oxo-1,2-dihidropirimidin-1-ilo en donde el grupo amino está protegido con un grupo protector en la síntesis de ácido nucleico.
13. Un análogo de oligonucleótido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con Reivindicación 11, en donde B representa un grupo 6-benzoilaminopurin-9-ilo, adeninilo, 2-isobutilamino-6-hidroxipurin-9-ilo, guaninilo, 2-oxo-4-benzoilamino-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, citosinilo, 2-oxo-5-metil-4-benzoilamino-1,2-dihidropirimidin-1-ilo, 5-metilcitosinilo, uracinilo o timinilo.
14. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un compuesto farmacológicamente activo con un soporte o diluyente del mismo, en donde dicho compuesto farmacológicamente activo es un análogo de oligonucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
15. Un análogo oligonucleótido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 para use en el tratamiento o la profilaxis del SIDA.
16. El uso de un análogo de oligonucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis del SIDA.
17. El uso de un análogo de oligonucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de enfermedades de posible prevención o tratables por la capacidad de dicho análogo de oligonucleótido para mostrar una actividad antigen útil farmacológicamente en el cuerpo del paciente después de la administración del mismo.
18. El uso de un análogo de oligonucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de enfermedades de posible prevención o tratamiento por la capacidad de dicho análogo de oligonucleótido de mostrar una actividad antigen en el cuerpo del paciente después de la administración del mismo.
19. Un análogo de oligonucleótido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 para uso como un medicamento.
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