ES2118778T5 - Formacion de microparticulas proteinicas por precipitacion en un antidisolvente. - Google Patents

Abstract

UN METODO PARA FORMAR MICROPARTICULAS DE MATERIAL QUE CONSISTE EN PONER UN GAS ANTIDISOLVENTE SUPERCRITICO EN CONTACTO CON UNA SOLUCION DE DICHO MATERIAL EN UN DISOLVENTE A UNA RELACION CONTROLADA PARA EXPANDIR LA SOLUCION Y PRECIPITAR EL MATERIAL.

Description

Formación de micropartículas proteínicas por precipitación en un antidisolvente.

La presente invención se refiere a un método de formación de micropartículas proteínicas usando la precipitación con antidisolvente gaseoso y también hace referencia a las composiciones de dichas proteínas.

Los medios convencionales para administrar fármacos (p. ej. píldoras y comprimidos) muestran un incremento repentino o un máximo único del fármaco en la sangre. A este pico inicial le sigue un descenso en la concentración sanguínea. Puesto que cada fármaco tiene un margen de concentración por debajo del cual su efecto terapéutico es limitado, y por encima del cual se producen efectos secundarios tóxicos, lo ideal sería liberar el fármaco a una velocidad controlado y minimizar las fluctuaciones. En una liberación controlada, esto se consigue incorporando al esquema del sistema de reparto una etapa que limita la velocidad. Entre los múltiples tipos de sistemas de liberación controlada están las microesferas poliméricas bioerosionables en el intervalo de 1 a 50 micrómetros (\mum). Dichas pequeñas microesferas pueden ser inyectadas por vía subcutánea o bien intramuscular. Los polímeros bioerosionables son materiales que son degradados por los fluidos corporales a productos no tóxicos. Las partículas poliméricas contienen el fármaco de interés en forma dispersa. La liberación del fármaco se produce parcialmente como resultado de la degradación polimérica dentro del cuerpo. Se hace referencia a los sistemas que proporcionan el control temporal o espacial de la liberación del fármaco en el organismo desde el punto de vista genérico como dispositivos de transporte controlado del fármaco.

La liberación controlada de proteínas, como los enzimas terapéuticos, requiera la formación de pequeñas partículas que pueden ser dispersadas uniformemente en la matriz polimérica. Las técnicas para producir partículas proteínicas incluyen el secado por pulverización, la liofilización, el molido, el triturado y la micronización proteínica, WO/90/132. Únicamente este último método conduce a pequeñas partículas.

Jean W. Tom and Pablo G. Debenedetti, "Formación de microesferas y micropartículas bioerosionables por la expansión rápida de soluciones supercríticas", Departamento de Ingeniería Química, Princeton University, 1991, revela un proceso para fabricar microesferas poliméricas bioerosionables y biocompatibles, principalmente polihidroxiácidos que incluyen el ácido poli(L-láctico)(L-PLA), el ácido poli(D,L-láctico), (DL-PLA) y el ácido poli(glicólico) (PGA). Las micropartículas y las microesferas de estos polímeros se fabrican con el objetivo de ser utilizadas para el transporte controlado de los productos farmacéuticos. La nucleación del ácido poli(L-láctico) a partir de mezclas de CO_{2} y CO_{2}-acetona daba lugar a micropartículas y microesferas que oscilaban entre 4 y 25 micrómetros (\mum). También se obtenían microesferas (2-20 \mum) usando el cloro-trifluormetano como disolvente.

La técnica para fabricar microesferas y micropartículas empleada por Tom y Debenedetti implicaba aplicar una rápida expansión de las soluciones supercríticas. Esto era conocido por Matson y cols., "Expansión de soluciones fluidas supercríticas: Formación de soluto a base de polvos, películas y fibras". Ind. Eng. Chem. Res. 26, 2298-2306 (1987). En el proceso de una expansión rápida de las soluciones supercríticas, se disuelve un soluto no volátil en un fluido supercrítico. La solución resultante es altamente comprensible en las proximidades del punto crítico de los disolventes. La nucleación del soluto es activada mecánicamente reduciendo la densidad de la solución a través de una rápida expansión, reduciendo así su capacidad disolvente; Kumar y cols., "Modelado de la solubilidad de los sólidos en fluidos supercríticos con la densidad como variable independiente", J. Supercrit. Fluids. 1988, 1, 15-22. La combinación de una perturbación mecánica que se propaga rápidamente y los elevados índices de super-saturación conducen a unas condiciones uniformes en el fluido portador y en principio a unas distribuciones de tamaño de partícula estrechas en partículas pequeñas.

Chang y cols., "Predicciones sobre la expansión del disolvente y la solubilidad del soluto en los líquidos expandidos con gas", AICHE Journal, 36, Nº 6, 939-942 (1990) revela la adición de antidisolvente gaseoso para la precipitación de la fase líquida de los sólidos. Ver también Gallagher y cols., "Recristalización gaseosa (antidisolvente gaseoso): Un nuevo proceso para recristalizar compuestos insolubles en fluidos supercríticos", Am. Chem. Soc. Symp. Ser., Nº 406 (1989).

Chang y cols. revelan la recristalización del acetaminofeno a partir del butanol y del \beta-caroteno a partir del tolueno usando CO_{2}. El CO_{2} se cargaba por la parte superior de la columna o del recipiente que contenía la solución que iba a ser expandida con gas.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un dibujo esquemático de un aparato experimental para la recristalización con antidisolvente gaseoso y para la expansión líquida útil en la presente invención. En la figura 1, "V" representa las válvulas, "PI" representa los sensores de presión, "TI" representa los sensores de temperatura. Los reguladores de contrapresión, los rotámetros, filtros, válvulas de retención, válvulas dosificadoras, válvulas de cierre o parada, discos de ruptura e intercambiadores de calor se representan con los símbolos convencionales.

La figura 2 es una microfotografía ampliada 8.000 veces que muestra las partículas de catalasa fabricadas en el ejemplo 1, las partículas recogidas en el lado superior de los portaobjetos.

La figura 3 es una microfotografía del mismo material al de la figura 2 que tiene una ampliación de 15.000.

La figura 4 es una microfotografía del mismo material al de la figura 3, donde las partículas se recogen en un filtro y se amplían 10.000 veces.

La figura 5 es una microfotografía como la de la figura 4 ampliada 5.000 veces.

La figura 6 es una microfotografía de las partículas de insulina fabricadas de acuerdo con el ejemplo 2 ampliadas 10.000 veces y recogidas en un filtro.

La figura 7 es una microfotografía de las partículas de insulina fabricadas en el ejemplo 2 ampliadas 5.500 veces y recogidas en un filtro.

Descripción

Con respecto a la figura 1, una solución de proteínas disueltas procedentes de la fuente de solución 14 (en la cual la solución se puede preparar y/o almacenar) alimenta al cristalizador 10. La solución se introduce a través de un medio adecuado de medición del flujo, como el rotámetro 36 y la bomba líquida de alta presión 32. La presión se puede controlar usando un regulador de contrapresión 34. La solución puede llevarse a la temperatura deseada con unos medios de calentamiento adecuados, como las bobinas 36, que se guardan a la temperatura deseada mediante aire circulante. El calentamiento puede conseguirse mediante calentadores de bandas y circulación forzada del aire.

La solución presurizada alimenta la cámara del cristalizador 20. Preferiblemente, se inyecta por la parte superior del cristalizador a través de un disco de platino 53 perforado con láser, que produce un pulverizado fino de gotitas de solución en la cámara del cristalizador 20. De esta manera, el disco 53 tendrá al menos un orificio para producir un pulverizado fino. Lo más frecuente es que el orificio tenga de 5 a 50 y preferiblemente de 10 a 30 y más preferiblemente de 15 a 20 micrómetros de diámetro.

Preferiblemente, la solución adquiera la forma de una pluralidad de gotitas que tienen un diámetro entre 10 y 500 \mum, al menos un rayo fino continuo que tiene un diámetro de menos de 1 milímetro, o bien una película delgada que tiene un espesor de menos de 1 milímetro.

El gas antidisolvente procede del depósito de gas antisolvente 18 conectado a la bomba de compresión del gas antisolvente 40. La presión del gas puede ser controlada por medio de un regulador de contrapresión de gas 42. La temperatura del antisolvente en el depósito 18 oscilará entre 10 y 40ºC, preferiblemente entre 20 y 30ºC, como el dióxido de carbono líquido a 25ºC. El antidisolvente se enfría en un intercambiador de calor 44 con la bomba de disolvente 40 que aporta el antidisolvente líquido a una presión supercrítica. El exceso de disolvente en la corriente gaseosa puede reciclarse de vuelta a la zona de entrada de líquido de la bomba 40.

Las condiciones típicas a la salida de la bomba 40 oscilan entre 25 y 45ºC y más preferiblemente entre 30 y 40ºC y entre 60 y 200 atmósferas de presión, más preferiblemente entre 100 y 150 atmósferas de presión. El antidisolvente comprimido pasa a través de un medio micrométrico adecuado, como la válvula micrométrica 46. De forma opcional, puede existir un medio de termostatado adicional como las bobinas 48 entre la bomba de disolvente 40 y el cristalizador 10. El gas antidisolvente supercrítico pasa entonces a la cámara de cristalización 20 a una velocidad controlada, para tener un espectro continuo de gas supercrítico.

En la cámara de cristalización 20, el gas antidisolvente supercrítico se disuelve en la solución proteínica a una velocidad controlada dependiendo del flujo o de la geometría de las gotitas, de la temperatura y de la concentración. A medida que se expande la solución, el material soluble precipita. El uso de un flujo de fluido supercrítico y el paso de una fina corriente, película o gotitas a través del gas supercrítico da lugar a una rápida expansión de la solución líquida y a la precipitación de los materiales disueltos, partículas extremadamente finas de menos de 5, más preferiblemente de menos de 3, y más preferiblemente de menos de 1 micrómetro en un diámetro equivalente, en particular para el material soluble que precipita en una forma globular. Los precipitados en forma de aguja tienen un diámetro inferior a unos 3 micrómetros y más preferiblemente de menos de 1 micrómetro con una longitud de menos de 5, y preferiblemente de menos de 3 micrómetros. La rápida precipitación da lugar a una estrecha distribución de partículas tal como se muestra en las figuras 2 a 7.

La solución empobrecida o agotada y el gas antidisolvente supercrítico gastado alimentan un depósito de despresurización 22, que se lleva de nuevo a las condiciones ambientales. Los cristales precipitados en el cristalizador 10 se recogen en el orificio de recogida de cristales 26. Los cristales pueden ser recogidos mediante un medio apropiado, como en un filtro y/o una placa de vidrio.

Una mezcla líquida del disolvente gastado y del fluido supercrítico se puede recoger del fondo de la cámara 20 de cristalización a través del tubo 50. La mezcla líquida pasa a través de la válvula V7 al depósito de recogida 52 a través de la válvula V4 al depósito de despresurización 22, donde la mezcla es despresurizada y expandida a presión atmosférica.

El sistema se debería calibrar a presiones de manejo habitual de hasta 6.000 psi, y preferiblemente en el intervalo comprendido entre la presión atmosférica y 6.000 psi, a las temperaturas comprendidas entre 20 y 60ºC y preferiblemente entre 30 y 50ºC.

Se pueden utilizar diferentes modelos de flujo en el cristalizador 10. La dirección del flujo de gas supercrítico antidisolvente en el cristalizador (ascendente o descendente) puede ser determinada por las válvulas antes y después del cristalizador. Para la corriente ascendente en el cristalizador, se abren las válvulas V2 y V3 y se cierran las válvulas V1 y V4. Donde el fluido antidisolvente tiene una corriente descendente se invierten las válvulas. El flujo de solución proteínica puede ser a favor de la corriente o contracorriente respecto al flujo de fluido antidisolvente. En la realización de la invención preferida con un funcionamiento continuado, se bombea la solución proteínica en el cristalizador mediante una bomba líquida de alta presión 32 y se mide la velocidad del flujo instantáneo mediante el rotámero líquido 30. Se controla la presión usando un regulador de contrapresión 34 y la solución proteínica presurizada se inyecta en la parte superior del cristalizador. El gas antidisolvente se inyecta también por la parte superior del cristalizador para el líquido a favor de la corriente procedente tanto del fluido de disolvente supercrítico a través del cristalizador como de la solución proteínica a través del cristalizador, ambos de la parte superior a la inferior. El cristalizador puede funcionar de forma discontinua, semidiscontinua o continua. La solución de material soluble se puede hacer pasar en el sentido de la corriente o contra la corriente, en relación con un flujo continuo de gas supercrítico antidisolvente.

El material soluble apropiado son las proteínas, en particular los enzimas hidrofóbicos como la insulina, catalasa, hormona adrenocorticotrofina y peroxidasa. El método tiene aplicabilidad para cualquier proteína y no depende de la estructura química o de la actividad biológica.

Las soluciones útiles para las proteínas comprenden al menos un disolvente no acuoso como el etanol, formamida, dimetilsulfóxido, tetrahidrofurano, ácido acético, dimetil-formamida, etilenglicol, polietilenglicol líquido y dimetilanilina.

Los gases supercríticos que se pueden utilizar incluyen (con una indicación de sus temperaturas críticas (ºC) y de las presiones críticas (atm)) incluyen el etano (32,2ºC, 48,1 atm), etileno (9,21ºC, 39,7 atm); hexafluoruro de sulfuro (45,5ºC, 37,1 atm), óxido nitroso (36,5ºC, 71,7 atm); clorotrifluormetano (28ºC, 38,7 atm), y mono-fluormetano (44,5ºC, 58 atm). Se ha utilizado una solución de agua y etanol. Sin embargo, se ha averiguado que la presencia de agua en dichas soluciones disminuye la producción de proteínas de partículas pequeñas.

De acuerdo con la presente invención se ha obtenido una composición proteínica que tiene partículas proteínicas donde prácticamente todas las partículas proteínicas son aisladas artificialmente y tienen un diámetro equivalente inferior a 5, más preferiblemente inferior a 3, y más preferiblemente inferior a 1 micrómetro. La composición proteínica tiene una distribución estrecha de partículas que se muestra en las figuras 2-7. Estas proteínas tienen composiciones químicas controladas o uniformes. Por lo tanto, pueden aislarse y fabricarse muestras de una composición basada esencialmente en una proteína deseada.

Las proteínas aisladas de la presente invención pueden utilizarse para preparar composiciones de liberación temporal del fármaco. Dichas composiciones pueden comprender una matriz polimérica bioerosionable y al menos una proteína que tenga un diámetro equivalente de menos de 3 micrómetros. Los polímeros preferidos son los polihidroxiácidos como los seleccionados entre el grupo formado por el ácido poli(L-láctico), ácido poli(D,L-láctico) y el ácido poliglicólico. La composición puede comprender de un 0,1 a un 50% en peso de la proteína.

Preferiblemente, las composiciones que liberan fármaco contienen una matriz polimérica que tiene un espectro continuo de matriz polimérica bioerosionable con las partículas proteínicas dispersadas por el mismo. Dichas partículas se pueden fabricar según medios conocidos tecnológicamente.

A continuación se muestran los ejemplos que ilustran la naturaleza de la invención y la forma de llevarla a cabo.

Con respecto a la figura 1, el dióxido de carbono líquido del depósito de disolvente 18 Se comprimía mediante una bomba líquida de alta presión 40 que era una American Lewa Plunger Metering Pump, modelo EL-1; ajustada a 6.000 psi y 2 galones por hora. La presión se controlaba mediante un regulador de contrapresión 42 que era un Tescom, serie modelo 54-2.100, ajustado a 6.000 psi. El dióxido de carbono comprimido se introducía en un cristalizador 20, que era una Jerguson Gauge, modelo 19T40, 316 de acero inoxidable, 5.000 psi, de 1,3 centímetros por 1,3 centímetros de 31,8 centímetros de longitud, 50 centímetros cúbicos, a través de una válvula micrométrica 46 que era una Autoclave Engineering Micrometering Valve 60VRMM. El dióxido de carbono presurizado se precalentaba en serpentines 48.

La presión en el cristalizador se indicaba mediante una galga de presión del cristalizador 54, que era una Bourdon Gauge, modelo Omega PGJ-45B-5.000, ajustada a 5.000 psi, y controlada por un regulador de contrapresión 59 que era un Tescom serie 26-1.700, ajustado a 6.000 psi.

La solución proteínica del depósito 14 de solución proteínica se bombeaba en una operación continua mediante una bomba de elevada presión que era una Milton Roy LDC Duplex Metering Pump. El flujo instantáneo se medía mediante un rotámetro líquido 30 que era un Fischer y Porter; modelo 10A6132, 0-14 centímetros cúbicos por minuto de flujo de agua. La presión de la solución proteínica se controlaba usando un regulador 34 de contrapresión que era un Tescom; serie 26-1.700 regulador ajustado a 10.000 psi. La solución proteínica se precalentaba en serpentines 36.

La solución proteínica presurizada se inyectaba por la parte superior del cristalizador 10 a través de un disco de platino 53 perforado con láser, Ted Pella; 3 mm DE x 0,24 mm de grosor; 20 micrómetros de diámetro.

En la base del cristalizador precipitaban las partículas proteínicas y se depositaban en un portaobjetos inclinadodespués de la cristalización. El plano del porta objetos 55 presentaba un ángulo de l0º en la dirección del flujo de solución proteínica. Además, un filtro 57, Mott Metallurgical; 316 acero inoxidable 1,6 centímetros de diámetro, 0,5-2 micrómetros de tamaño de poro se situaba bajo el portaobjetos para recoger todas las partículas proteínicas. Un termopar 56, Omega Engineering type 3, se colocaba en el centro del cristalizador para controlar la temperatura.

Las partículas proteínicas recogidas en los porta-objetos se examinaban a través de un Microscopio Óptico Universal Carl Zeiss y un Scanning Electron Microscopy JEOL JSM-840A, con muestras recubiertas de oro-paladio. Las partículas en el microfiltro también se examinaban con el microscopio electrónico para examen minucioso.

La mezcla líquida de dióxido de carbono, etanol y agua procedentes del cristalizador se despresurizaba y expandía a presión atmosférica pasando a través de un depósito de despresurizado cilíndrico 22, Swagelok, 150 ml, 5.000 psi y un regulador de contrapresión 58, Tescom, serie 26-1.700, ajustado a 6.000 psi.

Las velocidades del flujo total e instantáneo del gas CO_{2} libre de soluto se medían con el rotámetro 60 (Fischer y Porter; modelo 10A4555, 0-3,35 SCFM AIR y el, medidor de la prueba de secado 62, American Meter; modelo DTM200A respectivamente.

Durante el experimento las velocidades de flujo normales de la solución proteínica y del gas antidisolvente eran de 0,35 cm^{3}/min y de 35 g/min, respectivamente, y el tiempo de funcionamiento típico era de 4 horas para un funcionamiento continuo. Todo el sistema se situaba en una cámara de aire donde la temperatura se controlaba usando un controlador de temperatura PID, Omega Engineering Modelo CN9000, y calentadores de banda.

Para medir el comportamiento de expansión de la solución de CO_{2}-etanol, se cargaban previamente en el cristalizador 20 ml de solución de etanol y se aumentaba la presión en incrementos de 200 psi a través de las válvulas V2 y V7. Luego se hacía circular el disolvente gas a través de la válvula V8, el cristalizador 20 y la válvula V5 usando un compresor de alta presión (Haskell; Double Acting Single Stage Model ACD-62) con válvulas V6 y V7 cerradas hasta que el sistema alcanzaba el estado de equilibrio y el nivel de líquido se mantenía constante.

Ejemplo 1

Partículas de catalasa, figuras 2-5, se preparaban con un diámetro equivalente de menos de a Im.

Se utilizaba una solución de 20 mg de catalasa (de hígado bovino) (Sigma Chemicals C-40) en 200 ml de etanol del 90% (Pharmco Products Co., prueba 200) y un l0% de agua (desionizada a través de un aparato de ósmosis inversa, Hydro Picosystem). El pH de la solución se ajustaba a 3,22 con ácido clorhídrico.

El dióxido de carbono líquido (industrias MG; grado exento de humedad, >99,8%) se comprimía mediante una bomba líquida de alta presión 40. La presión de reparto (1.600 psi) se controlaba mediante un regulador de contrapresión 42. El líquido presurizado se calentaba previamente a una temperatura supercrítica (35ºC) y se hacía fluir a través del serpentín 48 antes de entrar en el cristalizador 10. Se trataba de un sistema cerrado y el termostatado se conseguía mediante aire caliente circulante con un control de la temperatura (Omega Engineering Model CN9000) mientras que el calentamiento provenía de los calentadores de bandas. La cámara 20 del cristalizador se mantenía a 35ºC.

El fluido supercrítico llegaba al cristalizador a través de una válvula micrométrica 46, con las válvulas V1 y V4 abiertas y las válvulas V2 y V3 cerradas. La presión dentro del cristalizador se mantenía a 1.300 psi mediante un regulador de contrapresión 59. Las velocidades de flujo total e instantáneo del fluido supercrítico se medían con un rotámetro 60 y el medidor de la prueba de secado 62, respectivamente. La velocidad de flujo del fluido supercrítico era de 33 g/min.

Se presurizaba la solución líquida que contenía el enzima y se hacía circular por la bomba líquida 32 y por el control del regulador de contrapresión (1.430-1.530 psi). La solución circulaba a través de la bobina 36 y se precalentaba a 35ºC. Entraba por la parte superior del cristalizador a través de un disco de platino perforado con láser (Ted Pella: 3 mm DE x 0,24 mm grosor; 20 \mum), y aparecía como gotitas muy pequeñas. La velocidad del flujo líquido era de 0,35 cc/min. El líquido y las corrientes supercríticas circulaban a favor de la corriente en sentido descendente.

La mezcla líquida de dióxido de carbono, etanol y agua que salía del cristalizador se despresurizaba y expandía a presión atmosférica haciéndola fluir a través de un depósito despresurizante 22 cilíndrico, y un regulador de contra-presión 58.

El fluido supercrítico se expandía y eventualmente disolvía la mayor parte del disolvente líquido, haciendo que las partículas enzimáticas se precipitaran. Las partículas se recogían en un portaobjetos inclinado situado sobre la base del cristalizador, que formaba un ángulo de aproximadamente 10º en la dirección del flujo de solución proteínica. Las partículas también se recogían en un filtro (Mott Metallurgical; 316 acero inoxidable, 1,6 cm de diámetro, 0,5 \mum de tamaño de poro). La salida del dióxido de carbono se situaba aproximadamente a 8 cm por encima del filtro. La duración del experimento era de 260 minutos.

Las figuras 2 y 3 son partículas que se recogen en el lado superior del portaobjetos (de cara a la boquilla). Las figuras 4 y 5 son partículas recogidas en el filtro.

Ejemplo 2

El pH de la solución de 20 mg de insulina de zinc (Miles; baja endotoxina 86-003) en 200 ml de etanol del 90% (Pharmco Producte Co., prueba 200) -10% de agua (desionizada a través de un aparato de ósmosis inversa, Hydro Picosystem) se ajustaba a 2,56 con ácido clorhídrico.

El dióxido de carbono líquido (Industrias MG; grado exento de humedad, >99,8%) se comprimía mediante una bomba líquida de alta presión 40. La presión de reparto (2.000 psi) se controlaba mediante un regulador de contrapresión 42. El líquido presurizado se calentaba previamente a una temperatura supercrítica (35ºC) a medida que fluía a través del serpentín 48 antes de entrar en el cristalizador 10. Se trataba de un sistema cerrado y el termostatado se conseguía mediante aire caliente circulante con un control de la temperatura (Omega Engineering Model CN9000) mientras que el calentamiento provenía de los calentadores de bandas. La cámara 20 del cristalizador se mantenía a 35ºC.

El fluido supercrítico llegaba al cristalizador a través de una válvula micrométrica 46, con las válvulas V1 y V4 abiertas y las válvulas V2 y V3 cerradas. La presión dentro del cristalizador se mantenía en 1.300 psi mediante un regulador de contrapresión 59. Las velocidades de flujo total e instantáneo del fluido supercrítico se medían con un rotámetro 60 y el medidor de la prueba de secado 62, respectivamente. La velocidad de flujo del fluido supercrítico era de 35,6 g/min.

Se presurizaba la solución líquida que contenía el enzima y se hacía circular por la bomba líquida 32 bajo el control del regulador de contrapresión 34 (1.450 psi). La solución circulaba a través de la bobina 36 y se precalentaba a 35ºC. Entraba por la parte superior del cristalizador a través de un disco de platino perforado con láser (Ted Pella: 3 mm DE x 0,24 mm grosor; 20 \mum), y aparecía como gotitas muy pequeñas. La velocidad del flujo líquido era de 0,39 cc/min. Las corrientes líquidas y supercríticas circulaban a favor de la corriente en sentido descendente.

La mezcla líquida de dióxido de carbono, etanol y agua que salía del cristalizador era despresurizada y se expandía a presión atmosférica haciéndola fluir a través de un depósito cilíndrico de despresurización 22, y un regulador de contrapresión 58.

El fluido supercrítico se expandía y eventualmente disolvía la mayor parte del disolvente líquido, haciendo que las partículas enzimáticas precipitaran. Las partículas se recogían en un portaobjetos inclinado situado en la base del cristalizador, que formaba un ángulo de aproximadamente 10º con respecto a la dirección del flujo de solución proteínica. Las partículas también se recogían en un filtro (Mott Metallurgical; 316 acero inoxidable, 1,6 cm de diámetro, 0,5 \mum de tamaño de poro). La salida del dióxido de carbono se situaba aproximadamente a 60 mm por debajo del filtro.

La duración del experimento era de 296 minutos para la entrada de dióxido de carbono y de 237 minutos para la entrada de liquido, seguido de 17 minutos de flujo de solución líquida sin enzima disuelta.

La figura 6 muestra las partículas que se recogen en el filtro que parecían agujas con un diámetro inferior a 1 \mum y siendo inferiores a 3 \mum. La figura 7 nuestra las partículas recogidas que eran globulares con un diámetro equivalente inferior a 1 \mum.

Mientras que se han descrito realizaciones ejemplares de esta invención, el verdadero objetivo de la invención se determina a partir de las reivindicaciones siguientes.

Claims (11)

1. Un método de formación de micropartículas de una proteína que tengan un diámetro equivalente de menos de unos 5 \mum, con una distribución estrecha de partículas que comprende poner en contacto contínuo un antidisolvente supercrítico, bajo control de presión, que tiene una potencia disolvente baja para la proteína, con gotitas de una solución líquida de dicha proteína en un disolvente para la proteína, teniendo las gotitas unos diámetros comprendidos entre alrededor de 10 \mum y alrededor de 500 \mum, a una velocidad controlada capaz de disolver y expandir la solución líquida y precipitar las partículas proteínicas secas.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha proteína sea un enzima hidrofóbico.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha proteína es seleccionada del grupo formado por la insulina, catalasa, hormona adrenocorticotrofina y peroxidasa.

4. Un método de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 1-3, donde dicho antidisolvente supercrítico se selecciona del grupo formado por el dióxido de carbono, etano, etileno, hexafluoruro de sulfuro, óxido nitroso, clorotrifluormetano, monofluormetano y mezclas de los mismos.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, donde dicho antidisolvente supercrítico es el dióxido de carbono.

6. Un método de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 1-5, donde dicho disolvente para semejante proteína se selecciona del grupo formado por el etanol, dimetilsulfóxido, tetrahidrofurano, ácido acético, formamida, N,N-dimetilformamida, etilenglicol, polietilenglicol líquido y N,N-dimetilanilina.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicho disolvente para semejante proteína es el etanol acuoso.

8. Un método de acuerdo con algunas de las reivindicaciones 1-7, donde dicha proteína forma generalmente partículas globulares que tienen un diámetro equivalente de menos de 1 \mum.

9. Un método de acuerdo con algunas de las reivindicaciones 1-7, donde dicha proteína forma generalmente partículas globulares que tienen un diámetro equivalente de menos de 3 \mum.

10. Un método de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 1-9, donde dichas gotitas de semejante solución de dicha proteína circulan de forma continuada en la misma dirección que una corriente de dicho gas antidisolvente.

11. Un método de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 1-9, donde dichas gotitas de semejante solución de dicha proteína pasan de forma continuada en la misma dirección que una corriente de dicho gas antidisolvente.