PL209826B1

PL209826B1 - Sposób współstrącania białka lub polipeptydu

Info

Publication number: PL209826B1
Application number: PL370303A
Authority: PL
Inventors: Marco Gentile; Palma Cesare Di; Maria Candida Cesta
Original assignee: Dompe Pha R Ma Spa Res & Mfg
Priority date: 2001-10-22
Filing date: 2002-10-21
Publication date: 2011-10-31
Also published as: US7250152B2; AU2002350588A2; NO330504B1; PT1440082E; US20050065063A1; CA2464308A1; DK1440082T3; HUP0402096A3; NO20041634L; US20070293655A1; NZ532395A; WO2003035673A9; RU2309160C2; ZA200402899B; ATE526340T1; IL161447A0; EP1440082A1; IL161447A; JP2005514341A; WO2003035673A1

Description

Opis wynalazku

Zakres wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób współstrącania białka lub polipeptydu ze stabilizatorem przy użyciu płynu nadkrytycznego.

Tło wynalazku

Wciąż rośnie zapotrzebowanie na stabilne białka i polipeptydy dla wielu zastosowań. Jest to szczególnie wyraźne w przypadku białek terapeutycznych w dziedzinie farmacji. Często korzystną dla wygody zarówno producentów jak i użytkowników końcowych postacią podawania są wodne roztwory białek. Ponadto to jest ich pospolita postać naturalna, która umożliwia tworzenie hydratowanych, pofałdowanych kompleksów trójwymiarowych. Ta konformacja jest ogólnie opisywana jako struktura trzeciorzędowa, a jej integralność ma żywotne znaczenie dla utrzymania aktywności biologicznej białek. Nieodwracalna utrata struktury trzeciorzędowej białek określana jest jako denaturacja i powoduje inaktywację. Ze względu na to, że białka i polipeptydy w roztworze wystawione są na wiele czynników szkodliwych, które mogą powodować rozkład fizyczny (denaturacja) i chemiczny (tj. reakcje takie jak hydroliza, deamidowanie, itp.), to bardzo często wykluczone jest opracowanie preparatów ciekłych. Obecnie, najpospolitszym sposobem osiągnięcia stabilności białka jest usunięcie wody w odpowiednich procesach, takich jak liofilizacja lub suszenie rozpyłowe. Jednak obie z tych technik (patrz Formulation and Delivery of Proteins and Peptides J. L. Cleland i R. Langer, American Chemical Society, Washington, DC 1994) mogą indukować rozwijanie białka. W szczególności, w odniesieniu do liofilizacji, rozwijanie białka może wystąpić albo podczas początkowego etapu zamrażania albo podczas ostrej dehydratacji przez sublimację.

Co się tyczy suszenia rozpyłowego, to głównymi ograniczeniami tej techniki są rozkład termiczny, niska sprawność, niska wydajność i wysokie poziomy pozostającej wilgoci.

Inny problem stanowi różnica stabilności długoterminowej analogicznych preparatów otrzymanych różnymi sposobami suszenia. Faktycznie, zależnie od sposobu dehydratacji, białko może przyjmować różne struktury trójwymiarowe o tej samej początkowej aktywności biologicznej, ale różnej przechowalności.

Działanie stabilizujące węglowodanów, a w szczególności trehalozy, na białka podczas zamrażania i dehydratacji jest dobrze udokumentowane (Formulation and Delivery of Proteins and Peptides, J. L. Cleland i R. Langer, American Chemical Society, Washington, DC 1994, oraz FreezeDrying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products, L. Rey i J. C. May, Marcel Dekker, Inc., New York 1999). Chociaż wiele cukrów może zapobiegać niszczeniu białka podczas odwadniania, to produkty często mają krótką przechowalność w temperaturze pokojowej wskutek reakcji Maillarda. Stabilność w temperaturze pokojowej można polepszyć, stosując cukry nieredukujące, takie jak sacharoza i trehaloza.

Brytyjskie zgłoszenie patentowe GB 2009198 ujawnia liofilizację polisacharydu meningokokowego i trehalozy; GB 2126588 ujawnia stabilizację czynnika martwicy nowotworów (TNF) wobec liofilizacji i zamrażania przez włączenie albo niejonowego środka powierzchniowo czynnego albo trehalozy (lub innego cukru); zaś japońskie zgłoszenie patentowe J 58074696 ujawnia liofilizację ATP w obecności trehalozy.

Opisano, że preparaty fosfatazy alkalicznej zawierające trehalozę utrzymują swoją aktywność po liofilizacji i utrzymują około 70% aktywności początkowej po 84 dniach przechowywania w temperaturze 45°C (A. W. Ford i in., J. Pharm. Pharmacol. 1993, 45: 86-93). Chociaż liofilizacja to wciąż główny sposób stosowany do suszenia białek, to trzeba podejmować kilka środków ostrożności w celu uniknięcia niszczenia, które może być powodowane przez kilka faz obejmujących czynniki szkodliwe, takich jak zamrażanie-rozmrażanie i suszenie. Faktycznie, podczas pierwszego etapu liofilizacji preparatu białka prawidłowy dobór warunków (pH, siła jonowa, obecność stabilizatorów, itp.) gwarantuje najlepsze zabezpieczenie przeciwko rozwijaniu i inaktywacji białek. Wiadomo, że wiele zaróbek, takich jak cukry, aminokwasy, polimery, środki powierzchniowo czynne, ligandy swoiste (substraty, kofaktory, modyfikatory allosteryczne, itp.), stabilizuje białka podczas liofilizacji, i nazwano je środkami osłaniającymi przy liofilizacji {ang. lyoprotectants}. Wśród nich szeroko badano węglowodany, a w szczególności disacharydy takie jak sacharoza i trehaloza. Mechanizm stabilizujący tych związków, jak również innych stabilizatorów, nie został jeszcze zupełnie wyjaśniony. Jednak skuteczny środek osłaniający przy liofilizacji musi utrzymywać stabilność podczas zarówno zamrażania-rozmrażania i suszenia. Skoro przez większość procesu zamrażania białko znajduje się w środowisku wodnym, to substancje

PL 209 826 B1 rozpuszczone, które stabilizują konformację natywną w roztworach wodnych, są bardzo często skuteczne jako środki osłaniające białko przy zamrażaniu. Przykłady to węglowodany i niektóre aminokwasy. Arakawa i in. (J. Pharm. Res. 1991, 8, 285-29 1) opisali, że takie substancje rozpuszczone mają tendencję do wykluczania z powierzchni białka w roztworze wodnym. Termodynamicznym następstwem tego zjawiska jest stabilizacja konformacji natywnej białka.

Stabilność podczas suszenia i przechowywania najlepiej wyjaśniają hipotezy podstawienia wody i zeszklenia. Pierwsza twierdzi, że stabilizatory oddziałują z białkiem tak jak woda, zastępując usuwaną wodę, i przyczyniają się do regulacji termodynamicznej procesu suszenia. Ta ostatnia twierdzi, że stabilizatory dobrze tworzą szkło i pozostają bezpostaciowe podczas i po suszeniu, tak że mechanicznie unieruchamiają białka wewnątrz matrycy szklistej. Jest to argument czysto kinetyczny, który stosuje się równie dobrze do stabilności zarówno przy suszeniu jak i przechowywaniu. (FreezeDrying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products, L. Rey i J. C. May, Marcel Dekker, Inc. New York 1999).

Stąd, odnosząc się do powyższej hipotezy stabilizacji wysuszonych białek, można postulować, że zeszklenie to jedna z głównych kwestii stabilności długoterminowej. Mniej badane było zastosowanie suszenia rozpyłowego do suszenia białek. Chociaż można wytworzyć drobne cząstki bezpostaciowe, to ten sposób wymaga ciepłego powietrza jako czynnika suszącego, co może prowadzić do rozkładu termicznego białka. Ponadto, inne ograniczenia stanowią niska skuteczność, niska wydajność i wysokie poziomy pozostającej wilgoci.

Inną opisywaną techniką suszenia białek, która powinna unikać inaktywacji, jest dehydratacja powietrzem w temperaturze pokojowej. Patent nr US 4,891,319 firmy Quadrant Bioresources Ltd (Zjednoczone Królestwo) ujawnia konserwowanie kilku białek i innych makrocząsteczek w temperaturze 37-40°C metodą suszenia w obecności trehalozy pod ciśnieniem atmosferycznym.

Zastosowanie technologii płynu nadkrytycznego opisywano także jako przydatny sposób otrzymywania białek jako suchych drobnych mikrocząstek. Głównymi zaletami tej techniki są możliwość utrzymania białka w korzystnym środowisku wodnym przed nagłym strąceniem w celu zmniejszenia denaturacji i długości procesu, który jest krótszy niż liofilizacja i mniej kosztowny.

S. P. Sellers i in. (J. Pharm. Sci., 2001, 90, 785-797) opisują sposób dehydratacji do wytwarzania proszku białka oparty na nebulizacji wspomaganej przez nadkrytyczny CO2. Ta technika może być traktowana podobnie do suszenia rozpyłowego; faktycznie nadkrytyczny CO2 stosuje się do wzmagania nebulizacji roztworu, a nie jako przeciwrozpuszczalnik do strącania substancji rozpuszczonej. Sposób GAS (ang. Gas Anti-Solvent recrystallization) wytwarzania mikrocząstek białka opisuje Debenedetti (US 6,063,910). W tym przypadku roztwór białka rozpyla się przez zrobiony laserem w platynowym krążku otwór o średnicy 20 μm i długości 240 μm wewnątrz naczynia do tworzenia cząstek poprzednio napełnionego płynem nadkrytycznym, który wprowadza się przez inny wlot. Tę technikę stosowano do wytwarzania cząstek katalazy i insuliny (0,01% wag./obj.) z roztworów etanol/woda (9:1 obj.), stosując ditlenek węgla jako płyn nadkrytyczny. W tym sposobie nie optymalizuje się wlotu płynu nadkrytycznego: wtryskiwanie roztworu zachodzi w niemal statycznej atmosferze płynu nadkrytycznego, przy niskiej turbulencji.

Hanna M. i York P. (WO 96/00610) zaproponowali nowy sposób i nową aparaturę do wytwarzania bardzo małych cząstek techniką specyficznego płynu nadkrytycznego, zwaną SEDS (ang. Solution Enhanced Dispersion by Supercritical Solution). Sposób opiera się na nowej dyszy współosiowej: roztwór rozpręża się przez wlot kapilarny, płyn nadkrytyczny rozpręża się przez zewnętrzne przejście współosiowe o stożkowym zakończeniu. Mieszanie zachodzi między płynem nadkrytycznym i roztworem w strefie stożkowej. Proponują oni także stosowanie dyszy trójdrożnej: można podawać modyfikator w celu polepszenia mieszania. Zastosowali oni technologię SEDS do strącania małych cząstek związków rozpuszczalnych w wodzie, takich jak cukry (laktoza, maltoza, trehaloza i sacharoza) i białka (beta-laktamaza R-TEM). Nie wspomniano tam, ani nie podawano przykładów współstrącania białek i stabilizatorów.

Ponadto, ci sami twórcy (WO 01/03821) opisują ulepszony sposób strącania przy użyciu tej samej aparatury, ale z podawaniem do naczynia do tworzenia cząstek płynu nadkrytycznego i dwóch rozpuszczalników nie mieszających się. Ten sposób umożliwia współstrącanie dwóch lub więcej substancji rozpuszczonych w dwóch nie mieszających się rozpuszczalnikach. Wlot płynów jest uformowany przez współosiową dyszę, w której kontakt między dwoma rozpuszczalnikami następuje na krótko przed ich zdyspergowaniem przez przeciwrozpuszczalnik nadkrytyczny, z uniknięciem strącania substancji rozpuszczonych wewnątrz dyszy. Jednak ten sposób pozwala na tworzenie homogennych

PL 209 826 B1 osadów współstrąconych; jest on ogólnie przydatny, gdy trzeba przerabiać dwie substancje rozpuszczone o różnych polarnościach. Ponadto, jeżeli stosuje się go do roztworu wodnego, to drugi rozpuszczalnik musi być co najmniej częściowo rozpuszczalny w wodzie tak, żeby umożliwiał dyspergowanie wody w przeciwrozpuszczalniku nadkrytycznym. Ten etap jest niezbędny dla umożliwienia strącenia rozpuszczalnej w wodzie substancji rozpuszczonej. Współstrącanie białek i stabilizatorów nie jest opisane w tym dokumencie.

Walker (WO 01/15664) ujawnia sposób wytwarzania wspólnego preparatu substancji aktywnej (korzystnie farmaceutycznie aktywnej) i zaróbki oligomerycznej lub polimerycznej, w którym ilość między 80 i 100% substancji aktywnej jest w postaci bezpostaciowej, w przeciwieństwie do postaci krystalicznej. W tych preparatach substancje aktywne są bardziej stabilne w porównaniu z postaciami krystalicznymi, gdy są przechowywane z temperaturze między 0 i 10°C. W tym dokumencie ujawniono tylko tworzenie wspólnego preparatu substancji farmaceutycznie aktywnej z zaróbką oligomeryczną lub polimeryczną i nie ma wzmianki o stabilizacji białka. Zatem w stanie techniki stabilizację białka osiąga się przez liofilizację i suszenie rozpyłowe. Współstrącanie białek ze stabilizatorami przy użyciu płynów nadkrytycznych nie zostało dotąd opisane i stanowi przedmiot niniejszego wynalazku.

Obecnie twórcy znaleźli sposób wytwarzania stabilnych suchych mikrocząstek białka przez współstrącanie ze stabilizatorem przy użyciu płynów nadkrytycznych.

Współstrącanie umożliwia bliskie oddziaływania między cząsteczkami białka/stabilizatora i dla każdej pary białko/stabilizator istnieje optymalny stosunek wagowy.

Faktycznie, skoro nie ma zamrażania-rozmrażania, to nie ma potrzeby zabezpieczania przed zimnem. Ponadto, chociaż charakter oddziaływań białka/stabilizatora musi zostać lepiej wyjaśniony, to w niniejszym przypadku stabilizator odgrywa zasadniczą rolę polepszania stabilnoś ci przy przechowywaniu, zamiast roli utrzymywania aktywności białka podczas suszenia. Faktycznie, strącanie przez płyn nadkrytyczny samo z siebie umożliwia wytwarzanie cząstek białka bez denaturacji podczas procesu suszenia.

Określenie wynalazku

Określenie płyn nadkrytyczny oznacza płyn w warunkach jego ciśnienia krytycznego lub wyższego i jego temperatury krytycznej.

Określenie rozpuszczalnik oznacza ciecz, która może tworzyć roztwór z białkiem i stabilizatorem.

Określenie stabilizator oznacza stałą zaróbkę farmaceutyczną, która jest zdolna do stabilizowania, na przykład, białek, która jest rozpuszczalna w rozpuszczalniku, i która jest zasadniczo nierozpuszczalna w płynie nadkrytycznym.

Określenie modyfikator oznacza substancję, korzystnie rozpuszczalnik, która zwiększa rozpuszczalność rozpuszczalnika w płynie nadkrytycznym. Modyfikator jest rozpuszczalny zarówno w rozpuszczalniku jak i w płynie nadkrytycznym. Zastosowanie modyfikatora jest potrzebne, gdy rozpuszczalnik nie miesza się z płynem nadkrytycznym.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zatem sposób współstrącania białka lub polipeptydu z jego stabilizatorem, przez dział anie gazowym przeciwrozpuszczalnikiem, który obejmuje wprowadzanie do naczynia do tworzenia cząstek płynu nadkrytycznego zmieszanego z modyfikatorem; oraz roztworu zawierającego wspomniane białko lub polipeptyd i wspomniany stabilizator rozpuszczone w rozpuszczalniku; tak ż e wspomniany rozpuszczalnik ekstrahuje się z roztworu wspomnianym pł ynem nadkrytycznym i zachodzi współstrącanie substancji i stabilizatora, przy czym wspomniany stabilizator stanowi trehaloza, wspomniany rozpuszczalnik stanowi woda, wspomniany płyn nadkrytyczny stanowi ditlenek węgla, a wspomniany modyfikator jest wybrany z grupy obejmującej metanol, etanol i izopropanol.

W naczyniu do tworzenia cząstek następuje mieszanie płynu nadkrytycznego z roztworem i ekstrakcja rozpuszczalnika płynem nadkrytycznym tak, że substancje rozpuszczone (substancja i stabilizator) współstrącają się jako drobne cząstki.

Korzystniej stosuje się aparaturę przedstawioną na fig. 1. W tym przypadku roztwór substancji i stabilizatora, oraz płyn nadkrytyczny z modyfikatorem wprowadza się oddzielnie do naczynia do tworzenia cząstek w przepływie współprądowym przez dyszę 27. Taka dysza WO 02/68107, która jest pokazana na fig. 2 i 3, zapewnia osobne wloty dla płynu nadkrytycznego i roztworu. Faktycznie jest to krążek z otworem na środku oraz dwoma lub więcej otworami w tej samej odległości od środka i równomiernie rozmieszczonymi na obwodzie. Wszystkie otwory łączą się z wnętrzem naczynia do twoPL 209 826 B1 rzenia cząstek. Roztwór wprowadza się do naczynia do tworzenia cząstek przez otwór środkowy, zaś płyn nadkrytyczny z modyfikatorem wprowadza się przez otwory zewnętrzne.

Korzystnie płyn nadkrytyczny wprowadza się do naczynia do tworzenia cząstek przez wiele dysz wlotowych.

Modyfikator i płyn nadkrytyczny miesza się przed wprowadzeniem do naczynia do tworzenia cząstek. W innej wersji sposobu modyfikator wprowadza się do naczynia do tworzenia cząstek w części z zmieszany z roztworem, a w części zmieszany z płynem nadkrytycznym.

Najkorzystniej modyfikator stanowi etanol.

Substancję współstrącaną stanowi związek białkowy lub polipeptydowy, korzystnie użyteczny farmaceutycznie lub diagnostycznie, rozpuszczalny w rozpuszczalniku i w mieszaninie rozpuszczalnik/modyfikator i zasadniczo nierozpuszczalny w płynie nadkrytycznym. Korzystniej substancję współstrącaną stanowi białko.

Stabilizator stanowi korzystnie zaróbka farmaceutyczna, która nadaje się do stabilizowania substancji we współstrąconym produkcie. Stabilizator jest rozpuszczalny w rozpuszczalniku i w mieszaninie rozpuszczalnik/modyfikator, i zasadniczo nierozpuszczalny w płynie nadkrytycznym.

Stosunek białka lub polipeptydu do stabilizatora w roztworze wynosi korzystnie 1:1 do 10 wagowo, korzystniej 1:2 wagowo.

Opis rysunków

Figura 1 pokazuje schemat technologiczny aparatury stosowanej do wykonywania sposobu według niniejszego wynalazku.

Figury 2 i 3 pokazują dyszę, którą stosuje się do wykonywania sposobu według niniejszego wynalazku.

Figury 4, 5 i 6 pokazują rozkłady wielkości cząstek współstrąconych nadkrytycznym CO2 proszków lizozym/trehaloza przy stosunkach wagowych, odpowiednio, 1:10, 1:2 i 1:0.

Figura 7 pokazuje termogramy otrzymane metodą różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC) współstrąconych nadkrytycznym CO2 proszków lizozym/trehaloza w odniesieniu do odpowiednich czystych produktów.

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek zostanie opisany dalej przy szczególnym odniesieniu do substancji będącej białkiem. Stwierdzono, że można wytworzyć stabilne suche mikrocząstki białko/stabilizator przez zastosowanie płynów nadkrytycznych.

Niespodziewanie stwierdzono, że współstrącanie przy użyciu płynów nadkrytycznych umożliwia szczególnie bliskie oddziaływania między cząsteczkami białka i stabilizatora, i że dla każdej pary białko/stabilizator istnieje optymalny stosunek wagowy. Jeżeli ilość stabilizatora przewyższa ilość optymalną, to nadmiar nie oddziałuje bezpośrednio z białkiem, ale raczej tworzy cząstki czystego stabilizatora. To zachowanie udowodniono metodą mikroskopii i metodą analizy różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC).

Sposób współstrącania substancji ze stabilizatorem sposobem GAS obejmującym zastosowanie płynu nadkrytycznego zmieszanego z modyfikatorem i roztworu do naczynia do tworzenia cząstek można wykonywać, stosując aparaturę opisaną na figurze.

Zaleta aparatury na fig. 1 wiąże się z kontaktem między płynem nadkrytycznym i roztworem, gdyż następuje on tylko w naczyniu do tworzenia cząstek. Roztwór i płyn nadkrytyczny wprowadza się do naczynia do tworzenia cząstek przez oddzielne dysze wlotowe. Stąd wewnątrz dyszy nie może nastąpić strącanie żadnego proszku i powodowanie blokady. Co ważne, płyn nadkrytyczny działa jako przeciwrozpuszczalnik, ale też wspomaga przekształcenie roztworu w drobno rozpyloną strugę cieczy, kiedy jest on wprowadzany do naczynia do tworzenia cząstek. To poszerza powierzchnię międzyfazową roztwór/przeciwrozpuszczalnik i pozwala na szybsze mieszanie dwóch faz, a stąd gwałtowne strącanie białka bez żadnej denaturacji. Ponadto, zwiększenie natężenia przenoszenia masy między roztworem i płynem nadkrytycznym umożliwia działanie w łagodnych warunkach temperatury i ciśnienia, które przyczynia się do uniknięcia jakiejkolwiek możliwej denaturacji białka. Aparatura według fig. 1 obejmuje naczynie do tworzenia cząstek 22. Jest to normalne naczynie reakcyjne o odpowiedniej objętości. W naczyniu przy pomocy płaszcza grzejnego 21 utrzymywana jest stała temperatura. Ciśnienie w naczyniu reguluje się przy pomocy mikrozaworu dozującego 25.

Temperaturę i ciśnienie w naczyniu do tworzenia cząstek mierzy się przy pomocy termopary 29 i przetwornika ciśnienia 30.

PL 209 826 B1

Powstałe cząstki są zatrzymywane przez filtr 23. Jest to kosz ze stali nierdzewnej, którego dno stanowi krążek ze spieku stali nierdzewnej (0,5 μm). Drugi filtr 24 (0,5 μm) jest umieszczony na wylocie naczynia.

Płyn nadkrytyczny jest pobierany z butli 3, skraplany przez chłodnicę 4 i pompowany przy pomocy pompy 8 do naczynia do tworzenia cząstek przez linię 34. Przed wprowadzeniem do naczynia do tworzenia cząstek płyn nadkrytyczny ogrzewa się do pożądanej temperatury przy pomocy grzejnika wstępnego 14 i grzejnika 17. Grzejnik wstępny 14 działa także jako tłumik pulsacji. Płyn nadkrytyczny także filtruje się przy pomocy filtra 15 (0,5 μm). Temperaturę i ciśnienie płynu nadkrytycznego przed wprowadzeniem do naczynia do strącania mierzy się przy pomocy, odpowiednio, termopary 29 i przetwornika ciśnienia 30.

Modyfikator pobiera się ze zbiornika 2, pompuje się przy pomocy pompy 9 do linii 34 i miesza się z płynem nadkrytycznym przed wprowadzeniem do naczynia do tworzenia cząstek. Modyfikator także filtruje się przy pomocy filtra 12 (0,5 μm).

Linia 34 jest wyposażona w zawór nadmiarowy 16.

Roztwór pobiera się ze zbiornika 1, pompuje się przy pomocy pompy 10 do naczynia do tworzenia cząstek przez linię 36. Roztwór także filtruje się przy pomocy filtra 13 (0,5 nm).

W innej wersji sposobu, modyfikator może być wprowadzony do naczynia do tworzenia cząstek w części zmieszany z roztworem, a w części zmieszany z płynem nadkrytycznym. Płyn nadkrytyczny zmieszany z modyfikatorem oraz roztwór podaje się do naczynia do tworzenia cząstek przy pomocy dyszy 27.

Za naczyniem do strącania 22 mieszaninę płynu nadkrytycznego, modyfikatora i rozpuszczalnika filtruje się przy pomocy filtra 24 (0,5 μm) w celu zatrzymania cząstek, które ostatecznie nie zostały zatrzymane przez filtr 23. Mieszaninę płynu nadkrytycznego, modyfikatora i rozpuszczalnika rozpręża się przy pomocy mikrozaworu dozującego 25, w separatorze 26 oddziela się od modyfikatora i rozpuszczalnika rozpuszczalnik nadkrytyczny, mierzy się jego natężenie przepływu przy pomocy miernika masowego natężenia przepływu 31, i wypuszcza się go.

Dysza, która jest pokazana na fig. 2 i 3, umożliwia wprowadzenie roztworu oraz płynu nadkrytycznego zmieszanego z modyfikatorem do naczynia do tworzenia cząstek w przepływie współprądowym. Szybkości roztworu i płynu nadkrytycznego na wylocie dyszy zależą od masowego natężenia przepływu i od średnicy otworów. Ponadto, korzystne jest, żeby energie ciśnienia zarówno roztworu jak i płynu nadkrytycznego przekształcały się w energię kinetyczną przy najmniejszej stracie energii. Dysza według fig. 2 i 3 była, faktycznie, skonstruowana w tym celu. Cecha wyróżniająca tej dyszy polega na tym, że rozprężanie roztworu i płynu nadkrytycznego następuje przez otwory. Otwór cechuje stosunek długości do średnicy w zakresie od 5 do 10. Ma tę przewagę wobec kapilary, że zmniejsza stratę energii ciśnienia i wydajnie przekształca energię ciśnienia w energię kinetyczną. Dysza ma otwory o średnicach w zakresie od 0,02 do 0,04 mm i długości w zakresie od 0,1 do 0,2 mm. Takie wymiary pozwalają na bardzo wysokie szybkości na wylocie otworu dla zarówno roztworu jak i płynu nadkrytycznego.

Dysza może być wykonana ze stali nierdzewnej lub z innego odpowiedniego materiału.

Dyszę stanowi krążek z otworem 39 środku i dwoma lub więcej otworami 41 zrobionymi w tej samej odległości od środka i równomiernie rozmieszczonymi na obwodzie. Otwory łączą się z wnętrzem naczynia do tworzenia cząstek. Roztwór wprowadza się do naczynia do tworzenia cząstek przez otwór środkowy, a płyn nadkrytyczny z modyfikatorem wprowadza się do naczynia do tworzenia cząstek przez otwory zewnętrzne. Roztwór 37 przechodzi przez kanał o średnicy D3. Jego koniec ma stożkowy kształt 40. Na wierzchołku stożkowego końca 40 znajduje się zrobiony laserem otwór 39. Długość L1 otworu środkowego jest 5 do 10 razy większa od jego średnicy D1. Średnica D1 może być dobrana w taki sposób, żeby uzyskać dowolną pożądaną szybkość roztworu na wylocie otworu.

Płyn nadkrytyczny 38 przechodzi przez kanały o średnicy D4. Każdy koniec kanału ma stożkowy kształt 42. Na wierzchołku stożkowego końca 42 znajduje się zrobiony laserem otwór 41 Długość 21 otworu jest 5 do 10 razy większa od jego średnicy D2. Średnica D2 może być dobrana w taki sposób, żeby uzyskać dowolną pożądaną szybkość płynu nadkrytycznego na wylocie otworu.

Stosunek między długością (L1 lub L2) i średnicą (D1 lub D2) otworów 39 i 41 dobiera się tak, żeby ustawić najmniejszą stratę energii i uzyskać wyższe szybkości przez przekształcenie energii ciśnienia w energię kinetyczną.

Roztwór wydostaje się z otworu środkowego 39 z wysoką szybkością i jest rozbijany na drobne kropelki w kontakcie z płynem nadkrytycznym. Dyspergowanie strugi ciekłego roztworu jest wzmagane

PL 209 826 B1 przez płyn nadkrytyczny wydostający się z otworów 41, pod warunkiem, że szybkość płynu nadkrytycznego jest bardzo wysoka, rzędu wielkości szybkości dźwięku przy roboczej temperaturze i ciśnieniu. Wpływ płynu nadkrytycznego przy wzmaganiu dyspergowania strugi ciekłego roztworu jest decydujący i określa kształt, wielkość i wydajność produktu.

Można zrobić otwory o średnicach nie mniejszych niż 0,02 mm. Dysze, które były stosowane do wykonywania testów, mają otwory o średnicy w zakresie od 0,02 do 0,04 mm. W innym wariancie wykonania wynalazku, jeden lub więcej otworów zewnętrznych robi się w taki sposób, że ich osie zbiegały się na osi otworu środkowego. Kąt tworzony przez oś otworów zewnętrznych z osią otworu środkowego leży między 1 i 30°.

Decydującą kwestią w sposobie tworzenia drobnych suchych mikrocząstek białka jest mieszanie roztworu z płynem nadkrytycznym: gwałtowne i dokładne mieszanie powoduje strącanie cząstek o małej średnicy i zapewnia wysoką wydajność proszku.

W celu uzyskania dobrego mieszania roztwór powinien być dyspergowany do płynu nadkrytycznego w postaci małych kropelek, zapewniając tak wysokie pole powierzchni międzyfazowej dla przenoszenia masy i krótką drogę dyfuzji płynu nadkrytycznego w kropelkach roztworu, a przez to zapobiegając wzrostowi cząstek substancji rozpuszczonej. Ponadto wysoki stosunek między natężeniem przepływu płynu nadkrytycznego i natężeniem przepływu roztworu powoduje duży nadmiar płynu nadkrytycznego do roztworu w chwili ich kontaktu, zwiększając siłę napędową dla przenoszenia masy płynu nadkrytycznego do roztworu i rozpuszczalnika do płynu nadkrytycznego.

Gdy rozpuszczalność rozpuszczalnika w płynie nadkrytycznym jest niska, to zastosowanie modyfikatora umożliwia lepsze mieszanie między roztworem i płynem nadkrytycznym.

Stosunek natężenia przepływu modyfikatora i natężenia przepływu roztworu musi być dobrany tak, żeby uzyskać wysoki wzrost rozpuszczalności rozpuszczalnika w płynie nadkrytycznym. Modyfikator może być wprowadzany w całości z płynem nadkrytycznym albo w części z płynem nadkrytycznym i w części z roztworem. Sposób wprowadzania modyfikatora ogromnie wpływa na ekstrahowanie rozpuszczalnika i strukturę tworzonych cząstek.

Dla strącania proszków z roztworu wodnego przy użyciu ditlenku węgla jako rozpuszczalnika nadkrytycznego i etanolu jako modyfikatora, stosunek między natężeniem przepływu płynu nadkrytycznego i natężeniem przepływu modyfikatora leży korzystnie w zakresie 4:1 do 8:1, korzystniej wynosi 7, zaś stosunek między natężeniem przepływu modyfikatora i natężeniem przepływu roztworu leży korzystnie w zakresie 15:1 do 25:1, a korzystniej wynosi 20.

Jak podkreślono wyżej, w celu uzyskania bardzo małych kropelek roztworu konieczne jest zapewnienie dobrego dyspergowania roztworu do płynu nadkrytycznego.

Wielkość tworzonych kropelek roztworu określają warunki dynamiki płynów w strefie mieszania i właściwości fizyczne roztworu i rozpuszczalnika nadkrytycznego, takie jak lepkość, napięcie powierzchniowe, gęstość. Na te właściwości w wielkim stopniu ma wpływ temperatura i ciśnienie płynu nadkrytycznego.

Wloty płynu nadkrytycznego są umieszczone dookoła wlotu roztworu i w bardzo krótkiej odległości od niego (około 3 mm) : ta konfiguracja umożliwia zasilanie roztworu energią płynu nadkrytycznego, i tak wzmaganie dyspergowania roztworu na bardzo drobne kropelki, zapewniając wysoką powierzchnię międzyfazową między dwiema fazami i szybką ekstrakcję rozpuszczalnika do płynu nadkrytycznego. Te zjawiska są szczególnie wydajne, gdy szybkość płynu nadkrytycznego na wylocie otworu osiąga lub przekracza szybkość dźwięku, powodując tworzenie dysku Macha i dyspergowanie roztworu jako bardzo drobnych kropelek (Matson D. W., Fulton J. L., Petersen R. C., Smith R. D.,

Rapid expansion of supercritical fluid solutions: solute formation of powders, thin films, and fibers,

Ind. Eng. Chem. Res., 1987, 26, 2298-2306). Szybkość dźwięku w płynie mocno zależy od ciśnienia i temperatury: najmniejsza wartość szybkości dźwięku dla ditlenku węgla w rejonie nadkrytycznym wynosi 208 m/s przy 8 MPa i 40°C. Żeby wykorzystać wyżej wymienione zjawiska, dogodnie jest pracować koło wartości szybkości dźwięku dla ditlenku węgla w rejonie nadkrytycznym, np. 208 m/s przy 8 MPa i 40°C.

Przy wytwarzaniu drobnych proszków z roztworów wodnych sposobem GAS przy użyciu ditlenku węgla jako rozpuszczalnika nadkrytycznego i etanolu jako modyfikatora, stwierdzono, że optymalne warunki robocze to 8-12 MPa i 35-50°C. W aparaturze doświadczalnej stosowanej do prowadzenia testów doświadczalnych masowe natężenie przepływu płynu nadkrytycznego wynosiło 30 g/min, natężenie przepływu roztworu 0,2 g/min, i masowe natężenie przepływu modyfikatora 4 g/min, przy nastawieniu stosunku płynu nadkrytycznego do masowego natężenia przepływu modyfikatora równego 7

PL 209 826 B1 i stosunku modyfikatora do masowego natężenia przepływu roztworu równego 20 oraz szybkości płynu nadkrytycznego na wylocie dyszy równej około 300 m/s. Przy użyciu tej aparatury twórcy wykonywali sposób z wytworzeniem stabilnych suchych mikro-cząstek substancji i stabilizatora metodą współstrącania GAS. Jako substancje stosowane były białka takie jak fosfataza alkaliczna i lizozym, a jako stabilizator trehaloza. Wytworzono proszki współstrącone przy różnych wartościach stosunku białko/stabilizator. Wydajność zebranego proszku wynosiła 90%.

Stwierdzono, że po wykonaniu sposobu zachowana aktywność enzymatyczna leżała w zakresie 95% i 100%, w porównaniu z nieprzerabianym reagentem handlowym. Rozkłady wielkości cząstek tych proszków pokazały, że więcej niż 90% cząstek ma równoważną średnicę mniejszą niż 10 μm przy wąskim rozkładzie wielkości. Ponadto, charakterystyka fizykochemiczna wykazała, że współstrącanie umożliwia bliskie oddziaływania między cząsteczkami białka i stabilizatora, i że dla każdej pary białko/stabilizator istnieje optymalny stosunek wagowy. Na koniec, badania stabilności wykazały, że współstrącone cząstki fosfatazy alkalicznej/trehalozy były bardziej stabilne niż równoważny produkt liofilizowany.

Procedura doświadczalna

Płyn nadkrytyczny wprowadza się do naczynia do strącania przy pomocy pompy 8, który stosuje się do nastawiania natężenia przepływu płynu nadkrytycznego. Temperaturę płynu nadkrytycznego w linii 35 nastawia się przy pomocy grzejnika 17 na wartość wyższą niż temperatura wewnątrz naczynia do tworzenia cząstek, biorąc pod uwagę obniżenie temperatury wskutek rozprężania przez otwory dysz. Następnie przy pomocy pompy 9 do płynu nadkrytycznego dodaje się modyfikator przy ustalonym natężeniu przepływu. Roztwór białka i stabilizatora pompuje się przy pomocy pompy 10 do naczynia do tworzenia cząstek, kiedy uzyskuje się warunki stanu stacjonarnego.

Po wprowadzeniu do naczynia do tworzenia cząstek pewnej ilości roztworu zatrzymuje się pompy 9 i 10, i do naczynia do tworzenia cząstek wprowadza się tylko płyn nadkrytyczny tak długo, aż strącony proszek będzie wolny od rozpuszczalnika i modyfikatora.

Naczynie do tworzenia cząstek rozhermetyzowuje się, odzyskuje się proszek i zamyka w fiolkach 10 mL pod osłoną suchego azotu.

Stabilność współstrąconych białek testowano przez przechowywanie fiolek w następujących warunkach: 25°C - 60% wilgotności względnej; 30°C - 65% wilgotności względnej; 40°C 75% wilgotności względnej. Aktywność biologiczną każdej próbki analizowano w chwili t = 0, 1, 2, 3 i 6 miesięcy. Dla porównania przeprowadzono równoległe badanie dla samego białka strącanego płynami nadkrytycznymi, dla analogicznych produktów liofilizowanych i dla nieprzetworzonego produktu handlowego, które wszystkie przechowywane były pod osłoną suchego azotu.

P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie współstrąconych cząstek fosfatazy alkalicznej (ALP)/trehalozy

W tym przykładzie sposób według wynalazku stosuje się do współstrącania mieszaniny fosfatazy alkalicznej (ALP) i trehalozy.

Stosowano roztwory zawierające ALP (SIGMA Chemicals) w stężeniu 0,2% wagowych i trehalozę (SIGMA Chemicals) w stężeniu leżącym w zakresie 0-2% wagowych w wodzie zdemineralizowanej.

Stosunki ALP/trehaloza otrzymanych proszków były jak następuje: 1:10, 1:2 i 1:0. Ditlenek węgla stosowano jako płyn nadkrytyczny, a etanol jako modyfikator.

Roztwór wprowadzano do naczynia do tworzenia cząstek 22 przy pomocy pompy 10 przy natężeniu przepływu równym 0,2 g/min. Nadkrytyczny ditlenek węgla wprowadzano przy pomocy pompy 8 przy natężeniu przepływu równym 30 g/min, etanol wprowadzano przy pomocy pompy 9 do linii 34 przy natężeniu przepływu równym 4 g/min i mieszano z nadkrytycznym ditlenkiem węgla przed wprowadzeniem do naczynia do tworzenia cząstek.

Płyn nadkrytyczny wtryskiwano do naczynia do tworzenia cząstek przez cztery zewnętrzne otwory dyszy, każdy o średnicy 0,04 mm. Roztwór wtryskiwano do naczynia do tworzenia cząstek przez otwór środkowy dyszy, mający średnicę 0,04 mm. Długość wszystkich otworów wynosiła 0,2 mm.

Temperaturę i ciśnienie wewnątrz naczynia do tworzenia cząstek utrzymywano na stałej wartości, odpowiednio, 40°C, przy pomocy płaszcza grzejnego 21, i 100 + 1 bar, przy pomocy mikrozaworu dozującego 25. Strącone cząstki zbierano na filtrze 22 na dnie naczynia do tworzenia cząstek, zaś płyn nadkrytyczny, modyfikator i wodę zbierano w cylindrze 26 pod ciśnieniem atmosferycznym.

PL 209 826 B1

Sposób prowadzono aż do otrzymania dostatecznej ilości proszku. Następnie zatrzymano przepływ roztworu i modyfikatora i do naczynia do tworzenia cząstek wprowadzano tylko czysty ditlenek węgla w celu ekstrahowania wszelkich śladów rozpuszczalnika i modyfikatora ze strąconych proszków. Typowo, w celu otrzymania suchych proszków naczynie do tworzenia cząstek przemywano dwiema objętościami ditlenku węgla.

Po rozhermetyzowaniu otwierano naczynie do tworzenia cząstek i odzyskiwano proszki i przechowywano w fiolkach 10 mL pod osłoną suchego azotu.

Wydajność zebranego proszku wynosiła 90%.

Pozostała aktywność enzymatyczna ALP leżała w zakresie 95% i 100% w porównaniu z nieprzetworzonym reagentem handlowym. Analiza proszku metodą mikroskopii optycznej pokazuje, że przy wysokiej zawartości trehalozy, jak dla stosunku ALP/ trehaloza 1:10, proszek tworzony jest przez dwie różne populacje cząstek: jedna, która jest znacznie częstsza, tworzona jest przez cząstki igłokształtne, zaś druga przez cząstki okrągłe. Cząstki igłokształtne są dość podobne do otrzymanych przez strącanie samej trehalozy nadkrytycznym CO2. Proszki o niższej zawartości trehalozy wykazują tylko populację cząstek okrągłych. Tak więc, trehaloza może być współstrącaną z ALP przez nadkrytyczny CO2 z wytworzeniem jednego rodzaju cząstek tylko przy niższych zawartościach trehalozy (stosunki białko/trehaloza 1:2). Podobne zachowanie stwierdzono dla współstrąconych osadów lizozym/trehaloza (patrz przykład 2). Analogiczne produkty wytworzono metodą liofilizacji. W tym przypadku stwierdzona pozostała aktywność enzymatyczna ALP leżała w zakresie 95% i 104% w porównaniu z nieprzetworzonym reagentem handlowym.

Wytworzono podobne fiolki zawierające nieprzetworzoną handlową ALP lub analogiczne produkty liofilizowane, wszystkie pod osłoną suchego azotu.

Badanie stabilności

Kilka fiolek z każdej kategorii umieszczano w każdych z następujących warunków: 25°C-60% wilgotności względnej; 30°C-65% wilgotności względnej; 40°C-75% wilgotności względnej przez 6 miesięcy. W chwili t = 0, 1, 2, 3, 6 miesięcy zawartość fiolek analizowano na aktywność ALP. Wyniki badania stabilności są streszczone w tabeli 1.

Czysta ALP strącona przez nadkrytyczny CO2 (próbka F6) wykazuje zanik aktywności enzymatycznej we wszystkich warunkach. Aktywność pozostała po 6 miesiącach w warunkach 40°C-75% wilgotności względnej (warunki najbardziej skrajne) wynosi 57% wartości dla t = 0.

W przeciwieństwie do tego, we wszystkich warunkach aż do 6 miesięcy nie stwierdzono znaczącej utraty aktywności dla ALP/trehaloza współstrąconych przez nadkrytyczny CO2 przy stosunku 1:10 (próbka FT8).

W warunkach 40°C-75% wilgotności względnej, czysta liofilizowana ALP (próbka F8) i produkt handlowy SIGMA wykazują podobne zaniki i tylko 43% i 42% początkowej aktywności enzymatycznej zostało zachowane po upływie 6 miesięcy. W pozostałych warunkach, zamiast tego, produkt SIGMA wykazuje wolniejszą utratę aktywności niż czysta liofilizowana ALP. Faktycznie po upływie 6 miesięcy wykryto następujące pozostałe aktywności enzymatyczne: 95% wobec 83% w warunkach 25°C-60% wilgotności względnej, i 86% wobec 76% w warunkach 30°C-65% wilgotności względnej.

Na koniec, liofilizowany proszek mający stosunek ALP/ trehaloza równy 1:10 (próbka FTIO) wykazał początkową gwałtowną utratę aktywności, następnie powolniejszą aż do sześciu miesięcy, co wydaje się być niezależne od warunków przechowywania. Faktycznie pozostałe aktywności enzymatyczne w warunkach 25°C-60% wilgotności względnej, 30°C-65% wilgotności względnej i 40°C-75% wilgotności względnej, wynoszą odpowiednio 90%, 88% i 90% wartości początkowej.

P r z y k ł a d 2

Wytwarzanie współstrąconych cząstek lizozymu/trehalozy

W tym przykładzie sposób według wynalazku stosuje się do wytwarzania współstrącanych proszków przy użyciu lizozymu i trehalozy.

Stosowano roztwory zawierające lizozym (SIGMA Chemicals) w stężeniu leżącym w zakresie 0,2-1% wagowych i trehalozę (SIGMA Chemicals) w stężeniu leżącym w zakresie 0-2% wagowych w wodzie zdemineralizowanej. Stosunki lizozym/trehaloza dla otrzymanych proszków były jak następuje: 1:10, 1:5, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1 i 1:0 (tabela 2).

Ditlenek węgla stosowano jako płyn nadkrytyczny, a etanol jako modyfikator.

Roztwór wodny zawierający enzym i stabilizator wprowadzano do naczynia do tworzenia cząstek 22 przy pomocy pompy 10 przy natężeniu przepływu równym 0,2 g/min. Nadkrytyczny ditlenek

PL 209 826 B1 węgla wprowadzano przy pomocy pompy 8 przy natężeniu przepływu równym 30 g/min, etanol wprowadzano przy pomocy pompy 9 do linii 34 przy natężeniu przepływu równym 4 g/min i mieszano z nadkrytycznym ditlenkiem węgla przed wprowadzeniem do naczynia do tworzenia cząstek.

Płyn nadkrytyczny wtryskiwano do naczynia do tworzenia cząstek przez cztery zewnętrzne otwory dyszy, każdy o średnicy 0,04 mm. Roztwór wtryskiwano do naczynia do tworzenia cząstek przez otwór środkowy dyszy, mający średnicę 0,04 mm. Długość wszystkich otworów wynosi 0,2 mm.

Temperaturę i ciśnienie wewnątrz naczynia do tworzenia cząstek utrzymywano na stałej wartości, odpowiednio, 40°C, przy pomocy płaszcza grzejnego 21, i 100 ± 1 bar, przy pomocy mikrozaworu dozującego 25.

Strącone cząstki zbierano na filtrze 23 na dnie naczynia do tworzenia cząstek, zaś płyn nadkrytyczny, modyfikator, wodę i substancję rozpuszczoną ostatecznie nie strąconą zbierano w cylindrze 26 pod ciśnieniem atmosferycznym.

Po wprowadzeniu pewnej ilości substancji rozpuszczonej do naczynia do tworzenia cząstek, zatrzymano pompy 9 i 10, i do naczynia do tworzenia cząstek wprowadzano tylko płyn nadkrytyczny w celu wysuszenia strąconych proszków: typowo, otrzymanie suchych proszków wymaga około dwa razy objętości naczynia do tworzenia cząstek.

W tym momencie naczynie do tworzenia cząstek rozhermetyzowywano, otwierano i zbierano proszki.

Wydajność odzyskanych proszków wynosiła 90%.

Stwierdzona pozostała aktywność enzymatyczna lizozymu leżała w zakresie 96% i 100%, w porównaniu z nieprzetworzonym reagentem handlowym.

Tabela 2 podaje dla każdej próbki stosunek lizozym/trehaloza, pozostałą aktywność enzymatyczną, zawartość białka, która wiąże się z jednorodnością strąconego osadu, liczbę populacji cząstek i wielkości cząstek. Jak można zauważyć, dla wszystkich próbek zarówno aktywność enzymatyczna i zawartość białka są bardzo bliskie wartościom teoretycznym. Tak więc, stosowane przez twórców warunki doświadczalne pozwoliły na podobne strącanie zarówno dla białka jak i cukru, i zagwarantowały niemal zupełne odzyskanie aktywności biologicznej.

Rozkłady wielkości cząstek proszków obliczone metodą analizy obrazu mikrofotografii SEM wykazały, że dla wszystkich proszków otrzymanych przez strącanie nadkrytycznym CO2, ponad 90% cząstek ma równoważną średnicę mniejszą niż 10 μm przy wąskim rozkładzie wielkości. Figury 4, 5, 6 pokazują rozkłady wielkości cząstek współstrąconych nadkrytycznym CO2 przy stosunkach lizozym/trehaloza, odpowiednio, 1:10, 1:2 i 1:0. Inne współstrącone osady dały podobne rozkłady. Ponadto, obserwacja proszków metodą analizy mikroskopii optycznej wykazała, że przy wysokiej zawartości trehalozy, jak dla obu stosunków lizozym/trehaloza 1:10 i 1:5, proszki składały się z dwóch populacji cząstek: jedna, która w znacznym stopniu była najczęstsza, była tworzona przez cząstki igłokształtne, zaś pozostała była tworzona przez cząstki okrągłe. Cząstki igłokształtne były dość podobne do otrzymywanych przez strącanie trehalozy nadkrytycznym CO2. W przeciwieństwie do tego, przy niższej zawartości trehalozy (stosunek lizozym/trehaloza 1:2) proszki wykazywały tylko populację cząstek okrągłych. Tak więc lizozym może być współstrącany z trehalozą nadkrytycznym CO2 z wytworzeniem tylko jednego rodzaju cząstek przy niższej zawartości trehalozy (wyższe stosunki białko/trehaloza). Stąd istnieje optymalna wartość dla stosunku białko/trehaloza, która gwarantuje najlepsze oddziaływanie między dwoma rodzajami cząsteczek. To zachowanie zostało potwierdzone metodą analizy DSC. Figura 7 pokazuje termogramy DSC rozmaitych współstrąconych proszków lizozymu. Jako próbki odniesienia podane są także czysty strącony lizozym i trehaloza. Jak można zauważyć, przy wyższej zawartości trehalozy (stosunek 1:5) próbki zawierają bezpostaciową trehalozę, która odzyskuje pokrój krystaliczny (pik egzotermiczny w 197°C), a następnie topi się w temperaturze 214°C w taki sam sposób jak strącona sama trehaloza. Zachowanie termiczne próbek o niższej zawartości trehalozy jest całkiem inne. Próbki o stosunkach 1:2 do 4:1 wykazują termogramy podobne do termogramu dla lizozymu jako takiego. Najbardziej istotną różnicą jest przesunięcie w stronę niższych temperatur charakterystycznej przemiany lizozymu w temperaturze T = 204°C. Im wyższa zawartość trehalozy, tym niższa temperatura przemiany. Tak więc twórcy uzyskali mocny dowód na to, że współstrącanie płynami nadkrytycznymi umożliwia bliskie oddziaływanie między białkiem i trehalozą. Faktycznie, co najwyżej do określonej ilości cukru (stosunek 1:2) otrzymuje się jednorodną fazę stałą. Ten stosunek może dawać najlepsze oddziaływanie białka/cukru i najlepszą stabilność długoterminową białka.

PL 209 826 B1

T a b e l a 1

Próbka/ Sposób suszenia	Stosunek ALP/trehaloza	Warunki przechowy- wania	Aktywność enz. po 1 mies. (% wartości dla t=0)	Aktywność enz. po 2 mies. (% wartości dla t=0)	Aktywność enz. po 3 mies. (% wartości dla t=0)	Aktywność enz. po 6 mies. (% wartości dla t=0)
ALP Sigma Liofilizacja	1: 0	-20°C	—	—	—	96
25°C/60% w.w.	101	100	101	95
30°C/70% w.w.	103	103	94	86
40°C/75% w.w.	94	85	75	42
ALP F6 Płyn nad- krytyczny	1: 0	-20°C	—	—	—	—
25°C/60% w.w.	91	72	69	67
30°C/70% w.w.	101	71	59	59
40°C/75% w.w.	64	69	58	57
ALP F8 Liofilizacja	1: 0	-20°C	—	—	—	—
25°C/60% w.w.	88	89	89	83
30°C/70% w.w.	83	87	87	76
40°C/75% w.w.	75	75	62	43
ALP FT8 Płyn nadkrytyczny	1: 10	-20°C	—	—	—	101
25°C/60% w.w.	111	99	113	99
30°C/70% w.w.	104	97	102	99
40°C/75% w.w.	113	98	101	99
ALP FT10 Liofilizacja	1:10	-20°C	—	—	—	95
25°C/60% w.w.	95	95	93	90
30°C/70% w.w.	94	96	92	88
40°C/75% w.w.	94	93	92	90

T a b e l a 2

Próbka	Stosunek lizozym/trehaloza	Aktywność enz. (mg enz./mg białka)	Zawartość białka (% nominalnej )	Liczba populacji cząstek	Wielkość cząstek (% < 10 gm)
1	2	3	4	5	6
L3	1:0	0,96	102,6	1	99
LT2	1:10	1,04	104,3	2	—
LT3	1:1	0,96	100,8	1	98

PL 209 826 B1 cd. tabeli 2

1	2	3	4	5	6
LT6	1:5	0,96	104,0	2	92
LT8	4:1	1,01	103,2	1	97
LT9	1:2	0,98	104,0	1	93
LT10	2:1	0,97	103,9	1	97

Zastrzeżenia patentowe

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób współstrącania białka lub polipeptydu z jego stabilizatorem, przez działanie gazowym przeciwrozpuszczalnikiem, znamienny tym, że obejmuje wprowadzanie do naczynia do tworzenia cząstek płynu nadkrytycznego zmieszanego z modyfikatorem; oraz roztworu zawierającego wspomniane białko lub polipeptyd i wspomniany stabilizator rozpuszczone w rozpuszczalniku;

tak że wspomniany rozpuszczalnik ekstrahuje się z roztworu wspomnianym płynem nadkrytycznym i zachodzi współstrącanie wspomnianego białka lub polipeptydu i stabilizatora, przy czym wspomniany stabilizator stanowi trehaloza, wspomniany rozpuszczalnik stanowi woda, wspomniany płyn nadkrytyczny stanowi ditlenek węgla, a wspomniany modyfikator jest wybrany z grupy obejmującej metanol, etanol i izopropanol.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że substancję współstrącaną stanowi białko.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ż e wspomniany roztwór i wspomniany płyn nadkrytyczny wprowadza się do wspomnianego naczynia do tworzenia cząstek przez oddzielne dysze wlotowe.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wspomniany płyn nadkrytyczny wprowadza się do wspomnianego naczynia do tworzenia cząstek przez wiele dysz wlotowych.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że wspomniane dysze znajdują się na krążku, przy czym dysza wlotowa roztworu znajduje się w środku wspomnianego krążka otoczona przez wiele otworów do wprowadzania płynu nadkrytycznego równomiernie rozmieszczonych na jego obwodzie.
6. Sposób według zastrz. 1 do 5, znamienny tym, ż e roztwór wprowadza się do naczynia do tworzenia cząstek zmieszany z modyfikatorem.
7. Sposób wedł ug zastrz. 1 do 6, znamienny tym, ż e wspomniany modyfikator stanowi etanol.
8. Sposób według dowolnego z zastrz. 1 do 7, znamienny tym, że stosunek białka lub polipeptydu do stabilizatora w roztworze wynosi 1:1 do 10 wagowo.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosunek białka lub polipeptydu do stabilizatora w roztworze wynosi 1:2 wagowo.
10. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1 do 9, znamienny tym, że płyn nadkrytyczny wprowadza się do naczynia do tworzenia cząstek z szybkością dźwięku w płynie lub większą.
11. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1 do 10, znamienny tym, że stosuje się modyfikator, zaś stosunek między natężeniem przepływu płynu nadkrytycznego i natężeniem przepływu modyfikatora leży w zakresie 4:1 do 8:1.
12. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1 do 11, znamienny tym, że stosuje się modyfikator, zaś stosunek między natężeniem przepływu modyfikatora i natężeniem przepływu roztworu leży w zakresie 15:1 do 25:1.