PT1440082E - Processamento de fluidos supercríticos: preparação de micropartículas de proteína e sua estabilização - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "PROCESSAMENTO DE FLUIDOS SUPERCRÍTICOS: PREPARAÇÃO DE MICROPARTICULAS DE PROTEÍNA E SUA ESTABILIZAÇÃO"

Campo da invenção A presente invenção refere-se a um método para precipitação de proteína e polipéptido através de processamento com fluido supercritico e sua protecção e estabilização contra a desnaturação.

Antecedentes da invenção A necessidade para proteínas e polipéptidos estáveis para muitas aplicações aumenta continuamente. Isto é particularmente acentuado para proteínas terapêuticas no campo farmacêutico.

Para a facilidade dos fabricantes e dos utilizadores finais as soluções de proteína aquosas são frequentemente a forma de administração preferida. Além disso, esta é a sua forma natural comum que permite a formação de um complexo hidratado, com estrutura tridimensional. Esta conformação é geralmente relatado como a estrutura terciária e a sua integridade é de vital

importância para manter a actividade biológica de proteínas. A perda irreversível de estrutura terciária de proteínas é referida como desnaturação e provoca inactivação. Dado que as proteínas e polipéptidos em solução são expostas a muito stresses que podem provocar a degradação física (desnaturação) e química (i. e. reacções, tais como hidrólise, desamidação, 1 etc...), muito frequentemente o desenvolvimento de formulações liquidas é impedido. Presentemente, o modo mais comum para alcançar a estabilidade da proteína é a remoção de água através de processos adequados, tais como liofilização ou secagem por vaporização. Contudo, ambas estas técnicas (ref. "Formulation and Delivery of Proteins and Peptides" J. L. Cleland e R. Lan ger American Chemical Society, Washington, DC 1994) podem induzir o desdobramento da proteína. Em particular, em relação à liofilização, o desdobramento da proteína pode ocorrer durante o passo de congelação inicial ou durante a desidratação aguda por sublimação.

Em relação à secagem por vaporização, a degradação térmica, baixa eficiência, baixo rendimento e níveis elevados de humidade residual são as principais limitações da técnica.

Outro problema é a diferença na estabilidade a longo prazo de formulações análogas obtidas através de processos de secagem diferentes. De facto, dependendo do método de desidratação, a proteína pode assumir estruturas tridimensionais diferentes com a mesma actividade biológica inicial, mas estabilidade em armazenamento diferente. 0 documento WO 00/69887 refere-se ao isolamento de uma proteína a partir de uma solução aquosa, na qual a proteína é simultaneamente desidratada. Isto é aplicado à preparação de microcristais revestidos por proteína. O efeito estabilizador de hidratos de carbono e em particular da trealose nas proteínas durante a congelação e desidratação está bem documentado ("Formulation and Delivery of

Proteins and Peptides" J. L. Cleland e R. Lan ger American 2

Chemical Society, Washington, DC 1994 e "Freeze-Drying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products" L. Rey e J. C. May, Mareei Dekker, Inc. Noca Iorque 1999) .

Embora muitos açúcares possam prevenir o dano da proteína durante a desidratação, os produtos possuem frequentemente uma estabilidade em armazenamento curta à temperatura ambiente devido à reacção de Maillard. A estabilidade à temperatura ambiente pode ser melhorada utilizando açúcares não redutores, tais como sacarose e trealose. 0 Pedido de Patente Britânica GB 2009198 divulga a liofilização de polissacárido de meningococos e trealose; o documento GB 2126588 divulga a estabilização do factor de necrose tumoral (TNF) para a liofilização e congelação por inclusão de um tensioactivo não iónico ou trealose (ou outro açúcar); e o Pedido de Patente Japonês J 58074696 divulga a liofilização de ATP na presença de trealose. São relatadas preparações de fosfatase alcalina contendo trealose para manter a sua actividade após liofilização e para manter cerca de 70% da actividade inicial após 84 dias/armazenamento a 45 °C (A. W. Ford et al., J. Pharm.

Pharmacol. 1993, 45: 86-93). Embora a liofilização seja ainda o principal processo utilizado para a secagem de proteínas, devem ser tomadas várias precauções de modo a evitar o dano que as fortes fases de stress, tais como a congelação-descongelação e a secagem podem provocar. De facto, durante o primeiro passo da formulação da proteína liofilizada, uma escolha correcta das condições (pH, força iónica, presença de estabilizadores, etc...) garante a melhor protecção contra a desdobragem e inactivação da proteína. Muitos excipientes, tais como açúcares, aminoácidos, polímeros, ligandos específicos para os 3 tensioactivos (substratos, co-factores, modificadores alostéricos, etc...) são conhecidos por estabilizarem proteínas durante a liofilização e foram denominados "lioprotectores". Entre eles, os hidratos de carbono e em particular dissacáridos, tais como sacarose e trealose, foram largamente estudados. 0 mecanismo de estabilização destes compostos, assim como outros estabilizadores, não foi completamente clarificado. Contudo, um lioprotector eficaz deve manter a estabilidade durante a congelação-descongelação e secagem. Uma vez que o ambiente da proteína é aquoso durante uma grande parte do processo de congelação, os solutos que estabilizam a conformação nativa em soluções aquosas são muito frequentemente eficazes como crioprotectores de proteínas. Os hidratos de carbono e alguns aminoácidos são exemplos. Arakawa et al. (J. Pharm. Res. 1991, 8, 285-29 1) relataram que esses solutos tendem a ser excluídos da superfície da proteína enquanto em solução aquosa. A consequência termodinâmica desse fenómeno é a estabilização da conformação da proteína nativa. A estabilidade durante a secagem e armazenamento é melhor explicada por ambas as hipóteses da substituição da água e da vitrificação. A primeira refere que os estabilizadores interagem com a proteína do mesmo modo que a água, substituindo a água removida e são responsáveis pelo controlo termodinâmico do processo de secagem. A última estabelece que os estabilizadores são bons formadores de vidro e permanecem amorfos durante e após a secagem de modo que imobilizam mecanicamente as proteínas dentro de uma matriz vítrea. Este é um argumento puramente cinético que se aplica igualmente bem à secagem e à estabilidade de armazenamento. ("Freeze-Drying/Lyophilization of Pharmaceut ical and Biological Products" L. Rey e J. C. May, Mareei Dekker, Inc. Nova Iorque 1999). 4

Por isso, como referência à hipótese acima de estabilização de proteínas secas, pode ser postulado que a vitrificação é uma das principais questões para a estabilidade a longo prazo. A utilização de secagem por vaporização para a dessecação da proteína tem sido menos investigada. Embora possam ser produzidas partículas finas amorfas, este processo requer ar aquecido como uma força de secagem que pode conduzir à degradação térmica da proteína. Além disso, a eficiência baixa, baixo rendimento e os níveis elevados de humidade residual são outras limitações.

Outra técnica relatada para secar proteínas que deve evitar a inactivação é a desidratação do ar à temperatura ambiente. 0 documento US 4891319 de Quadrant Bioresources Ltd (RU) divulga a preservação de várias proteínas e outras macromoléculas a 37-40 °C através de secagem na presença de trealose à pressão atmosférica. O documento US 5874029 divulga um método e um dispositivo para a produção de micro e nanopartícuias, utilizando um fluido supercrítico em gotículas atomizadas de modo a eliminar o solvente e produzir partículas. É utilizado um processo GAS. A utilização da tecnologia do fluido supercrítico também foi relatada como um método útil para obter proteínas como micropartículas finas secas. As principais vantagens desta técnica são a possibilidade de manter a proteína num ambiente aquoso favorável antes de uma precipitação rápida de modo a minimizar a desnaturação e a duração do processo que é mais curta do que a liofilização e menos dispendiosa. Jung et al reviram a construção de partículas utilizando fluidos 5 supercríticos no seu artigo (J. Supercritícal Fluids, 20. (2001) pp. 179-219). S. P. Sellers et ai. (J. Pharm. Sei. , 2001, 90, 785-797) relatam um método de desidratação para a produção de proteína em pó com base na nebulização assistida por C02 supererítico. Esta técnica pode ser assimilada para secagem por vaporização; de facto, é utilizado C02 supercrítico para aumentar a nebulização da solução e não como um anti-solvente para precipitação do soluto. O processo de GAS (recristalização anti-solvente de Gas) para formar micropartícuias de proteína é relatado por Debenedetti (documento US 6063910). Neste caso, a solução de proteína é pulverizada através de um disco de platina perfurado a laser com um diâmetro de 20 μπι e um comprimento de 240 μπι dentro do recipiente de formação da partícula previamente cheio com o fluido supercrítico que é introduzido por uma entrada diferente. Esta técnica foi utilizada para formar partículas de catalase e insulina (0,01% p/v) a partir de soluções de etanol/água (9:1 v/v) utilizando dióxido de carbono como fluido supercrítico. Neste processo, a entrada do fluido supercrítico não é optimizada: a injecção da solução ocorre numa atmosfera quase estática de fluido supercrítico, com baixa turbulência. Hanna M. e York P. (documento W096/00610) propuseram um novo método e um novo dispositivo para obter partículas muito pequenas através de uma técnica de fluido supercrítico especifico denominada SEDS (Dispersão Aumentada da Solução por Solução Supercrítica). O processo baseia-se num novo bocal coaxial: a solução expande-se através de uma entrada capilar, o fluido supercrítico expande-se através de uma via externa coaxial com uma extremidade de forma cónica. A mistura entre fluido supercrítico 6 e a solução ocorre na zona cónica. Também propõem a utilização de um bocal de três entradas: pode ser alimentado um modificador de modo a melhorar a mistura. Aplicaram a tecnologia SEDS para a precipitação de pequenas partículas de compostos solúveis em água, tais como açúcares (Lactose, Maltose, Trealose e Sacarose) e proteínas (R-TEM beta-lactamase). A co-precipitação de proteínas e estabilizadores não é ali mencionada nem exemplificada.

Além disso, a mesma requerente (documento W001/03821) descreve um método de precipitação melhorado utilizando o mesmo dispositivo mas alimentando para o recipiente de formação de partículas um fluido supercrítico e dois solventes imiscíveis. Este método permite a co-precipitação de dois ou mais solutos dissolvidos nos dois solventes imiscíveis. A entrada dos fluidos é formada por um bocal coaxial, em que o contacto entre os dois solventes ocorre pouco antes da sua dispersão pelo anti-solvente supercrítico, evitando os solutos de precipitação dentro do bocal. Contudo, este método permite a formação de co-precipitados homogéneos; é geralmente útil quando devem ser processados dois solutos com diferente polaridade. Além disso, se este for utilizado para uma solução aquosa, o segundo solvente deve ser pelo menos parcialmente solúvel em água, de modo a que permita que a água se disperse no anti-solvente supercrítico. Este passo é necessário para permitir a precipitação do soluto solúvel em água. A co-precipitação de proteínas e estabilizadores não é descrita neste documento. 0 documento US 5770559 divulga a solubilização de substâncias farmacêuticas num solvente orgânico e preparação de pó farmacêutico deste modo. Um polímero biodegradável pode ser 7 co-dissolvido com o agente farmacêutico, seguido por precipitação por GAS.

Walker (documento WOOl/15664) divulga um método para co-formular uma substância activa (de um modo preferido, uma substância farmaceuticamente activa) e um excipiente oligomérico ou polimérico no qual uma quantidade entre 80 e 100% da substância activa está numa forma amorfa em oposição a cristalina. Nestas formulações, as substâncias activas são mais estáveis em comparação com as formas cristalinas quando armazenadas a temperaturas entre os 0 e os 10 °C. Apenas a co-formulação de uma substância farmacêutica activa com um excipiente oligomérico ou polimérico é divulgada e não é mencionada estabilização de proteína neste documento. A estabilização de proteína é por isso alcançada na técnica através de liofilização e secagem por vaporização. A co-precipitação de proteínas com estabilizadores utilizando fluidos supercríticos não foi descrita anteriormente e é um objectivo da presente invenção. A requerente descobriu agora um método de produção de microparticulas de proteína secas estáveis, por co-precipitação com um estabilizador utilizando fluidos supercríticos. Estabilizadores preferidos são hidratos de carbono, aminoácidos, tensioactivos e polímeros. De um modo mais preferido, o estabilizador é um açúcar, de um modo muito preferido, trealose. A co-precipitação permite interacções próximas entre as moléculas de proteína/estabilizador e existe uma proporção óptima peso/peso para cada par proteína/estabilizador. 8

De facto, uma vez que não existe congelação-descongelação não há necessidade de crioprotecção. Além disso, embora a natureza das interacções proteina/estabilizador tenham que ser melhor esclarecidas, no presente caso, o estabilizador desempenha o papel essencial de melhorar a estabilidade em armazenamento mais do que reter a actividade da proteína durante a secagem. De facto, a precipitação por um fluido supercrítico permite por si só a produção de partículas de proteína sem desnaturação durante o processo de secagem.

Divulgação da invenção 0 termo "fluido supercrítico" significa um fluido à pressão crítica ou acima da sua pressão crítica e da sua temperatura crítica. 0 termo "solvente" significa um líquido, que é capaz de formar uma solução com a proteína e o estabilizador. 0 termo "estabilizador" significa um excipiente farmacêutico sólido que é capaz de estabilizar, por exemplo, proteínas, que é solúvel no solvente e que é substancialmente insolúvel no fluido supercrítico. 0 termo "modificador" é uma substância, de um modo preferido um solvente, que aumenta a solubilidade do "solvente" no fluido supercrítico. A presente invenção proporciona co-precipitação de uma proteína ou estabilizador para esse fim, 9 através um processo polipéptido de um para a com um processo anti-solvente de gás compreendendo introduzir num recipiente de formação de particulas um fluido supercritico misturado com um modificador; e uma solução compreendendo a referida proteína ou polipéptido e o referido estabilizador dissolvido num solvente; desse modo, o referido solvente é extraído da solução pelo referido fluido supercritico e ocorre a co-precipitação da substância e do estabilizador, em que o referido estabilizador é trealose, o referido solvente é água, o referido fluido supercritico é dióxido de carbono e o referido modificador é seleccionado de metanol, etanol e isopropanol. A solução é introduzida no recipiente de formação de partículas misturado com um modificador. 0 processo inclui a introdução num recipiente de formação de partículas de uma solução ou suspensão da substância e o estabilizador e um fluido supercritico. No recipiente de formação de partículas, a mistura do fluido supercritico com a solução e a extracção do solvente pelo fluido supercritico ocorre de modo a que os solutos (substância e estabilizador) co-precipitam como partículas finas. 0 modificador é um composto que é solúvel no solvente e no fluido supercritico.

De um modo mais preferido, é utilizado o dispositivo na figura 1. Neste caso, a solução da substância e estabilizador, o fluido supercritico e o modificador são introduzidos separadamente no recipiente de formação de partículas em fluxo co-corrente através do bocal 27. Esse bocal documento W002/68107, que é apresentado nas figuras 2 e 3, proporciona entradas separadas para o fluido supercritico e solução. De facto, este é um disco com um orifício no seu centro e dois ou mais orifícios à mesma distância do centro e com espaços 10 uniformes ao longo de uma circunferência. Todos os orifícios comunicam com o interior do recipiente de formação de partículas. A solução é introduzida no recipiente de formação de partículas através do orifício central, enquanto o fluido supercrítico, puro ou com o modificador, é introduzido através dos orifícios externos. 0 modificador e o fluido supercrítico são misturados antes da introdução no recipiente de formação de partículas. Noutra versão do processo, o modificador é introduzido no recipiente de formação de partículas em parte com a solução e em parte com o fluido supercrítico. A substância é um composto de proteína ou polipéptido de interesse farmacêutico ou de diagnóstico, solúvel no solvente e na mistura solvente/modificador e substancialmente insolúvel no fluido supercrítico. 0 estabilizador é, de um modo preferido, um excipiente farmacêutico que é capaz de estabilizar a substância no produto co-precipitado. 0 estabilizador é solúvel no solvente e na mistura solvente/modificador e substancialmente insolúvel no fluido supercrítico. 0 estabilizador é trealose. Uma mistura de estabilizadores também pode ser empregue. 0 solvente é água. 0 fluido supercrítico é dióxido de carbono. 0 modificador é etanol, metanol ou isopropanol. 11

Descrição dos desenhos A Figura 1 mostra um fluxograma esquemático do dispositivo utilizado para realizar o processo de acordo com esta invenção.

As Figuras 2 e 3 mostram o bocal que é utilizado para realizar o processo de acordo com esta invenção.

As Figuras 4, 5 e 6 mostram as distribuições do tamanho da partícula de pós de lisozima/trealose precipitados com CO2 supercrítico nas proporções p/p de 1:10, 1:2 e 1:0 respectivamente. A figura 7 mostra os termogramas obtidos por calorimetria de varrimento diferencial (DSC) de pós de lisozima/trealose coco-precipitados com CO2 supercrítico vs os respectivos produtos puros.

Descrição Detalhada da Invenção A invenção será ainda descrita com referência particular à substância que seja uma proteína. Descobriu-se que é possível produzir micro-partículas de proteína/estabilizador secas estáveis através da utilização de fluidos supercríticos.

Surpreendentemente, foi observado que a co-precipitação utilizando fluidos supercríticos permite interacções íntimas e particulares entre moléculas de proteína e de estabilizador e que para cada par proteína/estabilizador existe uma proporção de peso óptima. Se a quantidade de estabilizador exceder a 12 quantidade óptima, o excesso não interage directamente com a proteína, mas em vez disso forma partículas de estabilizador puro. Este comportamento foi evidenciado por Microscopia e por análise de Calorimetria de Varrimento Diferencial (DSC). 0 processo para a co-precipitação de uma substância com um estabilizador por um processo de GAS compreendendo a utilização de um fluido supercrítico misturado com um modificador e uma solução num recipiente de formação de partículas pode ser realizado pelo dispositivo relatado na Figura.

Uma vantagem do dispositivo na figura 1 está relacionada com o contacto entre fluido supercrítico e a solução uma vez que este ocorre apenas no recipiente de formação de partículas. Assim, qualquer precipitação do pó não pode ocorrer dentro do bocal e provoca bloqueamento. É importante que o fluido supercrítico actue como um anti-solvente, mas também promove a conversão da solução num spray fino à medida que entra no recipiente de formação de partículas. Isto amplia a interacção solução/anti-solvente e permite uma mistura mais rápida das duas fases e consequentemente uma precipitação rápida da proteína sem qualquer desnaturação. Adicionalmente, o aumento da taxa de transferência de massa entre a solução e o fluido supercrítico permite o funcionamento em condições de temperatura e pressão moderadas, que contribuem para evitar a desnaturação de qualquer proteina possivel. 0 dispositivo da figura 1 inclui um recipiente 22 de formação de partículas. Isto é um recipiente de reacção convencional de um volume apropriado. A temperatura no recipiente é mantida constante através de um revestimento 21 de aquecimento. A pressão no recipiente é controlada por meio de uma microválvula 25 de medição. 13 A temperatura e a pressão no recipiente de formação de partículas são medidas por meio de um termopar 29 e um transdutor 30 de pressão.

As partículas formadas são retidas pelo filtro 23. Este é um cesto de aço inoxidável, cujo fundo é fabricado a partir de um disco de aço inoxidável sinterizado (0,5 pm) . É colocado um segundo filtro 24 (0,5 pm) na saída do recipiente. O fluido supercrítico é retirado do cilindro 3, é condensado pelo refrigerador 4 e bombeado por meio da bomba 8 para o recipiente de formação de partículas através da linha 34. Antes da entrada para o recipiente de formação de partículas, o fluido supercrítico é aquecido até à temperatura desejada por meio de um pré-aquecedor 14 e aquecedor 17. 0 pré-aquecedor 14 também actua como um amortecedor de pulsação. 0 fluido supercrítico é também filtrados por meio do filtro 15 (0,5 pm). A temperatura e a pressão do fluido supercrítico antes da entrada no recipiente de precipitação são medidas por meio de um termopar 29 e o transdutor 30 de pressão, respectivamente. 0 modificador é retirado do tanque 2, é bombeado através da bomba 9 para a linha 34 e é misturado com o fluido supercrítico antes da entrada no recipiente de formação de partículas. O modificador é também filtrado por meio do filtro 12 (0,5 pm). A linha 34 está equipada com uma válvula 16 de alívio. A solução é retirada do tanque 1, é bombeada por meio da bomba 10 para o recipiente de formação de partículas através da linha 36. A solução é também filtrada por meio do filtro 13 (0,5 pm). 14

Noutra versão do processo, o modificador pode ser introduzido no recipiente de formação de partículas em parte com a solução e em parte com o fluido supercrítico. 0 fluido supercrítico, misturado com o modificador e a solução são alimentados para o recipiente de formação de partículas por meio do bocal 27. A jusante do recipiente de precipitação 22, a mistura de fluido supercrítico, o modificador e solvente são filtrados por mio do filtro 24 (0,5 μιη) para reter as partículas que não são eventualmente retidas pelo filtro 23. A mistura de fluido supercrítico, modificador e solvente é despressurizada por meio da microválvula 25 de medição, o solvente supercrítico é separado do modificador e o solvente no separador 26, a sua taxa de fluxo é medida por meio de um medidor 31 de fluxo de massa e é descarregado. 0 bocal que é mostrado na figura 2 e 3 permite a introdução da solução e o fluido supercrítico, puro ou misturado com o modificador, no recipiente de formação de partículas no fluxo co-corrente. As velocidades da solução e do fluido supercrítico na saída do bocal estão relacionadas com a taxa de fluxo de massa e para o diâmetro dos orifícios. Além disso, é preferido que a pressão da energia de ambos, a solução e o fluido supercrítico sejam convertidos em energia cinética com uma perda de energia mínima. O bocal das figuras 2 e 3 foi, de facto, concebido para este objectivo. A peculiaridade deste bocal é que a expansão da solução e do fluido supercrítico ocorre através dos orifícios. Um orifício é caracterizado por uma proporção de comprimento para diâmetro que varia desde 5 a 10. Tem a vantagem sobre o capilar de minimizar a perda de energia de pressão e de 15 converter eficientemente a energia da pressão em energia cinética. 0 bocal possui orifícios com diâmetros que variam desde 0,02 a 0,04 mm e o comprimento varia desde 0,1 a 0,2 mm. Essas dimensões permitem velocidades muito elevadas na saída do orifício para a solução e o fluido supercrítico. 0 bocal pode ser produzido em aço inoxidável ou de outro material apropriado. 0 bocal é um disco com um orifício 39 no seu centro e dois ou mais orifícios 41 perfurados à mesma distância a partir do centro e espaçados uniformemente ao longo da circunferência. Os orifícios comunicam com o interior do recipiente de formação de partículas. A solução é introduzida no recipiente de formação de partículas através do orifício central, o fluido supercrítico, puro ou com o modificador, é introduzido no recipiente de formação de partículas através dos orifícios de saída. A solução 37 passa através de uma passagem de diâmetro D3. A sua extremidade possui uma forma cónica 40. No vértice da extremidade 40 cónica há um orifício 39 perfurado com laser. O comprimento LI do orifício central é 5 a 10 vezes o seu diâmetro Dl. 0 diâmetro Dl pode ser seleccionado de modo a obter qualquer velocidade desejada da solução na saída do orifício. O fluido 38 supercrítico passa através de passagens do diâmetro D4. Cada extremidade 42 de passagem possui uma forma cónica. No vértice da extremidade 42 cónica há um orifício 41 perfurado com laser. O comprimento 21 do orifício é 5 a 10 vezes o seu diâmetro D2. 0 diâmetro D2 pode ser seleccionado de modo a obter qualquer velocidade desejada do fluido supercrítico na saída do orifício. 16 A proporção entre o comprimento (LI ou L2) e o diâmetro (Dl ou D2) dos orifícios 39 e 41 são seleccionados de modo a estabelecer para o mínimo a perda de energia e para obter velocidades mais elevadas convertendo a energia da pressão em energia cinética. A solução emerge do orifício 39 central a velocidade elevada e é degradada em goticulas finas que ficam em contacto com o fluido supercrítico. A dispersão do jacto do líquido da solução é aumentada pelo fluido supercrítico que emerge dos orifícios 41, desde que a velocidade do fluido supercrítico seja muito elevada, da ordem de magnitude da velocidade de som à temperatura e pressão de trabalho. 0 efeito do fluido supercrítico no aumento da dispersão do jacto do líquido da solução é crucial e determina a forma, tamanho e rendimento do produto.

Os orifícios podem ser perfurados com diâmetros até 0,02 mm.

Os bocais que foram utilizados para realizar os testes têm orifícios de diâmetro que varia desde 0,02 a 0, 04 mm. Noutra forma de realização da invenção, são perfurados um ou mais dos orifícios externos de modo a que os seus eixos convirjam para o eixo do orifício central. 0 ângulo formado pelo eixo dos orifícios externos com o eixo do orifício central está entre 1 e 30° .

Um ponto crucial no processo para a formação de micropartículas de proteína secas finas é a mistura da solução com o fluido supercrítico: uma mistura rápida e íntima provoca a precipitação de partículas com um diâmetro pequeno e permite um rendimento mais elevado do pó. 17

De modo a ter uma boa mistura, a solução deve ser dispersa no fluido supercritico na forma de pequenas goticulas, proporcionando assim uma área interfacial elevada para transferência de massa e uma via curta para a difusão de fluido supercritico nas goticulas de solução e desse modo prevenindo o crescimento de partículas de soluto. Além disso uma proporção elevada entre a taxa de fluxo do fluido supercritico e a taxa de fluxo da solução provoca um grande excesso do fluido supercritico para a solução no momento do seu contacto, aumentando a força motriz para a transferência de massa do fluido supercritico na solução e de solvente para o fluido supercritico.

Quando a solubilidade do solvente no fluido supercritico é baixa, a utilização de um modificador permite uma melhor mistura entre solução e fluido supercritico. A proporção da taxa de fluxo do modificador e da taxa de fluxo de solução tem que ser escolhida de modo a ser obtido um aumento elevado na solubilidade do solvente no fluido supercritico. 0 modificador pode ser introduzido com o fluido supercritico ou em parte com o fluido supercritico e em parte com a solução. 0 modo de introdução do modificador influencia grandemente a extracção do solvente e a estrutura de partículas que se formam.

Para a precipitação de pós a partir da solução aquosa utilizando dióxido de carbono como solvente supercritico e etanol como modificador a proporção entre a taxa de fluxo do fluido supercritico e a taxa de fluxo do modificador está, de um modo preferido, no intervalo 4-8, de um modo mais preferido, 7, enquanto a proporção entre a taxa de fluxo do modificador e a 18 taxa de fluxo da solução está, de um modo preferido, no intervalo de 15-25 e de um modo mais preferido, 20.

Como salientado acima, é necessário ter uma boa dispersão da solução no fluido supercrítico de modo a obter gotículas muito pequenas de solução. 0 tamanho das gotículas de solução formada é determinado pelas condições fluidodinâmicas na zona de mistura e pelas propriedades físicas da solução e do solvente supercrítico, tal como viscosidade, tensão de superfície, densidade. Estas propriedades são fortemente influenciadas pela temperatura e pela pressão do fluido supercrítico.

As entradas do fluido supercrítico estão posicionadas em torno da entrada da solução e a uma distância muito curta desta (cerca de 3 mm) : esta configuração permite que a solução seja energizada pelo fluido supercrítico aumentando assim a dispersão da solução para gotículas muito finas, proporcionando a existência de uma superfície interfacial elevada entre as duas fases e extracção rápida do solvente no fluido supercrítico. Estes fenómenos são particularmente eficientes quando a velocidade do fluido supercrítico na saída do orifício atinge ou é superior à velocidade do som provocando a formação de um disco Mach e dispersão da solução como gotículas muita finas (Matson D.W., Fulton J. L., Petersen R. C., Smith R. D., "Rapid expansion of supercritical fluid Solutions: solute formation of powders, thin films, and fibers" Ind. Eng. Chem. Res., 1987 26, 2298-2306). A velocidade do som num fluido está fortemente dependente da pressão e da temperatura: o valor mínimo da velocidade do som para o dióxido de carbono na região supercritica é 208 m/s a 8 MPa (D O o O Para tirar vantagem dos 19 fenómenos mencionados acima é conveniente trabalhar próximo do valor da velocidade do som para o dióxido de carbono na região supercritica, e. g. 208 m/s a 8 MPa e 40 °C.

Para a produção de pós finos a partir das soluções aquosas com o processo de GAS utilizando o dióxido de carbono como solvente supercrítico e etanol como modificador, verificou-se que as condições operacionais óptimas são 8-12 Mpa e 35-50 °C. No dispositivo experimental utilizado para realizar os testes experimentais, a taxa de fluxo de massa de fluido supercrítico foi de 30 g/min, a taxa de fluxo da solução de 0,2 g/min e a taxa de fluxo de massa do modificador 4 g/min, sendo estabelecida a proporção de taxa de fluxo de massa do fluido supercrítico para o modificador a 7 e a proporção da taxa do fluxo de massa do modificador para a solução a 20 e a velocidade do fluido supercrítico na saída do bocal a cerca de 300 m/s. Utilizando este dispositivo realizou-se o processo para produzir micro-partículas secas estáveis de uma substância e um estabilizador por co-precipitação de GAS. São utilizadas proteínas tais como Fosfatase Alcalina e Lisozima como a substância e Trealose como estabilizador. Foram produzidos pós co-precipitados a diferentes proporções de proteína/ estabilizador. O rendimento do pó recolhido foi de 90%. Foi observado que a actividade enzimática retida após o processo era entre 95% e 100%, em comparação com o reagente comercial não processado. As distribuições do tamanho de partícula destes pós mostraram que mais do que 90% das partículas possuem um diâmetro equivalente inferior a 10 pm com uma distribuição de tamanho estreita. Além disso, a caracterização físico-química mostrou que a co-precipitação permite interacções íntimas entre moléculas de proteína e de estabilizador e para cada par de proteína/estabilizador existe uma proporção óptima de peso/peso. 20

Finalmente, os estudos de estabilidade mostraram que as partículas de Fosfatase Alcalina/trealose co-precipitadas eram mais estáveis do que o produto liofilizado equivalente.

Processo Experimental

0 fluido supercrítico é alimentado para o recipiente de precipitação por meio de uma bomba 8, que é utilizada para estabelecer a taxa de fluxo do fluido supercrítico. A temperatura do fluido supercrítico na linha 35 é estabelecida através do aquecedor 17 para um valor mais elevado do que a temperatura dentro do recipiente de formação de partículas, para ter em consideração o abaixamento de temperatura devido à expansão através dos orifícios bocais. 0 modificador é então adicionado a uma taxa de fluxo predeterminada ao fluido supercrítico através de uma bomba 9. A solução de proteína e estabilizador é bombeada por meio da bomba 10 para o recipiente de formação de partículas quando são obtidas as condições de estado estável.

Depois disso, uma determinada quantidade de solução é alimentada para o recipiente de formação de partículas, as bombas 9 e 10 são paradas e apenas o fluido supercrítico é alimentado para o recipiente de formação de partículas desde que o pó precipitado esteja isento de solvente e modificador. 0 recipiente de formação de partículas é despressurizado, o pó é recuperado e selado em frascos de 10 mL sob azoto seco. A estabilidade das proteínas co-precipitadas foi testada por frascos de armazenamento nas seguintes condições: 25 °C - 60% 21 RH; 30 °C - 65% RH; 40 °C - 75% RH. Cada amostra foi analisada para a actividade biológica a t= 0, 1, 2, 3 e 6 meses. Em comparação, foi realizado um estudo paralelo em proteínas precipitadas por fluidos supercríticos como tal, em produtos liofilizados análogos e no produto comercial não processado, todos armazenados sob azoto seco.

Exemplo 1

Preparação de partículas co-precipitadas de fosfatase alcalina (ALP)/trealose

Neste exemplo, o método da invenção é utilizado para co-precipitar misturas de fosfatase alcalina (ALP) e trealose.

Foram utilizadas soluções contendo ALP (SIGMA Chemicals) à concentração de 0,2% p/p e trealose (SIGMA Chemicals) a uma concentração no intervalo de 0-2% p/p em água desionizada.

As proporções de ALP/Trealose dos pós obtidos foram como se segue: 1:10, 1:2 e 1:0. Foram utilizados dióxido de carbono como fluido supercrítico e etanol como modificador. A solução foi alimentada para o recipiente 22 de formação de partículas por meio da bomba 10 a uma taxa de fluxo de 0,2 g/min. O dióxido de carbono supercrítico foi alimentado por meio da bomba 8 a uma taxa de fluxo de 30 g/min, foi alimentado etanol por meio da bomba 9 para a linha 34 a uma taxa de fluxo de 4 g/min e foi misturado com dióxido de carbono supercrítico antes da entrada no recipiente de formação de partículas. 22 0 fluido supercrítico foi injectado no recipiente de formação de partículas através de quatro orifícios externos do bocal, cada um com um diâmetro de 0,04 mm. A solução foi injectada no recipiente de formação de partículas através do orifício central do bocal, possuindo um diâmetro de 0,04 mm. O comprimento de todos os orifícios foi de 0,2 mm. A temperatura e a pressão dentro do recipiente de formação de partículas foram mantidas a uma temperatura constante de 40 °C, por meio do revestimento 21 de aquecimento, e 100±1 bar por meio da microválvula 25 de medição da regulação, respectivamente. As partículas precipitadas foram recolhidas no filtro 23 no fundo do recipiente de formação de partículas, enquanto o fluido supercrítico, o modificador e a água foram recolhidos no cilindro 26 à pressão atmosférica. O processo foi realizado até ter sido obtida uma quantidade suficiente de pó. Após as alimentações de solução e modificador terem sido paradas e apenas o dióxido de carbono puro ter sido alimentado no recipiente de formação de partículas de modo a extrair qualquer vestígio de solvente e modificador dos pós precipitados. Tipicamente, o recipiente de formação de partículas foi lavado com dois volumes de dióxido de carbono de modo a obter pós secos.

Após a despressurização, o recipiente de formação de partículas foi aberto e os pós foram recuperados e armazenados em frascos de 10 mL em azoto seco. O rendimento do pó recolhido foi de 90%. 23 A actividade enzimática residual de ALP estava dentro de 95% e 100%, em comparação com o reagente comercial não processado. A análise do pó em microscopia óptica mostra que num teor de trealose elevado, como a proporção de ALP/trealose de 1:10 o pó é formado por duas populações de partículas diferentes: uma, que é vastamente a mais frequente, é formada por partículas em forma de agulha, enquanto a outra é formada por partículas de forma redonda. As partículas com forma de agulha são bastante semelhantes aquelas que são obtidas por trealose como é a precipitação por CO2 supercrítico. Os pós com um teor mais baixo de trealose apresentam apenas a população de partículas de forma redonda. Assim, a trealose pode ser co-precipitada com ALP por CO2 supercrítico pra produzir um tipo de partículas apenas nos teores de trealose mais baixos (proporções de proteína/trealose de 1:2). Foi encontrado um comportamento semelhante para os co-precipitados de lisozima/trealose (ver exemplo 2). Foram preparados produtos análogos por liofilização. Neste caso, a actividade enzimática residual de ALP encontrada estava dentro do intervalo 95% e 104%, em comparação com o reagente comercial não processado.

Foram preparados frascos semelhantes contendo ALP comercial não processado ou produtos liofilizados análogos, todos sob azoto seco.

Estudo da estabilidade

Foram colocados vários frascos de cada categoria em cada uma das seguintes condições: 25 °C - 60% RH; 30 °C - 65% RH; 40 °C -75% RH durante 6 meses. A t = 0, 1, 2, 3, 6 meses, os conteúdos dos frascos foram submetidos a ensaio para a actividade de ALP. 24

Os resultados dos estudos de estabilidade estão resumidos na Tabela 1. A ALP pura precipitada por C02 supercrítico (amostra F6) apresenta uma quebra da actividade enzimática em todas as condições. A actividade residual após 6 meses a 40 °C - 75% RH (condições muito extremas), é de 57% do valor t=0.

Pelo contrário, não se encontrou nenhuma perda de actividade significativa em todas as condições até aos 6 meses para ALP/trealose co-precipitados por C02 supercrítico na proporção de 1:10 (amostra FT8).

Aos 40 °C - 75% RH, a ALP liofilizada pura (amostra F8) e o produto comercial da SIGMA apresenta quebras semelhantes e apenas 43% e 42% da actividade enzimática inicial foi mantida após 6 meses. Nas outras condições, pelo contrário, os produtos da SIGMA apresentam uma perda de actividade mais lenta do que a ALP liofilizada pura. De facto, após 6 meses foram detectadas as seguintes actividades enzimáticas residuais: 95% vs 83% a 25 °C - 60% RH e 86% vs 76% a 30 °C - 65% RH.

Finalmente, o pó liofilizado que tinha a proporção ALP/trealose de 1:10 (amostra FT10) apresentou uma perda de actividade inicial rápida, depois uma mais lenta até aos seis meses, que parecem ser independentes das condições de armazenamento. De facto, as actividades enzimáticas retidas a 250 °C - 60% RH, 30 °C - 65% RH e 40 °C - 75% são de 90%, 88% e 90%, respectivamente, do valor inicial. 25

Exemplo 2

Preparação de partículas co-precipitadas de lisozima/trealose

Neste exemplo, o método da invenção é utilizado para preparar pós co-precipitados utilizando lisozima e trealose.

Foram utilizadas as soluções contendo lisozima (SIGMA Chemicals) a uma concentração dentro do intervalo 0,2 - 1% p/p e trealose (SIGMA Chemicals) a uma concentração dentro do intervalo 0-2% p/p em água desionizada. As proporções de lisozima/trealose dos pós obtidos foram como se segue: 1:10, 1:5, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1 e 1:0 (Tabela 2).

Foi utilizado dióxido de carbono como fluido supercrítico e etanol como modificador. A solução aquosa contendo a enzima e o estabilizador foi alimentada para o recipiente 22 de formação de partículas por meio da bomba 10 a uma taxa de fluxo de 0,2 g/min. 0 dióxido de carbono supercrítico foi alimentado através de uma bomba 8 a uma taxa de fluxo de 30 g/min, o etanol foi alimentado através de uma bomba 9 para a linha 34 a uma taxa de fluxo de 4 g/min e foi misturado com dióxido de carbono supercrítico antes de entrar no recipiente de formação de partículas. O fluido supercrítico foi injectado no recipiente de formação de partículas através dos quatro orifícios externos do bocal, cada um com um diâmetro de 0,04 mm. A solução foi injectada no recipiente de formação de partículas através do 26 orifício central do bocal, possuindo um diâmetro de 0,04 mm. 0 comprimento de todos os orifícios é de 0,2 mm. A temperatura e a pressão dentro do recipiente de formação de partículas foram mantidas a uma temperatura constante de 40 °C, por meio do revestimento 21 de aquecimento e a 100±1 bar por meio da microválvula 25 de regulação da medição, respectivamente.

As partículas precipitadas foram recolhidas no filtro 23 no fundo do recipiente de formação de partículas, enquanto o fluido supercrítico, modificador, água e o soluto eventualmente não precipitado foram recolhidos no cilindro 26 à pressão atmosférica.

Após isto, foi alimentada uma determinada quantidade de soluto no recipiente de formação de partículas, as bombas 9 e 10 foram paradas e foi alimentado apenas fluido supercrítico no recipiente de formação de partículas de modo a secar os pós precipitados: tipicamente, requer cerca de duas vezes o volume do frasco de formação de partículas para obter pós secos.

Neste momento, o recipiente de formação de partículas foi despressurizado, aberto e os pós foram recolhidos. 0 rendimento dos pós recuperados foi de 90%. A actividade enzimática residual encontrada da lisozima estava no intervalo de 96% e 100%, em comparação com o reagente comercial não processado. 27 A Tabela 2 relata, para cada amostra, a proporção de lisozima/trealose, a actividade enzimática retida, o teor de proteína que está relacionado com a homogeneidade da precipitação, o número de populações de partículas e os tamanhos das partículas. Como pode ser observado, para todas as amostras, a actividade enzimática e o teor de proteína estão muito próximos dos valores teóricos. Assim, as condições experimentais que foram utilizadas permitiram uma precipitação semelhante para a proteína e o açúcar e garantiram uma recuperação da actividade biológica quase completa.

As distribuições do tamanho de partícula dos pós calculados pela análise de imagem de micrografias SEM mostraram que para todos os pós obtidos por precipitação com CO2 supercrítico, mais do que 90% das partículas possuem um diâmetro equivalente inferior a 10 pm com uma estreita distribuição de tamanho. As Figuras 4, 5, 6 mostram as distribuições do tamanho das partículas do co-precipitado com CO2 supercrítico com proporções de lisozima/trealose de 1:10, 1:2 e 1:0, respectivamente. Os outros co-precipitados produziram distribuições semelhantes. Além disso, a observação dos pós através de análise por microscopia óptica demonstrou que em teores de trealose elevados como para as duas proporções de lisozima/trealose de 1:10 e 1:5, os pós eram compostos por duas populações de partículas: uma, que foi amplamente a mais frequente, era formada por partículas em forma de agulha, a outra era formada por partículas de forma redonda. As partículas em forma de agulha eram bastante semelhantes às obtidas por trealose como as precipitadas por C02 supercrítico. Pelo contrário, no teor de trealose mais baixo (proporção de lisozima/trealose de 1:2) os pós apresentaram apenas uma população de partículas de forma redonda. Assim, a lisozima pode ser co-precipitada com trealose por CO2 28 supercrítico para formar apenas um tipo de partícula no teor de trealose mais baixo (proporções elevadas de proteína/trealose). Deste modo, existe um valor óptimo para a proporção de proteína/trealose que garante a melhor interacção entre os dois tipos de moléculas. Este comportamento foi confirmado por análise de DSC. A Figura 7 mostra termogramas de DSC de vários pós de lisozima co-precipitados. Como referência, a lisozima precipitada pura e a trealose são também relatadas. Como pode ser observado, a um teor de trealose mais elevado (proporção 1:5), as amostras contêm trealose amorfa que recupera a pequena parte cristalina (pico exotérmico a 197 °C) e depois funde a 214 °C do mesmo modo que a própria trealose precipitada. 0 comportamento térmico das amostras com teor de trealose mais baixo é bastante diferente. As amostras com proporções de 1:2 a 4:1 apresentam termogramas semelhantes ao da lisozima, tal como é. A diferença mais relevante é o desvio em direcção a temperaturas mais baixas da transição característica da lisozima a T = 204 °C. Quanto mais elevado é o teor em trealose mais baixa é a temperatura de transição. Por isso, existe uma forte evidência de que a co-precipitação por fluidos supercríticos permite uma interacção íntima entre a proteína e a trealose. De facto, até uma quantidade definida de açúcar (proporção de 1:2) foi obtida uma fase sólida homogénea. Esta proporção é capaz de proporcionar a melhor interacção proteína/açúcar e a melhor estabilidade da proteína a longo termo. 29 TABELA 1

Amostra/ método de secagem Proporção ALP/ Trealose Condições de armazenamento Actividade enzimática a 1 mês (% de t=0) Actividade enzimática a 2 meses (% de t=0) Actividade enzimática a 3 meses (% de t=0) Actividade enzimática a 6 meses (% de t=0) Liofili- 1:0 - 20 °C — — - 96 zação de 25 °C/60% RH 101 100 101 95 ALP Sigma 30 °C/70% RH 103 103 94 86 40 °C/75% RH 94 85 75 42 ALP F6 1: 0 - 20 °C — — — - SCF 25 °C/60% RH 91 72 69 67 30 °C/70% RH 101 71 59 59 40 °C/75% RH 64 69 58 57 APL F8 1 : 0 - 20 °C — — — — Liofili- 25 °C/60% RH 88 89 89 83 zação 30 °C/70% RH 83 87 87 76 40 °C/75% RH 75 75 62 43 ALP Ff8 1:10 - 20 °C — — — 101 SCF 25 °C/60% RH 111 99 113 99 30 °C/70% RH 104 97 102 99 40 °C/75% RH 113 98 101 99 APL FT10 1:10 - 20 °C — — — 105 Liofili- 25 °C/60% RH 95 95 93 90 zação 30 °C/70% RH 94 96 92 88 40 °C/75% RH 94 93 92 90 TABELA 2 AMOSTRA Proporção Lisozima/Trealose Actividade Enz. (mg Enz.Img Prot.) Teor de proteína (% em nominal) N2. de populações de partículas Tamanho das Partículas (% < 10 jim) L3 1:0 0,96 102,6 1 99 LT2 1: 10 1,04 104,3 2 — LT3 1: 1 0,96 100,8 1 98 LT6 1:5 0,96 104, 0 2 92 LT8 4:1 1,01 103,2 1 97 LT9 1: 2 0,98 104, 0 1 93 LT10 2 : 1 0,97 103,9 1 97

Lisboa, 17 de Novembro de 2011 30

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a co-precipitação de uma proteína ou polipéptido com um estabilizador para este, por um processo de anti-solvente de gás, compreendendo introduzir num recipiente de formação de partículas, um fluido supercrítico misturado com um modificador; e uma solução compreendendo a referida proteína ou polipéptido e o referido estabilizador dissolvido num solvente; sendo o referido solvente extraído da solução pelo referido fluido supercrítico e ocorre co-precipitação da substância e estabilizador, em que o referido estabilizador é trealose, o referido solvente é água, o referido fluido supercrítico é dióxido de carbono e o referido modificador é seleccionado de metanol, etanol e isopropanol.
2. 2. Processo como reivindicado na reivindicação 1, em que a substância é uma proteína.
3. 3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 em que a referida solução e o referido fluido supercrítico são introduzidos no referido recipiente de formação de partículas através de bocais de entrada separados.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que o referido fluido supercrítico é introduzido no referido recipiente de formação de partículas através de uma pluralidade bocais de entrada.
5. 5. Processo como reivindicado na reivindicação 4, em que os referidos bocais estão presentes num disco, o bocal de 1 entrada da solução está no centro do referido disco rodeado por uma pluralidade de bocais de entrada do fluido supercritico espaçados uniformemente ao longo da sua circunferência.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 1 a 5, em que a solução é introduzida no recipiente de formação de partículas misturada com um modificador.
7. 7. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, em que o modificador é etanol.
8. 8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a proporção de proteína ou polipéptido para estabilizador na solução é de 1:1 para 10 p/p.
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que a proporção de proteína ou polipéptido para estabilizador na solução é de 1:2 p/p.
10. 10. Processo como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o fluido supercritico entra no recipiente de formação de partículas à velocidade do som ou superior.
11. 11. Processo como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que é utilizado um modificador e a proporção entre a taxa de fluxo do fluido supercritico e a taxa de fluxo do modificador está no intervalo 4:1 até 8:1 p/p· 2
12. 12. Processo como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que é utilizado um modificador e a proporção entre a taxa de fluxo de modificador e a taxa de fluxo da solução está no intervalo 15:1 até 25:1 p/p. Lisboa, 17 de Novembro de 2011 3