EA003604B1 - КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ ПИРРОЛО [2,3d] ПИРИМИДИНОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ - Google Patents

Abstract

Описаны новые деазапурины, которые могут быть использованы для лечения заболеваний, индуцированных аденозиновыми рецепторами.

Description

Предпосылки создания изобретения

Аденозин представляет собой повсеместно распространенный модулятор многих физиологических процессов, особенно в сердечнососудистой и нервной системах. Действие аденозина, очевидно, опосредовано специфическими рецепторными белками клеточной поверхности. Аденозиновые модуляторы различаются по своим физиологическим функциям, включая такие функции, как индуцирование седативного эффекта, расширение сосудов, снижение частоты сердечных сокращений, ингибирование агрегации тромбоцитов, стимуляцию глюконеогенеза и ингибирование липолиза. Кроме того, было показано, что, помимо своего воздействия на аденилатциклазу, аденозин открывает калиевые каналы, снижает поток через кальциевые каналы и ингибирует или стимулирует метаболизм фосфоинозитидина под действием рецепторопосредованных механизмов (См., например, С.Е.Ми11ег & В.8!сш Акспоктс РсссрЮг АпΙαβοηίδΙδ: 8!гис!игс5 апк Ро!сп!1а1 Тйсгарсикс Аррйсакощ. Сиггсп! Рйагтасси!1са1 Ос^щп. 2:501 (1996), и С.Е.Ми11сг А₁-Акспо81пс РсссрЮг АпГадопщй: Ехр.Орш.Тйсг.Ра!сп!8 7(5):419 (1997)).

Аденозиновые рецепторы принадлежат к суперсемейству пуриновых рецепторов, которые, в настоящее время, подразделяются на рецепторы Р! (аденозин) и рецепторы Р₂ (АТР, АЭР и другие нуклеотиды). До настоящего времени, от различных видов, включая человека, было клонировано четыре подтипа рецепторов для нуклеозидаденозина. Рецепторы двух подтипов (А1 и А2а) обладают сродством к аденозину в наномолярном диапазоне, а рецепторы двух других известных подтипов А_2Ь и А₃ являются низкоафинными рецепторами, обладающими аффинностью по отношению к аденозину в низкомикромолярном диапазоне. Активация аденозиновых рецепторов А₁ и А₃ может приводить к ингибированию аденилатциклазной активности, тогда как активация А_2а и А_2Ь приводит к стимуляции аденилатциклазы.

Для лечения заболевания познавательной способности, почечной недостаточности и сердечной аритмии было получено несколько антагонистов рецепторов А₁. Было высказано предположение, что антагонисты рецепторов А_2а могут быть использованы для лечения пациентов, страдающих синдромом Паркинсона (болезнью Паркинсона). В частности, вероятно, что при локальной доставке, антагонисты аденозиновых рецепторов могут оказаться эффективными для лечения аллергических воспалительных реакций и астмы. Имеющиеся данные (например, Иусс & Мс1/дсг ΩΝΛ аШБсщс Тйсгару £ог Аййта ш ап Ашта1 Мокс1 №Ш.1гс (1997) 385:721-5) указывают, что в данных патофизиологических условиях, антагонисты А! могут блокировать сокращение гладкой мышцы нижерасположенного эпителия дыхательных путей, тогда как антагонисты рецепторов А_2Ь или А₃ могут блокировать дегрануляцию тучных клеток, снижая уровень высвобождения гистамина и других медиаторов воспаления. Было обнаружено, что рецепторы А_2Ь присутствуют на протяжении всего желудочно-кишечного тракта, особенно в эпителии толстого и тонкого кишечника. Было сделано предположение, что рецепторы А_2Ь опосредуют сАМР-ответ (8!гойтс1сг с! а1., 1Вю1.Сйст., (1995) 270:2387-94).

Было показано, что аденозиновые рецепторы присутствуют на сетчатке глаза многих видов млекопитающих, включая, коров, свиней, обезьян, крыс, морских свинок, мышей, кроликов и человека (См., например, В1ахуп5к| с! а1. , Э|5сгс1 0181г1Ьи(1оп о£ Акспоыпс РсссрЮге ш МаттаНап РсИпа, 1оита1 о£ №игоскст18!гу, уо1итс 54, радсз 648-655 (1990); Аоокз с! а1., Скагас!сгща!юп о£ Акспоыпс А1-К.ссср!ог Вткшд 8йс т Воутс Вс0па1 МстЬгапсз, Ехрсптсп!а1 Еус Всксагсй, уо1итс 53, радсз 325-331 (1991); и Вгааз с! а1., Епкодспоиз акспоыпс апк акспоыпс гссср!ог8 1осаНхск !о дапдйоп сс1к о£ 111с гс(1па, Ргоссскшдк о£ 1йс №10опа1 Асаксту о£ 8с1спсс, уо1итс 84, радсз 3906-3910 (1987)). Недавно, в работе АПНапъ сообщалось о наблюдении сайтов транспорта аденозина в культивированной клеточной линии сетчатки глаза человека (\УННапъ с! а1., №с1сощкс Тгапкрой Зйск ш а Си1Шгск Нитап Вскпа1 Сс11 Ьтс ЕйаЫЫюк Ьу ЗУ40 Т Апкдсп Сспс, Сиггсп! Еус Всксагск, уо1итс 13, радсз 109-118 (1994)).

Ранее было высказано предположение, что соединения, которые регулируют поглощение аденозина, могут быть использованы в качестве потенциальных терапевтических агентов для лечения поражения сетчатки глаза и диска зрительного нерва. В патенте США № 5780450, Зкакс, обсуждается использование ингибиторов поглощения аденозина для лечения глазных болезней. В патенте Зкакс не описано использование специфических ингибиторов рецептора А3. Полное описание патента США № 5780450 вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Необходимость в получении других антагонистов аденозиновых рецепторов в качестве фармакологических средств остается актуальной, и особый интерес представляют лекарственные средства для лечения вышеупомянутых болезней и/или патологических состояний.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение основано, по крайней мере, частично, на обнаружении того факта, что Ν-6-замещенные 7-деазапурины, описанные ниже, могут быть использованы для лечения состояний, отвечающих на Ν-6замещенный 7-деазапурин. Примерами таких состояний являются состояния, ассоциированные с повышенной активностью аденозиновых рецепторов, например, бронхит, желудочнокишечные заболевания или астма. Эти состояния отличаются тем, что в них активация адено зинового рецептора может приводить к ингибированию или стимуляции активности аденозинциклазы. Композиции и способы настоящего изобретения включают энантиомерно или диастереомерно чистые Ν-6-замещенные 7-деазапурины. Предпочтительными Ν-6-замещенными 7деазапуринами являются такие Ν-6-замещенные 7-деазапурины, которые имеют ацетамидную, карбоксамидную, замещенную циклогексильную, например, циклогексанольную или карбамидную группу, связанную с Ν-6-азотом посредством алкиленовой цепи.

Настоящее изобретение относится к способам модуляции аденозинового(ых) рецептора(ов) у млекопитающего путем введения этому млекопитающему терапевтически эффективного количества Ν-6-замещенного 7-деазапурина, так, чтобы это введение приводило к модуляции активности аденозинового рецептора. Подходящими аденозиновыми рецепторами являются рецепторы семейств А_ь А₂ или А₃. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, Ν-6-замещенный 7-деазапурин представляет собой антагонист аденозинового рецептора.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам лечения заболеваний, отвечающих на Ν-6-замещенный 7-деазапурин, например, астмы, бронхита, аллергического ринита, хронической обструктивной болезни легких, почечных болезней, желудочно-кишечных заболеваний и глазных болезней у млекопитающих путем введения этому млекопитающему терапевтически эффективного количества Ν-6замещенного 7-деазапурина, так, чтобы это введение приводило к излечению указанного млекопитающего. Подходящими Ν-6-замещенными 7-деазапуринами являются соединения, имеющие общую формулу I

и их фармацевтически приемлемые соли. Каждый из К_| и К₂ независимо представляет собой атом водорода или замещенную или незамещенную алкильную, арильную или алкиларильную группу, либо, взятые вместе, они образуют замещенное или незамещенное гетероциклическое кольцо. К₃ представляет собой атом водорода или замещенную или незамещенную алкильную, арильную или алкиларильную группу. В₄ представляет собой атом водорода или замещенную или незамещенную алкильную, арильную или алкиларильную группу. Каждый из В₅ и К₆ независимо представляет собой атом галогена, например, атом хлора, фтора или брома, атом водорода или замещенную или незамещенную алкильную, арильную или алкиларильную группу; либо, В₄ и В₅ или В₅ и В₆, взятые вместе, образуют замещенное или незамещен ное гетероциклическое или карбоциклическое кольцо.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения каждый из Κ и К₂ может независимо представлять собой замещенные или незамещенные циклоалкильные или гетероарилалкильные группы.

В другом варианте осуществления изобретения К₃ представляет собой атом водорода или замещенную или незамещенную гетероарильную группу. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения, каждый из Β₄, В₅ и В₆ может независимо представлять собой гетероарильные группы. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, В! представляет собой атом водорода, В₂ представляет собой циклогексанол, например, транс-циклогексанол, В₃ представляет собой фенил, В₄ представляет собой атом водорода, В₅ представляет собой метильную группу и К₆ представляет собой метильную группу. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения, Κι представляет собой атом водорода, В₂ представляет собой

В₃ представляет собой фенил, В₄ представляет собой атом водорода, а В₅ и В₆ представляют собой метильную группу.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям для лечения заболеваний у млекопитающих, отвечающих на Ν-6-замещенный 7-деазапурин, например, астмы, бронхита, аллергического ринита, хронической обструктивной болезни легких, почечных болезней, желудочно-кишечных заболеваний и глазных болезней. Эта фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество Ν-6-замещенного 7-деазапурина и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям для лечения заболеваний, отвечающих на Ν-6-замещенный 7-деазапурин, у млекопитающих. Эта упакованная фармацевтическая композиция включает контейнер, содержащий терапевтически эффективное количество, по крайней мере, одного Ν-

6-замещенного 7-деазапурина, и инструкции по применению указанного Ν-6-замещенного 7деазапурина, используемого для лечения состояния, отвечающего на Ν-6-замещенный 7деазапурин, у млекопитающего.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к соединениям формулы I, где

К_| представляет собой водород;

В₂ представляет собой замещенный или незамещенный циклоалкил, замещенный или незамещенный алкил, либо Κι и В₂, взятые вместе, образуют замещенное или незамещенное гетероциклическое кольцо;

Я₃ представляет собой замещенный или незамещенный арил;

К₄ представляет собой водород; и каждый из К₅ и К₆ независимо представляет собой водород или алкил, и их фармацевтически приемлемые соли. Деазапурины данного варианта изобретения могут быть преимущественно селективными антагонистами рецептора А₃. Эти соединения могут быть использованы для различных терапевтических целей, таких как, например, лечение астмы, почечной недостаточности, ассоциированной с сердечной недостаточностью, и глаукомы. В особенно предпочтительном варианте настоящего изобретения, деазапурин представляет собой водорастворимое пролекарство, которое в результате метаболизма ίη νίνο, например, благодаря гидролизу, катализируемому эстеразой, способно превращаться в активное лекарственное вещество.

В еще одном варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к способу ингибирования активности аденозинового рецептора (например, А₃) в клетке, предусматривающему контактирование этой клетки с Ν-6замещенным 7-деазапурином (например, предпочтительно, с антагонистом аденозинового рецептора).

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения поражения глаз у животного (например, у человека) путем введения указанному животному эффективного количества Ν-6-замещенного 7-деазапурина формулы I. Предпочтительным Ν-6замещенным 7-деазапурином является антагонист аденозиновых рецепторов А₃ в клетках данного животного. Указанным поражением глаз является поражение сетчатки глаза или диска зрительного нерва, и это поражение может быть острым или хроническим. Указанное поражение может возникать в результате глаукомы, отека, ишемии, гипоксии или травмы.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей Ν-

6-замещенный 7-деазапурин формулы I. Указанным фармацевтическим препаратом, предпочтительно, является офтальмическая готовая препаративная форма (например, готовая препаративная форма для инъекции в окологлазную, ретробульбарную или внутриглазную область, готовая препаративная форма для системного введения или хирургический раствор для промывания).

В другом варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к деазапурину, имеющему формулу II

где Х представляет собой N или СК₆;

каждый из К и К₂ независимо представляет собой водород или замещенный или незамещенный алкокси, аминоалкил, алкил, арил или алкиларил, либо, взятые вместе, они образуют замещенное или незамещенное гетероциклическое кольцо, при условии, что К! и К₂ оба не являются водородом;

К₃ представляет собой замещенный или незамещенный алкил, арилалкил или арил;

К₄ представляет собой водород или замещенный или незамещенный С1-С₆алкил;

Ь представляет собой водород, замещенный или незамещенный алкил, либо К₄ и Ь, взятые вместе, образуют замещенное или незамещенное гетероциклическое или карбоциклическое кольцо;

К₆ представляет собой водород, замещенный или незамещенный алкил или галоген;

представляет собой СН₂, О, 8 или ΝΚ₇, где К₇ представляет собой водород или замещенный или незамещенный С₁-С₆алкил и представляет собой незамещенный или замещенный алкил, циклоалкил, арил, арилалкил, биарил, гетероарил, замещенный карбонил, замещенный тиокарбонил или замещенный сульфонил;

при условии, что если К₃ представляет собой пирролидино, то К₄ не является метилом. Настоящее изобретение также относится к фармацевтически приемлемым солям и пролекарствам соединений настоящего изобретения.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, Х представляет собой С.'К₆. а О представляет собой СН₂, О, 8 или ΝΗ в формуле II, где К₆ определен выше.

В другом варианте формулы II, Х представляет собой Ν.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу ингибирования активности аденозинового рецептора (например, аденозинового рецептора АД в клетке путем контактирования этой клетки с соединением настоящего изобретения. Предпочтительным соединением является антагонист данного рецептора.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения желудочно-кишечных заболеваний (например, диареи) или респираторного заболевания (например, аллергического ринита, хронической обструктивной болезни легких) у животного путем введения этому животному эффективного количества соединения формулы II (например, антагониста рецептора АД. Предпочтительным животным является человек.

Подробное описание изобретения

Отличительные признаки и другие характерные особенности настоящего изобретения будут подробно изложены в нижеследующем описании и в формуле изобретения. При этом, следует отметить, что конкретные варианты настоящего изобретения представлены лишь в иллюстративных целях и не ограничивают данное изобретение. Принципиальные отличия на стоящего изобретения могут быть использованы в различных вариантах его осуществления, не выходящих за рамки объема изобретения.

Настоящее изобретение относится к способам лечения состояния, отвечающего на Ν-6замещенный 7-деазапурин, у млекопитающего. Эти способы предусматривают введение этому млекопитающему терапевтически эффективного количества Ν-6-замещенного 7-деазапурина, описанного ниже, так, чтобы это введение приводило к излечению указанного состояния у млекопитающего, отвечающего на Ν-6-замещенный 7-деазапурин.

Выражение состояние, отвечающее на действие Ν-6-замещенного 7-деазапурина означает болезнь или болезненное состояние, характеризующееся тем, что оно поддается лечению Ν-6-замещенным 7-деазапурином настоящего изобретения, описанным ниже, например, лечению, которое приводит к значительному ослаблению, по крайней мере, одного симптома или болезненного эффекта этого состояния, достигаемому с использованием Ν-6-замещенного

7-деазапурина настоящего изобретения. Обычно такие состояния ассоциируются с увеличением уровня аденозина у хозяина, которое часто приводит к возникновению физиологических симптомов у данного хозяина, включая, но не ограничиваясь ими, высвобождение токсинов, воспаление, кому, удерживание воды в организме, увеличение или потерю веса, панкреатит, энфизему, ревматоидный артрит, остеоартрит, множественную недостаточность органов, респираторный дистресс-синдром у детей и взрослых, аллергический ринит, хроническую обструктивную болезнь легких, поражения глаз, желудочно-кишечные заболевания, стимуляцию опухолей кожи, иммунодефицит и астму. (См., например, С.Е.Ми11ег & В.81сш Абспоктс Кссср1ог Ап1адош515: 81гис1игс5 апб Ро1спйа1 ТйсгарсиНс Аррйсайопк, СиггсШ РйагтассиИса1 Эскщп. 2:501 (1996) и С.Е. Ми11сг Аг-Абспокшс Кссср1ог Ап1адош515: Ехр.Орт.Тйсг.Ра1сп15 7(5):419 (1997) и I. ЕсокЙ51оу, К. Ро1ока, 8.Т. Но1да1с & 1.В1аддюш Абспокшс А_2В гссср1огк: а поус1 Шсгарсийс 1агдс( ίη акШта? Т1Р8 19; 148 (1998)). Патологическими эффектами, часто ассоциирующимися с указанными симптомами, являются, но не ограничиваются ими, повышение температуры, учащенное дыхание, тошнота, диарея, слабость, головная боль и даже смерть. В одном из вариантов изобретения, состоянием, отвечающим на воздействие Ν-6-замещенного

7-деазапурина, является такие болезненные состояния, которые опосредуются стимуляцией аденозиновых рецепторов, например, А1, А2а, А₂ь, А₃ и т.п., в результате чего происходит модуляция концентраций кальция в клетках и/или активация РЬС (фосфолипазы С). В предпочтительном варианте осуществления изобретения, состояние, отвечающее на Ν-6-замещенный 7деазапурин, ассоциируется с аденозиновым(и) рецептором(ами), например, в том случае, когда Ν-6-замещенный 7-деазапурин действует как антагонист. Примерами подходящих положительно реагирующих состояний, которые могут излечиваться соединениями настоящего изобретения, являются состояния, например, ассоциированные с подтипами аденозиновых рецепторов, опосредующими биологические эффекты, например, эффекты центральной нервной системы (ЦНС), сердечно-сосудистые эффекты, почечные эффекты, респираторные эффекты, иммунологические эффекты, желудочнокишечные эффекты и метаболические эффекты. Относительное количество аденозина у индивидуума может быть ассоциировано с нижеперечисленными эффектами, так, что повышенные уровни аденозина могут стимулировать определенный эффект, например, нежелательный физиологический ответ, например, астматическую атаку.

ЦНС-эффектами являются снижение уровня высвобождения трансмиттера (А1), седативный эффект (А1), пониженная двигательная активность (А_2а), противосудорожная активность, стимуляция хеморецепторов (А₂) и гипералгезия. Терапевтическими применениями соединений настоящего изобретения является лечение деменции и болезни Альцгеймера и улучшение памяти.

Сердечно-сосудистыми эффектами являются расширение сосудов (А_2а), (А_2Ь) и (А₃), сужение сосудов (А1), брадикардия (А1), ингибирование тромбоцитов (А_2а), отрицательная инотропия и дромотропия сердца (А1), аритмия, тахикардия и ангиогенез. Терапевтическими применениями соединений настоящего изобретения являются, например, предупреждение вызванного ишемией повреждения сердца и снижения его тонуса, защита ткани миокарда и восстановление сердечной функции.

Почечными эффектами является снижение СКФ (скорости клубочковой фильтрации) (А₁), сморщивание мезангиальных клеток (А1), антидиурез (А1) и ингибирование высвобождения ренина (А1). Подходящими терапевтическими применениями соединений настоящего изобретения является их использование в качестве диуретиков, натриуретиков, калийудерживающих агентов, агентов для защиты/предохранения почек от острой почечной недостаточности, гипотензивных, противоотечных и противонефритных агентов.

Респираторными эффектами являются бронхолитические эффекты (А₂), бронхостеноз (А1), хроническая обструктивная болезнь легких, аллергический ринит, секреция слизи и угнетение дыхания (А2). Подходящими терапевтическими применениями для соединений настоящего изобретения являются их использование в качестве противоастматических средств, лечение болезней легких после трансплантации и респираторных заболеваний.

Иммунологическими эффектами являются иммуносупрессия (А₂), хемотаксис нейтрофилов (АД, генерация супероксида нейтрофилами (А_2а) и дегрануляция тучных клеток (А_2Ь и А₃). Терапевтическим применением антагонистов являются их использование в качестве медиаторов аллергических и неаллергических воспалительных реакций, например, медиаторов высвобождения гистамина и других медиаторов воспаления.

Желудочно-кишечными эффектами является ингибирование секреции кислоты (А!). Терапевтическим применением соединений настоящего изобретения является их использование при рефлюкс-состояниях и язвах. Желудочно-кишечными эффектами также являются заболевания толстой кишки, тонкой кишки и диарея, например, диарея, ассоциированная с воспалением тонкой кишки (А₂ь).

Глазными болезнями являются повреждение сетчатки и диска зрительного нерва, и заболевания, ассоциированные с травмами (А₃). В предпочтительном варианте осуществления изобретения, такой глазной болезнью является глаукома.

Другими терапевтическими применениями соединений настоящего изобретения является лечение ожирения (благодаря липолитическим свойствам этих соединений), гипертензии и депрессии; использование в качестве седативного средства, транквилизатора, антилептического средства и в качестве слабительного средства, например, для стимуляции перистальтики, не приводящей к диарее.

Термин болезненное состояние означает состояния, вызываемые или ассоциированные с нежелательными уровнями аденозина, аденилилциклазной активности, повышенной физиологической активности, связанной с нарушением стимуляции аденозиновых рецепторов и/или с возрастанием сАМР. В одном из вариантов осуществления изобретения, патологическим состоянием является, например, астма, хроническая обструктивная болезнь легких, аллергический ринит, бронхит, заболевание почек, желудочно-кишечные заболевания или глазные болезни. Другими примерами являются хронический бронхит и фиброз мочевого пузыря. Подходящими примерами воспалительных заболеваний являются нелимфатический лейкоз, ишемия миокарда, стенокардия, инфаркт, цереброваскулярная ишемия, перемежающаяся хромота, угрожающая ишемия конечностей, венозная гипертензия, варикозное расширение вен, изъязвления вен и артериосклероз. Повреждениями, ассоциированными с реперфузией, являются, например, любая травма после хирургической операции, такой как восстановительная хирургическая операция, тромболиз или ангиопластика.

Выражение воздействие на состояние, отвечающее на Ν-6-замещенный 7-деазапурин или лечение состояния, отвечающего на Ν-6замещенный 7-деазапурин означает такие изменения в патологическом состоянии или заболевании, описанном выше, которые могут приводить к уменьшению или минимизации физиологических симптомов у млекопитающего. Это выражение означает также регуляцию, предупреждение или ингибирование физиологических симптомов или эффектов, ассоциированных с аномальным количеством аденозина. В предпочтительном варианте настоящего изобретения, такой регуляцией патологического состояния или заболевания является его полное излечение. В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения, эту регуляцию выбирают так, чтобы осуществлялся контроль за отклонением уровней активности аденозинового рецептора, но, при этом, другие физиологические системы и параметры оставались неизменными.

Термин Ν-6-замещенный 7-деазапурин понятен специалистам и означает соединения, имеющие формулу I

Ν-замещенный 7-деазапурин включает его фармацевтически приемлемые соли, и, в одном из вариантов, также означает некоторые описанные здесь Ν-6-замещенные пурины.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, Ν-6-замещенный 7-деазапурин не замещен Ν-6-бензилом или Ν-6-фенилэтилом. В других вариантах изобретения, К₄ не замещен бензилом или фенилэтилом. В предпочтительных вариантах изобретения, Κι и К₂ оба не являются атомами водорода. В других предпочтительных вариантах, К₃ не является атомом водорода.

Термин терапевтически эффективное количество Ν-6-замещенного 7-деазапурина, описанного ниже, означает количество терапевтического соединения, необходимого или достаточного для осуществления его целевой функции в организме млекопитающего, например, для лечения состояния, отвечающего на Ν-6замещенный 7-деазапурин, или патологического состояния у млекопитающего. Эффективное количество терапевтического соединения может варьироваться в зависимости от таких факторов, как количество этиологического агента, уже присутствующего в организме млекопитающего, возраста, пола и веса млекопитающего, и от способности терапевтических соединений настоящего изобретения влиять на состояние, отвечающее на Ν-6-замещенный деазапурин у млекопитающего. Каждый средний специалист может сам исследовать вышеупомянутые факторы и определить эффективное количество терапевтического соединения без какого-либо излишнего экспериментирования. Для определения эффективного количества терапевтических соединений, описанных ниже, может быть использован ίη νίίτο- и ίη νίνο-анализ. Каждый средний специалист может выбрать соответствующее количество терапевтического соединения для использования в вышеупомянутом анализе или для терапевтического лечения.

Терапевтически эффективное количество предпочтительно ослабляет, по крайней мере, один симптом или эффект, ассоциированный с состоянием или заболеванием, отвечающим на действие Ν-6-замещенного 7-деазапурина, и подвергаемым лечению, по крайней мере, примерно на 20% (более предпочтительно, по крайней мере, примерно на 40%, еще более предпочтительно, по крайней мере, примерно на 60%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере, примерно на 80%) по сравнению с симптомом или эффектом у индивидуума, не подвергаемого такому лечению. Анализы для определения степени ослабления таких симптомов и/или эффектов могут быть разработаны любым специалистом. Любой известный анализ, позволяющий определить такие параметры, является частью настоящего изобретения. Так, например, если подвергаемым лечению заболеванием является астма, то объем воздуха, выдыхаемого из легких индивидуума, может быть измерен до и после лечения для определения увеличения этого объема методом, известным специалисту. Аналогично, если подвергаемым лечению заболеванием является воспалительное заболевание, то для определения уменьшения области воспаления, эта область воспаления может быть измерена до и после лечения методом, известным специалисту.

Термин клетка означает как прокариотическую клетку, так и эукариотическую клетку.

Термин животное означает любой организм с аденозиновыми рецепторами или любой организм, восприимчивый к состоянию, отвечающему на Ν-6-замещеный 7-деазапурин. Примерами таких животных являются дрожжи, млекопитающие, рептилии и птицы. В это понятие входят также трансгенные животные.

Термин млекопитающее понятен специалисту и означает животное, более предпочтительно, теплокровное животное, а наиболее предпочтительно, крупный рогатый скот, овцы, свиньи, лошади, собаки, кошки, крысы, мыши и человек. В объем настоящего изобретения также входят, например, млекопитающие, восприимчивые к состоянию, отвечающему на введение Ν-6-замещенного 7-деазапурина, воспалительным заболеваниям, эмфиземе, астме, заболеваниям центральной нервной системы или к острому респираторному дистресс-синдрому.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способам модуляции аденозинового рецептора(ов) у млекопитающих путем введения указанному млекопитающему те рапевтически эффективного количества Ν-6замещенного 7-деазапурина, так, чтобы это введение приводило к модуляции аденозинового рецептора у млекопитающего. Подходящими аденозиновыми рецепторами являются рецепторы семейств А!, А₂ или А₃. В предпочтительном варианте, №6-замещенный 7-деазапурин является антагонистом аденозинового рецептора.

Термин модуляция аденозинового рецептора означает такие события, при которых соединение взаимодействует с аденозиновым(и) рецептором(ами), вызывая повышенную, пониженную или аномальную физиологическую активность, ассоциированную с аденозиновым рецептором, или последующий каскад реакций, индуцированный в результате модуляции аденозинового рецептора. Физиологическими активностями, ассоциированными с аденозиновым рецептором, являются индуцирование седативного эффекта, расширения сосудов, снижение частоты сердечных сокращений и сократительной способности сердца, ингибирование агрегации тромбоцитов, стимуляция глюконеогенеза, ингибирование липолиза, открытие калиевых каналов, снижение потока ионов кальция в кальциевых каналах и т.п.

Термины модулировать, модулирование или модуляция означают предупреждение, устранение или ингибирование суммарного увеличения нежелательной физиологической активности, ассоциированной с аномальной стимуляцией аденозинового рецептора, например, с использованием терапевтических способов настоящего изобретения. В другом варианте настоящего изобретения, термин модуляция означает антагонистические эффекты, например, снижение активности или продуцирования медиаторов аллергии или аллергического воспаления, вызываемых сверхстимуляцией аденозинового(ых) рецептора(ов). Так, например, терапевтические деазапурины настоящего изобретения могут взаимодействовать с аденозиновым рецептором с ингибированием, например, аденилатциклазной активности.

Термин состояние, характеризующееся аномальной активностью аденозинового рецептора означает заболевания, расстройства или состояния, которые ассоциируются с нарушением стимуляции аденозинового рецептора, таким, что эта стимуляция рецептора вызывает каскад биохимических или физиологических реакций, которые прямо или опосредованно ассоциированы с данным заболеванием, расстройством или состоянием. Указанная стимуляция аденозинового рецептора не является единственным этиологическим фактором данного заболевания, расстройства или состояния, но она лишь ответственна за возникновение некоторых симптомов, обычно ассоциируемых с данным заболеванием, расстройством или состоянием, подвергаемым лечению. Такое нарушение стимуляции рецептора может быть единственным фактором или, по крайней мере, одним другим агентом, который может вызывать состояние, нуждающееся в лечении. Примерами таких состояний являются состояния, перечисленные выше, включая воспаление, желудочно-кишечные заболевания и симптомы, проявляемые в присутствии повышенной активности аденозинового рецептора. Предпочтительными примерами являются симптомы, ассоциированные с астмой, аллергическим ринитом, хронической обструктивной болезнью легких, эмфиземой, бронхитом, желудочно-кишечными заболеваниями и глаукомой.

Термин терапия или лечение состояния, характеризующегося нарушением активности аденозинового рецептора означает облегчение или ослабление, по крайней мере, одного симптома, ассоциированного с данным состоянием. Таким лечением также является облегчение или ослабление более чем одного симптома. Предпочтительно, если такое лечение приводит к излечению, например, в основном, к устранению симптомов, ассоциированных с данным состоянием.

Настоящее изобретение относится к соединениям, Ν-6-замещенным 7-деазапуринам, имеющим формулу I

где каждый из Κι и К₂ независимо представляет собой атом водорода или замещенную или незамещенную алкильную, арильную или алкиларильную группу, либо, взятые вместе, они образуют замещенное или незамещенное гетероциклическое кольцо;

К₃ представляет собой атом водорода или замещенную или незамещенную алкильную, арильную или алкиларильную группу;

К₄ представляет собой атом водорода или замещенную или незамещенную алкильную, арильную или алкиларильную группу. Каждый из Κ₅ и Κ₆ независимо представляет собой атом галогена, например, хлор, фтор или бром, атом водорода или замещенную или незамещенную алкильную, арильную или алкиларильную группу; либо, Κ₄ и Κ₅ или Κ₅ и К.₆. взятые вместе, образуют замещенное или незамещенное гетероциклическое или карбоциклическое кольцо. Настоящее изобретение также относится к фармацевтически приемлемым солям Ν-6-замещенных 7-деазапуринов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, каждый из Κ₁ и Κ₂ независимо может представлять собой замещенные или незамещенные циклоалкильные или гетероарилалкильные группы. В других вариантах осуществления изобретения, К₃ означает атом водорода или замещенную или незамещенную гетероарильную группу. В других вариантах осуществления изобретения, каждый из Κ₄, Κ₅ и Κ₆ может независимо представлять собой гетероарильную группу.

В одном варианте осуществления изобретения, Κ₁ представляет собой атом водорода, К₂ представляет собой замещенную или незамещенную циклогексановую, циклопентильную, циклобутильную или циклопропановую группу, Κ₃ представляет собой замещенную или незамещенную фенильную группу, Κ₄ представляет собой атом водорода, а Κ₅ и Κ₆ оба представляют собой метильные группы.

В другом варианте осуществления изобретения, Κ₂ представляет собой циклогексанол, циклогександиол, циклогексилсульфонамид, циклогексанамид, циклогексиловый сложный эфир, циклогексен, циклопентанол или циклопентандиол, а К₃ представляет собой фенильную группу.

В еще одном варианте осуществления изобретения, Κ₁ представляет собой атом водорода, Κ₂ представляет собой циклогексанол, Κ₃ представляет собой замещенную или незамещенную фенильную, пиридиновую, фурановую, циклопентановую или тиофеновую группу, Κ₄ представляет собой атом водорода, замещенную алкильную, арильную или арилалкильную группу, а каждый из Κ₅ и Κ₆ независимо представляет собой атом водорода или замещенную или незамещенную алкильную, арильную или алкиларильную группу.

В другом варианте осуществления изобретения, Κ₁ представляет собой атом водорода, К₂ представляет собой замещенный или незамещенный алкиламин, ариламин или алкилариламин, замещенный или незамещенный алкиламид, ариламид или алкилариламид, замещенный или незамещенный алкилсульфонамид, арилсульфонамид или алкиларилсульфонамид, замещенную или незамещенную алкилмочевину, арилмочевину или алкиларилмочевину, замещенный или незамещенный алкилкарбамат, арилкарбамат или алкиларилкарбамат, либо замещенную или незамещенную алкилкарбоновую кислоту, арилкарбоновую кислоту или алкиларилкарбоновую кислоту, Κ₃ представляет собой замещенную или незамещенную фенильную группу, представляет собой атом водорода, а К₅ и Κ₆ представляют собой метильные группы.

В еще одном варианте осуществления изобретения, Κ₂ представляет собой гуанидин, модифицированный гуанидин, цианогуанидин, тиомочевину, тиоамид или амидин.

В одном из вариантов осуществления изобретения, Κ₂ может представлять собой:

где каждый из К_2а-К._2с независимо представляет собой атом водорода или насыщенную или ненасыщенную алкильную, арильную или алкил арильную группу, а К₂₄ представляет собой атом водорода или насыщенную или ненасыщенную алкильную, арильную или алкиларильную группу, ИК_2еК_2£ или ОВ_2д. где каждый из К_2е-К_2д независимо представляет собой атом водорода или насыщенную или ненасыщенную алкильную, арильную или алкиларильную группы. Альтернативно, К_2а и К₂ь, взятые вместе, могут образовывать карбоциклическое или гетероциклическое кольцо, имеющее приблизительно 3-8 членов, например, циклопропильные, циклопентильные, циклогексильные группы.

В одном из аспектов настоящего изобретения, К₅ и К₆ оба не являются метильными группами, а предпочтительно, один из К₅ и К₆ представляет собой алкильную группу, например, метильную группу, а другой представляет собой атом водорода.

В другом аспекте настоящего изобретения, если Кд представляет собой 1-фенилэтил, а Κι представляет собой атом водорода, то К₃ не является фенилом, 2-хлорфенилом, 3-хлорфенилом, 4-хлорфенилом, 3,4-дихлорфенилом, 3метоксифенилом или 4-метоксифенилом, либо если К₄ и К₁ представляют собой 1-фенилэтил, то К₃ не является атомом водорода, или если К₄ представляет собой атом водорода, а К₃ представляет собой фенил, то К₁ не является фенилэтилом.

В другом аспекте настоящего изобретения, если К₅ и Кз, взятые вместе, образуют карбоциклическое кольцо, например:

пиримидо[4,5-6]индол, то К₃ не является фенилом, а если К₄ представляет собой 1-(4-метилфенил)этил, фенилизопропил, фенил или 1-фенилэтил или если К₃ не является атомом водорода, то Кд представляет собой 1-фенилэтил. Карбоциклическое кольцо, образованное К₅ и К₆, может быть либо ароматическим, либо алифатическим, и может иметь от 4 до 12 атомов углерода, например, нафтил, фенилциклогексил, и т.п., а предпочтительно, от 5 до 7 атомов углерода, например, циклопентил или циклогексил. Альтернативно, К₅ и К₆, взятые вместе, могут образовывать гетероциклическое кольцо, такое как кольцо, описанное ниже. Обычными гетероциклическими кольцами являются кольца, имеющие от 4 до 12 атомов углерода, а предпочтительно, от 5 до 7 атомов углерода, и эти кольца могут быть либо ароматическими, либо алифатическими. Это гетероциклическое кольцо может быть, кроме того, замещенным, включая замещение одного или нескольких атомов углерода кольцевой структуры одним или несколькими гетероатомами.

В еще одном аспекте настоящего изобретения, К1 и К₂ образуют гетероциклическое кольцо. Характерными примерами являются, но не ограничиваются ими, гетероциклические кольца, перечисленные ниже, такие как морфолино, пиперазин и т.п., например, 4-гидроксипиперидины, 4-аминопиперидины. Если К! и К₂, взятые вместе, образуют пиперазиногруппу,

то К₇ может представлять собой атом водорода или замещенную или незамещенную алкильную, арильную или алкиларильную группу.

В еще одном аспекте настоящего изобретения, Кд и К₅, взятые вместе, могут образовывать гетероциклическое кольцо, например:

Гетероциклическое кольцо может быть либо ароматическим, либо алифатическим, и может образовывать кольцо, которое имеет от 4 до 12 атомов углерода, например, нафтил, фенилциклогексил и т.п., и может быть либо ароматическим, либо алифатическим, например, циклогексил, циклопентил. Гетероциклическое кольцо может быть, кроме того, замещенным, включая замещение атомов углерода кольцевой структуры одним или несколькими гетероатомами. Альтернативно, К₄ и К₅, взятые вместе, могут образовывать гетероциклическое кольцо, такое как кольцо, описанное ниже.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, Ν-6-замещенный 7-деазапурин не является Ν-6-бензил- или Ν-6-фенилэтилзамещенным. В других вариантах настоящего изобретения, К4 не является бензил- или фенилэтилзамещенным. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, К| и К₂ оба не являются атомами водорода. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения, К₃ не является атомом водорода.

Соединения настоящего изобретения могут содержать водорастворимые пролекарства, которые в результате метаболизма ίη νίνο превращаются в активное лекарственное вещество, например, в результате гидролиза, катализируемого эстеразой. Примерами потенциальных пролекарств являются деазапурины, где, например, К2 представляет собой циклоалкил, замещенный -ОС(О)(Ζ)NΗ₂, где Ζ представляет собой боковую цепь природной или неприродной аминокислоты или ее аналога, α-, β-, γ- или ωаминокислоты или дипептида. Предпочтительными боковыми цепями аминоксилот являются боковые цепи глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, лизина, α-метилаланина, аминоциклопропанкарбоновой кислоты, азетидин2-карбоновой кислоты, β-аланина, γ-аминомасляной кислоты, аланин-аланина или глициналанина.

В другом своем предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к диазапуринам формулы (I), где

Я! представляет собой водород;

Я₂ представляет собой замещенный или незамещенный циклоалкил, замещенный или незамещенный алкил, либо Я1 и Я₂, взятые вместе, образуют замещенное или незамещенное гетероциклическое кольцо;

Я₃ представляет собой незамещенный или замещенный арил;

Я₄ представляет собой водород и каждый из Я₅ и Я₆ независимо представляет собой водород или алкил;

и их фармацевтически приемлемые соли. В этом варианте настоящего изобретения, указанные деазапурины могут быть селективными антагонистами рецептора А₃.

В одном из вариантов настоящего изобретения, Я₂ представляет собой замещенный (например, гидроксизамещенный) или незамещенный циклоалкил. В предпочтительном подварианте, Я₁ и Я₄ представляют собой водород, Я₃ представляет собой незамещенный или замещенный фенил, а каждый из Я5 и Я6 представляет собой алкил. Предпочтительно, Я₂ представляет собой моногидроксициклопентил или моногидроксициклогексил. Я₂ также может быть замещен -ЛН-С(=О)Е, где Е представляет собой замещенный или незамещенный С₁-С₄-алкил (например, алкиламин, например, этиламин).

Я1 и Я2, взятые вместе, могут образовывать замещенное или незамещенное гетероциклическое кольцо, которое может быть замещено амином или ацетамидогруппой.

В другом аспекте изобретения, Я₂ может быть -Л-ЛНС(=О)В, где А представляет собой незамещенный С₁-С₄алкил (например, этил, пропил, бутил), а В представляет собой замещенный или незамещенный С₁-С₄алкил (например, метил, аминоалкил, например, аминометил или аминоэтил, алкиламино, например, метиламино, этиламино), а предпочтительно, если Я1 и Я4 представляют собой водород, то Я3 представляет собой замещенный или незамещенный фенил, а каждый из Я₅ и Я₆ представляет собой алкил. В может быть замещенным или незамещенным циклоалкилом (например, циклопропилом или 1-аминоциклопропилом).

В другом варианте настоящего изобретения, Я₃ может представлять собой замещенный или незамещенный фенил, а предпочтительно, каждый из Я₅ и Я₆ представляет собой алкил. Предпочтительно, Я3 может иметь один или несколько заместителей (например, о-, м- или пхлорфенил, о-, м- или п-фторфенил).

Я3 может, преимущественно, представлять собой замещенный или незамещенный гетероарил, а предпочтительно, каждый из Я₅ и Я₆ представляет собой алкил. Примерами гетероарильных групп являются пиридил, пиримидил, пиридазинил, пиразинил, пирролил, триазолил, тиазолил, оксазолил, оксадиазолил, фуранил, метилендиоксифенил и тиофенил. Я₃, предпочтительно, представляет собой 2-пиридил, 3пиридил, 4-пиридил, 2-пиримидил или 3пиримидил.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения, каждый из Я₅ и Я₆ представляет собой водород. В другом варианте, каждый из Я5 и Я6 представляет собой метил.

В особенно предпочтительном варианте, деазапуринами настоящего изобретения являются водорастворимые пролекарства, которые в результате метаболизма ίη νίνο превращаются в активное лекарственное вещество, например, в результате гидролиза, катализируемого эстеразой. Предпочтительные пролекарства содержат группу Я₂, которая представляет собой циклоалкил, замещенный -ОС(О)(2)ИН₂, где Ζ представляет собой боковую цепь природной или неприродной аминокислоты или ее аналога, α-, β-, γ- или ω-аминокислоты или дипептида. Предпочтительными боковыми цепями аминокислот являются боковые цепи глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, лизина, αметилаланина, аминоциклопропанкарбоновой кислоты, азетидин-2-карбоновой кислоты, βаланина, γ-аминомасляной кислоты, аланиналанина или глициналанина.

В особенно предпочтительном варианте, Ζ представляет собой боковую цепь глицина, Я2 представляет собой циклогексил, Я₃ представляет собой фенил, а Я₅ и Я₆ представляют собой метил.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, деазапурином является 4-(цис-3-гидроксициклопентил)амино5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, деазапурином является соль трифторуксусной кислоты и 4-(цис-3-(2-аминоацетокси)циклопентил)амино-5,6-диметил-2фенил-7Н-пирроло [2,36]пиримидина.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, деазапурином является 4-(3ацетамидо)пиперидинил-5,6-диметил-2-фенил7Н-пирроло -[2,36] пиримидин.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, деазапурином является 4-(2Ы'-метилкарбомидопропил)амино-5,6-диметил2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, деазапурином является 4-(2ацетамидобутил)амино-5,6-диметил-2-фенил7Н-пирроло [2,36] -пиримидин.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, деазапурином является 4-(2Ы'-метилкарбамидобутил)амино-5,6-диметил-2фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, деазапурином является 4-(2 аминоциклопропилацетамидоэтил)амино-2фенил-7Н-пирроло -|2,3й| пиримидин.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, деазапурином является 4(транс-4-гидроксициклогексил)амино-2-(3хлорфенил)-7Н-пирроло[2,3й]пиримидин.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, деазапурином является 4(транс-4-гидроксициклогексил)амино-2-(3фторфенил)-7Н-пирроло[2,3й]пиримидин.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, деазапурином является 4(транс-4-гидроксициклогексил)амино-2-(4-пиридил)-7Н-пирроло[2,3й]пиримидин.

В еще одном варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к способу ингибирования активности аденозинового рецептора (например, А_ь А_2А, А_3В или предпочтительно, А₃) в клетке путем контактирования этой клетки с Ν-6-замещенным 7-деазапурином (например, предпочтительно, с антагонистом аденозинового рецептора).

В другом аспекте своего осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения поражения глаз у животного (например, у человека) путем введения этому животному эффективного количества Ν-6-замещенного 7деазапурина. Предпочтительным Ν-6-замещенным 7-деазапурином является антагонист аденозиновых рецепторов А3 в клетках животного. Указанным поражением глаз является поражение сетчатки или диска зрительного нерва, и это поражение может быть острым или хроническим. Указанное поражение может возникать в результате глаукомы, отека, ишемии, гипоксии или травмы.

В предпочтительном варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к деазапурину, имеющему формулу II, см. выше, где

Х представляет собой N или СВ₆;

каждый из В_| и В₂ независимо представляет собой водород или замещенный или незамещенный алкокси, аминоалкил, алкил, арил или алкиларил, либо, взятые вместе, они образуют замещенное или незамещенное гетероциклическое кольцо, при условии, что оба Щ и В₂ не являются водородом;

В₃ представляет собой замещенный или незамещенный алкил, арилалкил или арил;

В₄ представляет собой водород или замещенный или незамещенный С'₄ -С₆алкил;

Ь представляет собой водород, замещенный или незамещенный алкил, либо В₄ и Ь, взятые вместе, образуют замещенное или незамещенное гетероциклическое или карбоциклическое кольцо;

К.₆ представляет собой водород, замещенный или незамещенный алкил или галоген;

представляет собой СН₂, О, 8 или ΝΚ₇, где В- представляет собой водород или замещенный или незамещенный С_|-С₆алкил и представляет собой незамещенный или замещенный алкил, циклоалкил, алкинил, арил, арилалкил, биарил, гетероарил, замещенный карбонил, замещенный тиокарбонил или замещенный сульфонил; при условии, что если В₃ представляет собой пирролидино, то В₄ не является метилом.

В одном из вариантов настоящего изобретения, в соединениях формулы II, X представляет собой СВ₆ и О представляет собой СН₂, О, 8 или ΝΗ. В другом варианте изобретения, Х представляет собой Ν.

В другом варианте соединений формулы II, представляет собой замещенный или незамещенный арил, 5- или 6-членный гетероарил или биарил. может быть замещен одним или несколькими заместителями. Примерами заместителей являются: галоген, гидрокси, алкокси, амино, аминоалкил, аминокарбоксиамид, С^ СР₃, СО₂1% СО\111% СО\1%% 801% 8О₂% и 8О%К._ХК,₄. где каждый из и независимо представляет собой водород или замещенный или незамещенный алкил, циклоалкил, арил или арилалкил. Предпочтительно, может представлять собой замещенный или незамещенный фенил, например, метилендиоксифенил. также может представлять собой замещенное или незамещенное 5-членное гетероарильное кольцо, например, пиррол, пиразол, оксазол, имидазол, триазол, тетразол, фуран, тиофен, тиазол и оксадиазол. Предпочтительно, может представлять собой 6-членное гетероарильное кольцо, например, пиридил, пиримидил, пиридазинил, пиразинил и тиофенил. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, представляет собой 2-пиридил, 3-пиридил, 4пиридил, 2-пиримидил, 4-пиримидил или 5пиримидил.

В одном преимущественном варианте соединений формулы II, О представляет собой ΝΗ, а представляет собой 3-пиразольное кольцо, которое является незамещенным или Νзамещено замещенным или незамещенным алкилом, циклоалкилом, арилом или арилалкилом.

В другом преимущественном варианте соединений формулы II, О представляет собой кислород, а представляет собой 2-тиазольное кольцо, которое является незамещенным или замещено замещенным или незамещенным алкилом, циклоалкилом, арилом или арилалкилом.

В другом варианте соединений формулы II, представляет собой замещенный или незамещенный алкил, циклоалкил, например, циклопентил или арилалкил. Примерами заместителей являются галоген, гидрокси, замещенный или незамещенный алкил, циклоалкил, арил арилалкил или ΝΗΡ_|0, где К.ю представляет собой водород, либо замещенный или незамещенный алкил, циклоалкил, арил или арилалкил.

В еще одном варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к деазапурину формулы II, где представляет собой

-(СН₂)_а-С(=О)У или -(СН₂)_а-С(=8)У, где а равно целому числу от 0 до 3, Υ представляет собой арил, алкил, арилалкил, циклоалкил, гетероарил, алкинил, ΝΗΡ||Ρ|₂. либо в случае, если О представляет собой ΝΗ, то Υ представляет собой ОР_|3, и где каждый из К_{| |}, К_|2 и В₁₃ независимо представляет собой водород или незамещенный или замещенный алкил, арил, арилалкил или циклоалкил. Υ предпочтительно представляет собой 5- или 6-членное гетероарильное кольцо.

Кроме того, А представляет собой -(СН₂)_Ь8(=Ο)]Υ, где_) равно 1 или 2, Ь равно 0, к 2 или 3, Υ представляет собой арил, алкил, арилалкил, циклоалкил, алкинил, гетероарил, ΝΗΚ.^^ или в случае, если Ь равно 1, О представляет собой СН₂, и где каждый из К_|5 и К_|6 независимо представляют собой водород или незамещенный или замещенный алкил, арил, арилалкил или циклоалкил.

В другом варианте осуществления изобретения, Κ3 выбирают из группы, состоящей из замещенного и незамещенного фенила, пиридила, пиримидила, пиридазинила, пиразинила, пирролила, триазолила, тиазолила, оксазолила, оксадиазолила, пиразолила, фуранила, метилендиоксифенила и тиофенила. Если К₃ представляет собой фенил, то он может быть замещен, например, гидроксилом, алкокси (например, метокси), алкилом (например, толилом) и галогеном (например, о-, м- или п-фторфенилом или о-, м- или п-хлорфенилом). К₃ преимущественно может представлять собой 2-, 3- или 4пиридил или 2- или 3-пиримидил.

Настоящее изобретение также относится к деазапурину, где К₆ представляет собой водород или С-Сзалкил. К₆ предпочтительно представляет собой водород.

Настоящее изобретение также относится к деазапуринам, где К представляет собой водород, а К₂ представляет собой замещенный или незамещенный алкил или алкокси, замещенный или незамещенный алкиламин, ариламин или алкилариламин, замещенный или незамещенный аминоалкил, аминоарил или аминоалкиларил, замещенный или незамещенный алкиламид, ариламид или алкилариламид, замещенный или незамещенный алкилсульфонамид, арилсульфонамид или алкиларилсульфонамид, замещенную или незамещенную алкилмочевину, арилмочевину или алкиларилмочевину, замещенный или незамещенный алкилкарбамат, арилкарбамат или алкиларилкарбамат, либо замещенную или незамещенную алкилкарбоновую кислоту, арилкарбоновую кислоту или алкиларилкарбоновую кислоту. К₂ предпочтительно представляет собой замещенный или незамещенный циклоалкил, например, моноили дигидроксизамещенный циклогексил или циклопентил (предпочтительно, моногидроксизамещенный циклогексил или моногидроксизамещенный циклопентил).

Преимущественно, К₂ может иметь формулу

где А представляет собой Ц-С^лкил, С₃-С₇ циклоалкил, цепь из Ь7 атомов или кольцо из 37 атомов, необязательно замещенное Ц-С^лкильной, галогеновой, гидроксильной, карбоксильной, тиоловой или аминогруппами;

В представляет собой метил, Ы(Ме)₂, Ν(Εΐ)₂, ΝΗΜο, ΝΗΕΐ, (СН₂)_ГМН₃+, К1Н(СН₂)_ГСН₃, (0Η₂)_ΓΝΗ₂, (СН₂)_ГСНСН₃МН₂, (СН₂)_гМНМе, (СН2)_ГОН, СН-СУ (СН2)_тСО2Н, СНКАК или СНМеОН, где г означает целое число от 0 до 2, т равно 1 или 2, К_|8 представляет собой алкил, К_|9 представляет собой ΝΉ₃+ или СО₂Н, либо К_|8 и К.^, взятые вместе, представляют собой

-СН-ΝΗ— \ / (СН_г)_р где р равно 2 или 3 и

К_г представляет собой Ц-^алкил, С₃-С₇ циклоалкил, цепь из |-7 атомов или кольцо из 37 атомов, необязательно замещенное СгС₆ алкильной, галогеновой, гидроксильной, карбоксильной, тиольной или аминогруппами.

А преимущественно представляет собой незамещенный или замещенный Ц-С^лкил. В может представлять собой незамещенный или замещенный С|-С6алкил.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, К₂ представляет собой формулу -А-МНС(=О)В. В особенно предпочтительном варианте изобретения, А представляет собой -СН2СН2-, а В представляет собой метил.

Соединения настоящего изобретения могут содержать водорастворимые пролекарства, которые в результате метаболизма ίη νίνο превращаются в активное лекарственное вещество, например, в результате гидролиза, катализируемого эстеразой. Примерами потенциальных пролекарств являются деазапурины, где, например, К₂ представляет собой циклоалкил, замещенный -ОС(О)(2)МН₂, где Ζ представляет собой боковую цепь природной или неприродной аминокислоты или ее аналога, α-, β-, γ- или ωаминокислоты или дипептида. Предпочтительными боковыми цепями аминоксилот являются боковые цепи глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, лизина, α-метилаланина, аминоциклопропанкарбоновой кислоты, азетидин2-карбоновой кислоты, β-аланина, γ-аминомасляной кислоты, аланин-аланина или глициналанина.

В другом варианте осуществления изобретения, К_| и К₂, взятые вместе, представляют собой:

где η равно | или 2 и где указанное кольцо может быть, но не обязательно, замещено одной или несколькими гидроксильной, амино, тиольной, карбоксильной, галогеновой, СН₂ОН, СН₂ИНС(=О)-алкильной или 0Ή₂ΝΗ0’(=Ο)ΝΗалкильной группами.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения, Я! представляет собой водород, Я₂ представляет собой замещенный или незамещенный С|-С₆алкил. Я₃ представляет собой замещенный или незамещенный фенил, Я₄ представляет собой водород, Ь представляет собой водород или замещенный или незамещенный С₁-С₆алкил, О представляет собой О, 8 или ΝΚ.-, где Я₇ представляет собой водород или замещенный или незамещенный С₁-С₆алкил, а представляет собой замещенный или незамещенный арил. Я₂ предпочтительно представляет собой -А-ЫНС(=О)В, где каждый из А и В независимо представляет собой незамещенный или замещенный С₁-С₄алкил. Так, например, А может представлять собой СН2СН2. В может представлять собой, например, алкил (например, метил) или аминоалкил (например, аминометил). Я₃ предпочтительно представляет собой незамещенный фенил, а Ь представляет собой водород. Я₆ может представлять собой метил или, предпочтительно, водород. О предпочтительно представляет собой О, 8 или ΝΚ.7, где Я₇ представляет собой водород или замещенный или незамещенный С₁-С₆алкил, например, метил. представляет собой незамещенный или замещенный фенил (например, алкокси-, галоген-замещенный). Предпочтительно, представляет собой пфторфенил, п-хлорфенил или п-метоксифенил. также может представлять собой гетероарил, например, 2-пиридил.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанным деазапурином является 4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-феноксиметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36] пиримидин.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанным деазапурином является 4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-(4-фторфенокси)метил-2-фенил-7Н-пирроло [2,36] пиримидин.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанным деазапурином является 4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-(4-хлорфенокси)метил-2-фенил-7Н-пирроло [2,36] пиримидин.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанным деазапурином является 4-(2-ацетиламиноэтил)амино6-(4-метоксифенокси)метил-2-фенил-7Н-пирроло [2,36] пиримидин.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанным деазапурином является 4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-(2-пиридилокси)метил-2-фенил-7Н-пирроло [2,36] пиримидин.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанным деазапурином является 4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-(Ы-фениламино)метил-2-фенил-7Н-пирроло [2,36] пиримидин.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанным деазапурином является 4-(2-ацетиламиноэтил)амино6-(П-метил-П-фениламино)метил-2-фенил-7Нпирроло [2,36] пиримидин.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанным деазапурином является 4-(2-Ы'-метилкарбамидоэтил) амино-6-феноксиметил-2-фенил-7Н-пирроло [2,36] пиримидин.

Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования активности аденозинового рецептора (например, аденозинового рецептора А₂ь) в клетках путем контактирования указанной клетки с соединением настоящего изобретения. Предпочтительным соединением является антагонист рецептора.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения желудочно-кишечного заболевания (например, диареи) у животного путем введения этому животному эффективного количества соединения настоящего изобретения (например, антагониста А_2Ь). Предпочтительным животным является человек.

В другом варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей Ν-6-замещенный 7-деазапурин настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение относится к способу лечения состояния, отвечающего за Ν-6замещенный 7-деазапурин, у животного, путем введения млекопитающему терапевтически эффективного количества деазапурина настоящего изобретения, необходимого для лечения состояния, отвечающего на Ν-6-замещенный 7деазапурин у животного. Указанным патологическим состоянием преимущественно может быть заболевание, опосредованное аденозином. Предпочтительными примерами патологических состояний являются: заболевания центральной нервной системы, сердечно-сосудистые заболевания, почечные заболевания, воспалительные заболевания, аллергические заболевания, желудочно-кишечные заболевания, глазные болезни и респираторные заболевания.

Термин алкил означает радикал насыщенных алифатических групп, включая алкильные группы с прямой цепью, алкильные группы с разветвленной цепью, циклоалкильные (алициклические) группы, алкилзамещенные циклоалкильные группы и циклоалкилзамещенные алкильные группы. Термин алкил, кроме того, означает алкильные группы, которые могут, кроме того, включать атомы кислорода, азота, серы или фосфора, заменяющие один или несколько атомов углерода углеводородного осто ва, например, атомы кислорода, азота, серы или фосфора. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, алкил с прямой или разветвленной цепью имеет 30 или менее атомов углерода на своем остове (например, С1-С₃₀ для прямой цепи, С₃-С₃₀ для разветвленной цепи) и более предпочтительно, 20 атомов углерода или менее. Аналогично, предпочтительные циклоалкилы имеют от 4 до 10 атомов углерода на своей кольцевой структуре, а более предпочтительно, 5, 6 или 7 атомов углерода на кольцевой структуре.

Более того, термин алкил, используемый в описании и в формуле изобретения, включает как незамещенные алкилы, так и замещенные алкилы, где указанные замещенные алкилы означают алкильные группы, имеющие заместителей, заменяющие водород на одном или нескольких атомах углерода углеводородного остова. Такими заместителями могут быть, например, галоген, гидроксильная, алкилкарбонилокси-, арилкарбонилокси-, алкоксикарбонилокси-, арилоксикарбонилокси-, карбоксилатная, алкилкарбонильная, алкоксикарбонильная, аминокарбонильная, алкилтиокарбонильная, алкоксильная, фосфатная, фосфонато-, фосфинато-, циано-, амино- (включая алкиламино-, диалкиламино-, ариламино-, диариламино- и алкилариламино-), ациламино- (включая алкилкарбониламино-, арилкарбониламино-, карбамоильную и уреидо-), амидино-, имино-, сульфгидрильная, алкилтио-, арилтио-, тиокарбоксилатная, сульфатная, сульфонато-, сульфамоильная, сульфонамидо-, нитро-, трифторметильная, циано-, азидо-, гетероциклильная, алкиларильная, либо ароматическая или гетероароматическая группы. Следует отметить, что эти группы, замещенные на углеводородной цепи, сами могут быть замещены, если это необходимо. Циклоалкилы могут быть, кроме того, замещены, например, заместителями, описанными выше. Термин алкиларильная группа означает алкил, замещенный арилом (например, фенилметилом (бензилом)). Термин алкил также означает ненасыщенные алифатические группы, которые имеют длину и возможные заместители, аналогичные алкилам, описанным выше, но которые содержат, по крайней мере, одну двойную или тройную связь, соответственно.

Используемый здесь термин арил означает радикал арильных групп, включая 5- и 6членные ароматические группы с одним кольцом, которые могут иметь от 0 до 4 гетероатомов, например, бензол, пиррол, фуран, тиофен, имидазол, бензоксазол, бензотиазол, триазол, тетразол, пиразол, пиридин, пиразин, пиридазин и пиримидин и т. п. Арильными группами также являются полициклические конденсированные ароматические группы, такие как нафтил, хинолил, индолил и т.п. Эти арильные группы, имеющие гетероатомы на своей кольцевой структуре, могут быть также названы арильными гетероциклами, гетероарилами или гетероароматическими группами. Это ароматическое кольцо может быть замещено в одном или нескольких положениях кольца заместителями, описанными выше, например, такими как галоген, гидроксильная, алкокси, алкилкарбонилокси-, арилкарбонилокси-, алкоксикарбонилокси-, арилоксикарбонилокси-, карбоксилатная, алкилкарбонильная, алкоксикарбонильная, аминокарбонильная, алкилтиокарбонильная, фосфатная, фосфонато-, фосфинато-, циано-, амино- (включая алкиламино-, диалкиламино-, ариламино-, диариламино- и алкилариламино-), ациламино- (включая алкилкарбониламино-, арилкарбониламино-, карбамоильную и уреидо-), амидино-, имино-, сульфгидрильная, алкилтио-, арилтио-, тиокарбоксилатная, сульфатная, сульфонато-, сульфамоильная, сульфонамидо-, нитро-, трифторметильная, циано-, азидо-, гетероциклильная, алкиларильная либо ароматическая или гетероароматическая группы. Арильные группы могут быть также конденсированы или соединены мостиковой связью с алициклическими или гетероциклическими кольцами, которые не являются ароматическими, так чтобы образовывался полицикл (например, тетралин).

Термины алкенил и алкинил означают ненасыщенные алифатические группы, которые имеют длину и возможные заместители, аналогичные алкилам, описанным выше, но которые содержат, по крайней мере, одну двойную или тройную связь, соответственно. Так, например, в настоящем изобретении рассматриваются циано- и пропаргильные группы.

Что касается числа атомов углерода, то используемый здесь термин низший алкил, если это не оговорено особо, означает алкильную группу, определенную выше, но имеющую от одного до десяти атомов углерода, более предпочтительно, от одного до шести атомов углерода на своей каркасной структуре, и даже более предпочтительно, от одного до трех атомов углерода на своей каркасной структуре. Подобно этому, низший алкенил и низший алкинил имеют аналогичные длины цепей.

Термины алкоксиалкил, полиаминоалкил и тиоалкоксиалкил означают алкильные группы, описанные выше, которые, кроме того, включают атомы кислорода, азота или серы, заменяющие один или несколько атомов углерода углеводородного остова, например, атомы кислорода, азота или серы.

Термины полициклил или полициклический радикал означают радикал из двух или более циклических колец (например, циклоалкилов, циклоалкенилов, циклоалкинилов, арилов и/или гетероциклилов), где два сопряженные кольца имеют общие два или более атомов углерода, например, эти кольца называются конденсированными кольцами. Кольца, соединенные несмежными атомами, называются мостиковыми кольцами. Каждое кольцо этого полицикла могут быть замещены заместителями, описанными выше, такими как, например, галоген, гидроксильная, алкилкарбонилокси-, арилкарбонилокси-, алкоксикарбонилокси-, арилоксикарбонилокси-, карбоксилатная, алкилкарбонильная, алкоксикарбонильная, аминокарбонильная, алкилтиокарбонильная, алкоксильная, фосфатная, фосфонато-, фосфинато-, циано-, амино- (включая алкиламино-, диалкиламино-, ариламино-, диариламино- и алкилариламино), ациламино- (включая алкилкарбониламино-, арилкарбониламино-, карбамоильную и уреидо-), амидино-, имино-, сульфгидрильная, алкилтио-, арилтио-, тиокарбоксилатная, сульфатная, сульфонато, сульфамоильная, сульфонамидо-, нитро-, трифторметильная, циано, азидо-, гетероциклильная, алкильная, алкиларильная, либо ароматическая или гетероароматическая группы.

Используемый здесь термин гетероатом означает атом любого элемента кроме углерода или водорода. Предпочтительными гетеро атомами являются атомы азота, кислорода, серы и фосфора.

Термин аминокислоты означает природные и неприродные аминокислоты, обнаруженные в белках, например, глицин, аланин, валин, цистеин, лейцин, изолейцин, серин, треонин, метионин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, глутамин, аспарагин, лизин, аргинин, пролин, гистидин, фенилаланин, тирозин и триптофан. Аминокислотными аналогами являются аминокислоты с удлиненными или укороченными боковыми цепями или с модифицированными боковыми цепями с соответствующими функциональными группами. Аминокислотами также являются Ό- и Ь-стереоизомеры аминокислоты, если структура этой аминокислоты позволяет образовывать такие стереоизомерные формы. Термин дипептид означает две или более аминокислот, присоединенных друг к другу. Предпочтительными дипептидами являются две аминокислоты, соединенные пептидной связью. Особенно предпочтительными дипептидами являются, например, аланиналанин и глицин-аланин.

Следует отметить, что структура некоторых соединений этого изобретения включает асимметрические атомы углерода. Следует также отметить, что в объем настоящего изобретения, если это не оговорено особо, входят изомеры, образующиеся в результате такой асимметрии (например, все энантиомеры и диастереомеры). Такие изомеры могут быть получены, в основном, в чистом виде классическими методами разделения и стереохимически регулируемого синтеза.

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям для лечения состояний, отвечающих на Ν-6-замещенный 7деазапурин у млекопитающих, например, респираторных заболеваний (например, астмы, бронхита, хронической обструктивной болезни легких и аллергического ринита), почечных заболеваний, желудочно-кишечных заболеваний и глазных болезней. Эта фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество Ν-6-замещенного 7-деазапурина, описанного выше, и фармацевтически приемлемый носитель. Следует отметить, что все деазапурины, описанные выше, предназначены для терапевтического лечения. Кроме того, следует отметить, что деазапурины настоящего изобретения могут быть использованы как отдельно, так и в комбинации с другими деазапуринами настоящего изобретения, либо в комбинации со вспомогательными терапевтическими соединениями, такими как, например, антибиотики, противовоспалительные средства или противораковые средства.

Термин антибиотик понятен специалисту и означает вещества, продуцируемые путем культивирования микроорганизмов, и их синтетические производные, которые предотвращают или ингибируют рост патогенов и обладают избирательной токсичностью по отношению к патогенам, но которые, при этом, оказывают минимальное воздействие или не оказывают негативного воздействия на организм инфицированного хозяина. Подходящими примерами антибиотиков являются, но не ограничиваются ими, основные классы аминогликозидов, цефалоспоринов, хлорамфениколов, фусидных кислот, макролидов, пенициллинов, полимиксинов, тетрациклинов и стрептомицинов.

Термин противовоспалительное средство понятен специалистам и означает агенты, действующие на определенные механизмы в организме хозяина без какого-либо прямого антагонизирующего действия на этиологический фактор воспаления, такие как глюкокортикостероиды, аспирин, ибупрофен, НСПВС и т.п.

Термин противораковое средство понятен специалисту и означает агенты, которые способствуют уменьшению или уничтожению опухоли или предупреждению роста раковых клеток, предпочтительно, не оказывая неблагоприятного действия на другие физиологические функции. Характерными примерами являются цисплатин и циклофосфамид.

Если соединения настоящего изобретения вводят в виде фармацевтических препаратов человеку или млекопитающему, то они могут быть введены как таковые, либо в виде фармацевтической композиции, содержащей, например, 0,1-99,5 % (более предпочтительно 0,5-90%) активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

Используемый здесь термин фармацевтически приемлемый носитель означает фармацевтически приемлемый материал, композицию или носитель, такой как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, носитель, растворитель или инкапсулирующий материал, обеспе чивающий доставку или транспорт соединения(й) настоящего изобретения в данный участок или к данному участку организма, так, чтобы он мог осуществлять нужную функцию. В основном, такие соединения переносятся или транспортируются от одного органа или части тела к другому органу или части тела. Каждый носитель должен быть приемлемым в том смысле, что он должен быть совместимым с другими ингредиентами данной композиции и не должен оказывать негативного воздействия на пациента. Некоторыми примерами материалов, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей, являются сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлоза и ее производные, такие как натрийсодержащая карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетатцеллюлозы; порошкообразный трагакант; солод; желатин; тальк; наполнители, такие как масло-какао и воски для суппозиториев; масла, такие как арахисовое масло, масло семян хлопчатника, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; гликоли, такие как пропиленгликоль; полиолы, такие как глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; забуферивающие агенты, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновая кислота; апирогенная вода; изотонический физиологический раствор; раствор Рингера; этиловый спирт; фосфатно-буферные растворы и другие нетоксичные совместимые вещества, применяемые в фармацевтических композициях.

Как описано выше, некоторые варианты соединений настоящего изобретения могут включать основную функциональную группу, такую как амино или алкиламино, а поэтому они способны образовывать фармацевтически приемлемые соли с фармацевтически приемлемыми кислотами. Термин фармацевтически приемлемые соли в этом аспекте означает относительно нетоксичные аддитивные соли соединений настоящего изобретения, образованные неорганическими или органическими кислотами. Эти соли могут быть получены ίη κίΐιι в процессе конечного выделения и очистки соединений настоящего изобретения, либо посредством отдельной реакции очищенного соединения настоящего изобретения в его свободной основной форме с подходящей органической или неорганической кислотой и выделения полученной таким образом соли. Характерными солями являются гидробромид, гидрохлорид, сульфат, бисульфат, фосфат, нитрат, ацетат, валерат, олеат, пальмитат, стеарат, лаурат, бензоат, лактат, фосфат, тозилат, цитрат, малеат, фумарат, сукцинат, тартрат, нафтилат, мезилат, глюкогептонат, лактобионат и лаурилсульфонат и т.п. (См. например, В с где с1 а1.

(1977) Р11агтасеибса1 8а11к, ГРйагт. 8сг 66:119).

В других случаях, соединения настоящего изобретения могут содержать одну или несколько кислотных функциональных групп и таким образом, они обладают способностью образовывать фармацевтически приемлемые соли с фармацевтически приемлемыми основаниями. В этих случаях, термин фармацевтически приемлемые соли означает относительно нетоксичные аддитивные соли соединений настоящего изобретения, образованные с неорганическими или органическими основаниями. Эти соли могут быть получены ίη кби в процессе конечного выделения и очистки соединений настоящего изобретения, либо посредством отдельной реакции очищенного соединения настоящего изобретения в его свободной кислотной форме с подходящим основанием, таким как гидроксид, карбонат или бикарбонат фармацевтически приемлемого катиона металла, с аммиаком или с фармацевтически приемлемым органическим первичным, вторичным или третичным амином. Характерными солями щелочных или щелочно-земельных металлов являются соли лития, натрия, калия, кальция, магния, алюминия и т. п. Характерными органическими аминами, которые могут быть использованы для образования основно-аддивных солей являются этиламин, диэтиламин, этилендиамин, этаноламин, диэтаноламин, пиперазин и т.п.

Термин фармацевтически приемлемые сложные эфиры означает относительно нетоксичные этерифицированные продукты соединений настоящего изобретения. Эти сложные эфиры могут быть получены ίη κίΐιι в процессе конечного выделения и очистки соединений настоящего изобретения, либо посредством отдельной реакции очищенного соединения настоящего изобретения в его свободной кислотной форме или в форме гидроксила с подходящим этерифицирующим агентом. Карбоновые кислоты могут быть превращены в сложные эфиры путем обработки спиртом в присутствии катализатора. Гидроксилсодержащие производные могут быть превращены в сложные эфиры путем обработки этерифицирующим агентом, таким как алканоилгалогениды. Этот термин, кроме того, означает низшие углеводородные группы, способные подвергаться сольватации в физиологических условиях, например, алкиловые сложные эфиры, метиловые, этиловые и пропиловые сложные эфиры (см., например, Вегде е1 а1., см. выше).

В настоящем изобретении, кроме того, рассматривается использование пролекарств, которые превращаются ίη у1уа в терапевтические соединения настоящего изобретения (см., например, Ρ.Β.8ί1\ΌΓΐη;·ιη. 1992, Тйе Огдашс СйетШгу о£ Эгид Эе^ди алб Эгид Ас1юп, Асабетю Ргекк, Сйр.8). Такие пролекарства могут быть использованы для модификации биологи ческого распределения (например, соединений, которые обычно не должны входить в реакционный сайт протеазы) или фармакокинетики терапевтического соединения. Так, например, карбоновокислотная группа может быть этерифицирована, например, метильной группой или этильной группой с образованием сложного эфира. При введении этого сложного эфира индивидууму, указанный сложный эфир подвергается ферментативному или неферментативному, восстановительному или гидролитическому расщеплению с образованием анионной группы. Анионная группа может быть этерифицирована группами (например, ацилоксиметиловыми сложными эфирами), отщепляемыми с образованием промежуточного соединения, которое затем разлагается с образованием активного соединения. В другом варианте осуществления изобретения, указанное пролекарство представляет собой восстановленную форму сульфата или сульфоната, например, тиол, который окисляется ίη νίνο с образованием терапевтического соединения. Кроме того, анионная группа может быть этерифицирована с образованием группы, которая активно транспортируется ίη νίνο, или которая избирательно поглощается органамимишенями. Этот сложный эфир может быть выбран так, чтобы он обеспечивал специфическую доставку терапевтических молекул в конкретные реакционные сайты, описанные ниже для молекул носителя.

В этих композициях могут также присутствовать смачивающие агенты, эмульгаторы и замасливатели, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красители, высвобождающие агенты, агенты для нанесения покрытия, подсластители, отдушки и ароматизаторы, консерванты и антиоксиданты.

Примерами фармацевтически приемлемых антиоксидантов являются: водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфат натрия, сульфит натрия и т.п.; растворимые в масле антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфатокоферол и т.п.; и агенты, образующие хелатные комплексы с металлами, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ΕΌΤΑ), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и т. п.

Композициями настоящего изобретения являются композиции, подходящие для перорального, назального, местного, чрескожного, трансбуккального, подъязычного, ректального, вагинального и/или парентерального введения. Эти композиции могут, в основном, присутствовать в виде разовой лекарственной формы и могут быть получены любыми методами, хорошо известными специалистам-фармацевтам. Количеством активного ингредиента, которое может быть объединено с материаломносителем с получением разовой дозы, обычно является такое количество соединения, которое необходимо для достижения терапевтического эффекта. В основном, исходя из массы всей композиции, составляющей 100%, это количество составляет в пределах от около 1% до около 99% активного ингредиента, предпочтительно, от около 5% до около 70%, а наиболее предпочтительно, от около 10% до около 30% активного ингредиента.

Способы получения этих фармацевтических препаратов или композиций включают стадии объединения соединения настоящего изобретения с указанным носителем и, необязательно, с одним или несколькими дополнительными ингредиентами. В основном, эти композиции получают путем однородного и равномерного смешивания соединения настоящего изобретения с жидкими носителями или с тонкодисперсными твердыми носителями, либо с теми и другими носителями, и, если это необходимо, с последующим приданием нужной формы этому продукту.

Композиции настоящего изобретения, подходящие для перорального введения, могут быть изготовлены в форме капсул, облаток, драже, таблеток, пастилок (с использованием ароматизирующей основы, обычно, сахарозы, аравийской камеди или трагакантовой камеди), порошков, гранул, либо в виде раствора или суспензии в водной и безводной жидкости, либо в виде жидкой эмульсии типа масло в воде или вода в масле, либо в виде эликсира или сиропа, либо в виде пастилок (с использованием инертной основы, такой как желатин и глицерин или сахароза и аравийская камедь) и/или в виде жидкости для полоскания рта и т. п., каждая из которых содержит предварительно определенное количество соединения настоящего изобретения в качестве активного ингредиента. Соединение настоящего изобретения может быть также введено в виде болюса, лекарственной кашки или пасты.

В твердых лекарственных формах настоящего изобретения для перорального введения (капсулах, таблетках, пилюлях, драже, порошках, гранулах и т.п.), активный ингредиент смешивают с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, такими как цитрат натрия или дикальцийфосфат, и/или с любым из следующих носителей или добавок, таких как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и/или кремниевая кислота; связующие, такие как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и/или аравийская камедь; увлажнители, такие как глицерин; дезинтегрирующие агенты, такие как агар-агар, карбонат кальция, картофельный крахмал или крахмал тапиоки, альгиновая кислота, некоторые силикаты и карбонат натрия; ингибиторы растворения, такие как парафин; ускорители абсорбции, такие как соединения четвертичного аммония; смачивающие агенты, такие как, например, цетиловый спирт и моностеарат глицерина; абсорбенты, такие как каолиновая и бентонитовая глины; замасливатели, такие как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия и их смеси; и красители. В случае капсул, таблеток и драже, фармацевтические композиции могут также содержать забуферивающие агенты. Твердые композиции аналогичного типа могут быть также введены в качестве наполнителей в мягкие и жесткие желатиновые капсулы с использованием таких носителей, как лактоза или молочные сахара, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и т. п.

Таблетки могут быть изготовлены путем прессования или формования, необязательно, с одним или несколькими вспомогательными ингредиентами. Спрессованные таблетки могут быть получены с использованием связующего (например, желатина или гидроксипропилметилцеллюлозы), замасливателя, инертного разбавителя, консерванта, дезинтегрирующего агента (например, натрийсодержащего гликолята крахмала или структурированной натрийсодержащей карбоксиметилцеллюлозы), поверхностно-активного вещества или диспергирующего агента. Сформованные таблетки могут быть изготовлены путем формования смеси порошкообразного соединения, увлажненной инертным жидким разбавителем, в соответствующем устройстве.

Таблетки и другие твердые лекарственные формы фармацевтических композиций настоящего изобретения, такие как драже, капсулы, пилюли и гранулы, могут быть, но не обязательно, сделаны с насечками, или на них могут быть нанесены покрытия и оболочки, такие как солюбилизированные покрытия и другие покрытия, хорошо известные специалистамфармацевтам. Для медленного или регулируемого высвобождения активного ингредиента настоящего изобретения, эти композиции могут быть также изготовлены, например, с использованием гидроксипропилметилцеллюлозы в различных соотношениях с получением нужного профиля высвобождения, других полимерных матриц, липосом и/или микросфер. Они могут быть стерилизованы, например, путем фильтрации через удерживающий бактерии фильтр, или путем введения стерилизующих агентов в форме стерильных твердых композиций, которые, непосредственно перед их использованием, могут быть растворены в стерильной воде или в некоторой другой стерильной среде для инъекций. Эти композиции могут быть также, но необязательно, содержать агенты, придающие непрозрачность, и они могут быть изготовлены в виде композиций, которые высвобождают активный(е) ингредиент(ы) только, или предпоч тительно, в определенной области желудочнокишечного тракта, необязательно в пролонгированном режиме. Примерами инкапсулированных композиций, которые могут быть использованы, являются полимерные вещества и воски. Активный ингредиент может также присутствовать в микроинкапсулированной форме, если это необходимо, в сочетании с одним или несколькими из вышеуказанных наполнителей.

Жидкими лекарственными формами для перорального введения соединений настоящего изобретения являются фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. Помимо активного ингредиента, жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые специалистами, такие как, например, вода и другие растворители, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, |,3-бутиленгликоль, масла (в частности, масло из семян хлопчатника, арахисовое масло, кукурузное масло, масло зародышей семян, оливковое масло, касторовое масло и кунжутное масло), глицерин, тетрагидрофуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот и сорбитана, и их смеси.

Помимо инертных разбавителей, пероральные композиции могут также включать адъюванты, такие как смачивающие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты, подслащивающие агенты, ароматизаторы, красители, отдушки и консерванты.

Суспензии, помимо активных соединений, могут содержать суспендирующие агенты, такие как, например, этоксилированные изостеариловые спирты, полиоксиэтиленсорбит и сложные эфиры сорбитана, микрокристаллическую целлюлозу, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант и их смеси.

Препараты фармацевтических композиций настоящего изобретения для ректального или вагинального введения могут быть изготовлены в форме суппозиториев, которые могут быть получены путем смешивания одного или нескольких соединений настоящего изобретения с одним или несколькими подходящими нераздражающими наполнителями или носителями, содержащими, например, масло какао, полиэтиленгликоль, воск для суппозиториев или салицилат, и которые являются твердыми при комнатной температуре, и жидкими при температуре тела, а следовательно, они будут расплавляться в прямой кишке и во влагалище с высвобождением активного соединения.

Препаратами настоящего изобретения, подходящими для вагинального введения, также являются пессарии, тампоны, кремы, гели, пасты, пены или спреи, содержащие указанные но сители, и такие препараты хорошо известны специалистам.

Лекарственными формами для местного или чрескожного введения соединения настоящего изобретения являются порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и ингаляторы. Активное соединение может быть смешано в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и с любыми необходимыми консервантами, буферами или пропеллентами.

Мази, пасты, кремы и гели, помимо активного соединения настоящего изобретения, могут содержать наполнители, такие как животные и растительные жиры, масла, воски, парафины, крахмал, трагакантовую камедь, производные целлюлозы, полиэтиленгликоли, силиконы, бентониты, кремниевую кислоту, тальк и окись цинка или их смеси.

Порошки и спреи, помимо соединения настоящего изобретения, могут содержать наполнители, такие как лактоза, тальк, кремниевая кислота, гидроксид алюминия, силикаты кальция и полиамидный порошок или смеси этих веществ. Спреи могут, кроме того, содержать стандартные пропелленты, такие как хлорфторуглеводороды и летучие незамещенные углеводороды, такие как бутан и пропан.

Пластыри для чрескожного введения имеют дополнительные преимущества, заключающиеся в том, что они обеспечивают регулируемую доставку соединения настоящего изобретения в организм. Такие лекарственные формы могут быть изготовлены путем растворения или диспергирования этого соединения в подходящей среде. Для увеличения скорости прохождения данного соединения через кожу могут быть также использованы усилители абсорбции. Скорость такого прохождения может регулироваться либо путем использования скоростьрегулирующей мембраны, либо путем диспергирования активного соединения в полимерной матрице или геле.

Офтальмические препараты, глазные мази, порошки, растворы и т.п. также входят в объем настоящего изобретения. Таким фармацевтическим препаратом, предпочтительно, является офтальмическая готовая препаративная форма (например, готовая препаративная форма для инъекций в окологлазную, ретробульбарную или внутриглазную область, готовая препаративная форма для системного введения или хирургический раствор для промывания).

Офтальмические композиции настоящего изобретения могут включать один или несколько деазапуринов и фармацевтически приемлемый носитель. При этом, могут быть использованы различные типы носителей. Эти носители, по своей природе, обычно являются водными. В основном, предпочтительными являются водные растворы, полученные на основе композиции, а также с тем расчетом, чтобы эти компо зиции можно было легко закапывать пациенту по одной или две капли в пораженные глаза. Однако деазапурины настоящего изобретения могут быть также легко введены в композиции других типов, таких как суспензии, вязкие или полувязкие гели, либо твердые или полутвердые композиции других типов. Офтальмические композиции настоящего изобретения могут также включать другие различные ингредиенты, такие как буферы, консерванты, сорастворители и агенты, придающие вязкость.

Для предупреждения изменения рН в условиях хранения, могут быть добавлены соответствующие буферные системы (например, фосфат натрия, ацетат натрия или борат натрия).

Офтальмические продукты обычно упаковывают в упаковки для многоразового использования. А поэтому, для предупреждения микробного заражения в процессе использования, необходимо добавлять консерванты. Подходящими консервантами являются хлорид бензалкония, тимерозал, хлорбутанол, метилпарабен, пропилпарабен, фенилэтиловый спирт, динатрийэдетат, сорбиновая кислота, поликватерний1 или другие агенты, известные специалистам. Такие консерванты обычно используются в количестве от около 0,001 до 1,0% мас./об.(% мас./об.).

Если деазапурины настоящего изобретения вводят в процессе внутриглазных хирургических операций, таких как инъекция в ретробульбарную или окологлазную область и перфузия или инъекция во внутриглазную область, то, в качестве носителей, наиболее предпочтительным является использование сбалансированных физиологических растворов для промывания. Примерами сбалансированных физиологических растворов для промывания являются стерильные промывочные растворы В88® и стерильные промывочные растворы В 88 Р1ик® для внутриглазного введения (А1соп ЬаЬогаЮпск. Шс., Рой \УоП11. Тех.И8А). Последний из указанных типов растворов описан в патенте США № 4550022 (СагаЬеФап, с1 а1.), полное содержание которого вводится в настоящее описание посредством ссылки. Инъекции в ретробульбарную и окологлазную области известны каждому специалисту и описаны во многих публикациях, включая, например, ОрЫНаШис 8игдегу: Рпар1ек о£ Ргасйсе, Еб., С.Е 8рае111. XV.В. 8апбегк Со., РЫ1абе1рЫа, Ра., И8А, радек 85-87 (1990).

Как указано выше, использование деазапуринов для предупреждения или снижения поражения тканей сетчатки и диска зрительного нерва на клеточном уровне является наиболее важным аспектом одного из вариантов осуществления настоящего изобретения. Глазными болезнями, которые могут быть подвергнуты лечению, являются, но не ограничиваются ими, ретинопатия, дегенерация желтого пятна, ишемия глаза, глаукома и поражения, ассоциированные с повреждениями глазных тканей, такие как повреждения в результате реперфузии при ишемии, фотохимические повреждения и повреждения, ассоциированные с хирургией глаза, а в частности, повреждения сетчатки или диска зрительного нерва под действием светового излучения или хирургических инструментов. Эти соединения могут быть также использованы в качестве вспомогательного средства для хирургии глаза, такой как инъекция в стекловидное тело или в субконъюктиву глаза после хирургии глаза. Эти соединения могут быть использованы для экспресс-лечения преходящих состояний, либо они могут вводиться непрерывно при дегенеративных заболеваниях. Эти соединения могут быть также использованы в профилактических целях, а в частности, перед проведением хирургической операции на глазах или неинвазивных офтальмических процедурах или хирургии других типов.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения, подходящие для парентерального введения, содержат одно или более соединений настоящего изобретения в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми стерильными изотоническими водными или безводными растворами, дисперсиями, суспензиями или эмульсиями, или со стерильными порошками, которые, непосредственно перед их использованием, могут быть превращены в стерильные растворы или дисперсии для инъекций, и которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты, растворенные вещества, которые придают им изотоничность по отношению к крови данного реципиента, или суспендирующие или загущающие агенты.

Примерами подходящих водных или безводных носителей, которые могут быть использованы в фармацевтических композициях настоящего изобретения, является вода, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.), и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. При этом, может поддерживаться соответствующая текучесть, например, путем использования материалов для покрытия, таких как лецитин, путем поддержания нужного размера частиц в случае дисперсий и путем использования поверхностно-активных веществ.

Эти композиции могут также содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульгирующие агенты и диспергирующие агенты. Для предохранения от действия микроорганизмов, в композиции могут быть включены различные антибактериальные и противогрибковые агенты, например, парабен, хлорбутанол, фенолсорбиновая кислота и т. п. Может также оказаться желательным включить в данные композиции изотонические агенты, такие как сахара, хлорид натрия и т. п. Кроме того, пролонгированная абсорбция инъецируемой фармацевтической формы может быть достигнута благодаря включению агентов, обеспечивающих замедленную абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин.

В некоторых случаях, для достижения пролонгированного действия лекарственного средства, желательно замедлить абсорбцию лекарственного средства после подкожной или внутримышечной инъекции. Это может быть осуществлено благодаря использованию жидкой суспензии кристаллического или аморфного материала, имеющего плохую растворимость в воде. Следовательно, скорость абсорбции лекарственного средства зависит от скорости его растворения, которая, в свою очередь, может зависеть от размера кристаллов и кристаллической формы. Альтернативно, замедленная абсорбция вводимой парентерально лекарственной формы достигается путем растворения или суспендирования лекарственного средства в масляном носителе.

Депоформы для инъекций изготавливают путем формирования вводимых в микрокапсулы матриц, в которых данные соединения включены в биологически разлагаемые полимеры, такие как полилактид-полигликолид. Скорость высвобождения лекарственного средства может регулироваться в зависимости от отношения количества лекарственного средства к количеству полимера и от природы конкретно используемого полимера. Примерами других биологически разлагаемых полимеров являются поли(ортоэфиры) и поли(ангидриды). Композиции для инъекций в виде депоформ также изготавливают путем введения лекарственного средства в липосомы или микроэмульсии, совместимые с тканями организма.

Препараты настоящего изобретения могут быть введены перорально, парентерально, местно или ректально. Разумеется, они должны быть изготовлены в форме, подходящей для каждого способа введения. Так, например, они могут быть введены в виде таблеток или капсул путем инъекции, ингаляции, примочек для глаз или мази, или в виде суппозиториев путем ректального введения. При этом, предпочтительным является пероральное введение.

Используемые здесь термины парентеральное введение и введенный парентерально означают другие способы введения, отличающиеся от введения вовнутрь или местно, а обычно, они означают способы введения путем инъекции, которыми являются, но не ограничиваются ими, внутривенная, внутримышечная, внутриартериальная, внутриоболочечная, внутрикапсулярная, внутриглазная, внутрисердечная, чрезкожная, внутрибрюшинная, транстрахеальная, подкожная, субкутикулярная (через подкожный слой), интраартикулярная, субкап сулярная, субарахноидальная, интраспинальная и внутригрудинная инъекция и инфузия.

Используемые здесь термины системное введение, введенный системно, периферическое введение и введенный периферически означают такое введение соединения, лекарственного средства или другого материала, при котором не происходит прямой доставки в центральную нервную систему, но при котором это лекарственное средство поступает в организм пациента и, тем самым, подвергается метаболизму и другим аналогичным процессам, например, подкожное введение.

Указанные соединения могут быть введены человеку и другому животному, подвергаемому лечению, любым подходящим способом введения, включая пероральное; интраназальное, например, в виде спрея; ректальное; вагинальное; парентеральное; интрацистернальное или местное введение, например, в виде порошков, мазей или капель, включая трансбуккальное и сублингвальное введение.

Независимо от выбранного способа лечения, соединения настоящего изобретения, которые могут быть использованы в подходящей гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции настоящего изобретения изготавливают в виде фармацевтически приемлемых лекарственных форм стандартными методами, известными специалистам.

Конкретные дозы активных ингредиентов в фармацевтических композициях настоящего изобретения могут варьироваться в зависимости от эффективного количества активного ингредиента, необходимого для достижения нужного терапевтического ответа у данного пациента, от композиции и от способа введения, и не оказывают токсического действия на пациента.

Выбранная доза будет зависеть от ряда факторов, включая активность конкретно используемого соединения настоящего изобретения или его сложного эфира, соли или амида, способ введения, время введения, скорость высвобождения конкретно используемого соединения, продолжительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, используемые в комбинации с данным соединением, возраст, пол, вес, заболевание, общее состояние и историю болезни пациента, подвергаемого лечению, и также от других факторов, хорошо известных специалистам.

Средний специалист, врач или ветеринар, может легко определить и прописать эффективное количество требуемой фармацевтической композиции. Так, например, врач или ветеринар может начать с более низких доз соединений настоящего изобретения, присутствующих в данной фармацевтической композиции, чем это требуется для достижения желаемого терапевтического эффекта, а затем постепенно увеличивать дозу вплоть до достижения нужного эффекта.

В основном, подходящей суточной дозой соединения настоящего изобретения может быть такое количество данного соединения, которое является самой низшей дозой, эффективной для продуцирования терапевтического эффекта. Такая эффективная доза будет, в основном, зависеть от факторов, описанных выше. В основном, дозы соединений настоящего изобретения для внутривенного и подкожного введения пациенту составляют в пределах от около 0,0001 до около 200 мг на килограмм веса тела в день, более предпочтительно, от около 0,01 до около 150 мг на килограмм веса тела в день, а еще более предпочтительно, от около 0,02 до около 140 мг на килограмм веса тела в день.

Если необходимо, то эффективная суточная доза активного соединения может быть введена в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или более дробных доз отдельно через соответствующие интервалы времени в течение дня, и необязательно в виде разовых лекарственных форм.

Хотя соединение настоящего изобретения может быть введено отдельно, однако, предпочтительно, чтобы оно было введено в виде фармацевтической композиции.

Настоящее изобретение также относится к упакованным фармацевтическим композициям для лечения состояния, отвечающего на Ν-6замещенный 7-деазапурин, например, нежелательного увеличения активности аденозиновых рецепторов у млекопитающего. Эти упакованные фармацевтические композиции включают контейнер, содержащий терапевтически эффективное количество, по крайней мере, один деазапурин, описанный выше, и инструкции по применению указанного деазапурина, используемого для лечения состояния, отвечающего на деазапурин, у млекопитающего.

Деазапурины настоящего изобретения могут быть получены стандартными методами органического синтеза. Деазапурины могут быть очищены с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ, хроматографии, перекристаллизации и т. п., и их структуры подтверждаются массспектральным анализом, элементным анализом, ИК- и/или ЯМР-спектроскопией.

Обычно синтез промежуточных соединений, а также деазапуринов настоящего изобретения осуществляют в растворе. Добавление и удаление одной или нескольких защитных групп также являются обычной практикой и хорошо известны специалистам. Типичные схемы синтеза для получения промежуточных соединений деазапурина настоящего изобретения описаны ниже в схеме I.

Настоящее изобретение, кроме того, проиллюстрировано нижеследующими примерами, которые не должны рассматриваться как ограничение настоящего изобретения. Содержание всех работ, рассматриваемых патентных заявок и опубликованных патентных заявок, цитируе мых в настоящей заявке, включая и те работы, которые указаны в разделе Предпосылки создания изобретения, вводится в настоящее описание посредством ссылки. При этом, следует отметить, что модели, используемые в примерах, являются общепринятыми моделями, и что иллюстрация эффективности с использованием этих моделей позволяет прогнозировать эффективность для человека.

Деазапурины настоящего изобретения могут быть получены стандартными методами органического синтеза. Деазапурины могут быть очищены с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ, хроматографии, перекристаллизации и т.п., и их структуры могут быть подтверждены масс-спектральным анализом, элементным анализом, ИК- и/или ЯМР-спектроскопией.

Обычно, синтез промежуточных соединений, а также деазапуринов настоящего изобретения осуществляют в растворе. Добавление и удаление одной или нескольких защитных групп также является обычными процедурами и хорошо известны специалистам. Типичные схемы синтеза для получения промежуточных соединений деазапурина настоящего изобретения описаны ниже в схеме I.

Схема I

где Κ₃, Κ₅ и Κ₆ определены выше.

В основном, защищенный 2-амино-3цианопиррол может быть обработан ацилгалогенидом с получением карбоксиамидо-3-цианопиррола, который может быть обработан подкисленным метанолом для закрытия кольца с образованием пирроло [2,36] пиримидина-4(3 Н)она (Ми11ег, С.Е. е1 а1., ЬМеб.СНет. 40:4396(1997)). Удаление пирролозащитной группы с последующей обработкой хлорирующим реагентом, например, оксихлоридом фосфора, приводит к образованию замещенных или незамещенных 4-хлор-7Н-пирроло-[2,36]пиримидинов. В результате обработки хлорпиримидина аминами получают 7-деазапурины.

Так, например, как показано в схеме I, Ν(1-61-фенилэтил)-2-амино-3-цианопиррол обрабатывают ацилгалогенидом в пиридине или дихлорметане. Полученный №(1-61-фенилэтил)-2фенилкарбоксиамидо-3 -цианопиррол обрабаты вают смесью (10:1) метанола/серной кислоты для закрытия кольца с получением 61-7Н-7-(1фенилэтил) пирроло [2,36] пиримидина-4(3 Н)она. В результате удаления фенилэтильной группы путем обработки пиримидина полифосфорной кислотой (РРА), а затем РОС1₃, получают ключевое промежуточное соединение 4хлор-7Н-пирроло[2,36]пиримидина. После обработки 4-хлор-7Н-пирроло[2,36]пиримидина различными аминами, указанными в табл. 1, получают соединения формулы (I) и (II).

Таблица 1

К.	м++н	Я	м++н
Ло	343.2	о ны-/	351.27
Х~о	343.18		430.35
ίο	337.21	он сЛх	359.44
Чо Н	364.19	Л,	404.32

	330.18	ТО Ν	330.45
	347.22	Η ΗΟ^	339.47
это '--/ \—ΝΗ	350.28		353.41
ί Ύ 4-	344.19	Ο	324.45
χ'Ό'Λ	394.16		359.38
X	371.12	ГТОЛ то	379.40
он	359.39		387.41
σ4-	403.33	ТО	344.48
ΝΗΙ 4 он	351.49	X но —	337.53

	330.37	У	295.2
О	407.23		321.2
	355.45	Αχ,	337.53
	441.33	/Л н	350.2
	413.24		343.2
н	372.48	Со н	373.2
		χθ	3072

Общий способ получения 6-замещенных пирролов проиллюстрирован на нижеследующей схеме (схема II).

Схема II

_н

где В₁ - В₅ определены выше.

В результате переэтерификации и алкилирования этилцианоацетата α-галогенкетоном получают кетометиловый эфир. После проведения реакции защиты кетона с последующей обработкой гидрохлоридом амидина (напр., алкил-, арил- или алкилариламидина) получают пиримидин, защищенный путем превращения в кеталь. После удаления защитной группы с последующей циклизацией и обработкой оксихлоридом фосфора получают хлоридное промежуточное соединение, которое может быть затем обработано амином с получением амин-6-замещенного пиррола. Кроме того, алкилирование пиррола у атома азота может быть достигнуто в условиях, известных специалисту.

Общий способ получения 5-замещенных пирролов проиллюстрирован в нижеследующей схеме (схема III).

где В₁-В₆ определены выше, а В представляет собой удаляемую защитную группу.

В результате конденсации малононитрила и избытка кетона с последующим бромированием этого продукта получают смесь исходного материала, монобромированного и дибромированного продуктов, которую затем обрабатывают алкиламином, ариламином или алкилариламином. Полученный аминовый продукт ацилируют хлорангидридом, и этот моноацилированный пиррол циклизуют в присутствии кислоты с получением соответствующего пиримидина. Пирролзащитную группу удаляют с использованием полифосфорной кислоты и обрабатывают оксихлоридом фосфора с получением хлорированного продукта. Этот хлорированный пиррол может быть затем обработан амином с получением амино-5-замещенного пиррола. Алкилирование пиррола у атома азота может быть проведено в условиях, известных специалисту.

На схемах IV и V проиллюстрированы способы получения деазапуринов 1 и 2 настоящего изобретения.

где В₅ и В₆ являются такими, как они были определены выше, например, СН3.

Конкретный пример получения 6метилпирролопиримидинов

Ключевой реакцией получения 6-метилпирролопиримидинов (1) [В₅ = СН₃] является реакция циклизации цианоацетата с бензамидином с образованием пиримидина. Очевидно, что метилцианоацетат должен циклизоваться с бензамидином с образованием пиримидина более эффективно, чем соответствующий этиловый эфир. Поэтому, в результате переэтерификации и алкилирования этилцианоацетата в присутствии ЫаОМе и избытка α-галогенацетильной группы, например, хлорацетона, получали нужный метиловый сложный эфир (3) с выходом 79% (схема IV). Сложный кетоэфир (3) был защищен в виде ацеталя (4) с выходом 81%. Новый способ циклизации для получения пирими дина (5) проводили с гидрохлоридом амидина, например, гидрохлоридом бензамидина и с 2 эквивалентами ΌΒυ, в результате чего был получен пиримидин 5 с выходом 54%. Этот способ позволяет увеличить выход от 20% и более с использованием описанных в литературе условий, которые предусматривают использование ЫаОМе в процессе циклизации с гуанидином. Циклизация с образованием пирролпиримидина (6) достигается путем удаления ацеталевой группы в водном НС1 с выходом 78%. В результате реакции соединения (6) с оксихлоридом фосфора при нагревании с обратным холодильником получали соответствующее 4-хлорпроизводное (7). В результате реакции взаимодействия с транс-4-аминоциклогексанолом в диметил-сульфоксиде при 135°С получали соединение (1) с выходом 57% исходя из соединения (7). Каждому специалисту очевидно, что выбор реагентов дает большую свободу в выборе нужного заместителя Я5.

Схема IV

Конкретный пример получения 5метилпирролопиримидинов

В результате конденсации 1<пое\^гепде1 малононитрила и избытка кетона, например ацетона в кипящем бензоле, после дистилляции получали соединение 8 с выходом 50%. В результате бромирования соединения 8 Ν-бромсукцинимидом в присутствии бензоилпероксида в хлороформе, после дистилляции, получали смесь исходного материала, моно- (9) и дибромированных продуктов (5/90/5) (70%). Эту смесь подвергали реакции с α-метилалкиламином или α-метилариламином, например, α-метилбензиламином, в результате чего получали аминопиррол (10). После пропускания через короткую колонку с силикагелем, частично очищенный амин (выход 31%) ацилировали хлорангидридом, например, бензоилхлоридом, с получением моно-(11) и диацилированных (12) пирролов, которые были разделены с помощью флэшхроматографии. После кислотного гидролиза дизамещенного пиррола (12) получали ацилпиррол (11) с суммарным выходом 29%. В результате циклизации в присутствии концентрированной серной кислоты и ДМФ получали со единение (13) (23%), которое подвергали реакции снятия защиты с использованием полифосфорной кислоты с получением соединения (14). После проведения реакции соединения (14) с оксихлоридом фосфора при нагревании с обратным холодильником получали соответствующее 4-хлор-производное (15). В результате реакции взаимодействия с транс-4-аминоциклогексанолом в диметилсульфоксиде при 135°С получали соединение (2) [Я6 =СН3] из соединения (14) с выходом 30% (см. схему V). Каждому специалисту очевидно, что выбор реагентов дает большую свободу в выборе нужного заместителя Я₆.

Схема V

О

II ΝΟ- -СЫ Ν(Χ -ΟΝ Ν<Ε -ΟΝ — X * =.* *ХС « 9 —- * ΐ—А· —~

Альтернативный способ синтеза Κ₆замещенных пирролов, например, 5метилпирролопиримидинов

Этот альтернативный способ синтеза Я₆замещенных пирролов, например, 5-метилпирролопиримидинов, предусматривает переэтерификацию и алкилирование этилцианоацетата с получением соединения (16) (схема VI). В результате конденсации соединения (16) с гидрохлоридом бензамидина и с 2 эквивалентами ΌΒυ получали пиримидин (17). Циклизация с образованием пиррол-пиримидина (14) достигается путем удаления ацетальной группы в водном НС1. В результате реакции соединения (14) с оксихлоридом фосфора при нагревании с обратным холодильником получали соответствующее 4-хлор-производное (15). В результате реакции взаимодействия с транс-4-аминоциклогексанолом в диметилсульфоксиде при 135°С получали соединение 2. Эта методика позволяет снизить число реакций синтеза целевого соединения (2) с 9 до 4 стадий. При этом, значительно увеличивается выход. Каждому специалисту также очевидно, что выбор реагентов дает большую свободу в выборе нужного заместителя Я6.

Общий способ получения дезметилпиррола проиллюстрирован в нижеследующей схеме (схема VII).

Схема VII

где К4-К3 определены выше.

В результате алкилирования алкилцианоацетата диэтилацеталем в присутствии основания получали цианодиэтилацеталь, который обрабатывали солью амидина с получением ме тилпирролопиримидинового предшественника. Этот предшественник хлорировали и обрабатывали амином с образованием целевого дезме тилпирролопиримидина, показанного выше.

Так, например, на схеме VIII проиллюстрирован синтез соединения (18).

Коммерчески доступный метилцианоацетат алкилировали диэтилацеталем бромацетальдегида в присутствии карбоната калия и Να! с образованием соединения (19). Циклизацию с образованием пиримидина (20) проводили в две стадии. Сначала пиримидинацеталь получали посредством реакции соединения (19) с гидрохлоридом бензамидина и с двумя эквивалентами ΌΒυ. Полученный пиримидинацеталь подвергали реакции снятия защиты без очистки водным 1н. НС1, и полученный альдегид циклизовали с получением пирролпиридина (20) , который выделяли путем фильтрации. После проведения реакции соединения (20) с оксихлоридом фосфора при нагревании с обратным холодильником получали соответствующее 4-хлорпроизводное (21). В результате реакции взаимодействия хлорпроизводного с транс-4-аминоциклогексанолом в ДМСО при 135°С получали соединение (18) из соединения (21).

На схемах П-УШ показано, что в 5- и 6положения пирролпиримидинового кольца могут быть введены функциональные группы. Различные функциональные группы могут быть введены в 5- и 6-положения соединений формулы (I) и (II) путем использования различных исходных реагентов и проведения небольшой модификации в вышеуказанных реакционных схемах. Некоторые примеры представлены в табл. 2.

Таблица 2. Выбранный список 5- и 6замещенных пирролпиримидинов

Исходный реагент	*5	Кб
сг	н	н
С1—/ \=/\3	н	Замещенный Аг
О О	н	СН2С(О)ОСНз
О О С1	С(О)ОСНЗ	СНз
О О έι н	С(О)ИНСНз	снз

Настоящее изобретение, кроме того, проиллюстрировано нижеследующими примерами, которые не должны рассматриваться как ограничение настоящего изобретения. Содержание всех работ, рассматриваемых патентных заявок и опубликованных патентных заявок, цитируемых в настоящей заявке, включая работы, которые указаны в разделе Предпосылки создания изобретения, вводится в настоящее описание посредством ссылки. При этом, следует отметить, что используемые в примерах модели являются общеизвестными моделями, и что иллюстрация эффективности на этих моделях позволяет прогнозировать эффективность для человека.

Примеры

Препаративный пример |.

Использовали модификацию метода алкилирования 8ее1а & Ьирке¹. К охлажденному на льду (0°С) раствору этилцианоацетата (6,58 г, 58,1 ммоль) в МеОН (20 мл) медленно добавляли раствор №1ОМе (25% мас./об.; 58,1 ммоль). Через 10 мин медленно добавляли хлорацетон (5 мл; 62,8 ммоль). Через 4 ч, растворитель удаляли. Коричневое масло разбавляли ЕкОАс (100 мл) и промывали Н₂О (100 мл). Органическую фракцию сушили, фильтровали и концентрировали с получением коричневого масла (7,79 г; 79%). Масло (3) (схема IV) представляло собой смесь продуктов метилового/этилового сложного эфира (9/1), и было использовано без дополнительной очистки.

¹Н-ЯМР (200 МГц, СИС1₃) δ: 4,24 (кв., 1=7,2 Гц, ОСН₂), 3,91 (дд, 1Н, 1=7,2, 7,0 Гц, СН), 3,62 (с, 3Н, ОСН₃), 3,42 (дд, 1Н, 1=15,0, 7,1 Гц, 1 х СН₂); 3,02 (дд, 1Н, 1=15,0, 7,0 Гц, 1 х СН₂); 2,44 (с, 3Н, СН₃), 1,26 (т, 1=7,1 Гц, сложный эфир-СН3).

¹8ее1а, Е & Ьирке и, СЬеш.Вег. 1977, 110, 1462-1469.

Препаративный пример 2.

Использовали методику 8ее1а и Ьирке¹. В результате реакции защиты кетона (3) (схема IV; 5,0 г, 32,2 ммоль) этиленгликолем (4 мл, 64,4 ммоль) в присутствии ТзОН (100 мг) получали соединение (4) в виде масла (схема IV, 5,2 г, 81,0) после флэш-хроматографии (81О₂, 3/7 ЕкОАс/гексан, В_£ 0,35). Остаточное содержание составляло примерно 5% этилового эфира:

¹Н-ЯМР (200 МГц, СИС1₃) δ: 4,24 (кв, 1=7,2 Гц, ОСН2), 3,98 (с, 4Н, 2 х ацеталь-СН2), 3,79 (с, 3Н, ОСН₃), 3,62 (дд, 1Н, 1=7,2, 7,0 Гц, СН), 2,48 (дд, 1Н, 1=15,0, 7,1 Гц, 1 х ОСН₂), 2,32 (дд, 1Н, 1=15,0, 7,0 Гц, 1 х СН₂); 1,35 (с, 3Н, СН₃), 1,26 (т, 1=7,1 Гц, сложный эфир-СН₃); МС (ЭН) (ЭНэлектронапыление): 200,1 (М⁺+1).

¹8ее1а, Е & Ьирке и, СЬеш.Вег. 1977, 110, 1462-1469.

Препаративный пример 3.

Раствор ацеталя (4) (схема IV, 1 г, 5,02 ммоль), бензамидина (786 мг, 5,02 ммоль) и

ИВИ (1,5 мл, 10,04 ммоль) в сухом ДМФ (15 мл) нагревали до 85°С в течение 15 ч. Смесь разбавляли СНС1₃ (30 мл) и промывали 0,5н. №1ОН (10 мл) и Н₂О (20 мл). Органическую фракцию сушили, фильтровали и концентрировали с образованием коричневого масла. Была предпринята попытка проведения флэш-хроматографии (81О₂; 1/9 ЕкОАс/СН₂С1₂, ВТ=0,35), но материал кристаллизовался на колонке. Силикагель промывали МеОН. Фракции, содержащие продукт (5) (схема IV) , концентрировали и использовали без дополнительной очистки (783 мг, 54,3%).

¹Н-ЯМР (200 МГц, СИС1₃) δ: 8,24 (м, 2Н, Аг-Н), 7,45 (м, 3Н, Аг-Н), 5,24 (шир.с., 2Н, ИН₂), 3,98 (с, 4Н, 2 х ацеталь-СН₂), 3,60-3,15 (м, 2Н, СН₂), 1,38 (с, 3Н, СН₃); МС (ЭН): 288,1 (М⁺+1).

Получение соединения (20) (схема VIII): Раствор ацеталя (19)(4,43 г, 20,6 ммоль)¹, гидрохлорида бензамина (3,22 г, 20,6 ммоль) и ЬВЬ (6,15 мл, 41,2 ммоль) в сухом ДМФ (20 мл) нагревали до 85°С в течение пятнадцати часов. Смесь разбавляли 100 мл СНС13 и промывали Н2О (2 х 50 мл). Органическую фракцию сушили, фильтровали и концентрировали с получением темно-коричневого масла. Темно-коричневое масло перемешивали в 1н. НС1 (100 мл) в течение 2 ч при комнатной температуре. Полученную суспензию фильтровали с получением гидрохлоридной соли соединения (20) в виде коричневатого твердого вещества (3,60 г, 70,6%);

¹Н-ЯМР (200 МГц, ДМСО-б₆) δ: 11,92 (с, 1Н), 8,05 (м, 2Н, Аг-Н), 7,45 (м, 3Н, Аг-Н), 7,05 (с, 1Н, пиррол-Н); МС (ЭН): 212,1 (М⁺+1).

Препаративный пример 4.

Раствор ацеталя (5) (700 мг, 2,44 ммоль) в 1 н. НС1 (40 мл) перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Полученную суспензию фильтровали с получением НС1-соли 2фенил-6-метил-7Н-пирроло [2,36] пиримидин-4 (3Н)-она в виде коричневатого твердого вещества (498 мг, 78,0%):

¹Н-ЯМР (200 МГц, ДМСО-б₆) δ: 11,78 (с, 1Н), 8,05 (м, 2Н, Аг-Н), 7,45 (м, 3Н, Аг-Н), 6,17 (с, 1Н, пиррол-Н), 2,25 (с, 3Н, СН₃); МС (ЭН):

226,1 (М⁺+1).

Препаративный пример 5.

Использовали модифицированный метод циклизации СЬеи и др.¹. К охлажденному льдом (0°С) раствору бромида (9) (схема V; 20,0 г, 108 ммоль; 90% чистота) в изопропиловом спирте (60 мл) медленно добавляли раствор α-метилбензиламина (12,5 мл, 97,3 ммоль). Черный раствор оставляли для нагревания до комнатной температуры и перемешивали 15 ч. Смесь разбавляли ЕкОАс (200 мл) и промывали 0,5н. №1ОН (50 мл). Органическую фракцию сушили, фильтровали и концентрировали с получением соединения в виде черного дегтя (19,2 г, 94%).Остаток частично очищали с помощью флэш-хроматографии (81О₂; 4/96 МеОН/СН₂С1₂,

Κί 0,35) и получали соединение 61-1-(1фенилэтил)-2-амино-3-циано-4-метилпиррол в виде черного твердого вещества (6,38 г, 31%). МС (ЭН): 226,1 (М⁺+1).

'Скеп, У.Ь.; МапкЬаск, Κ.8.; \Ут1ег, 8.М.; Вгоокк, Ε.; СоШпк, 1.; Согтап, М.Ь.; Оипаккк, Α.Κ.; Еагас1, ^.8.; баЛакскип, Κ.Ι; 8скт161, А.; 8сйик, ϋ.'Μ. ГМеб.Скет. 1997, 40, 1749-1754.

Препаративный пример 6.

К раствору 61-1-(1-фенилэтил)-2-амино-3циано-4,5-диметилпиррола¹ (14,9 г, 62,5 ммоль) и пиридина (10,0 мл) в дихлорметане (50,0 мл) добавляли бензоилхлорид (9,37 г, 66,7 ммоль) при 0°С. После перемешивания в течение 1 ч при 0°С, для облегчения осаждения продукта добавляли гексан (10,0 мл). Растворитель удаляли в вакууме и твердое вещество перекристаллизовывали из смеси Ε1ΟΗ/Η₂Ο с получением 13,9 г (65%) 61-1-(1-фенилэтил)-2-фенилкарбониламино-3-циано-4,5-диметилпиррола, т.пл. 218-221°С;

Ή-ЯМР (200 МГц, СОС1_;) δ: 1,72 (с, 3Η), 1,76 (д, 1=7,3 Гц, 3Η), 1,98 (с, 3Η), 5,52 (кв, 1=7,3 Гц, 1Н), 7,14-7,54 (м, 9Н), 7,68-7,72 (дд, 1=1,4 Гц, 6,9 Гц, 2Н), 10,73 (с, 1Н); МС (ЭН): 344,4 (М⁺+1).

¹ЫеЬ1дк Апп. СНет. 1986, 1485-1505.

Нижеследующие соединения получали способом, аналогичным описанному в препаративном примере 6.

61-1-(1-Фенилэтил)-2-(3 -пиридил)карбониламино -3 -циано -4,5 -диметилпиррол.

Ή-ЯМР (200 МГц, СОС1_;) δ: 1,83 (д, 1=6,8 Гц, 3Η), 2,02 (с, 3Η), 2,12 (с, 3Η), 5,50 (кв, 1=6,8 Гц, 1Н), 7,14-7,42 (м, 5Н), 8,08 (м, 2Н), 8,75 (м, 3Η); МС (ЭН): 345,2 (М⁺+1).

61-1-(1-Фенилэтил)-2-(2-фурил)карбониламино -3 -циано -4,5 -диметилпиррол.

Ή-ЯМР (200 МГц, (ОСТ) δ: 1,84 (д, 1=7,4 Гц, 3Η), 1,92 (с, 3Η), 2,09 (с, 3Η), 5,49 (кв, 1=7,4 Гц, 1Н), 6,54 (дд, 1=1,8 Гц, 3,6 Гц, 1Н), 7,12-7,47 (м, 7Н); МС (ЭН): 334,2 (М⁺+1), 230,1.

61-1-(1-Фенилэтил)-2-(3 -фурил)карбониламино-3-циано-4,5 -диметилпиррол.

Ή-ЯМР (200 МГц, ГОСТ) δ: 1,80 (д, 1=7 Гц, 3Η), 1,89 (с, 3Η), 2,05 (с, 3Η), 5,48 (кв, 1=7 Гц, 1Н), 6,59 (с, 1Н), 7,12-7,40 (м, 6Н), 7,93 (с, 1Н); МС (ЭН): 334,1 (М⁺+1), 230,0.

61-1-( 1-Фенилэтил)-2-циклопентилкарбониламино -3 -циано -4,5 -диметилпиррол.

Ή-ЯМР (200 МГц, (ОСТ) δ: 1,82 (д, 1=7,4 Гц, 3Η), 1,88 (с, 3Η), 2,05 (с, 3Η), 1,63-1,85 (м, 8Н), 2,63 (м, 1Н), 5,43 (кв, 1=7,4 Гц, 1Н), 6,52 (с, 1Н), 7,05-7,20 (м, 5Н); МС (ЭН): 336,3 (М⁺+1).

61-1-( 1-Фенилэтил)-2-(2-тиенил)карбониламино-3-циано-4,5 -диметилпиррол.

Ή-ЯМР (200 МГц, СОС1_;) δ: 1,82 (д, 1=6, 8 Гц, 3Η), 1,96 (с, 3Η), 2,09 (с, 3Η), 5,49 (кв, 1=6,8 Гц, 1Н), 7,05-7,55 (м, 8Н); МС (ЭН): 350,1 (М⁺+1), 246,0.

61-1-(1-Фенилэтил)-2-(3-тиенил)карбониламино-3-циано-4,5-диметилпиррол.

Ή-ЯМР (200 МГц, СОС1_;) δ: 1,83 (д, 1=7,0 Гц, 3Η), 1,99 (с, 3Η), 2,12 (с, 3Η), 5,49 (кв, 1=7,0 Гц, 1Н), 6,90 (м, 1Н), 7,18-7,36 (м, 6Н), 7,79 (м, 1Н); МС (ЭН): 350,2 (М⁺+1), 246,1.

61-1-(1-Фенилэтил)-2-(4-фторфенил)карбониламино-3-циано-4,5-диметилпиррол.

Ή-ЯМР (200 МГц, СОС1_;) δ: 1,83 (д, 1=7,4 Гц, 3Η), 1,96 (с, 3Η), 2,08 (с, 3Η), 5,51 (кв, 1=7,4 Гц, 1Н), 7,16-7,55 (м, 9Н); МС (ЭН): 362,2 (М⁺+1), 258,1.

61-1-(1-Фенилэтил)-2-(3-фторфенил)карбониламино-3-циано-4,5-диметилпиррол.

Ή-ЯМР (200 МГц, СОС1_;) δ: 1,83 (д, 1=7,4 Гц, 3Η), 1,97 (с, 3Η), 2,10 (с, 3Η), 5,50 (кв, 1=7,4 Гц, 1Н), 7,05-7,38 (м, 7Н), 7,67-7,74 (м, 2Н); МС (ЭН): 362,2 (М⁺+1), 258,1.

61-1-(1-Фенилэтил)-2-(2-фторфенил)карбониламино-3-циано-4,5-диметилпиррол.

Ή-ЯМР (200 МГц, СОС1_;) δ: 1,85 (д, 1=7,2 Гц, 3Η), 1,94 (с, 3Η), 2,11 (с, 3Η), 5,50 (кв, 1=7,2 Гц, 1Н), 7,12-7,35 (м, 6Н), 7,53 (м, 1Н), 7,77 (м, 1Н), 8,13 (м, 1Н); МС (ЭН): 362,2 (М⁺+1), 258,0.

61-1-(1-Фенилэтил)-2-изопропилкарбониламино-3-циано-4,5-диметилпиррол.

Ή-ЯМР (200 МГц, ГОСТ) δ: 1,19 (д, 1=7,0 Гц, 6Н), 1,82 (д, 1=1,2 Гц, 3Η), 1,88 (с, 3Η), 2,06 (с, 3Η), 2,46 (м, 1Н), 5,39 (м, 1=7,2 Гц, 1Н), 6,64 (с, 1Н), 7,11-7,36 (м, 5Н); МС (ЭН): 310,2 (М⁺+1), 206,1.

При ацилировании 61-1-(1-фенилэтил)-2амино-3-циано-4-метилпиррола получали моноацилированный 61-1-(1-фенилэтил)-2-бензоиламино-3-циано-4-диметилпиррол и диацилированный 61-1-(1-фенилэтил)-2-дибензоиламино-3циано-4-метилпиррол.

Моноацилированный пиррол:

Ή-ЯМР (200 МГц, СОС1_;) δ: 7,69 (д, 2Н, 1=7,8 Гц, Аг-Н), 7,58-7,12 (м, 8Н, Аг-Н), 6,18 (с, 1Н, пиррол-Н), 5,52 (кв, 1Н, 1=7,2 Гц, СН-СН₃), 2,05 (с, 3Η, пиррол-СН₃), 1,85 (д,3И, 1=7,2 Гц, СН-СН₃); МС (ЭН): 330,2 (М⁺+1);

Диацилированный пиррол:

Ή-ЯМР (200 МГц, (ОСТ) δ: 7,85 (д, 2Н, 1=7,7 Гц, Аг-Н), 7,74 (6, 2Н, 1=7,8 Гц, Аг-Н), 7,52-7,20 (м, 9Н, Аг-Н), 7,04 (м, 2Н, Аг-Н), 6,21 (с, 1Н, пиррол-Н), 5,52 (кв, 1Н, 1=7,2 Гц, СНСН₃), 1,77 (д, 3Η, 1=7,2 Гц, СН-СН₃), 1,74 (с, 3Η, пиррол-СН₃); МС (ЭН): 434,1 (М⁺+1).

Препаративный пример 7.

К раствору 61-1-(1-фенилэтил)-2-фенилкарбоксиамидо-3-циано-4,5-диметилпиррола (1,0 г, 2,92 ммоль) в метаноле (10,0 мл) добавляли концентрированную серную кислоту (1,0 мл) при 0°С. Полученную смесь нагревали с обратным холодильником в течение 15 ч и охлаждали до комнатной температуры. Осадок фильтровали с получением 0,48 г (48%) 61-5,6-диметил-2фенил-7Н-7-(1-фенилэтил)пирроло[2,36]пиримидин-4 (3Щ-она.

Ή-ЯМР (200 МГц, СОС1₃) δ: 2,02 (д, 1=7,4 Гц, 3Н), 2,04 (с, 3Н), 2,41 (с, 3Н), 6,25 (кв, 1=7,4 Гц, 1Н), 7,22-7,50 (м, 9Н), 8,07-8,12 (дд, 1=3,4 Гц, 6,8 Гц, 2Н), 10,51 (с, 1Н); МС (ЭН): 344,2 (М⁺+1).

Нижеследующие соединения получали способом, описанным в препаративном примере

7.

61-5,6-Диметил-2-(3-пиридил)-7Н-7-(1-фенилэтил)пирроло[2,36]пиримидин-4(3Н)-он.

¹Н-ЯМР (200 МГц, ϋϋα₃) δ: 2,03 (д, 1=7,2 Гц, 3Н), 2,08 (с, 3Н), 2,42 (с, 3Н), 6,24 (кв, 1=7,2 Гц, 1Н), 7,09-7,42 (м, 5Н), 8,48 (м, 2Н), 8,70 (м, 3Н); МС (ЭН): 345,1 (М⁺+1). 61-5,6-диметил-2(2-фурил)-7Н-7-(1 -фенилэтил)пирроло [2,36] пиримидин-4(3Н)-он.

Ή-ЯМР (200 МГц, СВС1₃) δ: 1,98 (д, 1=7,8 Гц, 3Н), 1,99 (с, 3Н), 2,37 (с, 3Н), 6,12 (кв, 1=7,8 Гц, 1Н), 6,48 (дд, 1=1,8 Гц, 3,6 Гц, 1Н), 7,17-7,55 (м, 7Н), 9,6 (с, 1Н); МС (ЭН): 334,2 (М⁺+1).

61-5,6-Диметил-2-(3-фурил)-7Н-7-(1-фенилэтил)пирроло [2,36] пиримидин-4 (3Н)-он.

Ή-ЯМР (200 МГц, СОС1_;) δ: 1,99 (д, 1=7 Гц, 3Н), 2,02 (с, 3Н), 2,42 (с, 3Н), 6,24 (кв, 1=7 Гц, 1Н), 7,09 (с, 1Н), 7,18-7,32 (м, 5Н), 7,48 (с, 1Н), 8,51 (с, 1Н); МС (ЭН): 334,2 (М⁺+1).

61-5,6-Диметил-2-циклопентил-7Н-7-(1 -фенилэтил)пирроло[2,36]пиримидин-4(3Н)-он.

Ή-ЯМР (200 МГц, СОС1₃) δ: 1,95 (д, 1=7,4 Гц, 3Н), 2,00 (с, 3Н), 2,33 (с, 3Н), 1,68-1,88 (м, 8Н), 2,97 (м, 1Н), 6,10 (кв, 1=7,4 Гц, 1Н), 7,16-

7,30 (м, 5Н), 9,29 (с, 1Н); МС (ЭН): 336,3 (М⁺+1).

61-5,6-Диметил-2-(2-тиенил)-7Н-7-(1-фенилэтил)пирроло[2,36]пиримидин-4(3Н)-он.

Ή-ЯМР (200 МГц, СОС1_;) δ: 2,02 (д, 1=7,2 Гц,3Н), 2,06 (с, 3Н), 2,41 (с, 3Н), 6,13 (кв, 1=7,2 Гц, 1Н), 7,12 (дд, 1=4,8, 2,8 Гц, 1Н), 7,26-7,32 (м, 5Н), 7,44 (кв, 1=4,8 Гц, 1Н), 8,01 (д, 1=2,8 Гц, 1Н), 11,25 (с, 1Н); МС (ЭН): 350,2 (М⁺+1).

61-5,6-Диметил-2-(3-тиенил)-7Н-7-(1-фенилэтил)пирроло [2,36] пиримидин-4(3Н)-он.

Ή-ЯМР (200 МГц, СОС1_;) δ: 2,00 (д, 1=7,4 Гц, 3Н), 2,05 (с, 3Н), 2,43 (с, 3Н), 6,24 (кв, 1=7,4 Гц, 1Н), 7,24-7,33 (м, 5Н), 7,33-7,39 (м, 1Н), 7,85 (м, 1Н), 8,47 (м, 1Н), 12,01 (с, 1Н); МС (ЭН):

350,2 (М⁺+1).

61-5,6-Диметил-2-(4-фторфенил)-7Н-7-(1фенилэтил)пирроло[2,36]пиримидин-4(3Н)-он.

Ή-ЯМР (200 МГц, СОСЕ) δ: 2,01 (д, 1=6,8 Гц, 3Н), 2,05 (с, 3Н), 2,42 (с, 3Н), 6,26 (кв, 1=6,8 Гц, 1Н), 7,12-7,36 (м, 7Н), 8,23-8,30 (м, 2Н), 11,82 (с, 1Н); МС (ЭН): 362,3 (М⁺+1).

61-5,6-Диметил-2-(3-фторфенил)-7Н-7-(1фенилэтил)пирроло[2,36]пиримидин-4(3Н)-он.

Ή-ЯМР (200 МГц, СОС1_;) δ: 2,02 (д, 1=7,4 Гц, 3Н), 2,06 (с, 3Н), 2,44 (с, 3Н), 6,29 (кв, 1=7,4 Гц, 1Н), 7,13-7,51 (м, 5Н), 8,00-8,04 (м, 2Н), 11,72 (с, 2Н); МС (ЭН): 362,2 (М⁺+1).

61-5,6-Диметил-2-(2-фторфенил)-7Н-7-(1фенилэтил)пирроло[2,36]пиримидин-4(3Н)-он.

Ή-ЯМР (200 МГц, СОС1_;) δ: 2,00 (д, 1=7,2 Гц, 3Н), 2,05 (с, 3Н), 2,38 (с, 3Н), 6,24 (кв, 1=7,2 Гц, 1Н), 7,18-7,45 (м, 8Н), 8,21 (м, 1Н), 9,54 (с, 1Н); МС (ЭН): 362,2 (М⁺+1).

61-5,6-Диметил-2-изопропил-7Н-7-(1-фенилэтил)пирроло[2,36]пиримидин-4(3Н)-он.

Ή-ЯМР (200 МГц, СОС1_;) δ: 1,30 (д, 1=6,8 Гц, 3Н), 1,32 (кв, 1=7,0 Гц, 1Н), 2,01 (с, 3Н), 2,34 (с, 3Н), 2,90 (м, 1Н), 6,13 (м, 1Н), 7,17-7,34 (м, 5Н), 10,16 (с, 1Н); МС (ЭН): 310,2 (М⁺+1).

Препаративный пример 8.

Раствор 61-1-(1-фенилэтил)-2-бензоиламино-3-циано-4-диметилпиррола (785 мг, 2,38 ммоль) с концентрированной серной кислотой (1 мл) в ДМФ (13 мл) перемешивали при 130°С в течение 48 ч. Черный раствор разбавляли СНС1₃ (100 мл) и промывали 1н. №1ОН (30 мл) и солевым раствором (30 мл). Органическую фракцию сушили, фильтровали, концентрировали и очищали с помощью флэш-хроматографии (81О₂, 8/2 ЕЮАс/гекс., Κί 0,35) с получением 615-метил-2-фенил-7Н-7-(1-фенилэтил)пирроло [2,36] пиримидин-4(3Н)-она в виде коричневого твердого вещества (184 мг, 24%).

Ή-ЯМР (200 МГц, СОС1_;) δ: 8,18 (м, 2Н, Аг-Н), 7,62-7,44 (м, 3Н, Аг-Н), 7,40-7,18 (м, 5Н, Аг-Н), 6,48 (с, 1Н, пиррол-Н), 6,28 (кв, 1Н, 1=7,2 Гц, СН-СН₃), 2,18 (с, 3Н, пиррол-СН₃), 2,07 (д, 3Н, 1=7,2 Гц, СН-СН₃); МС (ЭН): 330,2 (М⁺+1).

Препаративный пример 9.

Смесь 61-1-(1-фенилэтил)-2-амино-3-циано-4,5-диметилпиррола (9,60 г, 40,0 ммоль) и муравьиной кислоты (50,0 мл, 98%) нагревали с обратным холодильником в течение 5 ч. После охлаждения до комнатной температуры и отскабливания стенок колбы образовывался обильный осадок, который затем фильтровали. Продукт промывали водой до тех пор, пока рН промывок не становился нейтральным, в результате чего получали 61-5,6-диметил-7Н-7-(1фенилэтил)пирроло[2,36]пиримидин-4(3Н)-он. Ή-ЯМР (200 МГц, СОС1_;) δ: 1,96 (д, 1=7,4 Гц, 3Н), 2,00 (с, 3Н), 2,38 (с, 3Н), 6,21 (кв, 1=7,4 Гц, 1Н), 7,11-7,35 (м, 5Н), 7,81 (с, 1Н), 11,71 (с, 1Н), МС (ЭН): 268,2 (М⁺+1).

Препаративный пример 10.

61-5,6-Диметил-2-фенил-7Н-7-(1 -фенилэтил)пирроло[2,36]пиримидин-4(3Н)-он (1,0 г, 2,91 ммоль) суспендировали в полифосфорной кислоте (30,0 мл). Смесь нагревали при 100°С в течение 4 ч. Горячую суспензию выливали в воду со льдом, интенсивно перемешивали для ее диспергирования и подщелачивали до рН 6 путем добавления твердого КОН. Полученное твердое вещество фильтровали и собирали с получением 0,49 г (69%) 5,6-диметил-2-фенил7Н-пирроло[2,36]пиримидин-4(3Н)-она.

¹Н-ЯМР (200 МГц, ДМСО-66) δ: 2,17 (с, 3Н), 2,22 (с, 3Н), 7,45 (шир.с., 3Н), 8,07 (шир., 2Н), 11,49 (с, 1Н), 11,82 (с, 1Н); МС (ЭН): 344,2 (М⁺+1).

Нижеследующие соединения получали способом, описанным в препаративном примере

10.

5-Метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин-4(3Н)-он.

МС (ЭН): 226,0 (М+1).

5-Метил-2-(3-пиридил)-7Н-пирроло[2,36] пиримидин-4(3Н)-он.

МС (ЭН): 241,1 (М⁺+1).

5.6- Диметил-2-(2-фурил)-7Н-пирроло[2,36] пиримидин-4(3Н)-он.

¹Н-ЯМР (200 МГц, ДМСО-6₆) δ: 2,13 (с, 3Н), 2,18 (с, 3Н), 6,39 (дд, 1= 1,8, 3,6 Гц, 1Н), 6,65 (дд, 1=1,8 Гц, 3,6 Гц, 1Н), 7,85 (дд, 1=1,8, 3,6 Гц, 1Н), 11,45 (с, 1Н), 11,60 (с, 1Н); МС (ЭН):

230,1 (М⁺+1).

5.6- Диметил-2-(3-фурил)-7Н-пирроло[2,36] пиримидин-4(3Н)-он.

¹Н-ЯМР (200 МГц, ДМСО-66) δ: 2,14 (с, 3Н), 2,19 (с, 3Н), 6,66 (с, 1Н), 7,78 (с, 1Н), 8,35 (с, 1Н), 11,3 (с, 1Н), 11,4 (с, 1Н); МС (ЭН): 230,1 (М⁺+1).

5.6- Диметил-2-циклопентил-7Н-пирроло [2,36]пиримидин-4(3Н)-он.

¹Н-ЯМР (200 МГц, ДМСО-6₆) δ: 1,57-1,91 (м, 8Н), 2,12 (с, 3Н), 2,16 (с, 3Н), 2,99 (м, 1Н), 11,24 (с, 1Н), 11,38 (с, 1Н); МС (ЭН): 232,2 (М⁺+1).

5.6- Диметил-2-(2-тиенил)-7Н-пирроло [2,36]пиримидин-4(3Н)-он.

¹Н-ЯМР (200 МГц, ДМСО-66) δ: 2,14 (с, 3Н), 2,19 (с, 3Н), 7,14 (дд, 1=3,0, 5,2 Гц, 1Н), 7,70 (д, 1=5,2 Гц, 1Н), 8,10 (д, 1=3,0 Гц, 1Н), 11,50 (с, 1Н); МС (ЭН): 246,1 (М⁺+1).

5.6- Диметил-2-(3-тиенил)-7Н-пирроло [2,36]пиримидин-4(3Н)-он.

¹Н-ЯМР (200 МГц, ДМСО-66) δ: 2,17 (с, 3Н), 2,21 (с, 3Н), 7,66 (м, 1Н), 7,75 (м, 1Н), 8,43 (м, 1Н), 11,47 (с, 1Н), 11,69 (с, 1Н);

МС (ЭН): 246,1 (М⁺+1).

5.6- Диметил-2-(4-фторфенил)-7Н-пирроло [2,36]пиримидин-4(3Н)-он.

¹Н-ЯМР (200 МГц, ДМСО-66) δ: 2,17 (с, 3Н), 2,21 (с, 3Н), 7,31 (м, 2Н), 8,12 (м, 2Н), 11,47 (с, 1Н); МС (ЭН): 258,2 (М⁺+1).

5.6- Диметил-2-(3-фторфенил)-7Н-пирроло [2,36]пиримидин-4(3Н)-он.

¹Н-ЯМР (200 МГц, ДМСО-66) δ: 2,18 (с, 3Н), 2,21 (с, 3Н), 7,33 (м, 1Н), 7,52 (м, 1Н), 7,857,95 (м, 2Н), 11,56 (с, 1Н), 11,80 (с, 1Н); МС (ЭН): 258,1 (М⁺+1).

5.6- Диметил-2-(2-фторфенил)-7Н-пирроло [2,36]пиримидин-4(3Н)-он.

¹Н-ЯМР (200 МГц, ДМСО-66) δ: 2,18 (с, 3Н), 2,22 (с, 3Н), 7,27-7,37 (м, 2Н), 7,53 (м, 1Н), 7,68 (м, 1Н), 11,54 (с, 1Н), 11,78 (с, 1Н); МС (ЭН): 258,1 (М⁺+1).

5.6- Диметил-2-изопропил-7Н-пирроло [2,36]пиримидин-4(3Н)-он.

Ή-ЯМР (200 МГц, ДМСО-6₆) δ: 1,17 (д, 1=6, 6 Гц, 6Н), 2,11 (с, 3Н), 2,15 (с, 3Н), 2,81 (м,

1Н), 11,20 (с, 1Н), 11,39 (с, 1Н); МС (ЭН): 206,1 (М⁺+1).

5,6-Диметил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин4(3Н)-он.

¹Н-ЯМР (200 МГц, ДМСО-66) δ: 2,13 (с, 3Н), 2,17 (с, 3Н), 7,65 (с, 1Н); МС (ЭН): 164,0 (М⁺+1).

Препаративный пример 11.

Раствор 5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло [2,36]пиримидин-4(3Н)-она (1,0 г, 4,2 ммоль) в оксихлориде фосфора (25,0 мл) нагревали с обратным холодильником в течение 6 ч, а затем концентрировали досуха в вакууме. К остатку добавляли воду для инициации кристаллизации и полученное твердое вещество фильтровали и собирали с получением 0,90 г (83%) 4-хлор-5,6диметил-2 - фенил-7Н-пирроло [2,36] пиримидина.

¹Н-ЯМР (200 МГц, ДМСО-66) δ: 2,33 (с,3Н), 2,33 (с, 3Н), 7,46-7,49 (м, 3Н), 8,30-8,35 (м, 2Н), 12,20 (с, 1Н), МС (ЭН): 258,1 (М⁺+1).

Нижеследующие соединения получали способом, описанным в препаративном примере

11.

4-Хлор-5-метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36] пиримидин.

МС (ЭН): 244,0 (М⁺+1).

4-Хлор-6-метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36] пиримидин.

МС (ЭН): 244,0 (М⁺+1).

4-Хлор-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин.

¹Н-ЯМР (200 МГц, ДМСО-66) δ: 8,35 (2,2Н), 7,63 (шир.с, 1Н), 7,45 (м, 3Н), 6,47 (шир.с, 1Н); МС (ЭН): 230,0 (М⁺+1).

4-Хлор-5,6-диметил-2-(3-пиридил)-7Нпирроло [2,36] пиримидин.

МС (ЭН): 259,0 (М⁺+1).

4-Хлор-5,6-диметил-2-(2-фурил)-7Н-пирроло[2,36]пиримидин.

¹Н-ЯМР (200 МГц, ДМСО-66) δ: 2,35 (с, 2Н), 2,35 (с, 3Н), 6,68 (дд, 1=1,8, 3,6 Гц, 1Н), 7,34 (дд, 1=1,8 Гц, 3,6 Гц, 1Н), 7,89 (дд, 1=1,8, 3,6 Гц, 1Н); МС (ЭН): 248,0 (М⁺+1).

4-Хлор-5,6-диметил-2-(3-фурил)-7Н-пирроло[2,36]пиримидин.

¹Н-ЯМР (200 МГц, ДМСО-66) δ: 2,31 (с, 3Н), 2,31 (с, 3Н), 6,62 (с, 1Н), 7,78 (с, 1Н), 8,18 (с, 1Н), 12,02 (с, 1Н); МС (ЭН): 248,1 (М⁺+1).

4-Хлор-5,6-диметил-2-циклопентил-7Нпирроло[2,36]пиримидин.

¹Н-ЯМР (200 МГц, ДМСО-66) δ: 1,61-1,96 (м, 8Н), 2,27 (с, 3Н), 2,27 (с, 3Н), 3,22 (м, 1Н),

11,97 (с, 1Н); МС (ЭН): 250,1 (М⁺+1).

4-Хлор-5,6-диметил-2-(2-тиенил)-7Н-пирроло[2,36]пиримидин.

¹Н-ЯМР (200 МГц, ДМСО-66) δ: 2,29 (с, 3Н), 2,31 (с, 3Н), 7,14 (дд, 1=3,1 Гц, 4,0 Гц, 1Н), 7,33 (д, 1=4,9 Гц, 1Н), 7,82 (д, 1=3,1 Гц, 1Н), 12,19 (с, 1Н); МС (ЭН): 264,1 (М⁺+1).

4-Хлор-5,6-диметил-2-(3-тиенил)-7Н-пирроло[2,36]пиримидин.

Ή-ЯМР (200 МГц, ДМСО-6₆) δ: 2,32 (с, 2Н), 2,32 (с, 3Н), 7,62 (дд, 1=3,0, 5,2 Гц, 1Н), 7,75 (д, 1=5,2 Гц, 1Н), 8,20 (д, 1=3,0 Гц, 1Н); МС (ЭН): 264,0 (М+1).

4-Хлор-5,6-диметил-2-(4-фторфенил)-7Нпирроло [2,36] пиримидин.

Ή-ЯМР (200 МГц, ДМСО-6₆) δ: 2,33 (с, 3Н), 2,33 (с, 3Н), 7,30 (м, 2Н), 8,34 (м, 2Н), 12,11 (с, 1Н); МС (ЭН): 276,1 (М⁺+1).

4-Хлор-5,6-диметил-2-(3-фторфенил)-7Нпирроло [2,36] пиримидин.

Ή-ЯМР (200 МГц, ДМСО-6₆) δ: 2,31 (с, 3Н), 2,35 (с, 3Н), 7,29 (м, 1Н), 7,52 (м, 1Н), 7,96 (м, 1Н), 8,14 (м, 1Н), 11,57 (с, 1Н); МС (ЭН):

276,1 (М⁺+1).

4-Хлор-5,6-диметил-2-(2-фторфенил)-7Нпирроло [2,36] -пиримидин.

Ή-ЯМР (200 МГц, ДМСО-6₆) δ: 2,34 (с, 2Н), 2,34 (с, 3Н), 7,33 (м, 2Н), 7,44 (м, 1Н), 7,99 (м, 1Н), 12,23 (с, 1Н); МС (ЭН): 276,1 (М⁺+1).

4-Хлор-5,6-диметил-2-изопропил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин.

Ή-ЯМР (200 МГц, ДМСО-6₆) δ: 1,24 (д, 1=6,6 Гц, 6Н), 2,28 (с, 3Н), 2,28 (с, 3Н), 3,08 (кв, 1=6,6 Гц, 1Н), 11,95 (с, 1Н); МС (ЭН): 224,0 (М⁺+1).

4-Хлор-5,6-диметил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин.

¹Н-ЯМР (200 МГц, ДМСО-66) δ: 2,31 (с, 3Н), 2,32 (с, 3Н), 8,40 (с, 1Н); МС (ЭН): 182,0 (М⁺+1),

61-4-Хлор-5,6-диметил-2-фенил-7Н-7-(1фенилэтил)пирроло[2,36]пиримидин.

Препаративный пример 12.

К раствору 61-1,2-диаминопропана (1,48 г, 20,0 ммоль) и карбоната натрия (2,73 г, 22,0 ммоль) в диоксане (100,0 мл) и воде (100,0 мл) добавляли ди-трет-дикарбонат (4,80 г, 22,0 ммоль) при комнатной температуре. Полученную смесь перемешивали в течение 14 ч. Диоксан удаляли в вакууме. Осадок отфильтровывали и фильтрат концентрировали в вакууме досуха. Остаток растирали с ЕЮ Ас, а затем фильтровали. Фильтрат концентрировали в вакууме досуха с получением смеси 61-1-амино-2-(1,1диметилэтокси)карбониламино-пропана и 61-2амино-1-(1,1-диметилэтокси)карбониламинопропана, которая не могла быть разделена обычным хроматографическим методом. Эту смесь использовали для реакции в примере 8.

Препаративный пример 13.

К раствору Етос-в-А1а-ОН (1,0 г, 3,212 ммоль) и оксалилхлорида (0,428 г, 0,29 мл, 3,373 ммоль) в дихлорметане (20,0 мл) добавляли несколько капель Ν,Ν-диметилформамида при 0°С. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем добавляли циклопропилметиламин (0,229 г, 0,28 мл, 3,212 ммоль) и триэтиламин (0,65 г, 0,90 мл, 6,424 ммоль). Через 10 мин, смесь обрабатывали 1М гидрохлоридом (10,0 мл) и водную смесь экст рагировали дихлорметаном (3 х 30,0 мл). Органический раствор концентрировали в вакууме досуха. Остаток обрабатывали раствором 20% пиперидина в Ν,Ν-диметилформамиде (20,0 мл) в течение 0,5 ч. После удаления растворителя в вакууме, остаток обрабатывали 1М гидрохлоридом (20,0 мл) и этилацетатом (20,0 мл). Смесь отделяли и водный слой подщелачивали твердым гидроксидом натрия до рН=8. Осадок удаляли путем фильтрации и водный раствор подвергали ионообменной хроматографии на колонке, проэлюированной 20% пиридином, в результате чего получали 0,262 г (57%) амида Νциклопропилметил-в-аланина.

Ή-ЯМР (200 МГц, СО₃ОЭ) δ: 0,22 (м, 2Н), 0,49 (м, 2Н), 0,96 (м, 2Н), 2,40 (т, 2Н), 2,92 (т, 2Н), 3,05 (д, 2Н);

МС (ЭН): 143,1 (М⁺+1).

Препаративный пример 14. Ν-трет-бутоксикарбонил-транс-1,4-циклогексилдиамин.

Транс-1,4-циклогексилдиамин (6,08 г, 53,2 ммоль) растворяли в дихлорметане (100 мл). Затем, с помощью канюли добавляли раствор ди-трет-бутилдикарбоната (2,32 г, 10,65 ммоль в 40 мл дихлорметана). Через 20 ч, реакционную смесь распределяли между СНС13 и водой. Слои отделяли и водный слой экстрагировали СНС1₃ (три раза). Объединенные органические слои сушили Мд§О₄, фильтровали и концентрировали с получением 1,20 г белого твердого вещества (53%).

Ή-ЯМР (200 МГц, СОС1_;) δ: 1,0-1,3 (м, 4Н), 1,44 (с, 9Н), 1,8-2,1 (м, 4Н), 2,62 (шир.м, 1Н), 3,40 (шир.с, 1Н), 4,37 (шир.с, 1Н); МС (ЭН): 215,2 (М⁺+1).

4-(№ацетил)-№трет-бутоксикарбонилтранс-1,4-циклогексилдиамин.

№трет-Бутоксикарбонил-транс-1,4-циклогексилдиамин (530 мг, 2,47 ммоль) растворяли в дихлорметане (20 мл). Затем по каплям добавляли уксусный ангидрид (250 мг, 2,60 ммоль). Через 16 ч, реакционную смесь разбавляли водой и СНС1₃. Слои отделяли и водный слой экстрагировали СНС1₃ (три раза). Объединенные органические слои сушили Мд§О₄, фильтровали и концентрировали. После перекристаллизации (ЕЮН/Н₂О) получали 190 мг белых кристаллов (30%).

Ή-ЯМР (200 МГц, СОС1₃) δ: 0,9-1,30 (м, 4Н), 1,43 (с, 9Н), 1,96-2,10 (м, 7Н), 3,40 (шир.с, 1Н), 3,70 (шир.с, 1Н), 4,40 (шир.с, 1Н), 4,40 (шир.с, 1Н); МС (ЭН): 257,2 (М⁺+1), 242,1 (М⁺15), 201,1 (М⁺-56).

4-(4-транс-ацетамидоциклогексил)амино-

5,6-диметил-2-фенил-7Н-(1-фенилэтил)пирроло [2,36]пиримидин.

4-(Ν-ацетил )-Ν -трет-бутоксикарбонилтранс-1,4-циклогексилдиамин (190 мг, 0,74 ммоль) растворяли в дихлорметане (5 мл) и разбавляли ТЕА (6 мл). Через 16 ч, реакционную смесь концентрировали. Неочищенное твердое вещество, ДМСО (2 мл), №1НСО₃ (200 мг, 2,2 ммоль) и 4-хлор-5,6-диметил-2-фенил-7Нпирроло[2,3б]пиримидин (35 мг, 0,14 ммоль) объединяли в колбе и нагревали до 130°С. Через 4,5 ч, реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и разбавляли ЕЮАс и водой. Слои отделяли и водный слой экстрагировали ЕЮАс (три раза). Объединенные органические слои сушили Мд§О₄, фильтровали и концентрировали. После хроматографии (препаративные пластины с двуокисью кремния, 20:1, СНС1₃: ЕЮН) получали 0,3 мг коричневатого твердого вещества (выход 1%). МС (ЭН): 378,2 (М^+1).

4-(№метансульфонил)-Ы-трет-бутоксикарбонил-транс-1,4-циклогексилдиамин.

Транс-1,4-циклогексилдиамин (530 мг, 2,47 ммоль) растворяли в дихлорметане (20 мл) и разбавляли пиридином (233 мг, 3,0 ммоль). Затем по каплям добавляли метансульфонилхлорид (300 мг, 2,60 ммоль). Через 16 ч, реакционную смесь разбавляли водой и СНС13. Слои отделяли и водный слой экстрагировали СНС13 (три раза). Объединенные органические слои сушили Мд§О₄, фильтровали и концентрировали. После перекристаллизации (ЕЮН/Н₂О) получали 206 мг белых кристаллов (29%).

¹Н-ЯМР (200 МГц, ϋϋα₃) δ: 1,10-1,40 (м, 4Н), 1,45 (с, 9Н), 2,00-2,20 (м, 4Н), 2,98 (с, 3Н), 3,20-3,50 (шир.с, 2Н), 4,37 (шир.с, 1Н); МС (ЭН): 293,1 (М⁺+1), 278,1 (М⁺-15), 237,1 (М⁺-56).

4-(4-транс-метансульфамидоциклогексил) амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-(1-фенилэтил) пирроло [2,3ά] пиримидин.

4-(Ы-сульфонил)-Ы-трет-бутоксикарбонилтранс-1,4-циклогексилдиамин (206 мг, 0,71 ммоль) растворяли в дихлорметане (5 мл) и разбавляли ТЕА (6 мл). Через 16 ч, реакционную смесь концентрировали. Неочищенную реакционную смесь, ДМСО (2 мл), NаНСО₃ (100 мг, 1,1 ммоль) и 1-хлор-5,6-диметил-2-фенил-7Нпирроло[2,3б]пиримидин объединяли в колбе и нагревали до 130°С. Через 15 ч, реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и разбавляли ЕЮАс (три раза). Объединенные органические слои сушили Мд§О₄, фильтровали и концентрировали. После хроматографии (препаративные пластины с двуокисью кремния, 20:1, СНС1₃/ЕЮН) получали 2,6 мг коричневатого твердого вещества (выход 5%). МС (ЭН):

414,2 (М⁺+1)

Пример 1.

Раствор 4-хлор-5,6-диметил-2-фенил-7Нпирроло[2,3б]пиримидина (0,50 г, 1,94 ммоль) и 4-транс-гидроксициклогексиламин (2,23 г, 19,4 ммоль) в метилсульфоксиде (10,0 мл) нагревали при 130°С в течение 5 ч. После охлаждения до комнатной температуры добавляли воду (10,0 мл) и полученный водный раствор экстрагировали ЕЮАс (3 х 10,0 мл). Объединенный раствор ЕЮАс сушили (Мд§О₄) и фильтровали, фильтрат концентрировали досуха в вакууме, и остаток хроматографировали на силикагеле с получением 0,49 г (75%) 4-(4-транс-гидроксициклогексил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Нпирроло[2,3б]пиримидина, т.пл. 197-199°С;

¹Н-ЯМР (200 МГц, δ: 1,25-1,59 (м,

8Н), 2,08 (с, 3Н), 2,29 (с, 3Н), 3,68-3,79 (м, 1Н), 4,32-4,38 (м, 1Н), 4,88 (д, 1=8 Гц, 1Н), 7,26-7,49 (м, 3Н), 8,40-8,44 (дд, 1=2,2, 8 Гц, 2Н), 10,60 (с, 1Н), МС (ЭН): 337,2 (М⁺+1).

Нижеследующие соединения получали способом, аналогичным описанному в примере 1.

4-(4-транс-Гидроксициклогексил)амино-6метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,3б]пиримидин.

¹Н-ЯМР (200 МГц, СОСЕ) δ: 11,37 (с, 1Н, пиррол-ΝΉ), 8,45 (м, 2Н, Аг-Н), 7,55 (м, 3Н, АгН), 6,17 (с, 1Н, пиррол-Н), 4,90 (шир.д., 1Н, ΝΉ), 4,18 (м, 1Н, СН-О), 3,69 (м, 1Н, СН-Ν), 2,40-2,20 (м, 2Н), 2,19-1,98 (м, 2Н), 2,25 (с, 3Н, СН₃), 1,68-1,20 (м, 4Н); МС (ЭН): 323,2 (М⁺+1).

4-(4-транс-Гидроксициклогексил)амино-5метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,3б]пиримидин.

¹Н-ЯМР (200 МГц, СОСЕ) δ: 11,37 (с, 1Н, пиррол-ΝΉ), 8,40 (м, 2Н, Аг-Н), 7,45 (м, 3Н, АгН), 5,96 (с, 1Н, пиррол-Н), 4,90 (шир.д., 1Н, ЫН), 4,18 (м, 1Н, СН-О), 3,69 (м, 1Н, СН-Ν), 2,38-2,20 (м, 2Н), 2,18-1,98 (м, 2Н), 2,00 (м, 3Н, СНз), 1,68-1,20 (м, 4Н); МС (ЭН): 323,2 (М⁺+1).

4-(4-транс-Гидроксициклогексил)амино-2фенил-7Н-пирроло[2,3б]пиримидин.

Т.пл. 245,5-245,6°С.

¹Н-ЯМР (200 МГц, С1ЕО1)) δ: 8,33 (м, 2Н, Аг-Н), 7,42 (м, 3Н, Аг-Н), 7,02 (д, 1Н, 1=3,6 Гц, пиррол-Н), 6,53 (д, 1Н, 1=3,6 Гц, пиррол-Н), 4,26 (м, 1Н, СН-О), 3,62 (м, 1Н, СН-Ν), 2,30-2,12 (м, 2Н), 2,12-1,96 (м, 2Н), 1,64-1,34 (м, 4Н); МС, М+1=309,3; анализ (Сий^О), С, Н, Ν.

4-(4-транс-Гидроксициклогексил)амино-

5.6- диметил-2-(3-пиридил)-7Н-пирроло [2,3ά] пиримидин.

¹Н-ЯМР (200 МГц, С1Х'Е) δ: 1,21-1,54 (м, 8Н), 2,28 (с, 3Н), 2,33 (с, 3Н), 3,70 (м, 1Н), 4,31 (м, 1Н), 4,89 (д, 1Н), 7,40 (м, 1Н), 8,61 (м, 2Н),

9,64 (м, 1Н); МС (ЭН): 338,2 (М+1).

4-(4-транс-Гидроксициклогексил)амино-

5.6- диметил-2-(2-фурил)-7Н-пирроло[2,3б]пиримидин.

¹Н-ЯМР (200 МГц, С1Х'Е) δ: 1,26-1,64 (м, 8Н), 2,22 (с, 3Н), 2,30 (с, 3Н), 3,72 (м, 1Н), 4,23 (м, 1Н), 4,85 (д, 1Н), 6,52 (м, 1Н), 7,12 (м, 1Н), 7,53 (м, 1Н), 9,28 (с, 1Н); МС (ЭН): 327,2 (М⁺+1).

4-(4-транс-Гидроксициклогексил)амино-

5.6- диметил-2-(3фурил)-7Н-пирроло[2,3б]пиримидин.

¹Н-ЯМР (200 МГц, С1Х'Е) δ: 1,25-1,63 (м, 8Н), 2,11 (с, 3Н), 2,27 (с, 3Н), 3,71 (м, 1Н), 4,20 (м, 1Н), 4,84 (д, 1Н), 7,03 (м, 1Н), 7,45 (м, 1Н), 8,13 (м, 1Н), 10,38 (м, 1Н); МС (ЭН): 327,2 (М⁺+1).

4-(4-транс-Гидроксициклогексил)амино-

5.6- диметил-2 -циклопентил-7Н-пирроло [2,3й] пиримидин.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: 1,26-2,04 (м, |6Н), 2,26 (с, 3Н), 2,27 (с, 3Н), 3,|5 (м, |Н), 3,70 (м, 1Н), 4,12 (м, 1Н), 4,75 (д, 1Н); МС (ЭН):

329.2 (М+1).

4-(4-транс-Гидроксициклогексил)амино-

5.6- диметил-2-(2-тиенил)-7Н-пирро ло[2,3й] пиримидин-4-амин.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: 1,28-1,59 (м, 8Н), 2,19 (с, 3Н), 2,29 (с, 3Н), 3,74 (м, 1Н), 4,19 (м, 1Н), 4,84 (д, 1Н), 7,09 (м, 1Н), 7,34 (м, 1Н), 7,85 (м, 1Н), 9,02 (с, 1Н); МС (ЭН): 343,2 (М⁺+1).

4-(4-транс-Гидроксициклогексил)амино-

5.6- диметил-2-(3-тиенил)-7Н-пирроло [2,3й] пиримидин.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: 1,21-1,60 (м, 8Н), 1,98 (с, 3Н), 2,23 (с, 3Н), 3,66 (м, 1Н), 4,22 (м, 1Н), 7,27 (м, 1Н), 7,86 (м, 1Н), 8,09 (м, 1Н), 11,23 (с, 1Н); МС (ЭН): 343,2 (М⁺+1).

4-(4-транс-Гидроксициклогексил)амино-

5.6- диметил-2-(4-фторфенил)-7Н-пирроло[2,3й] пиримидин.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: 1,26-1,66 (м, 8Н), 1,94 (с, 3Н), 2,28 (с, 3Н), 3,73 (м, 1Н), 4,33 (м, 1Н), 4,92 (д, 1Н), 7,13 (м, 2Н), 8,41 (м, 2Н), 11,14 (с, 1Н); МС (ЭН): 355,2 (М⁺+1).

4-(4-транс-Гидроксициклогексил)амино-

5.6- диметил-2-(3-фторфенил)-7Н-пирроло[2,3й] пиримидин.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: 1,26-1,71 (м, 8Н), 2,06 (с, 3Н), 2,30 (с, 3Н), 3,72 (м, 1Н), 4,30 (м, 1Н), 4,90 (д, 1Н), 7,09 (м, 1Н), 7,39 (м, 1Н), 8,05(м, 1Н), 8,20 (м, 1Н), 10,04 (с, 1Н); МС (ЭН):

355.2 (М⁺+1).

4-(4-транс-Гидроксициклогексил)амино-

5.6- диметил-2-(2-фторфенил)-7Н-пирроло[2,3й] пиримидин.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: 1,30-1,64 (м, 8Н), 2,17 (с, 3Н), 2,31 (с, 3Н), 3,73 (м, 1Н), 4,24 (м, 1Н), 4,82 (д, 1Н), 7,28 (м, 2Н), 8,18 (м, 1Н), 9,02 (м, 1Н), 12,20 (с, 1Н); МС (ЭН): 355,3 (М⁺+1).

4-(4-транс-Гидроксициклогексил)амино-

5.6- диметил-2 -изопропил-7Н-пирроло [2,3й] пиримидин.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: 1,31 (д, 1=7,0 Гц, 6Н), 1,30-1,65 (м, 8Н), 2,27 (с, 3Н), 2,28 (с, 3Н), 3,01 (м, 1=7,0 Гц, 1Н), 3,71 (м, 1Н), 4,14 (м, 1Н), 4,78 (д, 1Н); МС (ЭН): 303,2.

й1-4-(2-транс-Гидроксициклогексил)амино5,6-диметил-2 -изопропил-7Н-пирроло [2,3й] пиримидин.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: 1,31-1,42 (шир., 4Н), 1,75-1,82 (шир., 4Н), 2,02 (с, 3Н),

2,29 (с,3Н), 3,53 (м, 1Н), 4,02 (м, 1Н), 5,08 (д, 1Н), 7,41-7,48 (м, 3Н), 8,30 (м, 4Н), 10,08 (с, 1Н); МС (ЭН): 337,2 (М⁺+1).

4-(3,4-транс-Дигидроксициклогексил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,3й]пиримидин.

МС (ЭН): 353,2 (М+1).

4-(3,4-цис-Дигидроксициклогексил)амино-

5.6- диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,3й]пиримидин.

МС (ЭН): 353,2 (М⁺+1).

4-(2-Ацетиламиноэтил)амино-5,6-диметил2-фенил-7Н-пирроло [2,3й] -пиримидин.

Т.пл. 196-199°С.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: 1,72 (с,3Н),

1,97 (с, 3Н), 2,31 (с, 3Н), 3,59 (м, 2Н), 3,96 (м, 2Н), 5,63 (шир., 1Н), 7,44-7,47 (м, 3Н), 8,36-8,43 (дд, 1=1 Гц, 7 Гц, 2Н), 10,76 (с, 1Н); МС (ЭН):

324,5 (М⁺+1).

й1-4-(2-транс-Гидроксициклопентил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,3й]пиримидин¹.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: 1,62 (м, 2Н), 1,79 (шир., 4Н), 1,92 (с, 3Н), 2,29 (с, 3Н), 4,11 (м, 1Н), 4,23 (м, 1Н), 5,28 (д, 1Н), 7,41-7,49 (м, 3Н), 8,22 (м, 2Н), 10,51 (с, 1Н); МС (ЭН): 323,2 (М⁺+1).

¹ Для получения 2-транс-гидроксициклопентиламина, см. РСТ 9417090.

й1-4-(3 -транс-Г идроксициклопентил)амино-

5.6- диметил-2-фенил-7Н-пирроло [2,3й] пиримидин¹.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: 1,58-1,90 (шир., 6Н), 2,05 (с, 3Н), 2,29 (с, 3Н), 4,48-4,57 (м, 1Н), 4,91-5,01 (м, 2Н), 7,35-7,46 (м, 3Н), 8,428,47 (м, 2Н), 10,11 (с, 1Н); МС (ЭН): 323,2 (М⁺+1).

¹ Для получения 2-транс-гидроксициклопентиламина, см. ЕР-А-322242.

й1-4-(3-цис-Гидроксициклопентил)амино-

5.6- диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,3й]пиримидин¹.

¹Н-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: 1,82-2,28 (шир., 6Н), 2,02 (с, 3Н), 2,30 (с, 3Н), 4,53-4,60 (м, 1Н), 4,95-5,08 (м, 1Н), 5,85-5,93 (д, 1Н), 7,357,47 (м, 3Н), 8,42-8,46 (м, 2Н), 10,05 (с, 1Н); МС (ЭН): 323,2 (М+1).

¹Для получения 3-цис-гидроксициклопентиламина, см. ЕР-А-322242.

4-(3,4-транс-Дигидроксициклопентил)амино-

5.6- диметил-2-фенил-7Н-пирроло [2,3й] пиримидин¹.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: 1,92-1,99 (шир., 2Н), 2,14 (с, 3Н), 2,20 (шир., 2Н), 2,30 (с, 3Н), 2,41-2,52 (шир., 2Н), 4,35 (м, 2Н), 4,98 (м, 2Н), 7,38-7,47 (м, 3Н), 8,38-8,42 (м, 2Н), 9,53 (м, 1Н); МС (ЭН): 339,2 (М⁺+1).

¹Для получения 3,4-транс-дигидроксициклопентиламина, см. РСТ 9417090.

4-(3-Амино-3-оксопропил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,3й]пиримидин.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: 2,02 (с, 3Н),

2,29 (с, 3Н), 2,71 (т, 2Н), 4,18 (м, 2Н), 5,75-5,95 (м, 3Н), 7,38-7,48 (м, 3Н), 8,37-8,41 (м, 2Н), 10,42 (с, 1Н); МС (ЭН): 310,1 (М⁺+1).

4-(3-Ы-Циклопропилметиламино-3-оксопропил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло |2,3б|пиримидин^|.

¹Н-ЯМР (200 МГц, СО₃ОЭ) δ: 0,51 (кв, 2Н), 0,40 (кв, 2Н), 1,79-1,95 (шир., 1Н), 2,36 (с, 3Н), 2,40 (с, 3Н), 2,72 (т, 2Н), 2,99 (д, 2Н), 4,04 (т, 2Н), 7,58-7,62 (м, 3Н), 8,22-8,29 (м, 2Н); МС (ЭН): 364,2 (М⁺+1).

4-(2-Амино-2-оксоэтил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло [2,3б] пиримидин.

^!Н-ЯМР (200 МГц, (ΊΤΟΙ)) δ: 2,31 (с, 3Н),

2,38 (с, 3Н), 4,26 (с, 2Н), 7,36 (м, 3Н), 8,33 (м, 2Н); МС (ЭН): 396,1 (М⁺+1).

4-(2-Ы-Метиламино-2-оксоэтил)амино-5,6диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,3б]пиримидин.

^!Н-ЯМР (200 МГц, СОСУ) δ: 1,99 (с, 3Н), 2,17 (с, 3Н), 2,82 (д, 3Н), 4,39 (д, 2Н), 5,76 (т, 1Н), 6,71 (шир., 1Н), 7,41-7,48 (м, 3Н), 8,40 (м, 2Н), 10,66 (с, 1Н); МС (ЭН): 310,1 (М⁺+1).

4-(3 -трет-Бутилоксил-3 -оксопропил)амино -5,6 -диметил-2-фенил-7Н-пирроло [2,3б] пиримидин.

^!Н-ЯМР (200 МГц, СОС1_;) δ: 1,45 (с, 9Н), 1,96 (с, 3Н), 2,29 (с, 3Н), 2,71 (т, 2Н), 4,01 (кв, 2Н), 5,78 (т, 1Н), 7,41-7,48 (м, 3Н), 8,22-8,29 (м, 2Н); МС (ЭН): 367,2 (М⁺+1).

4-(2-Гидроксиэтил)амино-5,6-диметил-2фенил-7Н-пирроло [2,3б] пиримидин.

^!Н-ЯМР (200 МГц, СОСУ) δ: 1,92 (с, 3Н),

2,29 (с, 3Н), 3,81-3,98 (шир., 4Н), 5,59 (т, 1Н), 7,39-7,48 (м, 3Н), 8,37 (м, 2Н), 10,72 (с, 1Н); МС (ЭН): 283,1 (М⁺+1).

4-(3 -Гидроксипропил)амино-5,6-диметил2-фенил-7Н-пирроло [2,3б] -пиримидин.

^!Н-ЯМР (200 МГц, С1Х'1₃) δ: 1,84 (м, 2Н), 1,99 (с, 3Н), 2,32 (с, 3Н), 3,62 (т, 2Н), 3,96 (м, 2Н), 3,35 (т, 1Н), 7,39-7,48 (м, 3Н), 8,36 (м, 2Н), 10,27 (с, 1Н); МС (ЭН): 297,2 (М⁺+1).

4-(4-Гидроксибутил)амино-5,6-диметил-2фенил-7Н-пирроло[2,3б]пиримидин.

^!Н-ЯМР (200 МГц, СОС1_;) δ: 1,71-1,82 (м, 4Н), 1,99 (с,3Н), 2,31 (с, 3Н), 3,68-3,80 (м, 4Н), 5,20 (т, 1Н), 7,41-7,49 (м, 3Н), 8,41 (м, 2Н), 10,37 (с, 1Н); МС (ЭН): 311,2 (М⁺+1).

4-(4-транс-Ацетиламиноциклогексил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,3б]пиримидин.

4-(4-транс-Метилсульфониламиноциклогексил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло [2,3б]пиримидин.

4-(2-Ацетиламиноэтил)амино-5,6-диметил2-фенил-7Н-7-(1-фенилэтил)пирроло[2,3б]пиримидин.

4-(4-транс-Гидроксициклогексил)амино-

5,6-диметил-2-фенил-7Н-1-(фенилэтил)пирроло [2,3б]пиримидин.

4-(3-Пиридилметил)амино-5,6-диметил-2фенил-7Н-7-(1 -фенилэтил)пирроло [2,3б] пиримидин.

4-(2-Метилпропил)амино-5,6-диметил-2фенил-7Н-7-(1 -фенилэтил)пирроло [2,3б]пиримидин.

Пример 2.

К перемешанной суспензии трифенилфосфина (0,047 г, 0,179 ммоль) и бензойной кислоты (0,022 г, 0,179 ммоль) в ТГФ (1,0 мл), охлажденной до 0°С, добавляли 4-(4-транс-гидроксициклогексил)амино-5,6-диметил-2-фенил7Н-пирроло[2,3б]пиримидин (0,05 г, 0,149 ммоль) при 0°С. Затем в течение 10 мин по каплям добавляли диэтилазодикарбоксилат (0,028 мл, 0,179 ммоль). Реакционную смесь оставляли для нагревания до комнатной температуры. После завершения реакции, на что указывала ТСХ, реакционную смесь гасили водным раствором бикарбоната натрия (3,0 мл). Водную фазу отделяли и экстрагировали эфиром (2 х 5,0 мл). Органические экстракты объединяли, сушили и концентрировали в вакууме досуха. К остатку добавляли эфир (2,0 мл) и гексан (5,0 мл), после чего, избыток оксида трифенилфосфина отфильтровывали. После концентрирования фильтрата получали вязкое масло, которое очищали с помощью колоночной хроматографии (гексан:этилацетат = 4:1) и получали 5,0 мг (7,6%) 4-(4-цис-бензоилокициклогексенил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,3б]пиримидина. МС (ЭН): 441,3 (М^+1). В результате реакции было также получено 50,0 мг (84%) 4(3-циклогексил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Нпирроло[2,3б]пиримидина. МС (ЭН): 319,2 (М⁺+1).

Пример 3.

К раствору 4-(4-цис-бензоилоксициклогексил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло [2,3б]пиримидина (5,0 мг, 0,0114 ммоль) в этаноле (1,0 мл) добавляли 10 капель 2М гидроксида натрия. Через 1 ч, реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (3 х 5,0 мл) и органический слой сушили, фильтровали и концентрировали в вакууме досуха. Остаток подвергали колоночной хроматографии (гексан:этилацетат = 4:1) с получением 3,6 мг (94%) 4-(4-цисгидроксициклогексил)амино-5,6-диметил-2фенил-7Н-пирроло[2,3б]пиримидина. МС (ЭН):

337,2 (М++1).

Нижеследующие соединения получали способом, описанным в примере 3.

4-(3 -Ν,Ν-Диметил-3 -оксопропил)амино5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,3б]пиримидин.

^!Н-ЯМР (200 МГц, СОС1₃) δ: 2,01 (с, 3Н),

2,31 (с, 3Н), 2,73 (т, 2Н), 2,97 (с, 6Н), 4,08 (м, 2Н), 6,09 (т, 1Н), 7,41-7,48 (м, 3Н), 8,43 (м, 2Н), 10,46 (с, 1Н); МС (ЭН): 338,2 (М⁺+1).

4-(2-Формиламиноэтил)амино-5,6диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,3б]пиримидин.

^!Н-ЯМР (200 МГц, ГОСТ) δ: 2,26 (с, 3Н), 2,37 (с, 3Н), 3,59-3,78 (м, 2Н), 3,88-4,01 (м, 2Н), 5,48-5,60 (м, 1Н), 7,38-7,57 (м, 3Н), 8,09 (с, 1Н),

8,30-8,45 (м, 2Н), 8,82 (с, 1Н); МС (ЭН): 310,1 (М+1).

4-(3-Ацетиламинопропил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло [2,36] пиримидин.

МС (ЭН): 338,2 (М+1).

Пример 4.

4-(3-трет-Бутилокси-3-оксопропил)амино5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло [2,36] пиримидин (70,0 мг, 0,191 ммоль) растворяли в смеси трифторуксусной кислоты:дихлорметана (1:1, 5,0 мл). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем нагревали с обратным холодильником в течение 2 ч. После охлаждения до комнатной температуры, смесь концентрировали досуха в вакууме. Остаток подвергали препаративной тонкослойной хроматографии (ЕЮАс:гексан:АсОН = 7:2,5:0,5) с получением 40,0 мг (68%) 4-(3гидрокси-3-оксопропил)амино-5,6-диметил-2фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидина.

Ή-ЯМР (200 МГц, СО₃ОЭ) δ: 2,32 (с, 3Н),

2,38 (с, 3Н), 2,81 (т, 2Н), 4,01 (т, 2Н), 7,55 (м, 3Н), 8,24 (м, 2Н); МС (ЭН): 311,1 (М⁺+1).

Нижеследующее соединение получали способом, описанным в примере 4.

4-(3-Аминопропил)амино-5,6-диметил-2фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин.

МС (ЭН): 296,1 (М⁺+1), 279,1 (Μ⁺-ΝΗ₃).

Пример 5. 4-(3-Гидрокси-3-оксопропил) амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36] пиримидин (50,0 мг, 0,161 ммоль) растворяли в смеси Ν,Ν-диметилформамида (0,50 мл), диоксана (0,50 мл) и воды (0,25 мл). К этому раствору добавляли метиламин (0,02 мл, 40 мас.% в воде, 0,242 ммоль), триэтиламин (0,085 мл) и тетра-фторборат Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраметилурония (61,2 мг, 0,203 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 10 мин, раствор концентрировали и остаток подвергали препаративной тонкослойной хроматографии (ЕЮАс) с получением 35,0 мг (67%) 4-(3-Νметил-3-оксопропил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидина.

Ή-ЯМР (200 МГц, С1ХЧ ₃) δ: 1,92 (с, 3Н),

2,30 (с, 3Н), 2,65 (т, 2Н), 4,08 (т, 2Н), 5,90 (т, 1Н), 6,12 (м, 1Н), 7,45 (м, 3Н), 8,41 (м, 2Н), 10,68 (с, 1Н); МС (ЭН): 311,1 (М⁺+1).

Нижеследующие соединения получали способом, описанным в примере 5.

4-(2-циклопропанкарбониламиноэтил)амино -5,6 -диметил-2-фенил-7Н-пирроло [2,36] пиримидин.

МС (ЭН): 350,2 (М⁺+1).

4-(2-Изобутириламиноэтил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло-[2, 36] пиримидин.

МС (ЭН): 352,2 (М⁺+1).

4-(3-Пропиониламинопропил)амино-5,6диметил-2-фенил-7Н-пирроло -[2,36] пиримидин.

Ή-ЯМР (200 МГц, СОС1₃) δ: 1,00-1,08 (т, 3Н), 1,71-2,03 (м, 4Н), 2,08 (с, 3Н), 2,37 (с, 3Н), 3,26-3,40 (м, 2Н), 3,79-3,96 (м, 2Н), 5,53-5,62 (м,

1Н), 6,17-6,33 (м, 1Н), 7,33-7,57 (м, 3Н), 8,31-

8,39 (м, 2Н). 9,69 (с, 1Н); МС (ЭН): 352,2 (М⁺+1).

4-(2-Метилсульфониламиноэтил)амино-

5.6- диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин.

’Н-ЯМР (200 МГц, СОС1₃) δ: 2,18 (с, 3Н), 2,27 (с, 3Н), 2,92 (с, 3Н), 3,39-3,53 (м, 2Н), 3,713,88 (м, 2Н), 5,31-5,39 (м, 1Н), 6,17-6,33 (м, 1Н), 7,36-7,43 (м, 3Н), 8,20-8,25 (м, 2Н), 9,52 (с, 1Н); МС (ЭН): 360,2 (М⁺+1).

Пример 6. Смесь 4-Хлор-5,6-диметил-2фенил-7Н-пирроло[2,36]-пиримидина (0,70 г, 2,72 ммоль) и 1,2-диаминоэтана (10,0 мл, 150 ммоль) нагревали с обратным холодильником в инертной атмосфере в течение 6 ч. Избыток амина удаляли в вакууме, а остаток последовательно промывали эфиром и гексаном с получением 0,75 г (98%) 4-(2-аминоэтил)амино-5,6диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидина. МС (ЭН): 282,2 (М⁺+1), 265,1 (М^Н₃).

Пример 7. К раствору 4-(2-аминоэтил) амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36] пиримидина (70,0 мг, 0,249 ммоль) и триэтиламина (50,4 мг, 0,498 ммоль) в дихлорметане (2,0 мл) добавляли пропионилхлорид (25,6 мг, 0,024 мл, 0,274 ммоль) при 0°С. Через 1 ч, смесь концентрировали в вакууме и остаток подвергали препаративной тонкослойной хроматографии (ЕЮАс) с получением 22,0 мг (26%) 4-(2пропиониламиноэтил)амино-5,6-диметил-2фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидина.

МС (ЭН): 338,2 (М+1).

Нижеследующие соединения получали способом, описанным в примере 7.

4-(2-№-Метилкарбамидоэтил)амино-5,6диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин.

’Н-ЯМР (200 МГц, СОС1₃) δ: 2,13 (с, 3Н),

2,32 (с, 3Н), 3,53 (д, 3Н), 3,55 (м, 2Н), 3,88 (м, 2Н), 4,29 (м, 1Н), 5,68 (т, 1Н), 5,84 (м, 1Н), 7,42 (м, 3Н), 8,36 (дд, 2Н), 9,52 (с, 1Н), МС (ЭН):

339,3 (М⁺+1).

4-(2-№-этилкарбамидоэтил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин. МС (ЭН): 353,2 (М⁺+1).

Пример 8. К раствору гидрохлорида 1-(3диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (41,1 мг, 0,215 ммоль), диметиламинопиридина (2,4 мг, 0,020 ммоль) и пировиноградной кислоты (18,9 мг, 0,015 мл, 0,215 ммоль) в дихлорметане (2,0 мл) добавляли 4-(2-аминоэтил)амино-

5.6- диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин (55,0 мг, 0,196 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. После стандартной обработки и колоночной хроматографии (ЕЮАс) получали 10,0 мг (15%) 4-(2'-пирувиламидоэтил)амино-5,6-диметил-2фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидина. МС (ЭН):

352,2 (М⁺+1).

Пример 9. К раствору 4-(2-аминоэтил) амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36] пиримидина (60,0 мг, 0,2|3 ммоль) в дихлорметане (2,0 мл) добавляли Ν-триметилсилилизоцианат (43,3 мг, 0,05| мл, 0,320 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч, а затем добавляли водный раствор бикарбоната натрия. После фильтрации через небольшое количество силикагеля, фильтрат концентрировали в вакууме досуха с получением 9,8 мг (М%) 4-(2-карбамидоэтил)амино-5,6диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидина. МС (ЭН): 325,2 (ΜΜ).

Нижеследующие соединения получали способом, описанным в примере 7.

61-4-(2-Ацетиламинопропил)амино-5,6диметил-2-фенил-7Н-пирро ло -[2,36] пиримидин.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: 1,28-1,32 (д, 1=8 Гц, 3Н), Ц66 (с, 3Н), Ц96 (с, 3Н), 2,30 (с, 3Н), 3,76-3,83 (м, 2Н), 4,|0-4,30 (м, |Н), 5,605,66 (т, 1=6 Гц, Ш), 7,40-7^ (м, 3Н), 8,36-8,43 (м, 2Н), |0,83 (с, |Н); МС (ЭН): 338,2 (Μ⁺+|).

(К)-4-(2-Ацетиламинопропил)амино-5,6диметил-2-фенил-7Н-пирроло -[2,36] пиримидин.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: (д, 3Н), |,66 (с, 3Н), |,99 (с, 3Н), 2,3| (с, 3Н), 3,78-3,83 (м, 2Н), 4,|7-4,22 (м, |Н), 5,67 (т, |Н), 7,38-7,5 (м, 3Н), 8,39 (м, 2Н), 10,81 (с, Ш); МС (ЭН):

338,2 (Μ⁺+|).

(К)-4-( 1 -метил-2-ацетиламиноэтил)амино-

5.6- диметил-2-фенил-7Н -пирроло [2,36] пиримидин.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: 1,41 (д, 3Н), |,68 (с, 3Н), 2,2| (с, 3Н), 2,34 (с, 3Н), 3,46-3,52 (шир.м, 2Н), 4,73 (м, |Н), 5,22 (д, |Н), 7,4|-7,46 (м, 3Н), 8,36-8,40 (м, 2Н), 8,93 (с, |Н); МС (ЭН):

338,2 (Μ⁺+|).

(8)-4-(2-Ацетиламинопропил)амино-5,6диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: (д, 3Н), |,66 (с, 3Н), 2,26 (с, 3Н), 2,35 (с, 3Н), 3,78-3,83 (м, 2Н), 4,|7-4,22 (м, |Н), 5,67 (т, |Н), 7,38-7,5 (м, 3Н), 8,39 (м, 2Н), 8,67 (с, Ш); МС (ЭН):

338,2 (Μ⁺+|).

(8)-4-(1-Метил-2-ацетиламиноэтил)амино -

5.6- диметил-2-фенил-7Н-пирроло [2,36] пиримидин.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: 1,41 (д, 3Н), |,68 (с, 3Н), 2,05 (с, 3Н), 2,32 (с, 3Н), 3,46-3,52 (м, 2Н), 4,73 (м, |Н), 5,22 (д, |Н), 7,4|-7,46 (м, 3Н), 8,36-8,40 (м, 2Н), |0,|3 (с, |Н); МС (ЭН):

338,2 (Μ⁺+|).

Пример Ю. Реакцию 4-хлор-5,6-диметил-2фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидина со смесью 61-|-амино-2-(|,|-диметоксиэтокси)карбониламинопропана и 61-2-амино-|-(|,|-диметоксиэтокси)карбониламинопропана проводили способом, описанным в примере |. В результате этой реакции получали смесь 61-4-(|-метил-2(|,|-диметилэтокси)карбониламино)этиламино5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло [2,36] пиримидина и 61-4-(2-метил-2-(|,|-диметилэтокси) карбониламино)этиламино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло [2,36] пиримидина, которую разделяли с помощью колоночной хроматографии (ЕЮАс/гексан=Г3). Первая фракция представляла собой 61-4-(|-метил-2-(|,|-диметилэтокси)карбониламиноэтил)амино-5,6-диметил2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: 1,29-1,38 (м, |2Н), |,95 (с,3Н), 2,3| (с, 3Н), 3,34-3,43 (м, 2Н), 4,62-4,70 (м, Ш), 5,36-5,40 (д, 1=8 Гц, Ш), 5,53 (шир., |Н), 7,37-7,49 (м, 3Н), 8,37-8,44 (м, 2Н), Ю,75 (с, Ш), МС (ЭН): 396,3 (ΜΉ).

Вторая фракция представляла собой 61-4(2-(|,|-диметоксиэтокси)карбониламинопропил) амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36] пиримидин.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: 1,26-1,40 (м, |2Н), 2,00 (с, 3Н), 2,3| (с, 3Н), 3,60-3,90 (м, 2Н), 3,95-4,Ю (м, Ш), 5,4Ь5,44 (д, 1=6,0 Гц, Ш),

5,65 (шир., |Н), 7,40-7,46 (м, 3Н), 8,37-8,44 (м, 2Н), Ю,89 (с, Ш); МС (ЭН): 396,2 (ΜΉ).

Нижеследующие соединения получали способом, описанным в примере |0.

(8,8)-4-(2-Ацетиламиноциклогексил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: Ц43 (м, 4Н), |,60 (с, 3Н), |,83 (м, 2Н), 2,|8 (с, 3Н), 2,30 (м, 2Н), 2,32 (с, 3Н), 3,73 (шир., |Н), 4,25 (шир., |Н), 5,29 (д, |Н), 7,43-7,48 (м, 3Н), 8,35-8,40 (м, 2Н), 9,05 (с, |Н).

4-(2-Метил-2-ацетиламинопропил)амино5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: (с, 6Н), |,56 (с, 3Н), 2,07 (с, 3Н), 2,36 (с, 3Н), 3,76 (д, 2Н), 5,78 (т, |Н), 7,4|-7,48 (м, 3Н), 7,93 (с, |Н),

8,39 (м, 2Н), Ю,07 (с, Ш); МС (ЭН): 352,3 (ΜΉ).

Пример ||. 61-4-(|-Метил-2-(|,|-диметилэтокси)карбониламиноэтил)амино-5,6-диметил2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин (60,6 мг, 0,|53 ммоль) обрабатывали трифторуксусной кислотой (0,5 мл) в дихлорметане (2,0 мл) в течение |4 ч. Органический растворитель удаляли в вакууме досуха. Остаток растворяли в Ν,Νдиметилформамиде (2,0 мл) и триэтиламине (2,0 мл). К раствору при 0°С добавляли уксусный ангидрид (|7,2 мг, 0,0|6, 0,|69 ммоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 48 ч, а затем концентрировали в вакууме досуха. Остаток подвергали препаративной тонкослойной хроматографии (ЕЮАс) с получением 27,0 мг (52%) 61-4-( Ь метил-2-ацетиламиноэтил)амино-5,6-диметил-2фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидина.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: 1,38-1,42 (д, 1=8 Гц, 3Н), Ц69 (с, 3Н), 2Щ (с, 3Н), 2,32 (с,3Н), 3,38-3,60 (м, 2Н), 4,65-4,80 (м, |Н), 5,23-5,26 (д, 1=6Гц, Ш), 7,40-7^ (м, 3Н), 8,37-8,43 (м, 2Н), |0,44 (с, |Н); МС (ЭН): 338,2 (Μ⁺+|).

Пример 12. (К,К)-4-(2-аминоциклогексил) амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36] пиримидин, полученный способом, описанным в примере 1, из 4-хлор-5,6-диметил-2-фенил-7Нпирроло[2,36]пиримидина (0,15 г, 0,583 ммоль) и (1К,2К)-(-)-1,2-диаминоциклогексана (0,63 г, 5,517 ммоль), обрабатывали триэтиламином (0,726 г, 7,175 ммоль) и уксусным ангидридом (0,325 г, 3,18 ммоль) в Ν,Ν-диметилформамиде (10,0 мл) при комнатной температуре в течение 2 ч. После удаления растворителя в вакууме, к остатку добавляли этилацетат (10,0 мл) и воду (10,0 мл). Смесь отделяли и водный слой экстрагировали этилацетатом (2 х 10,0 мл). Объединенный этилацетатный раствор сушили (Мд§0₄) и фильтровали. Фильтрат концентрировали в вакууме досуха и остаток подвергали колоночной хроматографии (ЕЮАс:гексан=1:1) с получением 57,0 мг (26%) (К,К)-4-(2-ацетиламиноциклогексил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Нпирроло [2,36] пиримидина.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭС1₃) δ: 1,43 (м, 4Н), 1,60 (с, 3Н), 1,84 (м, 2Н), 2,22 (с, 3Н), 2,30 (м, 2Н), 2,33 (с,3Н), 3,72 (шир., 1Н), 4,24 (шир., 1Н), 5,29 (д, 1Н), 7,43-7,48 (м, 3Н), 8,35-8,39 (м, 2Н), 8,83 (с, 1Н); МС (ЭН): 378,3 (М+1).

Пример 13. К раствору 4-(2-гидроксиэтил) амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36] пиримидина (40,0 мг, 0,141 ммоль) в пиридине (1,0 мл) добавляли уксусный ангидрид (0,108 г,

I, 06 ммоль) при 0°С.

Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч и растворитель удаляли в вакууме. Остаток подвергали препаративной тонкослойной хроматографии (Е1ОАс:гексан=1:1) с получением 32,3 мг (71%) 4-(2-ацетилоксиэтил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло [2,36] пиримидина.

Ή-ЯМР (200 МГц, СЭСГ) δ: 1,90 (с, 3Н), 2,08 (с, 3Н), 2,31 (с, 3Н), 4,05 (м, 2Н), 4,45 (т, 2Н), 5,42 (м, 1Н), 7,41-7,49 (м, 3Н), 8,42 (м, 2Н),

II, 23 (с, 1Н).

Пример 14. Раствор Етос-3-А1а-ОН (97,4 мг, 0,313 ммоль) и оксалилхлорида (39,7 мг, 27,3 мкл, 0,313 ммоль) в дихлорметане (4,0 мл) с 1 каплей Ν,Ν-диметилформамида перемешивали при 0°С в течение 1 ч, а затем добавляли 4(2-аминоэтил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Нпирроло[2,36]пиримидин (80,0 мг, 0,285 ммоль) и триэтиламин (57,6 мг, 79,4 мкл, 0,570 ммоль) при 0°С. Через 3 ч, смесь концентрировали в вакууме и остаток обрабатывали раствором 20% пиперидина в Ν,Ν-диметилформамиде (2,0 мл) в течение 0,5 ч. После удаления растворителя в вакууме, остаток промывали смесью диэтилового эфира:гексана (1:5) с получением 3,0 г (3%) 4-(6-амино-3-аза-4-оксоэтил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидина. МС (ЭН): 353,2 (М⁺+1).

Пример 15. Раствор 4-(2-аминоэтил)амино5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло [2,36] пирими дина (70,0 мг, 0,249 ммоль) и янтарного ангидрида (27,0 мг, 0,274 ммоль) в дихлорметане (4,0 мл) с 1 каплей Ν,Ν-диметилформамида перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь экстрагировали 20% гидроксидом натрия (3 х 5,0 мл). Водный раствор подкисляли 3М гидрохлоридом до рН=7,0. Всю эту смесь экстрагировали этилацетатом (3 х 10 мл). Объединенный органический раствор сушили (Мд§О₄) и фильтровали. Фильтрат концентрировали в вакууме досуха с получением 15,0 мг (16%) 4-(7-гидрокси-3-аза-4,7-диоксогептил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидина. МС (ЭН): 382,2 (М⁺+1).

Пример 16.

К 10 мл диметилформамида (ДМФ) при комнатной температуре добавляли 700 мг 4(цис-3-гидроксициклопентил)амино-2-фенил-

5.6- диметил-7Н-пирроло[2,36]пиримидина, а затем добавляли 455 мг Ν-Вос-глицина, 20 мг Ν,Ν-диметиламинопиридина (ОМАР), 293 мг гид-роксибензотриазола (НОВТ) и 622 мг гидрохлорида 1 -(3 -диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (ΈΩΓΊ). Реакционную смесь оставляли на ночь при перемешивании. Затем, ДМФ удаляли при пониженном давлении и реакционную смесь распределяли между 20 мл этилацетата и 50 мл воды. Водную часть экстрагировали еще 2 х 20 мл этилацетата и объединенные органические части промывали солевым раствором, сушили безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. В результате очистки на силикагеле при элюировании смесью этилацетата/гексана получали 410 мг нужного продукта: 4-(цис-3-(№трет-бутоксикарбонил-2-аминоацетокси)циклопентил) амино-2-фенил-5,6-диметил-7Н-пирроло[2,36] пиримидина, МС (ЭН): (М⁺+1) =480,2. Затем, сложный эфир обрабатывали 5 мл 20% трифторуксусной кислотой в дихлорметане при комнатной температуре, оставляли на ночь, после чего концентрировали. После обработки этилацетатом получали 300 мг беловатого твердого вещества, соли трифторуксусной кислоты и 4(цис-3-(2-аминоацетокси) циклопентил)амино-

5.6- диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидина, МС (ЭН): (М⁺+1) = 380,1.

Следует отметить, что вышеописанными методами могут быть получены следующие соединения.

4-(цис-3-Гидроксициклопентил)амино-5,6диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин, МС (ЭН) : (М⁺+1) =323,1.

Соль трифторуксусной кислоты и 4-(цис-3(2-аминоацетокси)циклопентил)амино-5,6диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидина, МС (ЭН): (М⁺+1)=380,1.

4-(3-Ацетамидо)пиперидинил-5,6-диметил2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин, МС (ЭН): (М⁺+1)=364,2.

4-(2-№-Метилкарбамидопропил )амино-5,6диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин, МС (ЭН): (М⁺+1) =353,4.

4-(2-Ацетамидобутил) амино-5,6-диметил2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин, МС (ЭН): (М⁺+1)=352,4.

4-(2-№-Метилкарбамидобутил)амино-5,6диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин, МС (ЭН): (М⁺+1)=367,5.

4- (2-Аминоциклопропилацетамидоэтил) амино-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин, МС (ЭН):(М⁺+1)=309,1.

4-(транс-4-Гидроксициклогексил)амино-2(3-хлорфенил)-7Н-пирроло[2,36]пиримидин, МС (ЭН): (М⁺+1)=342,8.

4-(транс-4-Гидроксициклогексил)амино-2(3-фторфенил)-7Н-пирроло[2,36]пиримидин, МС (ЭН): (М⁺+1 )=327,2.

4-(транс-4-Гидроксициклогексил)амино-2(4-пиридил)-7Н-пирроло [2,36] пиримидин, МС (ЭН): (М⁺+1)=310,2.

Пример 17.

Схема IX

Азот пиррола (7) (Схема IX) защищали дитрет-бутилдикарбонатом в основных условиях с получением соответствующего карбама-та (22). Радикальное бромирование соединения (22) протекало региоселективно с образованием бромида (23). В основном, соединение (23) служит ключевым электрофильным промежуточным соединением для различных партнеров по нуклеофильному связыванию. Замена алкилбромида тригидратом фенолята натрия приводит к получению соединения (24). Последующая замена арилхлорида и удаление третбутилкарбаматной защитной группы в одной стадии приводит к получению нужного соединения (25).

Подробное описание синтеза соединений (22)-(25) в соответствии со схемой IX

Ди-трет-бутилдикарбонат (5,37 г, 24,6 ммоль) и диметиламинопиридин (1,13 г, 9,2 ммоль) добавляли к раствору, содержащему соединение (7) (1,50 г, 6,15 ммоль) и пиридин (30 мл). Через 20 ч реакционную смесь концентрировали и остаток распределяли между СН₂С1₂ и водой. СН₂С1₂-слой отделяли, сушили

Мд8О₄, фильтровали и концентрировали с получением черного твердого вещества. После флэш-хроматографии (8Ю₂; 1/9 ЕЮАе/гексан, В£=0,40) получали 1,70 г (80%) белого твердого вещества (22). ¹Н-ЯМР (200 МГц, СВС1₃) δ: 8,50 (м, 2Н, Аг-Н), 7,45 (м, 3Н, Аг-Н), 6,39 (с, 1Н, пиррол-Н), 2,66 (с, 3Н, пиррол-СН3), 1,76 (с, 9Н, карбамат-СН3); МС, М+1=344,1; Т.пл.175177°С.

Ν-Бромсукцинимид (508 мг, 2,86 ммоль) и ΑΣΒΝ (112 мг, 0,68 ммоль) добавляли к раствору, содержащему соединение (22) (935 мг, 2,71 ммоль) и СС14 (50 мл). Раствор нагревали с обратным холодильником. Через 2 ч, реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и концентрировали в вакууме с получением белого твердого вещества. После флэш-хроматографии (81О₂; 1/1 СН₂С1₂/гексан, В£ = 0,30) получали 960 мг (84%) белого твердого вещества (23).

¹Н-ЯМР (200 МГц, СВОД δ: 8,52 (м, 2Н, Аг-Н), 7,48 (м, 3Н, Аг-Н), 6,76 (с, 1Н, пиррол-Н), 4,93 (с, 2Н, пиррол-СН₂Вг), 1,79 (с, 9Н, карбамат-СН₃); МС, М+1=423,9; Т.пл.155-157°С.

Тригидрат феноксида натрия (173 мг, 1,02 ммоль) добавляли одной порцией к раствору бромида (23) (410 мг, 0,97 ммоль) в СН2С12 (5 мл) и ДМФ (10 мл). Через 2 ч, реакционный раствор распределяли между СН2С12 и водой. Водный слой экстрагировали СН₂С1₂. Объединенные СН2С12-слои промывали водой, сушили Мд8О₄, фильтровали и концентрировали с получением желтого твердого вещества. После флэш-хроматографии (8Ю₂; 1/9 ЕЮЛе/гексан, В£=0,30) получали 210 мг (50%) белого твердого вещества (24).

¹Н-ЯМР (200 МГц, СВС1₃) δ: 8,53 (м, 2Н, Аг-Н), 7,48 (м, 3Н, Аг-Н), 7,34 (м, 2Н, Аг-Н), 7,03 (м, 3Н, Аг-Н), 6,83 (с, 1Н, пиррол-Н), 5,45 (с, 2Н, АГСН2О), 1,76 (с, 9Н, карбамат-СН3); МС, М⁺= 436,2.

Раствор, содержащий соединение (24) (85 мг, 0,20 ммоль), Ν-ацетилэтилендиамин (201 мг, 1,95 ммоль) и ДМСО (3 мл), нагревали до 100°С. Через 1 ч, температуру повышали до 130°С. Через 3 ч реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и распределяли между ЕЮАс и водой. Водный слой экстрагировали ЕЮАс (2х). Объединенные ЕЮАс-слои промывали водой, сушили Мд8О₄, фильтровали и концентрировали. После флэш-хроматографии (8Ю₂, 1/10 ЕЮН/СНСЦ Ш=0,25) получали 73 мг (93%) белого пенистого твердого вещества (25).

Ή-ЯМР (200 МГц, ДМСО-6б) δ: 11,81 (шир.с, 1Н, Ν-Н), 8,39 (м, 2Н, Аг-Н), 8,03 (шир.т, 1Н, Ν-Н), 7,57 (шир.т., 1Н, Ν-Н), 7,20-7,50 (м, 5Н, Аг-Н), 6,89-7,09 (м, 3Н, Аг-Н), 6,59 (с, 1Н, пиррол-Н), 5,12 (с, 2Н, АгСН₂О), 3,61 (м, 2Н, ΝίΉ^ 3,36 (м, 2Н, Ν№₂), 1,79 (с, 3Н, СОСН₃); МС, М+1=402,6.

Нижеследующие соединения получали способом, описанным в примере 17.

4-(2-Ацетиламиноэтил)амино-6-феноксиметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин, т.пл. 196-197°С; МС (ЭН): 401,6 (М⁺+1).

4-(2-Ацетиламиноэтил)амино-6-(4-фторфенокси)метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин. МС (ЭН): 420,1 (М⁺+1).

4-(2-Ацетиламиноэтил)амино-6-(4-хлорфенокси)метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин. МС (ЭН): 436,1 (М⁺+1).

4-(2-Ацетиламиноэтил)амино-6-(4-метоксифенокси)метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36] пиримидин. МС (ЭН): 432,1 (М⁺+1).

4-(2 - Ацетиламиноэтил) амино -6-(Ν-пиридин-2-он)метил-2-фенил-7Н -пирроло [2,36] пиримидин. МС (ЭН): 403,1 (М⁺+1).

4-(2-Ацетиламиноэтил)амино-6-(№фениламино)метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин. МС (ЭН): 400,9 (М+1).

4-(2-Ацетиламиноэтил)амино-6-(№метил№фениламино)метил-2-фенил-7Н-пирроло [2,36]пиримидин. МС (ЭН): 414,8 (М⁺+1).

4-(2-№-Метилкарбамидоэтил)амино-6феноксиметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин. МС (ЭН): 416,9 (М⁺+1).

Анализ на аденозиновые рецепторы человека А1 и А2а с использованием репортерного гена дрожжевой -галактозидазы

Дрожжевые штаммы (8. се^еν^8^ае) трансформировали человеческим аденозином А1 (А1Я; САЭи8 штамм СУ12660) или человеческим А2а (А2а; САИи8 штамм СУ12660) и добавляли репортерный ген 1асΖ(β-галактозидазы) для использования в качестве функционального индекса. Полное описание трансформаций приведено ниже (см. раздел Дрожжевые штаммы). Для всех анализов, в качестве лиганда использовали ХЕСА(5'-Л-этилкарбоксамидоаденазин), сильный агонист аденозинового рецептора, имеющий аналогичную аффинность для рецеп торов А1 и А2а. Испытуемые соединения оценивали при 8 концентрациях (0,1-10000 нМ) на их способность ингибировать ИЕСА-индуцированную β-галактозидазную активность под действием Су12660 или СУ8362.

Получение исходных дрожжевых культур

Каждый из соответствующих дрожжевых штаммов, СУ 12660 и СУ8362. наносили штрихами на планшет с ЬТ-агаром и инкубировали при 30°С до тех пор, пока не появлялись колонии. Дрожжи от этих колоний добавляли к ЬТжидкости (рН 6,8) и культивировали в течение ночи при 30°С. Затем каждый дрожжевой штамм разводили до ОП600=1,0-2,0 (приблизительно 1-2 х 10⁷ клеток/мл), как было определено путем спектрофотометрии (Мо1еси1аг Оет1се5 УМАХ). К каждой 6 мл дрожжевой жидкой культуре добавляли 4 мл 40% глицерина (1:1,5 об.:об.) (маточный раствор дрожжей/ глицерина). Из этого маточного раствора дрожжей/глицерина брали десять 1 мл аликвот и хранили при -80°С до тех пор, пока они не потребуются для анализа.

Анализ на дрожжевые рецепторы А1 (А1Я) и А2а (А2аЯ)

Один сосуд, содержащий маточный дрожжевой/ глицериновый раствор для каждого из СУ12660 и СУ8362, оттаивали и использовали для инокуляции дополненной жидкой ЬТ-среды, рН 6,8 (92 мл) жидкости ЬТ, в которую было добавлено: 5 мл 40% глюкозы, 0,45 мл 1М КОН и 2,5 мл (Р1ре8, рН 6,8). Жидкие культуры выращивали при 30°С в течение 16-18 ч (в течение ночи). Затем, аликвоты, взятые от ночных культур, разводили в среде ЬТ, содержащей 4 ед./мл аденозин-дезаминазы (тип VI или VII, полученный из слизистой кишечника теленка, 8щша) с получением ОП₆₀₀=0,15 (1,5 х 10⁶ клеток/мл) для СУ18362 (А2аЯ) и ОП₆₀₀=0,50 (5 х 10⁶ клеток/мл) для СУ12660 (А1Я).

Анализы проводили с конечным объемом 100 мкл в 96-луночных микротитрационных планшетах, так, чтобы во всех лунках достигалась конечная концентрация 2% ДМСО. Для первичного скрининга, были использованы 1-2 концентрации тестируемых соединений (10 мкМ, 1 мкМ). Для получения профиля соединений были протестированы 8 концентраций (10000, 1000, 500, 100, 50, 10, 1 и 0,1 нМ). Для каждого микротитрационного планшета, в контрольные и полные лунки добавляли 10 мкл 20% ДМСО, а в неизвестные лунки добавляли 10 мкл тестируемого соединения (в 20% ДМСО). Затем в полные и неизвестные лунки добавляли 10 мкл ЛЕСА (5 мкМ для А1Я, 1 мкМ для А2аЯ), а в контрольные лунки добавляли 10 мкл РВ8. При конечном добавлении, во все лунки добавляли 80 мкл дрожжевого штамма СУ8362 или СУ12660. Все планшеты затем быстро перемешивали (на лабораторном орбитальном шейкере ЬаЬЫпе в течение 2-3 мин) и оставляли для инкубирования на 4 ч при 30°С в осушенной печи.

β-Галактозидазная активность может быть оценена с использованием колориметрических (например, О№С, СРРС), люминесцентных (например, 6а1ас!оп-8!аг) или флуориметрических субстратов (например, ΕΌ6, РскогиПп). В настоящее время, предпочтительной является флуоресцентная детекция, которую осуществляют исходя из более высокого отношения сигнал: шум, которая, в основном, свободна от интерференции и является недорогостоящей. Во все лунки при концентрации 20 мкл/лунку (конечная концентрация = 80 мкМ) добавляли флуоресцеин дегалактопиранозид (ЕЭС, Мо1сси1аг РгоЬск или Магксг Сспс Тсскпо1од1с8), т.е., флуоресцентный субстрат для β-галактозидазы. Планшеты встряхивали в течение 5-6 с (на лабораторном орбитальной шейкере ЬаЬЬшс), а затем инкубировали в течение 90 мин при 37°С (95% О₂ 5% СО₂ инкубатор). По истечении 90-минутного периода инкубирования, развитие β-галактозидазной активности прекращали с использованием 20 мкл/лунку 1М №₂СОз, и все планшеты встряхивали в течение 5-6 с. Затем планшеты встряхивали в течение 6 с и определяли относительную интенсивность флуоресценции с использованием флуориметра (Тесап ЗрссйаПног; возбуждение = 485 нм, излучение = 535 нм).

Вычисления

Значения относительной флуоресценции для контрольных лунок интерпретировали как фон и вычитали из значений для полных и неизвестных лунок. Профили соединений анализировали посредством логарифмического преобразования (ось х: концентрация соединения), а затем для вычисления величин 1С₅₀ (СгаркРак Рпкт).

Дрожжевые штаммы

Были получены штаммы Засскаготусск ссгсуЩас СУ12660 [£аг1*1442 !Ь!1-1 £и81-Н183 сап1 8!с14::!гр1::ЬУ82 к!с3*1156 дра1 (41)-6αί3 1ук2 ига3 1си2 1гр1:1Й83; ЬЕИ2 РСКр М£а1Ьсаксг-йА1В-РНО5!сгт 2ти-огщ РЕР3 Атрг] и СУ8362 [дра1р-гСакЕ10К £аг1*1442 !Ь!1-1 &81-Н183 сап1 8!с14::1гр1:ЬУ82 к!с3*1156 1ук2 ига3 1си2 1гр1 к1к3; ЬЕИ2 РСКр-кА2аВ 2тиоп КЕР3 Атрг].

Среда ЬТ

Среда ЬТ (Ьси-Тгр-дополненная) состоит из 100 г дрожжевого азотистого основания О1ЕСО и добавленных в нее следующих компонентов: 1,0 г валина, 1,0 г аспарагиновой кислоты, 0,75 г фенилаланина, 0,9 г лизина, 0,45 г тирозина, 0,45 г изолейцина, 0,3 г метионина, 0,6 г аденина, 0,4 г урацила, 0,3 г серина, 0,3 г пролина, 0,3 г цистеина, 0,3 г аргинина, 0,9 г гистидина и 1,0 г треонина.

Конструирование дрожжевых штаммов, экспрессирующих аденозиновый рецептор А1 человека

В этом примере описано конструирование дрожжевых штаммов, экспрессирующих аденозиновый рецептор А1 человека, функционально интегрированный в каскад реакций с участием феромона в дрожжевой системе.

I. Конструирование экспрессирующего вектора.

Для конструирования дрожжевого вектора, экспрессирующего аденозиновый рецептор А1 человека, кДНК аденозинового рецептора А1 получали посредством ПЦР с использованием обратной транскриптазы мРНК гиппокампа человека с использованием праймеров, сконструированных на основе опубликованной последовательности аденозинового рецептора А1 человека и с помощью стандартной техники. ПЦРпродукт субклонировали в №о1- и ХЬа1-сайты экспрессирующей дрожжевой плазмиды рМР15.

Плазмиду рМР15 получали из рЬРХ! следующим образом: ХЬа1-сайт УЕР51 (Вгоаск, 1Р. с! а1. (1983) Усс!ог8 £ог Ыдк-1сус1, ткис1Ь1с схргсккюп о£ с1опск дспск ш усак! р.83-117 ш М.1поиус (ск.), Ехрсптсп1а1 Машрц1а!юп о£ Сспс Ехргсккюп. Асакстк Ргскк, №\ν Уогк) элиминировали путем гидролиза, достраивали по концам и снова лигировали с получением Уср5ШсоЭХЬа. Другой ХЬа1-сайт конструировали в ВатН1-сайте путем рестрикции ВатН1, достраивали по концам, лигировали с линкером (№\ν Епд1апк Вю1аЬк, #1081), расщепляли ХЬа1 и снова лигировали с получением УЕР5 ШсоХ!. Эту плазмиду расщепляли Екр31 и №о1 и лигировали с фрагментами Ьси2 и РСКр, генерированными посредством ПЦР. 2 т.п.о.-Ееи2-ПЦРпродукт генерировали путем амплификации из УЕР5Шсо с использованием праймеров, содержащих Екр31- и Вд111. ПЦР-продукт рСКр, состоящий из 600 пар оснований, генерировали путем амплификации из рРСКак (Капд, У.-8. с! а1. (1990) Мо1.Сс11.В1о1. 10:2582-2590) с использованием ПЦР-праймеров, содержащих Вд111- и №о1-сайты. Полученную плазмиду обозначали рЬРХ!. рЬРХ! модифицировали путем встраивания кодирующей области лидерной пре-пропоследовательности а-фактора в №о1-сайт. Лидерную пре-про-последовательность встраивали так, чтобы №о1-сайт клонирования сохранялся на 3'-конце этой лидерной последовательности, но не восстанавливался на 5'-конце. Таким образом, рецепторы могут быть клонированы путем расщепления плазмиды ферментами №о1 и ХЬа1. Полученную плазмиду обозначали рМР15.

Плазмиду рМР15, в которую была встроена кДНК аденозинового рецептора А1 человека, обозначали р5095. В этом векторе, кДНК рецептора лигировали к 3'-концу препро-лидерной последовательности а-фактора дрожжей. В процессе созревания белка, пептидные препропоследовательности отщеплялись с образовани ем зрелого полноразмерного рецептора. Этот происходит во время процессинга рецептора посредством каскада секреторных реакций дрожжей. Эту плазмиду поддерживали путем Ьеи-селекции (то есть, путем культивирования на среде, не содержащей лейцина). Определяли последовательность клонированной кодирующей области и было обнаружено, что она эквивалентна последовательности, опубликованной в литературе (СепВапк номера доступа 845235 и 856143).

II. Конструирование дрожжевого штамма.

Для создания дрожжевого штамма, экспрессирующего аденозиновый рецептор А1 человека, в качестве родительского штамма использовали дрожжевой штамм СУ7967. СУ7967 имеет следующий генотип: МАТа драО1163 §ра1 (41)Са13 £агЮ1442 1Ы-1 ЕИ81-Н183 сап1 51е14::1гр1::ЬУ82 81е3И1156 1у§2 ига3 1еи2 1гр1 Ь183.

Генетические маркеры представлены ниже:

МАТа	Тип скрещивания а
драЮПбЗ	Эндогенный СРА1 С-белка дрожжей делетирован
дра1(41)Оаг3	дра1(41)-Са13 Интегрирован в геном дрожжей. Этот химерный белок Са состоял из первых 41 аминокислоты эндогенной субъединицы СРА1 дрожжевого белка Са, присоединенной к Са13 Сбелка млекопитающего, в которой были делетированы когнатные Ν-концевые аминокислоты
/аг1Б1442	Ген ГАК.1 (ответственный за прекращение клеточного цикла) был делегирован (в результате чего прекращается клеточный цикл после активации каскада реакций феромонового ответа)
1Ь1-1	Штамм с высокой эффективностью трансформации путем электропорации
гим-нмз	Гибрид промотора Γυ81 с кодирующей областью (в результате чего создан ген Ш83, индуцируемый феромоном)
сап1	Аргинин/ канавинин-пермеаза
з1е14::1гр1::1У82	Дизрупция гена 8ΤΕ14, С-фарнезилметилтранс-феразы (благодаря чему снижается передача базального сигнала по феромоновому пути)
Ае3Б115б	Эндогенный дрожжевый 8ТЯ, феромоновый рецептор фактора а (8ΤΕ3) был

разрушен

1уз2 Дефектный по 2-аминоапидат-редуктазе, дрожжам, для их роста, необходим лизин игаЗ Дефектный по оротидин-5'-фосфатдекарбоксилазе, дрожжам, для их роста, необходим урацил.

1еи2 Дефектный по Ь-изопропилмалатдегидрогеназе, дрожжам, для их роста, необходим лейцин

1гр1 Дефектный по фосфорибозил-лантранилату, дрожжам, для их роста, необходим триптофан

ЫзЗ Дефектный по имидазолглицеринфосфатдегидрогеназе, дрожжам, для их роста, необходим гистидин.

В штамм СУ7967, путем электропорации, трансформировали две плазмиды: плазмиду р5095 (кодирующую человеческий аденозиновый рецептор А1, описанный выше) и плазмиду р1584, которая несет репортерный ген Γυ81-βгалактозидазы. Плазмида р1584 была получена из плазмиды рЯ8426 (СйпФапкоп, Т.^. е! а1., (1992) Сепе 110:119-1122). Плазмида рЯ8426 содержит полилинкерный сайт в нуклеотидах 2004-2016. Для получения плазмиды р1584, гибрид промотора Γυ81 и гена β-галактозидазы встраивали в рестрикционные сайты Еад1 и ХМ. Плазмиду р1584 поддерживали путем Тгрселекции (то есть, путем культивирования на среде, не содержащей лейцина).

Полученный штамм, несущий р5095 и р1584 и обозначенный СУ12660, экспрессировал человеческий аденозиновый рецептор А1. Для культвирования этого штамма в жидкой среде или на чашках с агаром использовали минимальные среды, не содержащие лейцина и триптофана. Для проведения анализа на рост этого штамма на чашках (анализ на Еи81-Н183), использовали чашки со средой при рН 6,8, содержащей 0,5-2,5 мМ 3-амино-1,2,4-триазол и не содержащей лейцина, триптофана и гистидина. В качестве контроля на специфичность, во всех экспериментах был осуществлен скрининг с проведением сравнения семи трансмембранных рецепторов, происходящих от одного или нескольких других видов дрожжей.

Конструирование дрожжевых штаммов, экспрессируюших аденозиновый рецептор человека А2а

В этом примере описано конструирование дрожжевых штаммов, экспрессируюших аденозиновый рецептор человека А2а, который был функционально интегрирован в каскад реакций с участием феромона в дрожжевой системе.

I. Конструирование экспрессирующего вектора.

Для конструирования дрожжевого вектора, экспрессирующего аденозиновый рецептор А2а человека, получали кДНК аденозинового рецептора А2а от Иг. РЫ1 Мцгрйу (МН). После получения этого клона, его последовательность секвенировали на вставку рецептора А2а и было обнаружено, что она идентична опубликованной последовательности (СепВапк номера доступа # 846950). Из этой плазмиды вырезали кДНК рецептора с помощью ПЦР с использованием полимеразы νΕΝΤ и клонировали в плазмиду рЬРВХ, в которой экспрессия рецептора регулировалась конститутивным промотором дрожжевой фосфоглицерат-киназы (РСК). Затем последовательность всей вставки снова секвенировали, и было обнаружено, что она идентична опубликованной последовательности. Однако, благодаря используемой здесь стратегии, к карбокси-концу рецептора были присоединены три аминокислоты С1у8е1Уа1.

II. Конструирование дрожжевого штамма.

Для создания дрожжевого штамма, экспрессирующего аденозиновый рецептор А2а человека, в качестве родительского штамма использовали дрожжевой штамм СУ8342. СУ8342 имеет следующий генотип: МАТа ГагЮ1442 кЬк1 1уз2 ига3 1еи2 1гр 1 Ыз3 ГИ51-Ш83 сап1 5ке3О1156 драО1163 зке14::кгр1: : ЬУ82 дра1рг6_азЕ10К (или дра1р-г6_а,О2298 или дра1рΓ6_α3Ε10Κ+Ό2298).

Генетические маркеры описаны в примере 1 за исключением вариантов 6-белка. Для экспрессии человеческого рецептора А2а были использованы дрожжевые штаммы, в которых эндогенный 6РА1 белка 6 дрожжей был делегирован и заменен 6_аз млекопитающего. Было использовано три крысиных 6_аз-мутанта. Эти варианты содержат одну или две точковые мутации, которые превращают их в белки, эффективно связывающиеся с дрожжами β_γ. Они были идентифицированы как 6_α3Ε10Κ (в котором глутаминовая кислота в положении 10 заменена лизином), 6_α3Ό2298 (в котором аспарагиновая кислота в положении 229 заменена серином) и 6_α3Ε10Κ+Ό2298 (который содержит обе точковые мутации).

Штамм СУ8342 (несущий один из указанных трех мутантных крысиных С_аз-белков) был трансформирован либо родительским вектором рЬРВХ (рецептор^-), либо рЬРВХА2а (рецептор⁺). Для оценки степени активации пути феромонового ответа добавляли плазмиду с промотором ЕИ81, присоединенным к последовательностям, кодирующим β-галактозидазу (описанным выше).

Функциональный анализ с использованием дрожжевых штаммов, экспрессирующих человеческий аденозиновый рецептор А1

В этом примере описана разработка функционального анализа методом скрининга в дрожжах на модуляторы человеческого аденозинового рецептора А1.

I. Лиганды, используемые в анализе.

Для разработки этого анализа были использованы аденозин, являющийся природным агонистом для этого рецептора, и два других синтетических агониста. В субсерии экспериментов были использованы аденозин, который, как известно, имеет ЕС50 приблизительно 75 нМ, и (-)-Ы6-(2-фенилизопропил)аденозин (Р^), аффиность которого, как известно, составляет приблизительно 50 нМ. Во всех анализах на рост был использован 5'-Ы-этилкарбоксамидоаденозин (ЛЕСА). Для предупреждения передачи сигнала, обусловленной присутствием аденозина в культуральной среде, во все анализы добавляли аденозин-дезаминазу (4 ед./мл).

II. Биологический ответ в дрожжах.

Способность аденозинового рецептора А1 к функциональному связыванию в гетерологичной дрожжевой системе оценивали путем введения вектора, экспрессирующего рецептор А1 (р5095, описанный выше) в серию дрожжевых штаммов, которые экспрессируют различные субъединицы белка 6. Большинство этих трансформантов экспрессировали субъединицы 6_α подтипа 6_αι или 6_αο. Дополнительные белки 6_α были также протестированы на возможную идентификацию неспецифического связывания белка 6_α с рецептором. 8ТЕ18 или химерная конструкция 8ΊΈ18-6_γ2 были интегрированы в геном дрожжей различных штаммов. Дрожжевые штаммы содержали дефектный ген Ш83 и интегрированную копию Еи81-Ш83, что позволяет осуществлять отбор в селективной среде, содержащей 3-амино-1,2,4-триазол (протестированной при 0,2, 0,5 и 1,0 мМ) и не содержащей гистидина. Трансформанты выделяли и получали монослои на среде, содержащей 3-амино1,2,4-триазол, 4 ед./мл аденозиндезаминазы и не содержащей гистидина. Затем наносили пять микролитров различных концентраций лиганда (например, ИЕСА при 0, 0,1, 1,0 и 10 мМ). За ростом наблюдали в течение 2 дней. Таким образом, в различных штаммах дрожжей тестировали ответы в виде лиганд-зависимого роста. Результаты систематизировали ниже в табл. 3. Символ (-) означает, что лиганд-зависимой активации рецептора обнаружено не было, а (+) означает лиганд-зависимый ответ. Термин ЫРМА. указывает на лиганд-независимую активацию, опосредованную рецептором.

Таблица 3

Дрожжевой штамм	Субъединица 6а	Субъединица ©у	Варианты штаммов	Результат
СУ1316	6РА1	5ТЕ18		-
	ΟΡΑ41-6αί1			+
	СРА41-6а12			+
	ОРА41-Са13			+
	СРА41-Са12“6аов			ЫКМА
	СРА41-СазЕЮк			-
	6РА4 1~6а5О2293
ΟΥ79€7	6РА41-6О1з- Интегрированный	5ТЕ18		+++
СУ2120	6РА1	ЗТЕ18	53С2Д	+
	СРА41-Сац			+
	СРА41-Са12			+
	6ΡΑ41-Οαί3			+
	6РА41-Са12-СаОВ			ΣΙΚΜΑ
	6РА41-(эа5Е10К			-
	6РА4 1 “6(1302293			-
СУ9438	СРА1	ЗТЕ18-Су2		-
	6ΡΑ41-6αί1			+
	<3ΡΑ41-6αΐ2			+
	6ΡΑ41-6αΐ3			+
	СРА41~6αΐ2”θα0Β			ΣΙΚΜΑ
	6ΡΑ41-603ειοκ
	СРА4 1 “СаЗО2295			' -
СУ10560	СРА1интегрированный	5ТЕ18-6у2	ззЬ2Д	++

Как показано в табл. 3, было обнаружено, что стабильная передача большинства сигналов происходит в дрожжевом штамме, экспрессирующем химеру 6РА1(41)-6_ш3.

III. Анализ на Ги51-Ьас2.

Для более полной характеризации активации каскада реакции феромонового ответа, оценивали синтез β-галактозидазы посредством Ги51-Ьас2 в ответ на стимуляцию агонистом. Для проведения анализа на β-галактозидазу, к находящейся в средней фазе логарифмического роста культуре человеческого аденозинового рецептора А1, экспрессированного в дрожжевом штамме, коэкспрессирующем химеры 81с18-С-,2 и СРА₄1-С_а13, добавляли возрастающие концентрации лиганда. Трансформанты выделяли и культивировали в течение ночи в присутствии гистидина и 4 ед./мл аденозин-дезаминазы. После 5-часового инкубирования с 4 ед./мл аденозин-дезаминазы и лигандом, индуцирование βгалактозидазы измеряли с использованием СРКС в качестве субстрата для β-галактозида. В каждом анализе использовали 5 х 10⁵ клеток.

Результаты, полученные при стимуляции NЕСΑ, указывали на то, что при концентрации NЕСΑ 10^-8М, достигается, приблизительно, 2кратное увеличение уровня стимуляции βгалактозидазной активности. Более того, при концентрации №СА 10^-5М, наблюдалось приблизительно 10-кратное увеличение уровня стимуляции.

Эффективность этого анализа была увеличена путем подтверждения активности антагонистов по отношению к этому штамму. Два известных антагониста аденозина ХАС и ЭРСРХ были протестированы на их способность конкурировать с №СА (при 5 мМ) за активность в анализе на β-галактозидазу. В этих анализах, индуцирование β-галактозидазы измеряли с использованием ЕЭС в качестве субстрата и 1,6 х 10⁵ клеток на анализ. Результаты показали, что как ХАС, так и ЭРСРХ являются сильными антагонистами экспрессируемого в дрожжах аденозинового рецептора А1 с величинами 1С₅₀ = 44 нМ и 49 нМ, соответственно.

Для того, чтобы определить, является ли это ингибирующее действие специфическим по отношению к подтипу А1, была проведена серия дополнительных экспериментов путем анализа на рецептор А2а в дрожжах (описанный в примере 4). Результаты, полученные в анализе с использованием А2а-дрожжей, показали, что ХАС был относительно эффективным антагонистом рецептора А2а, что соответствует опубликованным данным. В противоположность этому, ЭРСРХ, как и предполагалось, исходя из опубликованных данных, был относительно инертным по отношению к этому рецептору.

IV. Мечение радиоактивным лигандом.

Анализ на аденозиновый рецептор, кроме того, заключается в измерении параметров связывания радиолигандов для рецептора. Заместительное связывание [³Н]СРХ с несколькими известными соединениями, являющимися лигандами для аденозинового рецептора, ХАС, ЭРСРХ и СС8 анализировали с использованием мембран, полученных от дрожжей, экспрессирующих человеческий аденозиновый рецептор А1. Для оценки специфичности связывания, результаты, полученные с использованием дрожжей, экспрессирующих человеческий аденозиновый рецептор А1, сравнивали с результатами, полученными для дрожжей, экспрессирующих человеческий аденозиновый рецептор А2а или человеческий аденозиновый рецептор А3. Для осуществления этого анализа, 50 мг мембран инкубировали с 0,4 мМ [³Н]СРХ и возрастающими концентрациями лиганда аденозинового рецептора. Инкубирование проводили в 50 мМ Трис-НС1, рН 7,4, 1 мМ ЕИТА, 10 мМ МдС1₂, 0,25% В8А и 2 ед./мл аденозиндезаминазы в присутствии ингибиторов протеазы в течение 60 мин при комнатной температуре. Связывание оценивали путем добавления охлажденного на льду 50 мМ Трис-НС1, рН 7,4 и 10 мМ МдС1₂, с последующей быстрой фильтрацией на фильтрах СЕ/В, предварительно пропитанных 0,5% полиэтиленимином, с использованием сборника Раскагб 96-луночных планшетов. Данные анализировали путем построения нелинейной кривой методом наименьших квадратов с использованием программного обеспечения Рпкт 2.01. Величины 1С₅₀, полученные в этом эксперименте, систематизированы ниже в табл. 4.

Таблица 4

		1С50 (нМ)
Соединение	ЕА1К	11А2аК	ЕА3К
ХАС	6.6	11.7	53.1
ЭРСРХ	8.5	326.4	1307.0
СС8-15943	13.1	15.8	55.5
\ТСА	215.5	294.9	34.9
К-Р1А	67.6	678.1	23.6
1В-МЕСА	727.7	859.4	3.1
Аллоксозин	1072.0	1934.0	8216.0

Эти данные указывают на то, что известные соединения обладают аффиностью, аналогичной аффинности, указанной в литературе. Эти данные, кроме того, свидетельствуют о том, что анализ с использованием дрожжей имеет достаточную чувствительность, позволяющую различать специфичность по отношению к подтипу рецептора.

Функциональный анализ с использованием дрожжевых штаммов, экспрессирующих человеческий аденозиновый рецептор А2

В этом примере описана разработка функционального анализа методом скрининга в дрожжах на модуляторы человеческого аденозинового рецептора А1.

I. Лиганды, используемые в анализе.

Для исследования человеческого аденозинового рецептора А2а, функционально экспрессированного в дрожжах, использовали природный лиганд аденозин, а также другие хорошо охарактеризованные и коммерчески доступные лиганды. Для постановки этого анализа были использованы три лиганда. Этими лигандами являются:

Лиганд	Известный К,	Функция
Аденозин	500 нМ	Агонист
5'-№Этилкарбоксамидоаденозин ^ЕСА)	10-15 нМ	Агонист
(-)-Ν6-(2- Фенилизопропил)аденозин (РТА)	100-125 нМ	Агонист

Для предотвращения передачи сигнала, обусловленной присутствием аденозина в культуральной среде, во все анализы добавляли аденозин-дезаминазу (4 ед./мл).

II. Биологический ответ в дрожжах.

Агонисты аденозинового рецептора А2а оценивали на способность к стимуляции ответного каскада реакций с участием феромона в дрожжах, трансформированных плазмидой, экспрессирующей рецептор А2а и экспрессирующей либо 6„,Е10К, либо 6_α,Ό2298, либо 6_а,Е10К+О2298. На способность лиганда стимулировать каскад реакций феромонового ответа рецепторзависимым образом указывает альтерация в фенотипе дрожжей. Активация рецептора приводила к модификации фенотипа гистидинового ауксотрофа в гистидиновый фототроф (активация Гик1-Н 183). Три независимых трансформанта выделяли и культивировали в течение ночи в присутствии гистидина. Клетки промывали для удаления гистидана и разводили до концентрации 2 х 10⁶ клеток/мл. 5 мкл каждого трансформанта наносили пятнами на неселективные среды (включающих гистидин) или селективные среды (1 мМ АТ) в отсутствие или в присутствии 4 ед./мл аденозин-дезаминазы. Планшеты культивировали при 30°С в течение 24 ч. В присутствии гистидина, как рецептор⁺штамм (К⁺), так и рецептор^--штамм (К^-) были способны к росту. Однако в отсутствие гистидина способным к росту оказался лишь К'. Поскольку в эти планшеты не было добавлено никакого лиганда, то этот факт может иметь два объяснения. Одна возможная интерпретация этого факта заключается в том, что дрожжи, несущие рецептор, имеют преимущественный рост, обусловленный лиганд-независимой активацией, опосредованной рецептором (ЫКМА). Альтернативно, дрожжи сами могут синтезировать лиганд аденозин. Для выявления эти двух возможностей, к растущим дрожжам и в планшеты добавляли фермент, который разлагает лиганд аденозин-дезаминазу (АДА). В присутствии аденозин-дезаминазы, К⁺-клетки прекращали свой рост в присутствии гистидана, что указывало на то, что дрожжи действительно синтезируют лиганд.

Эта интерпретация была подтверждена анализом на рост А2а в жидкой среде. В этом эксперименте, К'-дрожжи (штамм 6..Е10К, экспрессирующий рецептор А2а) инокулировали при трех плотностях (1 х 10⁶ клеток/мл; 3 х 10⁵ клеток/мл; или 1 х 10⁵ клеток/мл) в присутствии или в отсутствие аденозин-дезаминазы (4 ед./мл). Жесткость анализа повышалась с уве личением концентрации (0,01, 0,2 или 0,4 мМ) 3-амино-1,2,4-триазола (АТ), конкурентного антагониста имидазолглицерин-Р-дегидратазы, белкового продукта гена Ш83. В присутствии аденозин-дезаминазы и 3-амино-1,2,4-триазола, дрожжи росли более медленно. Однако, в отсутствие 3-амино-1,2,4-триазола, аденозин-дезаминаза оказывала незначительный эффект. Таким образом, аденозин-дезаминаза, сама по себе не оказывает непосредственного действия на каскад реакций феромонового ответа.

Альтернативным способом измерения роста и способом, масштаб которого может быть минимизирован для более тщательного скрининга, является анализ на пятна лиганда для рецептора А2а. Штамм 6„,Е10К, экспрессирующий рецептор А2а (А2аК⁺), или штамм, не содержащий рецептора (К^-), культивировали в течение ночи в присутствии гистидина и 4 ед./мл аденозин-дезаминазы. Затем клетки промывали для удаления гистидина и разводили до концентрации 5 х 10⁶ клеток/мл. 1 х 10⁶ клеток наносили путем разброса на чашки с селективной средой, содержащей 4 ед./мл аденозиндезаминазы и 0,5 или 1,0 мМ 3-амино-1,2,4триазола (АТ), и оставляли на 1 ч для осушки. Затем на монослой наносили по 5 мкл следующих реагентов: 10 мМ аденозина, 38,7 мМ гистидина, диметилсульфоксида (ДМСО), 10 мМ РЩ или 10 мМ NЕСА. Клетки культивировали при 30°С в течение 24 ч. Результаты показали, что без рецептора эти клетки могли расти только в присутствии гистидина, добавленного в среду. В противоположность этому, К⁺-клетки росли только на тех участках, где пятнами были нанесены лиганды Р^ и NЕСА. Поскольку эти планшеты содержали аденозин-дезаминазу, то отсутствие роста там, где аденозин был нанесен пятнами, подтверждал активность аденозиндезаминазы.

III. Анализ на Гик1-Ьас2

Для количественной характеризации активации пути скрещивания дрожжей оценивали синтез β-галактозидазы посредством Гик1-Ьас2. Дрожжевые штаммы, экспрессирующие

6..Е10К, 6 ...02298 или 6,... .Е10К-О2298, трансформировали плазмидой, кодирующей человеческий рецептор А2а (К⁺), или плазмидой, в которой отсутствовал этот рецептор (К^-). Трансформанты выделяли и культивировали в течение ночи в присутствии гистидина и 4 ед./мл аденозин-дезаминазы. 1 х 10⁷ клеток разводили до концентрации 1 х 10⁶ клеток/мл и экспонировали возрастающими концентрациями NЕСА в течение 4 ч, а затем определяли βгалактозидазную активность в этих клетках. Результаты показали, что К^--штаммы, в основном, не обнаруживали β-галактозидазной активности, тогда как К'-штаммы, экспрессирующие 6„,Е10К, 6 ..02298 или 6 „. Е10К-О2298, обнаруживали возрастающие количества β галактозидазной активности по мере возрастания концентрации ΝΕΌΑ, что свидетельствовало о том, что в ответ на экспонирование возрастающими концентрациями лиганда наблюдается дозозависимое увеличение единиц β-галактозидазы. Эта зависимость от дозы наблюдалась лишь в клетках, экспрессирующих рецептор А2а. Кроме того, наиболее активной 6_α5конструкцией по отношению к рецептору А2а была конструкция 6_а,Е10К. Второй по своей активности по отношению к рецептору А2а была конструкция 6,,,,02298, а из этих трех протестированных конструкций, наименее активной по отношению к рецептору А2а оказалась конструкция 6_α8Ε10Κ+Ό2298, однако, даже конструкция 6_а,Е10К+О2298 стимулировала легко обнаружимые количества β-галактозидазной активности.

Для более полного описания идентифицированных анализов см. заявку на патент США рег.№ 09/088985, озаглавленную Еипс1юпа1 ехрге55юп о1 а6епо§ше РесерЮгк ш УеаД', и поданную 2 июня 1998 (Патентный реестр № СРГ 093), полное содержание которой вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Фармакологическая характеризация подтипов человеческого аденозинового рецептора Материалы и методы

Материалы.

[³Н]-ОРСРХ [Циклопентил-1,3 -дипропилксантин], 8-[дипропил-2,3-³Н (Ν)] (120,0 Ки/ ммоль); [³Н]-С68 21680, [карбоксиэтил-³Н(Ц)] (30 Ки/ммоль) и [¹²⁵Ц-АВ-МЕСА ([¹²⁵η-4аминобензил-5'-Ы-метилкарбоксамидоаденозин) (2200 Ки/ммоль) поставлялись от фирмы №\ν Епд1ап6 Шскаг (Войоп, МА). ХАС (аналог ксантинамина); ΝΕί,Ά (5'-Ы-этилкарбоксамидоаденозин); и Ш-МЕСА поставлялись от фирмы РекеагсЕ ВюсЕеткаГ [п1егпаЦопа1 (РВЕ Νι1кк, МА). Аденозин-дезаминазы и таблетки полной смеси ингибиторов протеазы поставлялись от фирмы ВоеЬппдег Маппкепп Согр. (!η6ίапароШ, ΕΝ). Мембраны от клеток НЕК-293, стабильно экспрессирующих подтипы человеческого аденозинового рецептора 2а [РВ-НА2а]; аденозинового рецептора 2Ь [РВ-НА2Ь] или аденозинового рецептора 3 [РВ-НА3], соответственно, поставлялись от фирмы Ресер1ог Вк1оду (ВеИкуШе, МО). Реагенты клеточной культуры поставлялись от фирмы ЬИе Тес11по1одЙ5 (6гап6 [81ап6, ΝΥ), за исключением сыворотки, которая поставлялась от Нус1опе (Бодап, ЦТ).

Дрожжевые штаммы.

Штаммы 8ассЬаготусе§ сегехыае СΥ12660 [1аг1*1442 1Ы1-1 £ш51-Ш83 сап1 ^14::ίιρ1::ΕΥ82 §1е3*1156 дра1(41)-6а!3 1ук2 ига3 1еи2 1гр1:Ы§3; ЬЕИ2 Р6Кр-М£а1Ьеа6ег11А1Р-РНО51егт 2пш-опд КЕР3 Атрг] и СΥ8362 [дра1р-г6акЕ10К 1аг1*1442 1Ы1-1 1и81-НI83 сап1 81е14::1гр1:1А82 §1е3*1156 1ук2 ига3 1еи2 1гр1

Ы§3; ЬЕИ2 Р6Кр-ЕА2аР 2пш-оп КЕР3 Атрг] были получены как описано выше.

Дрожжевая культура.

Трансформированные дрожжи культивировали в среде с Ьеи-Тгр [ЬТ] (рН 5,4), в которую была добавлена 2% глюкоза. Для получения мембран, 250 мл среды ЬТ инокулировали с начальным титром 1-2 х 10⁶ клеток/мл от 30 мл ночной культуры и инкубировали при 30°С с непрерывной подачей кислорода и вихревом перемешивании. После 16-часового культивирования, клетки собирали путем центрифугирования и получали мембраны как описано ниже.

Культура тканей млекопитающих.

Клетки НЕК-293, стабильно экспрессирующие человеческий аденозиновый рецептор подтипа 2а (клон Са6ик #5) культивировали в минимальной поддерживающей среде Дульбекко (ЭМЕМ), в которую была добавлена 10% фетальная бычья сыворотка и IX пенициллин/стрептомицин, под давлением отбора с использованием 500 мг/мл антибиотика 6418 при 37°С в атмосфере 5% СО2 с повышенной влажностью.

Препараты клеточных мембран дрожжей.

После ночного инкубирования собирали 250 мл культуры путем центрифугирования при 2000 х д в центрифуге 8огуа11 КТ6000. Клетки промывали в охлажденной льдом воде, центрифугировали при 4°С, и осадок ресуспендировали в 10 мл охлажденного льдом буфера для лизиса [5 мМ Трис-НС1, рН 7,5; 5 мМ ЕОТА; и 5 мМ Е6ТА], в который были добавлены таблетки со смесью ингибиторов протеазы (1 таблетка на 25 мл буфера). К суспензии добавляли стеклянные сферы (17 г; 400-600 меш; 81дта), и эти клетки разрушали путем интенсивного вихревого перемешивания при 4°С в течение 5 мин. Гомогенат разводили еще 30 мл буфера для лизиса, содержащего ингибиторы протеазы, и центрифугировали при 3000 х д в течение 5 мин. Затем мембраны осаждали при 36000 х д (8огуа11 КС5В, ротор типа 8834) в течение 45 мин. Полученный мембранный осадок ресуспендировали в 5 мл мембранного буфера [50 мМ Трис-НС1, рН 7,5; 0,6 мМ ЕОТА; и 5 мМ МдС1₂], в который были добавлены таблетки из смеси ингибиторов протеазы (1 таблетка на 50 мл буфера) и хранили при -80°С для последующих экспериментов.

Получение мембранных препаратов клеток млекопитающих.

Мембраны клеток НЕК-293 получали, как описано ранее (Эи/к Е. е! а1., ГВкЕСЬет., 267, 9844-9851, 1992). Для этого, клетки промывали РВ8 и собирали резиновой палочкой. Клетки осаждали путем центрифугирования при 200 х д при 4°С на центрифуге 8огуа11 КТ6000. Осадок ресуспендировали в 5 мл/чашку в буфере для лизиса при 4°С (5 мМ Трис-НС1, рН 7,5; 5 мМ ЕЭТА; 5 мМ Е6ТА; 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторид, 10 мг/мл пепстатина А; и 10 мг/мл апротинина) и гомогенизировали в гомогенизаторе Даунса. Затем клеточный лизат центрифугировали при 36000 х д (8огуа11 КС5В, ротор типа 8834) в течение 45 мин и осадок ресуспендировали в 5 мл мембранного буфера [50 мМ Трис-НС1, рН 7,5; 0,6 мМ ЕОР А; и 5 мМ МдС1₂, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторид, 10 мг/мл пепстатина А; и 10 мг/мл апротинина) и хранили при -80°С для последующих экспериментов.

Для определения полной концентрации белка в дрожжах и мембранах млекопитающего использовали наборы для анализа белков ΒίοКаб на основе процедуры связывания с красителем по методу Брэдфорда (ВгабГогб, М, АиаГВюсРет. 72:248 (1976)).

Насыщение подтипа аденозинового рецептора 1 и конкуренция за связывание с радиоактивным лигандом.

Связывание с насыщением и конкурентное связывание на мембранах, полученных от дрожжевых клеток, трансформированных человеческим рецептором подтипа А1, осуществляли с использованием антагониста [³Н]ОРСРХ в качестве радиоактивного лиганда. Мембраны разводили в буфере для связывания [50 мМ Трис-НС1, рН 7,4; 10 мМ МдС1₂, 1,0 мМ ΕΌΤΑ; 0,25 % В 8А; 2 ед./мл аденозин-дезаминазы и таблетки смеси ингибиторов протеазы 1/50 мл] при концентрациях 1,0 мг/мл. При связывании с насыщением, мембраны (50 мкг/лунку) инкубировали с возрастающими концентрациями [³Н]ОРСРХ (0,05-25 нМ) в конечном объеме 100 мкл связывающего буфера при 25°С в течение 1 ч в 96-луночном микротитрационном планшете в отсутствие и в присутствии 10 мкм немеченного ХАС.

При конкурентном связывании, мембраны (50 мкг/лунку) инкубировали с [³Н]ОРСРХ (1,0 нМ) в конечном объеме 100 мкл связывающего буфера при 25°С в течение 1 ч в 96-луночном микротитрационном планшете в отсутствие и в присутствии 10 мкм немеченного ХАС или с возрастающими концентрациями конкурирующих соединений.

Конкурентное связывание аденозинового рецептора подтипа 2а с радиоактивным лигандом

Конкурентное связывание на мембранах, полученных от клеток НЕК-293, стабильно экспрессирующих человеческий рецептор подтипа А2а, осуществляли с использованием агониста |³Н|СС8-21680 в качестве радиоактивного лиганда. Мембраны разводили в буфере для связывания [50 мМ Трис-НС1, рН 7,4; 10 мМ МдС1₂, 1,0 мМ ЕЭТА; 0,25 % В8А; 2 ед./мл аденозиндезаминазы и таблетки смеси ингибиторов протеазы 1/50 мл] при концентрациях 0,2 мг/мл. Мембраны (10 мкг/лунку) инкубировали с [³Н] С68-21680 (100 нМ) в конечном объеме 100 мкл связывающего буфера при 25°С в течение 1 ч в 96-луночном микротитрационном планшете в отсутствие и в присутствии 50 мкМ немеченно го ИЕСА или с возрастающими концентрациями конкурирующих соединений.

Конкурентное связывание аденозинового рецептора подтипа 3 с радиоактивным лигандом

Конкурентное связывание на мембранах, полученных от клеток НЕК-293, стабильно экспрессирующих человеческий рецептор подтипа А3, осуществляли с использованием агониста ['^ЦАВ-МЕСА в качестве радиоактивного лиганда. Мембраны разводили в буфере для связывания [50 мМ Трис-НС1, рН 7,4; 10 мМ МдС1₂, 1,0 мМ ЕЭТА; 0,25 % В8А; 2 ед./мл аденозиндезаминазы и таблетки смеси ингибиторов протеазы 1/50 мл] при концентрациях 0,2 мг/мл. Мембраны (10 мкг/лунку) инкубировали с ['^ЦАВ-МЕСА (0,75 нМ) в конечном объеме 100 мкл связывающего буфера при 25°С в течение 1 ч в 96-луночном микротитрационном планшете в отсутствие и в присутствии 10 мкМ немеченного ГВ-МЕСА или с возрастающими концентрациями конкурирующих соединений.

По окончании инкубирования, анализы на связывание рецепторов подтипов А1, А2а и А3 с радиоактивным лигандом завершали путем добавления охлажденного льдом буфера 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,4), в который была добавлена 10 мМ МдС12 с последующей быстрой фильтрацией через стекловолоконные фильтры (96луночные фильтры 6Р/В ишРШегк, Раскагб), предварительно пропитанные в 0,5% полиэтиленимине в сборщике клеток Р11Гегта!е 196 (Раскагб). Фильтровальные планшеты осушали, сенсибилизировали 50 мкл/лунку сцинтилляционной жидкости (Мюго8стГ-20, Раскагб) и подсчитывали в счетчике ТорСоииГ (Раскагб). Анализы проводили в трех дубликатах. В анализах на связывание АШ. А2аК и А3К, неспецифическое связывание составляло 5,6 ± 0,5%, 10,8 ± 1,4% и 15,1 ± 2,6 % от общего связывания соответственно.

Конкурентное связывание аденозинового рецептора подтипа 2Ь с радиоактивным лигандом

Конкурентное связывание на мембранах, полученных от клеток НЕК-293, стабильно экспрессирующих человеческий рецептор подтипа А2Ь, осуществляли с использованием антагониста рецептора А1 [³Н]ОРСРХ в качестве радиоактивного лиганда. Мембраны разводили в буфере для связывания [10 мМ Нерек-КОН, рН 7,4, содержащего 1,0 мМ ЕЭТА; 0,1 мМ бензамидина и 2 ед./мл аденозин-дезаминазы] при концентрациях 0,3 мг/мл. Мембраны (15 мкг/лунку) инкубировали с [³Н]ОРСРХ (15 нМ) в конечном объеме 100 мкл связывающего буфера при 25°С в течение 1 ч в 96-луночном микротитрационном планшете в отсутствие и в присутствии 10 мкМ немеченного ХАС или с возрастающими концентрациями конкурирующих соединений. По окончании инкубирования, анализ завершали путем добавления охлажденного льдом буфера 10 мМ Нерек-КОН (рН 7,4) с последующей быстрой фильтрацией через стек ловолоконные фильтры (96-луночные фильтры 6Р/С ишР1Иег8, Раскаг6), предварительно пропитанные в 0,5% полиэтиленимине в сборщике клеток Н11егта1е 196 (Раскаг6). Фильтровальные планшеты осушали, сенсибилизировали 50 мкл/ лунку сцинтилляционной жидкости (М1сго8сш120, Раскаг6) и подсчитывали в счетчике ТорΟ’οιιηΙ (Раскаг6). Анализы проводили в трех дубликатах. Неспецифическое связывание составляло 14,3 ± 2,3% от общего связывания.

Специфическое связывание [³Н]ОРСРХ; [³Н]С68-21680 и [¹²⁵1]АВ-МЕСА определяли как разность между общим связыванием и неспецифическим связыванием. Процент ингибирования соединений вычисляли по отношению к общему связыванию. Данные конкурентного связывания анализировали путем построения итерационной кривой для односайтовой модели, а величины К₁ вычисляли, исходя из значений 1С₅₀ (Сйепд & РгикоГ, В1осйет.Рйагтасо1. 22, 3099-3109, 1973) с использованием программного обеспечения СгарйРа6 Рпхт 2.01.

Результаты

Главной функцией некоторых рецепторов клеточной поверхности является распознавание соответствующих лигандов. В соответствии с этим, мы определили аффинности связывания с лигандом для подтверждения функциональной целостности аденозинового рецептора подтипа 1, экспрессированного в дрожжах. Неочищенные мембраны, полученные из Зассйаготусек сегеуыае. трансформированных конструкцией человеческого аденозинового рецептора подтипа 1, обнаруживали специфическое связывание при насыщении с [³Н]ОРСРХ, где К_с составлял 4,0±0,19 нМ. Величины К_с и В_тах вычисляли по изотерме насыщения, и трансформация данных по Скетчарду указывала на один класс сайтов связывания. Были проведены оценки плотности сайтов связывания с аденозином в мембранных препаратах дрожжей, которые составляли 716,8 ± 43,4 фмоль/мг мембранного белка.

Фармакологические характеристики подтипов рецепторов для рекомбинантных дрожжевых клеток, трансформированных человеческим аденозиновым рецептором подтипа А1, исследовали с использованием селективных аденозиновых лигандов нескольких подтипов (ХАС, ЭРСРХ, С68-15943, СП8-046142, СП8-046123, ΝΕΟΑ, (К)-Р1А, 1В-МЕСА и аллоксазин). Они конкурировали с [³Н]ОРСРХ с аффинностью ожидаемого порядка. Кривая вытеснения, построенная для этих соединений, показала типичную крутизну для всех лигандов, и данные для каждого из этих лигандов могут быть смоделированы путем односайтового соответствия. Кажущиеся константы диссоциации, оцененные для каждого соединения, исходя из этих кривых, (табл. 5) совпадают со значением, опубликованным для рецептора, полученного от других источников.

Таблица 5. Величины К[ для мембран дрожжевых клеток, трансформированных человеческим аденозиновым рецептором подтипа А1

Лиганды	К (нМ)
ХАС	5,5
ЭРСРХ	7,1
СО8-1594	10,8
\ЕСА	179,6
(К)-Р1А	56,3
1В-МЕСА	606,5
Аллоксазин	894,1
СЭ8-046142	13,9
СЭ8-046123	9,8

В табл. 6-12 проиллюстрирована эффективность и профили активности структур деазапуринов настоящего изобретения. В табл. 13 и 14 проиллюстрирована селективность, которая может быть достигнута для сайтов человеческого аденозинового рецептора путем модулирования функциональных групп в деазапуриновой структуре. В табл. 14 также проиллюстрировано обнаружение того факта, что рассматриваемые здесь соединения имеют субнаномолярную активность и более высокую селективность по отношению к рецептору А₂ь по сравнению с соединениями, представленными в табл. 13.

Таблица 6. Активность серии 0Ό8-046142:

Влияние Ν-6-заместителя

		А)
Код	К	Связывание Κϊ (нМ)	Дрожжи 1С50 (нм)
СО8-046142	НО'™	13.9	97.2
СО8-062365	К>он	1423	>10,000
СО8-069533	ЧОН Ι-0....ΟΗ	483.5	>10,000
СО8-069534	он нс5~°н	196.6	4442.0
СО8-056176	Ϊ О “ Ϊ	>10,000	>10000
! ν» ί
СР8-056175	К>!Л-	>10000	>10000
СО8-062352	|—О—Ϊ—ΡΙι	297.9	>10000

СО5-062351	ю	309.7	>10000
СЭ8-090909		29.1
С08-090910		193.9
С08-090913	νθ 0н ω	411.5
С08-062352	Κ>τ	785.6	>10000
СЭ8-092474	уО ЙНАс Тгаи5 (8,8)	64.8
СО8-092475	уО ЙНАс Тгапа (КК.)	6726.0
СЭ8-О91175	но* Р (41)	32.1

СО8-062351	хО % (<и>	816.9	2577.0
С08-090914	КГ” ''он	34.3

Таблица 7. Активность серии СЭ8-046142:

Влияние С2-заместителя

Таблица 8. Активность серии ί.Ό8-046142: Влияние заместителя пиррольного кольца

		А1
Код	К	Связывание Κϊ (нМ)	Дрожжи 1С50 (нМ)
СЭ8-069532	θΑ	604.5	>10000
С08-090895	О4	157.7	763.1

Таблица 9

		Α1
Код	К	Связывание Κί (нМ)	Дрожжи 1С50 (нМ)
СО8- 056090	хг	863.1
СИ8- 056091		4512
СО8- 056089		8451
СО8- 056092	ν<'	353

Таблица Ю. Активность серии СЭ8-046!23:

Влияние Ы₆-заместителя

		А1
Код	К	Связывание К± (нМ)	Дрожжи 1С50 (нМ)
СО8-062354		1789	>10000
СР8-067146	н О	54.4	1865
СО8-046123	V О	9.8	82.8
СО8-062357		26.7	195.7
СО5-062355		32.8	545.8

Таблица И. Активность серии С^8-046123:

Влияние Ы₆-заместителя

		А1
Код	К	Связывание К1 (нМ)	Дрожжи 1С50 (нМ)
СО8-046123	у-^мн^сн,	9.8	115.4
СР8-О69535	у-^ΝΗ^ΝΗ, О	53.9	551.0
С08-090894	γ-\^ΝΗ ЫИке λ т о	10.3	101.3
С08-062301	γ-^,ΝΗ^,ΝΗΒ О	71.1	3217
С08-090904		6.5	58.7
С05-090906	άϋτ С±)	105.4	472.1

008-090908	Ме Н γΧ^γΟΗ, о <±>	27.8	162.4
008-090907	Ме Н (± >	126.5	1297.0
008-092473		2.3
008-095450		9.0
008-095451	ί/^,ΝΗΑο Т8	17.3
008-091183	ϊ к	2.5
008-091184	ΐΑ^ΝΗΑε * К	213

Таблица 12. Ретроамидные аналоги 0Ό8046123

		Α1
Код	Я	Связывание Κ± (нМ)	Дрожжи 1С50 (нМ)
008-065567	0	16.5	189.4
008-090891		7.4	45.7
008-062373	уДх Η ν	95.8	3345.0
008-090893		529.1	4040.0
008-062371	0 ^Ά-ΟΗ	1060.0	>10000

008-062372	О у^Э'-0-ВЦ1	1272	>10000
008-065566	νγΝΗ! 0	50.8	4028
008-065565	^χχγ,ΝΗΜβ 0	48.5	701.5

Таблица 13. Профиль селективных антагонистов аденозина

Л	Связывание К1	(нМ)
д ρΑν	Ме Г^Ме -^Ν Н
	К	А!	А2а	А2Ь	АЗ
008-046123		9.8- 25.1	18.0- 48.6	80.3	513.0
008-090908	Ме	27.8	50.7	84.6	429.8
008-090894	н 0	202	75.6	20.1	4.3

008-090891	0	17.4	111.3	120.6	44.6
008-046142	хСГ	13.9- 30.9	933.7	138.0	21.5
С08-0908901	ДТ	46.6	730.9	30%	9.9
С08-0909052	хСГ	16.4	766.3	168.3	71.7
008-090909	XX,	29.1	190.6	1143.0	3.1
008-90910	кд;	180	230	670	1.0

СОЗ-116676	σΥ	40	109	109	0.3
008-121180	У<сн^Д^е н	255	76%	275	<2.6
СО8-121178	1 Н	531	981	736	5.3
СО8-121179	у<сн^Амьме н	443	2965	375	<6.2
СО8-1232643	1 Н	30%	65%	515	24
008-062391	^(СН^Д^,	87	204	30	0.02

СО8-121181	---- н	75,000	720,000	3,400	507
СО8-121268	0 1 Н	333	710,000	710,000	97
СВ8-121272		710,000	710,000	720,000	369
СО8-0963704	/Г	3.7±0.5	630± 56.4	2307± 926	630±76
СО8-113760°	*сг	1.8	206	802	270
СО8-116665°		8.0	531	530	419
СО8-1319214·7		8.0	131	1031	54%·

¹ 2-тиенил-2-ил;

² С5-Н;

водорастворимый;

⁴ В5 и В6 означают водород;

⁵ В3 означает 3-фторфенил;

⁶ В3 означает 3-хлорфенил;

⁷ В3 означает 4-пиридил;

⁸ % активности при 10 мкМ.

Таблица 14. Профиль селективных антагонистов

Код	ХК|	В2	Данные связывания Κι (нМ)
			А,	А2а	А2В	А3
СЭ8-129851	-О-РЬ	Ме	41.7	21	0.3	14.6
СЭ8-143995	-О-РЬ(р)Г	Ме	33	58	0.01	18
СЭ8-143994	-О-РЬ(р)С1	Ме	825	591	0.3	60
СЭ8-143988	-№пиридин-2-он	Ме	60	41	47	48
СЭ8-143996	-ΝΙΙ-ΡΙ1	Ме	49	31	109	57

Введение посредством ссылки

Все патенты, опубликованные патентные заявки и другие описанные здесь работы вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Эквиваленты

Для каждого специалиста очевидно, или каждый специалист, путем лишь рутинного экспериментирования, может убедиться, что существует множество вариантов, эквивалентных конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения, описанных в настоящей заявке. Такие эквиваленты входят в объем нижеследующей формулы изобретения.

Claims (59)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение, имеющее формулу I

   ЧА где каждый из В1 и В2 независимо представляет собой атом водорода, замещенный прямой (С1С₃₀)алкил, замещенный разветвленный (С₃-С₃₀) алкил, замещенный (С₄-С₁₀)циклоалкил, замещенный циклопропил или замещенный или незамещенный арил;

   где только один из В1 и В2 может быть водородом;

   где, когда алкил представляет собой (С₁)алкил или (С₂)алкил, тогда любой заместитель фенила, если он имеется, замещен; или

   В₁ и В₂ вместе образуют замещенное или незамещенное 4-10-членное гетероциклическое кольцо;

   В₃ представляет собой замещенный или незамещенный арил;

   В4 представляет собой атом водорода, незамещенный прямой (С₁-С₃о)алкил, незамещенный разветвленный (С₃-С₃₀)алкил или замещенный или незамещенный арил; и каждый из В5 и В6 независимо представляет собой атом галогена, атом водорода или замещенный или незамещенный прямой (С1-С30) алкил, разветвленный (С₁-С₃₀)алкил или арил;

   где любой заместитель, если он имеется, представляет собой галоген, гидроксил, прямой (С₁-С₃₀)алкилкарбонилокси, разветвленный (С₃С30)алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси, прямой (С₁-С₃₀)алкоксикарбонилокси, разветвленный (С₃-С₃₀)алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилат, прямой (С1-С30) алкилкарбонил, разветвленный (С₃-С₃₀)алкилкарбонил, прямой (С₁-С₃₀)алкоксикарбонил, разветвленный (С₃-С₃₀)алкоксикарбонил, аминокарбонил, прямой (С1-С30)алкилтиокарбонил, разветвленный (С₃-С₃₀)алкилтиокарбонил, прямой (С₁-С₃₀)алкоксил, разветвленный (С₃-С₃₀) алкоксил, фосфат, фосфонато, циано, амино, прямой (С₁-С₃₀)алкиламино, разветвленный (С₃С₃₀)алкиламино, прямой (С₁-С₃₀)диалкиламино, разветвленный (С₃-С₃₀)диалкиламино, ариламино, диариламино, прямой (С₁-С₃₀)алкилариламино, разветвленный (С₃-С₃₀)алкилариламино, ациламино, прямой (С₁-С₃₀)алкилкарбониламино, разветвленный (С₃-С₃₀)алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбамоил, уреидо, амидино, имино, сульфгидрил, прямой (С₁-С₃₀) алкилтио, разветвленный (С₃-С₃₀)алкилтио, арилтио, тиокарбоксилат, сульфаты, сульфонато, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, трифторметил, азидо, 4-10-членный гетероциклил, прямой (С₁-С₃₀)алкиларил, разветвленный (С₃С30)алкиларил или ароматическую или 5-6членную гетероароматическую группу, где за

   100 меститель, в свою очередь, может быть замещен любым из вышеуказанных заместителей, или его фармацевтически приемлемая соль.
2. 2. Соединение по п.1, где Я представляет собой водород, Я₂ представляет собой замещенный (С₄-С1₀)циклоалкил, замещенный прямой (С1-С₃₀)алкил, замещенный разветвленный (С₃С₃₀)алкил или Я₁ и Я₂ вместе образуют замещенное или незамещенное 4-10-членное гетероциклическое кольцо, Я₃ представляет собой незамещенный или замещенный арил, Я₄ представляет собой водород и каждый из Я₅ и Я₆ независимо представляет собой водород или прямой (С1-С₃₀)алкил, разветвленный (С₃-С₃₀) алкил, или его фармацевтически приемлемая соль.
3. 3. Соединение по п.2, где Я₂ представляет собой замещенный (С₄-С1₀)циклоалкил.
4. 4. Соединение по п.3, где Я₁ и Я₄ представляют собой водород; Я₃ представляет собой незамещенный или замещенный фенил и каждый из Я₅ и Я₆ представляет собой прямой (С₁С30)алкил или разветвленный (С3-С30)алкил.
5. 5. Соединение по п.4, где Я₂ представляет собой моногидроксициклопентил.
6. 6. Соединение по п.4, где Я₂ представляет собой моногидроксициклогексил.
7. 7. Соединение по п.2, где Я! и Я₂ вместе образуют замещенное или незамещенное 4-10членное гетероциклическое кольцо.
8. 8. Соединение по п.7, где указанное гетероциклическое кольцо замещено амином или ацетамидом.
9. 9. Соединение по п. 2, где Я₂ представляет собой -А-ЛИС(=О)В, где А представляет собой незамещенный (С1-С₄)алкил и В представляет собой замещенный или незамещенный (С₁-С₄) алкил.
10. 10. Соединение по п.9, где Я! и Я₄ представляют собой водород, Я₃ представляет собой незамещенный или замещенный фенил и каждый из Я₅ и Я₆ представляет собой прямой (С₁С30)алкил или разветвленный (С3-С30)алкил.
11. 11. Соединение по п.2, где Я3 представляет собой замещенный или незамещенный фенил.
12. 12. Соединение по п.11, где каждый из Я₅ и Я₆ представляет собой прямой (С1-С₃₀)алкил или разветвленный (С3-С30)алкил.
13. 13. Соединение по п.12, где Я₃ представляет собой незамещенный фенил.
14. 14. Соединение по п.12, где Я₃ представляет собой замещенный фенил.
15. 15. Соединение по п.14, где Я₃ представляет собой фенил, замещенный, по крайней мере, одним заместителем.
16. 16. Соединение по п.1, где Я₃ представляет собой замещенный или незамещенный арил, где арил является гетероарильной группой.
17. 17. Соединение по п.16, где каждый из Я₅ и Я₆ представляет собой прямой (С1-С₃₀)алкил или разветвленный (С3-С30)алкил.
18. 18. Соединение по п.2, где каждый из Я₅ и Я6 представляет собой водород.
19. 19. Соединение по п.2, где каждый из Я₅ и Я₆ представляет собой метил.
20. 20. Соединение по п.2, где соединение выбрано из группы, включающей

    4-(цис-3-гидроксициклопентил)амино-5,6диметил-2 - фенил-7Н-пирроло [2,36] пиримидин, соль трифторуксусной кислоты 4-(цис-3(2-аминоацетокси)циклопентил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидина,

    4-(2-Л'-метилуреидопропил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин,

    4-(2-ацетамидобутил)амино-5,6-диметил-2фенил-7Н-пирроло -[2,36] пиримидин,

    4-(2-Л'-метилуреидобутил)амино-5,6-диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин и

    4-(2-аминоциклопропилацетамидоэтил) амино-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин.
21. 21. Соединение, представленное формулой II где X представляет собой Ν или СЯ·,, каждый из Я₁ и Я₂ независимо представляет собой водород, замещенный или незамещенный прямой (С1-С₃₀)алкокси, разветвленный (С₃С₃₀)алкокси, амино (прямой (С1-С₃₀)алкил), амино (разветвленный (С₃-С₃₀)алкил), прямой (С1-С30)алкил, разветвленный (С3-С30)алкил или арил;

    где только один из Я1 и Я2 может быть водородом,

    Я! и Я₂ вместе образуют замещенное или незамещенное 4-10-членное гетероциклическое кольцо;

    Я₃ представляет собой замещенный или незамещенный арил или гетероарил;

    Я4 представляет собой водород;

    Ь представляет собой водород, замещенный или незамещенный прямой (С1-С30)алкил или разветвленный (С3-С30)алкил;

    Я6 представляет собой водород, замещенный или незамещенный прямой (С1-С₃₀)алкил, разветвленный (С3-С30)алкил или галоген;

    0 представляет собой СН₂, О, 8 или ЛЯ, где Я₇ представляет собой водород или замещенный или незамещенный (С₁-С₆)алкил и представляет собой незамещенный или замещенный прямой (С1-С₃₀)алкил, разветвленный (С₃-С₃₀)алкил, (С₄-С1₀)циклоалкил, прямой (С₂-С₃₀)алкинил, разветвленный (С₃-С₃₀)алкинил, арил, биарил, гетероарил, замещенный карбонил, замещенный тиокарбонил или замещенный сульфонил;

    где любой заместитель, если он имеется, представляет собой галоген, гидроксил, прямой (С1-С₃₀)алкилкарбонилокси, разветвленный (С₃С30)алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси,

    101

    102 прямой (С1-С₃₀)алкоксикарбонилокси, разветвленный (С₃-С₃₀)алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилат, прямой (С1-С30) алкилкарбонил, разветвленный (С₃-С₃₀)алкилкарбонил, прямой (С1-С30)алкоксикарбонил, разветвленный (С₃-С₃₀)алкоксикарбонил, аминокарбонил, прямой (С1-С30)алкилтиокарбонил, разветвленный (С₃-С₃₀)алкилтиокарбонил, прямой (С1-С₃₀)алкоксил, разветвленный (С₃-С₃₀) алкоксил, фосфат, фосфонато, циано, амино, прямой (С1-С30)алкиламино, разветвленный (С3С30)алкиламино, прямой (С1-С30)диалкиламино, разветвленный (С₃-С₃₀)диалкиламино, ариламино, диариламино, прямой (С1-С30)алкилариламино, разветвленный (С₃-С₃₀)алкилариламино, ациламино, прямой (С₄-С₃₀)алкилкарбониламино, разветвленный (С₃-С₃₀)алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбамоил, уреидо, амидино, имино, сульфгидрил, прямой (С1-С₃₀)алкилтио, разветвленный (С₃-С₃₀)алкилтио, арилтио, тиокарбоксилат, сульфаты, сульфонато, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, трифторметил, азидо, 4-10-членный гетероциклил, прямой (С1-С30)алкиларил, разветвленный (С3-С30)алкиларил или ароматическую или 5-6членную гетероароматическую группу, где заместитель, в свою очередь, может быть замещен любым из вышеуказанных заместителей.
22. 22. Соединение по п.21, где О представляет собой СН₂, О, 8 или ΝΉ.
23. 23. Соединение по п.22, где В₄ представляет собой водород, Ь представляет собой водород или метил и Я₃ представляет собой незамещенный или замещенный арил.
24. 24. Соединение по п.23, где представляет собой замещенный или незамещенный прямой (С1-С₃₀)алкил, разветвленный (С₃-С₃₀)алкил, (С₄-С1₀)циклоалкил, прямой (С₂-С₃₀)алкинил или разветвленный (С3-С30)алкинил.
25. 25. Соединение по п.24, где представляет собой прямой (С₂-С₃₀)алкинил или разветвленный (С3-С30)алкинил.
26. 26. Соединение по п.25, где замещен одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, включающей галоген, гидрокси, замещенный или незамещенный прямой (С1-С₃₀)алкил, разветвленный (С₃-С₃₀)алкил, (С₄-С1₀)циклоалкил, арил или ΝΉΚ₁₀, где Я₁₀ представляет собой водород, замещенный или незамещенный прямой (С1-С₃₀)алкил, разветвленный (С₃-С₃₀)алкил, (С₄-С1₀)циклоалкил или арил.
27. 27. Соединение по п.24, где представляет собой замещенный или незамещенный циклопентил.
28. 28. Соединение по п.23, где представляет собой -(СН2)а-С(=О)У или -(СН2)а-С(=8)У, где а равно 0, 1, 2 или 3, Υ представляет собой арил, прямой (С1-С₃₀)алкил, разветвленный (С₃С₃₀)алкил, (С₄-С1₀)циклоалкил, гетероарил, ΝΒΚ.₁₁Κ.₁2, или при условии, что О представляет собой ΝΉ, ОВ₁₃, и где каждый из Я_п, Я₁₂ и Я₁₃ независимо представляет собой водород или незамещенный или замещенный прямой (С₁-С₃₀) алкил, разветвленный (С₃-С₃₀)алкил, арил или (С₄-Сю)циклоалкил.
29. 29. Соединение по п.22, где В₃ выбран из группы, включающей замещенный и незамещенный фенил, пиридил, пиримидил, пиридазинил, пиразинил, пирролил, триазолил, тиазолил, оксазолил, оксадиазолил, пиразолил, фуранил, метилендиоксифенил и тиофенил.
30. 30. Соединение по п.29, где В₃ представляет собой незамещенный фенил.
31. 31. Соединение по п.29, где В₃ представляет собой фенил, замещенный, по крайней мере, одним заместителем.
32. 32. Соединение по п.1 или 22, где Щ и Я₂ вместе представляют собой

    N где η равно 1 или 2, и где кольцо может быть необязательно замещено одной или несколькими группами гидроксила, амино, аминокарбонила, тиола, карбоксила, галогена, СН2ОН, СН2ХНС(=О)-(С1-С₃₀) прямого алкила,

    СН2ХНС(=О)-(С₃-С₃₀) разветвленного алкила или СН₂NНС(=О)NН-(С1-С₃₀) прямого алкила или СН₂NНС(=О)NН-(С₃-С₃₀) разветвленного алкила.
33. 33. Соединение по п.32, где η равно 1 или 2 и указанное кольцо замещено -МНС(=О)-(С1-С₃₀) прямым алкилом или СН2ХНС(=О)-(С₃-С₃₀) разветвленным алкилом.
34. 34. Соединение по п.22, где Щ представляет собой водород, Я₂ представляет собой замещенный или незамещенный С1-С₆алкил, В₃ представляет собой замещенный или незамещенный фенил, Я₄ представляет собой водород, Ь представляет собой водород или замещенный или незамещенный (С1-С₆)алкил, О представляет собой О, 8 или ΝΚ.7, где Я₇ представляет собой водород или замещенный или незамещенный (С1-С₆)алкил и представляет собой замещенный или незамещенный арил.
35. 35. Соединение по п.34, где указанное соединение выбрано из группы, включающей

    4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-феноксиметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,3й]пиримидин,

    4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-(4-фторфенокси)метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,3й]пиримидин,

    4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-(4-хлорфенокси)метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,3й]пиримидин,

    4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-(4-метоксифенокси)метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,3й]пиримидин,

    4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-(2-пиридилокси)метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,3й]пиримидин,

    103

    104

    4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-(N-фениламино)метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин,

    4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-(№метилN-фениламино)метил-2-фенил-7Н-пирроло [2,36] пиримидин и

    4-(2-Л'-метилуреидоэтил)амино-6-феноксиметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин.
36. 36. Применение соединения по любому из пп.1, 2, 4, 10, 21 или 22 для ингибирования активности аденозинового рецептора в клетках.
37. 37. Применение по п.36, где соединение выбрано из группы, включающей

    4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-феноксиметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидина,

    4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-(4-фторфенокси)метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидина,

    4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-(4-хлорфенокси)метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидина,

    4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-(4-метоксифенокси)метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36] пиримидина,

    4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-(2-пиридилокси)метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидина,

    4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-(№фениламино)метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидина,

    4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-(№метилN-фениламино)метил-2-фенил-7Н-пирроло [2,36] пиримидина,

    4-(2-Л'-метилуреидоэтил)амино-6-феноксиметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидина.
38. 38. Применение по п.36, где соединение выбрано из группы, включающей

    4-(цис-3-гидроксициклопентил)амино-5,6диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин, соль трифторуксусной кислоты 4-(цис-3(2-аминоацетокси)циклопентил)амино-5,6диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидина,

    4-(3-ацетамидо)пиперидинил-5,6-диметил2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин,

    4-(2-Л'-метилуреидопропил)амино-5,6диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин,

    4-(2-ацетамидобутил)амино-5,6-диметил-2фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин,

    4-(2-Л'-метилуреидобутил)амино-5,6диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин,

    4-(2-аминоциклопропилацетамидоэтил) амино-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин,

    4-(транс-4-гидроксициклогексил)амино-2(3 -хлорфенил)-7Н-пирроло [2,36] пиримидин,

    4-(транс-4-гидроксициклогексил)амино-2(3-фторфенил)-7Н-пирроло[2,36]пиримидин и

    4-(транс-4-гидроксициклогексил)амино-2(4 -пиридил)-7Н-пирроло [2,36] пиримидин.
39. 39. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по пп.1, 2, 4, 10, 21 или 22 и фармацевтически приемлемый носитель.
40. 40. Фармацевтическая композиция по п.39, где указанное соединение выбрано из группы, включающей

    4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-феноксиметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин,

    4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-(4-фторфенокси)метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин,

    4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-(4-хлорфенокси)метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин,

    4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-(4-метоксифенокси)метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин,

    4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-(2-пиридилокси)метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин,

    4-(2-ацетиламиноэтил)амино-6-(N-фениламино)метил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин,

    4-(2 -ацетиламиноэтил) амино -6-(Ν-метил№фениламино)метил-2-фенил-7Н-пирроло [2,36] пиримидин и

    4-(2-Л'-метилуреидоэтил)амино-6-феноксиметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин.
41. 41. Фармацевтическая композиция по п.39, где соединение выбрано из группы, включающей

    4-(цис-3-гидроксициклопентил)амино-5,6диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидина, соль трифторуксусной кислоты 4-(цис-3(2-аминоацетокси)циклопентил)амино-5,6диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидина,

    4-(3-ацетамидо)пиперидинил-5,6-диметил2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин,

    4-(2-Л'-метилуреидопропил)амино-5,6диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин,

    4-(2-ацетамидобутил)амино-5,6-диметил-2фенил-7Н-пирроло [2,36] пиримидин,

    4-(2-Л'-метилуреидобутил)амино-5,6диметил-2-фенил-7Н-пирроло[2,36]пиримидин,

    4-(2-аминоциклопропилацетамидоэтил) амино -2-фенил-7Н -пирроло [2,36] пиримидин,

    4-(транс-4-гидроксициклогексил)амино-2(3-хлорфенил)-7Н-пирроло[2,36]пиримидин,

    4-(транс-4-гидроксициклогексил)амино-2(3 -фторфенил)-7Н-пирроло [2,36]пиримидин и

    4-(транс-4-гидроксициклогексил)амино-2(4 -пиридил)-7Н-пирроло [2,36] пиримидин.
42. 42. Фармацевтическая композиция по п.39, где указанное терапевтически эффективное количество является эффективным для лечения респираторного заболевания или желудочнокишечного заболевания.
43. 43. Фармацевтическая композиция по п.41, где указанным желудочно-кишечным заболеванием является диарея.
44. 44. Фармацевтическая композиция по п.42, где указанным респираторным заболеванием является астма, аллергический ринит или хроническая обструктивная болезнь легких.

    105

    106
45. 45. Фармацевтический препарат по п.39, где указанным фармацевтическим препаратом является офтальмологический препарат.
46. 46. Фармацевтический препарат по п.45, где указанным фармацевтическим препаратом является препарат для инъекции в окологлазную, ретробульбарную или внутриглазную область.
47. 47. Фармацевтический препарат по п.45, где указанным фармацевтическим препаратом является препарат для системного введения.
48. 48. Фармацевтический препарат по п.45, где указанным фармацевтическим препаратом является хирургический раствор для промывания.
49. 49. Применение соединения по пп. 1, 2, 21 или 22 для получения лекарственного средства, используемого для лечения заболевания или состояния, связанного с повышенными уровнями аденозина у субъекта, где заболеванием или состоянием является нарушение центральной нервной системы, заболевание почек, воспалительное заболевание, аллергия, желудочнокишечное заболевание, глазная болезнь или заболевание дыхательных путей.
50. 50. Упакованная фармацевтическая композиция для лечения заболевания или нарушения, опосредованного аденозином, у млекопитающего, включающая контейнер, содержащий терапевтически эффективное количество, по крайней мере, одного соединения по пп.1, 2, 4, 10, 21 или 22 и инструкции по применению соединения для лечения опосредованного аденозином заболевания состояния у млекопитающего.
51. 51. Способ получения включающий следующие стадии:

    где Р представляет собой удаляемую защитную группу;

    Ь) обработки продукта стадии а) в условиях циклизации с получением

    с) обработки продукта стадии Ь) в подходящих условиях с получением и 6) обработки хлорированного продукта стадии с) амином с получением где каждый из Κι и К₂ независимо представляет собой атом водорода или замещенный прямой (С1-С₃₀)алкил или разветвленный (С₃-С₃₀)алкил, замещенный (С₄-С1₀)циклоалкил, замещенный циклопропил или замещенный или незамещенный арил;

    где только один из К₁ и К₂ может быть водородом;

    где, когда алкил представляет собой (С1)алкил или (С₂)алкил, тогда любой заместитель фенила, если он имеется, в свою очередь замещен; или

    Κι и К₂ вместе образуют замещенное или незамещенное 4-10-членное гетероциклическое кольцо;

    К₃ представляет собой замещенный или незамещенный арил, прямой (С1-С₃₀)алкиларил или разветвленный (С3-С30)алкиларил; и

    К₆ представляет собой атом галогена, атом водорода или замещенный или незамещенный прямой (С1-С₃₀)алкил или разветвленный (С₁С30)алкил или арил;

    где любой заместитель, если он имеется, представляет собой галоген, гидроксил, прямой (С1-С₃₀)алкилкарбонилокси, разветвленный (С₃С30)алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси, прямой (С1-С30)алкоксикарбонилокси, разветвленный (С₃-С₃₀)алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилат, прямой (С1-С30) алкилкарбонил, разветвленный (С₃-С₃₀)алкилкарбонил, прямой (С1-С30)алкоксикарбонил, разветвленный (С₃-С₃₀)алкоксикарбонил, аминокарбонил, прямой (С1-С30)алкилтиокарбонил, разветвленный (С₃-С₃₀)алкилтиокарбонил, прямой (С1-С₃₀)алкоксил, разветвленный (С₃-С₃₀) алкоксил, фосфат, фосфонато, циано, амино, прямой (С1-С30)алкиламино, разветвленный (С3С₃₀)алкиламино, прямой (С1-С₃₀)диалкиламино, разветвленный (С₃-С₃₀)диалкиламино, ариламино, диариламино, прямой (С1-С₃₀)алкилариламино, разветвленный (С₃-С₃₀)алкилариламино, ациламино, прямой (С₁-С₃₀)алкилкарбониламино, разветвленный (С₃-С₃₀)алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбамоил, уреидо, амидино, имино, сульфгидрил, прямой (С1-С₃₀)алкилтио, разветвленный (С₃-С₃₀) алкилтио, арилтио, тиокарбоксилат, сульфаты, сульфонато, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, трифторметил, азидо, 4-10-членный гетероциклил, прямой (С1-С30)алкиларил, разветвленный (С3-С30)алкиларил или ароматическую или 5-6членную гетероароматическую группу, где за

    107

    108 меститель, в свою очередь, может быть замещен любым из вышеуказанных заместителей.
52. 52. Соединение по п.6, имеющее структуру
53. 53. Соединение по п.6, имеющее структуру
54. 54. Соединение по п.6, имеющее структуру
55. 55. Соединение по п.6, имеющее структуру
56. 56. Соединение по п.2, имеющее структуру
57. 57. Соединение по п.9, имеющее структуру
58. 58. Соединение по п.9, имеющее структуру

    60. Соединение по п.9, имеющее структуру

    63. Соединение по п.62, имеющее структуру

    64. Соединение по п.62, имеющее структуру
59. 59. Соединение по п.1, имеющее структуру

    65. Соединение по п.1, где любой заместитель, если он имеется, представляет собой галоген, гидроксил, прямой (С1-С₃₀)алкилкарбонилокси, разветвленный (С₃-С₃₀)алкилкарбонилокси, прямой (С1-С30)алкоксикарбонилокси, разветвленный (С₃-С₃₀)алкоксикарбонилокси, карбоксилат, прямой (С1-С₃₀)алкилкарбонил, разветвленный (С₃-С₃₀)алкилкарбонил, прямой (С1-С₃₀)алкоксикарбонил, разветвленный (С₃С30)алкоксикарбонил, аминокарбонил, прямой (С1-С₃₀)алкилтиокарбонил, разветвленный (С₃С30)алкилтиокарбонил, прямой (С1-С30)алкоксил, разветвленный (С₃-С₃₀)алкоксил, амино, прямой (С₁-С₃₀)алкиламино, разветвленный (С₃С₃₀)алкиламино, прямой (С₁-С₃₀)диалкиламино, разветвленный (С₃-С₃₀)диалкиламино, ациламино, прямой (С1-С₃₀)алкилкарбониламино, раз109

    110 ветвленный (С₃-С₃₀)алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбамоил, уреидо, амидино, имино, нитро, 4-10-членный гетероциклил, прямой (С1-С₃₀)алкиларил, разветвленный (С₃-С₃₀) алкиларил или ароматическую или 5-6-членную гетероароматическую группу, где заместитель, в свою очередь, может быть замещен любым из вышеуказанных заместителей.

    66. Соединение по п.65, где заместитель представляет собой галоген, гидроксил, прямой (С1-С₃₀)алкилкарбонилокси, разветвленный (С₃С30)алкилкарбонилокси, прямой (С1-С30)алкоксикарбонилокси, разветвленный (С₃-С₃₀)алкоксикарбонилокси, карбоксилат, прямой (С1-С30) алкилкарбонил, разветвленный (С₃-С₃₀)алкилкарбонил, прямой (С1-С30)алкоксикарбонил, разветвленный (С₃-С₃₀)алкоксикарбонил, аминокарбонил, прямой (С1-С₃₀)алкилтиокарбонил, разветвленный (С₃-С₃₀)алкилтиокарбонил, прямой (С1-С₃₀)алкоксил, разветвленный (С₃-С₃₀) алкоксил, амино, прямой (С1-С30)алкиламино, разветвленный (С₃-С₃₀)алкиламино, прямой (С₁С₃₀) диалкиламино, разветвленный (С₃-С₃₀)диалкиламино, ациламино, прямой (С₁-С₃₀)алкилкарбониламино, разветвленный (С₃-С₃₀)алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбамоил, уреидо, амидино, имино, нитро, 4-10членный гетероциклил или 5-6-членную гетероароматическую группу, где заместитель, в свою очередь, может быть замещен любым из вышеуказанных заместителей.

    67. Соединение по п.1, где К и К₂ представляют собой замещенный прямой (С₁-С₃₀) алкил или замещенный разветвленный (С₃-С₃₀) алкил, содержащие два заместителя.