CZ302486B6 - N-6-Substituovaný 7-deazapurin, zpusob jeho prípravy a farmaceutická kompozice s jeho obsahem - Google Patents

Abstract

Rešení se týká N-6-substituovaných 7-deazapurinu a farmaceutických kompozic na jejich bázi. Uvedené kompozice jsou úcinné pri lécbe respiracních chorob a chorob gastrointestinálního traktu.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká N-6-substituovaných-7-deazapurinů, způsobů jejich přípravy a farmaceutických kompozic s jejich obsahem. Tyto sloučeniny jsou v popisu také označovány systematickým názvem pyrrolo[2,3-d]pyrimidiny.

io

Dosavadní stav techniky

Adenosin je všudypřítomný modulátor řady fyziologických aktivit, zejména v kardiovaskulárním a nervovém systému. Zdá se, že účinek adenosinu je zprostředkován specifickými buněčnými povrchovými receptářovými proteiny. Adenosin moduluje rozličné fyziologické funkce, zahrnující uklidnění, vasodilataci, potlačení srdeční frekvence a kontraktility, inhibicí shlukování destiček, stimulaci glukoneogenéze a inhibicí lipolýzy. Ukázalo se, že vedle účinků na adenylátcyklázu, adenosin také otevírá draslíkové kanálky, snižuje průtok přes draslíkové kanálky a inhibuje nebo stimuluje přeměnu fosfoinositidu receptářem zprostředkovanými mechanismy (viz. například C. E. Muller a B. Stein „Adenosine Receptor Antagonists: Structure and Potential Therapeutic Applications,“ Current Pharmaceutical Design, 2:501 (1996) a C. E. Muller _írA,Adenosine Receptor Antagonists, „Exp. Opin. Ther. Patents 7(5):419 (1997)).

Adenosinové receptory patří do superrodiny purinových receptorů, které jsou běžně rozděleny na Pí (adenosin) a P₂ (ATP, ADP a další nukleotidy) receptory. Až dosud byly klonovány čtyři receptářové subtypy pro adenosin z různých druhů, včetně lidí. Dva receptorové subtypy (A) a A₂) vykazují afinitu k adenosinu v nanomolámím rozsahu, zatímco ostatní dva známé subtypy A_2b a A₃ jsou nízkoafínitními receptory, s afinitou k adenosinu v nízko-mikromolekulámím rozsahu. Aktivace adenosínového receptoru Ai a A₃ může vést k inhibicí aktivity adenylátcyklázy, zatímco aktivace Α_2Λ a A₂b způsobuje stimulaci adenylátcyklázy.

Bylo vyvinuto několik antagonistů Aj k léčbě kognitivní nemoci, reneálního selhání a srdeční arytmie. Bylo navrženo, že antagonisty A₂a mohou být výhodné pro pacienty trpící Parkinsono35 vou nemocí. Zejména s ohledem na možné lokální dodávání, antagonisté adenosínového receptoru mohou být cenné při léčbě alergických zánětů a astma. Dostupné informace (například Nyce & Metzgel „DNA antisense Therapy for Asthma in an Animal Model“ Nátuře (1997) 385: 721 až 5) indikují, že v tomto patofyziologickém kontextu mohou antagonisty A| blokovat kontrakci hladkého svalu zejména respiračního epitelu, zatímco antagonisty receptoru A_2b nebo A₃ mohou

4d blokovat degranulaci žímé buňky zmírněním uvolnění histaminu a dalších zánětlivých mediátorů. A_2b receptory byly nalezeny v celém zažívacím traktu, zejména v tlustém střevě a intestinálním epitelu. Předpokládá se, že receptory A_2b zprostředkují cAMP odezvu (Strohmeier a kol. J. Bio. Chem. (1995) 270: 2387 až 94).

Bylo prokázáno, že adenosinové receptory existují na sítnici různých savčích druhů, včetně hovězího dobytka, prasat, opic, krys, morčat, myší, králíků a lidí (viz. Blazynski a kol., Discrete Distributions of Adenosine Receptors in Mammalian Retina, Journal of Neurochemistry, díl 54, str. 648 až 655 (1990); Woods a kol., Characterization of Adenosine A;-Receptor Binding Sitrs in Bovine Retinal Membranes, Experimental Eye Research, díl 53, str. 325 až 331 (1991); a Braas a kot, Endoenous adenosine and adenosine receptors localized to ganglion cells of the retina, Proceedings of the National Academy of Science, díl 8, str. 3906 až 3910 (1987)). Nedávno Wlliams uveřejnil pozorování o adenosinových transportních místech v kultivovaných buněčných liniích lidské sítnice (Williams a kol., Nucleoside Transport Sites in a Cul tur ed Human Retinal Cell Line Established By SV-40 T Antigen Gene, Current Eye Research, díl 13, str. 109 až 118 (1994)).

- 1 CZ 302486 B6

Sloučeniny, které regulují příjem příjmu adenosinu jsou pokládány za potenciální terapeutická činidla pro léčbu retinálního a zrakového nervu. V patentu US 5 780 450, přihlašovatel Shade, se uvádí použití inhibitorů příjmu adenosinu při léčbě očních chorob. Shade neuvádí použití specifických inhibitorů receptoru A₃. Obsah patentu US 5 780 450 se zde uvádí jako odkaz.

V současné době existuje potřeba dalších antagonistů adenosinových receptorů jako farmakologických nástrojů a které jsou předmětem vážného zájmu jako léčiva pro shora uvedené nemocné stavy a/nebo podmínky.

Podstata vynálezu

Prvním aspektem předmětu vynálezu v základním provedení i) je N-6-substituovaný 7-deazapurin maj ící obecný vzorec I

(I) kde

Ri představuje atom vodíku;

Ri představuje alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, který je nesubstituovaný nebo substituovaný hydroxyskupinou, karboxyskupinou, aminoskupinou, acetoxyskupinou, pyridyl skup i nou, nebo Zerc-butyloxykarbonylskupinou;

-A-NHC(=O)B, kde A představuje nesubstituovanou alkyl- skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku a B představuje atom vodíku, alkylskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, cyklopropylskupinu, aminomethylskupinu, aminoethylskupinu, karboxyethylskupinu, aminoskupinu, methylaminoskupinu, ethylaminoskupinu, acetylskupinu nebo /erc-butyloxyskupinu;

NH₂-CO-alkylenskupínu s 1 až 3 atomy uhlíku v alky lenové části, v níž atom vodíku aminové části je popřípadě nahrazen methylskupinou nebo cyklopropy Imethy [skupinou;

-CH₂CH₂NHSO₂CH₃; nebo cyklohexylskupinou nebo cyklopentyiskupinu, přičemž tato cyklohexylskupina nebo cyklopentylskupina je popřípadě substituována hydroxyskupinou, acetylaminoskupinou, methylsulfonyl-aminoskupinou, benzoyloxyskupinou, 2-aminoacetoxy skupinou, 2-aminomethylacetylaminoskupinou nebo 2-N-/£7-c-butyloxyacyl-aminoacetoxyskupinou; nebo

Ri a R₂, spolu s atomem dusíku, k němuž jsou připojeny, tvoří pyrrolidinylskupinu nebo 3-acetylaminopiperidinový kruh,

- 2 CZ 3024S6 Bó přičemž uvedená pyrrolidinylskupina je nesubstituovaná nebo substituovaná jedním nebo více substituenty zvolenými ze souboru sestávajícího z hydroxyskupiny, aminoskupiny, thiolové skupiny, karboxyskupiny, halogenu nebo skupiny vzorce -CH₂OH, -C(=O)NH₂, -CH₂NHC(=O)alkyl a <’H₂NHC(-O)NHalkyl:

Ra představuje fenylskupinu, pyridylskupinu, furylskupinu nebo thienyl skup i nu, přičemž uvedená fenylskupina je nesubstituovaná nebo substituovaná jedním nebo více substituenty zvolenými ze souboru sestávajícího z hydroxyskupiny, methoxyskupiny, methylskupiny a halogenu;

R4 představuje atom vodíku;

R₅ představuje atom vodíku nebo methylskupinu, přičemž uvedená methylskupina je nesubstituovaná nebo substituovaná hydroxyskupinou, zbytkem karboxylové kyseliny, který je popřípadě substituován fenoxyskupinou, 4-fluorfenoxy-skupinou, 4-chlorfenoxyskupinou, 4-methoxyfenoxy skupinou, pyridin-2-on-l-ylskupinou, pyridin-2-oxyskupinou, fenylaminoskupinou nebo N-methy lfeny lam i noskupinou,

Ré představuje atom vodíku nebo methylskupinu;

nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl.

Přednostní provedení deazapurinu podle prvního aspektu vynálezu zahrnují mimo jiné i i) Sloučeninu obecného vzorce I podle provedení i), kde R₂ představuje cyklohexylskupinu nebo cyklopentylskupinu, přičemž tato cyklohexylskupina nebo cyklopentylskupina je popřípadě substituována hydroxyskupinou, acetylaminoskupinou, methyl-sulfonylaminoskupinou, benzoyloxyskupinou, 2-aminoacetoxyskupinou, 2-aminomethylacetylaminoskupinou nebo 2-N-zercbutyloxyacylaminoacetoxyskupinou; nebo Ri a R₂, spolu s atomem dusíku, k němuž jsou připojeny, tvoří 3-acetylaminopiperidylovy kruh.

iii) Sloučeninu obecného vzorce I podle provedení ii), kde R₃ představuje fenylskupinu, která je popřípadě substituovaná halogenem a R₅ a R<, představují methy lskupiny.

iv) Sloučeninu obecného vzorce I podle provedení ii), kde skupina R₂ je substituována jednou nebo dvěma hydroxyskupinami.

v) Sloučeninu obecného vzorce I podle provedení iv), kde R₂ představuje monohydroxycyklopentylskupinu.

vi) Sloučeninu obecného vzorce I podle provedení iv), kde R₂ představuje monohydroxycyklohexylskupinu.

vii) Sloučeninu obecného vzorce I podle provedení ii), kde R_t a R₂, spolu s atomem dusíku, k němuž jsou připojeny, tvoří 3-acety lamin opi peridylový kruh.

viii) Sloučeniny obecného vzorce I podle provedení i), kde Rt a R₂ spolu s atomem dusíku, k němuž jsou připojeny, tvoří pyrrolidinylový kruh, přičemž uvedený pyrrolidinylový kruh je nesubstituovaný nebo substituovaný jedním nebo více substituenty zvolenými ze souboru sestávajícího z hydroxyskupiny, aminoskupiny, thiolové skupiny, karboxyskupiny, halogenu nebo skupiny vzorce-CH₂OH, ~C(=O)NH₂, -CH₂NHC(=O)alkyl a-CH₂NHC(-O)NHalkyl.

ix) Sloučeninu obecného vzorce l podle provedení i), kde R₂ představuje skupinu vzorce -A-NHC(=O)B, kde A znamená nesubstituovanou alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku a B

-3CZ 302486 B6 představuje atom vodíku, alkylskupinu s I až 3 atomy uhlíku, cyklopropylskupinu, aminoethylskupinu, karboxyethylskupinu, aminoskupinu, methylaminoskupinu, ethylaminoskupinu, acetylskupinu nebo terc-butyloxyskupinu.

x) Sloučeninu obecného vzorce 1 podle provedení ví až ix), kde R₃ představuje pyridylskupinu nebo nesubstituovanou fenylskupinu.

xi) Sloučeninu obecného vzorce I podle provedení i), kterou je některá z následujících sloučenin {cn-3-hydroxycyklopcnt\l)amino-5.6 dimethyl-2-fenyl 7H pyrrolol2,3-(-/|-pyrimidin, sůl trífluoracetátové kyseliny 4-(cM-3-(2-aminoacetoxy)cyklopentyl)-amino-5,6—dimethyl-2fenyl-7//pyrrolo|2,3í/]-pyrimidinu,

4H3-acetamido)piperidinyi 5,6-dimethy]-2 feriyl-7// pyrroIo|2,3<:/)-pyrirnidin.

4-(2-N' rnethyhireapropyi)amino' 5,6 -dimethyl-2-ťenyl-7//' pyrrolo[2.3c/]-pyrimidin, 4(2-acetaiTiidobutyl)a[nino5.6-dimethyl-2-fenyi-7//pyrrolo[2 JJ]-pyrimidin. 4-(2-N'-methylureidobutyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3ó/]-pyrimidin, 4J2-aminocyk!opropylacetamidoethyl)amino-2-fenyl-7/7-pyrrolo[2,3í/]-pyrimidin, 4-(zra«.s^4-hydroxycyklohexyl)amino-2-(3-chlorfeny 1)-7//-pyrroto[2,3<7]-pyrimidin, 4(/A7/A7.s'-4-liydroxycyklohexyl)amÍno-2-(3-ťÍLiorfény]}7//-pyrTolo[2,3c/]-pyrimidtn, 4-(/ram^-hydroxycyklohexyl)amino-2’(4-pyridyl)-7//-pyrrolo[2,3é/]-pyrimidin nebo její farmaceuticky vhodná sůl.

Druhým aspektem předmětu vynálezu v základním provedení xii) je N-ó-substituovaný 7-deazapurin mající obecný vzorec II

kde

X představuje N nebo CR^;

Ri představuje atom vodíku;

R? představuje 2-acetylaminoethylskupinu nebo 2-N -methyImočovinoethylskupinu;

R-, představuje fenylskupinu, která je nesubstituované nebo substituovaná jedním nebo více substítuenty zvolenými ze souboru sestávajícího z hydroxyskupiny, methoxyskupiny, methylskupiny a halogenu;

-4CZ 302486 B6

R, představuje atom vodíku;

L představuje atom vodíku;

K₆ představuje atom vodíku, nesubstituovanou aíkyískupinu s i až 3 atomy uhlíku nebo halogen;

Q představuje CH₂, O, S, nebo NR₇, kde R₇ znamená atom vodíku nebo nesubstituovanou io alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku; a

W představuje nesubstituovanou fenylskupinu nebo fenyl-skupinu substituovanou jedním nebo více substituenty zvolenými ze souboru sestávajícího z halogenu, methoxyskupiny a hydroxyskupiny;

nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl.

Přednostní provedení deazapurinu podle druhého aspektu vynálezu zahrnují mimo jiné xiii) Sloučeninu obecného vzorce II podle provedení xii), kde Q představuje CH₂, O, S nebo NH.

xiv) Sloučeninu obecného vzorce II podle provedení Xii), kterou je některá z následujících sloučenin

4-<2-acetylamínoethyl)amino—6—fenoxymethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3č/]pyrimidin,

4-(2-acetylaminoethyl)amino-6-(4~fluorfenoxy)methyl-2-fenyl-7/ř-pyrrolo[2,3<Y]pyrimidin,

4-<2-aeetylaminoethyí)ainino-6-(chlorfenoxy)methyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3č/]pyrimidin,

4-( 2-acetv 1 am inoethy l)amino—6—(4-methoxyfenoxy )methyl -2-feny l-7//-- pyrrolo[2.3 pyri midin,

4-(2-acetylaminoethyl)amino-6-{2-pyridyloxy)inethyl-2-fenyl-7//-pyrro]o[2,3č/]pyrimidin,

4-(2-acety 1 am inoethy 1 )am i no-6-(N-feny 1 am i no)methy 1-2-feny l-7/7pvrro lo [2,3 d] pyri m i d i n,

4-(2-acetylamÍnoethy l)amino-6-(N-methy l-N-fenylamino)methyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3c/]pyrimidin a

4-(2-N'-methylureaethyl)amino-6-fenoxymethyl-2-fenyl-7//-pyrTolo[2,3ť/]pyrimÍdin, nebo její farmaceuticky vhodná sůl.

Deazapurin podle některého z provedení i, v i až ix nebo xii je vhodný pro použití pro inhibici aktivity adenosinového receptorů v buňce.

Třetím aspektem předmětu vynálezu v základním provedení xv je farmaceutická kompozice, která obsahuje terapeuticky účinné množství deazapurinu podle provedení i), vi) až ix) nebo xii) a farmaceuticky přijatelný nosič.

Přednostní provedení farmaceutické kompozice podle třetího aspektu vynálezu zahrnují mimo jiné

-5 CZ 302486 B6 xvi) Farmaceutickou kompozici podle provedení xv), ve které je deazapurin je vybrán ze souboru sestávajícího z

4~(2-aeetylaminoethyl)amino-6-fenoxymethyl-2-fenyl-7/í-pyrrolo[2,3t/] pyrimidinu,

4-(2-acetylaminoethyl)amino-6-(4-fluorfenoxy)methyl-2“fenyl-7//-pyrrolo[2,3í/]pyrim]dinu, 4-(2-acetylaminoethyl)amino-6-(chlorfenoxy)methyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3ť7]pyrimidinu,

4-(2-acetylaminoethyl)amino-6-{4-methoxyfenoxy)methyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3č/lpyrimidinu,

4-(2-acety lam inoethy I )am i nc^6-(2-pyridy loxy )methyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3í/] pyrimidinu, io 4 (2- acetvlaminoethyl)amino-6-<N-fenylamino)methy 1-2- feny17// pyrroiof 2,3<7|pyrimidinu, (2 acetv lam inoethy l)amino-6-(N-methyl-N“feny lam i no)methyl-2-feny l-7//-pyrrolo[2,3tíQpyrimidinu a

4-(2-N '-methylureaethyl)amino-6-fenoxymethy 1-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3t/]pyrimidinu;

nebo jeho farmaceuticky vhodné soli, xvii) Farmaceutickou kompozici podle provedení xv), ve které je deazapurin je vybrán ze souboru sestávajícího z

2o 4-(cžs-3-hydroxycyklopentyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3í/] pyrimidinu, sůl trifluoracetátové kyseliny 4-(c/ó-3-(2-aminoacetoxy)cyklopentyl)-amino-5,6--dimethyl-2fenyl-7//-pyrrolo[2,3£^-pyrimidinu,

4-(3-acetamido)piperÍdinyl-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3í/}-pyrimidinu,

4--(2-N'-methylureapropyI)amino-5,6-ditnethyl-2-feny!-7//pyrrolo(2,3JJ-pyrimidinu, 4-<2-acetamidobutyl)amino 5,6 dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3J]-pyrimidinu,

4-( 2-N '-methy lureidobutyl)amino-5,6-d i methy l-2-feny!-7//-pyrrolo[2,3t/]-pyrimidi nu, 4-(2-aminocyklopropylacetamidoethyl)amino-2-fenyl-7//-pyrTolo[2,3ť/]-pyrimidinu,

4-(Zrt/«.sM-hydroxycyklohexyl)amino-2-(3-chlorfenyl)-7//-pynOlo[2,3ď]-pyrimÍdinu, 4-(Zró/nA’-4-hydroxycyklohexyl)amÍno-2-(3-fluorfenyl}-7//-pyrrolo[2,3í/]-pyrimidinu a 4-(trans-4~ hydroxy cyklohexyl)am i no-2-(4-pyridyl>-7//-pyrroIo[2,3t/]-pyrimid inu nebo farmaceuticky vhodné soli této sloučeniny.

xvi i i) Farmaceutickou kompozici podle provedení xvi, kde uvedené terapeuticky účinné množství je účinné k léčbě respirační choroby nebo choroby gastrointestinálního traktu.

xix) Farmaceutickou kompozici podle provedení xviii), kde uvedenou gastrointestinální chorobou je průjem.

xx) Farmaceutickou kompozici podle provedení xviii), kde uvedenou respirační chorobou je astma, alergická rinitida nebo chronická obstruktivní pulmonámí nemoc.

xx i) Farmaceutickou kompozici podle provedení xv), kteráje ve formě oťtalmické formulace.

xx i i) Farmaceutickou kompozici podle provedení xxi), která je ve formě periokulámí, retrobulbámí nebo intraokulámí injekční formulace.

xxi i i) Farmaceutickou kompozici podle provedení xxi), kteráje ve formě systém ické formulace.

-6CZ 302486 Bó xxiv) Farmaceutickou kompozici podle provedení xxi), kteráje ve formě roztoku pro chirurgické oplachování.

Čtvrtým aspektem předmětu vynálezu je v základním provedení xxvi) způsob přípravy deazapurinu obecného vzorce

kde

Ri představuje atom vodíku;

R? představuje alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, který je nesubstituovaný nebo substituovaný hydroxyskupinou, karboxyskupinou, aminoskupinou, acetoxyskupinou, pyridylskupinou, nebo terc-butoxykarbonyl skupinou;

-A-NHC(=O)B, kde A představuje nesubstituovanou alkyl- skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku a B představuje atom vodíku, alkylskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, cyklopropy (skupinu, aminomethylskupinu, aminoethylskupinu, karboxyethyIskupinu, aminoskupinu, methylaminoskupinu, ethylaminoskupinu, acetylskupinu nebo /erc-buty loxy skupinu;

NH₂-CO-alkylenskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku v alkylenové části, v níž atom vodíku aminové části je popřípadě nahrazen methyl skup i nou nebo cyklopropylmethylskupinou;

-CH₂CH₂NHSO₂CH₃; nebo cyklohexylskupinou nebo cyklopentyl skup inu, přičemž tato cyklohexylskupina nebo cyklopentyl skupina je popřípadě substituována hydroxyskupinou, acetylaminoskupinou, methylsulfonylaminoskupinou, ben zoy loxy skupí nou, 2—am i noacetoxy skupinou, 2-aminomethylacetylaminoskupínou nebo 2-N-terc-butyloxyacylaminoacetoxyskupinou; nebo

Ri a R₂, spolu s atomem dusíku, k němuž jsou připojeny, tvoří pyrro lid i nyl skupinu nebo 3-acety lam inopiperidi nový kruh, přičemž uvedená pyrrolidinyIskupina je nesubstituovaná nebo substituovaná jedním nebo více substituenty zvolenými ze souboru sestávajícího z hydroxy skupiny, aminoskupiny, thiolové skupiny, karboxy skupiny, halogenu nebo skupiny vzorce -CH₂OH, -C(=O)NH₂, -CH₂NHC(=O)alkyl a -CH₂NHC(=O)NHalkyl;

R₃ představuje fenylskupinu, pyridylskupinu, furylskupinu nebo thienylskupinu, přičemž uvedená feny Iskupina je nesubstituovaná nebo substituovaná jedním nebo více substituenty zvolenými ze souboru sestávajícího z hydroxyskupiny, methoxyskupiny, methylskupiny a halogenu;

-7CZ 302486 B6

R_f, představuje atom vodíku nebo methylskupinu; jehož podstata spočívá v tom, že se

a) sloučenina obecného vzorce

kde R₆ má shora uvedený význam a P znamená odštěpitelnou chránící skupinu, nechá reagovat se sloučeninou obecného vzorce

A.

fV 'Cl kde R-, má shora uvedený význam, za vzniku sloučeniny obecného vzorce

kde R₃, R₍, a P maj í shora uvedený význam; potom se

b) produkt ze stupně a) cyklizuje za vzniku sloučeniny obecného vzorce

kde R₃ a R_Ř mají shora uvedený význam; potom se

c) produkt ze stupně b) za vhodných podmínek chlorací převede na sloučeninu obecného vzorce

kde R₃ a 1% mají shora uvedený význam; a nakonec se

-8CZ 302486 Bó

d) chlorovaný produkt ze stupně c) nechá reagovat s aminem za vzniku sloučeniny vzorce

kde obecné symboly mají shora uvedený význam.

Předkládaný vynález je založen, alespoň částečně, na zjištění, že určité N-6-substituované 7-deazapuriny. popsané dále, mohou být použity k léčbě stavů, které jsou citlivé na N-6-substituované diazapuriny. Příklady takových stavů zahrnují ty, ve kterých se aktivita adenosinových receptorů zvyšuje, například bronchitida, gastrointestinální choroby nebo astma. Tyto stavy mohou být charakterizovány tím, že aktivace adenosinových receptorů může vést k inhibicí nebo stimulaci aktivity adenylátcyklázy. Prostředky a způsoby podle vynálezu zahrnují enantiomemě nebo diastereomemě čisté N-6-substituované 7-deazapuriny. Výhodné N-6-substituované 7-deazapuriny zahrnují ty, které mají acetamidovou, karboxamidovou, substituovanou cyklohexy lovou, například cyklohexano lovou nebo moěovinovou část připojenou k N6 dusíku přes alkylenový řetězec.

Předkládaný vynález lze využít při způsobu modulace adenosinových receptorů u savců, který spočívá v tom, že se savci podá terapeuticky účinné množství N-6-substituovaného 7-deazapurinu, takže dojde k modulaci aktivity adenosinových receptorů. Vhodné adenosinové receptory zahrnují rodinu Aj, A₂ nebo A₃. Ve výhodném provedení je N-6-substituovaný 7-deazapurin antagonist adenosinového receptoru.

Vynález je dále využitelný při způsobu léčení chorob N-6-substituovaným 7-deazapurinem, jako jsou například astma, bronchitida, alergická rinitida, chronická obstruktivní pulmonámí nemoc, renální choroby, gastrointestinální choroby a oční choroby u savců, kteiý spočívá v tom, že se podá savci terapeuticky účinné množství N-6-substituovaného 7-deazapurinu, takže dojde k léčbě nemoci savce, který trpí uvedenou nemocí. Vhodné N-6-substituované 7-deazapuriny zahrnují ty, které jsou znázorněny obecným vzorcem I.

Vynález se dále týká farmaceutických prostředků pro léčbu stavů citlivých na N-6-substituovaný 7-deazapurin, jako jsou například astma, bronchitida, alergická rinitida, chronická obstruktivní pulmonámí nemoc, renální choroby, gastrointestinální choroby a oční choroby u savců. Farmaceutický prostředek zahrnuje terapeuticky účinné množství N-6-substituovaného 7-deazapurinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

Předkládaný vynález také zahrnuje balení farmaceutického prostředku pro léčbu stavů citlivých na N-6-substituovaný 7-deazapurin u savců. Balení farmaceutického prostředku se skládá ze zásobníku s terapeutickým množstvím alespoň jednoho N-6-substituovaného 7-deazapurinu a návodu pro léčbu citlivých na N-7 substituovaný 7-deazapurin u savců.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být užitečné pro řadu terapeutického použití, jako je například léčení astma, selhání ledvin ve spojení se selháním srdce a glaukomu. Zejména výhodné provedení deazapurinu je ve vodě rozpustné proíéčivo, které je schopné metabolizace in vivo na aktivační léčivo, například esterázou katalyzovanou hydrolýzou.

-9CZ 302486 B6

V ještě dalším provedení se předkládaný vynález muže využít při způsobu inhibice adenosinového receptorů (například A₃) B buňkách, který spočívá v kontaktu buněk s N-6-substituovaným 7-deazapurinem (například výhodně antagonist adenosinového receptorů).

Vynález je využitelný i při způsobu léčby poškození očí u živočichů (například lidí), který spočívá v tom, že se podá savci účinné množství N-6-substituovaného 7-deazapurinu obecného vzorce 1. Výhodně N-6-substituovaný 7-deazapurin je antagonistem Aj adenosinových receptorů v buňkách savce. Poškození se týká sítnice nebo zrakového nervu a může být akutní nebo chronické. Poškození může být výsledkem například glaukomu, edemu, ischemie, hypoxie nebo traumatu.

Vynález se také týká farmaceutického prostředku zahrnujícího N-6-substituovaný 7-deazapurin obecného vzorce I. Výhodně farmaceutický prostředek je ve formě oftalmické formulace (například periokulární, retrobulbární nebo intraokulární injekce, systémické formulace nebo roztoku pro chirurgický oplaeh).

Vynález se dále může využít při způsobu inhibice aktivity adenosinového receptorů (například A?b adenosinového receptorů) v buňce, kontaktem buňky se sloučeninou podle vynálezu. Výhodně je sloučenina antagonist receptorů.

Vynález ho lze také využít při způsobu léčby gastrointestinální choroby (například průjmu) nebo respirační choroby (například alergické rínitidy, chronické pulmonámí nemoci) u savců, který spočívá v tom, že se podá savci účinné množství sloučeniny obecného vzorce 11 (například antagonistů A₂b). Výhodně je živočichem člověk.

Předkládaný vynález se může využít při léčbě stavů citlivých na N-6-substituovaný 7—deazapurin u savců. Metoda spočívá v podání savci terapeuticky účinného množství N-6substituovaného 7-deazapurinu popsaného dále, takže dojde k léčbě stavu citlivého na N-6substítuovaný 7-deazapurin.

Výraz „stav citlivý na N-6-substituovaný 7-deazapurin“ je třeba chápat jako že zahrnuje chorobný stav nebo stav charakterizovaný citlivostí na léčbu N-6-substituovaným 7-deazapurinem podle vynálezu jek je popsáno dále, například léčba zahrnuje podstatné snížení alespoň jednoho symptomu nebo účinku stavu dosaženého N-6-substituovaným 7-deazapurinem podle vynálezu. Typicky jsou takové stavy spojeny se zvýšením adenosinu v hostiteli, takže hostitel často trpí fyziologickými symptomy, které zahrnují, nikoliv však s omezením, uvolňování toxinu, zánět, kómu, retenci vody, přibrání nebo ztráty hmotnosti, pankreatitidu, emťyzém, revmatickou artritidu, osteoartritidu, násobné selhání orgánu, syndrom respiračního stresu dospělých a dětí, alergickou rinitidu, chronickou obstruktivní pulmonámí nemoc, choroby očí, gastrointestinální choroby, podporu rakoviny kůže, nedostatečnost imunity a astma. (Viz. například C. E: Muller a B. Stein „Adenosine Receptor Antagonísts: Structures and Potential Therapeutic Applications, „Current Pharmaceutical Design, 2:501 (1996) a C. E. Muller „A|-Adenosine Receptor Antagonísts, „Exp. Opin. Ther. Patents 7(5): 419 (1997) a I. Feoktistove, R. Po losa, S. T. Holgate a I. Biaggioni „Adenosine A_3B receptors: a novel therapeutic target ín asthma?“ TiPS 19; 148 (1998)). Účinky často spojované šlakovými symptomy zahrnují, nikoliv však s omezením, horečku, dýchavičnost, nauzeu, průjem, zesláblost a dokonce smrt. V jednom provedení stav citlivý na N-6-substituovaný 7-deazapurin zahrnuje chorobné stavy, které jsou zprostředkovány stimulací adenosinových receptorů, například Aj, A_2a, A₂b, A·», atd., jako je koncentrace vápníku v buňkách a/nebo je modulována aktivace PLC (fosfolipáza C). Ve výhodném provedení stav citlivý na N-6-substituovaný 7-deazapurin je stav spojen s adenosinovými receptory, například N-6-substituovaný 7-deazapurin působí jako antagonist. Příklady vhodných citlivých stavů, které mohou být léčeny sloučeninami podle vynálezu, například subtypy adenosinových receptorů, které zprostředkují biologické účinky zahrnují účinky na centrální nervový systém (CNS), kardiovaskulární účinky, renální účinky, respirační účinky, imunologické účinky, gastrointestinální účinky a metabolické účinky.

- 10CZ 302486 Bó

Relativní množství adenosinu v subjektu mohou být spojeny s účinky uvedenými dále; tj. zvýšené úrovně adenosinu mohou způsobit účinek, například nežádoucí fyziologickou odezvu, například astmatické napadení.

Účinky na CNS zahrnují snížení uvolnění přenašeče (AJ, uklidnění (AJ, sníženou pohybovou aktivitu (A_2a), antikolvusantní aktivitu, stimulaci chemoreceptoru (A₂) a hyperaígesu. Terapeutické aplikace sloučenin podle vynálezu zahrnují léčbu demence, Alzheimerovy nemoci a zvýšení paměti.

Kardiovaskulární účinky zahrnují vasodilataci (A_2a), (A_2b) a (A₃), vasokonstrikci (AJ, bradykardii (AJ, inhibici destiček (A_2a), negativní kardiální inotropii a dromotropii (Aj), arytmii, tachykardii a angiogenézí. Terapeutické aplikace sloučenin podle vynálezu zahrnují například prevenci ischémií indukovaného oslabení srdce a kardiotoniky, ochranu myokardiální tkáně a obnovu kardiální funkce.

Renální účinky zahrnují snížení GFR (AJ, mesangiální buněčnou kontrakci (AJ, antidiurézu (AJ a inhibici reninového uvolnění (AJ. Vhodné terapeutické aplikace sloučenin podle vynálezu zahrnují použití sloučenin podle vynálezu jako diuretikua, natriuretika, činidla snižující draslík, k ochraně ledvin a prevenci akutního reneálního selhání, antihypertensiva, činidla proti otokům a antinefritida.

Respirační účinky zahrnují bronchodilataci (A₂), bronchokon strike i (AJ, chronickou obstruktivní pulmonámí nemoc, alergickou rinitidu, sekreci hlenů a respirační depresi (AJ. Vhodné terapeutické aplikace pro sloučeniny podle vynálezu zahrnují antiastmatické aplikace, léčbu plicních chorob po transplantaci a resp i rač nich chorob.

Imunologické účinky zahrnují imunosupresi (A₂), neutrofilní chemotaxi (A J, neutrofilní generaci superoxidu (A_2a) a degranulaci žímých buněk (A_2b a A₃). Terapeutické aplikace antagonistů zahrnují alergický a nealergický zánět, například uvolnění histaminu a dalších zánětlivých mediátorů.

Gastrointestinální účinky zahrnují inhibici sekrece kyseliny (AJ. Terapeutická aplikace může zahrnovat refluxní a uleerativní stavy. Gastrointestinální účinky také zahrnují střevní intestinální a průjmové choroby, například průjmovou chorobu spojenou s intestinálním zánětem (A_2b).

Choroby očí zahrnují poranění sítnice a zrakového nervu a choroby spojené s traumatem (AJ. Ve výhodném provedení je oční choroba glaukom.

Další terapeutické aplikace sloučenin podle vynálezu zahrnují léčbu obezity (lipolytické vlastnosti), hypertenze, léčbu deprese, jako sedativa, anxiolytická a antileptická činidla a laxativa, například zvýšení motility bez vyvolání průjmu.

Výraz „chorobný stav“ zahrnuje stavy, které jsou spojeny s nežádoucími úrovněmi adenosinu, adenosincyklázové aktivity, se zvýšenou fyziologickou aktivitou spojenou s aberantní stimulací adenosinových receptorů a/nebo zvýšením v cAMP. V jednom provedení chorobný stav zahrnuje například astma, chronickou obstruktivní pulmonámí nemoc, alergickou rinitidu, bronchitidu, renální choroby, gastrointestinální choroby nebo oční choroby. Další příklady zahrnují například bronchitidu a cystickou fibrózu. Vhodné příklady zánětlivých nemocí zahrnují nelymfatickou leukémii, myokardinální ischémii, angínu, infarkt, cerebrovaskulámí ischémii, interminentní klaudikaci, kritickou ischémii kostí, venózní hypertenzi, verikózní žíly, venózní ulceraci a arteriosklerózu. Stavy reperfuzního poškození zahrnují například postchirurgické trauma, jako je rekonstrukční chirurgie, trombolýza nebo angioplastika.

Výrazy „léčba stavů citlivých na N-6 -substituovaný 7-deazapurin“ nebo „léčba stavů citlivých na N-6-substituovaný 7-deazapurin“ zahrnují změny v chorobných stavech, jak jsou popsány

- 11 CZ 302486 B6 shora, takže fyziologické symptomy u savců jsou podstatně sníženy nebo minimalizovány. Výraz také zahrnuje regulaci, prevenci nebo inhibicí fyziologických stavů nebo účinků spojených s aberujícím množstvím adenosinu. V jednom výhodném provedení regulace chorobného stavuje taková, že chorobný stav je eradikován. V dalším výhodném provedení je regulace selektivní, takže aberující úrovně účinnosti adenosinového receptoru jsou regulovány, zatímco další fyziologické systémy a parametry nejsou ovlivněny.

Výraz „N-6-substituovaný 7-deazapurin“ je znám ve stavu techniky a zahrnuje sloučeniny mající obecný vzorec 1:

„7 deaza místo (I) „N-6-substituovaný 7-deazapurin“ zahrnuje jeho farmaceuticky přijatelné soli a v jednom provedení také zahrnuje určité N-ó-substituované puriny popsané v popise vynálezu.

V určitém provedení N 6- substituovaný 7-deazapurin není v poloze N-6-substítuován benzylem nebo fenylethy(ethylem. V dalším provedení R₄ není substituován benzylem nebo fenylethylem. Ve výhodném provedení nejsou oba R] a R? atomy vodíku. V ještě dalším výhodném provedení není R, atom vodíku.

Výraz „terapeuticky účinné množství“ N-6-substituovaného 7-deazap urinu, popsaném dále zahrnuje množství terapeutické sloučeniny nezbytné nebo dostatečné k uskutečnění její zamýšlené funkce u savce, například léčbu stavu citlivého na N-6-substituovaný 7-deazapurin nebo chorobného stavu u savce. Účinné množství terapeutické sloučeniny se může lišit v závislosti na faktorech, jako je množství kauzativního činidla již přítomného v savci, věk, pohlaví a hmotnost savce a schopnost sloučeniny podle vynálezu působit N-ó-substituováným 7-deazapurinem na stav savce. Odborník bude schopen na základě shora uvedených faktorů stanovit účinné množství terapeutické sloučeniny bez nepřiměřených experimentů. Ke stanovení „účinného množství“ terapeutických sloučenin podle vynálezu popsaných shora může být použita in vitro nebo in vivo zkouška. Odborník může vybrat vhodné množství terapeutické sloučeniny pro použití ve shora uvedené zkoušce nebo pro terapeutickou léčbu.

Terapeuticky účinné množství výhodně zmenšuje alespoň jeden symptom nebo účinek spojený se stavem citlivým na N-6-substituovaný 7-deazapurin který je léčen alespoň o okolo 20 % (výhodněji alespoň o okolo 40 %, ještě výhodněji o okolo 60 % a ještě výhodněji o okolo 80 %) vzhledem k neléčeným subjektům. Odborník může stanovit příslušné zkoušky ke stanovení zmenšení takových symptomů a/nebo účinků. Všechny zkoušky, pomocí kterých je možné měřit takové parametry jsou zahrnuty do rozsahu předkládaného vynálezu. Například jestliže léčeným stavem je astma, pak se může měřit objem vydechnutého vzduchu před a po léčbě a měří se zvýšení objemu za použití technik známých ve stavu techniky. Podobně, jestliže se stav který se má léčit je zánět, pak se může měřit oblast, která je napadená zánětem před léčbou a po léčbě a měří se zmenšení zánětlivé oblasti za použití technik známých ve stavu techniky.

Výraz „buňka“ zahrnuje jak prokaryotické, tak eukaryotické buňky.

Výraz „živočich“ zahrnuje jakýkoliv organismus s adenosinovými receptory nebo jakýkoliv stav organismu citlivý na N-6-substituovaný 7-deazapurin. Příklady živočichů zahrnují kvasinky, savce, plazy a ptáky. Také zahrnuje transgenní živočichy.

- 12CZ 302486 B6

Výraz „savec“ je znám ve stavu techniky a zahrnuje savce, výhodněji teplokrevného živočicha, nejvýhodněji dobytek, ovce, prasata, koně, psy, kočky, krysy, myši a lidi. Savci citliví naN-6substituovaný 7-deazapurin, zánět emfyzém, astma, centrální nervový systém nebo na akutní respirační stresový syndrom jsou zahrnuty jako část předkládaného vynálezu.

Vynález lze dále využít při způsobu modulace adenos i nových receptorů u savců, který spočívá v podání terapeutického množství N-6-substituovaného 7-deazapurinu, takže dojde k modulaci adenosinového receptoru u savce. Vhodné adenosinové receptory zahrnují rodiny A_b A₂ nebo A₃. Ve vhodném provedení je N-6-substituovaný azapurin antagonist adenosinového receptoru.

Výraz „modulování adenosinového receptoru“ je třeba chápat tak, že zahrnuje ty případy, kde sloučenina interaguje s adenos i novým i receptory a způsobí zvýšenou, sníženou nebo abnormální fyziologickou aktivitu spojenou s adenosinovým receptorem nebo následné kaskádní účinky vznikající modulací adenosinového receptoru. Fyziologické aktivity spojené s adenosinovým i receptory zahrnují indukci uklidnění, vasodilataci, potlačení srdeční frekvence a kontrakt i lity, Ínhibici shlukování destiček, stimulaci glukoneogenéze, ínhibici lipolýzy, otvírání draslíkových kanálků, snížení toku draslíkových kanálků atd.

Výraz „modulovat“, „modulování“ a „modulace“ je třeba chápat tak, že zahrnuje prevenci, eradikaci nebo Ínhibici výsledného zvýšení nežádoucí fyziologické aktivity spojené s abnormální stimulací adenosinového receptoru například ve spojení s terapeutickými metodami podle vynálezu. V dalším provedení výraz „modulování“ zahrnuje antagonistické účinky, například snížení aktivity produkce mediátorů alergie a alergického zánětu, kterýje výsledkem nadměrné stimulace adenos i nových receptorů. Například terapeutické deazapuriny podle vynálezu mohou interagovat s adenosinovým receptorem a i nh i bují tak například aktivitu adenylátcyklázy.

Výraz „stav charakterizovaný aberantní aktivitou adenosinového receptoru“ je třeba chápat tak, že zahrnuje ty nemoci, choroby nebo stavy, které jsou spojeny s aberantní stimulací adenosinového receptoru, takže stimulace receptoru způsobí biochemickou a nebo fyziologickou řadu událostí, které jsou přímo nebo nepřímo spojeny s nemocí, chorobou nebo stavem. Tato stimulace adenosinového receptoru nemusí být jedinou příčinou nemoci, choroby nebo stavu, ale pouze zodpovídá za vyvolání některých symptomů, které jsou typicky spojeny s nemocí, chorobou nebo stavem, které mají být léčeny. Aberantní stimulace receptoru může být jediný faktor nebo alespoň jeden další činitel a může být zahrnut do stavu, který má být léčen. Příklady stavů jsou ty, které jsou uvedeny shora a zahrnují zánět, gastrointestinální choroby a symptomy prokázané zvýšenou aktivitou adenosinového receptoru. Výhodné příklady zahrnují ty symptomy, které jsou spojené s astma, alergickou rinitidou, chronickou obstruktivní pulmonámí nemocí, emfyzémem, bronchitidou, gastrointestinálními chorobami a očním zákalem.

Výraz „léčení nebo léčba stavu charakterizovaného aberantní aktivitou adenosinového receptoru“ je třeba chápat tak, že zahrnuje zmírnění nebo snížení alespoň jednoho symptomu typicky spojeného s tímto stavem. Léčba také zahrnuje zmírnění nebo snížení více než jednoho symptomu. Výhodně léčba léčí, tj. například podstatně eliminuje symptomy spojené s tímto stavem.

Sloučeniny podle vynálezu mohou zahrnovat ve vodě rozpustná proléčiva, která jsou metabolizována in vivo na aktivní léčivo, například hydrolýzou katalyzovanou esterázou. Příklady potenciálních léčiv zahrnují deazapuriny, s například K₂ cykloalkýlovou skupinou substituovanou s OC(O)(Z)NH₂, kde Z je boční řetězec v přírodě se vyskytující aminokyseliny nebo syntetické aminokyseliny nebo jejich analog a α, β, γ nebo ω aminokyselin nebo dipeptidu. Výhodné postranní řetězce aminokyselin zahrnují řetězce odvozené od gly cínu, a lan i nu, val inu, leucinu, ísoleucinu, lysinu, cc-methylalaninu, aminocyklopropankarboxylové kyseliny, azetidin-2-karboxylové kyseliny, β-alaninu, γ-aminobutanové kyseliny, alanin-alaninu nebo glycin-alaninu.

Ve zvlášť výhodném provedení jsou deazapuriny podle vynálezu ve vodě rozpustná proléčiva, která mohou být metabolizována in vivo na aktivní léčivo, například hydrolýzou katalyzovanou

-13CZ 302486 Β6 esterázou. Výhodně proléčiva obsahují R₂ skupinu, která je cykloalkylová skupina substituovaná s -OC(O)(Z)NH₂, kde Z je boční řetězec v přírodě se vyskytující aminokyseliny nebo syntetické aminokyseliny, jejich analog a α, β, γ nebo ω aminokyselin nebo dipeptidu. Příklady výhodných postranních řetězců aminokyselin zahrnují řetězce odvozené od glycinu, alaninu, valinu, leucinu, isoleucinu, lysinu, α-methylalaninu, aminocyklopropankarboxylové kyseliny, azetidin-2-karboxylové kyseliny, β-alaninu, γ-aminobutanové kyseliny, alanin-alaninu nebo glycin-alaninu.

Výraz „alkyl“ nebo „alkylová skupina” zahrnuje zbytek alifatických skupin, zahrnující alkylové skupiny s přímým nebo rozvětveným řetězcem, eykloalkyl(alifatické) skupiny, alkylsubstituované cykloalkylové skupiny a cykloalkylsubstituované alkylové skupiny. Výraz alkyl dále zahrnuje alkylové skupiny, které mohou dále zahrnovat atomy kyslíku, dusíku, síry nebo fosforu nahrazující jeden nebo více atomů uhlíku uhlovodíkové kostry, například atomy kyslíku, dusíku, síry nebo fosforu. Ve výhodném provedení alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem má 30 nebo méně atomů uhlíku ve své kostře (například alkyl s 1 až 30 atomy uhlíku v případě rovného řetězce a alkyl se 3 až 30 atomy uhlíku v případě rozvětveného řetězce) a výhodněji 20 nebo méně. Podobně, výhodné cykloalkylové skupiny mají 4 až 10 atomů uhlíku ve své kruhové struktuře, výhodněji mají 5, 6 nebo 7 atomů uhlíku ve své kruhové struktuře.

Dále, výraz alkyl a alkylová skupina jak se používá v předkládaném popise a v nárocích zahrnuje jak „nesubstituované alkyly“, tak „substituované alkyly“, přičemž substituovaný alkyl se týká alkylových zbytků, majících substituenty nahrazující vodík na jednom nebo více atomech uhlíku uhlovodíkového řetězce. Takové substituenty mohou zahrnovat například atom halogenu, hydroxyskupinu, alkylkarbonyloxyskupinu, arylkarbonyloxyskupinu, alkoxy karbony loxy skupinu, aryloxykarbonyloxyskupinu, karboxylátovou skupinu, alkylkarbonylovou skupinu, alkoxykarbonylovou skupinu, amino karbony lovou skupinu, alkylthiokarbonylovou skupinu, alkoxylovou skupinu, fosfátovou skupinu, fosfonátovou skupinu, fosfinátovou skupinu, kyanoskupinu, aminoskupinu (zahrnující alkylamino, dialkylamio, arylamino, diarylamino a alkylarylaminoskupiny), acylaminovou skupinu (zahrnující alkylkarbonylamino, arylkarbonylamino, karbamoylové a ureidové skupiny), amidinoskupinu, iminoskupinu, sulfhydrylovou skupinu, alkylthioskupinu, arylthioskupinu, thiokarboxylátovou skupinu, sulfátovou skupinu, sulfonátovou skupinu, sulfonamidoskupinu, nitroskupinu, trifluormethylovou skupinu, kyanoskupinu, azidoskupinu, heterocyklylovou skupinu, alkylarylovou skupinu nebo aromatický nebo heteroaromatický zbytek. Odborníkem může být vzato v úvahu, že zbytky substituované na uhlovodíkovém řetězci mohou být, pokud to je vhodné substituované samotné. Cykloalkylové skupiny mohou být dále substituovány například substituenty popsanými shora. Výraz „alkylarylový“ zbytek znamená alkyl substituovaný ary lem (například fenylmethyl (benzyl)). Výraz „alkyl“ také zahrnuje nenasycené alifatické skupiny analogické v délce a možné substituci alkylových skupin popsaných shora, ale obsahují alespoň jednu dvojnou nebo trojnou vazbu.

Výraz „aryl“ nebo „arylová skupina“ jak se zde používá, se týká zbytku arylových skupin, zahrnující 5-členný nebo 6-Členný aromatický kruh, který může obsahovat od nuly do čtyř heteroatomů, například benzen, pyrrol, furan, thiofen, imidazol, benzoxazol, benzothiazol, triazol, tetrazol, pyrazol, pyridin, pyrazin, pyridazin a podobně. Arylové skupiny mohou také zahrnovat polycyklické aromatické skupiny, jako je naftyl, chinolyl, indolyl a podobně. Arylové skupiny mající heteroatomy v cyklické struktuře mohou být také nazývány „arylheterocykly“, „heteroaryly“ nebo „heteroaromáty“. Aromatický kruh může být substituován v kterékoliv jedné nebo více polohách substituenty jak jsou popsány shora, například vybrané ze souboru, který zahrnuje atom halogenu, hydroxyskupinu, alkoxyskupinu, alkylkarbonyloxyskupinu, arylkarbonyloxyskupinu, alkoxykarbonyloxyskupinu, aryloxykarbonyloxyskupinu, karboxy láto vou skupinu, alkylkarbonylovou skupinu, alkoxykarbonyloxyskupinu, aminokarbonylovou skupinu, alkylthiokarbonylovou skupinu, fosfátovou skupinu, fosfonátovou skupinu, fosfinátovou skupinu, kyanoskupinu, aminoskupinu (zahrnující alkylamino, dialkylamino, arylamino, diarylamino a alkylarylaminoskupiny), acylaminovou skupinu (zahrnující alkylkarbonylamino, arylkarbonylamino, karbamoylové a ureidové skupiny), amidinoskupinu, iminoskupinu, sulfhydrylovou skupinu, alkylthioskupinu, arylthioskupinu, thiokarboxylátovou skupinu, sulfátovou skupinu, sulfonátovou

- 14 CZ 302486 Bó skupinu, sulfamoylovou skupinu, sulfonamidoskupinu, nitroskupinu, trifluormethylovou skupinu, kyanoskupinu, azidoskupinu, heterocyklylovou skupinu, alkylarylovou skupinu nebo aromatický nebo heteroaromatický zbytek. Arylové skupiny mohou být také kondenzované nebo můstkové s alicyklickými nebo heterocyklickými kruhy, které nejsou aromatické, takže vzniká poly5 cyklický systém (například tetralin).

Výraz „alkenyl“ a „alkinyl“ nebo „alkenylová skupina“ nebo „alkinylová skupina“ se týká nenasycených alifatických skupin analogických v délce a možné substituci k alkytovým skupinám popsaným shora, ale obsahující alespoň jednu dvojnou nebo trojnou vazbu. Například vynález zahrnuje kyanoskupinu a propargylovou skupinu.

Pokud není počet atomů uhlíku jinak specifikován, pak výraz „nižší alkyl“ jak se zde používá znamená alkylovou skupinu jak je definována shora, mající od jednoho do deseti atomů uhlíku, výhodněji od jednoho do 6 atomů uhlíku ve své kostře, ještě výhodněji jeden až tři atomy uhlíku ve své kostře. Podobně, „nižší alkenyl“ a „nižší alkinyl“ má stejné délky řetězce.

Výraz „alkoxyalkyl“, „polyaminoalkyl“ a „thioalkoxyalkyl“ znamená alkylové skupiny, jak jsou popsány shora, které dále obsahují atomy kyslíku, dusíku nebo síry, nahrazující jeden nebo více atomů uhlíku v uhlovodíkové struktuře, například atomy kyslíku, dusíku nebo síry.

Výraz „polycyklyl“ nebo „polycyklický zbytek“ znamená skupinu obsahující dva nebo více cyklických kruhů (například cykloalkylů, cykloalkenylů, cykloalkinylů, arylů a/nebo heterocyklů), kde jsou dva nebo více atomů uhlíku společně s dvěma sousedícími kruhy, například kruhy jsou „kondenzované kruhy“. Kruhy, které jsou vázány přes nesousední atomy uhlíku se nazývají „můstkové“ kruhy. Každý z kruhů polycyklu může být substituován substituenty popsanými shora vybranými ze souboru, který zahrnuje například atom halogenu, hydroxyskupinu, alky lkarbonyloxy skupinu, aryl karbony loxy skupinu, alkoxykarbonyloxyskupinu, aryloxykarbonyloxyskupinu, karboxylátovou skupinu, alkylkarbonylovou skupinu, alkoxykarbonylovou skupinu, aminokarbonylovou skupinu, alkylthiokarbonylovou skupinu, alkoxylovou skupinu, fosfátovou skupinu, fosfonátovou skupinu, fosfinátovou skupinu, kyanoskupinu, aminoskupinu (zahrnující alkylamino, dialkylamino, arylamino, diarylamino a alkylarylaminoskupiny), acylam í novou skupinu (zahrnující alkyl karbony lamino, aryl karbony lamino, karbamoylové a ureidové skupiny), amidinoskupinu, iminoskupinu, sulfhydry lovou skupinu, alkylthioskupinu, arylthioskupinu, thiokarboxylátovou skupinu, sulfátovou skupinu, sulfonátovou skupinu, sulfamoylovou skupinu, sulfonamidoskupinu, nitroskupinu, trifluormethylovou skupinu, kyanoskupinu, azidoskupinu, heterocykly lovou skupinu, alkylovou skupinu, alkylarylovou skupinu nebo aromatický nebo heteroaromatický zbytek.

Výraz „heteroatom“ jak se zde používá znamená atom kteréhokoliv prvku, kromě atomu uhlíku nebo vodíku. Výhodné heteroatomy jsou dusík, kyslík, síra nebo fosfor.

Výraz „aminokyselina“ zahrnuje přírodní nebo syntetické aminokyseliny, které se nachází v proteinech, jako je glycin, alanin, valin, cystein, leucin, ísoleucin, serin, threonin, methionin, kyselina glutamová, kyselina aspartová, glutamin, asparagin, lysin, arginin, protin, histidin, fenylalanin, tyrosín a tryptofan. Analogy aminokyselin také zahrnují kyseliny s delšími nebo kratšími bočními řetězci nebo různými vedlejšími řetězci s vhodnými funkčními skupinami. Aminokyseliny také zahrnují D a L stereoizomery aminokyseliny, kde struktura aminokyseliny připouští stereoizomemí formy. Výraz „dipeptid“ zahrnuje dvě nebo více aminokyselin spojených navzájem. Výhodně, dipeptidy jsou dvě aminokyseliny vázané peptidovou vazbou.

Zejména výhodně dipeptidy zahrnují například alanin-alanin a glycin-alanín.

Je třeba vzít v úvahu, že struktury některých sloučenin podle vynálezu zahrnují asymetrické atomy uhlíku. Pokud není uvedeno jinak, pak takové izomery vznikající z takové asymetrie (například enantiomery a diastereomery) jsou zahrnuty do rozsahu předkládaného vynálezu.

- 15CZ 302486 B6

Takové izomery se mohou získat v podstatě v čisté formě klasickými separačnímí technikami a stereochemicky kontrolovanými syntézami.

Vynález se dále týká farmaceutických prostředků pro léčbu stavů citlivých na N-6-substituovaný 7-deazapurin u savců, například respiračních chorob (například astma, bronchitida, chronická obstruktivní plicní choroba a alergická rinitida), renální choroby, gastro intestinální choroby a oční choroby. Farmaceutický prostředek zahrnuje terapeuticky účinné množství N-6-substituovaného 7-deazapurinu, popsaném shora a farmaceuticky přijatelný nosič. Je třeba vzít v úvahu, že všechny deazapuriny popsané shora jsou zahrnuty pro terapeutické účely. Je třeba dále vzít v úvahu, že deazapuriny podle vynálezu se mohou použít samotné nebo v kombinaci s jinými deazapuriny podle vynálezu nebo v kombinaci s jinými terapeutickými sloučeninami, jako jsou antibiotika, protizánětlivá Činidla nebo protirakovinná činidla.

Výraz „antibiotikum“ je známý ve stavu techniky a zahrnuje látky produkované růstem mikroorganismů a jejich syntetické deriváty, které eliminují nebo inhibují růst patogenů a jsou selektivně toxické vůči patogenů, za produkování minimálních nebo žádných škodlivých účinků na infikovaného hostitele. Příklady takových antibiotik zahrnují, nikoliv však s omezením, například základní třídy aminoglykosidů, ceťalosporinů, chloramfenikolů, makrolidů, fuscídové kyseliny, penicilínů, polym ixinů, tetracyklinu a streptomycinu.

Výraz „protizánětlivý“ je znám ve stavu techniky a zahrnuje činidla, která působí na tělesný mechanismus bez přímého působení na kauzativní činidlo zánětu, jako jsou glukokortikoidy, aspirin, ibuprofen, NSA1DS atd.

Výraz „protirakovinné činidlo“ je znám ve stavu techniky a zahrnuje činidla, která snižují, e rad i kují nebo zabraňují růstu rakovinných buněk, aniž by nepříznivě ovlivňovaly další fyziologické funkce. Reprezentativní příklady zahrnují cisplatin a cyklofosfamid.

Pokud se sloučeniny podle vynálezu podávají jako farmaceutika lidem a savcům, mohou se podávat samotné nebo jako farmaceutické prostředky obsahující 0,1 až 99,5 % (výhodněji 0,5 až 90 %) aktivní složky v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Fráze „farmaceuticky přijatelný nosič“ jak se zde používá znamená farmaceuticky přijatelný materiál, kompozici nebo vehikulum, jako je kapalina, plnivo, ředidlo, excipient, rozpouštědlo nebo zapouzdřující materiál, který se používá při doručování nebo transportu sloučenin podle vynálezu v nebo k subjektu, takže plní požadovanou funkci. Typicky jsou takové sloučeniny doručovány nebo transportovány z jednoho orgánu nebo části těla do jiného orgánu nebo části těla. Každý nosič musí být „přijatelný“ v tom smyslu, že je kompatibilní s ostatními složkami formulace a není škodlivý pacientovi. Některé příklady materiálů, které mohou sloužit jako farmaceuticky přijatelné nosiče zahrnují: cukry, jako je laktóza, glukóza a sacharóza; škroby, jako je kukuřičný škrob a bramborový škrob; celulóza a její deriváty, jako je karboxymethylcelulóza, ethylcelulóza a acetát celulózy; práškový tragakant; slad; želatina; talek; excipienty, jako je kokosové máslo a vosky pro čípky; oleje, jako je podzemnicový olej, bavlníkový olej, saflorový olej, sezamový olej, olivový olej, kukuřičný olej a sojový olej; glykoly, jako je propylenglykol; polyoly, jako je glycerin, sorbitol, mannitol nebo polyethylenglykol; estery, jako je ethyloleát, ethyllaurát; agar, pufrovací činidla, jako je hydroxid horečnatý a hydroxid hlinitý; kyselina alginová; bezpyrogenní voda; isotonický fyziologický roztok; Ringerův roztok; ethylalkohol; fosfátové pufrové roztoky a netoxické kompatibilní substance používané ve farmaceutických formulacích.

Jak se uvádí shora, určitá provedení předkládaných sloučenin mohou obsahovat bazickou funkční skupinu, jako je například aminoskupina nebo alkylaminoskupina a jsou tak schopné tvořit farmaceuticky přijatelné soli s farmaceuticky přijatelnými kyselinami. Výraz „farmaceuticky přijatelná sůl“ se týká relativně netoxických adičních solí sloučenin podle vynálezu s anorganickými a organickými kyselinami. Tyto soli se mohou připravit in šitu během finální izolace a

- 16cz 302486 Bó čištění sloučenin podle vynálezu nebo separátní reakcí vyčištěné sloučeniny podle vynálezu nebo její bazické formy s vhodnou organickou nebo organickou kyselinou a izolací takto vzniklé soli. Reprezentativní soli zahrnují bromidy, chloridy, sírany, hydrogen sírany, fosfáty, dusičnany, acetáty, valerátv, oleáty, palmitáty, stearáty, lauráty, benzoáty, laktáty, fosfáty, tosyláty, citráty, maleáty, fumaráty, sukcináty, tartráty, nafty laty, mesyláty, glukoheptanoáty, laktobionáty a laurylsulfonáty a podobně (viz. například Berge a kol. (1977) „Pharmaceuticai Salts“, J. Pharm. Sci. 66: 1 až 19).

V dalších případech mohou sloučeniny podle vynálezu obsahovat jednu nebo více kyselých id funkčních skupin a tak jsou schopné tvorby farmaceuticky přijatelných solí s farmaceuticky přijatelnými bázemi. Výraz „farmaceuticky přijatelná sůl“ v těchto případech se týká netoxických adičních solí sloučenin podle vynálezu s anorganickými a organickými bázemi. Tyto soli mohou být podrobně připraveny in sítu během finální izolace a čištění sloučenin nebo separátní reakcí čištěné sloučeniny ve formě své volné kyseliny s vhodnou bází, jako je hydroxid, uhličitan nebo hydrogenuhličitan farmaceuticky přijatelného kovového kationu, amonia nebo s farmaceuticky přijatelným organickým primárním, sekundárním nebo terciárním aminem. Reprezentativní soli alkalického kovu nebo kovu alkalických zemin zahrnují lithné, sodíkové, draslíkové, vápníkové, hořčíkové a hlinité soli a podobně. Reprezentativní organické aminy užitečné pro tvorbu bazických adičních solí zahrnují ethy lamin, diethy lamin, ethylendiamin, ethanolamin, diethanolamin, piperazin a podobně.

Výraz „farmaceuticky přijatelné estery“ se týká relativně netoxických, esterifikovaných produktů sloučenin podle vynálezu. Tyto estery se mohou připravit in šitu během finální izolace a čištění sloučenin nebo oddělenou reakcí čištěných sloučenin ve své formě volné kyseliny nebo s volným hydroxylem s vhodným esterifikačním činidlem. Karboxylové kyseliny mohou být konvertovány na své estery působením s alkoholem v přítomnosti katalyzátoru. Deriváty obsahující hydroxylovou skupinu mohou být konvertovány na své estery zpracováním s esterifíkačními činidly, jako jsou alkanoylhalogenidy. Tento výraz také zahrnuje nižší uhlovodíkové skupiny, které jsou schopné být solvatovány při fyziologických podmínkách, například alkylestery, methyl, ethyl

3D a propylesteiy. (Viz například Berge a kol., shora).

Vynález dále zahrnuje použití proléčiv, které jsou konvertovány in vivo na terapeutické sloučeniny podle vynálezu (viz. například R. B. Silverman, 1992, „The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action“ Academie Press, kap. 8). Taková proléčiva se mohou použít k úpravě biodistribuce (například umožnit přístup sloučeninám, které by typicky nevstupovaly na reakční místa proteázy) nebo farmakokinetiky terapeutické sloučeniny. Například skupina karboxylové kyseliny se může esterifikovat například s methylovou skupinou nebo ethylovou skupinou za vzniku esteru. Jakmile se ester podá subjektu, potom dochází ke štěpení esteru enzymaticky nebo neenzymatickým způsobem, redukčně nebo hydrolyticky za obnovení aniontové skupiny. Aniontová skupina se může potom esterifikovat se zbytky (například acyloxymethylestery), které se štěpí za vzniku meziproduktové sloučeniny, která se následně štěpí za získání aktivní sloučeniny. V dalším provedení je proléčivo redukovaná forma sulfátu nebo sulfonátu, například thiol, který se oxiduje in vivo na terapeutickou sloučeninu. Dále, aniontová část může být esterifikována na skupinu, která je aktivně transportována in vivo nebo která se selektivně zachycuje cílovými orgány. Ester může být vybrán tak, aby umožnil specifické zaměření terapeutických částí do zvláštních reakčních míst, jak je popsáno dále pro nosičové části.

Prostředek podle vynálezu může dále obsahovat smáčedla, emulgátory a mazadla, jako je lauryl50 sulfát sodný a stearát horečnatý a rovněž barviva, uvolňovací činidla, povlaková činidla, sladidla, aromáty a parfémy, konzervační činidla a antioxidanty.

Příklady farmaceuticky přijatelných antioxidantu zahrnují: ve vodě rozpustné antioxidanty, jako je kyselina askorbová, hydrochlorid cysteinu, hydrogensíran sodný, disiřičitan sodný, siřičitan sodný a podobně; v oleji rozpustné antioxidanty, jako je askorbylpalmitát, butylovaný hydroxy- 17CZ 302486 B6 anisol (BHA), butylovaný hydroxytoluen (BHT), lecitin, propylgalát, alfa-tokoferol a podobně; a kovová chelatační činidla, jako je kyselina citrónová, kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA), sorbitol, kyselina vinná, kyselina fosforečná a podobně.

Formulace podle předkládaného vynálezu zahrnují takové formulace, která jsou vhodné pro orální, nazální, topické, transdermální, bukální, sublinguální, rektální, vaginální a/nebo parenterální podání. Formulace jsou vhodně prezentovány ve formě jednotkové dávkové formy nebo se mohou připravit jakýmkoliv způsobem známým v oboru farmacie. Množství aktivní složky, která může být kombinována s nosičovým materiálem k produkci jednotlivé dávkové formy bude obecně takové množství, aby se dosáhlo terapeutického účinku. Obecně, toto množství bude v rozsahu od okolo I procenta od okolo 99 procent aktivní složky, výhodněji od okolo 5 procent do okolo 70 procent, nejvýhodněji od okolo 10 procent do okolo 30 procent.

Metody přípravy těchto formulací nebo kompozic zahrnují krok spočívající ve spojení sloučeniny podle vynálezu s nosičem a případně jednou nebo více dodatečných složek. Obecně se formuluje připraví důkladným a jednotným spojením sloučeniny podle vynálezu s kapalnými nosiči nebo jemnými pevnými nosiči nebo oběma a potom, je-li to žádoucí, tvarováním produktu.

Formulace podle vynálezu jsou vhodné pro orální podání může být ve formě kapslí, tobolek, pilulek, tablet, pastilek (za použití ochucené báze, obvykle sacharózy a akácie nebo tragakantu), prášků, granulí nebo roztoku nebo suspenze ve vodné nebo nevodné kapalině nebo jako emulze olej ve vodě nebo voda v oleji nebo jako elixír nebo sirup nebo tabletky (za použití inertní báze, jako je želatina nebo glycerin nebo sacharóza a akácie) a/nebo ústní vody a pod., přičemž formulace vždy obsahuje předem stanovené množství sloučeniny podle vynálezu jako aktivní složky. Sloučenina podle vynálezu také může být podána jako bolus, lektvar nebo pasta,

V případě pevných dávkových forem pro orální podání (kapsle, tablety, pilulky, dražé, prášky, granule a podobně) se aktivní složka smísí s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči, jako je citrát sodný nebo hydrogenfosforečnan vápenatý a/nebo kterákoliv z následujících složek: plniva nebo nastavovadla, jako je škrob, laktóza, sacharóza, glukóza, mannitol a/nebo kyselina křemičitá; pojidla, jako jsou například karboxymethylcelulóza, algináty, želatina, polyvinylpyrrolidon, sacharóza a/nebo akácie; zvlhčovadla, jako je glycerol; dezintegraění činidla, jako je agar-agar, uhličitan vápenatý, bramborový nebo tapiokový škrob, kyselina alginová, určité silikáty a uhličitan sodný; činidla zpomalující rozpuštění, jako je parafin; absorpční akcelerátory, jako jsou kvartem í amonné sloučeniny; smáčedla, jako jsou například četyIalkohol a glycerolmonostearát; absorbenty, jako jsou kaolin a bentonitový jíl; mazadla, jako je mastek, stearát vápenatý, stearát hořečnatý, pevné polyethylenglykoly, laurylsíran sodný a jejich směsi; a barviva. V případě kapslí, tablet a pilulek mohou farmaceutické prostředky také obsahovat pufry. Pevné prostředky podobného typu mohou být také použity jako plniva v měkkých a nebo tvrdých že lati nových kapslích za použití excipientů jako je laktóza nebo mléčný cukr a rovněž vysoko molekulární polyethylenglykoly a podobně.

Tablety se mohou připravit lisováním nebo tvářením, případně s jedním nebo více pomocnými látkami. Lisované tablety se mohou připravit za použití pojivá (například želatina nebo hydroxypropylmethylcelulóza), mazadla, inertního ředidla, konzervačního činidla, dezintegračního činidla (například sodného glykolátu škrobu) povrchové aktivního nebo dispergačního činidla. Tvářené tablety se mohou připravit tvářením směsí práškové sloučeniny zvlhčené inertním kapalným ředidlem ve vhodném zařízení.

Tablety a ostatní pevné dávkové formy farmaceutických prostředků podle vynálezu, jako dražé, kapsle, pilulky a granule mohou být případně rýhované nebo mohou obsahovat povlaky a slupky, jako jsou enterické povlaky a další povlaky známé v oboru formulace farmaceutických produktů. Mohou být také formulovány tak, že poskytují pomalé nebo řízené uvolňování použité aktivní složky použitím například hydroxypropyicelulózy v různých poměrech za poskytnutí žádaného profilu uvolnění, jiných poiymernich matric, liposomů a/nebo mikrosfér. Mohou být sterilizo-18CZ 302486 Bó vány například filtrací pres filtr zachycující bakterie nebo včleněním sterilizačních činidel ve formě sterilních pevných prostředků, které mohou být rozpuštěny ve sterilní vodě nebo jiném sterilním injektovatelném prostředí bezprostředně před použitím. Prostředky mohou také případně obsahovat kalidla a mohou být formulovány tak, že uvolňují aktivní složku (y) pouze nebo přednostně v určitých částech gastrointestinálního traktu, případně zpožděným způsobem. Příklady inkorporacních prostředků, které se mohou použit zahrnuji polymerní látky a vosky.

Aktivní složka může také být v mikro-zapouzdřené formě a je-li to vhodné, s jedním nebo více shora popsanými excipienty.

Kapalné dávkové formy pro orální podání sloučenin podle vynálezu zahrnují farmaceuticky přijatelné emulze, mikroemulze, roztoky, suspenze, sirupy a elixíry. Dále, vedle aktivní složky mohou kapalné dávkové formy obsahovat inertní ředidla obvykle používaná v oboru, jako jsou například voda nebo jiná rozpouštědla, solubilizační Činidla a emulgátory, jako ethylalkohol, isopropylalkohol, ethylkarbonát, ethylacetát, benzylalkohol, benzyl benzoát, propylen gly kol, 1.3-butylenglykol, oleje (zejména z bavlníkových semen, podzemnice olejně, kukuřice, klíčků, oliva dále ricinový olej a sezamový olej), glycerol, tetrahydrofurylalkohol, polyethylenglykoly a estery mastných kyselin sorbitolu ajejich směsi.

Vedle inertních ředidel mohou orální prostředky také obsahovat adjuvanty jako jsou smáčedla. emulgační a suspenzační činidla, sladidla, aromáty, barviva, parfémy a konzervační činidla.

Suspenze mohou obsahovat vedle aktivních sloučenin suspenzační činidla, jako například ethoxylované isostearylalkoholy, polyoxyethylensorbitol a estery sorbitolu, mikrokrystalickou celulózu, metahydroxid hlinitý, bentonit, agar-agar a tragakant ajejich směsi.

Formulace farmaceutických prostředků podle vynálezu pro rektální nebo vaginální podání mohou být ve formě čípků, které se mohou připravit smícháním jedné nebo více sloučenin podle vynálezu s jedním nebo více nedráždivými excipienty nebo nosiči zahrnují například kakaové máslo, polyethylenglykol, vosk pro čípky nebo salicylát a které jsou pevné při teplotě místnosti ale kapalné při teplotě těla a proto budou tát v rektu nebo vaginální dutině a tak uvolňovat aktivní sloučeninu.

Formulace podle předkládaného vynálezu, které jsou vhodné pro vaginální podání také zahrnují pesary, tampony, krémy, gely, pasty, pěny nebo spreje, obsahující nosiče, které jsou známé ve stavu techniky.

Dávkové formy pro topické nebo transdermální podání sloučenin podle vynálezu zahrnují prášky, masti, spreje, pasty, krémy, omyvadla, gely, roztoky, náplasti a inhalační prostředky. Aktivní sloučenina může být smísena pri sterilních podmínkách s farmaceuticky přijatelným nosičem a s konzervačními činidly, pufry nebo hnacími činidly.

Masti, pasty, krémy a gely mohou obsahovat vedle aktivní sloučeniny podle vynálezu excipienty, jako jsou živočišné nebo rostlinné tuky, oleje, vosky, parafíny, škrob, tragakant, deriváty celulózy, polyethylenglykoly, silikony, bentonity, kyselinu křemičitou, talek a oxid zinečnatý ajejich směsi.

Prášky a spreje mohou obsahovat vedle sloučeniny podle vynálezu excipienty, jako je laktóza, talek, kyselina křemičitá, hydroxid hlinitý, křemiěitan vápenatý a polyamidový prášek nebo směsi těchto látek. Spreje mohou dále obsahovat obvyklá hnací činidla, jako jsou fluorchloruhlovodíky a těkavé nesubstituované uhlovodíky, jako je butan a propan.

Transdermální náplasti mají výhodu vtom, že poskytují regulované dodávání sloučeniny podle vynálezu do těla. Takové dávkové formy mohou být připraveny rozpuštěním nebo dispergováním sloučeniny ve vhodném médiu. Ke zvýšení průniku sloučeniny podle vynálezu přes kůži se

- 19CZ 302486 B6 mohou požít činidla zvyšující absorpci. Rychlost takového průniku může být regulována membránou kontrolující rychlost nebo dispergováním aktivní sloučeniny do polymerní matrice nebo gelu.

Oftalmické formulace, oční masti, prášky, roztoky a podobně jsou rovněž zahrnuty do rozsahu předkládaného vynálezu. Výhodně je farmaceutický prostředek v oftalmické formulaci (například periokulární, retrobulbární nebo intraokulární injekční formulace, systémová formulace nebo roztok k oplachování po chirurgickém zákroku).

Oftalmické formulace podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat jeden nebo více dcazapurinů a farmaceuticky přijatelné vehikulum. Mohou se použít různé typy farmaceutických vehikul. Vehikula jsou obvykle vodné povahy. Vodné roztoky jsou obecně výhodné, v závislosti na konkrétní formulaci a také na schopnosti pacienta snadno přijímat takové prostředky vkapáním jedné nebo dvou kapek roztoku do napadených očí. Nicméně, deazapuriny podle předkládaného vynálezu mohou být snadno začleněny do ostatních typů prostředků, jako jsou suspenze, viskózní nebo poloviskózní gely nebo jiné typy pevných nebo polopevných prostředků. Oftalmické prostředky podle předkládaného vynálezu mohou zahrnovat také jiné ostatní složky, jako jsou pufry, konzervační činidla, spolurozpouštědla a činidla zvyšující viskozitu.

Vhodný pufr (například fosforečnan sodný, octan sodný nebo boritan sodný) se přidává za účelem zabránění změny v pH během skladovacích podmínek.

Oftalmické produkty jsou obvykle baleny v multidávkové formě. Úkolem konzervačních činidel je bránit jejich mikrobiální kontaminaci během použití. Vhodná konzervační činidla zahrnují: benzalkoniumchlorid, thimerosal, chlorbutanol, methylparaben, propyIparaben, fenylethylalkohol, dvojsodnou sůl kyseliny ethylendiamintetraoctové, kyselinu sorbovou, polyquaternium1 nebo další činidla, která jsou odborníkům známá. Taková konzervační činidla jsou typicky použita v množství 0,001 až 1,0 % hmotn./objem.

Jestliže se deazapuriny podle vynálezu podávají během intraokulární chirurgické operace retrobulbámí nebo periokulární injekcí a intraokulární perfuzí nebo injekcí je nejvýhodnější použít jako vehikulum pufrovaných solných oplachovacích roztoků. Příklady takových fyziologicky rovnovážných intraokulámích oplachovacích roztoků je BSS® Sterile Irrigating Solution a BSS Plus® Sterile Intraocular Irrigating Solution (Alcon Laboratories, lne. Fort Worth, Tex. USA). Posledně uváděný typ roztoku je popsán v patentu US 4 550 022 (Garabedian a kol.), uváděný zde jako odkaz, etrobulbámí a periokulární injekce jsou odborníkům známé a jsou popsány v řadě publikací, zahrnující například Ophthalmic Surgery: Principles of Practice, vydavatel G. L. Spaeth, W. B. Sanders Co., Filadelfie, Pa, USA, str. 85 až 87 (1990).

Jak bylo uvedeno shora, použití deazapurinu k zabránění nebo snížení poškození sítnicových a očních nervových tkání na buněčné úrovni je zvlášť důležitým aspektem předkládaného vynálezu. Oftalmické stavy, které mohou být léčeny zahrnují, nikoliv však s omezením, retin opati i, makulámí degeneraci, oku lamí ischémii, glaukom a poškození spojené s poraněním oftalmických tkání, jako je ischemícké reperfuzní poranění, fotochemické poranění a poranění spojené s oční operací, zejména poranění sítnice nebo očního nervu vystavením světlu nebo chirurgickým nástrojům. Sloučeniny mohou být také použity jako pomocný prostředek při oční chirurgii, například injekcemi do sklivce nebo spojivky po oční operaci. Sloučeniny se mohou použít pro akutní léčbu nebo dočasných stavů nebo se mohou podávat chronicky, zejména v případě degenerativní nemoci. Sloučeniny také mohou být použity profylakticky, zejména před oční operací nebo neinvazivními očními procedurami nebo jinými typy operací.

Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu vhodné pro parenterální podání zahrnují jednu nebo více sloučenin podle vynálezu v kombinaci s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými sterilními vodnými nebo nevodnými roztoky, disperzemi, suspenzemi nebo emulzemi, sterilními prášky, které mohou být těsně před použitím převedeny do sterilních injektovatel-20CZ 302486 Bó ných roztoků nebo disperzí a které mohou obsahovat antioxidantv. pufry, bakteriostatika, další rozpuštěné látky, které umožní isotonickou formulaci s krví příjemce nebo suspenzační nebo zahušťovac 'činidla.

Příklady vhodných vodných a nevodných nosičů, které se mohou použit v prostředcích podle předkládaného vynálezu zahrnují vodu, ethanol, poíyoíy, (jako glycerol, propylengiykoi. poíyethylenglykol a podobně) ajejich vhodné směsi, rostlinné oleje, jako je olivový olej a injektovatelné organické estery, jako je ethyloleát. Řádná fluidita se může udržovat například použitím povlakových materiálů, jako je lecitin, udržováním požadované velikosti částic v případě disperzí io a použitím povrchově aktivních látek.

Tyto prostředky také mohou obsahovat pomocné látky, jako jsou konzervační činidla, smáčedla, emulgační činidla a dispergační činidla. Ochrany před působením mikroorganismů se dosáhne přidáním různých anti bakteriálních a antifungálních činidel, jako je například paraben, chlor15 butanol, kyselina fenylsorbová a podobně, Do prostředků se také mohou přidat isotonická činidla, jako jsou cukry, chlorid sodný a podobně. Dále, prodloužené absorpce injektovatelné formy se může dosáhnout zahrnutím činidel, která zpožďují absorpci, jako je monostearát hlinitý a želatina.

V některých případech, za účelem dosažení prodlouženého účinku léčiva je žádoucí zpomalit absorpci léčiva ze subkutánní nebo intramuskulární injekce. Toho se může dosáhnout použitím kapalné suspenze nebo krystalického amorfního materiálu majícího špatnou rozpustnost ve vodě. Rychlost absorpce léčiva potom závisí na jeho rychlosti rozpouštění, které opět může záviset na velikosti krystalu a krystalické formě. Alternativně, zpožděné absorpce parenterálně podávané léčivé formy se dosáhne rozpuštěním nebo suspendováním léčiva v olejovém vehikulu.

Injektovatelné depotní formy se připraví formováním mikrozapouzdřených matric sloučenin podle vynálezu do biodegradovatelného polymeru, jako je polylaktid-polyglykolid. Rychlost uvolňování léčiva je závislá na poměru léčiva k polymeru a na povaze konkrétního polymeru.

který se použije. Příklady dalších biodegradovatelných polymerů zahrnují poly(ortoestery) a poly(anhydridy). Depotní injektovatelné formulace se také připraví zadržením léčiva v liposomech nebo mikroemulžích, které jsou kompatibilní s tělesnou tkání.

Prostředky podle předkládaného vynálezu se mohou podávat orálně, topicky nebo rektálně.

Ovšem jsou podávány formami vhodnými pro každou cestu podání. Například mohou být podávány v tabletách nebo kapslích, injekcí, inhalací, očními omyvadly, mastí, čípky atd. Podání může být také injekcí, infúzí, nebo inhalací; topicky se mohou podávat omyvadly nebo mastí; a rektální čípky. Orální podání je výhodné.

Fráze „parenterální podání“ a „podáno parenterálně“ jak se zde používá, znamená způsob podání, který je jiný než enterální a topické podání, obvykle injekcí a zahrnuje, nikoliv však s omezením, intravenózní, intramuskulární, intraarteriální, intrahekální, intrakapsulámí, intraorbitální, intrakardiální, intradermální, intraperitoneální, transtracheální, subkutánní, subkutikulámí, intraartikulámí, subkapsulámí, subarachnoidní, intraspinální a intrastemální injekce a infuze.

Fráze „systémové podání“ nebo „podání systémově“, „periferní podání“ a „podání periferně“ jak se zde používá zahrnují podání sloučeniny, léčiva nebo jiného materiálu přímo do centrálního nervového systému, takže vstupuje do pacientova systému a působí na metabolismus a podobné procesy, například subkutánní podání.

Tyto sloučeniny se mohou podávat lidem a ostatním pacientům pro terapii jakoukoliv vhodnou cestou podání, zahrnující orální, nazální, například sprejem, rektálně, íntravaginálně, parenterálně, intracistemálně a topicky, prášky, mastmi nebo kapkami, včetně bukálně a sublinguálně.

-21 CZ 302486 B6

Bez ohledu na vybranou cestu podání, sloučeniny podle vynálezu se mohou použít ve vhodné hydratované formě a/nebo farmaceutické prostředky podle vynálezu jsou formulovány do farmaceuticky přijatelných dávkových forem konvenčními metodami, kteréjsou odborníkům známé.

Aktuální dávkové úrovně aktivních složek ve farmaceutickém prostředku podle předkládaného vynálezu mohou být různé, mělo by být takové, aby se dosáhlo žádané terapeutické odezvy pro konkrétního pacienta, při vybraném způsobu podání, aniž by toxicky působilo na pacienta.

Vybraná dávková úroveň bude záviset na řadě různých faktorů, zahrnujících aktivitu konkrétní sloučeniny podle vynálezu která se použije nebo jejího esteru, soli nebo amidu, cestě podání, době podání, rychlost vylučování konkrétní použité sloučeniny, trvání léčby, ostatních sloučeninách a/nebo materiálech použitých v kombinaci s konkrétní použitou sloučeninou, věku, hmotnosti, stavu, obecném zdraví a stavu pacienta, který má být léčen a podobných faktorech známých v medicíně.

Lékař a veterinář mající obvykle zkušenosti může snadno určit a předepsat účinné množství požadovaného farmaceutického prostředku. Například lékař nebo veterinář mohou začít dávkovat sloučeniny podle vynálezu ve farmaceutickém prostředku v úrovních, které jsou nižší než je požadováno k dosažení žádaného terapeutického účinku a postupně zvyšovat dávky, dokud se nedosáhne požadovaného účinku.

Obecně, vhodná denní dávka sloučeniny podle vynálezu bude takové množství sloučeniny podle vynálezu, která je alespoň taková, která zabezpečí terapeutický účinek. Taková účinná dávka bude obecně závislá na faktorech popsaných shora. Obecně, intravenózní a subkutánní dávky sloučenin podle vynálezu pro pacienta, pokud se použijí pro indikované analgetické účinky, budou v rozsahu od okolo 0,0001 do okolo 200 mg/kg tělesné hmotnosti, výhodněji od okolo 0,01 do okolo 150 mg/kg denně a ještě výhodněji od okolo 0,2 do okolo 140 mg/kg denně.

Pokud je to žádoucí, účinná denní dávka aktivní sloučeniny může být podána jako dvě, tři, čtyři, pět, šest nebo více dílčích dávek, podávaných separátně ve vhodných intervalech během dne, případně v dávkových formách.

I když je možné podávat sloučeniny podle vynálezu samotné, je výhodné podávat sloučeninu jako farmaceutický prostředek.

Předkládaný vynález se také týká balení farmaceutických prostředků pro léčbu stavů citlivých na N-6-substituovaný 7 deazapurin, například při nežádoucím zvýšení aktivity adenosínového receptoru u savců. Balené farmaceutické prostředky zahrnují zásobník, obsahující terapeuticky účinné množství alespoň jednoho deazapurínu, jak je popsáno shora a návod pro použití deazapurinu pro léčbu stavů citlivých na deazapurin u savců.

Deazapuriny podle vynálezu se připraví za použití standardních metod organických syntéz. Deazapurin může být čištěn HPLC s reverzní fází, chromatografií, rekry stal izaci atd. a jejich struktury mohou být potvrzeny hmotnostní spektrální analýzou, elementární analýzou, IR a/nebo NMR spektroskopií.

Typicky se syntéza meziproduktů a rovněž deazapurinů podle vynálezu provádí v roztoku. Zavedení a odstranění jedné nebo více chránících skupin jsou typickou praxí a je známé odborníkům. Typické syntetické schéma pro přípravu deazapurinových meziproduktů podle vynálezu je uvedeno ve schématu I.

Vynález je dále ilustrován následujícími příklady, které v žádném případě neomezují rozsah vynálezu. Obsah všech odkazů, patentových přihlášek nacházejících se v řízení a publikovaných patentových přihlášek citovaných v přihlášce, včetně těch, které jsou uvedeny ve stavu techniky

-22 CZ 302486 Bó je zde uváděn jako odkaz. Je třeba vzít v úvahu, že modely použité v příkladech jsou akceptované modely a že projev účinnosti těchto modelech je předpokládaná účinnost u lidí.

Deazapuriny podle vynálezu se připraví za použití standardních metod organických syntéz, ? Deazapuriny mohou být čištěny HPLC s reverzní fází, chromatografií, rekrystalizací atd. ajejich struktury jsou potvrzeny hmotnostní spektrální analýzou, elementární analýzou, IR a/nebo NMR spektroskopií.

Typicky, syntézy meziproduktů a rovněž deazapurinů podle vynálezu se provádí v roztoku, io Zavedení a odstranění jedné nebo více chránících skupin je typickou praxí a je odborníkovi známé. Typické syntetické schéma pro přípravu deazapur i nových meziproduktů podle vynálezu jsou uvedeny dále ve schématu L

Schéma l

kde R₃, R5 a Rů mají význam definovaný shora.

Obecně, chráněný 2-amino--3 kyanopyrrol může reagovat s acylhalogenidem za vzniku 20 3-kyanopyrrolu, který reaguje dále s kyselým methanolem za uzavření kruhu na pyrrolo[2,3í/]pyrimidin-4(3H)on (Muller, C. E.a kol., J. Med. Chem. 40:4396 (1997)). Odstranění pyrrolové chránící skupiny bylo následováno zpracováním s chloračním činidlem, například oxychloridem fosforečným za vzniku 4-chlor-7//-pyrrolo[2,3d|pyrimidinu. Zpracováním chlorpyrimidinu s aminy se získají 7—deazapuriny.

-23 CZ 302486 B6

Například, jak je ukázáno ve schématu I, N-{ lí//-fěny]ethyl)-2-amino-3-kyanopyrrol se zpracuje s aeylhalogenidem v pyridinu a dichlormethanu. Vzniklý N-{ l-J/-feny let hyl)-2-fenylkarboxamido-3-kyanopyrrol se zpracuje směsí 10:1 methanol/kyselina sírová za uzavření kruhu a vzniku dl-TU-1-( I-feny lethy l)pyrrolo[2,3t/]pyrimidin-4(3H)-onu. Odstraněním fenylethylové skupiny zpracováním pyrimidinu s polyfosforečnou kyselinu (PPA) následované POC1₃ se získal klíčový meziprodukt, 4-chlor-7// pvrrolo[2,3J|pyrimidin. Dále, působením různými aminy na 4-chlor-7//-pyrrolo[3,3í/] pyrimidin se získají sloučeniny obecného vzorce laik

Tabulka 1

R	M+ + H	R	M+ + H
kn	343,2	O HN/ í N^H	351,27
rO	343,18		430,35
H	337,21	OH —NH [II 4^	359,44
%	364,19	V N^NOl	404,32

-24CZ 302486 Bó

		330,18	7n’ Ί H	CJ	330,45
ΓΤ- N^/		347,22	H 1 V N-	rx	339,47
			HO'
o-	^NH	350,28	HN^.______	0	353,41
cc		344,19	HN__- aJaw	o -„-v I	324,45
			1 H
x-Oa'7	394,16		,Ό	359,38
α	X—OH \h-|	371,12		<x	379,40
OH	359,39	CT	387,41
H XN *		403,33	CT		344,48
fl l	H		ST
UJ
	~nh-}	351,49	TNiS	T	337,53
*'ff	OH |		HO......

-25 CZ 302486 B6

	330,37	An-V H |	295,2
H	407,23		321,2
OH	355,45	U,	337,53
^OjO	441,33	H	350,2
-a(>	413,24		343,2
H	372,48	zXo H	373,2
		X-0	307,2

Obecný postup přípravy 6-substituováných pyrrolů je znázorněn v následujícím schématu (schéma II).

-26CZ 302486 Bd

Schéma II

^R5

NH

Jí HCI

OH

R< N

kde Ri až R₅ mají význam uvedený shora.

Transesterifíkací a alkylací ethylkyanoacetátu s α-haloketonem se získá ketomethylester. Ochrannou ketonu, následovanou zpracováním s hydrochloridem amidinu (například alkyl, aryl nebo arylalkyl) se získá pyridin chráněný ketalem. Odstranění chránící skupiny a následující cyklizace a zpracování s oxychloridem fosforečným vede k chloridovému meziproduktu, který se může dále zpracovat s aminem za získání pyrrolu substituovaného v poloze 6 aminem. Alkylace pyrrolového dusíku se může provést za podmínek známých ve stavu techniky.

Obecný postup přípravy 5-substituovaných pyrrolů je znázorněn v následujícím schématu (schéma 3).

-27CZ 302486 B6

Schéma III

kde R.| až Ró mají význam uvedený shora a R je odstranitelná skupina.

Kondenzaci malonnitrilu a přebytku ketonu následuje bromace produktu, která vede ke směsi výchozího materiálu, monobromovaných a dibromovaných produktů, na které se působí alkylaminem, arylaminem nebo alkylarylaminem. Vzniklý aminový produkt se acyluje s acylehloridem a monoacylovaný pyrrol se cyklizuje v přítomnosti kyseliny za získání odpovídajícího pyrimidinu. Pyrrolová chránící skupina se odstraní kyselinou póly fosforečnou a zpracováním s oxychloridem fosforečným se získá chlorovaný produkt. Chlorovaný pyrrol se následně zpracuje s aminem za vzniku 5-substituovaného pyrrolu. Alkylace pyrrolu dusíkem se může provést za známých podmínek.

Schémata IV a V znázorňují způsoby přípravy deazapurinů 1 a 2 podle vynálezu.

kde R₅ a R₆ mají význam uvedený shora, například CH₃.

-28CZ 302486 Bó

Specifická příprava ó-methylpyrrolpyrimidinů

Klíčová reakce vedoucí k 6-methylpyrrolopyrimidinů (1) [R₅ = CH4 spočívá v cyklizaci kyanoacetatu s benzamidinem za vzniku pyrimidinu. Má se za to, že methylkyanoacetát bude cyklizovat mnohem efektivněji s benzamidinem na pyrimidin než odpovídající ethylester, Transesterifi kace a alkylace ethylkyanoacetátu v přítomnosti NaOMe a přebytku a-halogenacetylové části, například chloracetonu poskytuje žádaný methylester (3) v 79% výtěžku (schéma IV). Ketoester (3) se chrání jako acetal (4) v 81% výtěžku. Nová cyklizační metoda na pyrimidin (5) spočívá v použití hydrochloridu amidinu, například hydrochloridu benzamidinu se 2 ekvivalenty DBU za získání (5) v 54% výtěžku. Tento způsob zvyšuje výtěžek z 20 % získaný za publikovaných podmínek, které využívají během cyklizace s guanidinem NaOMe. Cyklizace pyrrolopyrimidinu (6) se provede odstraněním acetalové skupiny ve vodné HCI v 78% výtěžku. Reakce (6) s oxychloridem fosforečným při zpětném toku poskytuje odpovídající 4-chlorderivát (7). Kopulací (7) s trans-4-aminocyklohexanolem v dimethylsulfoxidu při 135 °C se získá (1) v 57% výtěžku. Odborník pozná, že výběr reakčních složek umožňuje značnou flexibilitu ve výběru žádaného substituentu R₅.

Schéma IV

Specifická příprava 5-methylpyrrolopyrimidinů

Knovengelova kondenzace malonn itrilu a přebytku ketonu, například acetonu v benzenu při zpětném toku poskytuje po destilaci (8) v 50% výtěžku. Bromace (8) s N-bromsukcinimidem v přítomnosti benzoylperoxidu v chloroformu poskytuje po destilaci směs výchozího materiálu, mono- (9) a dibromovaných produktů (5/90/5) (70 %). Směs reaguje s a-methylalkylaminem nebo α-methylary lam inem, například α-methy lbenzy lam inem za vzniku aminopyrrolu (10). Produkt se převede přes krátkou kolonu silikagelu a částečně vyčištěný amin (31 % výtěžek) se acyluje s chloridem kyseliny, například benzoylchloridem za získání mono- (11) a diacylovaných (12) pyrrolů, které se oddělí mřížkovou chromatografií. Kyselou hydrolýzou disubstituovaného

-29CZ 302486 B6 pyrrolu (12) poskytuje 29% výtěžek acylpyrrolu (11). Cyklizací v přítomnosti koncentrované kyseliny sírové a DMF se získá (13) (23% výtěžek), a odstraněním chránící skupiny za použití póly fosforečné kyseliny se získá (14). Reakcí (14) s oxyehloridem fosforečným při zpětném toku se získá odpovídající 4-chíorderivát (15). Kopulací s /ram-4-aminocyklohexanolem v dimethylsulfoxidu při 135 °C se získá (2) [R₆ = CHi] v 30% výtěžku (viz. schéma V). Odborník pozná, že výběr reakčních složek umožňuje značnou flexibilitu ve výběru žádaného substituentu R^.

Schéma V

Alternativní syntetická cesta k přípravě R_ň-substituovaných pyrrolů, například 5-methylpyrrolopyrimidinů.

Tato alternativní cesta k R₃-substituováným pyrrolům, například 5-methylpyrrolopyridinům 15 zahrnuje transesterifikaci a alkylací ethylkyanoacetátu na (16) (schéma VI). Kondenzací (16)

-30CZ 302486 B6 s hydrochloridem benzamidinu s 2 ekvivalenty DBU poskytuje pyrimidin (17). Cyklizace na pyrrol pyrimidin (14) se provede odstraněním acetalové skupiny ve vodné HCI. Reakce (14) s oxychloridem fosforečným při zpětném toku poskytuje odpovídající 4-chlorderivát (15). Kopulace s//wis-4-aminocyklohexanolern v dimethylsulfoxidu pri 135 °C poskytuje (2). Tento postup snižuje počet syntetických reakcí pro přípravu cílové sloučeniny (2) z 9 stupňů na 4 stupně. Navíc, výtěžek se výrazně zvýší. Opět, odborník pozná, že výběr reakčních složek umožňuje značnou flexibilitu ve výběru žádaného substituentu R6.

io Schéma VI

je znázorněn v následujícím schématu (schéma VII) 15

-31 CZ 302486 B6

kde R| až R, mají význam uvedený shora.

Alkylací alkylkyanoacetátu s diethylacetalem v přítomnosti báze se získá kyanodiethyiacetal, na který se působí amídinovou solí za vzniku methylpyrrolpyrimidinového prekurzoru. Prekurzor se chloruje a působí se na něj aminem a získá cílový í/ďA-methylpyrrolpyrimidin, jak je uvedeno shora.

Například, schéma VII znázorňuje syntézu sloučeniny 18.

-32 CZ 302486 B6

Schéma VIII

Komerčně dostupný methylkyanoacetát se alkyluje s diethy lacetalem brom acetaldehydu v přítomnosti uhličitanu draselného a Naí a získá se (19), Cyklizace na pyridiny (20) se provede ve dvou stupních. Nejprve se připraví pyrimidinacetal reakcí (19) s hydrochloridem benzamidinu se dvěma ekvivalenty DBU. Za vzniklého pyrimidinacetalu se odstraní chránící skupina bez čištění pomocí vodné 1 N HCI a vzniklý aldehyd cyklizuje na pyrrol pyrimidin (20), který se izoluje filtrací. Reakcí (20) s oxychloridem fosforečným se získá odpovídající 4-chlorderivát (21). Kopulací chlorderivátu s /ríz/w-4-aminocyklohexanolem v DMSO při 135 °C poskytuje sloučeio ninu (18) ze sloučeniny (21).

Schémata II až Vlil znázorňují, že je možné funkcionalizovat 5- a 6-polohu pyrrolopyrimidinového kruhu. Použitím různých výchozích reakčních složek a mírnou modifikací shora uvedených schémat se mohou zavést do polohy 5- a 6- obecného vzorce I a II různé funkční skupiny.

Tabulka 2 znázorňuje některé příklady

-33CZ 302486 B6

Tabulka 2. Vybrané 5- a 6-substituované pyrrol pyr i midiny

Výchozí složka	R5	Ró
cr	H	H
Cl-/ \=/\3	H	Substituovaný Ar
o o	H	CH2C(O)OCH3
0 o Cl	C(O)OCH3	CH3
o o AV c,	C(O)NHCH3	CH3

Vynález je dále ilustrován následujícími příklady, kteréjsou uvedeny pouze pro ilustraci a v žádném případě neomezují rozsah vynálezu. Obsah všech odkazu, patentových přihlášek nacházejí5 cích se v řízení a publikovaných patentových přihlášek citovaný v přihlášce, včetně těch, které jsou uvedeny ve stavu techniky je zde uváděn jako odkaz. Je třeba vzít v úvahu, že modely použité v příkladech je akceptované modely a že projev účinnosti těchto modelech je předpokládaná účinnost u lidí.

Příklady provedení vynálezu

Příprava 1

Použije se modifikace alkylační metody, kterou popsali Seela a Liipke¹. K ledem chlazenému roztoku (0 °C) ethylkyanoacetátu (6,58 g, 58,1 mmol) v MeOH (20 ml) se pomalu přidá roztok NaOMe (25% hmotn./obj.; 58,1 mmol). Po 10 minutách se pomalu přidá chloraceton (5 ml; 62,8 mmol). Po 4 hodinách se rozpouštědlo odstraní. Hnědý olej se zředí EtOAc (100 ml) a promyje s H₂O(100 ml). Organická frakce se suší, filtruje, a koncentruje na hnědý olej (7,79 g; 79%). Olej (3) (Schéma IV) je směsí methyle stero vých a ethylesterových produktů (9/1), a použije bez dalšího čištění.

'H NMR (200 MHz, CDCl,) δ 4,24 (q, J = 7,2 Hz, OCH₂), 3,91 (dd, IH, J = 7,2, 7,0 Hz, CH),

3,62 (s, 3H, OCH,), 3,42 (dd, IH, J = 15,0, 7,1 Hz, I x CH,); 3,02 (dd, IH, J = 15,0, 7,0 Hz), x CH₂); 2,44 (s, 3H, CH₃), 1,26 (t, J = 7,1 Hz, ester-CH₃).

'Seela, F.; Lupke, U. Chem. Ber. 1977, 110, 1462 až 1469.

-34CZ 302486 B6

Příprava 2

Použije se procedura, kterou popsali Seela a I.iipke¹. Keton (3) (Schéma IV; 5,0 g, 32,2 mmol) se chrání ethylenglykolem (4 ml, 64,4 mmol) za přítomnosti TsOH (100 mg) a získá se (4) jako olej (Schéma IV; 5,2 g, 81,1) po mžikové chromatografií (SiO₂; 3/7 EtOAc/Hex, Rf 0,35). Obsahuje ještě cca 5% ethyl esteru.

'H NMR (200 MHz, CDCh) 6 4,24 (q, J - 7,2 Hz, OCH₂), 3,99 (s, 4H, 2 x acetal-CH₂), 3,79 (s, 3H, OCH₃), 3,62 (dd, IH, J = 7,2, 7,0 Hz, CH), 2,48 (dd, IH, J = 15,0, 7,1 Hz, l x CH₂); 2,32 io (dd, IH, J= 15,0, 7,0 Hz, 1 x CH₂); 1,35 (s, 3H, CH₃), 1,26 (t, J = 7,1 Hz, ester-CH₃);

MS (ES): 200,1 (M⁺-H).

'Seela, F.; Lupke, U. Chem. Ber. 1977, 110, 1462 až 1469.

Příprava 3

Roztok acetalu (4) (Schéma IV, 1 g, 5,02 mmol), benzamidinu (786 mg, 5,02 mmol), a DBU (1,5 ml, 10,04 mmol) v suchém DMF (15 ml) se zahřívá při teplotě 85 °C po dobu 15 hodin. 20 Směs se zředí s CHCl₃ (30 ml) a promyje s 0,5 N NaOH (10 ml) a H₂O (20 ml). Organická frakce se suší, filtruje a koncentruje na hnědý olej. Provede se mžiková chromatografíe (SiO₂; 1/9

EtOAc/CH₂Cl₂, Rf 0,35), ale materiál krystalizuje na koloně. Silikagel se promyje s MeOH.

Frakce obsahující produkt (5) (Schéma IV) se koncentrují a použijí bez dalšího čištění (783 mg,

54,3%):

^lH NMR (200 MHz, CDC1₃) δ 8,24 (m, 2H, Ar-H), 7,45 (tn, 3H, Ar-H), 5,24 (brs, 2H, NH₂),

3,98 (s, 4H, 2 x acetal-CH₂), 3,60 - 3,15 (m, 2H, CH₂), 1,38 (s, 3H, CH₃); MS (ES): 288,1 (M⁺+l).

Příprava sloučeniny (20) (Schéma VIII): Roztok acetalu (19) (4,43 g, 20,6 mmol)¹, benzaminhydrochloridu (3,22 g, 20,6 mmol), a DBU (6,15 ml, 41,2 mmol) v suchém DMF (20 ml) se zahřívá při teplotě 80 °C po dobu 15 hodin. Směs se zředí s 100 ml CHCl₃ a promyje s H₂O (2 x 50 ml). Organická frakce se suší, filtruje, a koncentruje na tmavě hnědý olej. Tmavý hnědý olej se míchá v IN HCI (100 ml) po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Vzniklá kaše se filtruje a získá se sůl HCI (20) jako nahnědlá pevná látka (3,60 g, 70,6 %);

^lH NMR (200 MHz, DMSO-dó) 11,92 (s, IH), 8,05 (m, 2H, Ar-H), 7,45 (m, 3H, Ar-H), 7,05 (s, IH, pyrrol-H); MS (ES): 212,1 (M*+l).

Příprava 4

Roztok acetalu (5) (700 mg, 2,44 mmol) v 1 N HCI (40 ml) se míchá po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Výsledná kaše se filtruje a získá se sůl HCI 2-fenyÍ-6-methyl-7FZ-pyrrolo[2,3dj45 pyrimidin-4 (3H)—onu jako nahnědlá pevná látka (498 mg, 78 %):

'H NMR (200 MHz, DMSOd₆) δ 11,78 (d, IH), 8,05 (m, 2H, Ar-H), 7,48 (m, 3H, Ar-H), 6,17 (s, IH, pyrrol-H), 2,25 (s, 3H, CH₃); MS (ES): 226,1 (M⁺+l).

Příprava 5

Použije se modifikace cyklizační metody, kterou popsal Chen a kol¹. K ledem chlazenému roztoku (0 °C) bromidu (9), (Schéma V; 20,0 g, 108 mmol; 90% čistota) v isopropylalkoholu (60 ml) se pomalu přidá roztok a-methylbenzylaminu (12,5 ml, 97,3 mmol). Černý roztok se

-35CZ 302486 B6 nechá ohřát při teplotě místnosti a míchá se po dobu 15 hodin. Směs se zředí s EtOAc (200 ml) a promyje s 0,5 N NaOH (50 ml). Organická frakce se suší, filtruje a koncentruje na černý dehet (19,2 g, 94 %). Zbytek se po částech čistí mžikovou ehromatografií (SiO₂; 4/96 MeOH/CH₂CI₂, Rf,35)na tmavou pevnou látku (6,38 g, 31 %)jako sloučenina dl-1-( I-fenylethyl)-2-amino-35 kyan—4-melhy Ipyrrol:

MS(ES): 226,1 (M' + |), 'Chen, Y. L.; Mansbach, R. S.; Winter, S. M; Brooks, E; Collins, J; Corman, M, L; Dunaiskis, io A, R; Faraci, W, S; Gallaschun, R, J; Schmidt, A; Schulz D, W. J. Med. Chem. 1997, 40, 1749 až

1754.

Příprava 6

K roztoku d 1-1-(1-feny lethyl)~2-aminO3-kyano-4,5-dimethy ipyrrolu¹ (14,9 g, 62,5 mmol) a pyridinu (10,0 ml) v dichlormethanu (50,0 ml) se přidá benzoylchlorid (9,37 g, 66,7 mmol) při teplotě 0 °C. Směs se míchá při teplotě 0 °C po dobu 1 hodiny, přidá se hexan (10,0 ml) k usnadněnému vysrážení produktu. Rozpouštědlo se odstraní ve vakuu a pevná látka se rekrystalizuje z EtOH/H₂O a získá se 13,9 g (65 %) dl-l-(I-fenylethyl)-2-fenylkarboxylamÍno-3-kyano—4,5dimethylpyrrolu. t.t. 218 až 221 °C;

'H NMR (200 MHz, CDCh) δ 1,72 (s, 3H), 1,76 (d, J= 7,3 Hz, 3H), 1,98 (s, 3H), 5,52 (q, J - 7,3 Hz, 1H), 7,14 - 7,54 (m, 9H), 7,68 - 7,72 (dd, J = 1,4 Hz, 6,9 Hz, 2H), 10,73 (s, 1H);

MS (ES); 344,4 (M +l).

¹ Liebigs Ann. Chem. 1986, 1485 až 1505.

Následující sloučeniny se získají podobným postupem.

dl-l-(l-fenylethyl)-2-(3-pyridyl)karbonylamino-3-kyano-4,5-dÍmethylpyrrol.

'HNMR (200 MHz, CDCI,) δ 1,83 (d, J= 6,8 Hz, 3H), 2,02 (s. 3H), 2,12 (s, 3H), 5,50 (q, J = 6,8 Hz, 1H), 7,14 - 7,42 (m, 5H), 8,08 (m, 2H), 8,75 (m, 3H); MS (ES): 345,2 (\C+1).

d 1-1-(1-feny lethyl)-2-(2-furyl)karbonylamino-3-kyano-4,5-dimethylpyrrol.

'HNMR (200 MHz, CDCh) δ 1,84 (d, J= 7,4 Hz, 3H), 1,92 (s, 3H), 2,09 (s, 3H), 5,49 (q, J = 7,4 Hz, IH), 6,54 (dd, J- 1,8 Hz, 3,6 Hz, IH), 7,12- 7,47 (m, 7H); MS (ES): 334,2 (ΜΠ1), 230,1.

d I — I —(1 -feny Ϊ ethy I )-2-(3-fury 1 )karbony I am i no-3-kyan-4,5-d i methy 1 pyrro 1.

'HNMR (200 MHz, CDCh) δ 1,80 (d, J = 7 Hz, 3H), 1,89 (s, 3H), 2,05 (s, 3H), 5,49 (q, J = 7 Hz, IH), 6,59 (s, IH), 7,12 - 7,40 (m, 6H), 7,93 (s, IH); MS (ES): 334,1 (M⁺+l), 230,0.

dl- l-(l-fenylethyl)~2-cyklopentylkarbony lamino-3-kvan^4,5-dimethy Ipyrrol.

*H NMR (200 MHz, CDCh) δ 1,82 (d, J - 7,4 Hz, 3H), 1,88 (s, 3H), 2,05 (s, 3H), 1,63 - 1,85 (m, 8H), 2,63 (m, IH), 5,43 (q, J “ 7,4 Hz, IH), 6,52 (s, IH), 7,05 - 7,20 (m, 5H); MS (ES): 336,3 (MG-l).

d I-1 -(1 -fe ny 1 ethy 1 )-2-(2-th ieny I) karbony I am ino 3 kvan 4,5 -d i methy 1 pyrro 1.

'HNMR (200 MHz, CDCI,) δ 1,82 (d, J= 6,8 Hz, 3H), 1,96 (s, 3H), 2,09 (s, 3H), 5,49 (q, J = 6,8 Hz, IH), 7,05 - 7,55 (m, 8H); MS (ES): 350,1 (M*+l), 246,0.

dl—1—(I-fenylethyl)2(3--thienvl)karbonylamino-3-ky an-4,5-dimethy Ipyrrol.

-36CZ 302486 B6 'HNMR (200 MHz, CDC1,) δ 1,83 (d, J= 7,0 Hz, 3H), 1,99 (s, 3H), 2,12 (s, 3H), 5,49 (q, J = 7,0 Hz, IH), 6,90 (m, iH), 7,18 - 7,36 (m, 6H), 7,79 (m, IH); MS (ES): 350,2 (M⁺+1), 246,1.

s dl— I -(l-fenyíethyl)-2-(4-tluorťuryl)karbonyÍamino-3-kyan-4,5-dimethyÍpyrroi.

'HNMR (200 MHz, CDC1₃) δ 1,83 (d, J= 7,4 Hz, 3H), 1.96 (s, 3H), 2,08 (s, 3H), 5,51 (q, J - 7,4 Hz, IH), 7,16-7,55 (m, 9H); MS (ES): 362,2 (M⁺+l), 258,1.

dl-1 -(1 -fenylethyl)-2-(3-fluorfeny l)karbony lamino-3-kyan^4,5-dimethy lpyrrol.

II) 'HNMR (200 MHz, CDCIj) δ 1,83 (d, J= 7,4 Hz, 3H), 1,97 (s, 3H), 2,10 (s, 3H), 5.50 (q, J = 7,4 Hz, IH), 7,05 - 7,38 (m, 7H), 7,76 - 7,74 (m, 2H); MS (ES): 362,2 (M’+l), 258,1.

dl-1-(1-feny lethy 1)-2-( 2-fluorfenyl)karbonylamino-3-kyan^l,5-dimethylpyrrol.

‘HNMR (200 MHz, CDC1₃) δ 1,83 (d, J = 7,4 Hz, 3H), 1,97 (s, 3H), 2,10 (s, 3H), 5,50 (q, J = 7,4 Hz, IH), 7,05-7,38 (m, 7H), 7,67-7,74 (m, 2H); MS (ES): 362,2 (M⁺+l), 258,1.

dl-l-(l-fenylethyl)-2-(2-fluorfenyl)karbonylamino-3-kyan-4,5-dimethylpyrrol.

'HNMR (200 MHz, CDC1₃) δ 1,85 (d, J= 7,2 Hz, 3H), 1,94 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 5,50 (q, J - 7,2 Hz, IH), 7,12 - 7,35 (m, 6H). 7,53 (m, IH), 7,77 (m, IH), 8,13 (m, IH); MS (ES):

362,2 (M⁺+1),258,0.

dl-1 -(l-fenylethyl)-2-isopropylkarbonylamÍno-3-kyan^,5-dimethylpyrrol.

‘HNMR (200 MHz, CDC1₃) δ 1,19 (d, J = 7,0 Hz, 6H), 1,82 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 1,88 (s, 3H), 2,06 (s, 3H), 2,46 (m, IH), 5,39 (m, J = 7,2 Hz, IH), 6,64 (s, 1H), 7,11 - 7,36 (m, 5H); MS (ES):

310,2 (M⁺+1),206,1.

V případě alky láce dl-1-0 -feny lethyl)-2-amino-3-kyan^l,5~dimethy lpyrrol u se získá monoacylovaný dl-1 -(1 -feny lethyl)-2-benzoy lamí no-3-kyan--4-dimethy lpyrrol a diacylovaný d 1-1-(1-feny lethyl)-2-dibenzoylamino-3-kyan-4-methy lpyrrol.

Monoacylovaný pyrrol: ‘HNMR (200 MHz, CDC1₃) δ 7,69 (d, 2H, J= 7,8 Hz, Ar-H), 7,58-7,12 (m, 8H, Ar-H), 6,18 (s, IH, pyrrol-H), 5,52 (q, IH, J= 7,2 Hz, CH-<H₃), 2,05 (s, 3H, pyrrol-CH₃), 1,85 (d, 3H, J = 7,2 Hz, CH-CH₃); MS (ES): 330,2 (M⁺+l); Diacylovaný pyrrol: 'HNMR (200 MHz, CDC1₃) δ 7,85 (d, 2H, J = 7,7 Hz, Ar-H), 7,74 (d, 2H, J = 7,8 Hz,

Ar-H), 7,52 - 7,20 (m, 9H, Ar-H), 7,04 (m, 2H, Ar-H), 6,21 (s, IH, pyrrol-H), 5,52 (q, IH, J- 7,2 Hz, CH^CH·,), 1,77 (d, 3H, J = 7,2 Hz, CH-CH₃), 1,74 (s, 3H, pyrrol-CH₃); MS (ES): 434,1 (M⁺+l).

Příprava 7

K roztoku dl-1 -(l-fenylethyl)-2-fenylkarboxylamido-3-kyan-4,5-<iimethylpyrrolu (1,0 g, 2,92 mmol) v methanolu (10,0 ml) se přidá koncentrovaná kyselina sírová (1,0 ml) při teplotě 0 °C. Vzniklá směs se zahřívá při zpětném toku po dobu 15 hodin a ochladí na teplotu místností.

Sraženina se filtruje a získá se 0,48 g (48 %) dl-5.6-dimethy 1-2-feny l-7//-7Ál-feny lethyl)pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4(3H)-onu.

'HNMR (200 MHz, CDC1₃) δ 2,02 (d, J= 7,4 Hz, 3H), 2,04 (s, 3H), 2,41 (s, 3H), 6,25 (q,J = 7,4Hz, IH), 7,22- 7,50 (m, 9H), 8,07-8,12 (dd, J= 3,4 Hz, 2H), 10,51 (s, IH);

MS (ES): 344,2 (M^TN).

Následující sloučeniny se získají podobným způsobem jako sloučeniny v Přípravě 7: dl-5,6-dimethy l—2—(3—pyridy 1)-7//-7-(1 -feny lethyl)pyrrolo[2,3d]pyrimidín^J(3H)-on.

-37CZ 302486 B6 'HNMR (200 MHz, CDCb) δ 2,03 (d, J= 7,2 Hz, 3H), 2,08 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 6,24 (q, J = 7,2 Hz, IH), 7,09 - 7,42 (m, 5H), 8,48 (m, 2H), 8,70 (m,3H); MS (ES): 345,1 (M⁺+l).

d]-5.6-dimethyl-2-(2-fury!)- 7//7(l-fenylethyl)pyrrolo[2,3dlpyrirnidin-4(3H)-on.

'HNMR (200 MHz, CDCb) δ 1,98 (d, J “ 7,8 Hz, 3H), 1,99 (s, 3H), 2,37 (s, 3H), 6,12 (q, J = 7,8 Hz, 1 H), 6,48 (dd, J = 1,8 Hz, 3,6 Hz, 1H), 7,17 - 7,55 (m, 7H), 9,6 (s, 1H); MS (ES):

334.2 (M^+l).

dl-5,6-dimethyl-2-(3-furyl)-7//--7-( l-fenylethyl)pyrrolo[2,3d]pyrimidin^(3H)-on. io 'HNMR (200 MHz, CDCb) δ 1,99 (d, J = 7,Hz, 3H), 2,02 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 6,24 (q, J - 7 Hz. IH), 7,09 (s, IH), 7,18-7,32 (m, 5H), 7,48 (s, 1 H), 8,51 (s, IH); MS (ES): 334,2 (M”+l).

dl-5,6-dimethyl-2-cyklopenty 1-7//-7-( l-fenylethyl)pyiTolo[2,3d]pyrimÍdin-4(3H)-on.

’H NMR (200 MHz, CDCb) δ 1,95 (d, J = 7,4 Hz, 3H), 2,00 (s, 3H), 2,33 (s, 3H), 1,68 - 1,88 (m, 8H), 2,97 (m, IH), 6,10 (q, J ~ 7,4 Hz, IH), 7,16- 7,30 (m, 5H), 9,29 (s, IH); MS (ES):

336.3 (M*+1).

dl—5,6—dÍ methyl-2-(2-thieny 1)-7//-7-(1 -feny lethyl)pyrrolo[2,3d]pyr i midin-4(3H)-on.

'HNMR (200 MHz, CDCb) δ 2,02 (d, J= 7,2 Hz, 3H), 2,06 (s, 3H), 2,451 (s, 3H), 6,13 (q, J - 7,2 Hz, IH), 7,12 (dd, J = 4,8, 2,8 Hz, IH), 7,26-7,32 (m, 5H), 7,44 (d, J - 4,8 Hz, IH), 8,01 (d,J-2,8 Hz, IH), 11,25 (s, IH); MS (ES): 350,2 (M⁺+1).

dl-5,6-dimethyl-2-(3-thienyl)-7//-7-(l-fenylethyl)pyrrolo[2,3d]pyrimidm—4(3H}-on.

'HNMR (200 MHz, CDCb) δ 2,00 (d, J= 7,4 Hz, 3H), 2,05 (s, 3H), 2,43 (s, 3H), 6,24 (q, J - 7,4 Hz, IH), 7,24 - 7,33 (m, 5H), 7,33 - 7,39 (m, IH), 7,85 (m, IH), 8,47 (m, IH), 12,01 (s, IH); MS (ES): 350,2 (M’+l).

dl-5,6-dímethyl-2-(3-fluorfeny 1)-7//-7-( ] -feny lethyl)pyrrolo[2,3d]pyrimidin—4(3 H)-on.

'HNMR (200 MHz, CDCb) δ 2,01 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 2,05 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 6,26 (q, J = 6,8 Hz, IH), 7,12- 7,36 (m, 7H), 8,23- 8,30 (m, 2H), 11,82 (s, IH); MS (ES): 362,3 (M*+l).

d 1-5,6-dimethyl-2-(3-fluorfenyl)~7//-7-(l -feny lethyl)pyrrolo[2,3d|pyrimidin^4(3H)-on.

'HNMR (200 MHz, CDCb) δ 2,02 (d, J= 7,4 Hz, 3H), 2,06 (s, 3H), 2,44 (s, 3H), 6,29 (q, J 7,4 Hz, IH), 7,13 - 7,51 (m, 7H), 8,00- 8,04 (m, 2H), 11,72 (s, IH); MS (ES): 362,2 (M^r+1).

dl-5,6-dimethyl-2-(2-fluorfenyl)-7//-7-(1-fenylethyl)pyrrolo[2,3d]pyrimidÍn~4(3H)-on.

'HNMR (200 MHz, CDCb) δ 2,00 (d, J- 7,2 Hz, 3H), 2,05 (s, 3H), 2,38 (s, 3H), 6,24 (q, J = 7,2, IH), 7,18 - 7,45 (m,8H), 8,21 (m, lH),9,54(s, IH); MS (ES): 362,2 (M⁺+l).

dl-5,6-dimethyl-2-i sopropy 1-7//-7-(1 -feny lethyl)pyrrolo[2,3 d]pyrimidin—<4(3 H)-on.

'H NMR (200 MHz, CDCb) δ 1,30 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,32 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 2,01 (s, 3H),

2,š4 (s, 3H), 2,90 (m, IH), 6,13 (m, IH), 7,17 -7,34 (m, 5H), 10,16 (s, IH); MS (ES): 310,2 (M⁺+l).

Příprava 8

Roztok dl-l-{l-fenylethyl)-2-benzoyIamino-3-kyan-4—dimethylpyrrolu (785 mg, 2,38 mmol) s koncentrovanou kyselinou sírovou (1 ml) v DMF (13 ml) se míchá při teplotě 130 °C po dobu 48 hodin. Černý roztok se zředí CHCb (100 ml) a promyje se 1 N NaOH (30 ml), a solankou (30 ml). Organická frakce se suší, filtruje, koncentruje, a čistí se mžikovou chromatografií (SiO?;

-38CZ 302486 Bó

8/2 EtOAc/Hex, Rf 0,35) na hnědou pevnou látku (184 mg, 24 %) jako dl-5-methyl~2-fenyl7//-7-( 1 -feny lethyl)pyrrolo[2,3 djpyrim idin-4(3 H)-on.

'HNMR (200 MHz, CDCh) δ 8,18 (m, 2H, Ar-H), 7,62 - 7,44 (m, 3H, Ar-H), 7,40 - 7,18 s (m, 5H. Ar-H). 6,48 (s. IH. pvrrol-H). 6,28 (q, IH, J= 7,2 Hz, CH-CH₃), 2,18 (s, 3H, pyrrol CH₃), 2,07 (d, 3H, J = 7,2 Hz, CH-CH₃); MS (ES): 330,2 (M⁺+l).

Příprava 9 to

Směs dl—1—(fenylethyl)-2-amino-3-kyan^,5-dimethylpyrrolu (9,60 g, 40,0 mmol) a mravenčí kyseliny (50,0 ml, 98%) se zahřívá při zpětném toku po dobu 5 hodin. Poté se směs ochladí na teplotu místnosti a odstraní se ze stěn nádoby. Vzniklá sraženina se filtruje, Materiál se promyje, dokud promývací kapaliny nevykazují neutrální pH a získá se dl-5,6-dimethyl-7//-7-(l-fenyli5 ethy 1 )py rro 1 o [2,3 d] py rim id in-4 (3 H)-on.

‘HNMR (200 MHz, CDCh) δ 1,96 (d, J= 7,4 Hz, 3H), 2,00 (s, 3H); 2,38 (s, 3H), 6,21 (q, J = 7,4 Hz, 1H), 7,11 - 7,35 (m, 5H), 7,81 (s, 1 Η), 11,71 (s, 1H); MS (ES): 268,2 (M^T+1).

Příprava 10 dl-5,6-dimethyl-2-feny 1-7/7-7-( 1-feny lethyl)pyrrolo[2,3 d]pyrimidin-4(3H)-on (l,0 g,

2,91 mmol) se suspenduje v polyfosforečné kyselině (30 ml). Směs se zahřívá při teplotě 100 °C po dobu 4 hodin. Horká suspenze se vylije do ledové vody, intenzivně se míchá, aby se dosáhlo disperze suspenze, a alkalizuje se na pH 6 s pevným KOH. Vzniklá pevná látka se filtruje a sebere a získá se 0,49 g (69 %) 5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4(3H)-onu.

'HNMR (200 MHz, DMSO-d₃) δ 2,17 (s, 3H), 2,22 (s, 3H), 7,45 (br, 3H), 8,07 (br, 2H), 11,49 (s, IH), 11,82 (s, IH); MS (ES): 344,2 (M⁺+l).

Následující sloučeniny se získají podobným postupem jako sloučeniny v přípravě 10:

5-methyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3djpyrimidin—4(3Hf-on. MS (ES): 226,0 (M*-H).

5,6-dimethyl-2-(3-pyridyl)-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. MS (ES): 241,1 (M⁺+l).

5.6- dimethyl-2-(2-furyl)-7//-pymolo[2,3d]pyriniidin^t(3H)-on.

’H NMR (200 MHz, DMSO-Λ) δ 2,13 (s, 3H), 2,18 (s, 3H), 6,39 (dd, J = 1,8, 3,6 Hz, IH), 6,65 (dd, J= 1,8 Hz, 3,6 Hz, IH), 7,85 (dd, J= 1,8, 3,6 Hz. IH), 11,45 (s, IH), 11,60 (s, IH);

MS (ES): 230,1 (M⁺+l).

5.6- dimethyl-2-(3-furyl)-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimÍdin-4(3H)-on.

‘HNMR (200 MHz, DMSO-Λ) δ 2,14 (s, 3H), 2,19 (s, 3H), 6,66 (s, IH), 8,35 (s, IH), 11,3 (s, IH), ll,4(s, IH); MS (ES): 230,1 (M⁺+l).

5.6- dimethyl-2~cyklopentyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin^K3H)-on.

‘HNMR (200 MHz, DMSO-d_ó) δ 1,57- 1,91 (m, 8H), 2,12 (s, 3H), 2,16 (s,3H), 2,99 (m, IH), 11,24 (s, IH), 11,38 (s, IH); MS (ES): 232,2 (M⁺+l).

5,6-dimethyÍ-2-(2-thienyi)-7//-pyrrolo[2,3ciJpyrimidin-4(3H)-on.

'HNMR (200 MHz, DMSO-Λ) δ 2,14 (s, 3H), 2,19 (s, 3H), 7,14 (dd, J = 3,0, 5,2 Hz, IH), 7,70 (d, J = 5,2 Hz, IH), 8,10 (d, J = 3,0, IH), 11,50 (s, IH); MS (ES): 246,1 (M⁺+l).

5.6- dimethvl-2-(3-thienyl)-7//-pyrrolo[2,3d|pyrimidin-4(3H>-on.

-39CZ 302486 B6 'HNMR (200 MHz, DMSO-d_ň) δ 2,17 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 7,66 (m, IH), 7,75 (m, IH), 8,43 (m, IH), 1 1,47 (s, 111), 1 l,69(s, 1H);MS(ES): 246,1 (M' + l).

5,6 dimelliyl- 2 <4--lluorfenvl> 7// pvrrolo[2Jd]pvrimidÍn-4(3H)-on, 'HNMR (200 MHz, DMSO-d_ň) ó 2,17 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 7,31 (m, 2H), 8,12 (m, 2H), 11,47 (s, 1H);MS(ES): 258,2 (M^k + 1).

5,6-dimethy 1-2 <3 Πuorfenyl> 7/7 pyrrolo[2,3d|pyrimidin^4(3H)—on.

‘HNMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 2,18 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 7,33 (m, IH), 7,52 (m, IH), io 7,85 - 7,95 (m, 2H), ll,56(s, IH), 1 l,80(s, 1H); MS (ES): 258,1 (M^h+1).

5,6-dimethy 1-2-(2-fluor fenyl)--ΊΗ--pyrrolo[2,3d]pyrimidin—4(3 H)-on.

'HNMR (200 MHz, DMSO-d_ft) δ 2,18 (s, 3H), 2,22 (s, 3H), 7,27-7,37 (m, 2H), 7,53 (m, IH), 7,68 (m, IH), 11,54 (s, IH), 11,78 (s, IH); MS (ES): 258,1 (Nf+1).

5,6-dimethy l-2-isopropyl-7H[2,3d]pyrimidin—4(311)—on.

'HNMR (200 MHz, DMSO-40 δ 1,17 (d, J~ 6,6 Hz, 6H), 2,11 (s, 3H), 2,15 (s, 3H), 2,81 (m, IH), 11,20 (s, IH), 11,39 (s, IH); MS (ES): 206,1 (M’+l).

zo 5,6-dimethyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4(3 H)-on.

‘HNMR (200 MHz, DMSOd₆) δ 2,13 (s, 3H), 2,17 (s, 3H), 7,65 (s, IH); 164,0 (M⁺+l).

Příprava 1 1

Roztok 5.6—dimethyl 2 fenyl-77/-pyrroio[2,3d]pyrimidin—4(3H)-on (1,0 g, 4,2 mmol) v oxvchloridu fosforečném (25,0 ml) se zahřívá pri zpětném toku po dobu 6 hodin a poté se koncentruje ve vakuu do sucha. Ke zbytku se přidá voda, aby došlo ke krystalizací a výsledná pevná látka se filtruje a sebere a získá se 0,90 g (83 %) 4-chlor-5,6-dimethyl-2-fenyl-7H-pyrrolo30 [2,3d]pyrimidinu.

'HNMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 2,33 (s, 3H), 2,33 (s, 3H), 7,46 - 7,49 (m, 3H), 8,30 -8,35 (m,2H), 12,20(s, 1H);MS(ES): 258,1 (M‘+1).

Následující sloučeniny se získají podobným postupem jako sloučeniny v přípravě 11:

4-chlor-5-methyl-2-fenyl~7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS (ES): 244,0 (Μ^Ψ+1). 4-chlor-6-methyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS (ES): 244,0 (M⁺+l), 4-chlor-2-fenyl-7-pyÍTolo[2,3d]pyrimidin.) ‘H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) 8,35 (2, 2H), 7,63 (br s, IH), 7,45 (m, 3H), 6,47 (brs, IH); MS (ES): 230,0 (M⁺+l).

4-chlor-5,6-dímethyl-2-(3-pyridyl)-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS (ES): 259,0 (M⁺+l).

4-ch lor-5,6-d imethy 1-2-(2- f uryl )-7H-pyrrolo [2,3 dl pyrimidin.

^!H NMR (200 MHz, DMSO-d_ó) δ 2,35 (s, 3H), 2,35 (s, 3H), 6,68 (dd, J - 1,8, 3,6 Hz, IH), 7,34 (dd, J - 1,8 Hz, 3,6 Hz, 1H), 7,89 (dd, J = 1,8, 3,6 Hz, 1H); MS (ES): 248,0 (M⁺+1).

4-ch lor-5.6-dimethy l-2-(3-íury])-7/y-pynOlo[2,3djpyrim idin.

'H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 2,31 (s, 3H), 2,31 (s, 3H), 6,62 (s, IH), 7,78 (s, IH), 8,18 (s, IH), 12,02(s, 1H);MS(ES): 248,1 (M⁺+l).

4-ch lor-5,6-d i methyl-2-cyklopentyl-7tf-pyrrolo[2,3d] pyrimidin.

-40CZ 302486 B6 ‘HNMR (200 MHz, DMSO-dJ δ 1,61 - 1,96 (m, 8H), 2,27 (s, 3H), 2,27 (s, 3H), 3,22 (m, IH), 11,97 (s, 1H);MS(ES): 250,1 (M⁺+l).

4-chlor-5,6-dimethyl-2-(2-thienyl)-7//-pyrrolo[2,3d]pyrÍmidin, ‘H NMR (200 MHz, DMSOd₆) ó 2,29 (s, 3H), 2,31 (s, 3H), 7,14 (dd, J = 3,1 Hz, 4,0 Hz, IH), 7,33 (d, J - 4,9 Hz, 1H), 7,S2 (d, j = 3,1 Hz, iH), 12,i9 (s, IH); MS (ES): 264,i (M*+Í).

4-chlor-5,6—dimcthyl-2-(3-thtenyl)-7//-pyrro!o[2,3d]pyrimidin.

Ή NMR (200 MHz, DMSO-d«) δ 2,32 (s, 3H), 2,32 (s, 3H), 7,62 (dd, J = 3,0, 5,2 Hz, IH), 7,75 (d, J = 5,2 Hz, IH), 8,20 (d, J = 3,0 Hz, IH); MS (ES): 264 (M’+l).

4~chIor-5,6—dimethyl-2-(4-fluorfenyl)-7Z/-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 2,33 (s, 3H), 2,33 (s, 3H), 7,30 (m, 2H), 8,34 (m, 2H), 12,11 (s, IH); MS (ES): 276,1 (M⁺+l).

4-chlor-5,6—dirnethyl-2J3-fiuorťenyl}-7//- pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

^lH NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 2,31 (s, 3H), 2,33 (s, 3H), 7,29 (m, IH), 7,52 (m, IH), 7,96 (m, IH), 8,14(m, IH), 11,57 (s, IH); MS (ES): 276,1 (M⁺+l),

4-ehlor-5,6-dÍmethyl-2-(2-fluorfenyl)-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

^lH NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 2,34 (s, 3H), 2,34 (s, 3H), 7,33 (rn, 2H), 7,44 (m, IH), 7,99 (m, IH), 12,23 (s, IH); MS (ES): 276,1 (M⁺+l),

4-chlor--5,6-dimethyl-2-isopropyl-7/7pyrrolo[2,3d|pyrimidin.

‘H NMR (200 MHz, DMSO-dJ δ 1,24 (d, J= 6,6 Hz, 6H), 2,28 (s, 3H), 2,28 (s,3H), 3,08 (q, J - 6,6 Hz, 1 Η), 11,95 (s, 1H); MS (ES): 224,0 (M⁺+1). 4-chlor-'5,6-dimethyl-7Hpyrrolo[2.3d]pyrimidin, 'H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 2,31 (s, 3H), 2,32 (s, 3H), 8,40 (s, IH); MS (ES): 182,0 (M⁺+l).

dl-4-chlor—5,6~dimethyl-2-fenyI-7//-7-(l-fenylethyl)pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

Příprava 12

K roztoku dl-l,2-diaminopropanu (1,48 g, 20,0 mmol) a uhličitanu sodného (2,73 g, 22,0 mmol) v dioxanu (100,0 ml) a vodě (100,0 ml) se přidá di-terc-dikarbonát (4,80 g, 22,0 mmol) při pokojové teplotě. Výsledná směs se míchá po dobu 14 hodin. Dioxan se odstraní ve vakuu. Sraženina se odfiltruje a filtrát se koncentruje ve vakuu do sucha. Zbytek se trituruje s EtOAc a poté filtruje. Filtrát se koncentruje ve vakuu do sucha a získá se směs dl-l-amino-2-(l,l-dimethyloxy)karbonylaminopropanu a dl-2-amino-l-(l,l-dimethylethoxy)karbonylaminopropanu, která nelze oddělit normální chromatografickou metodou. Směs se použije pro reakci v příkladě 8.

Příprava 13

K roztoku Fmoc-p-Ala-OH (1,0 g, 3,212 mmol) a oxalylchloridu (0,428 g, 0,29 ml, 3,373 mmol) v dichlormethanu (20,0 ml) se přidá několik kapek Ν,Ν-dimethylfbrrnamidu při teplotě 0 °C. Směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny a poté se přidá cyklopropylmethylamin (0,229 g, 0,28 ml, 3,212 mmol) a triethylamin (0,65 g, 0,90 ml, 6,424 mmol). Po době 10 minut se na směs působí 1 M hydrochloridem (10,0 ml) a vodná směs se extrahuje dichlormethanem (3 x 30,0 ml). Organický roztok se koncentruje ve vakuu do sucha. Na zbytek

-41 CZ 302486 B6 se působí roztokem 20% piperidinu v Ν,Ν-dimethylformamidu (20,0 ml) po dobu 0,5 hodiny. Po odstranění rozpouštědla ve vakuu se na zbytek působí 1 M hydrochloridem (20,0 ml) a ethylacetátem (20,0 ml). Směs se oddělí a vodná vrstva se alkalizuje pevným hydroxidem sodným na pH 8. Sraženina se odstraní filtrací a vodný roztok se zpracuje na ionexové koloně eluováním s 20% pyridinem a získá se 0,262 g (57 %) N-eyklopropylmethyl β-alaninamidu.

'H NMR (200 Mhz. CD₃OD) δ 0,22 (m, 2H), 0,49 (m, 211), 0,96 (m, 2H), 2,40 (t, 2H), 2,92 (t, 2H), 3,05 (d, 2H); MS (ES): 143,1 (M +l).

io

Příprava 14

N-/erc™butoxylkarbonyl-trans-l,4-cyklohexyldiamin.

trans- 1,4-Cyklohexyldiamin (6,08 g, 53,2 mmol) se rozpustí v dichlormethanu (100 ml). Kanylou se přidá roztok di-t-butyldikarbonátu (2,32 g, 10,65 mmol v 40 ml dichlormethanu). Po době 20 hodin se reakční směs rozdělí mezi CHCh a vodu. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje s CHC1₃ (3x). Spojené organické vrstvy se suší nad MgSO₄, filtrují a koncentrují a získá se 1,20 g bílé pevné látky (53 %).

'Η NMR (200 MHz, CDCh): δ 1,0- 1,3 (m,4H), l,44(s,9H), 1,8-2,1 (m, 4H), 2,62 (brm, IH), 3,40 (brs, 1H), 4,37 (brs, 10H); MS (ES): 215,2 (M⁺+l).

4-(N-acety I )—N-terc-butoxy karbony [-trans-1,4-cy k lohexy Id iam i n.

4-N-/m-butoxykarbonyl-/ra«ó-l,4-cyklohexyldiamin (530 mg, 2,47 mmol) se rozpustí v dichlormethanu (20 ml). Po kapkách přidá se anhydrid kyseliny octové (250 mg, 2,60 mmol). Po době 16 hodin se reakční směs zředí s vodou a s CHCh- Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje sCHCh (3x). Spojené organické vrstvy se suší nad MgSO₄, filtrují a koncentrují.

Rekrystalizací (EtOH/11Ό) se získá 190 mg bílých krystalů (30 %).

‘H NMR (200 MHz, CDCh): δ 0,9 - 1,30 (m, 4H), 1,43 (s, 9H), 1,96- 2,10 (m, 7H), 3,40 (brs, IH), 3,70 (brs, 1H), 4,40 (brs, 1H), 4,40 (brs, 1H); MS (ES): 257,2 (M^+l), 242,1 (M⁺- 15), 201,1 (M⁺-56).

4—(4-/ra«s-acetam idocyklohexyl)amino-5,6-dimethyl-2-feny 1-7//-(1 -feny Iethy l)pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

4-(N-acetyl)-N-terc-butoxykarbonyl-/rarts-l,4-cyklohexyldiamin (190 mg, 0,74 mmol), se rozpustí v dichlormethanu (5 ml) a zředí sTFA (6 ml). Po době 16 hodin se reakční směs koncentruje. Surová pevná látka, DMSO (2 ml), NaHCO₃ (200 mg, 2,2 mmol) a 4-chlor-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin (35 mg, 0,14 mmol) se spojí v nádobě a zahřejí na teplotu 130 °C. Po době 4 hodin se reakční směs ochladí na teplotu místnosti a zředí s EtOAc a vodou. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje s EtOAc (3x). Kombinované organické vrstvy se suší nad MeSO₄, filtrují a koncentrují. Preparát i vní chromatografií na silikagelu (20:1 CHCh:EtOH) se získá 0,3 mg nahnědlé pevné látky (1% výtěžek). MS (ES): 378,2 (M⁺+l). 4-(N-meth an su 1 fony 1 )-N -/trc-butoxy karbon y \-trans-cy k I o hexy 1 d i am i n.

/ra«s-l,4-Cyklohexyldiamin (530 mg, 2.47 mmol) se rozpustí v dichlormethanu (20 ml) a zředí s pyrímidem (233 mg, 3,0 mmol). Po kapkách se přidá methansulfonylchlorid (300 mg, 2,60 mmol). Po době 16 hodin se reakční směs zředí s vodou a s CHCh- Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje s CHCh (3x). Spojené organické vrstvy se suší nad MgSO₄, filtrují a koncentrují. Rekrystalizací (EtOH/H₂O) se získá 206 mg bílých krystalů (29 %).

-42 CZ 302486 B6 ’Η NMR (200 MHz, CDCI₃): δ 1,10 - 1,40 (m, 4H), 1,45 (s, 9H), 2,00- 2,20 (m, 4H), 2,98 (s, 3H), 3,20 - 3,50 (brs, 2H), 4,37 (brs, IH); MS (ES): 293,1 (M⁺-H), 278.1 (M-15), 237,1 (M⁺-56).

4-(4—irans—niethansulfamidoeyklohexyl)amino~5,6-<limetl»yI-2-fenyÍ-7/ř-(l-fenylethyl)pyjTOÍG[2,3ujpyriiriiíiin.

4-(N-sulfonyl)-N-/erc-butoxykarbonyl~/raws-l ,4-cyklohexyldiamin (206 mg, 0,71 mmol), se rozpustí v dichlormethanu (5 ml) a zředí s TFA (6 ml). Po době 16 hodin se reakční směs io koncentruje. Surová reakční směs, DMSO (2 ml), NaHCO₃ (100 mg, 1,1 mmol) a l-chlor-5,6dimethyl-2-fenyl-77/-pyrrolo[2,3d]pyrimidtnu se spojí v nádobě a ohřeje na teplotu 130 °C. Po době 15 hodin se reakční směs ochladí na teplotu místnosti a zředí s EtOAc (3x). Kombinované organické vrstvy se suší nad MgSO₄, filtrují a koncentrují. Preparativní chromatografií na silikagelu (20:1 CHCl₃/EtOH) se získá 2,6 mg nahnědlé pevné látky (5% výtěžek). MS (ES):

414,2 (M⁺+l).

Příklad 1

Roztok 4-chlor-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidinu (0,50 g, 1,94 mmol) a 4-/ra«s-hydroxycyklohexylaminu (2,23 g, 19,4 mmol) v methy lsulfoxídu (10,0 ml) se zahřívá při teplotě 130 °C po dobu 5 hodin. Poté se směs ochladí na teplotu místnosti, přidá se voda (10,0 ml) a vzniklý vodný roztok se extrahuje s EtOAc (3 x 10,0 ml). Spojený EtOAc roztok se suší (MgSO₄) a filtruje, filtrát se koncentruje ve vakuu do sucha, zbytek se chromatografuje na silikagelu a získá se 0,49 (75 %) 4-(4-/ra«5-hydroxycyklohexyl)amino~5,6-dimethyÍ-2-fenyl7/ř-pyrrolo[2,3d3pyrimidinu, t.t. 197 až 199 °C;

'H NMR (200 MHz, CDC1₃): δ 1,25 - 1,59 (m, 8H), 2,08 (s, 3H), 2,29 (s, 3H), 3,68- 3,79 (m, IH), 4,32 - 4,38 (m, IH), 4,88 (d, J = 8 Hz, IH), 7,26 - 7,49 (m, 3H), 8,40 - 8,44 (dd, J - 2,2, 8 Hz, 2H), 10,60 (s, IH); MS (ES): 337,2 (M⁺+l).

Následující sloučeniny se získají podobným postupem jako sloučeniny v příkladě 1:

4-(4-/ra«j-hydroxycyklohexyI)am ino-ó-methy 1-2-feny 1-777--pyrrolo [2,3 d]pyrimidin.

*H NMR (200 MHz, CDC1₃): δ 11,37 (s, IH, pyrrol-NH), 8,45 (m, 2H, Ar-H), 7,55 (m, 3H,

Ar-H), 6,17 (s, IH, pyrrol-H), 4,90 (brd, IH, NH), 4,18 (m, IH, CH-O), 3,69 (m, IH, CH-N), 2,40 - 2,20 (m, 2H), 2,19 - 1,98 (m, 2H), 2,25 (s, 3H, CH₃), 1,68 - 1,20 (m, 4H); MS (ES): 323,2 (M⁺+l).

4-(4-/rarts—hydroxycyklohexyl)amino-5-methyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

'H NMR (200 MHz, CDC1₃): δ 11,37 (s, IH, pyrrot-NH), 8,40 (m, 2H, Ar-H), 7,45 (m, 3H, Ar-H), 5,96 (s, IH, pyrrol-H), 4,90 (br d, IH, NH), 4,18 (m, IH, CH-O). 3,69 (m, IH, CH-N), 2,38 - 2,20 (m, 2H), 2,18 - 1,98 (m, 2H), 2,00 (s, 3H, CH₃), 1,68 - 1,20 (m, 4H); MS (ES): 323,2 (M⁺+l).

4-(4-zrařw-hydroxycyklohexyl)amino-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin, t.t. 245,5 až 246,5 °C;

’H NMR (200 MHz, CDC1₃): δ 8,33 (m, 2H, Ar-H), 7,42 (m, 3H, Ar-H), 7,02 (d, IH, J = 3,6 Hz, pyrrol-H), 6,53 (d, IH, J = 3,6 Hz, pyrrol-H), 4,26 (m, IH, CH-O), 3,62 (m, IH, CH-N), 2,30 - 2,12 (m, 2H), 2,12 - 1,96 (m, 2H), 1,64 - 1,34 (m, 4H); MS, Μ + 1 - 309,3; Anal, (C_i8H₂₀N₄O)C, H,N.

4—(4—Zrtzm-hydroxycy klohexy l)amino-5,6-di methy 1-2-(3-pyTÍdyl)-77/-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. ^]H NMR(200 MHz, CDC1₃): δ 1,21 - 1,54 (m, 8H); 2,28 (s, 3H), 2,33 (s, 3H); 3,70 (m, IH), 4,31 (m, IH), 4,89 (d, IH), 7,40 (m, IH), 8,61 (m, 2H), 9,64 (m, IH); MS (ES): 338,2 (M+l).

-43 CZ 302486 B6

444-/ratts-hydroxycyklohexyl)amino-5,6-dirnethyl-2-(2-furyl)-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

'H NMR (200 MHz, CDCb): δ 1,26- 1,64 (m, 8H), 2,22 (s, 3H), 2,30 (s, 3H), 3,72 (m, IH), 4,23 (m, IH), 4,85 (d, IH), 6,52 (m, IH), 7,12 (m, IH), 7,53 (m, IH), 9,28 (s, IH); MS (ES): 327,2 (M^f+1).

4-<4-/ra/is'-hydroxycyklohexyl)ammo-5,6-dimethyl-2-(3-fiiry 1)-7//-pyrrolo[2.3d]pyrimidin. 'HNMR (200 MHz, CDCb): δ 1,25 - 1,63 (m, 8H), 2,11 (s, 3H), 2,27 (s, 3H), 3,71 (m, 1H),4,2O (ni, 1H), 4,84 (d, 1H), 7,03 (m, 1H), 7,45 (m, 1H), 8,13 (m, 1 Η), 10,38 (m, 1 H); MS (ES): 327,2 (M*+l).

4-(4-/r£tfj.s'-hydroxycyklohexyl)amino-5,6-dimethyl-2-cyklopentyl-7/7-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

'H NMR (200 MHz, CDCb): δ 1,26- 2,04 (m, 16H), 2,26 (s, 3H), 2,27 (s, 3H), 3,15 (m, IH), 3,70 (m, IH), 4,12 (m, lH),4,75(d, IH); MS (ES): 329,2 (M⁺+l).

4-(4-/ra/7.s’hytlroxycyklohexyl)ainino-5,6-dimethyl242-thienyl)-7//-pyrrolo[2.3d]pyrimidin. ^lH NMR (200 MHz, CDCb): δ 1,28 - 1,59 (m, 8H), 2,19 (s, 3H), 2,29 (s, 3H), 3,74 (m, 1H),4,19 (m, IH), 4,84 (d, IH), 7,09 (m, IH), 7,34 (m, IH), 7,85 (m, IH), 9,02 (s, IH); MS (ES): 343,2 (M* + l).

4-(4-/rť7/75-hydroxycyklohexyl)amino-5,6-dimethyl-2-(3-thienyl)-7//-pyrrolo[2,3dJ pyrimidin. 'H NMR (200 MHz, CDCb): δ 1,21 - 1,60 (m, 8H), 1,98 (s, 3H), 2,23 (s, 3H), 3,66 (m, IH), 4,22 (m, IH), 7,27(m, lH),7,86(m, lH),8,09(m, IH), 11,23 (s, IH); MS (ES): 343,2 (M⁺+l).

4-(4-Zra»5-hydroxycyklohexyl)amino-5,6-dimethyl-2-(4-fluorfenyl)-7//-pyrrol0[2,3d]pyrimidin.

'H NMR (200 MHz, CDCb): δ 1,26 - 1,66 (m, 8H), 1,94 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 3,73 (m, IH), 4,33 (m, lH),4,92(d, IH), 7,13 (m, 2H), 8,41 (m, 2H), 11,14 (s, IH); MS (ES): 355,2 (M' + l).

4~(4-/ra«s-hydroxycyklohexyl)amino-5,6-dimethy]-2-(3-fluorfenyl)-7//-pynOlo[2,3d]pyrimidin.

'H NMR(200 MHz, CDCb): δ 1,26-1,71 (m, 8H), 2,06 (s, 3H), 2,30 (s, 3H), 3,72 (m, IH), 4,30 (m, IH), 4,90 (d, IH), 7,09 (m, IH), 7,39 (m, IH), 8,05 (m, IH), 8,02 (m, IH), 10,04 (s, IH);MS (ES): 355,2 (M⁺+l).

4-(4-/ra«s-hydroxycyklohexyl)amino-5,6-dimethyl-2-(2-fluorfenyl)-7//-pynOlo[2,3d]pyrimidin.

'H NMR(200 MHz, CDCb): δ 1,30-1,64 (m, 8H), 2,17 (s, 3H), 2,31 (s, 3H), 3,73 (m, IH), 4,24 (m, IH), 4,82 (d, IH), 7,28 (m, 2H), 8,18 (m, IH), 9,02 (m, IH), 12,20 (s, IH); MS (ES): 355,3 (M'+l).

4-(4-Zran5-hydroxycyklohexyl)amino-5,6-dimethyl-2-isopropyl-7//-pyrrolo[2,3d] pyrimidin.

'H NMR (200 MHz, CDCb): δ 1,31 (d, J = 7,0 Hz, 6H), 1,30 - 1,65 (tn, 8H), 2,27 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 3,01 (m, J = 7,0 Hz, IH), 3,71 (m, IH), 4,14 (m, IH), 4,78 (d, 1H); MS (ES): 303,2.

dl-4-{2-/ratts-hydroxycyklohexyÍ)amino-5,6-dimethyl-2-isopropyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

'H NMR (200 MHz, CDCb): δ 1,31 - 1,42 (br, 4H), 1,75- 1,82 (br, 4H), 2,02 (s, 3H), 2,29 (s, 3H), 3,53 (m, IH), 4,02 (m, IH), 5,08 (d, IH), 7,41 - 7,48 (m, 3H), 8,30 (m, 2H), 10,08 (s, 1H); MS (ES): 337,2 (M⁺+1).

4-(3,4-/rews—dihydroxycyklohexyl)amino-5,6—dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidm.

MS (ES): 353,2 (M⁺+l).

-44CZ 302486 B6

4-(3,4-cz.s—dihydroxycyklohexyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimiclin,

MS (ES): 353,2 (M⁺+l).

4-(2-acetylaminoethyl)am i no-5,6-dimethy 1-2-feny l-77f-pyrrolo[2,3d]pyrimidin, t.t. 196 až s 199 °C;

Ή NMR (200 MHz. CDCi₃): δ 1,72 (s, 3H), Ϊ.97 (s, 3H), 2,31 (s, 3H), 3,59 (m, 2H), 3,96 (m, 2H), 5,63 (br, IH), 7,44 - 7,47 (m, 3H), 8,36 - 8,43 (dd, J = 1 Hz, 7 Hz, 2H), 10,76 (s, IH); MS (ES): 324,5 (M⁺+l).

ío dM-(2-Zrart5-hydroxycyklopentyl)amino-5,6-dÍmethyl-2-fenyl-7//-pyrroio[2,3d]pyrirnidin^l, ^!H NMR (200 MHz, CDCb): δ 1,62 (m, 2H), 1,79 (br, 4H), 1,92 (s, 3H), 2,29 (s, 3H), 4,11 (m. IH), 4,23 (m, IH), 5,28 (d, IH), 7,41 - 7,49 (m, 3H), 8,22 (m, 2H), 10,51 (s, IH); MS (ES):

323,2 (M⁺+l).

‘Přípravu 2-·trans-hydroxycyklopentylaminu viz PCT 9417090.

dl-4-(3-/ra«s-hydroxycyktopentyl)amino-5,6-dimethyl-2-feny 1-7/7--pyrrolo[2,3d] pyrimidin¹. *H NMR (200 MHz, CDC1₃): δ 1,58- 1,90 (br, 6H), 2,05 (s, 3H), 2,29 (s. 3H), 4,48- 4,57 (m, IH), 4,91 -5,01 (m, 2H), 7,35 - 7,46 (m, 3H), 8,42 - 8,47 (m, 2H), 10,11 (s, 1H); MS (ES):

323,2 (M⁺+l).

'Přípravu 3-/ra«.?-hydroxycyklopentylaminu viz EP-A-322242.

d 1-4-(3-r/5-hydroxycy klopentyl)amino-5,6-di methy 1-2-feny l-7//-pyrrolo[2,3d] pyrimidin¹.

’H NMR (200 MHz, CDC1₃): δ 1,82- 2,28 (br, 6H), 2,02 (s, 3H), 2,30 (s, 3H), 4,53- 4,60 (m, IH), 4,95 - 5,08 (m, IH), 5,85 - 5,93 (d, IH), 7,35 - 7,47 (m, 3H), 8,42 - 8,46 (m, 2H),

10,05 (s, IH); MS (ES): 323,2 (M⁺+l).

'Přípravu 3-<?Zs-hydroxycyklopentylaminu viz EP-A-322242.

4-(3,4-íraws-dihydroxy cyklopenty t)amino-5,6-dimethy 1-2-feny l-7//-pyrrolo[2,3 d]pyrimidi n'. 'H NMR (200 MHz, CDC1₃): δ 1,92 - 1,99 (br, 2H), 2,14 (s, 3H), 2,20 (br, 2H), 2,30 (s, 3H),

2,41 - 2,52 (br, 2H), 4,35 (m, 2H), 4,98 (m, 2H), 7,38 - 7,47 (m, 3H), 8,38 - 8,42 (m, 2H), 9,53 (s, IH); MS (ES): 339,2 (M*+l),

Pro přípravu 3,4-/ran$-dihydroxycyklopentylaminu viz PCT 9417090.

4-(3-amino-3-oxopropyl)amino-5,6-dimethy 1-2-feny l-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

'H NMR (200 MHz, CDCb) δ 2,02 (s, 3H), 2,29 (s, 3H), 2,71 (t, 2H), 4,18 (m, 2H), 5,75 - 5,95 (m, 3H), 7,38-7,48 (m,3H), 8,37-8,41 (m, 2H), 10,42 (s, IH); MS (ES): 310,1 (M⁺+l).

4-(3-N-cykIopropylmethylamino-3-oxopropyI)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

'HNMR (200 MHz, CDCb) δ 0,51 (q, 2H), 0,40 (q, 2H), 1,79- 1,95 (br, IH), 2,36 (s, 3H), 2,40 (s, 3H), 2,72 (t, 2H), 2,99 (d, 2H), 4,04 (t, 2H), 7,58- 7,62 (m, 3H), 8,22- 8,29 (m, 2H); MS (ES): 364,2 (M⁺+l).

4—(2-am i no-2-oxoethy l)am ino-5,6-dimethy I-2-feny l-77/-pyrro lo [2,3 d] pyri m id in.

‘HNMR (200 MHz, CD₃OD) δ 2,31 (s, 3H), 2,38 (s, 3H), 4,26 (s, 2H), 7,36 (m, 3H), 8,33 (m, 2H); MS (ES): 396,1 (M⁺+l).

4-(2-N-methylamino-2-oxoethyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7/T-pyrrolo[2,3d] pyrimidin. 'HNMR (200 MHz, CDCb) δ 1,99 (s, 3H), 2,17 (s, 3H), 2,82 (d, 3H), 4,39 (d, 2H), 5,76 (t, IH),

6,71 (br, IH), 7,41 - 7,48 (m, 3H), 8,40 (m, 2H), 10,66(s, IH); MS (ES): 310,1 (M>1).

4-{3-Zerc-butyloxy-3-oxopropyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7/í-pyrrolo[2,3d]pyriniidin. ^lH NMR (200 MHz, CDCb) δ 1,45 (s, 9H), 1,96 (s, 3H), 2,29 (s, 3H), 2,71 (t, 2H), 4,01 (q, 2H), 5,78 (t, IH), 7,41 - 7,48 (m, 3H), 8,22-8,29 (m, 2H); MS (ES): 367,2 (M⁺+l).

-45CZ 302486 B6

4(2-hydro\yíneth_vl)amino5.6-di[nethyl-2-t'ctiyl-7//-pyrrolo[2,3d ] pyrimidin.

^lH NMR (200 MHz, CDCb) δ 1,92 (s, 3H), 2,29 (s, 311), 3,81 - 3,98 (br, 4H), 5,59 (t, IH),

7,39 - 7,48 (m, 3H), 8,37 (m, 2H), 10,72 (s, 1H); MS (ES): 283,1 (Μ ^l+1).

4-{3-hydroxypropyl)amino-5,6—dimethyl-2-ťenyl-7//-pyrrolo[2,3d] pyrimidin.

'HNMR (200 MHz, CDCb) δ 1,84 (m, 2H), 1,99 (s, 3H), 2,32 (s, 3H), 3,62 (t, 2H), 3,96 (m, 2H), 3,35 (t, IH), 7,39 - 7,48 (m, 3H), 8,36 (m,2H), 10,27 (s, IH); MS (ES): 297,2 (M+l).

io 4-(4-hydroxybutyl)amino-5,6-dimethyl-2-fěnyl-7//-pyrroio[2,3d]pyrÍmidin.

'HNMR (200 MHz, CDCb) δ 1,71 - 1,82 (m, 4H), 1,99 (s, 3H), 2,31 (s, 3H), 3,68- 3,80 (m, 4H), 5,20 (t, IH), 7,41 - 7,49 (m, 3H), 8,41 (m, 2H), 10,37 (s, 1 H); MS (ES): 311,2 (M* + l).

4—(4-/nw.s’acety laminoeyklohexyl)amtno-5,6-dí methy 1-2- feny l-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

4-(4-/z^,í7«.s-methylsulfonylamínocyklohexyl)amino-5,6-dimethy 1-2-feny 1-7// pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

4-(2-aeety lam i noethyl)am i no-5,6-dimethy 1-2-feny 1-7//7( 1 -feny lethy l)pyrrolo[2,3d]20 pyrimidin.

-(4-/rms-hydroxycyklohexyl)amino-5,6—dimethyl-2-fenyl 777 7 ( l -fenylethyl)pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

4-(3-pyridylmethy])amino-5,6-dimethyl-2-feny 1-7//-7-(1 -feny lethy l)pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

4-(2-methylpropyl)amino-5,6-dimethyl—2-feny 1-7//-7-(1 -feny lethy l)pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

Příklad 2

K míchané suspenzi trifenylfosfinu (0,047 g, 0,179 mmol) a benzoové kyseliny (0,022 g, 0,179 mmol) v THF (1,0 ml) ochlazeném teplotu na 0 °C se přidá při teplotě 0 °C 4-(4-transh yd ro xycy k I o hexy1 )am i no-5,6-d i methy 1-2-feny l—7//—py rro lo[2,3 d] py ri m i d i n (0,05 g,

0,149 mmol). Poté se během doby 10 minut přidá po kapkách diethylazod i karboxy lát (0,028 ml,

0,179 mmol). Reakční směs se nechá ohřát na teplotu místnosti. Po skončení reakce (TLC) se reakce potlačí s vodným hydrogenuhličitanem sodným (3,0 ml). Vodná fáze se oddělí a extrahuje etherem (2 x 5,0 ml). Organické extrakty se spojí, suší a koncentrují ve vakuu do sucha. Ke zbytku se přidá ether (2,0 ml) a hexan (5,0 ml), a odfiltruje se trifenylfosfinoxid. Koncentrací filtrátu se získá viskózní olej, který se čistí sloupcovou chromatografií (hexan : ethyl acetát = 4:1) a získá se 5,0 mg (7,6%) 4-(4-cZs-benzoyloxycyklohexyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//pyrrolo[2,3d]pyrímidinu. MS (ES): 441,3 (M⁺+l). Pri reakci také vznikne 50,0 mg (84 %) 4-(3-cyklohexyl)amino-5,6-dimethy 1-2-feny I-7//-pyrrolo[2,3d] pyrimidinu. MS (319,2 (M⁺+l).

Příklad 3

K roztoku 4-(4-c/s-benzoyloxycyklohexyl)amino-5,6-dimethy 1-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3djpyri50 midinu (5,0 mg, 0,0114 mmol) v ethanolu (1,0 ml) se přidá 10 kapek 2M hydroxidu sodného. Po době 1 hodiny se reakční směs extrahuje ethylacetátem (3 x 5,0 ml) a organická vrstva se suší, filtruje a koncentruje ve vakuu do sucha. Zbytek se podrobí sloupcové chromatografií (hexan : ethyl acetát = 4 : 1) a získá se 3,6 mg (94 %) 4-(4~cw-hydroxycyklohexyl)amino-5,6-dimethyl2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidinu. MS (ES): 337,2 (M^T+1).

-46CZ 302486 B6

Následující sloučeniny se získají podobným postupem jako sloučeniny v příkladě 3:

4-( 3-N, N-dimethy 1-3 —oxopropy l)am ino-5,6-d i methy Í-2-fenyl-7//-pyrrolo [2,3 dl pyrimidin.

’H NMR (200 MHz, CDClj δ 2,01 (s, 3H), 2,31 (s, 3H), 2,73 (t, 2H), 2,97 (s~ 6H)” 4,08 (m, 2H), > 6,09 (t, IH), 7,41 - 7,48 (m, 3H), 8,43 (m, 2H), 10,46 (s, IH); MS (ES): 338,2 (MSj).

4-(2~formylaminoethyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

’H NMR (200 MHz, CDClj: δ 2,26 (s, 3H), 2,37 (s, 3H), 3,59- 3,78 (m, 2H), 3,88-4,01 (m,2H), 5,48 - 5,60 (m, IH), 7,38 - 7,57 (m, 3H), 8,09 (s, IH), 8,30 - 8,45 (m, 2H), 8,82 io (s, 1H);MS(ES): 310,1 (M⁺-»-l).

4-(3-acetylaminopropyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7/f-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS (ES):

338,2 (MSI).

Příklad 4

4-(3-terc-butyloxy-3-oxopropyl)ammo-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin (70,0 mg, 0,191 mmol) se rozpustí v trifluoroctové kyselině: dichlormethanu (1 : 1, 5,0 ml).

Vzniklý roztok se míchá při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny a poté se zahřívá při zpětném toku po dobu 2 hodin. Poté se směs ochladí na teplotu místnosti, se koncentruje ve vakuu do sucha. Zbytek se podrobí preparativní chromatografií na tenké vrstvě (EtOAc: hexan: AcOH = 7 : 2, 5 : 0, 5) a získá se 40,0 mg (68 %) 4-(3-hydroxy-3-oxopropyl)amino-5,6-dimethyl~2-fenyl7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidinu.

‘H NMR (200 MHz, CD₃OD) δ 2,32 (s, 3H), 2,38 (s, 3H), 2,81 (t, 2H), 4,01 (t, 2H), 7,55 (m, 3H), 8,24 (m, 2H); MS (ES): 311,1 (M⁺+l).

Následující sloučenina se získá podobným postupem jako sloučeniny v příkladě 4.

4~(3-aminopropyl)amino-5,6—dimethyl-2-fenyl—77/-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS (ES): 296,1 (M⁺+l), 279,1 (M⁺-NHJ.

Příklad 5

4-(3-hydroxy-3-oxopropy l)amino-5,6-dimethyl-2-feny l-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin (50,0 mg, 0,161 mmol) se rozpustí ve směsi Ν,Ν-dimethylformamidu (0,50 ml), dioxanu (0,50 ml) a vody (0,25 ml). K tomuto roztoku se přidá methylamin (0,02 ml, 40% hmotn. ve vodě, 0,242 mmol), triethylamin (0,085 ml) a Ν,Ν,Ν',Ν -tetramethyluroniumtetrafluorborát (61,2 mg, 0,203 mmol).

Roztok se míchá o teplotě místnosti po dobu 10 minut, poté se koncentruje a zbytek se podrobí preparativní chromatografií na tenké vrstvě (EtOAc) a získá se 35,0 mg (67 %) 4-(3-N-methyl3- oxopropyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidinu.

'HNMR (200 MHz, CDCIJ δ 1,92 (s, 3H), 2,30 (s, 3H), 2,65 (t, 2H), 4,08 (t, 2H), 5,90 (t, IH), 6,12 (m, 1H), 7,45 (m, 3H), 8,41 (m, 2H), 10,68 (s, IH); MS (EH): 311,1 (M⁺+l).

Následující sloučeniny se získají podobným postupem jako sloučeniny v příkladě 5:

4- (2-cykIopropankarbonylaminoethyl)amino-5,6-dimethyI-2-fenyl-77í-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS (ES): 350,2 (M⁺+l).

4—(2-i sobutyry 1 am inoethy l)am ino-5,6-dimethy 1-2-feny l-7//-pyrro 1 o [ 2,3 d] pyrim idin.

MS (ES): 352,2 (M⁺+l).

4-(3-propionylaminopropyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-77/-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

-47C7 302486 B6 'Η NMR (200 MHz, CDO₃)Ó 1,00-1,08 (t, 3H), 1,71 -2,03 (m, 4H), 2,08 (s, 3H), 2,37 (s, 3H), 3,26 - 3,40 (m, 2H), 3,79 - 3,96 (m, 2H), 5,53 - 5,62 (m, 111), 6,17 - 6,33 (m, 1H), 7,33 - 7,57 (m, 3H), 8,31 - 8,39 (m, 2H), 9,69 (s, IH); MS (ES): 352,2 (M‘+l).

4-(2-methylsulfonylaminoethyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

^lH NMR (200 MHz, CDCf) δ 2,18 (s, 3H), 2,27 (s, 3H), 2,92 (s, 2H), 3,39 - 3,53 (m, 2H), 3,71 -3,88 (rn, 2H), 5,31 - 5,39 (m, IH), 6,17 - 6,33 (m, IH), 7,36- 7,43 (m, 3H), 8,20-8,25 (m, 2H), 9,52 (s, IH); MS (ES): 360,2 (M+l).

io

Příklad 6

Směs 4-ehlor-5,6-ditnethy[-2-těnyl- 7// pyrrole>l2.5d]pyrimidinu (0,70 g, 2,72 mmol) a 1,2-diaminoethanu (10,0 ml, 150 mmol) se zahřívá pod inertní atmosférou po dobu 6 hodin. Přebytek aminu se odstraní ve vakuu, zbytek se postupně promyje s etherem a hexanem a získá se 0,75 g (98 %) 4-(2-amÍnoethyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidinu. MS (ES):

282,2 (M +l), 265,1 (Μ'-ΝΗ₃).

Příklad 7

K roztoku 4-( 2-am i noethyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d] pyrimidinu

2? (70,0 mg, 0,249 mmol) a triethylaminu (50,4 mg, 0,498 mmol) v dichlormethanu (2,0 m) se přidá při teplotě 0 °C propionylchlorid (25,6 mg, 0,024 ml, 0,274 mmol). Po době l hodiny se směs koncentruje ve vakuu a zbytek se podrobí preparativní chromatografii na tenké vrstvě (EtOAc) a získá se 22,0 mg (26 %) 4-(2 propionylaminoethy l)amino 5,6 -dimethyl-2-ťenyl-7//-pyTrolo[2,3djpyrimidinu. MS (ES): 338,2 (M⁺+l).

Následující sloučeniny se získají podobným postupem jako sloučeniny v příkladě 7:

4-2-(N -methylureaethyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin 'H NMR (200 MHz, CDCf) δ 2,13 (s, 3H), 2,32 (s, 3H), 3,53 (d, 3H), 3,55 (m, 2H), 3,88 (m, 2H), 4,29 (m, IH), 5,68 (t, IH), 7,42 (m, 3H), 8,36 (dd, 2H), 9,52 (s, IH); MS (ES): 339,3 (M^T+1).

4-(2-N'-ethylureaethyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-77í-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

MS (ES): 353,2 (M⁺+l).

Příklad 8

K roztoku 1-(3-dimethy laminopropyl)-3-ethylkarbodiimid hydrochloridu (41,1 mg,

0,215 mmol), dimethylaminopyridinu (2,4 mg, 0,020 mmol) a pyrohroznové kyseliny (18,9 mg,

0,015 ml, 0,215 mmol) v dichlormethanu (2,0ml) se přidá 4-(2-arninoethyl)amino-5,6--dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin (55,0 mg, 0,196 mmol). Směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 4 hodin. Obvyklým zpracováním a sloupcovou chromatografii (EtOAc) se poté získá 10,0 mg (15 %) 4-(2'-pyruvylamidoethyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo50 [2,3d]pyrimidinu- MS (ES): 352,2 (M⁺+l).

-48CZ 302486 B6

Příklad 9

K roztoku 4-(2-aminoethyl)amino-5,6-dimethyÍ-2-fenyÍ-7//-pyrroloÍ2,3dJpyrimidinu (60,0 mg, 0,213 mmol) v dichlormethanu (2,0 ml) se přidá N-trimethylsily!isokyanát (43,3 mg,

0,051 ml, 0,320 inmol). Směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 3 hodin a poté se přidá vodný hydrogenuhličitan sodný. Směs sc poté filtruje přes maíé množství siiikageiu, filtrát se koncentruje ve vakuu do sucha a získá se 9,8 mg (14 %) 4—(2-ureaethyl)amino-5,6-dimethyl-2~ fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidinu. MS (ES): 325,2 (M'+l).

i o Následující sloučeniny se získají podobným postupem jako sloučeniny v příkladě 9:

d]-4-f2-acetylaminopropyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

'HNMR (200 MHz, CDCh) δ 1,28 - 1,32 (d, J = 8 Hz, 3H), 1,66 (s, 3H), 1,96 (s, 3H), 2,30 (s,3H), 3,76- 3,83 (m, 2H), 4,10-4,30 (m, IH), 5,60- 5,66 (t, J - 6 Hz, IH), 7,40 - 7,51 (m, 3H), 8,36 - 8,43 (m, 2H), 10,83 (s, IH); MS (ES): 338,2 (M⁺+l).

(R)-4~(2-acetylaminopropyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7tf-pynOlo[2,3d] pyrimidin.

'HNMR (200 MHz, CDCh) δ 1,31 (d, 3H), 1,66 (s, 3H), 1,99 (s, 3H), 2,31 (s, 3H), 3,78- 3,83 (m, 2H), 4,17-4,22 (m, IH), 5,67 (t, IH), 7,38 - 7,5 (m, 3H), 8,39 (m, 2H), 10,81 (s, IH);

MS (ES): 338,2 (M*+l).

(R) -4-( l-methyl-2-acetylaminoethyl)amino-5,6-dimethyl~2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

'H NMR (200 MHz, CDCh) δ 1,41 (d, 3H), 1,68 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,34 (s, 3H), 3,46 - 3,52 (br, m, 2H), 4,73 (m, IH), 5,22 (d, IH), 7,41 - 7,46 (m, 3H), 8,36 - 8,40 (m, 2H), 8,93 (s, IH); MS (ES): 338,2 (M⁺+l).

(S}-4-(2-acetylaminopropyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyI-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

'HNMR (200 MHz, CDCh) δ 1,31 (d, 3H), 1,66 (s, 3H), 2,26 (s, 3H), 2,35 (s, 3H), 3,78 - 3,83 (m,2H), 4,17- 4,22 (m, IH), 5,67 (t, IH), 7,38 - 7,5 (m, 3H), 8,39 (m, 2H), 8,67 (s, IH);

MS (ES): 338,2 (M⁺+l).

(S) -4-(l-methyI-2-acetylaminoethyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7/í-pyrrolo[2,3d]yrimidin. 'HNMR (200 MHz, CDCh) δ 1,41 (d, 3H), 1,68 (s, 3H), 2,05 (s, 3H), 2,32 (s, 3H), 3,46 - 3,52 (m, 2H), 4,73 (m, IH), 5,22 (d, IH), 7,41 - 7,46 (m, 3H), 8,36 - 8,40 (m, 2H), 10,13 (s, IH);

MS (ES): 338,2 (M⁺+l).

Příklad 10

Reakce 4—chlor-5,6-dimethyl-2-fenyI-7//-pyirolo[2,3d]pyrimidinu se směsí dl-l-amino-2(1,1 -di methy l ethoxy )karbony lam i nopropanu a dl-2-amino-l -(1,1 -d i methy 1 ethoxy )karbony 1aminopropanu se provede podobným postupem jako reakce v příkladě 1. Reakcí se získá směs d1^h-(l-methyl-2-(hl-dimethylethoxy)karbonylamino)ethylamíno-5,6-dtmethyl-2-fenyl-77745 pyrrolo[2,3d]pyrimidinu a dl-4-(2-methyl-2-(hl-dimethy]ethoxy)karbony[amino)ethylammo5,6-dimethyl-2-fenyl-77/-pyrrolo[2,3d]pyrimidinu, které se oddělí sloupcovou chromatografií (EtOAc: hexany -1:3). První frakce je dl-4-( 1 -methy 1-2-(lj-dtmethylethoxy)karbony 1amÍnoethyl)amino-5,6-dimethyI-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin:

'HNMR (200 MHz, CDC1₃) δ 1,29 - 1,38 (m, 12H), 1,95 (s, 3H), 2,31 (s, 3H), 3,34-3,43 (m, 2H), 4,62 - 4,70 (m, IH), 5,36 - 5,40 (d, J = 8 Hz, IH), 5,53 (br, IH), 7,37 - 7,49 (m, 3H),

8,37 - 8,44 (m, 2H), 10,75 (s, IH); MS 396,3 (M⁺+l). Druhá frakce je dM-(241,l^dÍmethylethoxy)karbonylaminopropyÍ)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin:

-49CZ 302486 B6 'HNMR (200 MHz, CDCh) δ 1,26 1,40 (m, 12H), 2,00 (s, 3H), 2,31 (s, 3H), 3,60- 3,90 (m, 2H), 3,95 - 4,10 (m, 1H), 5,41 - 5,44 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,65 (br, IH), 7,40 - 7,46 (m, 3H), 8,37 - 8,44 (m, 2H), 10,89 (s, IH); MS (ES): 396,2 (M +l).

Následující sloučeniny se získají podobným postupem jako sloučeniny v příkladě 10:

(S,S)-4-(2-acetylaminocyklohexyl)amino-5,6-dimethyl“2-fenyl-7f/-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. 'HNMR (200 MHz, CDCh) δ 1,43 (m, 4H), 1,60 (s, 3H), 1,83 (m, 2H), 2,18 (s, 3H), 2,30 (m, 2H), 2,32 (m, 211), 3,73 (br, 1H), 4,25 (br, 1H), 5,29 (d, 1H), 7,43 - 7,48 (m, 3H), 8,35 - 8,40 io (m, 2H), 9,05 (s, IH).

4-(2~methy 1-2-acety lam i no pro pyl)am i no-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3 d] pyrimidin.

'H NMR (200 MHz, CDCh) δ 1,51 (s, 6H), 1,56 ($, 3H), 2,07 (s, 3H), 2,36 (s, 3H), 3,76 (d, 2H), 5,78 (t, IH), 7,41 - 7,48 (m, 3H), 7,93 (s, IH), 8,39 (m, 2H), 10,07 (s, IH); MS (ES): 352,3 ís (M⁺+l).

Příklad 11

Na d 1-4-( l-methy 1-2-( 1 ,l-dimethylethoxy)karbonylaminoethyl)amino-5,6—d i methy 1-2-feny 17//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin (60,6 mg, 0,153 mmol) se působí trifluoroctovou kyselinou (0,5 ml) v dichlormethanu (2,0 mi) po dobu 14 hodin. Organické rozpouštědlo se odstraní ve vakuu do sucha. Zbytek se rozpustí v Ν,Ν-dimethylformamidu (2,0 ml) a triethylaminu (2,0 ml). K roztoku o teplotě 0 °C se přidá anhydrid kyseliny octové (17,2 mg, 0,016, 0,169 mmol). Výsledná směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 48 hodin a poté koncentruje ve vakuu do sucha. Zbytek se podrobí preparativní chromatografií na tenké vrstvě (EtOAc) a získá se 27,0 mg (52 %) d 1-4-( 1 -methy 1-2-acety 1 am i noethy 1 )am i no-5,6-d i methy 1-2-feny l-7//-py rro 1 o [2,3 d] pyrimidinu.

'HNMR (200 MHz, CDCh) δ 1,38 - 1,42 (d, J = 8 Hz, 3H), 1,69 (s, 3H), 2,01 (s, 3H), 2,32 (s, 3H), 3,38 - 3,60 (m, 2H), 4,65 - 4,80 (m, IH), 5,23 - 5,26 (d, J = 6 Hz, IH), 7,40- 7,51 (m, 3H), 8,37-8,43 (m, 2H), 10,44 (s, IH); MS (ES): 338,2 (M⁺+l).

Příklad 12

Na (R,R)-4-(2-aminocyklohexy])amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin, připravený podobným postupem jako v příkladě 1 z 4—chlor-5,6—dimethyl- 2-fenyl-7// pyrrolo[2,3d]pyrimidinu (0,15 g, 0,583 mmol) a (IR, 2R)-(-)-l,2-diaminocyklohexanu (0,63 g, 5,517 mmol) se působí při teplotě místnosti triethy lam inem (0,726 g, 7,175 mmol), se působí pri teplotě místnosti triethy lam inem (0,726 g, 7,175 mmol) a anhydridem kyseliny octové (0,325 g, 3,18 mmol) v Ν,Ν-dimethylformamidu (10,0 ml) po dobu 2 hodin. Po odstranění rozpouštědla ve vakuu se přidá ke zbytku ethylacetát (10,0 ml) a voda (10,0 ml). Směs se oddělí a vodná vrstva se extrahuje ethylacetátem (2 x 10,0 ml). Spojený roztok ethylacetátu se suší (MgSO₄) a filtruje. Filtrát se koncentruje ve vakuu do sucha a zbytek se podrobí sloupcové chromatografií (EtOAc : Hexan -1 : 1) a získá se 57,0 mg (26 %) (R,R)-4-(2-acetylaminocyklohexyl)amino5,6-dimethyl—2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidinu.

'HNMR (200 MHz, CDCh) δ 1,43 (m, 4H), 1,60 (s, 3H), 1,84 (m, 2H), 2,22 (s, 3H), 2,30 (m, 2H), 2,33 (s, 3H), 3,72 (br, IH), 4,24 (br, IH), 5,29 (d, IH), 7,43 - 7,48 (m, 3H), 8,35 - 8,39 (m, 2H), 8,83 (s, IH); MS (ES): 378,3 (M⁺+1).

Příklad 13

K roztoku 4-( 2-hydroxyethy l)amino-5,6-d imethy 1-2-feny l-7//-pyrrolo[2,3d] pyrimidinu (40,0 mg, 0,141 mmol) v pyridinu (1,0 ml) se při teplotě 0 °C přidá anhydrid kyseliny octové

- 50CZ 302486 B6 (0,108 g, 1,06 mmol). Směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 4 hodin a rozpouštědlo se odstraní ve vakuu. Zbytek se podrobí preparatívní chromatografií na tenké vrstvě (EtOAc : hexan =1 : 1) a získá se 32,3 mg (7 i %) 4-(2-acetyloxyethyl)amíno-5,6-di methy 1-2-fen y 1-7//pyrrolo[2,3d]pyrimidinu.

’H NMR (200 MHz, CDCi₃) δ 1,90 (s, 3H), 2,08 (s, 3H), 2,31 (s, 3H), 4,05 (m, 2H), 4,45 (t, 2H), 5,42 (m. iH), 7.41 - 7.49 (m. 3H), 8,42 (m, 2H), i i,23 (s, i H).

Příklad 14 io

Roztok Fmoc-p-Ala-OH (97,4 mg, 0,313 mmol) a oxalylchloridu (39,7 mg, 27,3 μ!, 0,313 mmol) v dichlormethanu (4,0 ml) s 1 kapkou N,N-dimethylfomnamidu se míchá při teplotě 0 °C po dobu 1 hodiny a poté se při teplotě 0 °C přidá 4-(2-aminoethyl)amino-5,6-dimethyl-2~ fenyl-7/7-pyrrolo[2,3d]pyrimidin (80,0 mg, 0,285 mmol) a triethylamin (57,6 mg, 79,4 μΐ,

0,570 mmol). Po době 3 hodin se směs koncentruje ve vakuu a zbytek se zpracuje roztokem 20% piperidinu v N,N-dimethylformamidu (2,0 ml) po dobu 0,5 hodiny. Poté co se odstraní rozpouštědlo ve vakuu a zbytek promyje diethyletherem a hexanem (1 : 5) a získá se 3,0 mg (3 %) 4-(6amino-3-aza—4-oxohexyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidinu. MS (ES):

353,2 (M⁺+l).

Příklad 15

Roztok 4-(2-aminoethyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidÍnu (70 mg,

0,249 mmol) a anhydridu kyseliny jantarové (27,0 mg, 0,274 mmol) v dichlormethanu (4,0 ml) s 1 kapkou N,N—dimethylformamidu se míchá při teplotě místnosti po dobu 4 hodin. Reakční směs se extrahuje 20% hydroxidem sodným (3 x 5,0 ml). Vodný roztok se okyselí 3 M hydrochloridem na pH 7,0. Celá směs se extrahuje ethylacetátem (3x10 ml). Spojený organický roztok se suší (MgSO₄) a filtruje. Filtrát se koncentruje ve vakuu do sucha a získá se 15,0 mg (16%) 4-(7-hydroxy-3-aza-4,7-dioxoheptyl)am i no-5,6-dimethy 1-2-feny l-7//-pvrrolo [2,3d]pyrimidinu. MS (ES): 382,2 (M⁺-H).

Příklad 16

K 10 ml dimethylformamidu (DMF) se při pokojové teplotě přidá 700 mg 4-o/5-(3-hydroxycyklopentvl)amino-2-fenyl-5,6—dimethyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidinu a poté 455 mg N-Boc glycinu, 20 mg Ν,Ν-dimethylaminopyridinu (DMAP), 293 mg hydroxy benzy Itriazolu (HOBT) a 622 mg l-(3-dimethylamÍnopropyl)-3-ethylkarbodiÍmid hydrochloridu (EDCI). Reakční směs se míchá přes noc. Poté se za sníženého tlaku odstraní DMF a reakční směs se rozdělí mezi 20 ml ethyl acetátu a 50 ml vody. Vodná část se dále extrahuje 2 x 20 ml ethyl acetátu a spojené organické části se promyjí solankou, vysuší bezvodým síranem sodným, filtrují a koncentrují. Čištěním na silika gelu a eluováním ethylacetátem a ethylhexanem se získá 410 mg žádaného produktu: 4-(cis-3-(N-t-butoxykarbonyl-2-ammoacetoxy)cykIopentyI)amino-2-fenyl-5,6-di45 methyl-777-pyrrolo[2,3d]pyrimidin, MS (ES) (\C+1) = 480,2. Ester se poté při pokojové teplotě zpracuje 5 ml 20% trifluoroctové kyseliny v dichlormethanu, nechá se stát přes noc a poté koncentruje. Triturací ethylacetátem se získá 300 mg ne zcela bílé pevné látky; sůl 4_(c/j-3-{2aminoacetoxy)cyklopentyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin trifluoroctové kyseliny, MS (ES): (M⁺+l) = 380,1.

Odborník bude schopen připravit následující sloučeniny podle metod popsaných shora:

4-(cw-3-hydroxycyklopentyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

MS (ES) (M*+l) = 323,1.

-51 CZ 302486 B6

Sůl 4-{c/5--3-{2 aminoacctoxy)cyklopcntyl)aiiiin(5-5,6 <limcthyl-2 fěnyl 7// pyrrolo[2,3d]pyrimidintrifluoroctové kyseliny. MS (ES) (M +l) = 380,1.

4-(3-acetamido)piperidinyl-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

MS (ES) (Μ‘Ή) - 364,2.

-(2 -N'-methylureapropyl)amino-5,6 diniethyl-2-lcnyl-7/Z-pyrroloj2,3d]pyrimidin.

MS (ES)(M^ř+l) - 353,4.

io 4-(2-acetamidobutyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

MS (ES)(M‘+1) = 352,4.

4-(2-N -methylureabutyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

MS (ES) (M +l) = 367,5.

4-{2-ammocyklopropvlacetamidoethyl)arnino-2 -fenyl-7// pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

MS (ES) (M' + l) = 309,1.

4-(/rwz.s-'4hydroxycyklohexyl)aminc^2-(3-chlorfenyl)-77/-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

MS (ES)(M‘+l) = 342,8.

4-(/nz«.v^-hydroxycyklohexyl)amino--2--(3fluorfenyl>-7/7-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

MS (ES)(\f+l)- 327,2.

4-(te^5M-hydroxycyklohexyl)amino-2-(4-pyridyl)-7/7pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

MS (ES)(M⁺+l) = 3 10,2.

Příklad 17

Schéma IX

Pyrrolový dusík (7) (schéma IX) se chrání s di-Zere-huty Idi karbonátem při bazických podmín35 kách a získá se odpovídající karbamát (22). Regioselektivní radikálovou bromací (22) se získá bromid (23). Obecně, sloučenina (23) slouží jako klíčový meziprodukt pro různé kopulační složky. Vytěsněním alkylbromidu s trthydrátem fenolátu sodného se získá sloučenina (24). Násled- 52CZ 302486 B6 ným vytěsněním arylchloridu a odstraněním íerc-butylkarbamátové chránící skupiny v jednom stupni se získá žádaná sloučenina (25).

Detailní syntéza sloučenin (22)-(25) podle schématu IX

Di—/erc-butyldiuhličitan (5,37 g, 24.6 mmol) a dimethylaminopyridin (1,13 g, 9,2 mmol) se přidají k roztoku obsahujícímu (7) (1,50 g, 6,15 mmol) a pyridin (30 ml). Po době 20 hodin se reakční směs koncentruje a zbytek se rozdělí mezi CH₂C1₂ a vodu. CH₂C1₂ se oddělí, suší nad MgSO₄, filtruje, koncentruje a získá se pevná čemá látka. Mžikovou chromatografií (SiO₂; 1/9 ío EtOAc/Hexany, Rf 0,40) se získá 1,70 g (80 %) bílé pevné látky (22).

*H NMR (200 MHz, CDCh) δ 8,50 (m, 2H, Ar-H), 7,45 (m, 3H, Ar-H), 6,39 (s, IH, pyrrol-H), 2,66 (s, 3H, pyrrol—CH₃), 1,76 (s, 9H, karbamát-CH₃); MS, Μ + 1 = 344,1; T.t. = 175 až 177 °C.

Cl

23-7

N-Bromsukcinimid (508 mg, 2,86 mmol) a AIBN (112 mg, 0,68 mmol) se přidají k roztoku 15 obsahujícímu (22) (935 mg, 2,71 mmol) a CCfi (50 ml). Roztok se zahřívá při zpětném toku. Po době 2 hodin se reakční směs ochladí na teplotu místnosti, koncentruje ve vakuu a získá se bílá pevná látka. Mžikovou chromatografií (SiO₂; 1/1 CH₂Cl₂/hexany, Rf 0,30) se získá 960 mg (84 %) bílé pevné látky (23).

*H NMR (200 MHz, CDCh) δ 8,52 (m, 2H, Ar-H), 7,48 (m, 3H, Ar-H), 6,76 (s, IH, pyrrol-H), 20 4,93 (s, 2H, pyrrol-CH₂Br), 1,79 (s, 9H, karbamát-CH₃); MS, Μ + 1 - 423,9; T. t, = 155 až

157 °C.

Cl

/]

Trihydrát fenoxidu sodného (173 mg, 1,θ2 mmol) se přidá v jedné části k roztoku bromidu (23) (410 mg, 0,97 mmol) rozpuštěném v CH₂C1₂ (5 ml) a DMF (10 ml). Po době 2 hodin se reakční

-53 CZ 302486 B6 roztok rozdělí mezi ClECh a vodu. Vodná vrstva se extrahuje CH₂CI₂· Spojené CH₂CI₂ vrstvy se promyjí vodou, suší nad MgSO₄, filtrují, koncentrují a získá se žlutá pevná látka. Mžikovou ehromatografií (SiO₂; 1/6 EtOAc/Hexany, Rf 0,30) se získá 210 mg (50 %) bílé pevné látky (24). 'H NMR (200 MHz, CDCh) δ 8,53 (m, 2H, Ar-H), 7,48 (m, 3H, Ar-H), 7,34 (m, 2H, Ar-H),

7,03 (m, 2H, Ar-H), 6,83 (s, 1 H, pyrroI-H), 5,45 (s, 21 f, ArCPEO), 1,76 (s, 9H, karbamát~CH₃);

MS M' 436.2.

Roztok obsahující (24) (85 mg, 0,20 mmol), N-acetylethylendiamin (201 mg, 1,95 mmol) a

DMSO (3 ml) se zahřívá na teplotu 100 °C. Po době 1 hodiny se teplota zvýší na teplotu 130 °C. io Po době 3 hodin se reakční směs ochladí na teplotu místnosti a rozdělí mezi EtOAc a vodu.

Vodná vrstva se extrahuje EtAOc (2x). Spojené EtOAc vrstvy se promyjí vodou, suší nad

MgSO₄, filtrují a koncentrují. Mžikovou ehromatografií (SiO₂; 1/10 EtOH/CHCl₃, Rf 0,25) se získá 73 mg (93 %) bílé pěnovité pevné látky (25).

’H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 11,81 (br s, IH, N-H), 8,39 (m, 2H, Ar-H), 8,03 (brt, 1 H, 15 N-H), 7,57 (br t, IH, N-H), 7,20- 7,50 (m, 5H, Ar-H), 6,89 - 7,09 (m, 3H, Ar-H), 6,59 (s, 1 H, pyrrol-H), 5,12 (s, 2H, ArCH₂O), 3,61 (m, 2H, NCH₂), 3,36 (m, 2H, NCH₂), 1,79 (s, 3H,

COCH0; MS, M + 1 -402,6.

Následující sloučeniny se získají podobným postupem jako sloučeniny v příkladě 17:

4-(2-acetylaminoethyl)amino-6-fenoxymethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. t.t. 196 až

197 °C; MS (ES): 401,6 (M'+1).

4-{2-acetylaminoethyl)amino-6-(4-ťluorťenoxy)methyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

MS (ES): 420,1 (M‘ + l).

4-(2-acety lam inoethyl)amino-6-(4-chlorfenoxy)methyl-2-fenyl~7//-pyrrolo[2,3d]pyrim idin.

MS (ES): 436,1 (MGl).

4-{2acetylaminoethyl)amino—6—(4—methoxyfenoxy)methyI-2-fenyl*-7H-pyrro1of2,3d]pyrimidin. MS (ES): 432,1 (M^+l).

4-(2-acetylaminoethyl)amino-6-(N-pyridin-2-on)methyl-2-fenyl-7/ř-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

MS (ES): 403,1 (M⁺+I).

4-(2-acetylaminoethyÍ)amino-6-(N-fenylamino)methyl-2_feny]-7Z/-pyrroÍo[2,3d]pyrimidin.

MS (ES): 400,9 (M*+l).

-54CZ 302486 B6

4-(2-acet>laminoethyl)amino-6HN-methyl-N-fenylamino)methyI-2-feny]-7//-pyrrolo[2₁3djpyrimidin. MS (ES): 414,8 (M' + l).

4—(2-N'-methylureaethyl)amino-6-fenoxymethy!-2-fenyl-7//pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

MS (ES): 416,9 (M⁺-H).

Zkouška pomocí kvasinkového β-galaktosidázového genu na lidský adenosinový receptor typu A1 a A2a io Kvasinkové kmeny (S. cerevisiaě) se transformují lidským adenosinem Al (AIR; CADUS kmen CY12660) nebo lidským A2a (A2a; CADUS kmen CY8362) a přidáním reportérového genu lacZ( β-galaktosidázy) k využití jako funkčního výstupu. Kompletní popis transformace je uveden dále (viz. Yeast Strains). Jako ligand pro všechny zkoušky se použije NECA (5'-N-ethylkarboxamidoadenosin), silný agonist adenosinového receptorů s podobnou afinitou vůči recepto15 rům Al a A2. Testované sloučeniny se zkouší při 8 koncentracích (0,1 až 10,000 nM) na schopnost inhibovat NECA-indukovanou aktivitu β-galaktosidázy působením CY12660 nebo CY8362.

Příprava kvasinkových zásobních kultur. Každý z příslušných kvasinkových kmenů, CY 12660 aCY8362 se očkuje na LT agarové plotně a inkubuje se při 30 °C dokud jsou pozorovány kolonie. K LT kapalině (pH 6,8) se přidají kvasinky z těchto kolonií a pěstují se přes noc při 30 °C. Každý kvasinkový kmen se potom zředí na OD₆₀₀ = 1,0 až 2,0 (přibližně 1 až 2 x 10⁷ buněk/ml), jak bylo určeno spektrofotometricky (Molecular Devices WMAX). Na každých 6 ml kvasinkové kapalné kultury se přidají 4 ml 40% glycerolu (1:1,5 objem/objem) („zásobní roztok kvasinek v glycerolu“). Z tohoto roztoku se připraví deset 1 ml alikvotů a uchovají se při 80 °C do provedení požadované zkoušky.

Zkouška kvasinek na AIR a A2R. Lékovka s CY8362 a lékovka s CY 12660 ve formě zásobního roztoku kvasinek v glycerolu se rozmrazí a použije se k očkování dodatkovým LT kapalným médiem pH 6,8 (92 ml LT kapaliny, ke které se přidá 5 ml 40% glukózy, 0,45 ml 1 Μ KOH a 2,5 ml Pipes (1,4-piperaz.in-bis-ethansulfonová kyselina), pH 6,8)). Kapalné kultury se pěstují 16 až 18 hodin přes noc při teplotě 30 °C. Alikvoty z těchto kultur se potom zředí v LT prostředí, obsahující 4U/ml adenosin deaminázy (typ VI nebo VII z telecí střevní mukózy, Sigma) a získá se OD₆oo = 0,15 (1,5 x 10⁶ buněk/ml) v případě CY8362 (A2aR) a OD₆₀₀ - 0,50 (5 x 10⁶ buněk/ml) v případě CY12660 (AIR).

Zkoušky se provádějí s konečným objemem 100 μΐ v 96 jamkových mikrotitračních plotnách, tak že se dosáhne v každé jamce finální koncentrace 2 % DMSO. Pro primární pozorování se použijí 1 až 2 koncentrace testovaných sloučenin (10 μΜ, 1 μΜ). K získání profilu o sloučenině se zkouší 8 koncentrací (10000, 1000, 500, 100, 50, 10, 1 a 0,1 nM). Do každé „kontrolní“ („control“) jamky a „celkové“ („total“) jamky se přidá 10 μΐ 20% DMSO, zatímco do „neznámých“ („unknown“) jamek se přidá 10 μί testované sloučeniny. Potom se přidá do každé „celkové“ jamky a „zkušební“ jamky 10 μΐ NECA (5 μΜ pro AIR, 1 μΜ pro A2R); 10 μΐ PBS se přidá do „kontrolních“ jamek. Nakonec se přidá do všech jamek 80 μί kvasinkového kmene,

CY8362 nebo CY 12660. Všechny plotny se krátce protřepou (2 až 3 minuty, orbitální třepačka

LabLine) a nechají se inkubovat 4 hodiny při 30 °C v sušárně.

Aktivita β-galaktosidázy se může stanovit za použití kolorimetrického (například ONPG, CPRG), luminescentního (například Galacton-Star) nebo fluorometrického (například FDG,

Resorufin) substrátu. Obvykle se používá íluorescentní signál, který je výhodný vzhledem k vynikajícímu poměru signákšum, relativně nízké interference a nízkým nákladům. Do každé jamky se přidá 20 μΙ/jamku (finální koncentrace = 80 μί) fluorescein digalaktopyranosidu (FDG, Molecular Probes nebo Markér Gene Technologies), fluorescentní β-galaktosidázový nosič. Plotny se třepou 5 až 6 vteřin (orbitální třepačka LabLine) a potom se inkubují při 37 °C po dobu

-55CZ 302486 B6 minut (inkubátor 95 % O₂/5 % CO₂). Ke konci 90 minutové inkubační periody se aktivita β-galaktosidázy zastaví za použití 20 μΙ/jamku 1 M Na₂CO₃ a plotny se třepou 5 až 6 vteřin. Plotny se potom třepou 6 vteřin a za použití ťlurometru (Tecan Spectraťluor; excitace = 485 nm, emise = 535 nm) se stanoví relativní intenzita fluorescence.

Výpočet: Relativní fluorescenční hodnoty pro „kontrolní“ jamky se vyhodnocují jako pozadí a odečítají se z „celkových“ a „neznámých“ hodnot. Profily sloučenin se analyzují logaritmickou transformací (osa x: koncentrace sloučeniny), následovanou proložením křivky k výpočtu hodnot IC₅₀ (GraphPad Přisni).

Kvasinkový kmen. Byly vyvinuty kmeny Saccharomyces cerevisiae CY12660 [farl * 1442 tbt 1-fusi-H1S3 can 1 ste!4;:trpl::LYS2 ste3*1156 gpal (41)-Gai3 lys2 ura3 leu2 trpl:his3; LEU2 PGKp-MfctlLeader-hAlR-PHO5term 2mu-orig REP3 Ampr] a CY8362 [gpal prGasElOK farl*1442 tbt—1 fusl-HlS3 canl stepl4::trpl:LYS2 ste3*1156 lys2 ura3 leu2 trpí his3; LEU2 PGKp-hA2aR 2mu-ori REP3 Amprj.

LT prostředí: LT (obohacené Leu-Trp) prostředí se skládá ze 100 g DIFCO kvasinkového dusíkatého základu, obohaceného následujícími složkami: 1,0 g valinu, 1,0 g kyseliny aspartové, 0,75 g fenylalaninu, 0,9 g lysinu, 0,45 g tyrosinu, 0,45 g isoleucinu, 0,3 g methioninu, 0,6 g ío adeninu, 0,4 g uracilu, 0,3 g šeřinu, 0,3 g prolinu, 0,3 g cysteinu, 0,3 g argininu, 0,9 g histidinu a 1,0 gthreoninu.

Konstrukce kvasinkových kmenů exprimujících lidský adenosinový receptor A1

V tomto příkladu se popisuje konstrukce kvasinkových kmenů exprimujících lidský adenosinový receptor A1 funkčně integrovaných do dráhy kvasinkového feromonového systému.

I. Konstrukce expresního vektoru

Ke konstrukci kvasinkového expresního vektoru pro lidský adenosinový receptor Al se získá cDNA adenosinového receptorů Al reverzní transkriptázou PCR lidské mRNA z hipoccampu za použití označených primérů založených na publikované sekvenci lidského adenosinového receptoru Al a standardních technikách. PCR produkt se subklonuje do míst jVcoI aXbal kvasinkového expresního plasmidu pMPI5.

Plasmid pMP 15 se vytvoří z pLPX následovně: Místo Xbal YEP51 (Broach, J. R. a kol. (1983); „Vectors for high-level inducible expression of cloned genes Ín yeast“ str. 83 až 117 v M. Inouye (vyd.), Experimental manipulation of gene Expression. Academie Press, New York) se eliminuje digescí, vyplněním konce a religací se vytvoří Yep51/VcoDA2>a. Další místo Xbal se vytvoří v místě ZtomHI digescí s/to/wHI, vyplněním konce linkerovou (New England Bíolabs, # 1801) ligací, digescí Xbol a religací se vytvoří YEP51 NcoXt. Tento plasmid se digestuje s Esp31 a Atol a liguje se do Leu2 a PGKp fragmentů vytvořených pomocí PCR. 2 kb Leu2 PCR produkt se generuje zesílením zYEP51Aco použitím primérů obsahujících místa £sp31 a BglU. 660 základní párový produkt PGKp PCR se generuje zesílením z pPGKas (Kang, Y. S. a kol. (1990)

Mol. Cell. Biol·. 10. 2582 až 2590) s PCR priméry obsahující místa Bg/II a Ncol. Vzniklý plasmid se nazývá pLPXt. pLPXt se modifikuje vložením kódujícího regionu a-faktorového pre-pro lídru do místa Nco\. Prepro lídr se vloží tak, že Nco\ klonující místo se udržuje v 3' konci lídru, ale neregeneruje se v 5' konci. Takto mohou být receptory klonovány digescí plasmidu s/Veol aJfíial. Vzniklý plasmid se nazývá pMP15.

Vzniklý plasmid pMP15, do kterého se vloží lidský Al adenosinový receptor cDNA se označí p5095. V tomto vektoru je cDNA receptor kondenzován ke konci 3' kvasinkového a-faktorového prepro lídru. Během proteinového zrání se prepro peptidové sekvence štěpí za vzniku zralého receptorů plné délky. K tomu dochází během zpracování receptorů kvasinkovou sekrecí. Tento plasmid se udržuje Leu selekcí (tj. růstem v prostředí s nedostatkem leucinu). Sekvence

-56CZ 302486 B6 klonovaného kódujícího regionu byly stanoveny a nalezeny jako ekvivalentní ktěm, které jsou publikovány v literatuře (Gen Bank, přírůstkové číslo S45235 a S56143).

II. Konstrukce kvasinkového kmene

K vytvoření kvasinkového kmene exprimujícíno lidsky adenosinový receptor Aí se použije jako výchozí rodičovský kmen kvasinkový kmen CY7967. Genotyp CY7967 je následující: MATa gpaD1163 gpal(41)Gai3 far 1 Dl442 tbt-1 FUS1-H1S3 canl stel4::trpl;:LYS2 ste3D1156 lys2 ura3 leu2 trp! his3 io

Přehled genetických zkratek je uveden dále:

MATa....................Mating typu a (pářící typ a) gpalD1163...........Endogenní kvasinkový G-protein GPA1 byl vymazán gpal(41)Gai3.......gpal (41)—Gai3 byl integrován do kvasinkového genomu. Tento chimérní Ga protein se skládá z prvních 41 aminokyselin endogenní kvasinkové Ga subjednotky GPA1 kondenzované k savčímu G-proteinu Gai3, ve kterém byly příbuzné N-terminální aminokyseliny vymazány.

Dl442.................. gen FAR1 (zodpovědný za buněčnou cyklickou zástavu) byl vymazán (tím se zabrání buněčné cyklické zástavě po aktivaci na feromonu závislé dráhy). tbtl....................... kmen s vysokou transformační účinností elektroporací.

FUS1-11IS3.......... spojení mezi promotérem FUSI1 a kódujícím regionem HIS3 (tím se vytváří feromonem indukovatelný HIS3 gen). canl..................... permeáza arginin/canavinin.

ste!4::trp::LYS2.. genové přerušení STEM, C-famesyl methyltransferázy (tím dojde ke snížení bazální signalizace feromonovou cestou).

ste3D1156.......... endogenní kvasinka STR, a faktor feromonového receptoru (STE3) byl přerušen.

Iys2...................... porucha v 2-aminoadipát reduktáze, kvasinka potřebuje k růstu lysin, ura3.................... porucha v omitidin-5-fosfát dekarboxyláze, kvasinka potřebuje k růstu uráčil.

Ieu2..................... porucha v b-isopropylmalonát dehydrogenáze, kvasinka potřebuje k růstu leucin.

trpí..................... porucha ve fosforibosylantranilátu, kvasinka potřebuje k růstu tryptofan.

his3..................... porucha v imidazolglycerolfosfát dehydrogenáze, kvasinka potřebuje k růstu histidin.

Do kmene CY7967 byly transformovány elektroporací dva plasmidy: plasmid p5095 (kódující lidský adenosinový receptor Al; popsaný shora) a plasmid 154, který je EUSl-(3-galaktosidázo40 vý reporterový genový plasmid. Plasmid pl584 je odvozen od plasmidu pRS426 (Christianson, T. W: a kol. (1992) Gene 110: 1119 až 1122). Plasmid pRS426 obsahuje polylinkerové místo v nukleosidech 2004 až 2016. Do ohraničených míst Eag\aXHO\ se k vytvoření plasmidu p 1584 vloží spojení mezi promotorem FUSI a β-galaktosidázovým genem. Plasmid 1584 se udržuje Trp selekcí (tj. růstem v médiu s nedostatkem tryptofanu).

Výsledný kmen nesoucí p5095 a pl584, uváděný jako Y12660 exprimuje lidský Al adenosinový receptor. K růstu tohoto kmenu v kapalných nebo agarových plotnách se použije minimální množství média s nedostatkem leucinu a tryptofanu. K provedení růstové zkoušky na plotnách (zkoušení FUS1-HIS3) se použijí plotny při pH 6,8 a obsahující 0,5-2,5 nM 3-amino-1,2,450 triazolu a s nedostatkem leucinu, tryptofanu a histidinu. Jako kontrola na specifičnost se provede ve všech experimentech porovnání s jedním nebo více jinými na kvasinkách založenými sedmi transmemhranovými receptory.

-57CZ 302486 B6

Konstrukce kvasinkových kmenů exprimuj ících lidský adenosinový receptor A2a

V tomto příkladu se popisuje konstrukce kvasinkových kmenů exprimuj ících lidský adenosinový receptor A2a funkčně integrovaný do dráhy kvasinkového feromonového systému.

I. Konstrukce expresního vektoru

Ke konstrukci kvasinkového expresního vektoru pro lidský adenosinový receptor A2a se použila io cDNA lidského A2a receptoru získaná od Dr. Phil Murphyho (NIH). Po obdržení tohoto klonu se insert A2a receptoru sekvencuje a bylo nalezeno, že je shodný s publikovanou sekvencí (GenBank, přírůstkové číslo # S46950). Receptorová cDNA se excitovala z plasmidu pomocí PCR s VENT polymerázou a klonovala se do plasmidu pLPBX, který řídí exprimaci receptoru vytvořením promotoru fosfoglycerát kinázy (PGK) v kvasinkách. Sekvence vstupního insertu se is opět sekvencovala a bylo zjištěno, že je shodná s publikovanou sekvencí. Nicméně, na základě použité strategie klonování byly tři aminokyseliny GlySerVal. připojeny ke karboxylovému konci receptoru.

II. Konstrukce kvasinkového kmene

K vytvoření kvasinkového kmene exprimuj ícího lidský adenosinový receptor A2a se použije jako rodičovský kmen kvasinkový kmen CY8342. Genotyp CY8342 je následující:

MATa far 1 Dl 442 tbl 11 lys2 ura3 leu2 trpí his3 fusl-HIS3 canl ste3D1156 gpaD1163 ste 14:;rtpl;:LYS2 ypalp Kl„E10K (nbo gpalp-rG_a,D229S nebo gpalp-rG_axE10K^D229S)

Genetické značky jsou shodné jakje popsáno v příkladu 1, kromě variace G-proteinu. Pro expresi lidského receptoru A2a se použijí kvasinkové kmeny, ve kterých byl endogenní kvasinkový G protein GPAl vyškrtnut a nahrazen savčím G_(1S. Použijí se tri krysí mutanty G_as. Tyto varianty obsahují jedno nebo dvoubodové mutace, které je konverují do proteinů, které kopulují účinně do kvasinek βγ. Jsou identifikovány jako G_asE10K (kde je kyselina glutamová v poloze deset nahrazena lysinem), G_asD229S (kde je aspartová kyselina v poloze 229 nahrazena serinem) a G_usEJ0K4-D229S (obsahující obě bodové mutace).

Kmen CY8342 (nesoucí jeden ze tří mutantních krysích G_as proteinů) se transformoval s buď rodičovským vektorem pLPBX (Receptor“), nebo s pLPBX-A2a (Receptor*). Potom se přidal plasmid s promotorem FUSI připojeným k β-gal aktosídázové kódující sekvenci (popsané shora), aby se posoudila velikost aktivace na feromonu závislé dráhy.

Funkční zkouška používají kvasinkového kmeny exprimující lidský adenosinový receptor A1

V tomto příkladu je popsán průběh funkční zkoušky u kvasinek pro modulátory lidského adenosinového receptoru Al.

í. Ligandy použité při zkoušce

Pro tuto zkoušku se použijí adenosin, přírodní agonist pro tento receptor a rovněž dva další syntetické agonisty. V podsouboru pokusů se použije adenosin, o kterém se uvádí, že má EC₅₀ přibližně 75 nM a (-)-N6-(2-fenylisopropyl)-adenosin, (PIA) s uváděnou afinitou okolo 50 nM.

Ve všech růstových zkouškách se použije 5' N-ethylkarboxamidoadenosin (NECA). Aby se zabránilo signalizaci v důsledku přítomnosti adenosinu v růstovém médiu, přidá se ke všem zkouškám adenosin deamináza (4LÍ/ml).

-58CZ 302486 B6

II. Biologická odezva v kvasinkách

Schopnost adenosínového receptoru Al funkčně se kopulovat v heterologním kvasinkovém systému se zkoumala zavedením Al receptorového expresního vektoru (p5095, popsaný shora) s do série kvasinkových kmenů, které exprimovaly různé G proteinové podjednotky. Většina z těchto transformantů exprimovaía podjednotky G_a suhtvpu G~, nebo G_7C. Další G_a proteiny se rovněž testovaly na možnou identifikaci různorodého kopulování receptor-<j_a protein. V různých kmenech byl integrován do genomu kvasinek STE18 nebo chimémí STE18-G konstrukt.

Kvasinkového kmeny přechovávaly porušený gen H1S3 a integrovaná matrice FUS1-HIS3 tím io umožňovala selekci v selektivním médiu obsahujícím 3-amino-l,2,4-triazol (testovaný pri 0,2,

0,5 a 1,0 nM) a postrádajících histidin. Transformanty se izolovaly a monovrstvy se připravily v médiu obsahujícím 3-amino-l,2,4-triazol, 3U/ml adenosindeaminázy a postrádající histidin. Potom se aplikovalo 5 μΐ ligandu při různých koncentracích (například NECA při 0, 0,1, 1,0 a 10 mM). Po dobu 2 dnů se sledoval růst. Růstové odezvy závislé na ligandu se testovaly tímto is způsobem u různých kvasinkových kmenů. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 1 dále. Symbol (-) indikuje, že nebyla detekována aktivace receptoru závislá na ligandu, zatímco (+) znamená odezvu závislou na ligandu. Výraz „LIRMA“ indikuje aktivaci zprostředkovanou receptářem nezávislým na ligandu.

-59CZ 302486 B6

Tabulka 3

Kvasinkový kmen podjednotka Ga podjednotka Gy Varianty kmene Výsledek

	------ —	í
CY13Í6	GPA1	~ SŤĚÍ8~”		-
1* ' f . . 1	GPA4I-Gai) _T	i		-+-
i—...... 1 1.	GPA41-Gtt(2 j	T	1	4·
'...... f	GPA41-Gai3‘ |	i		4-
—	GPA41-Gíi2-GaoB	l l		LIRMA
GPA4l-GaSE10K			-
	GPA41-GOS0229S	j
7 Integrovaný TTg
1	1
ČY2120 i	GPA1	P STE18	sst2A	+
	GPA4l-Gai,			i + 1
	GPA4Í-Gej2			4-
	GPA41-Gai3	!		4-
	GPA41-GairGaoa			’ LIRMA
	GPA41-GaS£ioK	I I I	[ 1 i	t
	GPA41-GasQ229S	I j	1 c
			i
CY9438	GPA1	STE18-Gy2		•
1 '	GPA41-Gaii			i +
	GPA41-Gaí2			+
	GPA4'í-Ge0	I		+ '
i I	GPÁ41 -G,i2-GaoB			LIRMA
i	GPA41-GoseioK	1--		i
	GPA41 -G(xSD229S			-
j				1
: ČY 10560 1	1 GPA1-integrovaný	STE18-Gy2	sst2A	++

Jak vyplývá z tabulky 3, k nejvýraznější signalizaci dochází u kvasinkového kmene exprimují5 čího chiméru GPA 1(41)- G_ai3.

III. Zkouškafusl-CacZ

Za účelem podrobnější charakterizace aktivace dráhy odezvy na feromon se měřila syntéza io β-galaktosidázy prostřednictvím fusJC&cZ v odezvě na agonistovou stimulaci. K provedení β-galaktosidázové zkoušky se přidají zvyšující se koncentrace ligandu do středního logaritmu

-60CZ 302486 36 kultury lidského adenosinového receptorů Al exprimovaného v kvasinkovém kmenu, ko-exprimujícího chiméru Ste 18-Gy2 a GPA4i~G_ai3. Transformanty se izolovaly a nechaly se růst přes noc v přítomnosti histidinu a 4 IJ/ml adenosin deaminázy, Po 5 hodinách inkubace s 4 U/ml adenosin deaminázy a ligandů se měří indukce β-galaktosidázy za použití CPRG jako substrátu pro β-galaktosid. Na zkoušku se použije 5 x ÍO³ buněk.

Výsledky získané stimulací NECA indikovaly, že při koncentraci NECA 10 ⁸ M se dosáhne přibližně dvojnásobné aktivity β-galaktosidázy. Přibližně 10-násobný stimulační index byl pozorován při koncentraci NECA 10“⁵ M.

Využití této zkoušky bylo rozšířeno validací aktivity antagonistů na tento kmen. Za účelem zjištění schopnosti obstát proti NECA (v 5 mM) v aktivitě v β-galaktosidázové zkoušce, byly testovány dva známé adenosínové antagonisty, XAC a DPCPX, Při této zkoušce se měřila indukce β-galaktosidázy za použití FDG jako substrátu a 1,6 χ 10⁵ buněk na zkoušku. Výsledky indikovaly, že jak XAC, tak DPCPX sloužily jako silné antagonisty kvasinkami exprimovaného adenosinového receptorů Al s hodnotami IC_S0 44 nM, respektive 49 nM.

Za účelem stanovení, zda tento inhibiční účinek byl specifický k subtypu Al se provedla série doplňkových experimentů za použití zkoušky založené na kvasinkách a receptorů A2a (popsáno v příkladu 4). Výsledky získané v této zkoušce ukázaly, že XAC by! relativně účinný antagonist receptorů A2a, konzistentní s publikovanými zprávami. Naproti tomu DPCPX byl relativně inertní k tomuto receptorů, jak bylo očekáváno na základě publikovaných zpráv.

IV. Vazba radioligandu

Zkouška na adenosinový receptor Al se dále charakterizuje měřením parametrů receptorové radioligandové vazby. Analyzovalo se přemístění vazby [³H]CPX některými adenosinový mi referenčními sloučeninami, XAC, DPCPX a CGS za použití membrán připravených z kvasinek exprimujících lidský adenosinový receptor Al. Ke zkoumání specifičnosti vazby byly porovnány výsledky s kvasinkovými membránami exprimující lidský adenosinový receptor Al s výsledky s kvasinkovými membránami exprimujícími lidský adenosinový receptor A2a nebo lidský receptor A3. Při zkoušce se inkubuje 40 mg membrán s 0,4 nM [³H]CPX a při zvyšující se koncentraci adenosinových receptářových ligandů. Inkubace se provedla v 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 1 mM EDTA, 10 mM MgCl₂, 0,25% BSA a 2 U/ml adenosin deaminázy v přítomnosti inhibitorů proteázy po dobu 60 minut a při teplotě místnosti. Vázání se zakončilo přidáním ledem chlazené 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 plus 10 mM MgCl₂, následováno rychlou filtrací přes GF/B filtry předem namočené s 0,5% polyethyleniminem, za použití Packardova 96-jamkového sběrače. Data se analyzovala nelineární metodou nej menších čtverců za použití software Prism 2.01. Hodnoty IC₅₀ získané v tomto pokusu jsou shrnuty v tabulce 4, dále:

-61 CZ 302486 B6

Tabulka 4

		IC50 fnM}
Sloučenina	hAIR	hA2aR	hA3R
XAC	6,6	11,7	53,1
DPCPX	8,5	326,4	1307,0
CGS-15943	13,1	15,8	55,5
NECA	215,5	294,9	34,9
R-PIA	67,6	678,1	23,6
IB-MECA	727,7	859,4	3,1
Alíoxozin	1072,0	1934,0	8216,0

Tato data indikují, že referenční sloučeniny mají afinity konzistentní s hodnotami uváděnými v literatuře. Data dále indikují, že zkoušky založené na kvasinkách jsou dostatečně citlivé k rozlišení receptorového subtypu.

Funkční zkouška využívající kvasinkové kmeny exprimující lidský adenosinový receptor A2a ίο V tomto příkladu je popsán průběh funkční zkoušky u kvasinek pro modulátory lidského adenosinového receptoru Al.

I. Ligandy použité při zkoušce

Přírodní adenosinový ligand a rovněž další zcela charakterizované a komerčně dostupné ligandy se použily ke studiu lidského receptoru A2 funkčně exprimovaném v kvasinkách. V rámci této zkoušky se použily tři ligandy. Tyto ligandy zahrnují:

Ligand	Uvedená Ki	Funkce
Adenosin	500 nM	agonist
5 '-N-ethylkarboxamidoadenosin	10 až 15 nM	agonist
(NECA)
(-)-N 6-( 2-fe ny 1 i sopropy 1 }-adenosi n	100 až 125 nM	agonist

(PIA)

Aby se zabránilo signalizaci v důsledku přítomnosti adenosinu v růstovém médiu, přidá se ke všem zkouškám adenosin deamináza (4U/ml).

3ϋ II. Biologická odezva v kvasinkách

A2a receptorové agonisty se testovaly na kapacitu stimulovat dráhu feromonového odezvy v kvasinkách transformovaných s A2a receptorovým expresním plasmidem a exprimující buď GoJElOK, G_asD229S, nebo G_asE10K+D229S. Schopnost ligandu stimulovat dráhu feromonové odezvy způsobem závislým na receptoru se indikovala obměnou v kvasinkové fenotypu. Aktivace receptoru modifikovala fenotyp z histidinové auxotrofie na histidinovou petrotrofie (aktivace fusl--flIS3). Byly izolovány tři nezávislé transformanty a byly pěstovány přes noc v přítomnosti histidinu. Buňky byly promyty k odstranění histidinu a zředěny 2 x 10⁶ buněk/ml. 5 μΐ každého transformantu bylo přeneseno do neselektivního média (zahrnují histidin) nebo selektivního

-62CZ 302486 B6 média (1 mM AT) v nepřítomnosti nebo v přítomnosti 4 U/ml adenosin deaminázy. Plotny se nechaly růst při 30 °C po dobu 24 hodin. V přítomnosti histidinu byly oba kmeny obsahující receptor' (R*) a receptor“ (R^_) schopné růstu. Avšak v nepřítomnosti histidinu mohly růst nouze buňky R⁺. Jelikož nebyl přidán k těmto plotnám žádný ligand, jsou možné k vysvětlení tohoto výsledku dvě možnosti. Jedna možná interpretace spočívá v tom, že receptor nesoucí kvasinky měl výhodu v růstu v dúsieaku aktivace zprostředkované receptorem nezávislým na iigandu (LIRMA). Alternativně, kvasinky by mohly syntetizovat adenosinový ligand. K odlišení těchto dvou možností se přidal ke kultivovaným kvasinkám a plotnám enzym, který odbourává ligand, adenosin deaminázu (ADA). V přítomnosti adenosin deaminázy ff buňky dále nerostou io v nepřítomnosti histidinu, což indikuje, že kvasinky byly skutečně syntetizující ligand.

Tato interpretace byla potvrzena A2a kultivační zkouškou v kapalině. Při tomto pokusu byly kvasinky R (G_as El OK kmen exprimující receptor 2A) očkovány ve třech hustotách (1 x 10⁶ buněk/ml; 3 χ 10⁵ buněk/ml; nebo lx 10⁵ buněk/ml) v přítomnosti nebo nepřítomnosti is adenosin deaminázy (4 U/ml). Přesnost zkoušky byla zvýšena se zvyšující se koncentrací (0, 0,1,

0,2 nebo 0,4 mM) 3-amino-l ,2,4-triazolu (AT), kompetitivního antagonistu imidazolglycerol-P dehydratázy, proteinového produktu genu HIS3. V přítomnosti adenosin deaminázy a 3-amino1,2,4-triazolu kvasinky kultivují méně intenzivně. Nicméně, v nepřítomnosti 3-amíno-l,2,4-triazo lu má adenosin deamináza malý účinek. Tak samotná adenosin deamináza nemá žádný přímý

2u účinek na dráhu feromonové odezvy.

Alternativní způsob měření kultivace a způsob, který může být miniaturizován pro velké množství vzorkuje kapková zkouška na ligand receptoru A2a. Kmen G_asE10K exprimující A2a receptor (A2aR‘) nebo postrádající receptor (R“) se kultivoval přes noc v přítomnosti histidinu a4U/ml adenosin deaminázy. Buňky se promyly k odstranění histidinu a zředily se 5 x

10⁶ buněk/ml. 1 χ 10⁶ buněk bylo naneseno do selektivních ploten obsahujících 4 U/ml adenosin deaminázy a 0,5 nebo 1,0 mM 3-amino-l ,2,4-triazolu (AT) a nechaly se sušit po dobu 1 hodiny. Do monovrstvy se aplikovalo 5 μΐ následujících reakčních složek: lOmM adenosin, 38,7 mM histidin, dimethylsulfoxíd (DMSO), 10 mM PIA nebo 10 mM NECA. Buňky se kultivovaly

24 hodin při 30 °C. Výsledky ukázaly, že buňky bez receptoru mohly růst pouze když byl do média přidán histidin. Naproti tomu buňky R rostly pouze v oblastech, kde byly A2a receptorové ligandy PIA a NECA zjištěny. Jelikož plotny obsahovaly adenosin deaminázu, nedostatek kultivace v místech, kde byl zjištěn adenosin potvrzuje, že adenosin deamináza byla aktivní.

III. Zkouška/«s/ LacZ

Ke stanovení aktivace cesty spojování kvasinek se měří syntéza β-galaktosidázy přes fusi LacZ. Kvasinkové kmeny exprimující G_asElOK, G,_íSD229S nebo G«_sE10K+D229S se transformovaly plasmidem kódujícím lidský A2a receptor (R⁺) nebo splasmidem postrádající receptor (R). Transformanty byly izolovány a kultivovány přes noc v přítomnosti histidinu a 4 U/ml adenosin deaminázy. 1 χ 10⁷ buněk bylo zředěno na 1 χ 10⁶ buněk/ml a bylo vystaveno zvyšujícím se koncentracím NECA po dobu 4 hodin a poté následovalo stanovení aktivity β-galaktosidázy v buňkách. Výsledky ukázaly, že nebyla stanovena v podstatě žádná aktivita β-galaktosidázy v kmenech R“, zatímco zvyšující se množství aktivity β-galaktosidázy bylo stanoveno v R⁺ kmenech exprimujících buď G_asE10K, G_asD229S, nebo G_asElOK+D229S se zvyšující se koncentrací NECA, indikujíce na dávce závislé zvýšení v jednotkách β-galaktosidázy detekované v odezvě na vystavení zvýšené koncentraci ligandy. Tato závislost na dávce byla pozorována pouze u buněk exprimujících receptor A2a, Dále, nejsilnější G_as konstrukt pro receptor A2a byl

G_asE10K. G_asD229S byl druhý nejsilnější konstrukt pro receptor A2a, zatímco G_asE10K+D229S konstrukt byl nejslabší ze tří zkoušených G_as konstrukt, ačkoliv konstrukt G_(ISE1Í)K’D229S stimuloval snadno detekovatelné množství aktivity β-galaktosidázy.

-63CZ 302486 B6

Další popis zkoušek se uvádí v US patentové přihlášce 09/088985 o názvu „Functional Expression of Adenosine Receptors in Yeast“, podané 2. 6. 1998 (zástupce Docket, č. CP1-093), uváděné zde jako odkaz.

s Farmakologické charakterizace subtypů lidského adenosínového receptoru Materiál a metody

Materiály. [³H]-DPCPX [Cyklopentyl-1,3-dipropylxantin, 8-[dipropyl-2,3-³H(N) (120,0 Ci/10 mmol); [’H]-CGS 21680, [karboxyethyl-H(N)] (30 Ci/mmol) a ['-⁵I]-AB-MECA (['²⁵IKAminobenzyl-5'-N-methy Ikarboxamidoadenosin) (2200 Ci/mmol) byly dodány firmou New England Nuclear (Boston, MA). XAC (Xantinový aminový congener); NECA (5'-N-Ethylkarboxamidoadenosin); a IB-MECA od firmy Research Biochemicais International (RBI, Natick, MA). Adenosindeamináza a kompletní proteázové inhibiční koktailové tablety byly dodány od firmy Boehringer Mannheim Corp. (Indianapolis, IN). Membrány z HEK-293 buňky stabilně exprimují lidský adenosin 2a [RB-HA2a]; Adenosin 2b [RB-HA2b] nebo adenosin 3 [RB-HA3] receptorové subtypy byly dodány firmou Receptor Biology (Beltsville, MD). Reakční složky buněčné kultury byly dodány firmou Life Technologies (Grand Island, NY), kromě séra, které bylo od firmy Hyclone (Logan, UT).

Kvasinkové kmeny. Saccharomyces cerevisíae kmeny CY12660 [far] 1442 tbtl-fusl-HIS3 canl stel44::trpl::LYS2 a ste3*1156 gpal(41)-Gaí3 lys2 ura3 leu2 trpl:his3; LEU2 PGKp-MfalLeader-hAlR-PHO5term 2mn-orig REP3 Ampr] a CY8362 [gpa]p-rGa sElOK farl*1442 tbt—1 fusl-HIS3 canl ste!4::trpl:LYS2 ste3*1156 lys2 ura3 leu2 trpí his3; LEU2

PGKp-hA2aR 2mu-ori REP3 Ampr] byly vyvinuty jak je popsáno shora.

Kvasinková kultura. Transformované kvasinky byly pěstovány v Leu-Trp [LT] médiu (pH 5,4) obohaceném s 2% glukózou. Pro přípravu membrán bylo 250 ml LT média očkováno výchozím titrem 1 až 2 x 10^Ď buněk/ml z 30 ml kultury a inkubovalo se pri 30 °C za stálého okysličování jo rotací. Po 16 hodinách růstu se buňky sebraly odstředěním a membrány se připravily jak je popsáno shora.

Savčí tkáňová kultura: Buňky HEK-293 stabilně exprimující lidský adenosinový receptorový subtyp 2a (Cadus cloně # 5) byly kultivovány v Dulbecově minimálním základním médiu (DMEM) doplněném 10% fetálním hovězím sérem a IX penicilin/streptomycin pri selektivním tlaku za použití 500 mg/ml antibiotika G418, při 37 °C v zvlhčené atmosféře s obsahem 5% CO₂.

Příprava kvasinkové buněčné membrány: 250 ml kultur se po celonoční inkubaci odstředí pri

2 0 00 x g v odstředivce Sorvall RT6000. Buňky se promyly ledovou vodou, odstředily se pri 4 °C a pelety se resuspendovaly vvlOml ledem chlazeného lysisového pufru [5 mM Tris-HCl, pH 7,5; 5 mM EDTA a 5 mM EGTA] obohaceného proteázovými inhibičními kokteilovými tabletami (1 tableta na 25 ml pufru). K suspenzi se přidaly skleněné kuličky (17 g; 400 až 600 mesh; Sigma) a buňky se rozrušily intenzivním mícháním při 4 °C po dobu 5 minut.

Homogenát se zředil dalšími 30 ml lysisového pufru plus proteázovými inhibitory a odstřeďovalo se při 3000 g po dobu 5 minut. Následně se membrány tabletovaly při 36000 x g (Sorvall RC5B, rotor typ SS34) po dobu 45 minut. Vzniklé membránové pelety se resuspendovaly v 5 ml membránového pufru [50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 0,6 mM EDTA; a 5 mM MgCL] obohaceném proteázovými inhibičními kokteilovými tabletami (1 tableta na 50 ml pufru) a uchovaly se pri

-80 °C pro další pokusy.

Příprava savčí buněčné membrány. Buněčné membrány se připravily jak bylo popsáno dříve (Duzic E a kol.: J. Biol. Chem., 267, 9844-9851, 1992). Stručně, buňky se promyly s PBS a sklidily se stěrkou. Buňky se peletovaly pri 4 °C pri 200 x g v odstředivce Sorvall RT6000.

Pelety se resuspendovaly v 5 ml/jamku lysisového pufru pri 4 °C (5 mM Tris-HCl, pH 7,5;

-64CZ 302486 Bó mM EDTA; 5 mM EGTA; 0,1 mM fenylmethylsulfonylfluoridu, 10 mg/ml pepsatinu A; a 10 mg/ml aprotininu) a homogenizovaly se v Dounceově homogenizéru. Buněčný lysat se odstředil při 36000x g (Sorvall RRC5B, rotor typu SS34) po dobu 45 minut a pelety se resuspendovaly v 5 ml/jamku membránového pufru [50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 0,6 mM EDTA;

5 mM MgCl₂; 0,1 mM fenylmethylsulfonylfluoridu, 10 mg/ml pepsatinu A; a 10 mg/ml aprotininu) a uchovaly se při -80 pro další pokusy.

Ke stanovení celkové koncentrace proteinu v kvasinkových a savčích membránách se použije proteinová zkušební sada Bio-Rad podle Bradforda (Bradford, M.: Anal. Biochem. 72:248 io (1976)).

Saturace adenosinového receptorů subtypu la kompetitivní vazba radioligandu

Saturace a kompetice vazby na membrány z kvasinkových buněk transformovaných lidským receptorovým subtypem Al se provedla za použití antagonistu [³H] DPCPX jako radioaktivního ligandu. Membrány se zředily vazebným pufrem [50 mM Tris-HCl, pH 7,4; obsahující 10 mM MgCl₂; 1,0 mM EDTA; 0,25% BSA; 2 U/ml adenosindeaminázy a 1 proteázovou inhibiční kokteilovou tabletu/50 ml] při koncentraci 1,0 mg/ml. Pri saturaci byly vazebné membrány (50 pg/jamku) inkubovány za zvyšující se koncentrace [³H] DPCPX (0,05-25 nM) v konečném objemu 100 μΐ vazebného pufru při 25 °C po dobu 1 hodiny v nepřítomnosti a přítomnosti 10 μΜ neznačené XAC v 96-jamkové mikrotitrační plotně.

Při kompetitici byly vazebné membrány (50 pg/jamku) inkubovány [³H] DPCPX (1,0 nM) v konečném objemu 100 ml vazebného pufru pri 25 °C po dobu 1 hodiny v nepřítomnosti a přítomnosti 10 μΜ neznačeného XAC nebo zvyšující se koncentrace kompetitivních sloučenin v 96-jamkové mikrotitrační plotně.

Kompetitivní vazba radioligandu na adenosinový receptor subtyp 2a

Kompetitice vazby na membránu z buněk HEK293 stabilně exprimujících lidský receptorový subtyp A2a se provedla za použití [³H] CGS-21680 jako radioaktivního ligandu. Vazby se zředily ve vazebném pufru [50 mM Tris-HCl, pH 7,4; obsahující 10 mM MgCl₂; 1,0 mM EDTA; 0,25% BSA; 2 U/ml adenosindeaminázy a 1 proteázovou inhibiční kokteilovou tabletu/50 ml] pri koncentraci 0,2 mg/ml. Membrány (10 pg/jamku) byly inkubovány [³H] CGS-21680 (100 nM) v konečném objemu 100 pl vazebného pufru při 25 °C po dobu 1 hodiny v nepřítomnosti a přítomnosti 50 μΜ neznačené NECA nebo za zvyšující se koncentrace kompetitivních sloučenin v 96-jamkové mikrotitrační plotně.

Kompetitivní radioligandová vazba na adenosinový receptor 3

Kompetitivní vazba na membrány z buněk HEK293 stabilně exprimujících lidský receptorový subtyp A3 se provedla za použití [¹²⁵I]AB-MECA jako radioaktivního ligandu. Membrány se zředily vazebným pufrem [50 mM Tris-HCl, pH 7,4; obsahující 10 mM MgCl₂; 1,0 mM EDTA; 0,25% BSA; 2 U/ml adenosindeaminázy a 1 proteázovou inhibiční kokteilovou tabletu/50 ml] při koncentraci 0,2 mg/ml. Membrány (10 pg/jamku) byly inkubovány [^l25I] AB-MECA (0,75 nM) v konečném objemu 100 μΐ vazebného pufru při 25 °C po dobu 1 hodiny v nepřítomnosti a přítomnosti 10 μΜ neznačeného IB-MEXA nebo za zvyšující se koncentrace kompetitivních sloučenin v 96-jamkové mikrotitrační plotně.

Ke konci inkubace se zkouška radioligandové vazby na receptorové subtypy Al, A2 a A3 zakončila přidáním ledem chlazeného 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) pufru obohaceného s 10 mM MgCl₂. Potom následovala rychlá filtrace přes filtry ze skleněných vláken (96-jamkové GF/B UniFiltry, Packard), předem namočené v 0,5% polyethylen iminu v zařízení na sběr buněk Filtermate 196 (Packard). Filtrační plotny byly za sucha povlečeny 50 μΙ/jamku scintilační

-65 CZ 302486 B6 tekutinou (MicroScint-20, Packard) a počítány v TopCount (Packard). Zkoušky se třikrát opakovaly. Nespecifická vazba ve vazebné zkoušce byla 5,6 ± 0,5 %, 10,8 ± 1,4 % a 15,1 ± 2,6 % celkové vazby v AlR, A2aR a A3R.

Kompetitivní radiolígandová vazba na adenosinový subtypový receptor 2b

Kompetitivní vazba na membrány z buněk HEK293 stabilně exprimující lidský receptorový subtyp A2b se provedla za použití Al receptorového antagonistů [³H] DPCPX jako radioaktivního ligandů. Membrány se zředily vazebným pufrem [10 mM Hepes-KOH, pH 7,4 obsahulo jící 1,0 mM EDTA; 0,1 mM benzamidinu a 2LJ/ml adenosin deaminázy] při koncentracích

0,3 mg/ml. Membrány (15 pg/jamku) se inkubovaly s [Ή] DPCPX (15 nM) v konečném objemu

100 μΙ vazebného pufru při 25 °C po dobu 1 hodiny v nepřítomnosti nebo přítomnosti ΙΟμΜ neznačeného XAC nebo zvyšujících se koncentrací kompetitivních sloučenin v 96-jamkové mikrotitrační plotně. Ke konci inkubace se zkouška zakončí přidáním ledem chlazeného 10 mM

Hepes-KOH (pH 7,4). Potom následovala rychlá filtrace přes filtry ze skleněných vláken (96-jamkové GF/B UniFiltry, Packard), předem namočené v 0,5% polyethyleniminu v zařízení na sběr buněk Filtermate 196 (Packard). Filtrační plotny byly za sucha povlečeny 50 μΙ/jamku sc int i lační tekutinou (MicroScint-20, Packard) a počítány v TopCount (Packard). Zkoušky se třikrát opakovaly. Nespecifická vazba se vazebné zkoušce byla 14,3 ± 2,3 % celkové vazby.

Specifické vazby [³H]DPCPX; [³H]CGS-21680 a [^Ι2Ί] AB-MECA se definují jako rozdíl mezi celkovou vazbou a nespecifickou vazbou. Procenta inhibice sloučenin se počítají vůči celkové vazbě. Kompetitivní data se analyzují iterativní křivkou proložením vůči jednomístnému modelu a hodnoty Kj se počítají z hodnot IC₅o (Cheng a Prusof, Biochem. Pharmacol. 22, 3099 až 3109,

1973) za použití software GraphPad Prizm. 2.01

Výsledky

Primární funkce určitých receptorů na povrchu buněk je rozpoznávat vhodné ligandy. Podle toho jo jsme určili vazebné afinity k ligandů, aby se založila funkční integrita adenosinového receptoru subtypu 1 exprimovaného v kvasinkách. Surové membrány připravené ze Sacharomyces cerevisiae transformované konstruktem lidského adenosinového receptoru 1 vykazují specifické vazby schopné nasycení [³H] DPCPX s K_D 4,0±0,19nM. Hodnoty K_D a B_max se počítají ze saturační izotermy a Scatchardovou transformací indikovaly jednu třídu vazebných míst. Hustoty adenosinových vazebných míst v kvasinkových membránových preparátech byly vypočteny na

716,8 ± 43,4 fmol/mg membránového proteinu.

Farmakologické subtypové charakteristiky rekombinantních kvasinkových buněk transformované lidským Al receptorovým subtypem byly zkoumány pomocí adenosinových ligandů (XAC,

DPCPX; CGS-15943; CDS-046142; CDS-046123; NECA (R)-P1A; IB-MECA a Alloxazin) selektivních vůči tomuto subtypu. Ty konkurovaly s [³H] DPCPX v očekávaném pořadí. Posuvné křivky zaznamenané pro tyto sloučeniny ukazují typickou strmost u všech ligandů a data každého z ligandů mohou být modelovány jednomístným proložením. Zdánlivé disociaění konstanty vypočtené z křivek (tabulka 5) jsou konzistentní s hodnotami publikovanými pro receptor získaný z ostatních zdrojů.

-66CZ 302486 B6

Tabulka 5 s Hodnoty KA pro membrány z kvasinkových buněk transformovaných lidským Aí receptorem SUuíypu Al.

Ligandy Kj (nM)

XAC	5,5
DPCPX	7,1
CGS-1594	10,8)
NECA	179,6
(R)-PIA	56,3
IB-MECA	606,5
Alloxazin	894,1
CDS-046142	13,9
CDS-046123	9,8

Tabulky 6 až 12 znázorňují účinnost a profily strukturní aktivity deazapurinu podle vynálezu. Tabulky 13 a 14 znázorňují selektivitu, která může být dosažena pro místa lidského adenosinoío vého receptorů modulací funkčních skupin na deazapurinové struktuře. Tabulka 14 rovněž znázorňuje překvapující zjištění, že sloučeniny popisované v předkládané přihlášce mají subnanomolámí aktivitu a vyšší selektivitu pro A_2b receptor ve srovnání se sloučeninami v tabulce 13.

-67CZ 302486 B6

Tabulka 6

Aktivita série CDS-046142: Vliv Νή-substituentu

		Al
Kód	R	Vazba Ki (nM)	Kvasinka IC50 (nM)
CĎS-046I42	HDO«	13,9	97,2
CDS-062365	OH	: 1423	>10.000
CDS-069533	zOH MO·™	483,5	>10.000
CDS-069534	OH HZy-011	196,6	4442,0
CDS-056176	t-o.....H- — 0	>10 000	>10000
CDS-056175	,-- H 0	>10000	>10000
CDS-062352	i-Qj-»	297,9	>10000

-68CZ 302486 B6

CDS-062351	HD	309,7	>10000
CDS-090909	-i, ίΛΙΤ ž_/ ........ ω	29.1
CDS-0909I0	KX	193,9
CDS-O9O913	X i (+) OH	411,5
CDS-062352	iOY	785,6	>10000
CDS-092474	ŇHAc Trans (S,S)	64,8
CDS-092475	vO ŇHAc Trans (R,R)	6726,0
CDS-091175	(dl)	32,1

-69CZ 302486 B6

ČDS-062351	X3 V (dl)	816,9	2577,0
CDS-090914	.....OH	34,3
	* \_i OH

Tabulka 7

Aktivita série CDS-046142: Vliv C?-substituentu

		Al
Kód	R	Vazba Ki (nM)	Kvasinka IC50 (nM)
CDS-069532	ry	604,5	>10000
CDS-090895	o	157,7	763,1

- 70CZ 302486 B6

CDS-065564	Ό	198,5	2782,5
rns.nonítQr,		* z	>wnnn
ČDS-090903		61,1	297,0
CDS-090890	CO	30,1	194,7
CDS-090915	G F	19,9
CDS-090912		62,8
CDS-090936	>-F	2145
CDS-090177	0'	48,7

-71 CZ 302486 B6

Tabulka 8

Aktivita série CDS-046142: Vliv substituentu na pyrrolovém kruhu

					Al
Kód	R	R'	R	R’	Vazba Ki (nM)	Kvasinka IC50 (nM)
CDS- Ί 078187	σ	Me	Me	Me	3311	>10000
CDS- 090905	O	H	Me	H	22,3	148.3
CDS- 090921	o*	H	H	Mc	8,9
CDS- 090902	ď	m/O	Me	Me	2210	>10000
CDŠ- 056090	cx		Me	Me	863,1
CDS- 056091	cf	M^~O	Me	Me	4512

- 72 CZ 302486 B6

CDS- 056089	O*	ΜΐΜΖ)	Me	Me	8451
CDS- 056092	úx1 1	mZ \_Z	Me	Me	35,3

Tabulka 9

		Al
Kód	R	Vazba Ki (nM)	Kvasinka IC50 (nM)
CDS- 056090	X)'	863,1
CDS- 056091	X3	4512
CDS- 056089		8451
ČDS- 056092		353

-73CZ 302486 B6

Tabulka 10

Aktivita série CDS-046123: Vliv N₍-substituentu

		Al
Kód	R	Vazba Ki(nM)	Kvasinka IC50 (nM)
CDS-062354	--NK,	1789	>10000
CDS-067146	H O	54,4	1865
CDS-046123	H 0	9,8	82;8
CDS-062357	0	26,7	195,7
CDS-062355	0	32,8	545,8

-74CZ 302486 Bó

CDS-062356	O	147,5	3972
CDS-067325	o	151,7	2918
CDS-062392	o y-^NH͔Me ' o	692,5	>10000
CDS-062393	V^NHy\y°0H	93,1	3217
CDS-062394		475,3	>10000
CDS-067227	V^-^NHAc	674,9	9376/)
CDS-065568	V^—OAc	121,9	2067,5
CDS-066956		233,9	3462
CDS-067038		270,1	3009,5
CDS-062358		384,9	2005
ČĎS-062359		179,3	3712
ČDS-062360	OH	176/	5054

-75 CZ 302486 B6

Tabulka 11

Aktivita série CDS-046123: Vliv N₍,-substituentu

		Al
Kód	R	Vazba Ki (nM)	Kvasinka IC50 (nM)
CDS-046123	0	9,8	115,4
CDS-069535	O	53,9	551,0
CDS-Ó9Ó894	NHMc Λ ¥ O	10,3	101,3
CDS-062301	V— ¥ o	71,1	3217
CDS-090904	OV1 Me O (+)	6,5	58,7
CDS-090906	(±)	105,4	472,1

-76CZ 302486 Só

CDS-090908	Me H o (1)	27,8	162,4
CDS-090907	Mc H Cí)	126,5	1297,0
CDS-092473	|^^NHAc	2,3
CDS-095450	tÁ^NHAc ** s	9,0
CDS-095451	X-\.NHAc	17,3
CDŠ-091183	J^^NHAc 4 Ξ R	2,5
CDS-091184	|A^.NHAC R	213

-77CZ 302486 B6

Tabulka 12 „Retroamidové“ analogy CDS-046123

		Al
Kód	R	Vazba | Ki (nM)	Kvasinka IC50 (nM)
CDS-065567	0	16,5	189,4
CDS-090891	o	7.4	45,7
CDSO62373	0	95,8	3345,0
CDS-090893	o	529,1	4040,0
CDS-062371	0	1060,0	>10000

-78CZ 302486 B6

CDS-062372	o o^3b~	1272	>10000
rns-nňsv.ň		ςη s
o
CDS-065565	-/x.NHMe x Y o	48,5	701,5

Tabulka 13

Profil selektivních adenosinových antagonistů

zR HN 1 Me í !L / Me Ph^N^N H	Vazba Ki (nM)
	R	Al	A2a	A2b
CDS-046123		9,8- 25,1	18,0- 48,6	80,3	513,0
CDS-090908	Me ^X^NHAc	27,8	50,7	84,6	429,8
CDS-090894	H Υ\ΥγΝΗΜ'	20,2	75,6	20,1	4,3

-79CZ 302486 B6

CDS-090891	O VxA Λ NHMe	17,4	111,3	120,6	44,6
CDS-046142	xO“	13,9- 30,9	933,7	138,0	21,5
CDS-090890*		46,6	730,9	30%	9,9
CDS-0909052	χθ	16,4	766,3	168,3	71,7
CDS-090909	7γ-.....'™ L—1 (di)	29,1	190,6	1143,0	3,1
CDS-90910		180	230	670	1,0

-80CZ 302486 Bó

CDS-l 16676	CrV	40	109	109	0.3
CDS-121180		255	76%	275	<2,6
CDS-121178	V(chj-,Am. A	531	981	736	5,3
CDS-121179	1 H	443	2965	375	<6,2
CDS-l 23264’	^(Ca>^nXíZnh? I H	30%	65%	515	24
CDS-062391	y™%A« H	87	204	30	0,02

-81 CZ 302486 B6

CDS-121181	1 H	75 000	720 000	3 400	507
CDS-I21268	0 /(CHá3x^L/NH,· I H	333	710000	710 000	97
CDS-121272		710 000	710 000	720 000	369
CDS-0963704	xO.....“	3,7+0,5	630± 56,4	2307+ 926	630±76
CDS-113760°	xO0	1,8	206	802	270
CDS-116665°	X)......0H	8,0	531	530	419
CDS-1319214·7		8,0	131	1031	54%’

^-Ihienyl; ²C5-H; ³ve vodě rozpustný;⁴ Rs a R₆jsou vodík;⁵ R3 je 3-fluorfenvl·⁶ R, ie 3 chlorfenyl; R3 je 4-pyndyl; ⁸ % aktivity @ 10 mM ^y ’ K₃ je 3

-82r*zr ^U^4oO ου

Tabulka 14

Profil selektivních A_?b antagonistů

Kód	XRi	Rz	Vazebná data Kt (nM)
A,	A2a	A2b	a3
CDS-129851	-O-Ph	Me	41,7	21	0,3	14,6
CDS-143995	-O-Ph(p)F	Me	33	58	0,01	18
“ČDS-143994	-O-Ph(p)Cl	Me	825	591	0.3	60
CDS-143988	-N-pyridin-2-on	Me	60	41	47	48
CDS-143996	-NH-Ph	Me	49	31	109	57

Odkazy

Všechny patenty, publikované patentové přihlášky a ostatní odkazy jsou zde uváděny jako odkaz.

Ekvivalenty o

Odborník pozná nebo bude schopen zjistit, za použití běžného experimentování, řadu ekvivalentů ke specifickému provedení vynálezu, které je popsané v předkládané přihlášce. Takové ekvivalenty je třeba chápat, že jsou zahrnuty do rozsahu následujících nároků.

Claims (38)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   5 I. N-ó—substituovaný 7-deazapurin mající obecný vzorec 1 (I) kde

   R, představuje atom vodíku; io

   R₂ představuje alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, který je nesubstituovaný nebo substituovaný hydroxyskupinou, karboxyskupinou, aminoskupinou, acetoxy skupinou, pyridylskupinou, nebo terc-butoxy15 karbonylskupinou;

   A -Nl!C(“())B, kde A představuje nesubstituovanou alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku a B představuje atom vodíku, alkylskupinu s I až 3 atomy uhlíku, cyklopropylskupinu, aminomethylskupinu, aminoethylskupinu, karboxyethylskupinu, aminoskupinu, methylaminoskupinu, ethyl20 aminoskupinu, acetylskupinu nebo Zerc-butyloxyskupinu;

   NH₂-CO-alkylenskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku v alky lenové části, v níž atom vodíku aminové části je popřípadě nahrazen methylskupinou nebo cyklopropylmethylskupinou;

   25 -CH₂CH₂NHSO₂CH₃; nebo cyklohexylskupinou nebo cyklopentylskupinu, přičemž tato cyklohexylskupina nebo cyklopentylskupina je popřípadě substituována hydroxyskupinou, acetylaminoskupinou, methylsulfonylaminoskupinou, benzoyloxyskupinou, 2-aminoacetoxyskupinou, 2-aminomethylacetyl30 aminoskupinou nebo 2-N-te/^,c-butyloxyacylaminoacetoxyskupinou; nebo

   R₍ a R₂, spolu s atomem dusíku, k němuž jsou připojeny, tvoří pyrrolidinylskupinu nebo 3-acetylaminopiperidinový kruh,

   35 přičemž uvedená pyrrolidinylskupina je nesubstituovaná nebo substituovaná jedním nebo více substituenty zvolenými ze souboru sestávajícího z hydroxyskupiny, aminoskupiny, thiolové skupiny, karboxyskupiny, halogenu nebo skupiny vzorce -CH?OH, -C(-O)NH₂, -CH₂NHC(-O)alkyl a -CH₂NHC(=O)NHalkyl;

   40 R₃ představuje fenylskupinu, pyridylskupinu, furylskupinu nebo thienylskupinu, přičemž uvedená fenylskupina je nesubstituovaná nebo substituovaná jedním nebo více substituenty zvolenými ze souboru sestávajícího z hydroxyskupiny, methoxy skupiny, methyl skupiny a halogenu;

   -84CZ 302486 Bč

   R₄ představuje atom vodíku;

   R₅ představuje atom vodíku nebo methylskupinu, přičemž uvedená methylskupina je nesubstituovaná nebo substituovaná hydroxyskupinou, zbytkem karboxylové kyseíiny, který je popřípadě substituován fenoxyskupinou, 4-fiuorfenoxyskupinou, 4-chlorfenoxyskupinou, 4-methoxy fenoxy skupi nou, pyridin-2-on-l-ylskupinou, pyridin-2-oxy skupinou, feny lam inoskupinou nebo N-methylfenylaminoskupinou,

   Rů představuje atom vodíku nebo methylskupinu;

   nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl.
2. 2. Deazapurin obecného vzorce I podle nároku 1, kde R₂ představuje cyklohexylskupinu nebo cyklopentyiskupinu, přičemž tato cyklohexylskupina nebo cyklopenty (skupina je popřípadě substituována hydroxyskupinou, acetylaminoskupinou, methylsulfonylaminoskupinou, benzoyloxyskupinou, 2-aminoacetoxyskupinou, 2-am inomethylacety lam inoskupinou nebo 2-N-Zercbutyloxyacylaminoacetoxyskupinou; nebo R] a R₂, spolu s atomem dusíku, k němuž jsou připojeny, tvoří 3-acetylaminopiperidylový kruh.
3. 3. Deazapurin obecného vzorce I podle nároku 2, kde R₃ představuje fenylskupinu, která je popřípadě substituovaná halogenem a R₅ a R$ představují methylskupiny.
4. 4. Deazapurin obecného vzorce I podle nároku 2, kde skupina R₂ je substituována jednou nebo dvěma hydroxyskupinami.
5. 5. Deazapurin obecného vzorce I podle nároku 4, kde R₂ představuje monohydroxycyklopenty lskupinu.
6. 6. Deazapurin obecného vzorce I podle nároku 4, kde R₂ představuje monohydroxycyklohexylskupinu.
7. 7. Deazapurin obecného vzorce I podle nároku 2, kde Rj a R₂, spolu s atomem dusíku, k němuž jsou připojeny, tvoří 3-acetylaminopiperidinový kruh.
8. 8. Deazapurin obecného vzorce I podle nároku 1, kde R| a R₂, spolu s atomem dusíku, k němuž jsou připojeny, tvoří pyrrolidínylový kruh, přičemž uvedený pyrrolidinylový kruh je nesubstituovaný nebo substituovaný jedním nebo více substituenty zvolenými ze souboru sestávajícího z hydroxyskupiny, aminoskupiny, thiolové skupiny, karboxyskupiny, halogenu nebo skupiny vzorce -<H₂OH, -C(=O)NH₂, -CH₂NHC(-O)alkyi a -CH₂NHC(=O)NHalkyl.
9. 9. Deazapurin obecného vzorce I podle nároku 1, kde R₂ představuje skupinu vzorce -A-NHC(=O)B, kde A znamená nesubstituovanou alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku a B představuje atom vodíku, alkylskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, cyklopropylskupinu, aminoethylskupinu, karboxyethylskupinu, aminoskupinu, methylaminoskupinu, ethylaminoskupinu, acetylskupinu nebo fórc-buty loxy skupinu.
10. 10. Deazapurin obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 6 až 9, kde R₃ představuje pyridylskupinu nebo nesubstituovanou fenylskupinu.
11. 11. Deazapurin podle nároku 1, kterým je některá z následujících sloučenin

    4-(c/s-3-hydroxy cyklopenty l)amino-5,6-dimethy 1-2-feny l-7//-pyrTolo[2,3-</]-pyri m id i n,

    -85CZ 302486 B6 sul trifluoracetátové kyseliny 44m-3-(2-aminoaceto\y)cyklopentyl)-amino-5,6-dimethyl-2feny 17//-pyrrolo|2,3tZ|—py rím idinu,

    4-(3-acetamído)piperidinyl-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3ť/]-pyrÍmidin, s

    4-(2-N -methylureapropyl)amino-5,6-dimethy 1-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3í/]-pyrimidin, 4-í2-aeetamidobutyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3t/]-pyrimidÍn,

    10 4-(2-N'-methylureidobutyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3í/]-pyrimidin,

    4-{2-aminocyklopropylacetamidoethyl)amino-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3ť/]-pyrimidÍn,

    4--{trans--4-hydroxycyklohexyl)amino-2-(3-chlorfenyl)-7//-pyrrolo[2,3</|-pyrimidin,

    4-(/ra^-4-hydroxycyklohexyl)amino-2-(3-fluorfenyl)-77/-pyrrolo[2,3J|-pyrimidÍn, a 4-(trans-~4-hydroxycyklohexyl)am i no-2-(4-pyridy 1)-7//-py rro lo[2,3tZ]-pyrim idin

    20 nebo její farmaceuticky vhodná sůl.
12. 12. Deazapurin obecného vzorce II kde

    X představuje N nebo CR₆;

    Ri představuje atom vodíku;

    30 Rj představuje 2-acetylaminoethylskupinu nebo 2-N'-methylmočovinoethylskupinu;

    R₃ představuje fenylskupinu, která je nesubstituovaná nebo substituovaná jedním nebo více substituenty zvolenými ze souboru sestávajícího z hydroxyskupiny, methoxyskupiny, methy lskupiny a halogenu;

    R₄ představuje atom vodíku;

    L představuje atom vodíku;

    40 R₆ představuje atom vodíku, nesubstituovanou alkylskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku nebo halogen;

    Q představuje CH₂, O, S, nebo NR₇, kde R₇ znamená atom vodíku nebo nesubstituovanou alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku; a

    - 86CZ 302486 B6

    W představuje ne substituovanou fenylskupinu nebo fenylskupinu substituovanou jedním nebo více substituenty zvolenými ze souboru sestávajícího z halogenu, methoxy skupiny a hydroxyskupiny:

    nebo jeho farmaceuticky vhodná sul.
13. 13. Deazapurin obecného vzorce II podle nároku 12, kde Q představuje CH₂, O, S nebo NH.
14. 14. Deazapurin podle nároku 12, kterým je některá z následujících sloučenin

    4-(2-acetylaminoethyl)amino-6—fenoxy methy l-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3ť/[pyrimidin,

    4-(2—acetylamÍnoethyl)amino-6—(4—fluorfenoxy)methyl~2~fenyl—7//-pyrToto[2,3£/]pyrimÍdin,

    4-(2-acetylamÍnoethyl)amÍno—6—(chlorfenoxy)methyl—2-feny l-77/-pyrroIo[2,3í7]pyrimidin,

    4—(2—acetylaminoethyl)amino—6—(4-methoxy fenoxy )methyl—2-feny l-7//-pyrrol o [2,3 <7]pyrimidin,

    4--{2-'acetylaminoethyl)aminO'6-(2-pyrÍdyloxy)rTiethyl-2--fenyl-7//-pyrrolo[2,3ť7] pyrimidin,

    4-(2-acetylaminoethyl)amino-6-(N-fenylamino)methyi-2-fenyi-7řA-pyrrolo[2,3£/] pyrimidin,

    4-(2- acety lamí noethvl)am i ησ-6-(N-methy 1-N-feny i am i no)rneth\l-2-fenyi-7//-pyrrolo[ 2.3 d]pyrimidin a

    4-(2-N'-methylureaethyl)amino-6—fenoxymethyl-2~fenyl-7í/-pyrrolo[2,3í/] pyrimidin; nebo její farmaceuticky vhodná sůl.
15. 15. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství deazapurinu podle nároků 1, 6 až 9 nebo 12 a farmaceuticky přijatelný nosič.
16. 16. Farmaceutická kompozice podle nároku 15,vyznačující se tím, že deazapurin je vybrán ze souboru sestávajícího z

    4-(2-acetylaminoethyí)amino-6-fenoxymethyl-2-fenyl-77/-pyrrolo[2,3í/] pyrimidinu,

    4-<2-acety[aminoethyl)amino-6—(4-fiuorfenoxy)methyl-2-fěnyl---777 pyrrolo[2,3(7]pyrirnÍdinu,

    4—(2-acety lamin oethyl)amino—6-(chlorfenoxy)methyl“2-fenyl-7/ř-pyrrolo[2,3ť/|pyrimÍ dinu,

    4-(2-acety 1 am inoethy 1 )am ino—6—(4—methoxy fenoxy )methy l-2-feny 1-77/pyrro lo [2,31/]pyrimidinu,

    4-(2-acety 1 am i noethy 1 )am ino-6-(2-pyridy loxy )methyl-2-fenyl-77/-pyrrolo[2,3 </] pyrimidinu,

    4-(2-acetylamÍnoethyl)amino-6-(N-fenylamino)methyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3í/]pyrimidinu,

    4-42--acety lam i noethy l)amino-6-( N-methy l-N-fenv lamino )rnethv l-2-feny l-7//-pyrrolo[ 2 Jč/]pyrimidinu a

    4-(2-N '-methy lureaethyl )amino-6—fenoxy methy l-2-ťenyl-7//pyrrolo[2,3í/] pyrimidin u; nebo jejich farmaceuticky vhodných solí.

    -87CZ 302486 B6
17. 17. Farmaceutická kompozice podle nároku 15, vyznačující se tím, že deazapurín je vybrán ze souboru sestávajícího z

    5 4-(cZs'-3-hydroxycykIopentyl)amino-5,6-dimethyl-2-f'enyl-7//-pyrrolo[2,3ť/|pyrimidÍnu, soli trifluoracetátové kyseliny 4 -(c’/.s 3 -(2 aminoacetoxy)cyklopentyi)-amiiio-5,6- dimcthyl-2 fenyl-7//-pyrrolo[2,3ť/]pyrimidinu, ío 4-(3-acetamido)piperidinyl-5,6-dimethyl-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3ó/]-pyrimidinu,

    4 (2 N’-inethy]urcaprop\l)amino-5,6--dimethyi -2 -íenyl -7H pyrro!o[2,3Jj-pyrimidinu.

    4--(2--acetHmidobutyl)ainini>-5,6dimethy]-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3í/]-pyrimidinu,

    4-(2-~N'-metbylureidobutyl)amino-5,6-dimethyl-2-fenyl-7// pyrrolo[2,3í/]-pyrimidinu, 4-(2-aminocyklopropylacetainidoethyl)amino-2-fenyl-7//-pyrrolo[2,3í/]-pyrimidÍnu,

    20 4-(/^7//5 4 hydroxycyklohcxyl)amino- 2- (3--chlorfenyl)-7//-pyrrolo52,3č/] pyrimidinu,

    4 (/rao.V' 4 hydroxycyklohexyl)amino 2-(3-fluorťenyl)-7//-pyrrolo[2,37/] pyrimidinii a 4—(/rařM’~4-hydroxycyklohexyl)amino-2-(4-pyridyl)-7//-pyrrolo[2,3ť/]-pyrimidinu nebo farmaceuticky vhodné soli této sloučeniny.
18. 18. Farmaceutická kompozice podle nároku 15, v y z n a č u j í e í se tím, že uvedené terapeuticky účinné množství je účinné k léčbě respirační choroby nebo choroby gastrointestinál30 ního traktu.
19. 19. Farmaceutická kompozice podle nároku 18, vyznačující se tím, že uvedenou gastrointestinální chorobou je průjem.

    35
20. 20. Farmaceutická kompozice podle nároku 18, vyznačující se tím, že uvedenou respirační chorobou je astma, alergická rinitida nebo chronická obstruktivní pulmonámí nemoc.
21. 21. Farmaceutická kompozice podle nároku 15, vy znač u j í cí se t í m, že je ve formě oftalmické formulace.
22. 22. Farmaceutická kompozice podle nároku 21, v y z n a č u j í c í se t í m , že je ve formě periokulární, retrobulbární nebo intraokulární injekční formulace.
23. 23. Farmaceutická kompozice podle nároku 21,vyznačující se tím, že je ve formě

    45 systemické formulace.
24. 24. Farmaceutická kompozice podle nároku 21, v y z n a č u j í c í se t í m , že je ve formě roztoku pro chirurgické oplachování.

    -88 CZ 302486 Bó
25. 25. Způsob přípravy deazapurinu uvedeného v nároku 1 obecného vzorce kde

    Ri představuje atom vodíku;

    R₂ představuje alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, který je nesubstituovaný nebo substituovaný hydroxyskupinou, karboxy skupí nou, amínoskupinou, acetoxy skupinou, pyridylskupinou, nebo /erc-butoxykarbony 1 skup i nou;

    -A-NHC(=O)B, kde A představuje nesubstituovanou alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku a B představuje atom vodíku, alkylskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, cyklopropyl skupinu, aminomethylskupinu, aminoethylskupinu, karboxyethylskupinu, aminoskupinu, methylaminoskupinu, ethylaminoskupínu, acetylskupinu nebo řerc-butyloxyskupinu;

    NH2—CO-alkylenskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku v alky lenové Části, v níž atom vodíku aminové části je popřípadě nahrazen methyl skupí nou nebo cyklopropylmethyl skupinou;

    CH₂CH₂NHSO₂Clb; nebo cyklohexylskupinou nebo cyklopentylskupinu, přičemž tato cyklohexylskupina nebo cyklopentyl skupina je popřípadě substituována hydroxyskupinou, acetylaminoskupinou, methyl sulfonylaminoskupinou, benzoy loxy skupinou, 2—aminoacetoxyskupinou, 2—aminomethylacetylaminoskupinou nebo 2-N-terc-butyloxyacylamínoacetoxyskupinou; nebo

    Ri a R₂, spolu s atomem dusíku, k němuž jsou připojeny, tvoří pyrrolidinylskupinu nebo 3-acetylaminopiperidinový kruh, přičemž uvedená pyrrolidinylskupina je nesubstituovaná nebo substituovaná jedním nebo více substituenty zvolenými ze souboru sestávajícího z hydroxy skupiny, aminoskupiny, thiolové skupiny, karboxy skupiny, halogenu nebo skupiny vzorce -CH₂OH, -C(-O)NH₂, -CH₂NHC(=O)alkyl a -CH₂NHC(=O)NHalkyl;

    R₃ představuje fenylskupinu, pyridylskupinu, furylskupinu nebothienylskupinu, přičemž uvedená fenylskupina je nesubstituovaná nebo substituovaná jedním nebo více substituenty zvolenými ze souboru sestávajícího z hydroxyskupiny, methoxyskupiny, methylskupiny a halogenu;

    Ró představuje atom vodíku nebo methylskupinu;

    vyznačující se tím, že se

    -89CZ 302486 B6

    a) sloučenina obecného vzorce kde R<, má shora uvedený význam a P znamená odstěpitelnou chránící skupinu, nechá reagovat se sloučeninou obecného vzorce

    A.

    r₃- 'Cl kde Rt má shora uvedený význam, za vzniku sloučeniny obecného vzorce kde R₃, R<, a P mají shora uvedený význam; potom se

    b) produkt ze stupně a) eyklizuje za vzniku sloučeniny obecného vzorce kde R₃ a R₆ mají shora uvedený význam; potom se

    c) produkt ze stupně b) za vhodných podmínek chlorací převede na sloučeninu obecného vzorce kde Rt a R_ň mají shora uvedený význam; a nakonec se

    d) chlorovaný produkt ze stupně c) nechá reagovat s aminem za vzniku sloučeniny vzorce kde obecné symboly mají shora uvedený význam.
26. 26. Deazapurin podle nároku 6 vzorce nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl.
27. 27. Deazapurin podle nároku 6 vzorce io nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl.
28. 28. Deazapurin podle nároku 6 vzorce nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl.

    -91 CZ 302486 Bó
29. 29. Deazapurin podle nároku 6 vzorce
30. 30. Deazapurin podle nároku 6 vzorce nebojeho farmaceuticky vhodná sůl.
31. 31. Deazapurin podle nároku 9 vzorce o nebojeho farmaceuticky vhodná sůl.

    -92 CZ 302486 Bó
32. 32. Deazapurin podle nároku 9 vzorce

    H₂N nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl.

    S
33. 33. Deazapurin podle nároku 1 vzorce nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl.

    -93 CZ 302486 Bó
34. 34. Deazapurin podle nároku 9 vzorce nebojeho farmaceuticky vhodná sůl.

    5
35. 35. Deazapurin podle nároku 9 vzorce nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl.
36. 36. Deazapurin podle nároku 7 vzorce

    -94CZ 302486 Β6 nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl.
37. 37. Deazapurin podle nároku 36 vzorce

    5 nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl.
38. 38. Deazapurin podle nároku 36 vzorce nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl.