DK169657B1

DK169657B1 - Anvendelse af visse uracilnucleosider til fremstilling af et lægemiddel mod adenovirusinfektioner samt oftalmiske præparater indeholdende sådanne uracilnucleosider

Info

Publication number: DK169657B1
Application number: DK468288A
Authority: DK
Inventors: John William Talbot Selway; Iii Lowrie Miller Beacham; Susan Mary Daluge; Joel Van Tuttle; Thomas Anthony Krenistky
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1987-08-22
Filing date: 1988-08-19
Publication date: 1995-01-09
Also published as: KR890003382A; JP2634202B2; IE63655B1; ZA886182B; GB8719877D0; NZ225881A; SG26364G; IE940696L; US5070078A; AU2142988A; JPS6468325A; US5376644A; CA1333361C; DK140393D0; DE3876174T2; IE882533L; EP0305117A3; EP0305117B1; ATE82681T1; DK140393A

Description

5 i DK 169657 B1

Opfindelsen angår anvendelse af et uracilnucleo-sid med den almene formel (I) 10 ΗΟ-^Ον^

F

15 hvori R betegner hydrogen, C1-4 alkyl, fluor eller brom, eller et fysiologisk acceptabelt salt eller en fysiologisk acceptabel ester deraf, til fremstilling af et lægemiddel til behandling af eller profylakse for en adenovirusinfektion. Opfindelsen angår endvidere oftal-20 miske præparater indeholdende sådanne nucleosidderiva-ter.

Adenovira blev først isoleret hos mennesker i 1953, og man har nu identificeret i det mindste 41 forskellige serotyper, der repræsenterer seks underfami-25 lier. Adenovira er f.eks. ansvarlige for 5% af akutte luftvejsinfektioner hos børn under fire år og findes hos 10% af luftvejssygdomme, der kræver hospitalsophold, i denne aldersgruppe. Sådanne tilstande er almindeligvis ledsaget af betændelse i svælget, hoste og 30 betændelse i øjets bindehinde. Der forekommer meget ofte laryngotracheobronchitis, der hos små børn udvikler sig til lungebetændelse, og i virkeligheden skyldes 10% af lungebetændelser hos børn infektion med adenovira, og de er ofte dødelige, hvis børnene er under to år 35 gamle.

Hos voksne er adenovira ofte ansvarlige for feber i forbindelse med betændelse i svælg og øjets bin- 2 DK 169657 B1 dehinde, og for akutte luftvejssygdomme hos institutionaliserede personer, hvor de kan have dødelig udgang. Disse vira står ofte i forbindelse med krampagtig hoste, blødende cystitis, meningitis, diarré og epidemisk 5 horn- og bindehindebetændelse. Ved den sidste sygdom udvikler der sig hurtigt i bindehinden smerter, lysskyhed, lymfadenopati og derefter hornhindebetændelse. Sygdommen kan vare i adskillige uger, men uklarheden af hornhinden kan vare i mange år. Patienten bliver der-10 efter til en vis grad invalideret i en udstrakt tidsperiode. Man har vist, at adenovirus type 8 er den vigtigste årsag til denne særlige adenovirussygdom. Adenovirus sygdomme er særlig alvorlige hos børn med alvorlig kombineret immundefektsyndrom (SCID) og hos perso-15 ner med dårligt immunsystem. Man har også anerkendt, at adenovira forekommer mere og mere hos patienter med erhvervet immundefektsyndrom (AIDS) og hos modtagere af knogletransplantationer. Man har hidtil ikke kendt nogen effektiv antiviral forbindelse til behandling af 20 adenovirale infektioner, og der findes heller ikke nogen anvendelig vaccine.

Visse af forbindelserne med ovennævnte formel (I) er tidligere beskrevet i litteraturen. For eksempel er forbindelsen med formel (I), hvori R er hydrogen, 25 beskrevet af G. Kowollik et al., Journal f. prakt. Che-mie, 315(5), 1973, 895-900; og forbindelsen med formel (I), hvori R er en methylgruppe, er beskrevet i UK patentskrift nr. 1 189 973. Endvidere er forbindelsen med formel (I), hvori R er et bromatom, nævnt i europæisk 30 patentskrift nr. 254 268.

Repræsentative forbindelser med formel I, anvendt ifølge opfindelsen er endvidere kendte som terapeutika. Se Chem. Abstr. 84 (1976), 25824u og US-A-3.775.397 (R=H); J. Med. Chem. 27 (1984), 11-14 35 (R=F); dansk patentansøgning nr. 3786/87 (R=Br) og dansk patentansøgning nr. 927/88 (R=CH3). Fra J. Med.

3 DK 169657 B1

Chem. 1987, 30, 1270-1278, er forbindelsen, hvor R=CH3, dvs. S'-desoxy-S'-fluorthymidin, kendt som anti-HIV-middel.

Imidlertid angives eller antydes det ikke i dis-5 se referencer, at forbindelserne skulle have aktivitet mod adenovira.

Krenitsky et al., J. Med. Chem. 26 (1983), s 891-5 påviste en rimelig adenoviral aktivitet hos 31-amino-31-desoxy-5-fluoruridin, men fandt kun ringe 10 eller umålelig aktivitet, når 5-substituenten var hydrogen, methyl eller øvrige halogener.

Det er nu blevet opdaget, at forbindelser med ovennævnte formel (I) med et fluoratom i 3'-stilling har uventet kraftig aktivitet mod adenovira, især mod 15 sådanne af type 8, og opfindelsen er baseret herpå.

Forbindelserne med formel (I) samt de farmaceutisk acceptable salte og estere deraf, som ovenfor omtalt, vil herefter blive betegnet forbindelser anvendt ifølge opfindelsen.

20 Særlig foretrukne forbindelser med formel (I) er på grund af deres særlig kraftige aktivitet imod adenovira: 1. 3'-Desoxy-3'-fluorthymidin; 25 2. 21,3'-Didesoxy-3'-fluoruridin; og 3. 5-Brom-1-(2,3-didesoxy-3-fluor-p-D-erythro-pen- tofuranosyl)uracil;

Den ovennævnte forbindelse nr. 1 har en særlig 30 høj anti-adenovirusvirkning, især mod serotyperne 5 og 8.

Eksempler på adenovirusinfektioner, der kan behandles eller forhindres med forbindelserne med formel I, inkluderer kliniske tilstande, omtalt ovenfor, og 35 især adenovirale infektioner i øjet.

Eksempler på foretrukne estere af forbindelserne med formel (I) er carboxylsyre-estere, hvori ikke-car- 4 DK 169657 B1 bonyldelen af esteren udvælges blandt ligekædede eller forgrenede alkyl, alkoxyalkyl (f.eks. methoxymethyl), aralkyl (f.eks. benzyl), aryloxyalkyl (f.eks. phenoxy-methyl), aryl (f.eks. phenyl eventuelt substitueret med 5 halogen, Cx_4 alkyl eller C1_4alkoxy); sulfonatestere såsom alkyl- eller aralkylsulfonyl (f.eks. methansulfo-nyl); og mono-, di- eller triphosphatestere. Hvad angår de ovenfor beskrevne estere, vil enhver alkyldel, hvis ikke andet angives, i sådanne estere med fordel inde-10 holde 1-18 carbonatomer, især 1-4 carbonatomer. En eventuel aryldel, der findes i sådanne estere, vil med fordel omfatte en phenylgruppe. Enhver reference til hvilke som helst af de ovenfor givne forbindelser skal også inkludere en reference til farmaceutisk acceptable 15 salte deraf.

Eksempler på farmaceutisk acceptable salte af forbindelserne med formel (I) og farmaceutisk acceptable derivater deraf inkluderer basesalte, f.eks. afledt af en passende base såsom et alkalimetal (f.eks.

20 natrium), jordalkalimetal (f.eks. magnesium)salte, ammonium og NX+ (hvori X betegner C1_4alkyl).

Forbindelserne anvendt ifølge opfindelsen kan indgives til mennesker til profylakse for eller behandling af adenovirusinfektioner, især øjeninfektioner, 25 ved en hvilken som helst indgivelsesvej, deriblandt oral, rectal, nasal, topisk (inkluderende buccal og sublingual), vaginal og parenteral (deriblandt subkutan, intramuskulær, intravenøs og intradermal). Man bør bemærke, at den foretrukne indgivelsesvej vil af-30 hænge af sygdomstilstanden og patientens alder, infektionens art og det valgte aktive middel.

Almindeligvis vil en passende dosis være i området 3,0-120 mg pr. kg. kropsvægt for patienten pr. dag, foretrukken 6-90 mg pr. kg kropsvægt pr. dag, og især 35 15-60 mg pr. kg kropsvægt pr. dag. Den ønskede dosis indgives foretrukken som 2, 3, 4, 5, 6 eller flere un- 5 DK 169657 B1 derdoser, indgivet med passende mellemrum i løbet af dagen. Disse underdoser kan indgives på enhedsdosisform, f.eks. med indhold af 10-1500 mg, foretrukket 20-1000 mg, og især 50-750 mg af forbindelsen pr. en-5 hedsdosisform.

Selv om forbindelserne anvendt ifølge opfindelsen kan indgives alene, indgives de foretrukket i et farmaceutisk præparat. Sådanne præparater omfatter i det mindste én forbindelse anvendt ifølge opfindelsen 10 sammen med en eller flere acceptable bærere derfor, og eventuelt andre terapeutiske midler. Enhver bærer må være "acceptabel", idet den må være forligelig med de andre ingredienser i præparatet og ikke skade patienten. Præparater inkluderer sådanne, der er egnet til 15 oral, rektal, nasal, topisk (inkluderende buccal og sublingual), oftalmisk, vaginal eller parenteral (deriblandt subkutan, intramuskulær, intravenøs og intradermal) indgivelse. Præparaterne kan bekvemt fremstilles på enhedsdosisform og kan fremstilles ved en hvilken 20 som helst fremgangsmåde ifølge kendt teknik indenfor farmacien. Ved sådanne fremgangsmåder bringer man den aktive ingrediens i forbindelse med bæreren, der udgør en eller flere hjælpeingredienser. Almindeligvis fremstiller man præparaterne, idet man ensartet og grundigt 25 bringer den aktive ingrediens i forbindelse med flydende eller fintopdelte faste bærere eller begge, og derefter eventuelt formgiver produktet.

På grund af aktiviteten hos forbindelserne anvendt ifølge opfindelsen imod adenovirusinfektioner i 30 øjet, som ovenfor nævnt, er det særlig foretrukket at indgive disse forbindelser i præparater, tilpasset til oftalmisk indgivelse.

Sådanne præparater til oftalmisk indgivelse inkluderer øjendråber og oftalmiske salver, cremer, su-35 spensioner og lotioner.

I overensstemmelse hermed er oftalmiske præparater ifølge opfindelsen ejendommelige ved det i de kendetegnende dele af kravene 10, 11 eller 12 angivne.

6 DK 169657 B1 Øjendråber ifølge opfindelsen kan omfatte sterile, vandige eller olieopløsninger eller suspensioner og kan fremstilles, idet man opløser den aktive ingrediens i en passende vandig opløsning af et bakteriedræbende 5 middel og/eller et hvilket som helst andet egnet præserverende middel. Denne opløsning kan derefter klares ved filtrering, overføres til en passende beholder, der derefter forsegles, og steriliseres ved autoklavering. Alternativt kan man sterilisere opløsningen ved filtre-10 ring og overføre den aseptisk til beholderen. Eksempler på baktericide og fungicide midler, egnet til ingredienser i dråberne, er phenylmercurinitrat eller acetat (0,002%), benzalkoniumchlorid (0,01%) og chlor-hexidinacetat (0,01%).

15 Lotioner ifølge opfindelsen inkluderer sterile, vandige opløsninger, der eventuelt indeholder præserverende midler og kan fremstilles ved fremgangsmåder, der minder om sådanne til fremstilling af dråber.

Cremer eller salver ifølge opfindelsen er halv-20 faste præparater med indhold af den aktive ingrediens, tilpasset oftalmisk indgivelse. Man kan fremstille sådanne ved at blande den aktive ingrediens på findelt eller pulveriseret form alene eller i opløsning eller suspension i en vandig eller ikke-vandig væske 25 med en fedtet eller ikke-fedtet salvebasis. Basis kan omfatte et carbonhydrid, såsom hård, blød eller flydende paraffin, glycerol, bivoks, en metallisk sæbe; slim, en naturlig forekommende olie, såsom mandelolie, majsolie, arachisolie, ricinusolie eller olivenolie, uld-30 fedt eller derivater deraf eller en fedtsyre, såsom stearinsyre eller oliesyre sammen med en alkohol, såsom propylenglycol eller macrogoler. Præparatet kan inkorporere et hvilket som helst passende overfladeaktivt middel, såsom sorbitan, estere eller polyoxyethylende-35 rivater deraf. Man kan også inkludere suspenderende midler, såsom naturlige gummier, cellulosederivater el- 7 DK 169657 B1 ler uorganisk materiale, såsom kiselagtigt materiale; og andre ingredienser, såsom lanolin.

Præparater fremstillet ved anvendelsen ifølge opfindelsen, egnet til oral indgivelse, kan foreligge 5 som enkelte enheder, såsom kapsler, cachetter eller tabletter, som hver indeholder en forudbestemt mængde af den aktive ingrediens; som et pulver eller granulat; som en opløsning eller suspension i en vandig eller ikke-vandig væske; eller som en flydende olie-i-vand-10 emulsion eller en vand-i-olie-emulsion. Den aktive ingrediens kan også foreligge som en bolus eller pasta. Orale præparater kan yderligere inkludere andre midler ifølge kendt teknik, såsom sødemidler, aromamidler og fortykkende midler.

15 Man kan fremstille tabletter ved sammenpresning eller formstøbning, eventuelt sammen med en eller flere hjælpeingredienser. Man fremstiller pressede tabletter ved, i en passende maskine, at sammenpresse den aktive ingrediens på fri-flydende form såsom et pulver eller 20 et granulat, eventuelt sammen med et bindemiddel (f. eks. povidon, gelatine, hydroxypropylmethylcellulose), et smøremiddel, en inert fortynder, et sprængmiddel (f.eks. natriumstivelsesglycollat, tværbundet povidon, tværbundet natriumcarboxymethylcellulose), eller over-25 fladeaktivt eller dispergerende middel. Formstøbte tabletter kan fremstilles, idet man i en passende maskine støber en blanding af de pulveriserede ingredienser, fugtet med et inert flydende fortyndingsmiddel. Man kan eventuelt overtrække tabletterne eller forsyne dem 30 med kærv, og de kan formuleres til opnåelse af langsom eller kontrolleret frigivelse af det aktive middel deri, idet man f.eks. herved benytter hydroxypropylmethylcellulose i forskellige andele til opnåelse af den ønskede frigivelsesprofil.

35 Præparater, egnet til topisk indgivelse i mun den, inkluderer pastiller, der omfatter den aktive 8 DK 169657 B1 ingrediens på aromatiseret basis, sædvanligvis sucrose og acacia eller tragant; pastiller, der omfatter den aktive ingrediens i en inert basis, såsom gelatine og glycerin, eller sucrose og acacia; og mundskyllemidler, 5 der omfatter den aktive ingrediens i en passende flydende bærer.

Præparater til rektal indgivelse kan foreligge som stikpiller med en passende basis, der f.eks. omfatter cacaosmør eller et salicylat.

10 Præparater, egnet til vaginal indgivelse, kan foreligge som vagitorier, tamponer, cremer, geler, pastaer, skum eller spraypræparater, der foruden den aktive ingrediens indeholder passende bærere ifølge kendt teknik.

15 Præparater, egnet til parenteral indgivelse, in kluderer vandige og ikke-vandige isotoniske sterile injektionsopløsninger, der kan indeholde antioxiderende midler, puffere, bakteriedræbende midler og opløste stoffer, der gør præparatet isotonisk med blodet hos 20 modtageren; og vandige og ikke-vandige sterile suspensioner, der kan indeholde suspenderende midler og for-tykkende midler. Præparaterne kan foreligge i enhedsdosis eller mangedosis lukkede beholdere, f.eks. ampuller og småglas, og kan oplagres på frysetørret 25 (lyophiliseret) form, hvor man kun behøver at tilsætte den sterile væskeformige bærer, f.eks. injektionsvand, umiddelbart før anvendelsen. Injektionsopløsninger og suspensioner kan fremstilles på stedet ud fra sterilt pulver, granulat eller tabletter af tidligere beskrevne 30 typer.

Foretrukne enhedsdosispræparater er sådanne, der indeholder en daglig dosis eller daglig underdosis som ovenfor beskrevet, eller en passende brøkdel deraf, af forbindelsen med formlen I.

35 Man kan fremstille forbindelser med formlen I

ved kendt teknik. Man kan f.eks. således fremstille 9 DK 169657 B1 forbindelser med formel (I), især forbindelsen hvori R betegner en methylgruppe, som beskrevet i UK patentskrift nr. 1 189 973. Forbindelsen med formel (I), hvori R betegner hydrogen, kan fremstilles f.eks. som 5 beskrevet af G. Kowollik et al., J. Prakt. Chem. 1973, 315(5), 895-900.

Forbindelserne med formel (I), hvori R betegner brom eller fluor kan f.eks. fremstilles ved bromering eller fluorering af en tilsvarende forbindelse med for-10 mel (I), hvori R betegner hydrogen, og hvori 5'-hy-droxygruppen er blokeret, f.eks. af en acylgruppe, såsom en p-toluoylgruppe.

Man kan udføre bromering eller fluorering af ovenfor nævnte udgangsmateriale ved kendt teknik, 15 f.eks. bromering under anvendelse af brom, f.eks. i iseddikesyre.

Det ovenfor nævnte toluoylderivat kan fremstilles, idet man behandler den relevante forbindelse med formel (I) med f.eks. p-toluoylchlorid, f.eks. i pyri-20 din. Efter halogenering, som beskrevet ovenfor, kan man f.eks. fjerne den p-toluoylbeskyttende gruppe ved hjælp af natriumhydroxid i methanol.

Forbindelsen med formel (I) kan omdannes til en fysiologisk acceptabel ester ved reaktion med et pas-25 sende esterificerende middel, f.eks. et syrehalogenid eller anhydrid. Forbindelsen med formel (I), deriblandt estere deraf, kan omdannes til farmaceutisk acceptable salte deraf ved kendt teknik, f.eks. ved behandling med en passende base. En ester eller et salt 30 kan f.eks. ved hydrolyse omdannes til udgangsforbindelsen.

De følgende eksempler skal betrages som illustrerende. Betegnelsen "aktiv ingrediens" vil i eksemplerne betyde forbindelsen med formel (I) eller et fy-35 siologisk acceptabelt salt eller en fysiologisk acceptabel ester deraf.

5 DK 169657 B1 10

Eksempel 1 5-Brom-l-(2,3-didesoxy-3-fluor-6-D-erythro-pentofurano- syl)uracil_

Man satte 325 mg frisk destilleret p-toluoyl-chlorid (2,10 mmol) til en opløsning af 440 mg 1-(2,3-didesoxy-3-fluor^-D-erythro-pentofuranosyl)uracil (1,91 mmol) i 10 ml vandfri pyridin. Opløsningen blev 10 holdt under omrøring ved 50° i 1½ time og derefter ved 25° i 18 timer. Man bortfordampede pyridinen og opløste remanensen i 25 ml CHCl3. Denne opløsning blev ekstraheret med 5 ml 1M H2S04, derefter 2 x 10 ml H20 og tørret (MgS04). Efter bortfordampning af CHCI3 forelå 0,72 15 g af et farveløst glas, der blev kromatograferet på si-licagel. Eluering med 2% MeOH-CHCl3 gav 5'-0-toluoyl-derivatet som et hvidt fast skum (0,66 g, 90%); kromatografisk homogen på TLC-plader (silicagel fremkaldt med 5% MeOH-CHCl3); strukturen kunne bekræftes ved 20 hjælp af 'H-NMR.

Man holdt 200 mg af 5'-O-toluoylderivatet af 1-(2,3-didesoxy-3-fluor-p-D-erythropentofuranosyl)ura-cil, fremstillet som beskrevet ovenfor (0,574 mmol), 5 ml iseddikesyre og 0,08 ml af en 8M opløsning af brom i 25 iseddikesyre (0,64 mækv.) under omrøring ved 25 C i 18 timer. Man inddampede opløsningen til et glas, der blev behandlet med natriumhydroxid og methanol. Produktet blev elueret fra en silicagelkolonne med 5% MeOH-CH2Cl2 som 135 mg hvide krystaller. Omkrystallisering fra EtOH 30 gav titelforbindelsen som 115 mg hvide krystaller (64% totaludbytte);

Smp. 193,5-194°C (sønderdeling);

Analyse for C9H10BrFN2O4:

Beregnet; C 34,97 H 3,26 N 9,06 Br 25,85 F 6,15 35 Fundet: 35,07 3,31 9,00 25,78 6,04 11 DK 169657 B1 UV λ max (H20): 277 nM; strukturen kunne yderligere bekræftes ved Ή-NMR og massespektrum.

Eksempel 2 5 3'-Desoxy-31-fluorthymidin

Fremstilling af l-(2-Desoxy-5-(p-chlorbenzoyl)^-D-threo-pentofuranosyl)thymin_ 10

Man opløste 49,0 g 1-(2-desoxy-p-D-threo-pento- furanosyl) thymin (J.J. Fox og N.C. Miller J. Org.

Chem., 1963, 28, 936) i 500 ml vandfri pyridin i en 1 liter rundbundet kolbe med tilsætningstragt, nitrogen- 15 tilførsel og mekanisk omrører. Opløsningen blev afkølet 0 til 5 C i et isbad, og man tilsatte drabevis i løbet af 30 minutter 35,4 g 4-chlorbenzoylchlorid (0,202 mol).

Man lod opløsningen langsomt varme til stuetemperatur, hvorefter man afbrød reaktionen ved tilsætning af 20 ml 20 vand, fjernede hovedparten af pyridin ved roterende fordampning og opløste den olieagtige remanens i 1 liter ethylacetat. Den organiske opløsning blev vasket med 700 ml portioner vand, 1,2 N HC1 og 10% vandig na-triumbicarbonat og tørrede over natriumsulfat. Derefter 25 filtrerede man blandingen og fjernede opløsningsmidlet ved roterende fordampning til opnåelse af 62,1 g 1-(2-desoxy-5-(p-chlorbenzoyl)-D-threo-pentofuranosyl)-thymin (80,7%) som et hvidligt fast stof, egnet til næste trin.

30 IH NMR (DMS0-d6) 1,76 (d, J = 0,9 Hz, 3H, C-5 CH2), 2,1-2,6 (m, 2H, C-2'), 3,8-4,5 (m, 4H, C-3'H, C-4'H og C-51H), 5,55 (d, J = 2,6 Hz, IH, C-3'OH), 6,13 (dublet af dubletter, J = 2,8 Hz og 8,3 Hz, IH, C-l'H), 7,58 (d, J = 8,6 Hz, 2H, ArH), 7,81 (m, IH, C-6H), 7,85 35 (d, J = 8,6 Hz, 2H, ArH); TLC Rf = 0,72, silicagel, CHC13 : CH3OH/90:10.

12 DK 169657 B1

Fremstilling af 31-desoxy-31-fluorthymidin

Man afkølede en suspension af 61,0 g l-(2-des-oxy-5-(p-chlorbenzoyl)-β-D-threo-pentofuranosyl)thymin 5 og 30,0 g kaliumcarbonat i 700 ml methylenchlorid til -78°C i en 2 liter rundbundet kolbe, forsynet med mekanisk omrører, tilsætningstragt og nitrogentilførsel. Hertil satte man i løbet af ti minutter dråbevis 30 ml diethylaminosvovltrifluorid, og man fortsatte omrøring 10 i yderligere 2½ time ved -78 C. Blandingen blev opvarmet til stuetemperatur, overført til en skilletragt og vasket med 700 ml isvand og 500 ml portioner af vand, 1,2 N saltsyre og 10% vandig natriumbicarbonatopløs-ning. Man fjernede opløsningsmidlet ved roterende for-15 dampning og opløste remanensen i 500 ml methanol. Hertil satte man 15 g fast natriumbicarbonat, og man opvarmede suspensionen to timer under tilbgesvaling, hvorefter man afkølede blandingen til stuetemperatur, filtrerede, fjernede opløsningsmidlet ved roterende 20 fordampning og rensede den olieagtige remanens ved flashkromatografi under anvendelse af et 3 x 36 tommers rumfang af flash siligacel. Man eluerede kolonnen med 96:4/CHC13:CH3OH, idet man indsamlede 200 ml fraktio ner. Fraktionerne 29-41 blev indkoncentreret ved rote-25 rende fordampning, remanensen blev opslæmmet i 100 ml acetone, og man frafiltrerede fast stof til opnåelse af 7,70 g (19,9%) 3'-desoxy-3'-fluorthymidin.

Smp. 169-171°C.

TLC, Rf = 0,53, silicagel, 90:10/CHC13:CH30H.

3 0 Elementæranalyse:

Beregnet: C 49,18 H 5,37 N 11,47

Fundet : 49,00 5,38 11,40 35 DK 169657 B1 13

Eksempel 3 Tabletpræparater 5 Man fremstillede de følgende præparater A, B og C ved vådgranulering af ingredienserne med en opløsning af povidon, hvorefter man tilsatte magnesiumstearat og pressede.

iO Præparat A

_mg/Tablet mg/Tablet (a) Aktiv ingrediens 250 250 15 (b) Lactose 210 26 (c) Povidon 15 9 (d) Natriumstivelsesglycolat 20 20 (e) Magnesiumstearat 5 3 500 300 20

Præparat B

_mg/Tablet mg/Tablet 25 (a) Aktiv ingrediens 250 250 (b) Lactose 150 (c) Avicel®PH 101 60 26 (d) Povidon B.P. 15 9 (e) Natriumstivelsesglycolat 20 12 30 (f) Magnesiumstearat 5 3 500 300 35 14

Præparat C

DK 169657 B1 _mg /Tablet_ 5 Aktiv ingrediens 100

Lactose 200

Stivelse 50

Povidon B.P. 5

Magnesiumstearat 4 10 359

Man fremstillede de følgende præparater, D og E, ved direkte sammenpresning af de sammenblandede ingredienser. Lactosen i præparat E er af direkte sammen-15 presningstype.

Præparat D

_mq/Tablet 20

Aktiv ingrediens 250

Prægelatineret stivelse 150 400

25 Præparat E

_mq/Tablet

Aktiv ingrediens 250 30 Lactose B.P. 150

Avicel® 100

Magnesiumstearat 5 500 35 15

Præparat F

DK 169657 B1 (Præparat til kontrolleret frigivelse) 5 Man fremstiller præparatet ved vådgranulering af de nedenfor givne ingredienser med en opløsning af po-vidon, hvorefter man tilsætter magnesiumstearat og sammenpresser.

10 _mq/Tabelt (a) Aktiv ingrediens 500 (b) Hydroxypropylmethylcellulose 112 (Methocel®K4M Premium) 15 (c) Lactose B.P. 35 (d) Povidon B.P.C. 28 (e) Magnesiums tear at 7 700 20 Eksempel 4

Kapselpræparater

Præparat A: 25 Man fremstiller et kapselpræparat ved at sam menblande ingredienserne fra præparat D i Eksempel 1 ovenfor og fylde disse i hårde todelte gelatinekapsler. Præparat B (se nedenunder) fremstilles på lignende måde.

30 DK 169657 Bl 16

Præparat B

_mq/kapsel 5 (a) Aktiv ingrediens 250 (b) Lactose B.P. 143 (c) Natriumstivelseglycolat 25 (d) Magnesiums tear at 2 420 10

Præparat C

_mg/kapsel 15 (a) Aktiv ingrediens 250 (b) Macrogol® 4000 BP 350 600

Man fremstiller disse kapsler ved at smelte Ma-20 crogol 4000 BP, dispergere den aktive ingrediens i smelten og fylde smelten i todelte hårde gelatinekaps ler.

Præparat D

25 _mq/kapsel

Aktiv ingrediens 250

Lecithin 100

30 Arachisolie lQQ

450

Man fremstiller disse kapsler ved at dispergere den aktive ingrediens i lecithin og arachisolie og fyl-35 de dispersionen i bløde, elastiske gelatinekapsler.

DK 169657 B1 17

Præparat E

(Kapsler til kontrolleret frigivelse) 5 Man fremstillede det følgende kapselpræparat til kontrolleret frigivelse ved, i et ekstrusionsapparat, at ekstrudere ingredienserne (a), (b) og (c), hvorefter man afrundede og tørrede ekstrudatet. Derefter overtrak man de tørrede pellets med membranen (d) til kon- 10 trolleret frigivelse og fyldte dem i hårde, todelte gelatinekapsler .

_mg/kapsel 15 (a) Aktiv ingrediens 250 (b) Mikrokrystallinsk cellulose 125 (C) Lactose BP 125 (d) Ethylcellulose 13 513 20

Eksempel 5

Præparat til injektion 25 Præparat A:

Aktiv ingrediens 0,200 g

Saltsyreopløsning 0,1M g.s. til pH 4,0 - 7,0

Natriumhydroxidopløsning 0,1M g.s. til pH 4,0 - 7,0 30 Sterilt vand g.s. til 10 ml.

Man opløste den aktive ingrediens i hovedparten af vandet ved 35-40°C og tilpassede pH til 4,0-7,0 med saltsyre eller natriumhydroxid efter behov. Derefter 35 fyldte man op med vand, filtrerede gennem et sterilt mikroporefilter i en steril 10 ml beholder af ravfarvet DK 169657 B1 18 glas (type 1) og forseglede med sterile låg og overlåg.

Præparat B

5 Aktiv ingrediens 0,125 g

Steril, pyrogenfri, pH 7 -citratpuffer, q.s. til 25 ml

Eksempel 6 10

Intramuskulær injektion

Aktiv ingrediens 0,20 g

Benzylalkohol 0,10 g 15 Glycofurol 75 1,45 g

Injektionsvand q.s. til 3,00 ml.

Man opløste den aktive ingrediens i glucofurol. Derefter tilsatte man benzylalkohol og opløste den, 20 hvorefter man tilsatte vand til 3 ml. Blandingen blev derefter filtreret gennem et sterilt mikroporefilter og forseglet i sterile 3 ml beholdere af ravfarvet glas (type 1).

25 Eksempel 7 Øj endråber

Aktiv ingrediens 0,20 g 30 Benzalkoniumchlorid 0,01 g

Isotonisk phosphatpuffer, pH 7 til 10,00 ml.

Man opløste den aktive ingrediens i hovedparten af den isotoniske phosphatpuffer. Man tilsatte benz-35 alkoniumchlorid og opløste det, hvorefter man fyldte op med yderligere isotonisk phosphatpuffer og filtrerede DK 169657 B1 19 gennem et sterilt, steriliserende filter, fyldte på sterile flasker til øjendråber og forseglede.

Eksempel 8 5 Øj ensalve

Aktiv ingrediens 0,5 g 0,5 g

Steril, hvid, blød paraffin til 5,0 g.

10

Man steriliserede den aktive ingrediens ved tør varme og blandede den med steril, hvid, blød paraffin under aseptiske betingelser. Den opnåede dispersion pakkes i sterile oftalmiske salvetuber.

15

Eksempel 9 Oftalmisk suspension 20 Aktiv ingrediens 0,1 g

Polysorbat 80 0,005 g

Thiomersal 0,001 g

Propylenglycol 0,1 g

Injektionsvand til 5,0 ml.

25

Man opløser polysorbat 80, thiomersal og propy-lenglycol i hovedparten af injektionsvandet.

30 Opløsningen steriliseres ved filtrering, hvoref ter man dispergerer steril, mikroniseret aktiv ingrediens i opløsningen under aseptiske betingelser. Man fylder op med yderligere injektionsvand, der i forvejen var steriliseret og pakker produktet i sterile flasker 35 til øjendråber, som man forsegler.

DK 169657 B1 20

Antiviral aktivitet

Man prøvede den anti-adenovirale aktivitet for den omhandlede forbindelse nr. 1 (se side 3) på følgen-5 de måde:

Man passerede celler fra en human epithelcelle-linie NCTC 2544 (EP) i serie fra 75 cm2 vævskulturflasker (Corning) med et forhold på 1/20 hver syvende dag. Dyrkningsmediet var Eagles BHK medium suppleret 10 med 10% kvægfosterserum og indeholdt 2,5% 4,4% natri- umbicarbonatopløsning sammen med 1% penicillin (5000 IU ml-1) og streptomycin (600 yg ml-1) (Flow).

Man fremstillede en beholdning af adenovirus af type 5 i 25 cm2 vævskulturflasker. Man podede flasker-15 ne med 2 x 106 EP-celler i dyrkningsmedium og inkuberede natten over ved 37°C. Man hældte mediet fra og satte 1,0 ml af virussuspension fra lageret til flasken. Efter et times adsorption satte man 10 ml opretholdelsesmedium (som ovenfor, men med 2% serum) til flasken.

20 Man inkuberede flasken ved 37°C. Efter 72 timer kunne man se den klassiske "drueklase" cytopatiske virkning. Derefter nedfrøs man flaskerne og optøede dem tre gange for at frigive virus, hvorefter man lagrede ved -70°C. Indhold af virus var sædvanligvis ca. 4 x 108 pfu 25 ml”1.

Man udførte plakassay i 50 mm diameter plastvævskul tur skåle, der først blev tilført 2 x 106 EP celler i dyrkningsmedium, og inkuberede natten over i 5% C02 ved 37°C. Man inokulerede adenovirus på cellemono-30 lagene i 1,0 ml serumfrit medium og lod adsorptionen foregå ved 37°C i en C02 inkubator i en time. Efter adsorption fjernede man overskud af inokulerende materiale og tilsatte 9,0 ml overlægningsmedium. Dette bestod af 0,5% agarose, Eagles BHK medium, 2,5% af 4,4% 35 natriumbicarbonatopløsning, 1,5% kvægfosterserum, 1% penicillin/streptomycinopløsning og 0,5% 3 M magnesium- DK 169657 B1 21 chloridopløsning. Pra den femte dag, hvor man kunne se plakker i den ikke-farvede kultur, fikserede man kulturerne i 10% af en 40% formaldehydopløsning i phos-phatpufret saltopløsning. Efter en times forløb fjer-5 nede man den overliggende gel fra pladen med postevand og farvede det frie monolag med 2 ml 0,5% methylviolet i 5% methanol.

EP-cellerne tillod produktiv vækst af adenovirus, og plakker var klart synlige.

10 Man opnåede følgende resultater for aktiviteten af den ovenfor nævnte forbindelse imod adenovirus af serotype 8:

Forbindelse nr. IC5 0(μΜ) 15__ 1 0,005

Bestemmelse af cytotoxicitet 20

Man bestemte cytotoksicitet ved hjælp af fremgangsmåden med trypanblåt eksklusion. Man udpræparerede NCTC 2544 celler i vækstmedium og satte portioner deraf til 25 cm3 vævskulturflasker med ca. 1 x 105 25 celler/ml. Efter 24 timers forløb opdelte man flaskerne og fyldte op med vækstmedium. Halvdelen af flaskerne fik vækstmedium med indhold af ti gange fortyndinger af forbindelsen, hvorved man udsatte cellerne for 1, 10 og 100 μΜ koncentrationer. Efter 24, 48 og 72 timer 30 udtog man repræsentative flasker fra inkubatoren og vaskede monolagene til fjernelse af affald. Cellerne blev resuspenderet i vækstmedium, og udtagne prøver deraf blev blandet med et lige så stort rumfang af trypanblåt. Farvede og uf arvede celler blev talt på et 35 hæmocytometer. Man omregnede celletal til celler/ml.

Derefter foretog man et overslag over vækst og overlevelse af behandlede og ubehandlede celler.

DK 169657 B1 22

Koncentrationen af forbindelse nr. l, der kan forårsage 50% inhibition af cellekultur, var 38 yM efter 72 timer.

Claims

1. Anvendelse af et uracilnucleosid med den al- 5 mene formel Hh/Sp 10 ° F hvori R betegner hydrogen, C1-4 alkyl, fluor eller brom eller et fysiologisk acceptabelt salt eller en fysiolo- 20 gisk acceptabel ester deraf, til fremstilling af et lægemiddel til behandling af eller profylakse for en ade-novirusinfektion.

2. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at uracilnucleosidet er 3'-desoxy-3*-fluor- 25 thymidin eller et farmaceutisk acceptabelt salt eller en farmaceutisk acceptabel ester deraf.

3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, hvorved adenovirusinfektionen er forårsaget af en adenovirus af serotype 8.

4. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, hvorved lægemidlet er på en form, der er egnet til oral indgivelse.

5. Anvendelse ifølge krav 4, hvorved lægemidlet er på form af en tablet eller en kapsel.

6. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, hvorved lægemidlet er på en form, der er egnet til oftalmisk indgivelse. DK 169657 B1

7. Anvendelse ifølge krav 6, hvorved lægemidlet er på form af øjendråber.

8. Anvendelse ifølge krav 6, hvorved lægemidlet er på form af en oftalmisk salve, creme, suspension el- 5 ler lotion.

9. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvorved lægemidlet er på en enhedsdosisform indeholdende 50-700 mg af et uracilnucleosid som defineret i krav l.

10. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det er på form af øjendråber, omfattende et uracilnucleosid som defineret i krav 1 sammen med en farmaceutisk acceptabel bærer.

11. Farmaceutisk præparat, kendetegnet 15 ved, at det er på form af en oftalmisk salve, creme, suspension eller lotion, omfattende et uracilnucleosid som defineret i krav 1 sammen med en farmaceutisk acceptabel bærer.

12. Præparat ifølge krav 10 eller 11, k e n -20detegnet ved, at uracilnucleosidet er 3'-des- oxy-31-fluorthymidin eller et farmaceutisk acceptabelt salt eller en farmaceutisk acceptabel ester deraf.