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Verfahren zur Anreicherung und Gewinnung eines die Steigerung der
Leukocytenhildung bewirkenden Stoffes Vorliegendes Verfahren hat die AnreichLerung
und Gewinnung eines die Bildung der weißen Blutkörperchen fördernden Wirkstoffes
zum Gegenstand.
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Während über die Eigenschaften und das Verhalten des die Eythrocytenbildung
fördernden Faktors schon Näheres bekannt ist, sind die Eigenschaften des die Leuksocytenbildung
fördernden Faktors so gut wie unbekannt.
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Anläßlich einer systematischen Untersuchung der Einwirkung der verschiedensten
Extrakte aus Magen- oder Darmschleimhaut, Blut oder gelbem Knochenmark auf die Blutbildung
wurde gefunden, daß der die Leukocytose fördernde Faktor in Wasser und wäßrigen
Lösungen löslich ist, daß er aber aus den wäßrigen Lösungen durch Zusatz wasserlöslicher
organischer Lösungsmittel gefällt werden kann, wenn die Konzentration der Lösungen
reicher an dem organischen Lösungsmittel wird. So wird dieser Faktor z.B. durch
60- bis gooioigen Mkohol oder durch Acetoliösungen etwa gleicher Konzentration gefällt.
Fernerhin hat sich gezeigt, daß der Faktor recht beständig gegen die Einwirkung
hoher Temperaturen ist, indem ler z. B. 70, So, 9c° und selbst noch höhere Temperaturen
verträgt. Diese Hitzebeständigkeit wie auch seine Fällbarkeit durch konzentriertere
Lösungen organisciher Lösungsmittel in Wasser erlauben es, ihn aus tierischen Organen
abzuscheiden und zu gewinnen.
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Das Verfahren vorliegender Erfindung zur Anreicherung und Gewinnung
eines die Leukocytcse fördernden Faktors, insbesondere für
Injektionszwecke.
besteht demgemäß darin. daß man ihn enthaltende Flüssigkeiten oder Extrakte von
Magen- oder Darmschleimhaut, Blut oder gelbem Knochenmark in Wasser oder verdünnten
wäßrigen Lösungen organischer Lösungsmittel nach Enteiweißung durch Zusatz mit Wasser
mischbarer organischer Lösungsmittel fällt, die Fällungsprodukte in Wasser oder
verdünnten wäßrigen organischen Lösungen löst, Fällung und Wiederauflösung gegebenenfalls
ein oder mehrmals wiederholt und die zuletzt erhaltenen Lösungen dann sterilisiert.
Gegebenenfalls kann man sich bei dem Verfahren einer Kontrolle der in Frage kommenden
Lösungen und Fraktionen auf ihren Gehalt an dem die Leukocytose fördernden Faktor
durch Auszählung eines nach Injektion der Lösung gewonnenen Blutbildes bedienen.
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In der österreichischen Patentschrift 152 396 ist ein Verfahren zur
Darstellung eines den Darmkanal entgiftenden Wirkstoffes aus D,armschleimhaut beschrieben;
hiernach werden die Darmschleimhäute nach Vorbehandlung mit Desinfektionsmitteln
und Einfrieren mit Pufferlösungen behandelt, die filtrierten Lösungen mit gekühltem
wasserlös]ichem ,organischem Lösungsmittel versetzt und die ausgefällten Stoffe
auf Puffersubstanzen niedergeschlagen. Infolge von den gegenüber dem vorliegenden
Verfahren abweichenden Maßnahmen wird dabei ein Produkt erhalten, das sich, abgesehen
von seiner anders artigen physiologischen Wirkung. von dern Leukocytosefaktor durch
seine Unbeständigkeit gegen höhere Temperaturen unterscheidet.
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Beispiele I. 3,6kg gelbes Knochenmark von Rindern werden mit sol
Wasser zum Sieden erhitzt.
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Dann wird die Lösung durch Zugabe von goccm fünffach normaler Essigsäure
und weiteres Erhitzen für etwa 5 Minuten auf 95 enteiweißt. Man trennt von der wäßrigen
Flüssigkeit das Fett ab, filtriert heiß und neutralisiert mit Natriumbicarbonat.
Es werden dann 201 Aceton zu der abgekühlten Lösung unter Umrühren zugefügt. Der
hierbei ausfallende Niederschlag wird abgesaugt. er kann gegebenenfalls nochmals
in Wasser gelöst und mit etwa dem dreifachen Volunien Aceton erneut gefällt werden.
Dann wird mit Aceton und Äther getrocknet. Die erhaltene Substanz stellt ein rein
weißes Pulver vor, das zu 6o mg, in 2 ccm Wasser gelöst, innerhalb von 4 bis 6 Stunden
eine Leukocytensteigerung von óooo bis 8000 auf 16 000 bis 22 000 hervorruft. Die
Injektionslösung wird durch kurzes Kochen sterilisiert.
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2. 1 kg von entfettetem gelbem Knochenmark wird mit 201 Wasser von
einem pI: von 9 extrahiert, worauf kurze Zeit erhitzt ; wird. Das Filtrat wird mit
Äthylalkobol verrührt und die Fällung sviederum in Wasser von pH = 9 aufgelöst.
Diese Lösung wird auf ein PH von 4,8 gebracht. die entstandene Flockung abfiltriert
und das Filtrat mit.thylalkohol verrührt. Der so gefällte Wirkstoff ergibt in Dosen
von 30 mgi'2 ccm eine Steigerung der Leukocytenzahl von 5200 auf 13 500.
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3. 65o g von Schweinemagen oder Zwölfüngerdarni werden fein zerkleinert
und in 31 Wasser, das, um einer zu starken Quelilung entg-egenzuwirken, zweckmäßig
schwach alkalisch gehalten wird (PH etwa = 9 bis bis IO,, unter öfterem Umschütteln
und unter Zusatz von etwas Chloroform 4 Tage im Eisschrank stehengelassen. Dann
wird die SIasse durch ein Koliertuch gepreßt, worauf das enteiweißte Filtrat mit
Salzsäure neutralisiert und mit etwa 61 Aceton verrührt wird.
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Der Niederschlag wird nochmals mit schwach alkalisch gemachtem Wasser
gelöst und aus der Lösung durch Zugabe des etwa fachen Volumens Aceton erneut gefällt.
Man sterilisiert die wäßrige Lösung des zuletzt erhaltenen Fällungsproduktes, dessen
Wirksamkeit der des Verfahrensproduktes gemäß Beispiel 1 entspricht, in der Hitze.
Man kann aber auch statt dessen oder zusätzlich sterili sierend wirkende Stoffe,
wie Trikresol usw., zusetzen.
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4. I kg von frischem Magen werden gut zerkleinert und mit 8 1 Wasser
von einem PH von 9,7 ausgezogen, worauf kurze Zeit erhitzt wird. Das Filtrat wird
mit Aceton oder Alkohol gefällt. Die entstehende Fällung wird gut abgesaugt und
in Wasser von einem pH von 8 bis 10 aufgenommen. Man stellt darauf auf ein PH von
4,8 ein und trennt von der dabei entstehenden Ausflokkung ab. Aus dem Filtrat wird
der Wirkstoff in hochkonzentrierter Form durch Zugabe von Lösungsmitteln. wie Aceton,
Alkohol u. dgl., gefällt. Der getrennte Wirkstoff stellt ein in Wasser lösliches
weißes Pulver vor, dessen Lösungen in üblicher Weise sterili siert werden können.
Eine Injektion voli 20 mg dieses Pulvers. in 2 ccm Wasser gelöst, bewirkt beim Menschen
eine Steigerung der Leukocytenzahl von öooo auf 16 000.
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Statt von zerkleinertem frischem Magen kann auch von Magentrockenpulver
ausge gangen werden.