DE69936100T2

DE69936100T2 - Somatostatin-analoge mit einer zyklisierten konformationsbeschränkten hauptkette

Info

Publication number: DE69936100T2
Application number: DE69936100T
Authority: DE
Inventors: Vered Hornik; Michel M. Afargan; Gary Gellerman
Original assignee: Peptor Ltd
Current assignee: Peptor Ltd
Priority date: 1998-06-19
Filing date: 1999-06-15
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2019-06-16
Also published as: AU4288499A; IL139956A0; ATE362371T1; EP1085896A4; NZ508956A; AU747515B2; JP4637352B2; US6930088B2; US7060679B2; US20020052315A1; KR20010071523A; ES2288029T3; CY1106781T1; US6355613B1; DE69936100D1; WO1999065508A1; KR100689402B1; US20050043226A1; CA2335488C; CA2335488A1

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Somatostatinanaloga mit cyclischen Gerüst mit erzwungener Konformation, die über neue Bindungen cyclisiert sind und pharmazeutische Zusammensetzungen, die dieselben enthalten.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Somatostatinanaloga
Somatostatin ist ein cyclisches Tetradecapeptid, das sowohl im zentralen Nervensystem als auch in periphären Geweben gefunden wird. Es wurde ursprünglich isoliert aus Sängerhypothalamus und identifiziert als ein wichtiger Inhibitor der Wachstumshormonsekretion des Hypophysenvorderlappens. Seine vielfachen biologischen Aktivitäten umfassen Inhibierung der Sekretion von Glucagon und Insulin des Pankreas, Regulation der meisten Darmhormone und Regulation der Freisetzung anderer Neurotransmitter, die beteiligt sind an motorischen Aktivitäts- und Wahrnehmungsprozessen im zentralen Nervensystem (siehe zur Übersicht Lamberts, Endocrine Rev., 9:427, 1988). Zusätzlich sind Somatostatin und seine Analoga potenziell geeignete Antiproliferationsmittel für die Behandlung verschiedener Typen von Tumoren.
Natürliches Somatostatin (ebenfalls bekannt als Somatotropin Release Inhibiting Factor, SRIF (Somatotropinfreisetzungsinhibierungsfaktor)) mit der folgenden Struktur:
H-Ala¹-Gly²-Cys³-Lys⁴-Asn⁵-Phe⁶-Phe⁷-Trp⁸-Lys⁹-Thr¹⁰-Phe¹¹-Thr¹²-Ser¹³-Cys¹⁴-OH
wurde zum ersten mal isoliert von Guillemin und Kollegen (Bruzeau et al. Science, 179:78, 1973). Es übt seine Wirkungen durch Wechselwirkung mit einer Familie von Rezeptoren aus. Kürzlich sind fünft Rezeptorsubtypen, bezeichnet als SST-R1 bis 5, identifiziert und kloniert worden. Der exakte funktionale Unterschied zwischen diesen Rezeptorsubtypen ist bis jetzt nicht vollständig aufgeklärt worden.
In seiner natürlichen Form hat Somatostatin eine begrenzte Anwendung als therapeutisches Mittel, da es zwei unerwünschte Eigenschaften zeigt: geringe Bioverfügbarkeit und kurze Wirkungsdauer. Aus diesem Grund sind während der letzten zwei Jahrzehnte große Anstrengungen unternommen worden, um Somatostatinanaloga zu finden, die überragend sind sowohl hinsichtlich Potenz, Biostabilität, Wirkungsdauer als auch Selektivität im Hinblick auf die Inhibierung der Freisetzung von Wachstumshormon, Insulin oder Glucagon.
Untersuchungen des Zusammenhangs zwischen Struktur und Aktivität, Spektroskopietechniken, wie etwa Zirkulardichroismus und kernmagnetische Resonanz und Molekularmodellierung ergeben das Folgende: die Konformation des cyclischen Teils von natürlichem Somatostatin ist wahrscheinlich ein antiparalleles β-Blatt; Phe⁶ und Phe¹¹ spielen eine wichtige Rolle beim Stabilisieren der Pharmakophorkonformation durch hydrophobe Wechselwirkungen zwischen zwei aromatischen Ringen; die vier Aminosäuren Phe⁷-Trp⁸-Lys⁹-Thr¹⁰, die um die β-Windung in dem antiparallelen β-Blatt verteilt sind, sind wesentlich für das Pharmakophor; und (D)Trp⁸ ist bevorzugt gegenüber (L)Trp⁸ für die Wechselwirkungen mit Somatostatinrezeptorsubtypen 2 bis 5.
Nichtsdestotrotz ist ein Hexapeptid-Somatostatinanalog, das diese vier Aminosäuren, verankert durch eine Disulfidbrücke:
nahezu inaktiv, sowohl in vitro als auch in vivo, wenngleich es den Vorteil der kovalenten Disulfidbrücke zeigt, welche die Phe⁶-Phe¹¹-hydrophoben Wechselwirkungen in natürlichem Somatostatin ersetzt.
Vier Hauptansätze sind unternommen worden, um die Aktivität dieses Hexapeptid-Somatostatinanalogs zu erhöhen.
(1) Ersetzen der Disulfidbrücke durch eine Cyclisierung, die eine cis-Amidbindung unterstützt, oder Durchführen einer zweiten Cyclisierung im Molekül, was zu einem bicyclischen Analog führt. In beiden Fällen hat das resultierende Analog eine verringerte Anzahl von konformativen Freiheitsgraden. (2) Ersetzen der ursprünglichen Reste in der Sequenz Phe⁷-(D)Trp⁸-Lys⁹-Thr¹⁰ mit anderen natürlichen oder nichtnatürlichen Aminosäuren, wie etwa Ersetzen von Phe⁷ durch Tyr⁷ und Thr¹⁰ mit Val¹⁰. (3) Einführen zusätzlicher funktioneller Gruppen von natürlichem Somatostatin mit dem Ziel, dass diese neuen Elemente zu der Wechselwirkung mit dem Rezeptor beitragen werden. (4) Eliminieren einer der vier Aminosäuren Phe⁷-(D)Trp⁸-Lys⁹-Thr¹⁰ unter der Annahme, dass solche Analoga selektiver sein würden. Das Somatostatinanalog MK-678:
cyclo(N-Me-Ala⁶-Tyr⁷-(D)Trp⁸-Lys⁹-Val¹⁰-Phe)
ist ein Beispiel eines hochpotenten Somatostatinanalogs, entwickelt unter Verwendung der ersten drei obigen Ansätze (Veber, et al., Life Science, 34:371, 1984). In diesem Hexapeptidanalog ist eine cis-Amid-Bindung lokalisiert zwischen N-Me-Ala und Phe¹¹, Tyr⁷ und Val¹⁰ ersetzen Phe⁷ bzw. Thr¹⁰ und Phe¹¹ ist inkorporiert von natürlichem Somatostatin.
Eine andere Gruppe von Somatostatinanaloga ( U.S. Patente 4,310,518 und 4,235,886 ) umfassen Octreotid:
das erste zugelassene Somatostatinanalog, das klinisch verfügbar ist.
Es wurde entwickelt unter Verwendung des dritten oben beschriebenen Ansatzes. Hier wird angenommen, dass (D)Phe⁵ und das reduzierte C-terminale Thr¹²-CH₂OH einen Teil des Konformationsraumes besetzen, der verfügbar ist für das natürliche Phe⁶ bzw. Thr¹².
Die Verbindung TT-232:
ist eng verwandt mit Octreotid und ist ein Beispiel der Ausführung des vierten oben beschriebenen Ansatzes. Das Fehlen von Thr¹⁰ ist wahrscheinlich verantwortlich für seine hohe funktionelle Selektivität im Hinblick auf Antitumoraktivität.
Diese Beispiele von hochpotenten Somatostatinanaloga legen nahe, dass die Phenylalanine in den Positionen 6 und 11 nicht nur eine wichtige Rolle beim Stabilisieren der Pharmakophorkonformation spielen, sondern auch eine funktionale Rolle bei der Wechselwirkung mit dem Rezeptor spielen. Eine weitere offen Frage ist, ob ein Phenylalanin (entweder Phe⁶ oder Phe¹¹) ausreichend ist für die Wechselwirkung mit dem Rezeptor oder ob beide erforderlich sind.
Es ist bekannt, dass die Somatostatinrezeptoren eine Familie von fünf verschiedenen Rezeptorsubtypen bilden (Bell und Reisine, Trends Neurosci., 16, 34–38, 1993); die unterschieden werden können auf Basis ihrer Gewebespezifität und/oder biologischen Aktivität.
Therapeutische Anwendungen von Somatostatinanaloga
Hinsichtlich ihrer inhibitorischen pharmakologischen Eigenschaften können Somatostatinanaloga verwendet werden zur Behandlung von Patienten mit Hormon-sekretierenden- und Hormon-abhängigen Tumoren. Derzeit werden Symptome, die verbunden sind mit metastatischen karzinoiden Tumoren (Flush, Diarrhoe, Herzklappenerkrankung und Abdominalschmerz) und vasoaktives intenstinales Peptid (VIP) sezernierende Adenome (wässrige Diarrhoe) mit Octreotid behandelt. Octreotid wurde ebenfalls zugelassen zur Behandlung von schweren Gastrointestinalhämorrhagien und Acromegalie. Zusätzlich ermöglicht die Fülle von Hochaffinitäts-Somatostatinrezeptoren in verschiedenen Tumoren die Verwendung von radioaktiv markierten Somatostatinanaloga in vivo zur Sichtbarmachung dieser Tumore (Lamberts et al. N. Engl. J. Med., 334:246, 1996). In neuroendokrinen Tumoren, insbesondere Karzinoide und VIPoma, inhibiert Octreotid sowohl die Sekretion als auch die Wirkung des aktiven Mittels. Daher verringern Somatostatinanaloga in VIPoma, die gekennzeichnet sind durch Diarrhoe mit übermäßiger Sekretion durch die Inhibierung von VIP-Sekretion und durch direkte Wirkung auf die Intestinalsekretion. Jedoch nimmt die Reaktion auf das Arzneimittel mit der Zeit häufig ab, möglicherweise aufgrund der Hinabregulierung von Somatostatinrezeptoren auf Tumorzellen oder aufgrund der Erzeugung von Rezeptornegativklon. Das Fehlen von konsistenter antiproliferativer Wirkung kann verbunden sein mit der geringen Affinität von Octreotid für einige der Somatostatinrezeptorsubtypen, die in diesen Tumoren gefunden werden (Lamberts et al. ibid.).
Wie berichtet, verbessern natives Somatostatin und Octreotid die Symptome von sekretorischer Diarrhoe, im Unterschied zu denjenigen, die mit Neuroendokrintumoren verbunden sind. Die Kontrolle von sekretorischer Diarrhoe, die assoziiert ist mit dem Syndrom des kurzen Darms, Ileostomdiarrhoe, idiopathische sekretorische Diarrhoe, Diarrhoe, die assoziiert ist mit Amyloidose und diabetische Diarrhoe sind beschrieben worden. Von beiden Verbindungen ist gezeigt worden, dass sie ebenfalls eine gewisse Hoffnung geben bei der Handhabung von Refraktäriarrhoe, die mit AIDS in Beziehung steht, im Besonderen bei Patienten ohne identifizierbare Pathogene. Somatostatinanaloga, die in der Technik bekannt sind, können keine ausreichende Selektivität oder Rezeptorsubtypselektivität bereitstellen, insbesondere als antineoplastische Mittel (Reubi und Laissue, TIPS, 16, 110–115, 1995).
Somatostatinanaloga, die selektiv für Typ 2- und Typ 5-Rezeptoren sind, die Wachstumshormon, jedoch nicht Insulinfreisetzung inhibieren, können potenziell verwendet werden zur Behandlung von nicht-Insulin abhängiger Diabetes Mellitus (NIDDM). Geringere Potenz auf Glucagonfreisetzungsinhibierung ist bevorzugt zur Reduktion der peripheren Resistenz gegenüber Insulin und zur Verbesserung der glykämischen Kontrolle.
Wachstumshormon ist ein direkter Antagonist des Insulinrezeptors in der Peripherie und Wachstumshormonüberproduktion ist assoziiert mit Insulinperipherresistenz. Erhöhter IGF, was ein prinzipielles biologisches Signal des Wachstumshormons ist, ist assoziiert mit diabetischen Komplikationen, wie etwa Angiopathie, Retinopathie und Nephropathie. Nephropathie ist eine der Hauptkomplikationen von diabetischer Angiopathie und einer der Hauptgründe für das Endstadium von Nierenversagen und Tod von Diabetespatienten. Der Nachweis der signifikaten Beteiligung der GH-IGF-Achse in diabetischen oder anderen Nephropathien kann bereitgestellt werden durch mehrere Untersuchungen (Flyvbjerg A. Kidney Int. S12–S19, 1997). Es wurde kürzlich gefunden, dass erhöhte Serumwachstumshormongehalte in den Non-Obese-Diabetic (NOD)-Mäusen ähnlich sind zu den Änderungen, die beschrieben sind bei Menschen (Landau et al. J. Am. Soc. Nephrol. 8:A2990, 1997). Diese Entdeckungen ermöglichen die Erklärung der Rolle der Wachstumshormon-IGF-Achse bei diabetischer Retinopathie und das Testen von Somatostatinanaloga auf potenzielle therapeutische Wirkung in diesen sekundären mit Diabetes assoziierten Komplikationen.
Verbesserte Peptidanaloga
Es wäre wünschenswert, Peptidanaloga bereitzustellen mit einer größeren Spezifität für Rezeptorsubtypen, wobei verbesserte klinische Serlektivität erreicht wird.
Als ein Ergebnis der Hauptfortschritte in der organischen Chemie und in der Molekularbiologie können viele bioaktive Peptide nun hergestellt werden in Mengen, die ausreichend sind für pharmakologische und klinische Anwendungen. So sind in den letzten Jahren neue Methoden entwickelt worden für die Behandlung und Therapie von Krankheiten, worin Peptide impliziert waren. Jedoch ist die Verwendung von Peptiden als Arzneimittel durch die folgenden Faktoren begrenzt: a) ihre geringe Stoffwechselstabilität gegenüber Proteolyse im Gastrointestinaltrakt und im Serum; b) ihre geringe Absorption nach oraler Aufnahme, insbesondere aufgrund ihrer relativ hohen Molekülmasse oder des Fehlens spezifischer Transportsysteme oder aufgrund von beidem; c) ihrer schnellen Ausscheidung durch die Leber und Nieren; und d) ihrer ungewünschten Nebenwirkungen in nicht-Targetorgansystemen, da Peptidrezeptoren weit in einem Organismus verteilt werden können.
Es wäre am vorteilhaftesten Peptidanaloga mit erzwungener Konformation zu erzeugen, die die Nachteile von den nativen Peptidmolekülen beseitigen, wobei verbesserte therapeutische Eigenschaften bereitgestellt werden.
Ein neuer konzeptioneller Ansatz für Peptide, deren Konformation erzwungen ist, wurde eingeleitet von Gilon et al., (Biopolymers 31:745, 1991), der Gerüst-an-Gerüst-Zyklisierung von Peptiden vorschlug. Die theoretischen Vorteile dieser Strategie umfassen die Möglichkeit zum Beeinflussen der Zyklisierung über die Kohlenstoffe oder Stickstoffe des Peptigerüsts ohne Wechselwirkung mit Seitenketten, die äußerst wichtig sein können für Wechselwirkung mit dem spezifischen Rezeptor eines gegebenen Peptids. Während das Konzept als anwendbar auf jedes lineare Peptid erachtet wurde, das von Interesse ist, war tatsächlich der limitierende Faktor des vorgeschlagenen Schemas die Verfügbarkeit von geeigneten Baueinheiten, die verwendet werden müssen, um die Aminosäuren zu ersetzen, die verbunden werden müssen über überbrückende Gruppen. Die tatsächliche Reduktion auf die Praxis dieses Konzepts der Gerüstzyklisierung wurde dadurch verhindert, dass es nicht möglich war ein praktisches Verfahren zum Herstellen von Baueinheiten von Aminosäuren, die verschieden von Glycin sind, zu erdenken (Gilon et al., J. Org. Chem., 587:5687, 1992).
Weitere Offenbarungen von Gilon und Mitarbeitern ( WO 95/33765 und WO 97/09344 ) lieferten Verfahren zum Herstellen von Bauinheiten, die erforderlich sind bei der Synthese von Peptidanaloga mit zyklischem Gerüst. Kürzlich wurde auch die erfolgreiche Verwendung dieser Verfahren zum Herstellen von Peptidanaloga zyklischem Gerüst mit Somatostatinaktivität ebenfalls offenbart ( WO 98/04583 ).
Keine der zugrundliegenden Techniken lehrt oder legt die Somastotatinanaloga, die hier offenbart sind, nahe, die verbesserte therapeutische Selektivität aufweisen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden neue Peptidanaloga bereitgestellt, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie neue Baueinheiten mit überbrückenden Gruppen umfassen, die gebunden sind an die alpha-Stickstoffe von alpha-Aminosäuren. Im Speziellen sind diese Verbindungen Somatostatinanaloga mit zyklischem Gerüst, umfassend eine Peptidsequenz aus vier bis vierundzwanzig Aminosäuren, wobei jedes Analog mindestens eine Baueinheit umfasst, wobei die Baueinheit ein Stickstoffatom des Peptidgrundgerüsts, verbunden mit einer überbrückenden Gruppe bzw. Überbrückungsgruppe enthält, umfassend ein Amid, Thioether, Thioester oder Disulfid, worin die mindestens eine Baueinheit verbunden ist über die Überbrückungsgruppe, um eine zyklische Struktur zu bilden mit einer Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer zweiten Baueinheit, der Seitenkette eines Aminosäurerestes der Sequenz oder dem N-terminalen Aminosäurerest.
Bisher hatten Somatostatinanaloga mit cyclischem Gerüst mit erzwungener Konformation vorherrschend Selektivität für Rezeptorsubtyp 5. Diese Analoga hatten eine begrenzte therapeutische oder diagnostische Anwendbarkeit.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der Formel Nr. 7:
wie unten definiert.
Ein derzeit am meisten bevorzugtes Analog der vorliegenden Erfindung ist PTR 3173 mit verbesserter Selektivität der Bindung an SST-Rezeptorsubtyp SST-R2 und SST-R5.
Für zusätzliche am meisten bevorzugte Analoga, die offenbart sind, ist die Brücke verbunden zwischen dem N^α-ω-funktionalisiertem Derivat einer Aminosäure und dem N-Terminus der Peptidsequenz. Für andere bevorzugte Analoga der vorliegenden Erfindung ist die Brücke verbunden zwischen einer Baueinheit, umfassend ein N^α-ω-funktionalisiertes Derivat mit einer terminalen Thiogruppe und einem anderen solchen Derivat einer Aminosäure, oder an der Seitenkette eines Cys-Restes, mit einer Mercaptoenthaltenden Säure oder einem anderen SH-enthaltenden Rest, um eine Disulfidbrücke zu bilden.
Die am meisten bevorzugten Somatostatinanaloga mit cyclischen Gerüst gemäß der Erfindung sind beschrieben in Tabelle 1: Tabelle 1. Die am meisten bevorzugten Analoga der Erfindung.

PTR Sequenz SST-R

3173 GABA*-Phe-Trp-(D)Trp-Lys-Thr-Phe-Gly(C3)-X 2,5

3229 Galactose-Dab*-Phe-Trp-(D)Trp-Lys-Thr-Phe-Gly(C3)-X

worin X-NH₂ oder -OH ist und die überbrückende Gruppe sich zwischen den zwei Baueinheiten oder wie unten angegeben erstreckt:
Für PTR 3173 gibt das Sternchen an, dass die überbrückende Gruppe verbunden ist zwischen dem N^α-ω-funktionalisierten Derivat von einer Aminosäure und dem N-Terminus des Peptids.
SST-R bezeichnet die Somatostatinrezeptorsubtypen, für welche jedes Analog selektiv ist.
Diese Somatostatinpeptidanaloga mit cyclischem Gerüst werden hergestellt durch Aufnehmen mindestens eines N^α-ω-funktionalisierten Derivats einer Aminosäure in eine Peptidsequenz und nachfolgendes selektives Cyclisieren der funktionellen Gruppe mit einer der beiden Seitenketten der Aminosäuren in der Peptidsequenz oder mit einem anderen ω-funktionalisierten Aminosäuresderivat. Das N^α-ω-funktionalisierte Derivat von Aminosäuren hat vorzugsweise die folgende Formel:
worin X eine Abstandsgruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkylen, substituiertem Alkylen, Arylen, Cycloalkylen und substituiertem Cycloalkylen; R' eine Aminosäureseitenkette ist, optional verbunden mit einer spezifischen Schutzgruppe; B eine Schutzgruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkyloxy, substituiertem Alkyloxy oder Arylcarbonylen; und G eine funktionelle Gruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Aminen, Thiolen, Alkoholen, Carbonsäuren und Astern, Aldehyden, Alkoholen und Alkylhalogeniden; und A eine spezifische Schutzgruppe von G ist.
Bevorzugte Baueinheiten sind ω-funktionalisierte Aminosäurederivate, worin X Alkylen ist; G eine Thiolgruppe, eine Aminogruppe oder eine Carboxylgruppe ist; und R' die Seitenkette einer Aminosäure ist. Weiter bevorzugt sind ω-funktionalisierte Aminosäurederivate, worin R' geschützt ist mit einer spezifischen Schutzgruppe.
Mehr bevorzugt sind ω-funktionalisierte Aminosäurederivate, worin G eine Aminogruppe, eine Carboxylgruppe oder eine Thiolgruppe mit den folgenden Formeln ist:
worin X, R' und B wie oben definiert sind.
Die am meisten herausragenden Vorteile dieser Verfahren sind:

1) Cyclisieren der Peptidsequenz wird erreicht ohne Beeinträchtigen einer der Seitenketten des Peptids, wobei die Wahrscheinlichkeiten der Zerstörung funktioneller Gruppen, die wesentliche für biologische Erkennung und biologische Funktion sind, abnimmt.
2) Optimierung der Peptidkonformation wird erreicht indem Permutation der Brückenlänge, -richtung und des Bindungstyps (z.B. Amid, Disulfid, Thioether, Thioester usw.) und der Position der Bindung im Ring zugelassen wird.
3) Bei Anwendung auf die Cyclisierung von linearen Peptiden mit bekannter Aktivität kann die Brücke auf eine solche Art ausgestaltet werden, um Wechselwirkung mit der aktiven Region des Peptids und seinem verwandten Rezeptor zu minimieren. Dies erniedrigt die Möglichkeiten des Cyclisierungsarms zum Stören der Erkennung und Funktion und bildet ebenfalls eine Stelle, die geeignet ist zur Bindung von Markierungen, wie etwa radioaktive Tracer, cytotoxische Arzneimittel, Lichteinfangsubstanzen oder einem anderen gewünschten Markierungsmittel.

Analoga mit cyclischem Gerüst der vorliegenden Erfindung können verwendet werden als pharmazeutische Zusammensetzungen und in Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen, einschließlich: Krebs (einschließlich Karzinoidsyndrom), endokrine Störungen (einschließlich Akromegalie und NIDDM), Diabetes-assoziierte Komplikationen (einschließlich diabetische Nephropathie, diabetische Angiopathie und diabetische Retinopathie), Magen-Darm-Störungen, Pankreatitits, Autoimmunerkrankungen (einschließlich rheumatische Arthritis und Psoriasis), Arteriosklerose, Retenose, post-operativer Schmerz und Entzündungskrankheiten. Zusätzlich werden Somatostatinanaloga gemäß der Erfindung geeignet sein bei der Verhinderung von Arteriosklerose und Restenose durch Inhibieren von Wachstumfaktoren, die an diesen Störungen beteiligt sind.
Die bevorzugten Analoga, die in der vorliegenden Erfindung offenbart sind, besitzen einzigartige Merkmale der Stoffwechselstabilität, Selektivität ihrer in vivo-Aktivitäten und Sicherheit. Das am meisten bevorzugte offenbarte Analog (PTR 3173) bietet einen Arzneimittelkandidaten mit einem klaren therapeutischen Potenzial zur Behandlung von Karzinoidtumoren, Akromegalie und Diabetes-assoziierten Komplikationen. Dieses am meisten bevorzugte Analog hat signifikante Vorteile gegenüber jedem anderen Somatostatinanalog, das derzeit verfügbar ist, dahingehend, dass es äquipotent ist wie verfügbare Somatostatinanaloga bei der Wachstumshormoninhibierung, ohne nennenswerte Wirkungen auf Insulin oder Glucagon.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die pharmazeutisch aktive Somatostatinagonisten oder -antagonisten mit cyclischem Gerüst und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel umfassen, stellen eine andere Ausführungsform der Erfindung dar, wie auch die Verfahren zur Behandlung von Krebs, endokrinen Störungen, Magen-Darm-Erkrankungen, Diabetes-assoziierten Komplikationen, Pankreatitis, Autoimmunerkrankungen und Entzündungserkrankungen, Arteriosklerose und Restenose unter Verwendung solcher Zusammensetzungen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen vorteilhafterweise mindestens ein Peptidanalog mit cyclischem Gerüst, das selektiv ist für einen oder zwei Somatostatinrezeptorsubtypen. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können über jeden geeigneten Verabreichungsweg verabreicht werden, einschließlich oral, topisch oder systemisch. Bevorzugte Arten zur Verabreichung umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein, parenterale Wege, wie etwa intravenöse und intramuskuläre Injektionen als auch nasale oder orale Aufnahme.
Analoga mit cyclischen Gerüst der vorliegenden Erfindung können ebenfalls verwendet werden als pharmazeutische Zusammensetzungen in Verfahren zur Diagnose von Krebs und Bilddarstellung des Vorliegens von Tumoren oder ihren Metastasen. Die Verfahren zur Diagnose von Krebs umfassen das Verabreichen an einen Säuger, einschließlich einen humanen Patienten, eines Analogs oder von Analoga mit cyclischem Gerüst, markiert mit einer nachweisbaren bzw. feststellbaren Sonde, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem radioaktiven Isotop und einem nichtradioaktivem Tracer. Die Verfahren zur Diagnose oder Bilddarstellung von Krebs unter Verwendung solcher Zusammensetzungen stellen eine andere Ausführungsform der Erfindung dar.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Graph, der die prozentuale Inhibierung von SRIF-Bindung an 5 humane klonierte Somatostatinrezeptoren durch PTR-3173 zeigt.
2 ist ein Graph, der die nichtspezifische Bindung von Somatostatinanaloga (getestet bei einer Konzentration von 100 nM) an verschiedene G-Protein-gekoppelte Rezeptoren zeigt.
3 ist ein Graph, der die Wirkung von Somatostatinanaloga gemäß der Erfindung auf die Freisetzung von Wachstumshormon im Vergleich mit Octreotid zeigt.
4 ist ein Graph, der die Dosisreaktionswirkung des Somatostatinanalogs gemäß der vorliegenden Erfindung auf die Freisetzung von Glucagon zeigt.
Die 5a und 5b sind Graphen, die die Wirkung von Somatostatinanaloga gemäß der Erfindung auf die Freisetzung von Insulin im Vergleich mit Octreotid in drei verschiedenen Versuchen zeigen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die hier beschriebenen Verbindungen können asymmetrische Zentren aufweisen. Alle chiralen, diastereomeren und racemischen Formen sind von der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Viele geometrische Isomere von Doppelbindungen und dgl. können ebenfalls in den Verbindungen, die hier beschrieben sind, vorliegen, und alle solche stabilen Isomere sind in der vorliegenden Erfindung vorgesehen.
Unter „stabile Verbindung" oder „stabile Struktur" versteht sich hier eine Verbindung, die ausreichend stabil ist, um eine Isolierung bis zu einem geeigneten Reinheitsgrad aus einem Reaktionsgemisch und die Formulierung in einem wirkungsvollen therapeutischen Mittel zu überstehen.
Wie hier und in den Ansprüchen verwendet, soll „Alkyl" oder „Alkylenyl" sowohl verzweigte als auch geradkettige gesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppen mit einem bis zehn Kohlenstoffatomen umfassen; „Alkenyl" soll Kohlenwasserstoffketten mit entweder einer geradkettigen oder verzweigten Konfiguration umfassen, wobei zwei bis zehn Kohlenstoffatome und ein oder mehrere ungesättigte Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen vorliegen können, die an jedem stabilen Punkt entlang der Kette auftreten können, wie etwa Ethenyl, Propenyl und dgl.; und „Alkinyl" soll Kohlenwasserstoffketten mit entweder einer geradkettigten oder verzweigten Konfiguration umfassen, mit von zwei bis zehn Kohlenstoffatomen und einer oder mehreren Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindungen, die an jedem stabilen Punkt entlang der Kette auftreten können, wie etwa Ethinyl, Propinyl und dgl.
Wie hier und in den Ansprüchen verwendet, soll „Aryl" einen beliebigen stabilen 5- bis 7-gliedrigen monocyclischen oder bicyclischen oder 7- bis 14-gliedrigen bicyclischen oder tricyclischen Kohlenstoffring umfassen, wobei jeder von diesen gesättigt, teilweise ungesättigt oder aromatisch sein kann, z.B. Phenyl, Naphthyl, Indanyl oder Tetrahydronaphthyl usw.
Wie hier und in den Ansprüchen verwendet, soll „Alkylhalogenid" sowohl verzweigte als auch geradkettige gesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppen mit einem bis zehn Kohlenstoffatomen, worin 1 bis 3 Wasserstoffatome ersetzt worden sind durch ein Halogenatom, wie etwa Cl, F, Br und I, umfassen.
Wie hier und in den Ansprüchen verwendet, bedeutet der Ausdruck „therapeutisch wirksame Menge" die Menge eines neuen Peptidanalogs mit cyclischem Gerüst oder Zusammensetzungen, die dasselbe umfassen, die zu verabreichen ist an einen Wirt, um die gewünschten Ergebnisse für die hier beschriebenen Indikationen zu erreichen, wie etwa, ohne darauf begrenzt zu sein, Entzündungskrankheiten, Krebs, endokrine Störungen und Magen-Darm-Erkrankungen.
Der Ausdruck „substituiert" bedeutet, wie er hier und in den Ansprüchen verwendet wird, dass beliebig ein oder mehrere Wasserstoffatome auf dem gekennzeichneten Atom ersetzt werden mit einer Auswahl aus der angegebenen Gruppe, vorausgesetzt, dass die normale Valenz des angegebenen Atoms nicht überschritten wird und dass die Substitution zu einer stabilen Verbindung führt.
Wenn eine Variable (z.B. R, X, Z usw.) mehr als einmal in einem beliebigen Konstituenten oder in einer hier genannten Formel auftritt, ist ihre Definition bei jedem Auftreten unabhängig von ihrer Definition bei jedem anderen Auftreten. Ebenfalls sind Kombinationen von Substituenten und/oder Variablen nur dann erlaubt, wenn solche Kombinationen zu stabilen Verbindungen führen.
Wie hier verwendet, gibt „Peptid" eine Sequenz von Aminosäuren an, die durch Peptidbindungen verbunden sind. Die Somatostatinpeptidanaloga dieser Erfindung umfassen eine Sequenz von Aminosäuren, wobei jeder Rest dadurch gekennzeichnet ist, dass er einen Amino- und einen Carboxyterminus aufweist.
Eine „Baueinheit" gibt eine N^α-derivatisierte α-Aminosäure der allgemeinen Formel Nr. 5:
an, worin X eine Abstandsgruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkylen, substituiertem Alkylen, Arylen, Cycloalkylen und substituiertem Cycloalkylen; R' eine Aminosäureseitenkette ist, die optional verbunden ist mit einer spezifischen Schutzgruppe; und G eine funktionelle Gruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Aminen, Thiolen, Alkoholen, Carbonsäuren und Estern und Alkylhalogeniden; die eingebaut wird in die Peptidsequenz und nachfolgend selektiv cyclisiert wird über die funktionelle Gruppe G mit einer der Seitenketten der Aminosäuren in der Peptidsequenz oder mit einem anderen ω-funktionalisiertem Aminosäurederivat.
Die Methodologie zum Herstellen der Baueinheiten ist beschrieben in den internationalen Patentanmeldungen, die veröffentlicht sind als WO 95/33765 und WO 98/04583 und in den US Patenten 5,770,687 und 5,883,293 .
Die Baueinheiten werden abgekürzt durch den Dreibuchstabencode der entsprechend modifizierten Aminosäure, gefolgt vom Typ der reaktiven Gruppe (N für Amin, C für Carboxyl) und eine Angabe der Anzahl von Methylenabstandsgruppen. Zum Beispiel beschreibt Gly-C2 einen modifizierten Gly-Rest mit einer reaktiven Carboxylgruppe und einem Abstandhalter mit zwei Methylenkohlenstoffen und Phe-N3 bezeichnet eine modifizierte Phenylalaningruppe mit einer Amino-reaktiven Gruppe und einem Methylen-Abstandshalter mit drei Kohlenstoffen.
In einer generischen Formel werden die Baueinheiten abgekürzt als R mit einer Hochstellung, die der Position in der Sequenz entspricht, gefolgt von dem Buchstaben N als ein Hinweis, dass der Gerüststickstoff an dieser Position der Bindungspunkt der überbrückenden Gruppe ist, die in der Formel angegeben ist.
Wie hier verwendet, bezeichnet „Peptid mit cyclischem Gerüst" ein Analog eines linearen Peptids, das mindestens eine Baueinheit enthält, die verbunden worden ist, um eine Brücke über den alpha-Stickstoff des Peptidgerüstes an eine andere Baueinheit oder eine andere Aminosäure in der Sequenz zu bilden.
Bestimmte Abkürzungen werden hier verwendet, um diese Erfindung und die Art zu ihrer Herstellung und Verwendung zu beschreiben. Zum Beispiel betrifft AcOH Essigsäure, Alloc betrifft Allyloxycarbonyl, Boc betrifft den t-Butyloxycarbonylrest, BOP betrifft Benzotriazol-1-yloxy-tris-(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat, DCC betrifft Dicyclohexylcarbodiimid, DCM betrifft Dichlormethan, DIEA betrifft Diisopropylethylamin, DMF betrifft Dimethylformamid, EDT betrifft Ethandithiol, Fmoc betrifft den Fluorenylmethoxycarbonylrest, GH betrifft das Wachstumshormon, HBTU betrifft 1-Hydroxybenztriazolyltetramethyluroniumhexafluorphosphat, HF betrifft Fluorwasserstoffsäure, HOBT betrifft 1-Hydroxybenzotriazol, HPLC betrifft Hochdruckflüssigchromatographie, IGF betrifft Insulinwachstumsfaktor, MS betrifft Massenspektrometrie, NIDDM betrifft Nicht-Insulin-abhängige-Diabetes-Mellitus, NMM betrifft N-Methylmorpholin, NMP betrifft 1-Methyl-2- pyrrolidon, PyBOP betrifft Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphat, PyBrOP betrifft Brom-tris-pyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphat, rt betrifft Raumtemperatur, SRIF betrifft Somatotropin Release Inhibitory Factor (Somatotropinfreisetzungsinhibierungsfaktor), TBTU betrifft 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat, t-Bu betrifft den tertiären Butylrest, TFA betrifft Trifluoressigsäure, VIP betrifft vasoaktives intestinales Peptid.
Die Aminosäuren, die in dieser Erfindung verwendet werden, sind diejenigen, die kommerziell erhältlich sind oder durch Routinesyntheseverfahren erhältlich sind. Bestimmte Reste können spezielle Verfahren zum Einbau in das Peptid erfordern und entweder sequenzielle oder divergente und konvergente Syntheseansätze für die Peptidsequenz sind in dieser Erfindung geeignet. Natürlich codierte Aminosäuren und ihre Derivate werden durch den Dreibuchstabencode gemäß den IUPAC-Konventionen dargestellt. Wenn es keine Angabe gibt, wurde das L-Isomer verwendet. Die D-Isomere werden angezeigt durch „D" vor der Abkürzung des Restes. Liste der nichtcodieren Aminosäuren: Abu betrifft 2-Aminobuttersäure, β-Ala betrifft β-Alanin, Dab betrifft Diaminobuttersäure, GABA betrifft gamma-Aminobuttersäure, 1Nal betrifft 1-Naphthylalanin, 2Nal betrifft 2-Naphthylalanin.
Die Verbindung und Konjugation von Mono- und Disaccharidresten am Aminoterminus zum Erhöhen oraler Bioverfügbarkeit (Nelson-Piercy et al., J. Clin. Endocrinol. And Metab. 78:329, 1994) oder andere solche Substitutionen können orale Bioverfügbarkeit, Penetration in das zentrale Nervensystem, das Zielrichten auf (Targeting) spezifische Zellpopulationen und dgl. verbessern.
Synthetische Ansätze
Peptidanaloga werden cyclisiert durch überbrückende Gruppen, die an die alpha-Stickstoffe von Aminosäuren gebunden sind, die neue Nicht-Peptidbindungen erlauben. Im Allgemeinen beruhen die Verfahren, die verwendet werden zum Aufbau solcher Peptidanaloga aus ihren Baueinheiten auf den bekannten Prinzipien der Peptidsynthese; am üblichsten können die Verfahren durchgeführt werden gemäß den bekannten Prinzipien der Festphasenpeptidsynthese. Die Innovation erfordert Ersatz von einer oder mehreren der Aminosäuren in einer Peptidsequenz durch neue Baueinheiten der allgemeinen Formel:
worin R die Seitenkette einer Aminosäure ist, X eine Abstandsgruppe ist und G die funktionelle Endgruppe ist, durch welche Cyclisierung bewirkt werden wird. Die Seitenkette R ist die Seitenkette einer beliebigen natürlichen oder synthetischen Aminosäure, die ausgewählt wird, um in die Peptidsequenz der Wahl eingebaut zu werden. X ist eine Abstandsgruppe, die ausgewählt wird, um einen größeren oder geringeren Flexibilitätsgrad bereitzustellen, um die geeigneten konformativen Zwänge des Peptidanalogs zu erreichen. Solche Abstandsgruppen umfassen Alkylenketten, substituierte, verzweigte und ungesättigte Alkylene, Arylene, Cycloalkylene und ungesättigte und substituierte Cycloalkylene. Darüber hinaus können X und R kombiniert werden, um eine heterocyclische Struktur zu bilden. Die terminalen (ω) funktionalen Gruppen, die zur Cyclisierung des Peptidanalogs zu verwenden sind, umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein:

a. Amine zur Reaktion mit Elektrophilen, wie etwa aktivierte Carboxylgruppen, Aldehyde und Ketone (mit oder ohne nachfolgende Reduktion) und Alkyl- oder substituierte Alkylhalogenide.
b. Alkohole zur Reaktion mit Elektrophilen, wie etwa aktivierte Carboxylgruppen. c. Thiole zur Bildung von Disulfidbindungen und Reaktion mit Elektrophilen, wie etwa aktivierte Carboxylgruppen und Alkyl- oder substituierte Alkylhalogenide
d. 1,2- und 1,3-Diole zur Bildung von Acetalen und Ketalen.
e. Alkine und substituierte Alkine zur Reaktion mit Nukleophilen, wie etwa Amine, Thiole und Carbanionen; freie Radikale; Elektrophile, wie etwa Aldehyde und Ketone und Alkyl- oder substituierte Alkylhalogenide; oder organometallische Komplexe.
f. Carbonsäuren und -ester zur Reaktion mit Nukleophilen (mit oder ohne vorherige Aktivierung), wie etwa Amine, Alkohole und Thiole.
g. Alkyl- oder substituierte Alkylhalogenide oder Ester zur Reaktion mit Nukleophilen, wie etwa Amine, Alkohole, Thiole und Carbanionen (von aktiven Methylengruppen, wie etwa Acetoacetaten oder Malonaten); und Bildung von freien Radikalen zur nachfolgenden Reaktion mit Alkenen oder substituierten Alkenen und Alkinen oder substituierten Alkinen.
h. Alkyl- oder Arylaldehyde und -ketone zur Reaktion mit Nukleophilen, wie etwa Amine (mit oder ohne nachfolgende Reduktion), Carbanionen (von aktiven Methylengruppen, wie etwa Acetoacetaten oder Malonaten), Diole (zur Bildung von Acetalen und Ketalen).
i. Alkene oder substituierte Alkene zur Reaktion mit Nukleophilen, wie etwa Amine, Thiole, Carbanionen, freie Radikale oder organometallische Komplexe.
j. Aktive Methylengruppen, wie etwa Malonatester, Acetoacetatester und andere zur Reaktion mit Elektrophilen, wie etwa Aldehyde und Ketone, Alkyl- oder substituierte Alkylhalogenide.

Man wird einzuschätzen wissen, dass während der Synthese des Peptides diese reaktiven Endgruppen als auch sämtliche reaktiven Seitenketten durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden müssen. Geeignete Schutzgruppen für Amine sind Alkyloxy-, substituierte Alkyloxy- und Arlyoxycarbonyle, einschließlich, ohne darauf begrenzt zu sein, tert-Butyloxycarbonyl (Boc), Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), Allyloxycarbonyl (Alloc) und Benzyloxycarbonyl (Z). Carboxylendgruppen zur Cyclisierung können geschützt werden als ihre Alkyl- oder substituierte Alkylester oder Thioester oder Aryl- oder substituierte Arylester oder Thioester. Beispiele umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein, Tertiärbutylester, Allylester, Benzylester, 2-(Trimethylsilyl)ethylester und 9-Methylfluorenyl.
Thiolgruppen für Cyclisierungen können geschützt werden als ihre Alkyl- oder substituierte Alkylthioether oder Disulfide oder Aryl- oder substituierte Arylthioether oder Disulfide. Beispiele solcher Gruppen umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein, Tertiärbutyl, Trityl(triphenylmethyl), Benzyl-2-(Trimethylsily)ethyl, Pixyl(9-phenylxanthen-9-yl), Acetamidomethyl, Carboxymethyl, 2-Thio-4-nitropyridyl.
Es wird weiter durch den Fachmann in der Technik einzuschätzen sein, dass verschiedene reaktive Reste geschützt werden durch verschiedene Schutzgruppen, um ihre selektive Entfernung zu erlauben. So wird eine spezielle Aminosäure gekoppelt an ihren Nachbarn in der Peptidsequenz wenn das N^α geschützt ist durch, z.B. Schutzgruppe A. Wenn ein Amin als eine Endgruppe für die Cyclisierung in dem Reaktionschema zu verwenden ist, wird das N^ω geschützt werden durch die Schutzgruppe B oder eine ε-Aminogruppe eines Lysins in der Sequenz wird geschützt werden durch die Schutzgruppe C usw.
Die Kopplung der Aminosäuren aneinander wird durchgeführt als eine Reihe von Reaktionen, wie in der Technik der Peptidsynthese bekannt. Neue Baueinheiten der Erfindung, nämlich die N^α-ω-funktionalisierte Aminosäuresderivate, werden in die Peptidsequenz eingebaut, um eine oder mehrere der Aminosäuren zu ersetzen. Wenn nur ein solches N^α-ω-funktionalisiertes Aminosäurederivat ausgewählt wird, wird es cyclisiert an eine Seitenkette von einer anderen Aminosäure in der Sequenz oder an jede der beiden terminalen Aminosäuren der Peptidsequenz. Zum Beispiel: (a) kann eine N^α-(ω-Aminoalkylen)-Aminosäure gebunden werden an die Carboxylgruppe eines Asparagin- oder Glutaminsäurerestes; (b) eine N^α-(ω-Carboxylalkylen)-Aminosäure kann an die ε-Aminogruppe eines Lysinrestes gebunden werden; (c) eine N^α-(ω-Thioalkylen)-Aminosäure kann an die Thiolgruppe eines Cysteinrestes gebunden werden; usw. Eine mehr bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst zwei solche N^α-(ω-funktionalisierten Aminosäurederivate, die aneinander gebunden sein können, um cyclische Peptidanaloga mit N-Gerüst an N-Gerüst zu bilden. Drei oder mehr solcher Baueinheiten können in eine Peptidsequenz eingebaut werden, um bicyclische Peptidanaloga zu bilden, wie unten ausgeführt wird.
So können Peptidanaloga konstruiert werden mit zwei oder mehr Cyclisierungen, einschließlich N-Gerüst-an-N-Gerüst als auch Gerüst-an-Seitenkette oder einer anderen Peptidcyclisierung.
Wie oben angegeben, beruhen die Verfahren, die verwendet werden zum Aufbau von Somatostatinanaloga der vorliegenden Erfindung aus neuen Baueinheiten im Allgemeinen auf den bekannten Prinzipien der Peptidsynthese. Jedoch wird es einzuschätzen sein, dass eine Anpassung der Verfahren auf die voluminöseren Baueinheiten der vorliegenden Erfindung erforderlich sein kann. Koppeln der Aminosäuren in der Festphasepeptidchemie kann erreicht werden mittels eines Kopplungsmittels, wie etwa, ohne darauf begrenzt zu sein, Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), bis(2-Oxo-3-oxazolidinyl)phosphinchlorid (BOP-Cl), Benzotriazolyl-N-oxytrisdimethylaminophosphoniumhexafluorphosphat (3OP), 1-Oxo-1- chlorphospholan (Cpt-Cl), Hydroxybenzotriazol (HOBT) oder Gemische davon.
Es wurde nun gefunden, dass das Koppeln der nachfolgenden Aminosäure an die voluminösen Baueinheiten der vorliegenden Erfindung die Verwendung von zusätzlichen Kopplungsmitteln erfordern kann, einschließlich, ohne darauf begrenzt zu sein: Kopplungsmittel, wie etwa PyBOP (Benzotriazol-1-yl-oxytrispyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphat), PyBrOP (Brom-trispyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphat), HBTU (2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat), TBTU (2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat).
Neue Kopplungschemie kann verwendet werden, wie etwa vorgeformte Urethan-geschützte N-Carboxyanhydride (UNCAs), vorgeformte Acylhalogenide, am meisten bevorzugt Acylchloride.
Vorteilhafterweise ist es ebenfalls möglich in situ erzeugte Aminosäurechloride zu verwenden. Die Aminosäurechloride könnten erzeugt werden durch Verwenden von Reagenzien, wie etwa z.B. Bis(trichlormethyl)carbonat, allgemein bekannt als Triphosgen.
Eine solche Kopplung kann bei Raumtemperatur und ebenfalls bei erhöhten Temperaturen stattfinden, in Lösungsmitteln, wie etwa Toluol, DCM (Dichlormethan), DMF (Dimethylformamid), DMA (Dimethylacetamid), NMP (N-Methylpyrrolidinon), Dioxan, Tetrahydrofuran, Diglyme und 1,3-Dichlorpropan oder Gemischen der obigen.
Die Somatostatinanaloga mit cyclischem Gerüst der vorliegenden Erfindung werden nun beschrieben.
Die Somatostatinanaloga der vorliegenden Erfindung mit cyclischem Gerüst weisen die allgemeine Formel auf:
worin
n 1 bis 5 ist;
X eine terminale Carbonsäure-, Amid- oder Alkoholgruppe bezeichnet;
Q Wasserstoff oder ein Mono- oder Disaccharid ist;
R⁵ gamma-Aminobuttersäure, Diaminobuttersäure,
Gly, β-Ala, 5-Aminopentansäure oder Aminohexansäure ist;
R⁶ (D)- oder (L)-Phe oder Tyr ist;
R⁷ (D)- oder (L)-Trp, (D)- oder (L)-Phe, (D)- oder (L)-1Nal oder (D)- oder (L)-2Nal oder Tyr ist;
R⁸ (D)- oder (L)-Trp ist;
R⁹ (D)- oder (L)-Lys ist;
R¹⁰ Thr, Gly, Abu, Ser, Cys, Val, (D)- oder (L)-Ala oder (D)- oder (L)-Phe ist;
R¹¹ (D)- oder (L)-Phe, (D)- oder (L)-Ala, Nie oder Cys ist;
R¹² Gly, Val, Leu, (D)- oder (L)-Phe oder 1 Nal oder 2Nal ist.
Eine am meisten bevorzugte Verbindung gemäß dieser Ausführungsform wird als PTR 3173 bezeichnet, worin die Reste wie folgt sind:
Q ist Wasserstoff;
R⁵ ist GABA;
R⁶ ist Phe;
R⁷ ist Trp;
R⁸ ist (D)Trp;
R⁹ ist Lys;
R¹⁰ ist Thr;
R¹¹ ist Phe;
R¹² ist Gly;
n ist 3; und
X ist ein Amid.
Eine andere bevorzugte Verbindung gemäß dieser Ausführungsform wird als PTR 3229 bezeichnet, worin die Reste wie folgt sind: Q ist Galactose;
R⁵ ist Dab;
R⁶ ist Phe;
R⁷ ist (L)-Trp;
R⁸ ist (D)-Trp;
R⁹ ist Lys;
R¹⁰ ist Thr;
R¹¹ ist Phe;
R¹² ist Gly;
n ist 3; und
X ist Amid.
Die am meisten bevorzugten Somatostatinanaloga mit cyclischem Gerüst gemäß der vorliegenden Erfindung sind in Tabelle 3 beschrieben: Tabelle 3: Die am meisten bevorzugten Analoga.

PTR Sequenz

3173 GABA*-Phe-Trp-(D)Trp-Lys-Thr-Phe-Gly(C3)-X

3229 Galactose-Dab*-Phe-Trp-(D)Trp-Lys-Thr-Phe-Gly(C3)-X

worin X -NH₂ oder -OH ist und die überbrückende Gruppe sich zwischen zwei Baueinheiten oder wie unten angegeben erstreckt:
Für PTR 3173 gibt das Sternchen an, dass die überbrückende Gruppe verbunden ist zwischen dem N^α-ω-funktionalisierten Derivat einer Aminosäure und dem N-Terminus des Peptids.
Somatostatin ist ein Tetradecapeptidhormon, dessen zahlreiche regulatorischen Funktionen vermittelt werden durch eine Familie aus fünf Rezeptoren, wobei die Expression gewebeabhängig ist. Es wird angenommen, dass rezeptorspezifische Analoga von Somatostatin wertvolle therapeutische Mittel bei der Behandlung verschiedener Krankheiten sind. Ansätze zum Entwickeln kleiner Peptidanaloga mit dieser Selektivität sind nicht von besonderem Erfolg gewesen. Es ist nun unerwarteterweise gefunden worden, dass die Somatostatinanaloga mit cyclischem Gerüst mit erzwungener Konformation der vorliegenden Erfindung hochselektiv für SST-Rezeptorsubtypen sind.
Die Peptide mit cyclischem Gerüst dieser Erfindung sind neue selektive Analoga und binden vorzugsweise mit höherer Affinität an einen einzelnen Rezeptor der Somatostatinrezeptorfamilie.
Die Aminosäuresequenz der entsprechenden Analoga mit hexacyclischem Grundgerüst (PTRs 3113, 3123 und 3171, nicht in der vorliegenden Erfindung enthalten) basiert auf den angenommen am meisten wichtigen Aminosäuren, die von dem nativen SRIF-14 abgeleitet sind. Aus den Daten in der Literatur (Bauer et al., Life Sciences, 31:1133, 1982) wurde geschlossen, dass die Aminosäuren des nativen SRIF-14 in mindestens den Positionen 7 bis 10, nämlich Phe⁷, Trp⁸, Lys⁹ und Thr¹⁰, und vorzugsweise den Positionen 6 bis 10, nämlich Phe⁸, Phe⁷, Trp⁸, Lys⁹ und Thr¹⁰, wesentlich sind für das Pharmakophor des Hormons.
Die vorliegenden innovativen Gerüstanaloga umfassen vorzugsweise 8 Aminosäuren mit speziellen Aminsäuremodifikationen. Für bestimmte bevorzugte Analoga wurde die Aminsäure Asn substituiert durch die Gerüst-Phe-Baueinheit an Position 5. Die Konfigurationssubstitution des nativen L-Trp an Position 8 durch D-Trp wurde durchgeführt zum Verbessern der Stabilität des Analogs. Der Thr-Rest an Position 10 wurde deletiert und die Sequenz vervollständigt durch die entsprechende Gerüst-ehe-Baueinheit. Die einzigartige Konfigurationssubstitution an Position 9 von L-Lys durch D-Lys, wie in den PTRs 3123 und 3171 im Vergleich zu PTR 3113 gezeigt, führt eher zu verbesserter Selektivität der Bindung an SST-Rezeptorsubty SST-R3 als an SST-R5 (nicht in der vorliegenden Erfindung enthalten).
Zusätzlich wurden mehrere weitere Modifizierungen von Analoga von Aminosäuren durchgeführt. Zum Beispiel Substitution von Phe-Resten mit Tyr zur Erleichterung der Iodierung. Substitution von Phe-Resten mit N-Methyl-Phe-Rest (z.B. Substitution von Phe⁶ in PTR 3173, um PTR 3223 zu ergeben und Substitution von Phe⁶ und Phe¹¹ in PTR 3173, um PTR 3225 zu ergeben) zum Erhöhen der Bioverfügbarkeit der Verbindung (nicht in der vorliegenden Erfindung enthalten). Addition von Mono- und Disaccharidresten am Amino-Terminus von bestimmten Verbindungen wird durchgeführt zum Erhöhen der oralen Bioverfügbarkeit (Nelson-Piercy et al., ibid.). Zum Beispiel wurde Galactose konjugiert an den N-Terminus einer Verbindung, die ähnlich PTR 3173 ist, um ein Analog zu ergeben, das die Sequenz aufweist:
Galactose-Dab-Phe-Trp-(D)Trp-Lys-Thr-Phe-Gly(C3)-NH₂, hier bezeichnet als PTR 3229.
In einem bestimmten am meisten bevorzugten Analog (PTR 3173 zum Beispiel) ist die Brücke verbunden zwischen dem N^α-ω-funktionalisierten Derivat einer Aminosäure und dem N-Terminus der Peptidsequenz. Für andere bevorzugte Analoga der vorliegenden Erfindung ist die Brücke verbunden zwischen einer Baueinheit, umfassend ein N^α-ω-funktionalisiertes Derivat mit einer terminalen Thiogruppe, und einem anderen, wie etwa einem Derivat einer Aminosäure oder mit der Seitenkette eines Cys-Restes, an eine Mercapto-enthaltende Säure oder einen anderen beliebigen SH-enthaltenden Rest, um eine Disulfidbrücke zu bilden.
Die vorliegenden neuen Analoga stellen eine zusätzliche Dimension für die Neuheit der Gerüstcyclisierungstechnologie dar, bei der Verwendung einer verkürzten Gerüstbrücke (d.h. nur ein bis drei Methylene neben der Peptidbindung). Dieser Ansatz ermöglicht das Erreichen einer viel größeren Steifheit des Peptides und weiteres Erzwingen der gewünschten Konformation des nativen Pharmakophors.
Ein zusätzlicher Vorteil der Hexapeptidanaloga der vorliegenden Erfindung ist verbunden mit ihrem retativ geringen Molekutargewicht (wobei ihre Sequenz nur aus sechs Aminosäuren besteht), bis zu nur 1000 Dalton, im Vergleich zu den üblichsten synthetischen Somatostatinanaloga, die üblicherweise Hepta- oder Octapeptide sind.
Somatostatinanaloga der vorliegenden Erfindung mit cyclischem Gerüst (z.B. PTR 3173) erwiesen sich so, dass sie beachtenswerte Stoffwechselbiostabilität gegenüber Abbau durch Enzyme aufweisen. Dieses Attribut könnte eine potenziell lange Dauer der Aktivität im Körper nahelegen.
Die Stabilität der Analoga mit cyclischem Gerüst war vergleichbar mit der von Stoffwechsel-stabilem Arzneimittel Octreotid, unter Verwendung von experimentellen Stabilitätsmessungen, basierend auf dem Abbau durch verschiedene Enzymgemische (z.B. Nierenhomogenat, Rattenleberhomogenat und Humanserum). Alle getesteten Verbindungen zeigten signifikant höhere Biostabilität als das native Hormon SRIF-14. In einigen der entsprechenden nichtcyclischen Peptide wurde ein gewisser Abbau zwei Stunden nach Inkubation beobachtet, was anzeigte, dass die Cyclisierung bemerkenswert zur Stabilität des Peptides beitrug. Es wurde erwartet, dass der Einbau von N-alkylierten Aminosäuren, die verwendet wurden für die Gerüstcyclisierung, die Stoffwechselbiostabilität dieser Peptide verleiht.
Analoga mit cyclischem Gerüst der vorliegenden Erfindung binden in vitro mit hoher Affinität an einen definierten Subsatz der humanen Somatostatinrezeptoren. Dieser Rezeptor zeigt selektiv seine potenzielle physiologische Selektivität in vivo.
Übereinstimmend mit der in vitro-Rezeptorbindung beeinflussen die Analoga mit cyclischem Gerüst der vorliegenden Erfindung selektiv ein definiertes System im Körper, während sie andere bekannte physiologische Aktivitäten des nativen Hormons Somatostatin nicht beeinflussen. Zum Beispiel zeigt PTR 3173 signifikante Inhibierung mit ausgedehnter Wirkungsdauer auf der Wachstumshormon-IGF-1-Achse mit einer ähnlichen Größenordnung wie das Arzneimittel Octreotid, jedoch fehlen die Nachteile von Octreotid, wie etwa Inhibierung der Insulinsekretion. PTR 3173 zeigt auch eine beachtenswert geringere Beeinträchtigung der Freisetzung von Glucagon als Octreotid, es hat daher den Vorteil, dass es keine Hyperglykämie bewirkt, was es zu einer sehr attraktiven Verbindung zur Behandlung von Diabetes Typ 2 (NIDDM) macht.
Wie in Tabelle 4 zusammengefasst, besitzt PTR 3173 wesentliche physiologische Selektivität gegenüber dem Arzneimittel Octreotid. PTR 3173 ist ein potenter Inhibitor des Wachstumshormons, weist jedoch weniger Aktivität auf Glucagon und keine nennenswerte Wirkung auf Insulin auf. Tabelle 4: Physiologische Selektivität von PTR 3173 im Vergleich mit Octreotid.

Analog GH ID50 μg/kg Glucagon ID50 μg/kg Insulin ID50 μg/kg GH/Insulin GH Glucagon

Octreotid 0,08 0,65 26 309 8

PTR 3173 0,1 > 100 > 1000 > 10.000 > 1000
PTR 3173 zeigt eine signifikante Wachstumsinhibierung von CHO-Zellen, die kloniertes humanes SST-R5 exprimieren, wodurch eine potenzielle Rolle bei der Behandlung von SST-R5-exprimierenden Tumoren (z.B. Karzinoide, Hypophysentumore) gezeigt wird. Dieses Analog inhibiert ebenfalls Chromogranin A-Freisetzung von der humanen Karzinoidzelllinie, wodurch eine Antitumorwirkung angezeigt wird (Beispiel 5).
Das einzigartige pharmakokinetische Profil von PTR 3173 ist, wie es beurteilt wird in Tieren, übereinstimmend mit seiner Stoffwechselbiostabilität, wie in vitro beurteilt. Dieses Somatostatinanalog mit cyclischem Gerüst zeigt flip flog (eine langsame Freisetzungskinetik)-Pharmakokinetiken. Nachfolgend auf subkutane Verabreichung resultiert die scheinbare-Halbwertszeit im Organismus aus seiner Absorptionsrate, jedoch nicht aus seiner Eliminierungsrate. Nachfolgend auf subkutane Verabreichung an Ratten hatte PTR 3173 eine Halbwertszeit im Kreislauf von etwa 3 Stunden. Diese Aktivität überschreitet wesentlich die des lange wirkenden Arzneimittels Octreotid, das eine Halbwertszeit im Kreislauf von nur 40 Minuten aufweist.

Die pharmakokinetischen Hauptparameter von PTR 3173 gegenüber Octreotid sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Tabelle 5: Pharmakokinetische Hauptparameter von PTR 3173 gegenüber Octreotid nachfolgend auf IV & SC-Verabreichung an Wistar-Ratten, die bei Bewusstsein sind.

Verabreichungsweg	Arzneimittel	F (%)	Vs (ml/kg)	T_1/2 β (min)	E %	Clearance (ml/min/kg)
IV	PTR 3173	–	653	31	10,3	13,0
IV	Octreotid^*	–	602	49	21,3	17,6
SC	PTR 3173	99,6	–	170	15,9	13,3
SC	Octreotid^*	103	–	40	23,0	17,1

* von Sandostatin (Octreotidacetat), Übersicht und klinische Zusammenfassung. Sandoz Pharmaceutical Corporation, 1992.
F – Bioverfügbarkeit,
Vs. – Verteilungsvolumen,
T_1/2 – Halbwertszeit im Kreislauf
E – extrahiert aus Urin

Das Somatostatinanalog mit cyclischem Gerüst PTR 3173 ist selektiv für Somatostatinrezeptoren und bindet signifikant weniger andere G-Protein gekoppelte Rezeptoren als Octreotid, wie gefunden wird durch Screenen beider Analoga und SRIF auf Bindung an mehrere solche Rezeptoren (Beispiel 6). Dieses Charakteristikum ist von großem Vorteil, da Bindung an nicht Somatostatinrezeptoren potenziell nachteilige Wirkungen im Körper bewirken könnte.
Es erwies sich weiterhin, dass PTR 3173 nicht mitogen ist für humane Lymphozyten in humanen peripheren Blutlymphozyten (PBL)-Proliferationsassays.
PTR 3173 wurde in verschiedenen Spezies auf seine Grundsicherheitseigenschaften getestet. In Hinblick auf die Pharmacopoeia-Europaea-Anforderungen für Sicherheitstesten wurde es als sicherer Arzneimittelkandidat in diesem Entwicklungsstudium deklariert. Keine Toxizitäthinweise in Nagern oder Hunden waren ersichtlich bei Injektion einer Dosis, die 10.000-fach höher ist als die wirksame Dosis zum Inhibieren von Wachstumshormonfreisetzung.
Allgemeines Verfahren zur Synthese, Reinigung und Charakterisierung von Peptiden mit cyclischem Gerüst
Synthese:

Harz: 1 g Rink-Amid oder Tenta-Gelharz mit einer Beladung von 0,2–0,7 mmol/g.
Fmoc-Entschützung: Mit 7 ml 20 % Piperidin in NMP. Zweimal für 15 Minuten, nachfolgend 5 Waschungen mit 10 ml NMP für 2 Minuten unter Schütteln.
Kopplungen:

1. Reguläre Kopplungen (Kopplung an einfache Aminosäuren): mit einer Lösung, enthaltend 3 Äquivalente Aminosäure, 3 Äquivalente PyBroP und 6 Äquivalente DIEA in 7 ml NMP. Für 0,5–2 Stunden unter Schütteln. Das Koppeln wird beobachtet durch Ninhydrintest und wiederholt bis die Ninhydrinlösung gelb wird.
2. Koppeln von His und Asn mit einer Lösung, enthaltend 5 Äquivalente DIC und 5 Äquivalente HOBT in 10 ml DMF.
3. Koppeln an Gly-Baueinheiten: mit einer Lösung, enthaltend 3 Äquivalente Aminosäure, 3 Äquivalente PyBroP und 6 Äquivalente DIEA in 7 ml NMP. Zweimal für 1–4 Stunden unter Schütteln.
4. Koppeln an Baueinheiten, die nicht Gly sind: mit einer Lösung, enthaltend 5 Äquivalente Aminosäure, 1,5 Äquivalente Trisphosgen und 13 Äquivalente Collidin in 15 ml Dioxan oder THF. Zweimal für 0,5 bis 2 Stunden bei 50°C unter Schütteln.

Entfernen der Allyl- und Alloc-Schutzgruppen von den Baueinheiten: mit 1,5 Äquivalenten pro Peptid Pd(PPh3)4 in 30 ml DCM, enthaltend 5 % Essigsäure und 2,5 % NMM. Für 1–4 Stunden unter Schütteln.
Cyclisierung: mit einer Lösung, enthaltend 3 Äquivalente PyBOP und 6 Äquivalente DIEA in 7 ml NMP. Für 0,5–2 Stunden unter Schütteln. Cyclisieren wird beobachtet durch einen Ninhydrintest und erforderlichenfalls wiederholt.
Spaltung: mit 82 %–95 % TFA, supplementiert mit Einfängern: 1–15 % H₂O, 1–5 % TIS und 1–5 % EDT.
Reinigung: Ein individuelles Reinigungsverfahren für jedes Peptid mit cyclischem Gerüst wird entwickelt auf einer analytischen HPLC, um die maximale Isolierung des cyclischen Peptids von anderen Rohkomponenten zu erreichen. Das analytische Verfahren wird üblicherweise durchgeführt unter Verwendung einer C-18 Vydac Säule 250 × 4,6 mm als die stationäre Phase und eines Wasser/ACN-Gemisch-Gradienten mit 0,1 % TFA.

Das präparative Verfahren wird entwickelt durch Einbeziehen des analytischen Trennverfahrens in dem präparativen 2 Zoll-C-18 Vydac-Verfahren. Während des Reinigungsverfahrens wird das Material, das dem Signal für das cyclische Peptid entspricht, gesammelt, unter Verwendung eines halbautomatischen Fraktionssammlers. Die gesammelten Fraktionen werden zur Reinheitsüberprüfung in die analytische HPLC injiziert. Die reinen Fraktionen werden vereinigt und lyophylisiert.
Charakterisierung:
Das vereinigte reine lyophylisierte Material wird durch HPLC, MS und Kapillarelektrophorese analysiert und durch Aminosäureanalyse auf den Peptidgehalt und zur Bestimmung des Aminosäureverhältnisses analysiert.
Allgemeines Screening von Somatostatinanaloga.
Somatostatinanaloga mit cyclischem Grundgerüst werden gescreent indem sie in vitro getestet werden auf ihre Inhibierung der natürlichen Peptid (SRIF-14)-Bindung an seine G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (Beispiel 3). Analoga, die mit hoher Affinität binden, werden dann auf ihren Einfluss auf zweite Messenger, wie etwa cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP)-Gehalte, Typrosinphosphataseaktivität, Wachstumshormon- und Chromogranin A-Sekretion, und auf Zellwachstum getestet.
Aktive Analoga werden darüber hinaus in vivo getestet auf Inhibierung von Hormonen und Enzymsekretion, in speziellen relevanten Modellsystemen, basierend auf Literaturdaten, die anzeigen, dass SST-R2 und SST-R5 die meisten endokrinen Wirkungen von Somatostatin vermittelen, inhibierend sind für Freisetzung von Wachstumshormon und Amylase, Magensäure, Insulin- und Glucagonsekretion, die auf den bekannten endokrinen Aktivitäten des nativen Hormons SRIF und des Somatostatinanalogs, Octreotid, basieren.
Das am meisten bevorzugte Somatostatinanalog mit cyclischem Gerüst: PTR-3173, das Rezeptorspezifität für SST-R2 + SST-R5 besitzt, wurde verwendet zum Aufklären der physiologischen Rolle von jedem Somatostatinrezeptor auf die Endokrinprofile, zusätzlich zum Auffinden ihrer Potenziale als Arzneimittelkandidaten.
Somatostatinanaloga mit erzwungener Konformation, aufgebaut zum Teil basierend auf den Sequenzen einer Vielzahl bekannter biologisch aktiver Peptide oder basierend auf früher nicht bekannten neuen Sequenzen, werden in den Beispielen unten dargestellt. Die folgenden Beispiele sollen veranschaulichen, wie die Verbindungen herzustellen und zu verwenden sind und die Verfahren dieser Erfindung anzuwenden sind und sollen in keiner Art begrenzend ausgelegt werden.
BEISPIELE
Beispiel 1. Detaillierte Synthese von PTR 3173.
Fünf Gramm Rink-Amidharz (NOVA) (0,56 mmol/g) wurden in N-Methylpyrrolidon (NMP) in einem Reaktionsbehältnis gequollen, das ausgestattet war mit einem Sinterglasboden, und auf einem Schüttler angeordnet. Die Fmoc-Schutzgruppe wurde von dem Harz entfernt durch Reaktion mit 20 % Piperidin in NMP (2 mal 10 Minuten, jeweils 25 ml). Die Fmoc-Entfernung wurde beobachtet durch Ultraviolettabsorptionsmessung bei 290 nm. Ein Kopplungszyklus wurde durchgeführt mit Fmoc-Gly-C3(Allyl) (3 Äquivalente), PyBrop (3 Äquivalente), DIEA (6 Äquivalente) in NMP (20 ml) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Reaktionsabschluss wurde beobachtet durch den qualitativen Ninhydrintest (Kaiser Test). Nachfolgend auf das Koppeln wurde das Peptidharz gewaschen mit NMP (7 mal mit 25 ml NMP, jeweils 2 Minuten). Ein Capping wurde durchgeführt durch Reaktion des Peptidharzes mit Essigsäureanhydrid (Capping-Gemisch: HOBt 400 mg, NMP 20 ml, Essigsäureanhydrid 10 ml, DIEA 4,4 ml) für 0,5 Stunden bei Raumtemperatur. Nach dem Capping wurden NMP-Waschungen wie oben durchgeführt (7 mal, jeweils 2 Minuten). Fmoc-Entfernung wurde wie oben durchgeführt. Fmoc-Phe-OH wurde auf dieselbe Art gekoppelt und die Fmoc-Gruppe wie oben entfernt. Das Peptidharz wurde umgesetzt mit Fmoc-Thr(OtBu)-OH: Kopplungsbedingungen sind wie oben. Fmoc-Entfernung wurde wie oben durchgeführt. Fmoc-Lys(Boc)-OH wurde an das Peptidharz gekoppelt unter den die gleichen Kopplungsbedingungen. Der Abschluss der Kopplung wurde beobachtet durch den Fmoc-Test (eine Probe des Peptidharzes wurde genommen und gewogen, das Fmoc wurde wie oben entfernt und die Ultraviolettabsorption wurde gemessen). Fmoc-D-Trp-OH wurde gekoppelt an das Peptidharz mit PyBrop, wie oben beschrieben. Nachfolgend auf Fmoc-Entfernung wurde Fmoc-Trp-OH auf dieselbe Art gekoppelt. Nachfolgend auf Fmoc-Entfernung wurde Fmoc-Phe-OH auf dieselbe Art gekoppelt. Nachfolgend auf Fmoc-Entfernung wurde Fmoc-GABA-OH auf dieselbe Art gekoppelt. Die Allylschutzgruppe wurde entfernt durch Reaktion mit Pd(PPh₃)₄ und Essigsäure 5 %, Morpholin 2,5 % in Chloroform unter Argon, für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Das Peptidharz wurde wie oben mit NMP gewaschen. Die Fmoc-Schutzgruppe wurde von dem Peptid entfernt durch Reaktion mit 20 % Piperidin in NMP (2 mal 10 Minuten, jeweils 25 ml). Cyclisierung wurde durchgeführt mit 3 Äquivalenten PyBOP, 6 Äquivalenten DIEA in NMP, bei Raumtemperatur für 2 h. Das Peptidharz wurde gewaschen und getrocknet. Das Peptid wurde von dem Harz abgespalten durch Reaktion mit TFA 94 %, Wasser 2,5 %, EDT 2,5 %, TIS (Triisopropylsilan) 1 %, bei 0°C für 15 Minuten und 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Argon. Das Gemisch wurde filtriert in kalten Ether (30 ml, 0°C) und das Harz wurde mit einem kleinen Volumen TFA gewaschen. Das Filtrat wurde in einem Rotationsverdampfer angeordnet und alle flüchtigen Komponenten wurden entfernt. Ein öliges Produkt wurde erhalten. Es wurde dreimal mit Ether verrieben und der Ether dekantiert. Ein weißes Pulver wurde erhalten. Dieses Rohprodukt wurde getrocknet. Das Gewicht des Rohproduktes war 4 g.
Nach Reinigung durch HPLC wurde ein einzelnes Signal erhalten, entsprechend 100 % Reinheit, gemäß Nachweis durch analytische HPLC und Kapillarelektrophorese. Die erwartete Masse von 1123 Dalton wurde durch Massenspektroskopie nachgewiesen.
Beispiel 3: Beständigkeit gegenüber Bioabbau.
Die in vitro-Biostabilität von SST-cyclischen Peptidanaloga; PTRs 3113^*, 3123^*, 3171^* und 3173, wurde gemessen in Nierenhomogenat und es erfolgte ein Vergleich mit Octreotid (Sandostatin) und mit nativem Somatostatin (SRIF-14). Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 6 gezeigt. In diesem Assay waren die Peptidanaloga mit cyclischem Gerüst der vorliegenden Erfindung so stabil wie Octreotid und waren viel stabiler als SRIF. Der Assay basierte auf einer HPLC-Bestimmung des Peptidabbaus als eine Funktion der Zeit in Nierenhomogenat bei 37°C. Tabelle 6: Prozent intaktes Molekül nach Inkubieren in Nierenhomogenat.

Zeit (h) SRIF Octreotid PTR-3113^* PTR-3123^* PTR-3171^* PTR-3173

0 100 100 100 100 100 100

1 5 100 100 100 100 100

3 0 100 100 100 100 100

24 0 100 100 100 100 100

^*kein Bestandteil der vorliegenden Erfindung

Beispiel 4: Bindung von Analoga an Somatostatinrezeptoren.
Die Somatostatinanaloga wurden getestet auf ihre Potenz bei der Inhibierung der Bindung von ¹²⁵I-Tyr¹¹-SRIF (basierend auf dem von Raynor et al., Molecular Pharmacology 43: 838, 1993, beschriebenen Verfahren) an Membranpräparate, die die Transmembran-Somatostatinrezeptoren exprimieren (SST-R1, 2, 3, 4 oder 5). Die Rezeptorpräparate, die für diese Tests verwendet wurden, waren entweder von den klonierten humanen Rezeptoren, die selektiv und stabil exprimiert werden in Chinesischem Hamster-Ovar (CHO)-Zellen oder von Zelllinien, die natürlich die SST-Rs exprimieren. Typischerweise wurden Zellmembranen in Tris-Puffer in der Gegenwart von Proteaseinhibitoren homogenisiert und inkubiert für 30–40 Minuten mit ¹²⁵I-Tyr¹¹-SRIF bei verschiedenen Konzentrationen der getesteten Probe. Die Bindungsreaktionen wurden filtriert, die Filter wurden gewaschen und die gebundene Radioaktivität wurde in einem Gammazähler gezählt. Nicht-spezifische Bindung wurde definiert als die Radioaktivität, die gebunden bleibt in der Gegenwart von 1 μM unmarkiertem SRIF-14.

Zum Validieren positiver Signale der Bindungstests und zum Eliminieren nichtspezifischer Signale wurden Proben irrelevanter Peptide, wie etwa GnRH, die synthetisiert und gehandhabt wurden unter Verwendung der gleichen Verfahren, in den gleichen Assays als negative Kontrollproben getestet. Diese Proben hatten keine Bindungsaktivität in einem der Assays. Ergebnisse sind unten in den Tabellen 8 und 9 und in 1 gezeigt. Tabelle 8: Prozentuale Inhibierung von SRIF-14-Bindung an klonierte humane Somatostatinrezeptoren durch PTR 3173.

Rezeptor-Subtyp	Konzentration (M)
	10^–11	10^–10	10^–9	10^–8	10^–7	10^–6
SST-R1	0	0	0	0	5	15
SST-R2	15	30	42	80	95	96
SST-R3	2	1	1	4	50	89
SST-R4	0	0	0	0	5	5
SST-R5	20	48	63	82	95	95

Tabelle 9: Konzentration (nM) von Somatostatinanaloga zum inhibieren von SRIF-Bindung an jeden der humanen klonierten Somatostatinrezeptoren um 50 %.

PTR	IC 50 (nM)
	SST-R1	SST-R2	SST-R3	SST-R4
3173	> 10^–6	10^–9	10^–7	10^–9

Beispiel 5 In vitro Bio-Reaktion von bevorzugten Somatostatinanaloga mit cyclischem Gerüst.
A. Inhibierung von cAMP in humanen Karzinoid-BON-1-Zellen durch das Somatostatinanalog mit cyclischem Gerüst PTR 3173:
Die Aktivierung von SST-R5 führt zur Verringerung der Adenylat-Cyclase-Aktivität. Somatostatinrezeptoren, einschließlich Typ 5-Rezeptoren, werden in dem humanen Karzinoid exprimiert, das von der Zelllinie BON-1 abgeleitet ist. Diese humane Zellkultur diente als ein in vitro Forschungsassay für neue Karzinoidtherapeutika. Wechselwirkung von Somatostatinanaloga mit Somatostatinrezeptoren, die in diesem System exprimiert werden, beeinträchtigt folglich die zelluläre Funktion von BON-1. Es wurde gefunden, dass bevorzugte Analoga mit cyclischem Gerüst der vorliegenden Erfindung cAMP-Produktion nachfolgend auf Forskolin-Stimulierung inhibieren. In diesem Signal-Absonderungsweg ist PTR 3173 äquipotent wie das klinisch verwendete Arzneimittel Octreotid.
B. In vitro-Zellwachstumsinhibierung durch das Somatostatinanalog mit cyclischem Gerüst PTR 3173:
Eine pharmakologische Beurteilung der Wachstumsinhibierung wurde durchgeführt unter Verwendung von CHO-Zellen, die humanes kloniertes SST-R5 exprimieren. PTR 3173-Erkennung von SST-R5 bei zellulärem Gehalt war verbunden mit beachtenswert höherer Potenz der Wachstumsinhibierung im Vergleich mit dem nativen Hormon und dem Arzneimittel Octreotid.
C. Inhibierung von Chromogranin A-Freisetzung durch das Somatostatinanalog mit cyclischem Gerüst PTR 3173:
Eine Abschätzung der Chromogranin A-Freisetzung von BON-1 ist eine wichtige Untersuchung mit dem Ziel zur Identifizierung potenzieller Antikarzinoid-Arzneimittel. Chromogranin A ist einer der Hauptmediatoren bei der Degranulierung von Tumorgranalien, die übermäßige Menge vasoaktive Substanzen von Karzinoidtumoren sekretieren. PTR 3173 besitzt eine signifikante Antifreisetzungswirkung in diesem Stoffwechselweg. Eine der faszinierendsten Entdeckungen hinsichtlich des Analogs mit cyclischem Gerüst im humanen BON-1-Assay ist seine äquivalente Potenz wie die des nativen Hormons Somatostatin, wodurch eine potenzielle vorteilhafte Wirkung. beim Karzinoidsyndrom angezeigt wird.
Beispiel 6: Vergleich von PTR 3173, Octreotid und SRIF zur Bindung an nicht-Somatostatin G-gekoppelte Rezeptoren.
Somatostatinrezeptoren gehören zu der seven Transmembran-G-Protein gekoppelte Rezeptoren-Superfamilie. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind weit verbreitet im Körper und vermitteln physiologische Aktivitäten verschiedener Hormone, wie etwa Adrenalin, Acetylcholin, Opiaten, Neurokininen, Gastrin und vielen anderen Hormonen. Ein Arzneimittelkandidat könnte entdeckt werden durch einen definierten Subtyp von intrafamiliären Rezeptoren. Jedoch könnten potenzielle nachteilige Wirkungen im Körper bewirkt werden, aufgrund der Erkennung anderer Rezeptoren, die verschieden von dieser Familie sind. Diese Betrachtung erhöhte die Wichtigkeit von inter- versus intra-Rezeptorselektivität im Zusammenhang mit der Entwicklung physiologisch selektiver Arzneimittel.
NovaScreen (Hannover, MD) führten eine Beurteilung der nichtspezifischen Bindung an verschiedene G-Protein-gekoppelte Rezeptorfamilien durch. Bindungsstudien an Neurokinin-, Opiat- und Muscarin-Rezeptoren basierten auf einem Vergleich zwischen dem nativen Hormon Somatostatin, Octreotid und PTR 3173.
In einer Screeninguntersuchung, die durchgeführt wurde durch NovaScreen, wurde eine signifikant hohe Affinität von Octreotid für Opiatrezeptoren gefunden, während unter den gleichen experimentellen Bedingungen PTR 3173 und das native Hormon Somatostatin nicht an diese Rezeptoren banden (2). Signifikant höhere Affinität von Octreotid über PTR 3173 und dem nativen Hormon wurde ebenfalls für den Muscarin-2-Rezeptor gefunden.
Die Signifikanz der kreuzreaktiven Bindung von Octreotid an die Opiatrezeptoren wurde weiter untersucht in dem Meerschweinchen-Ileum. Vorhergehende Ergebnisse bestätigen die Wirkung von Octreotid als ein Opiatantagonist, während unter den gleichen experimentellen Bedingungen PTR 3173 die durch met-Enkephalin hervorgerufene Zuckkontraktion nicht beeinflusst.
Beispiel 7: Die in vivo-Wirkung von Rezeptor-spezifischen Somatostatinanaloga mit cyclischem Gerüst auf Wachstumshormonfreisetzung
Verfahren:
Inhibierung von Wachstumshormon (GH)-Freisetzung als ein Ergebnis der Peptidverabreichung wurde gemessen in männlichen Wistar-Ratten. Die analoge Aktivität wurde in dieser Studie verglichen mit SRIF oder Octreotid, unter Verwendung von 4 Ratten in jeder Gruppe. Erwachsene männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 200–250 g wurden bei einem konstanten Licht-Dunkel-Zyklus (Licht von 8:00 bis 20:00 h), konstanter Temperatur (21 ± 3°C) und relativer Feuchte (55 ± 10%) gehalten. Futterwasser und Leitungswasser waren ad libitum verfügbar. Am Tag des Versuches wurden die Ratten anästhesiert mit Nembutal (IP, 60 mg/kg). Zehn Minuten nach Anästhesie wurden Arzneimittel s.c. in einer Dosis von 0,01–100 Mikrogramm/kg verabreicht. Stimulierung von GH wurde durch i.v.-Verabreichung von 0,5 g/kg L-Arginin über die Femoralvene durchgeführt. Die Beprobung wurde wie folgt nachfolgend auf 5 Minuten Stimulierung durchgeführt, 15 oder 30 Minuten nach Peptidverabreichung. Blutproben wurden aus der abdominalen vena-cava gesammelt in Röhrchen, die Heparin enthielten(15 Einheiten pro ml Blut), und unmittelbar zentrifugiert. Plasma wurde abgetrennt und bei –20°C gefrorengehalten bis es untersucht wurde. Rattenwachstumshormon (rGH) [¹²⁵I]-Gehalte wurden bestimmt mittels eines Radioimmunoassaykits (Amersham). Der Standard in diesem Kit ist kalibriert worden gegen eine Referenzstandardpräparation (NIH-RP2), die erhalten wurde vom National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases. Alle Proben wurden doppelt gemessen. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Figur 3 gezeigt.
Ergebnisse:
Wachstumshormonfreisetzung wurde in Ratten stimuliert unter Verwendung von intravenöser (i.v.) Bolus-Verabreichung von L-Arginin unter Nembutal-Anästhesie. Der angegebene ED50 für Octreotid (Bauer et al., ibid.) ist in diesem Modell ungefähr 0,1 Mikrogramm pro Kilogramm. Folglich wurden Octreotid und die getesteten Rezeptor-spezifischen Analoga mit cyclischem Gerüst verabreicht in einer relativ hohen Dosis von 100 Mikrogramm pro Kilogramm. Unter diesen experimentellen Bedingungen waren PTR 3205, nicht enthalten in der vorliegenden Erfindung, und PTR 3173 äquipotente Inhibitoren der Wachstumshormonfreisetzung im Vergleich mit Octreotid (3). Faszinierende Ergebnisse wurden erhalten mit PTR 3201, nicht in der vorliegenden Erfindung enthalten, das ein Rezeptor 5-spezifisches Analog ist. Dieses selektive Analog beeinflusste nicht die Wachstumshormonfreisetzung, wodurch gezeigt wird, dass Wachstumshormoninhibierung nicht durch den Somatostatinrezeptor Subtyp 5 vermittelt wird. Auf der anderen Seite zeigt die signifikante Inhibierung, die gefunden wird mit PTR 3205, nicht in der vorliegenden Erfindung enthalten, das selektiv ist für Rezeptorsubtyp 2, dass dieser der prinzipielle Rezeptor ist, der Wachstumshormoninhibierung vermittelt. Daher können wir schließen, dass die Wirkung auf das Wachstumshormon, die mit dem Arzneimittel Octreotid oder PTR 3173 gefunden wird, auf ihre Erkennung von Rezeptorsubtyp 2 zurückzuführen ist.
Beispiel 8: Die in vivo Wirkung von Rezeptor-spezifischen Somatostatinanaloga mit cyclischem Gerüst auf Glucagonfreisetzung.
In vivo-Bestimmung der Freisetzung von Glucagon als ein Ergebnis von Peptidverabreichung wurde gemessen in männlichen Wistar-Ratten. Die analoge Aktivität wurde in dieser Studie verglichen mit SRIF oder Octreotid, unter Verwendung von 4 Ratten in jeder Gruppe. Zeitverlaufsprofile für Glucagonfreisetzung unter konstanten experimentellen Bedingungen wurden gemessen.
Männliche Wistar-Ratten ließ man über Nacht fasten. Die Tiere wurden mit Nembutal anästhesiert (i.p., 60 mg/kg). Zehn Minuten nach Anästhesie wurden Arzneimittel s.c. in einer Dosis von 0,01–100 Mikrogramm/kg verabreicht. Die Stimulierung der Glucagonsekretion wurde durch i.v.-Verabreichung von L-Arginin, 0,5 g/kg, 5 Minuten vor dem Sammeln von Blut aus der Portalvene durchgeführt. Die Hormonkonzentration wurde durch RIA gemessen.
Der einzig statistisch signifikante Unterschied der Glucagongehalte im Vergleich mit der Kontrolle wurde erhalten mit der hohen Dosis von 100 Mikrogramm pro Kilogramm PTR 3173 (4), einer 1000-fach höheren Dosis im Vergleich zu der ED50 von PTR 3173 auf Wachstumshormonfreisetzung. Diese Ergebnisse heben hervor, dass dieses Analog mit cyclischem Gerüst signifikante physiologische Selektivität im Vergleich mit Octreotid aufweist, wie oben in Tabelle 4 zusammengefasst.
Beispiel 9: Die in vivo Wirkung von Rezeptor-spezifischen Somatostatinanaloga mit cyclischem Gerüst auf Insulinfreisetzung.
Die Inhibierung der Insulinfreisetzung durch Somatostatinanaloga ist gut dokumentiert in der Literatur (Bauer et al., ibid., Lamberts et al., 1996, ibid.). Jedoch sind synthetische Somatostatinanaloga mit einer langen physiologischen Aktivitätsdauer beschrieben worden als weniger aktiv für Insulin im Vergleich mit ihrer potenten Inhibierung der Wachstumshormon- oder Glucagonfreisetzung (Bauer et al., ibid., Lamberts et al., 1996, ibid.). Sandoz beansprucht, dass eine physiologische Selektivität von Octreotid für das Wachstumshormon gegenüber Insulin besteht. Jedoch supprimiert in Typ 2 Diabetes das langwirkende analoge Octeotid Insulin und Glucagonfreisetzung, wodurch Glucosegehalte entweder unverändert bleiben oder etwas erhöht werden.
Andere klinische Versuche haben gezeigt, dass das Versagen von Octreotid beim Absenken glykämischer Werte bei Typ 2-Diabetes trotz seiner Fähigkeit zum Erniedrigen von Glucagon und Wachstumshormon möglicherweise abhängig war von einer temporären Blockade von residualer endogener Insulinsekretion, die durch seine Verabreichung induziert wird. In gesunden Individuen führte die Verabreichung von Octreotid zur Entwicklung von schwacher Nüchtern-Hyperglykämie und deutlicher Nüchtern-Hypoinsulinämie. Darüber hinaus ist Octreotid beschrieben für die Behandlung von Nesidioblastose, ein Syndrom, das verbunden ist mit übermäßiger Freisetzung von Insulin aus dem Pankreas, was die physiologisch nichtspezifische Wirkung von Octreotid auf Insulin hervorhebt (Kane et al., J. Clin. Inves., 100:1888, 1997).
Zum Beurteilen der physiologischen Wirkungen von Rezeptor-spezifischen Somatostatinanaloga mit cyclischem Gerüst auf Insulinfreisetzung wurde das gleiche experimentelle Protokoll, das von Sandoz zur Beurteilung von Octreotid verwendet wurde, durchgeführt. Insulinstimulierung wurde induziert durch i.v.-Bolus-Verabreichung von D-Glucose an Ratten, die man über Nacht fasten ließ.
Verfahren:
Eine in vivo-Bestimmung der Insulinfreisetzung als ein Ergebnis von Peptidverabreichung wurde gemessen in männlichen Wistar-Ratten. Die analoge Aktivität wurde verglichen in dieser Studie mit SRIF oder Octreotid, unter Verwendung von 4 Ratten in jeder Gruppe. Zeitverlaufsprofile für GH- Freisetzung unter konstanten experimentellen Bedingungen wurden gemessen.
Männliche Winstar-Ratten wurden über Nacht fasten gelassen. Die Tiere wurden anästhesiert mit Nembutal (i.p., 60 mg/kg). Zehn Minuten nach Anästhesie wurden Arzneimittel s.c. in einer Dosis von 0,01–100 Mikrogramm/kg verabreicht, 30 Minuten vor Stimulierung der Insulinsekretion, ausgeführt durch i.v.-Verabreichung von 0,5 g/kg D-Glucose, 5 Minuten vor Sammeln von Blut aus der abdominalen vena-cava. Hormongehalte wurden durch RIA gemessen.
Ergebnisse:
PTR 3205, nicht in der vorliegenden Erfindung enthalten, und Octreotid waren beide aktive Inhibitoren der Insulinfreisetzung (5a). Der ED50 von Octreotid war nachfolgend auf subkutane Injektion zwischen 10 bis 100 Mikrogramm pro Kilogramm, gemäß dem ED50, der von Sandoz angegeben wird – 26 Mikrogramm pro Kilogramm. Die signifikante Wirkung, die gefunden wird mit PTR-3205, nicht in der vorliegenden Erfindung enthalten, zeigt, dass Somatostatinrezeptorsubtyp 2 die Wirkung auf Wachstumshormon und auch auf Insulin vermittelt. Diese Rezeptor-Effektor-Beziehung wurde korreliert mit früher veröffentlichten Daten, die angaben, dass Somatostatin β-Zellsekretion über Rezeptorsubtyp 2 in isoliertem perfundiertem humanem Pankreas inhibiert. Im Gegensatz zu der signifikanten Wirkung, die gefunden wird für PTR 3205, nicht in der vorliegenden Erfindung enthalten, und Octreotid, waren hohe Dosen (100 Mikrogramm pro Kilogramm) PTR 3201, nicht in der vorliegenden Erfindung enthalten, und PTR 3173 inaktiv für Insulin. Es sollte festgehalten werden, dass PTR 3173 in einer ähnlichen Dosis eine signifikante Wirkung auf die Freisetzung von Wachstumshormon hatte. Diese faszinierende physiologische Selektivität von PTR 3173 führte uns zur Wiederholung dieses Versuches mit einer viel höheren Dosis von bis zu 1 Milligramm pro Kilogramm. Unter diesen experimentellen Bedingungen wurde PTR 3173 definiert als ein physiologisch selektives Somatostatinanalog mit keiner nennenswerten Wirkung auf Insulin im Vergleich mit dem Arzneimittel Octreotid (5b).
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Somatostatin-Analog mit zyklischem Gerüst, das mindestens eine Baueinheit beinhaltet, wobei die Baueinheit ein mit einer Überbrückungsgruppe, umfassend ein Amid, einen Thioether, einen Thioester oder ein Disulfid, verbundenes Stickstoffatom des Peptidgerüstes enthält, wobei mindestens eine Baueinheit über die Überbrückungsgruppe verbunden ist, um eine zyklische Struktur mit einer Einheit zu bilden, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus einer zweiten Baueinheit, der Seitenkette eines Aminosäurerestes der Sequenz oder dem N-terminalen Aminosäurerest besteht, mit folgender allgemeiner Formel 7:
wobei n 1 bis 5 ist, X eine terminale Carboxysäure, ein Amid- oder eine Alkoholgruppe bezeichnet, Q Wasserstoff oder ein Mono- oder Disaccharid ist, R⁵ Gamma-Aminobuttersäure, Diaminobuttersäure, Gly, β-Ala, 5-Aminopentansäure oder -Aminohexansäure ist, R⁶ (D)- oder (L)-Phe oder Tyr ist, R⁷ (D)- oder (L)-Trp, (D)- oder (L)-Phe, (D)- oder (L)-1Nal oder (D)- oder (L)-2Nal oder Tyr ist, R⁸ (D)- oder (L)-Trp ist, R⁹ (D)- oder (L)-Lys ist, R¹⁰ Thr, Gly, Abu, Ser, Cys, Val, (D)- oder (L)-Ala oder (D)- oder (L)-Phe ist, R¹¹ (D)- oder (L)-Phe, (D)- oder (L)-Ala, Nie oder Cys ist und R¹² Gly, Val, Leu, (D)- oder (L)-Phe oder 1Nal oder 2Nal ist.
Somatostatin-Analog mit zyklischem Gerüst nach Anspruch 1 mit der allgemeinen Formel 7, wobei: Q Wasserstoff ist, R⁵ GABA ist, R⁶ Phe ist, R⁷ Trp ist, R⁸ (D)-Trp ist, R⁹ Lys ist, R¹⁰ Thr ist, R¹¹ Phe ist, R¹² Gly ist, n 3 ist und X ein Amid ist.
Somatostatin-Analog mit zyklischem Gerüst nach Anspruch 1 mit der allgemeinen Formel 7, wobei: Q Galaktose ist, R⁵ DAB ist, R⁶ Phe ist, R⁷ (L)-Trp ist, R⁸ (D)-Trp ist, R⁹ Lys ist, R¹⁰ Thr ist, R¹¹ Phe ist; R¹² Gly ist, n 3 ist und X ein Amid ist.
Somatostatin-Analog mit zyklischem Gerüst nach Anspruch 1 mit der Formel GABA*-Phe-Trp-(D)Trp-Lys-Thr-Phe-Gly(C3)-X Galaktose-Dab*-Phe-Trp-(D)Trp-Lys-Thr-Phe-Gly(C3)-X, wobei X eine terminale Carbonsäure, Amid- oder Alkoholgruppe bezeichnet, der Stern angibt, dass die Überbrückungsgruppe zwischen dem N^α-ω-funktionalisierten Derivat einer Aminosäure und dem N-Terminus des Peptids oder der Seitenkette des Cys-Restes verbunden ist.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche ein Somatostatin-Analog mit zyklischem Gerüst, wie in einem der Ansprüche 1–4 definiert, umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das Analog mit zyklischem Gerüst für einen Somatostatin-Rezeptor-Subtyp selektiv ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das Analog mit zyklischem Gerüst für zwei Somatostatin-Rezeptor-Subtypen selektiv ist.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines Somatostatin-Analogs mit zyklischem Gerüst nach einem der Ansprüche 1–4 bei der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung oder Vorbeugung von Erkrankungen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, welche aus Krebserkrankungen, Autoimmunkrankheiten, endokrinen Störungen, diabetes-assoziierten Komplikationen, Magen-Darm-Störungen, Entzündungskrankheiten, Pankreatitis, Atherosklerose, Restenose und post-operativen Schmerzen besteht.
Anwendung nach Anspruch 8, wobei das Analog mit zyklischem Gerüst für einen Somatostatin-Rezeptor-Subtyp selektiv ist.
Anwendung nach Anspruch 8, wobei das Analog mit zyklischem Gerüst für zwei Somatostatin-Rezeptor-Subtypen selektiv ist.
Anwendung eines Somatostatin-Analogs mit zyklischem Gerüst nach einem der Ansprüche 1–4 für die Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung zum Diagnostizieren von Krebs.
Anwendung nach Anspruch 11, wobei das Analog mit zyklischem Gerüst für die Bilddarstellung des Vorhandenseins von Metastasen verwendet wird.
Anwendung nach Anspruch 12, wobei das Analog mit zyklischem Gerüst mit einer feststellbaren Sonde markiert ist.