DE69737787T2

DE69737787T2 - Zyklische somatostatin-analoge mit einer hauptkette mit einer gespannten konformation

Info

Publication number: DE69737787T2
Application number: DE69737787T
Authority: DE
Inventors: Vered Hornik; Alon Seri-Levy; Gary Gellerman; Chaim Gilon
Original assignee: Peptor Ltd; Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Peptor Ltd; Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1996-07-31
Filing date: 1997-07-30
Publication date: 2008-03-06
Anticipated expiration: 2017-07-31
Also published as: AU3633197A; CA2262778C; BR9710636A; CN1124282C; US5770687A; KR20000029654A; EP0920446A4; DE69737787D1; IL128084A0; AU711100B2; EP0920446B1; CA2262778A1; EP0920446A1; KR100477710B1; WO1998004583A1; NZ334046A; JP4018752B2; ATE363911T1; CN1231672A; JP2000516592A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Somatostatin-Analoga mit gespannter Konformation mit cyclisiertem N^α-Gerüst, die über neue Verknüpfungen cyclisiert sind, Verfahren zur Herstellung dieser Peptid-Analoga mit cyclisiertem Gerüst, Verfahren zur Verwendung dieser Peptid-Analoga und pharmazeutische Zusammensetzungen, welche diese enthalten.
Somatostatin-Analoga
Somatostatin ist ein cyclisches Tetradekapeptid, das sowohl im zentralen Nervensystem als auch in peripheren Geweben auftritt. Es wurde ursprünglich aus dem Säugerhypothalamus isoliert und als wichtiger Hemmer der Sekretion von Wachstumshormon aus dem Hypophysenvorderlappen identifiziert. Seine vielfältigen biologischen Wirkungen schließen die Hemmung der Sekretion von Glucagon und Insulin aus der Bauchspeicheldrüse, Regulierung der meisten Darmhormone und Regulierung der Freisetzung anderer Neurotransmitter, die an der motorischen Aktivität und kognitiven Prozessen im zentralen Nervensystem beteiligt sind, ein (für einen Überblick, siehe Lamberts, Endocrine Rev., 9:427, 1988). Außerdem sind Somatostatin und dessen Analoga potenzielle nützliche antiproliferative Mittel für die Behandlung verschiedener Arten von Tumoren.
Natürliches Somatostatin (auch als Somatotropin-Freisetzungs-hemmender Faktor, SRIF, bekannt) mit der folgenden Struktur: H-Ala¹-Gly²-Cys³-Lys⁴-Asn⁵-Phe⁶-Phe⁷-Trp⁸-Lys⁹-Thr¹⁰-Phe¹⁰-Thr¹²-Ser¹³-Cys¹⁴-OH wurde erstmals von Guillemin und Mitarbeitern isoliert (Bruzeau et al. Science, 179:78, 1973). Es übt seine Wirkung durch Wechselwirkung mit einer Familie von Rezeptoren aus. Vor kurzem wurden fünf Rezeptoruntertypen mit der Bezeichnung SSTR1-5 identifiziert und kloniert. In seiner natürlichen Form ist Somatostatin begrenzt als therapeutisches Mittel verwendbar, da es zwei unerwünschte Eigenschaften aufweist: geringe Bioverfügbarkeit und kurze Wirkungsdauer. Aus diesem Grund wurden während der letzten zwei Jahrzehnte große Anstrengungen unternommen, um Somatostatin-Analoga aufzufinden, die in ihrer Wirksamkeit, Biostabilität, Wirkungsdauer oder Selektivität im Hinblick auf die Hemmung der Freisetzung von Wachstumshormon, Insulin oder Glucagon überlegen sind.
Struktur-Aktivitäts-Beziehungsuntersuchungen, spektroskopische Techniken wie etwa Zirkulardichroismus und kernmagnetische Resonanz und Ansätze des molekularen Modellings ergeben Folgendes: Die Konformation des cyclischen Teils von natürlichem Somatostatin ist am wahrscheinlichsten ein antiparalleles β-Blatt; Phe⁶ und Phe¹¹ spielen eine bedeutende Rolle bei der Stabilisierung der pharmakophoren Konformation durch hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den beiden aromatischen Ringen; die vier Aminosäuren Phe⁷-Trp⁹-Lys⁹-Thr¹⁰, die um die β-Schleife in dem antiparallelen β-Blatt verteilt sind, sind für den Pharmakophor essenziell; und (D) Trp⁸ ist gegenüber (L) Trp⁸ für die Wechselwirkungen mit Somatostatin-Rezeptoruntertyp 2 bis 5 bevorzugt.
Dennoch ist ein Somatostatin-Hexapeptidanalogon, welches diese vier Aminosäuren über eine Disulfidbrücke verankert enthält,
sowohl in vitro als auch in vivo nahezu inaktiv, obwohl es von der kovalenten Disulfidbrücke profitiert, welche die hydrophoben Phe⁶-Phe¹¹ Wechselwirkungen in natürlichem Somatostatin ersetzt.
Hexapeptidanalogons zu erhöhen. (1) Ersetzen der Disulfidbrücke durch eine Cyclisierung, welche eine cis-Amidbindung begünstigt oder durch Ausführung einer zweiten Cyclisierung des Moleküls, um ein bicyclisches Analogon zu erhalten. In beiden Fällen besitzt das resultierende Analogon eine verringerte Zahl an Konformationsfreiheitsgraden. (2) Ersetzen der ursprünglichen Reste in der Sequenz Phe⁷-(D)Trp⁸-Lys⁹-Thr¹⁰ durch andere natürliche oder nicht natürliche Aminosäuren, wie etwa Ersetzen von Phe⁷ durch Tyr⁷ und Tyr¹⁰ durch Val¹⁰. (3) Einbau zusätzlicher funktioneller Gruppen aus natürlichem Somatostatin mit der Intention, dass diese neuen Elemente zur Wechselwirkung mit dem Rezeptor beitragen. (4) Entfernen einer der vier Aminosäuren Phe⁷-(D)Trp⁸-Lys⁹-Thr¹⁰ unter der Annahme, dass solche Analoga selektiver sind.
Das Somatostatin-Analogon MK-678: Cyclo (N-Me-Ala⁶-Tyr⁷-(D)Trp⁸-Lys⁹-Val¹⁰-Phe) ist ein Beispiel für ein hochwirksames Somatostatin-Analogon, das unter Verwendung der ersten drei der obigen Ansätze entworfen wurde (Veber, et al., Life Science, 34:371, 1984). In diesem Hexapeptidanalogon befindet sich eine cis-Amidbindung zwischen N-Me-Ala und Phe¹¹, Tyr⁷ und Val¹⁰ ersetzen Phe⁷ bzw. Thr¹⁰, und Phe¹¹ ist aus natürlichem Somatostatin enthalten.
Eine andere Gruppe von Somatostatin-Analoga ( US-Patente 4,310,518 und 4,235,886 ) umfasst Octreotid:
das einzige derzeit erhältliche zugelassene Somatostatin-Analogon. Es wurde unter Verwendung des dritten oben beschriebenen Ansatzes entwickelt. Hier wurde angenommen, dass (D) Phe⁵ und das reduzierte C-terminale Thr¹²-CH₂OH einen Teil des konformativen Raums, der natürlichem Phe⁶ bzw. Thr¹² zur Verfügung steht, besetzt.
Die Verbindung TT-232
ist eng verwandt mit Octreotid und ist ein Beispiel für die Umsetzung des vierten oben beschriebenen Ansatzes. Das fehlende Thr¹⁰ ist möglicherweise verantwortlich für dessen hohe funktionelle Selektivität im Hinblick auf die Antitumorwirkung.
Diese Beispiele für hochwirksame Somatostatin-Analoga legen nahe, dass die Phenylalanine in den Positionen 6 und 11 nicht nur eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung der pharmakophoren Konformation spielen, sondern dass sie außerdem eine funktionelle Rolle bei der Wechselwirkung mit dem Rezeptor spielen. Eine offene Frage ist noch, ob ein Phenylalanin (entweder Phe⁶ oder Phe¹¹) für die Wechselwirkung mit dem Rezeptor ausreichend ist, oder ob beide erforderlich sind.
Es ist heute bekannt, dass die Somatostatin-Rezeptoren eine Familie von fünf verschiedenen Rezeptoruntertypen bilden (Bell und Reisine, Trends Neurosci., 16, 34-38, 1993), die auf Basis ihrer Gewebespezifität und/oder biologischen Wirkung unterschieden werden können. Im Fachbereich bekannte Somatostatin-Analoga können keine ausreichende Selektivität oder Rezeptoruntertyp-Selektivität, insbesondere als antineoplastische Mittel, bereitstellen (Reubi und Laissue, TIPPS, 16, 110-115, 1995).
Symptome, die mit metastasierenden karzinoiden Tumoren (Flush und Diarrhöe) und vasoaktives Intestinalpeptid (VIP)-sekretierenden Adenoma (wässrige Diarrhöe) assoziiert sind, werden mit Somatostatin-Analoga behandelt. Somatostatin wurde auch für die Behandlung schwerer Magen-Darm-Hemorrhagen zugelassen. Somatostatin kann auch bei der palliativen Behandlung anderer Hormonsekretierender Tumore (z.B. Pankreas-Inselzelltumore und Akromegalie) und Hormon-abhängiger Tumore (z.B. Chondrosarkom und Osteosarkom) aufgrund seiner antisekretorischen Wirkung nützlich sein.
Ein weiteres Somatostatin-Analogon der Formel
ist in Patent Abstracts of Japan, Bd. 007, Nr. 139 (C-171) und in JP 58052259 A für die Unterdrückung der Sekretion von Gastrin und Wachstumshormon offenbart, was bei Hemorrhagen der Verdauungsröhre, wie etwa stressbedingten Geschwüren und Gastritis nützlich ist. Efendic S. et al., Acta Endocrinologica, 85, 579-586, 1997 untersuchten die Wirkung von Somatostatin-Analoga auf die Freisetzung von Insulin und Glucagon aus isolierten perfundierten Ratten-Pankreas. Bei diesen Analoga der beiden obigen Dokumente befindet sich Phe an einer Position, die Position 6 des Wildtyp-Somatostatins entspricht.
Peptidmimetika
Infolge der bedeutenden Fortschritte der organischen Chemie und Molekularbiologie können heute zahlreiche bioaktive Peptide in Mengen hergestellt werden, die für pharmakologische und klinische Verwendungen ausreichend sind. Daher wurden in den letzten Jahren neue Verfahren zur Behandlung und Therapie von Erkrankungen eingeführt, bei denen Peptide einbezogen werden. Die Verwendung von Peptiden als Arzneimittel ist durch die folgenden Faktoren begrenzt: a) ihre geringe metabolische Stabilität gegenüber Proteolyse im Magen-Darm-Trakt und Serum; b) ihre geringe Absorption nach oraler Aufnahme, insbesondere aufgrund ihrer relativ hohen Molekülmasse oder des Mangels an spezifischen Transportsystemen oder beidem; c) ihre schnelle Ausscheidung durch Leber und Nieren, und d) ihre unerwünschten Nebenwirkungen in Nicht-Zielorgansystemen, da Peptidrezeptoren in einem Organismus weit verteilt sein können.
Außerdem liegen natürliche Peptide mit kleiner bis mittlerer Größe (weniger als 30 Aminosäuren) mit wenigen Ausnahmen in verdünnter wässriger Lösung ungeordnet in einer Vielzahl von Konformationen im dynamischen Gleichgewicht vor, was zu einer fehlenden Rezeptorselektivität, metabolischen Anfälligkeiten führen kann und Versuche zur Bestimmung der biologisch wirksamen Konformation beeinträchtigen kann. Wenn ein Peptid per se die biologisch aktive Konformation aufweist, d.h. die Rezeptor-gebundene Konformation, so erwartet man eine erhöhte Affinität gegenüber dem Rezeptor, da die Entropieabnahme bei der Bindung geringer ist als bei der Bindung eines flexiblen Peptids. Es ist daher wichtig, nach geordneten, einheitlichen und biologisch aktiven Peptiden zu suchen und diese zu entwickeln.
In den letzten Jahren wurden intensive Anstrengungen unternommen, um Peptidmimetika oder Peptidanaloga zu entwickeln, welche günstigere pharmakologische Eigenschaften besitzen als ihre nativen Peptidprototypen. Das native Peptid selbst, dessen pharmakologische Eigenschaften optimiert wurden, dient im Allgemeinen als Leiter für die Entwicklung dieser Peptidmimetika. Ein Hauptproblem bei der Entwicklung solcher Mittel liegt jedoch in der Bestimmung der aktiven Region eines biologisch aktiven Peptids. Beispielsweise ist regelmäßig nur eine kleine Zahl von Aminosäuren (üblicherweise 4 bis 8) für die Erkennung eines Peptidliganden durch einen Rezeptor verantwortlich. Sobald diese biologisch aktive Stelle ermittelt ist, kann eine Leitstruktur für die Entwicklung von Peptidmimetika optimiert werden, beispielsweise durch Untersuchungen der Struktur-Aktivitätsbeziehung.
Wie hierin verwendet, ist ein „Peptidmimetikum" eine Verbindung, die als Ligand eines Rezeptors die biologische Wirkung eines Peptids auf Rezeptorebene imitieren (Agonist) oder blockieren (Antagonist) kann. Die folgenden Faktoren sollten beachtet werden, um den bestmöglichen peptidmimetischen Agonisten zu erhalten a) metabolische Stabilität, b) gute Bioverfügbarkeit, c) hohe Rezeptoraffinität und Rezeptorselektivität, und d) minimale Nebenwirkungen.
Ein allgemein anwendbares und erfolgreiches Verfahren ist die vor kurzem erfolgte Entwicklung von Peptidmimetika mit eingeschränkter Konformation, welche die Rezeptor-gebundene Konformation des endogenen Peptidliganden so gut wie möglich imitieren (Rizo und Gierasch, Ann. Rev. Biochem., 61:387, 1992). Untersuchungen dieser beiden Arten von Analoga zeigen, dass sie eine erhöhte Beständigkeit gegenüber Proteasen besitzen, d.h. eine erhöhte metabolische Stabilität, sowie eine erhöhte Selektivität und daher weniger Nebenwirkungen (Veber und Friedinger, Trends Neurosci., S. 392, 1985).
Sobald diese peptidmimetischen Verbindungen mit starren Konformationen hergestellt sind, werden die wirkungsvollsten Strukturen ausgewählt, indem die Struktur-Aktivitätsbeziehungen untersucht werden. Solche konformatorischen Spannungen können lokale Modifikationen der Struktur oder globale Konformatonsbeschränkungen einschließen (für einen Überblick, siehe Giannis und Kolter, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32:1244, 1993).
Peptidanaloga mit gespannter Konformation
Die Verbrückung zwischen zwei benachbarten Aminosäuren in einem Peptid führt zu einer lokalen Modifikation der Konformation, deren Flexibilität im Vergleich zu der regulärer Dipeptide eingeschränkt ist. Einige Möglichkeiten zur Bildung solcher Brücken schließen den Einbau von Lactamen und Piperazinonen ein. γ-Lactame und δ-Lactame wurden in gewissem Maß als „Kurven-Mimetika" entworfen; in verschiedenen Fällen führt die Aufnahme solcher Strukturen in Peptide zu biologisch wirksamen Verbindungen.
Globale Konformationsbeschränkungen eines Peptids sind möglich, indem die Flexibilität des Peptidstrangs durch Cyclisierung eingeschränkt wird (Hruby et al., Biochem. J. 268:249, 1990). Durch Cyclisierung bioaktiver Peptide wird nicht nur deren metabolische Stabilität und Rezeptorselektivität verbessert, sondern die Cyclisierung führt auch zu Spannungen, welche die konformatorische Homogenität fördern und die Konformationsanalyse erleichtern. Die gebräuchlichen Arten der Cyclisierung sind dieselben, die bei natürlich auftretenden cyclischen Peptiden anzutreffen sind. Diese beinhalten eine Seitenkette-an-Seitenkette-Cyclisierung oder Seitenkette-an-Endgruppe-Cyclisierung. Zu diesem Zweck werden Aminosäureseitenketten, die nicht an der Rezeptorerkennung beteiligt sind, miteinander oder mit dem Peptidgerüst verbunden. Eine weitere gebräuchliche Cyclisierung ist die Ende-an-Ende-Cyclisierung.
Die Haupteinschränkungen dieser klassischen Arten der Cyclisierung sind, dass eine Substitution von Aminosäureseitenketten erforderlich ist, um eine Cyclisierung zu erreichen.
Ein weiteres Konzept zur gespannten Konformation von Peptiden wurde von Gilon et al. (Biopolymers 31:745, 1991) einführt, die eine Gerüst-an-Gerüst-Cyclisierung von Peptiden vorschlugen. Die theoretischen Vorteile dieser Strategie beinhalten die Fähigkeit, eine Cyclisierung über die Kohlenstoffe oder Stickstoffe des Peptidgerüsts zu bewirken, ohne Seitenketten zu beeinflussen, die für die Wechselwirkung mit dem speziellen Rezeptor eines bestimmten Peptids entscheidend sein könnten. Obwohl man annahm, dass das Konzept für ein beliebiges lineares Peptid von Interesse anwendbar sei, war der begrenzende Faktor bei dem vorgeschlagenen Schema tatsächlich die Verfügbarkeit geeigneter Baueinheiten, die verwendet werden müssen, um die Aminosäuren zu ersetzen, die durch verbrückende Gruppen verknüpft werden sollen. Die tatsächliche Übertragung dieses Konzepts der Gerüst-Cyclisierung in die Praxis wurde verhindert, da es nicht möglich ist, irgendein praktisches Verfahren zur Herstellung von Baueinheiten aus anderen Aminosäuren als Glycin zu entwerfen (Gilon et al., J. Org. Chem. 587:5687, 1992).
In Gilon, EP-Anmeldung Nr. 564 739 A2 und J. Org. Chem., 57:5687, 1992, werden zwei grundlegende Ansätze für die Synthese von Baueinheiten beschrieben. Der erste beginnt mit der Umsetzung eines Diamins mit einer Bromsäure. Selektives Schützen des ω-Amins und weitere Aufarbeitung der Schutzgruppen stellt eine Baueinheit bereit, die für die Boc-Chemie-Peptidsynthese geeignet ist. Der zweite Ansatz beginnt mit dem selektiven Schützen eines Diamins und der Umsetzung des Produkts mit Chloressigsäure, um das geschützte Glycinderivat bereitzustellen, welches für die Fmoc-Peptidsynthese geeignet ist.
Weitere Methoden zum Einsatz des Konzeptes der Gerüst-cyclisierten Peptidanaloga sind in WO 95/33765 beschrieben, worin auch neue Verfahren zur Synthese von anderen Baueinheiten als Glycin bereitgestellt werden. Unter den Familien der in WO 95/33765 offenbarten Peptidanaloga sind verschiedene Somatostatin-Analoga. Für keine der in dieser Anmeldung offenbarten Familien von Analoga werden einzigartige Eigenschaften oder unerwartete Vorteile im Hinblick auf die Bindung an Rezeptoruntertypen gezeigt.
Bibliotheken von Peptidanaloga mit cyclisiertem Gerüst
Wie oben erwähnt, sind lineare Peptide mit verschiedenen schwerwiegenden Nachteilen als mögliche Wirkstoffe verbunden, da sie in vivo bekanntermaßen instabil sind, häufig keine hohe Bindungsaffinität an ihren Rezeptor aufweisen, regelmäßig nicht selektiv für eine Art von Rezeptor sind und im Allgemeinen eine geringe orale Bioverfügbarkeit besitzen. Bei Versuchen, solche Probleme zu bewältigen, können auch die im Zusammenhang mit synthetischen Peptidbibliotheken entwickelten Methodiken eingesetzt werden, um Sammlungen cyclischer Peptide, neuer Biopolymere und sogar neuer verzweigter oligomerer Verbindungen zu erzeugen (zusammengefasst von Zuckermann, Current Opinion in Structural Biology 3, 580-584, 1993).
Die Erzeugung von Bibliotheken cyclischer Peptide erfordert zusätzlich zu allen zuvor erwähnten Überlegungen, dass die Cyclisierungsreaktion mit hoher Ausbeute und einem Minimum an zusätzlichen Manipulationen durchgeführt wird. Unglücklicherweise sind klassische Cyclisierungsreaktionen im Hinblick auf die erwarteten Ausbeuten stark sequenzabhängig, so dass die einheitliche Cyclisierung eines Peptidgemischs unzuverlässig wird.
Aktuelle Fortschritte bei der direkten Cyclisierung von Peptiden auf dem festen Träger haben das synthetische Vorgehen verbessert und sogar die Automatisierung von Cyclisierungsreaktionen auf Grundlage bekannter Cyclisierungsschemata ermöglicht. In der Vergangenheit wurden Cyclisierungen typischerweise in Lösung unter Bedingungen großer Verdünnung durchgeführt. Durch Polymer-unterstützte Cyclisierungen können sowohl mögliche Nebenreaktionen wie etwa eine Oligomerisierung verhindert werden, als auch die Produktaufreinigung erleichtert werden. Beispielsweise wurden vor kurzem Auf-Harz-Cyclisierungsverfahren verwendet, um Cyclopeptide herzustellen, bei denen Brücken aus Thioethern, Disulfiden oder Lactamen zwischen zwei Seitenketten, Lactam zwischen dem Aminoterminus und einer Seitenkette und Lactame zwischen den Amino- und Carboxyenden ausgebildet sind (zusammengefasst von Zuckermann, Current Opinion in Structural Biology 3, s.o.).
Die Verwendung Harz-gebundener cyclischer Peptide und freier cyclischer Peptide in kombinatorischen Bibliotheken ist in WO 92/00091 offenbart. Diese cyclischen Peptide enthalten jedoch keinerlei Elemente mit gespannter Konformation und in den Fällen, in denen eine Cyclisierung erreicht wird, können diese Peptide noch immer mehrere Konformationen annehmen und viele derselben Nachteile wie lineare Peptide aufweisen.
Bei den Bibliotheken cyclischer Halb-Zufallspeptide, die in WO 95/01800 offenbart sind, handelt es sich ausschließlich um cyclische Penta- und Hexapeptid-Bibliotheken, die eine oder mehrere Zufallsaminosäuren und ein Element mit gespannter Konformation in Form eines Aminosäurerestes wie etwa Prolin enthalten, welches die Winkel der Beta-Schleife der benachbarten Aminosäurereste fixiert. Diese Vorteile solcher Elemente mit gespannter Konformation werden von Erfindern dieses Ansatzes hervorgehoben. Eine Aufnahme solcher Elemente durch Einbau eines bestimmten Aminosäurerestes in die Peptidsequenz kann jedoch nachteilige Auswirkungen auf diejenigen Reste, die für die Rezeptorerkennung oder eine andere biologische Wirkung benötigt werden zur Folge haben. Außerdem ist die Cyclisierungsreaktion in dieser Offenbarung ( WO 95/01800 ) nur eine weitere Kopplungsreaktion, bei der die terminale Aminogruppe des linearen Peptids an die terminale Carboxygruppe des Peptids gekoppelt wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden nun neue peptidmimetische Verbindungen für die Verwendung als Medikament erzeugt, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie neue Baueinheiten mit verbrückenden Gruppen, die an Alpha-Stickstoffe von Alpha-Aminosäuren angebunden sind, enthalten.
Die beachtlichsten Vorteile dieses Ansatzes sind:

1) Das Verfahren ermöglicht die Cyclisierung der Peptidsequenz, ohne irgendwelche Seitenketten des Peptids zu gefährden, so dass die Wahrscheinlichkeit, dass funktionelle Gruppen, die für biologische Erkennung und Funktion wesentlich sind, verloren gehen, verringert wird.
2) Das Verfahren ermöglicht die Optimierung der Peptidkonformation, indem eine Permutation der Brückenlänge, Richtung und Bindungsart (z.B. Amid, Disulfid, Thioether, Thioester, etc.) und der Position der Bindung im Ring ermöglicht wird.
3) Wenn die Cyclisierung auf lineare Peptide mit bekannter Aktivität angewendet wird, so kann die Brücke derart konzipiert werden, dass die Wechselwirkung mit der aktiven Region des Peptids und seinem verwandten Rezeptor minimiert wird. Dadurch wird die Wahrscheinlichkeit, dass der Cyclisierungsarm die Erkennung und Funktion stört, verringert und es wird außerdem eine Stelle erzeugt, die für die Anbindung von Markierungen wie etwa radioaktiven Tracern, zytotoxischen Wirkstoffen, Licht einfangenden Substanzen oder beliebigen anderen gewünschten Markierungen geeignet ist.

Bei der vorliegenden Erfindung wird ein Paar der Baueinheiten miteinander unter Bildung einer cyclischen Struktur verbunden. Somit werden gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung Somatostatin-Analoga mit cyclisiertem Gerüst für die Verwendung als Medikament bereitgestellt, welche aus der Struktur: Cyclo [N Phe-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-N Phe]-Thr-X, worin X eine Carboxy-terminale Aminosäure, ein Carboxy-terminales Amid, einen Carboxy-terminalen Ester oder einen Carboxy-terminalen Alkohol bezeichnet, bestehen.
Eine bevorzugte Verbindung besteht aus der Struktur
worin X eine Carboxy-terminale Aminosäure, ein Carboxy-terminales Amid, einen Carboxy-terminalen Ester oder einen Carboxy-terminalen Alkohol bezeichnet.
Die verbrückende Gruppe hat die Formel -(CH₂)_x-M-(CH₂)_y-; M ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Amid, Thioether, Thioester und Disulfid; und x und y bezeichnen jeweils eine ganze Zahl von 1 bis 10.
Die Aspekte der vorliegenden Erfindung sind damit auf die Cyclisierung des Gerüsts gerichtet, um neue Somatostatin-Analoga zu erzeugen, die zwischen den Positionen 6 und 11 verknüpft sind, wobei die Phenylalanin-Seitenketten unberührt bleiben. Diese konformatorische Stabilisierung ist sehr viel steifer als die hydrophobe Phe⁶, Phe¹¹-Wechselwirkung bei natürlichem Somatostatin und viel stabiler gegenüber Reduktions-/Oxidationsreaktionen als die Cys-Cys-Disulfidbrücke. In anderen Worten kann erstmals eine stabile kovalente Brücke erzielt werden, bei der die ursprünglichen Phe⁶ und Phe¹¹ beibehalten bleiben.
Wie hierin und in den folgenden Peptidanaloga mit cyclisiertem Gerüst verwendet, bezeichnen die hochgestellten Zahlen nach den Aminosäuren ihre Positionszahlen in dem nativen Somatostatin.
Das erfindungsgemäße Somatostatin-Analogon mit cyclisiertem Gerüst fällt unter die Formel (Va):
und innerhalb dieser Verbindungen unter die Formel (Vb):
worin m und n 1 bis 5 sind; X ein Carboxy-terminales Amid oder einen Carboxy-terminalen Alkohol bezeichnet; R⁵ nicht vorhanden ist oder Gly, (D)- oder (L)-Ala, (D)- oder (L)-Phe, Nal und β-Asp(Ind) ist; R⁶ und R¹¹ unabhängig Gly oder (D)- oder (L)-Phe sind; R⁷ Phe oder Tyr ist; R¹⁰ nicht vorhanden ist oder Gly, Abu, Thr oder Val ist; R¹² nicht vorhanden ist oder Val, Thr oder Nal ist, und Y² ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Amid, Thioether, Thioester und Disulfid. Diese allgemeinen Formeln sind jedoch nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst. Bei diesen monocyclischen Somatostatin-Analoga ersetzt eine Gerüstcyclisierung die Cys⁶-Cys¹¹-Disulfidbrücke, wobei die Phenylalanin-Seitenketten ebenso wie in natürlichem Somatostatin bleiben.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist:
(d.h. Cyclo[NPhe-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-NPhe]-Thr-X: genannt PTR 3046).
Das im Folgenden gezeigte Analogon PTR 3040 ist nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst, es wird hier jedoch zu Vergleichszwecken erwähnt (siehe 2):
(d.h. Cyclo[NPhe-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-NPhe]-Val-X: genannt PTR 3040),
worin X eine Carboxy-terminale Säure, ein Carboxy-terminales Amid, einen Carboxy-terminalen Ester oder einen Carboxy-terminalen Alkohol bedeutet, sowohl für PTR 3046 als auch für PTR 3040. Für diese beiden Analoga wurde gezeigt, dass sie aufgrund ihrer Selektivität gegenüber bestimmten Somatostatin-Rezeptoruntertypen unerwartete nützliche Eigenschaften besitzen.
Die erfindungsgemäßen monocyclischen Somatostatin-Analoga können auch in Form von Bibliotheken aktiver Analoga hergestellt werden, die besonders nützlich zum Screening nach den optimalen Konformeren sind.
Die vorliegende Beschreibung offenbart ein Verfahren zur Herstellung cyclischer Peptide der allgemeinen Formel
worin a-c jeweils unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 8 oder 0 bezeichnen; (AA) einen Aminosäurerest bezeichnet, worin die Aminosäurereste in jeder Kette gleich oder unterschiedlich sein können; Q H oder eine Acylgruppe bedeutet; E eine Hydroxylgruppe, eine Carboxylschutzgruppe oder eine Aminogruppe bedeutet oder die terminale Carboxylgruppe zu CH₂-OH reduziert sein kann; R¹ bis R⁴ jeweils eine Aminosäureseitenkette bezeichnen, die ggf. mit einer spezifischen Schutzgruppe verbunden ist, und die Linien bezeichnen eine verbrückende Gruppe der Formel: -X-M-Y-W-Z-; (i) oder -X-M-Z-, (ii)worin M und W unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Amid, Thioether, Thioester und Disulfid; und X, Y und Z jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkylen, substituiertem Alkylen, Arylen, Homo- oder Heterocycloalkylen und substituiertem Cycloalkylen.
Verbindungen der allgemeinen Formel I umfassen die erfindungsgemäßen Somatostatin-Analoga. Obwohl also die allgemeine Formel I nicht Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, wird in dieser Beschreibung ein allgemeines Verfahren zur Synthese von Verbindungen, die unter diese Formel fallen, offenbart.
Dieses Verfahren umfasst die Schritte des Einfügens wenigstens eines N^α-ω-funktionalisierten Derivats von Aminosäuren der Formel (III):
worin X eine Spacergruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkylen, substituiertem Alkylen, Arylen, Cycloalkylen und substituiertem Cycloalkylen; R¹ eine Aminosäureseitenkette ist, ggf. verbunden mit einer spezifischen Schutzgruppe; B eine Schutzgruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkoxy-, substituierten Alkoxy- oder Arylcarbonylen; und G eine funktionelle Gruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminen, Thiolen, Alkoholen, Carbonsäuren und Estern, Aldehyden, Alkoholen und Alkylhalogeniden; und A eine spezifische Schutzgruppe für G ist; in eine Peptidsequenz und die anschließende selektive Cyclisierung der funktionellen Gruppe mit einem anderen ω-funktionalisierten Aminosäurederivat.
Weiter bevorzugt sind ω-funktionalisierte Aminosäurederivate, worin R mit einer spezifischen Schutzgruppe geschützt ist.
Weiter bevorzugt sind ω-funktionalisierte Aminosäurederivate der Formel III, worin G eine Aminogruppe, eine Carboxylgruppe oder eine Thiolgruppe ist:
worin X, R, A und B wie oben definiert sind.
Die vorliegende Beschreibung offenbart ferner Verfahren zur Herstellung neuer Somatostatin-Analoga mit cyclischem Gerüst, umfassend die Schritte des Einfügens wenigstens eines N^α-ω-funktionalisierten Derivats einer Aminosäure in eine Peptidsequenz und anschließendes selektives Cyclisieren der funktionellen Gruppe mit einem anderen ω-funktionalisierten Aminosäurederivat. Erfindungsgemäße Analoga mit cyclisiertem Gerüst können als pharmazeutische Zusammensetzungen und zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Erkrankungen einschließlich postchirurgischen Schmerzes, aller Arten von Entzündungen, insbesondere Pankreatitis, Krebs, endokrinen Störungen und Magen-Darm-Störungen verwendet werden.
Die pharmakologisch wirksamen Peptidanaloga mit cyclisiertem Gerüst, die gemäß der hier offenbarten Verfahren hergestellt werden, können zur Behandlung endokriner Erkrankungen, Neoplasmen und Stoffwechselstörungen nützlich sein.
1 ist ein Diagramm, welches die Hemmung der Somatostatin (SRIF-14)-Bindung an die verschiedenen SSTR-Untertypen als Funktion der Konzentration des Somatostatin-Analogons PTR 3046 mit cyclischem Gerüst zeigt.
2 ist ein Diagramm, welches die Hemmung der Somatostatin (SRIF-14)-Bindung an die Somatostatin-Rezeptoren der Maus-Hypophysen-AtT20-Zelllinie als Funktion der Konzentration der Somatostatin-Analoga PTR 3046 und PTR 3040 mit cyclischem Gerüst zeigt.
3 ist ein graphischer Vergleich der Wirkungen von Octreotid und dem Somatostatin-Analogon PTR 3046 mit cyclischem Gerüst auf die Wachstumshormon-Freisetzung in Ratten.
4 ist ein graphischer Vergleich der Wirkungen von Octreotid und dem Somatostatin-Analogon PTR 3046 mit cyclischem Gerüst auf die Insulinfreisetzung in Ratten.
5 ist ein graphischer Vergleich der Wirkungen von Octreotid und dem Somatostatin-Analogon PTR 3046 mit cyclischem Gerüst auf die pankreatische endokrine Freisetzung nach Bombesin-Induktion.
6 ist ein graphischer Vergleich der antiproliferativen Wirkungen von PTR 3046 und Octreotid auf MiaPaca-2-Zellen.
Die hierin beschriebenen Verbindungen können asymmetrische Zentren aufweisen. Alle chiralen, diastereomeren und racemischen Formen sind in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Viele geometrische Isomere von Olefinen oder dergleichen können ebenfalls in den hierin beschriebenen Verbindungen vorhanden sein und alle solchen stabilen Isomere sind von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Unter „stabile Verbindung" oder „stabile Struktur" wird hier eine Verbindung verstanden, die ausreichend widerstandsfähig ist, um die Isolierung zu einem nützlichen Reinheitsgrad aus einem Reaktionsgemisch und die Formulierung zu einem wirksamen therapeutischen Mittel zu überleben.
Wie hierin und in den Ansprüchen verwendet, soll „Alkyl" oder „Alkylenyl" sowohl verzweigte als auch geradkettige gesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen einschließen; „Alkenyl" soll Kohlenwasserstoffketten mit entweder gerader oder verzweigter Konfiguration mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen und einer oder mehreren ungesättigten Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen einschließen, die an einem beliebigen stabilen Punkt entlang der Kette auftreten können wie etwa Ethenyl, Propenyl und dergleichen; und „Alkinyl" soll Kohlenwasserstoffketten mit entweder gerader oder verzweigter Konfiguration mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen und einer oder mehreren Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindungen bedeuten, die an einer beliebigen stabilen Stelle entlang der Kette auftreten können, wie etwa Ethinyl, Propinyl und dergleichen.
Wie hierin und in den Ansprüchen verwendet, soll „Aryl" einen beliebigen stabilen 5- bis 7-gliedrigen monocyclischen oder bicyclischen oder 7- bis 14-gliedrigen bicyclischen oder tricyclischen Kohlenstoffring bedeuten, die jeweils nach Belieben gesättigt, teilweise ungesättigt oder aromatisch sein können, beispielsweise Phenyl, Naphthyl, Indanyl oder Tetrahydronaphthyltetralin, etc.
Wie hierin und in den Ansprüchen verwendet, soll „Alkylhalogenid" sowohl verzweigte als auch geradkettige gesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen einschließen, worin 1 bis 3 Wasserstoffatome durch ein Halogenatom wie etwa Cl, F, Br und I ersetzt sein können.
Wie hierin und in den Ansprüchen verwendet, bedeutet die Formulierung „therapeutisch wirksame Menge", diejenige Menge des neuen Peptidanalogons mit cyclisiertem Gerüst oder der Zusammensetzung, welche dieses umfasst, die einem Wirt verabreicht wird, um die gewünschten Ergebnisse für die hierin beschriebenen Indikationen zu erzielen, wie etwa, aber nicht begrenzt auf Entzündung, Krebs, endokrine Störungen und Magen-Darm-Störungen.
Der Begriff „substituiert" bedeutet wie hierin und in den Ansprüchen verwendet, dass eines oder mehrere beliebige Wasserstoffatome an dem bestimmten Atom durch eine Auswahl aus der angegebenen Gruppe ersetzt sind, unter der Maßgabe, dass die normale Valenz des bezeichneten Atoms nicht überschritten wird und dass die Substitution zu einer stabilen Verbindung führt.
Wenn eine beliebige Variable (z.B. R, X, Z, etc.) mehr als einmal in einem beliebigen Bestandteil oder in einer beliebigen Formel hier auftritt, so ist ihre Bedeutung bei jedem Auftreten unabhängig von ihrer Bedeutung bei jedem anderen Auftreten. Außerdem sind Kombinationen von Substituenten und/oder Variablen nur erlaubt, wenn solche Kombinationen zu einer stabilen Verbindung führen.
Wie hierin verwendet, bezeichnet „Peptid" eine durch Peptidbindungen verknüpfte Sequenz von Aminosäuren. Die erfindungsgemäßen Somatostatin-Peptidanaloga umfassen eine Sequenz von Aminosäuren mit 4 bis 24 Aminosäureresten, vorzugsweise 6 bis 14 Resten, wobei jeder Rest dadurch gekennzeichnet ist, dass er ein Amino- und ein Carboxyende aufweist.
Eine „Baueinheit" bezeichnet eine N^α-derivatisierte α-Aminosäure der allgemeinen Formel IV:
worin X eine Spacergruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkylen, substituiertem Alkylen, Arylen, Cycloalkylen und substituiertem Cycloalkylen; R' eine Aminosäureseitenkette ist, die ggf. mit einer spezifischen Schutzgruppe verbunden ist, und G eine funktionelle Gruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminen, Thiolen, Alkoholen, Carbonsäuren und Estern und Alkylhalogeniden; welche in die Peptidsequenz eingefügt und anschließend selektiv über die funktionelle Gruppe G mit einem anderen ω-funktionalisierten Aminosäurederivat cyclisiert wird.
Die Methodik zur Herstellung der Baueinheiten ist in der internationalen Patentanmeldung PCT/IB95/00455 beschrieben, die hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit inbegriffen ist. Die Baueinheiten werden durch den Dreibuchstabencode der entsprechenden modifizierten Aminosäure, gefolgt von der Art der reaktiven Gruppe (N für Amin, C für Carboxyl) und eine Angabe der Anzahl der beabstandenden Methylengruppen abgekürzt. Beispielsweise beschreibt Gly-C2 einen modifizierten Gly-Rest mit einer Carboxyl-reaktiven Gruppe und einem Zwei-Kohlenstoff-Methylenspacer, und Phe-N3 bezeichnet eine modifizierte Phenylalaningruppe mit einer Amino-reaktiven Gruppe und einem Drei-Kohlenstoff-Methylenspacer.
Wie hierin verwendet, bezeichnet „lineares Peptid" die Peptidsequenz, die nur aus Aminosäureresten zusammengesetzt ist und keinerlei Baueinheiten enthält.
Wie hierin verwendet, bedeutet „Peptid mit cyclischem Gerüst" ein Analogon eines linearen Peptids, das wenigstens eine Baueinheit enthält, die unter Bildung einer Brücke über den Alpha-Stickstoff des Peptidgerüsts mit einer anderen Baueinheit verknüpft wurde. Wie hierin verwendet, bezeichnet „präcyclisches Peptid" ein zu dem cyclischen Analogon identisches Analogon, außer dass es in der nicht cyclisierten Form verbleibt, um als Kontrolle bei den biologischen Assays oder anderen Screening-Assays zu dienen. Der Begriff nicht cyclisch kann austauschbar mit dem Begriff präcyclisch verwendet werden. Bestimmte Abkürzungen werden hierin verwendet, um diese Erfindung und die Art und Weise ihrer Herstellung und Verwendung zu beschreiben. Beispielsweise bezieht sich AcOH auf Essigsäure, Ada bezieht sich auf Adamantylacetyl, Adac bezieht sich auf Adamantancarbonyl, Alloc bezieht sich auf Allyloxycarbonyl, Boc bezieht sich auf den t-Butyloxycarbonylrest, BOP bezieht sich auf Benzotriazol-1-yloxy-tris-(dimethylamino)phosphonium-hexafluorphosphat, BSA bezieht sich auf Rinderserumalbumin, Cbz bezieht sich auf den Carbobenzyloxyrest, DCC bezieht sich auf Dicyclohexylcarbodiimid, DCM bezieht sich auf Dichlormethan, Dde bezieht sich auf 1-(4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-yliden-ethyl), DIEA bezieht sich auf Diisopropylethylamin, DMF bezieht sich auf Dimethylformamid, DPPA bezieht sich auf Diphenylphosphorylazid, Dtc bezieht sich auf 5,5-Dimethylthiazolidin-4-carbonsäure, EDC bezieht sich auf N-Ethyl-N'(dimethylaminopropyl)-carbodiimid, EDT bezieht sich auf Ethandithiol, Fmoc bezieht sich auf den Fluorenylmethoxycarbonylrest, GPI bezieht sich auf Meerschweinchen-Ileum, HATU bezieht sich auf [O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat, HBTU bezieht sich auf 1-Hydroxybenztriazolyltetramethyl-uroniumhexafluorphosphat, HF bezieht sich auf Fluorwasserstoffsäure, HOBT bezieht sich auf 1-Hydroxybenzotriazol, HPLC bezieht sich auf Hochdruckflüssigchromatographie, MALDI-TOF MS bezieht sich auf Matrix-unterstützte Laserdesorption-Flugzeit Massenspektrometrie, Mts bezieht sich auf das 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzensulfonyl, NBT bezieht sich auf Nitroblau-Tetrazolium, NMM bezieht sich auf N-Methylmorpholin, NMP bezieht sich auf 1-Methyl-2-pyrolidonon, PBS bezieht sich auf Phosphat-gepufferte Saline, Pmc bezieht sich auf Pentamethylchroman-6-sulfonyl, PNPP bezieht sich auf p-Nitrophenylphosphat, PPA bezieht sich auf 1-Propanphosphorsäure-cyclisches Anhydrid, PyBOP bezieht sich auf Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium-hexafluorphosphat, PyBrOP bezieht sich auf Brom-tris-pyrrolidinphosphonium-hexafluorphosphat, RT bezieht sich auf Raumtemperatur, SMPS bezieht sich auf simultane mehrfache Peptidsynthese, SRIF bezieht sich auf Somatotropinfreisetzungs-hemmenden Faktor, TBTU bezieht sich auf 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-tetrafluororat, t-Bu bezieht sich auf den tertiären Butylrest, TFA bezieht sich auf Trifluoressigsäure, TIS bezieht sich auf Triisopropylsilan, Tpr bezieht sich auf Thiazolidin-4-carbonsäure, Trt bezieht sich auf Trityl, Ts bezieht sich auf Toluolsulfonyl.
Die in dieser Erfindung verwendeten Aminosäuren sind solche, die kommerziell erhältlich sind oder die über synthetische Standardverfahren erhältlich sind. Bestimmte Reste können spezielle Verfahren zur Einfügung in das Peptid erfordern, und sowohl sequenzielle, divergente und konvergente Syntheseansätze für die Peptidsequenz sind in dieser Erfindung nützlich. Natürlich codierte Aminosäuren und deren Derivate werden durch den Dreibuchstabencode gemäß IUPAC- Konvention dargestellt. Wenn keine Angabe gemacht ist, so wird das L-Isomer verwendet. Die D-Isomere werden mit „D" vor der Abkürzung für den Rest bezeichnet. Die Aufzählung nicht codierter Aminosäuren: Abu bezieht sich 2-Aminobuttersäure, Aib bezieht sich auf 2-Aminoisobuttersäure, Cha bezieht sich auf Cyclohexylalanin, Hcys bezieht sich auf Homocystein, Hyp bezieht sich auf S-trans-4-hydroxyprolin, 1Nal bezieht sich auf 1-Naphthylalanin, 2Nal bezieht sich auf 2-Naphthylalanin, Nva bezieht sich auf Norvalin, Oic bezieht sich auf Octahydroindolcarbonsäure, Phg bezieht sich auf Phenylglycin, pClPhe bezieht sich auf p-Chlorphenylalanin, pFPhe bezieht sich auf p-Fluorphenylalanin, pNO₂Phe bezieht sich auf p-Nitrophenylalanin, Thi bezieht sich auf Thienylalanin.
Syntheseansätze
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Peptidanaloga über verbrückende Gruppen, die an die Alpha-Stickstoffe von Aminosäuren angebunden sind, die neue nicht peptidische Verknüpfungen erlauben, cyclisiert. Im Allgemeinen beruhen die für die Erzeugung solcher Peptidanaloga aus ihren Baueinheiten verwendeten Verfahren auf den bekannten Prinzipien der Peptidynthese; am günstigsten können die Verfahren gemäß der bekannten Prinzipien der Festphasenpeptidsynthese durchgeführt werden. Die Erfindung erfordert einen Austausch von zwei der Aminosäuren in der Peptidsequenz durch neue Baueinheiten der allgemeinen Formel:
worin R die Seitenkette einer Aminosäure ist, X eine Spacergruppe ist und G die funktionelle Endgruppe ist, durch die eine Cyclisierung bewirkt wird. Die Seitenkette R ist die Seitenkette einer beliebigen natürlichen oder synthetischen Aminosäure, die für die Aufnahme in die Peptidsequenz der Wahl ausgewählt ist. X ist eine Spacergruppe, die ausgewählt ist, um ein größeres oder kleineres Maß an Flexibilität bereitzustellen, um die entsprechenden konformatorischen Spannungen des Peptidanalogons zu erzielen. Solche Spacergruppen beinhalten Alkylenketten, substituierte, verzweigte und ungesättigte Alkylene, Arylene, Cycloalkylene und ungesättigte und substituierte Cycloalkylene. Außerdem können X und R unter Bildung einer heterocyclischen Struktur kombiniert werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet Alkylenketten, die 2 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten.
Die für die Cyclisierung des Peptidanalogons zu verwendenden terminalen (ω) funktionellen Gruppen umfassen, sind aber nicht begrenzt auf:

a. Amine, zur Umsetzung mit Elektrophilen wie etwa aktivierten Carbonsäuregruppen, Aldehyden und Ketonen (mit oder ohne anschließende Reduktion) und Alkyl- oder substituierten Alkylhalogeniden.
b. Alkohole, zur Umsetzung mit Elektrophilen wie etwa aktivierten Carbonsäuregruppen.
c. Thiole, zur Bildung von Disulfidbindungen und Umsetzung mit Elektrophilen wie etwa aktivierten Carbonsäuregruppen und Alkyl- oder substituierten Alkylhalogeniden.
d. 1,2- und 1,3-Diole, zur Bildung von Acetalen und Ketalen.
e. Alkine oder substituierte Alkine zur Umsetzung mit Nukleophilen wie etwa Aminen, Thiolen oder Carbanionen; freien Radikalen; Elektrophilen wie etwa Aldehyden und Ketonen und Alkyl- oder substituierten Alkylhalogeniden oder organometallischen Komplexen.
f. Carbonsäuren und Ester, zur Umsetzung mit Nukleophilen (mit oder ohne zuvorige Aktivierung (wie etwa Amine, Alkohole und Thiole).
g. Alkyl- oder substituierte Alkylhalogenide oder Ester, zur Umsetzung mit Nukleophilen wie etwa Aminen, Alkoholen, Thiolen und Carbanionen (von reaktiven Methylengruppen wie etwa Acetacetaten oder Malonaten); und Bildung von freien Radikalen für die anschließende Umsetzung mit Alkenen oder substituierten Alkenen und Alkinen oder substituierten Alkinen.
h. Alkyl oder Arylaldehyde und Ketone, zur Umsetzung mit Nukleophilen wie etwa Aminen (mit oder ohne anschließende Reduktion), Carbanionen (von aktiven Methylengruppen wie etwa Acetacetate oder Malonate), Diolen (zur Bildung von Acetalen und Ketalen).
i. Alkene oder substituierte Alkene, zur Umsetzung mit Nukleophilen wie etwa Aminen, Thiolen, Carbanionen, freien Radikalen oder organometallischen Komplexen.
j. Aktive Methylengruppen wie etwa Malonatester, Acetacetatester oder andere, zur Umsetzung mit Elektrophilen wie etwa Aldehyden und Ketonen, Alkyl- oder substituierten Alkylhalogeniden.

Es versteht sich, dass diese reaktiven Endgruppen sowie jegliche reaktive Seitenketten während der Synthese des Peptids durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden müssen.
Geeignete Schutzgruppen für Amine sind Alkyloxy-, substituierte Alkyloxy- und Aryloxycarbonyle einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf tert-Butyloxycarbonyl (Boc), Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), Allyloxycarbonyl (Alloc) und Benzyloxycarbonyl (Z).
Carbonsäureendgruppen für Cyclisierungen können in Form ihrer Alkylester oder substituierten Alkylester oder Thioester oder Arylester oder ihrer substituierten Arylester oder Thioester geschützt werden. Beispiele beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf tertiäre Butylester, Allylester, Benzylester, 2-(Trimethylsilyl)ethylester und 9-Methylfluorenyl.
Thiolgruppen für Cyclisierungen können in Form ihrer Alkylether oder substituierter Alkylthioether oder Disulfide oder Arylthioether oder substituierter Arylthioether oder Disulfide geschützt werden. Beispiele für solche Gruppen beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf tertiäres Butyl, Trityl (Triphenylmethyl), Benzyl, 2-(Trimethylsilyl)ethyl, Pixyl(9-phenylxanthen-9-yl), Acetamidomethyl, Carboxymethyl, 2-Thio-4-nitropyridyl.
Außerdem erkennt der Fachmann, dass die verschiedenen reaktiven Gruppen durch unterschiedliche Schutzgruppen geschützt werden können, um ihre selektive Entfernung zu ermöglichen. So wird eine bestimmte Aminosäure an ihren Nachbarn in der Peptidsequenz gekoppelt, während das N^α geschützt ist, beispielsweise durch Schutzgruppe A. Wenn ein Amin als Endgruppe für die Cyclisierung verwendet werden soll, so wird das N^α in dem Reaktionsschema durch eine Schutzgruppe B geschützt oder eine e-Aminogruppe eines beliebigen Lysins in der Sequenz wird durch eine Schutzgruppe C geschützt, und so weiter.
Die Kopplung der Aminosäuren aneinander wird in Form einer Reihe von Reaktionen auf im Fachbereich der Peptidsynthese bekannte Weise durchgeführt. Neue erfindungsgemäße Baueinheiten, nämlich die N^α-ω-funktionalisierten Aminosäurederivate, werden in die Peptidsequenz eingefügt, um mehrere der Aminosäuren zu ersetzen.
Die erfindungsgemäßen Analoga beinhalten zwei solcher N^α-ω-funktionalisierter Aminosäurederivate, die miteinander unter Bildung von cyclischen N-Gerüst an N-Gerüst Peptidanaloga verknüpft sein können.
Wie oben angegeben, beruhen die für die Erzeugung von erfindungsgemäßen Somatostatin-Analoga verwendeten Verfahren mit neuen Baueinheiten im Allgemeinen auf bekannten Prinzipien der Peptidsynthese. Es versteht sich jedoch, dass möglicherweise eine Anpassung der Verfahren an die sperrigeren Baueinheiten der vorliegenden Erfindung erforderlich ist. Eine Kopplung der Aminosäuren durch Festphasenpeptidchemie kann mittels eines Kopplungsmittels wie etwa, aber nicht eingeschränkt auf Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)-phosphinsäurechlorid (BOP-Cl), Benzotriazolyl-N-oxytrisdimethylamino-phosphoniumhexafluorphosphat (BOP), 1-Oxo-1-chlorphospholan (Cpt-Cl), Hydroxybenzotriazol (HOBT), oder Gemischen davon erzielt werden.
Es wurde nun gefunden, dass die Kopplung der anschließenden Aminosäure an die sperrigen Baueinheiten der vorliegenden Erfindung die Verwendung zusätzlicher Kopplungsmittel einschließlich, aber nicht beschränkt auf Kopplungsmittel wie etwa PYBOP^® (Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidin-phosphonium-hexafluorphosphat), PyBrOP^® (Brom-tris-pyrrolidinphosphonium-hexafluorphosphat), HBTU (2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorphosphat), TBTU (2-(1H- Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat) erforderlich machen kann.
Neue Kopplungschemikalien können verwendet werden, wie etwa vorgeformte Urethan-geschützte N-Carboxyanhydride (UNCA'S) und vorgeformte Acylhalogenide, am meisten bevorzugt Acylchloride. Eine solche Kopplung kann bei Raumtemperatur und auch bei erhöhter Temperatur in Lösungsmitteln wie etwa Toluol, DCM (Dichlormethan), DMF (Dimethylformamid), DMA (Dimethylacetamid), NMP (N-Methylpyrrolidinon) oder Gemischen der obigen stattfinden.
Die vorliegende Beschreibung offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Somatostatin-Analoga mit cyclisiertem Gerüst der allgemeinen Formel (I), wobei Formel (I) nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst ist, welche die vorliegenden Analoga umfasst:
worin die Substituenten wie vorstehend definiert sind;
wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (i) Einfügen von wenigstens zwei N^α-ω-funktionalisierten Derivaten von Aminosäuren der Formel (III):
worin X eine Spacergruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkylen, substituiertem Alkylen, Arylen, Cycloalkylen und substituiertem Cycloalkylen; R' eine Aminosäureseitenkette wie etwa H, CH₂, etc. ist, ggf. verbunden mit einer spezifischen Schutzgruppe; B eine Schutzgruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyloxy-, substituierten Alkyloxy- oder Aryloxycarbonylen, und G eine funktionelle Gruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminen, Thiolen, Alkoholen, Carbonsäuren und Estern, Aldehyden, Alkoholen und Alkylhalogeniden; A eine spezifische Schutzgruppe für G ist;
in eine Aminosäuresequenz, um eine Verbindung der Formel:
zu erhalten;
(ii) selektives Entfernen der Schutzgruppen A und A' und Umsetzen der Gruppen G und G', um eine Verbindung der Formel:
zu bilden, worin d, e und f unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 10 sind; (AA) ein Aminosäurerest ist, wobei die Aminosäurereste in jeder Kette gleich oder unterschiedlich sein können; E eine Hydroxygruppe, eine Carbonsäureschutzgruppe oder eine Aminogruppe ist; R und R' unabhängig eine Aminosäureseitenkette wie etwa H, CH₃, etc. sind, und die Linie eine verbrückende Gruppe der Formel: -X-M-Y-W-Z- bedeutet,
worin M und W unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Disulfid, Amid, Thioether, Imin, Ether, und Alken; X, Y und Z unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkylen, substituiertem Alkylen, Arylen, Cycloalkylen und substituiertem Cycloalkylen;
(iii) Entfernen aller verbleibenden Schutzgruppen, um eine Verbindung der Formel (Ia) zu erhalten.
Bicyclische Analoga werden auf dieselbe Weise hergestellt, d.h. durch Wiederholen der Schritte (ii) und (iii). Die Bestimmung, welche Reste mit anderen Resten cyclisiert werden, erfolgt über die Wahl der Blockierungsgruppen. Die verschiedenen Blockierungsgruppen können selektiv entfernt werden, sodass die gewählten reaktiven Gruppen für die Cyclisierung freigelegt werden.
Bevorzugt sind Verfahren zur Herstellung von Peptidanaloga mit cyclisiertem Gerüst zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung, bei denen G eine Amin-, Thiol- oder Carbonsäuregruppe ist; R und R' Benzyl sind und worin E kovalent an einen unlöslichen polymeren Träger gebunden ist.
Syntheseansatz zur Erzeugung von Bibliotheken von Somatostatin mit cyclisiertem Gerüst.
Die allgemeine Methodik zur Herstellung von Bibliotheken cyclischer Peptide schließt die Festphasenpeptidsynthese unter Verwendung eines orthogonalen Schutzschemas ein, welches die Kettenverlängerung, selektive Entfernung der Schutzgruppen, Cyclisierung der geschützten Peptide und Entfernung aller Seitenketten-schützenden Gruppen mit oder ohne Abspaltung von dem Harz ermöglicht. Es ist wünschenswert, dass die verschiedenen Peptidsequenzen in den Bibliotheken in im Wesentlichen gleicher Menge vorhanden sind. Dieses hier beschriebene Herstellungsverfahren für cyclische Peptidbibliotheken wird beibehalten, da es die Herstellung von erfindungsgemäßen Analoga veranschaulicht, ohne dass solche Bibliotheken und Verfahren zu ihrer Herstellung von der vorliegenden Erfindung umfasst sind.
Die Kopplungsreaktionen werden durch Verfahren zur Erzeugung von Amid- oder Esterbindungen und vorzugsweise durch im Fachbereich vertraute Verfahren wie hierin beschrieben durchgeführt. Typische Kopplungsreagenzien sind Carbodiimide, aktivierte Anhydride und Ester und Acylhalogenide. Reagenzien wie etwa EDC, DCC, DPPA, PPA, BOP, PyBOP, PyBrop, HATU, HBTU, TBTU, HOBT und N-Hydroxysuccinimid sind typisch dafür.
Nach Beendigung der Festphasen-Peptidverlängerung werden über ein beliebiges Schema Abschnitte des Peptids durch die an den Aminbindungsstickstoffen des Gerüstes der Baueinheiten angebunden verbrückenden Gruppen cyclisiert. Es ist bevorzugt, dass ein Abschnitt in der nicht cyclisierten Form belassen wird, damit dieser während der biologischen Assays oder anderen Screening-Assays als Kontrolle dient. Dieser Teil der Bibliothek von Peptidanaloga, der die Baueinheiten, die identisch zu denen der Bibliothek mit cyclisiertem Gerüst sind, aber deren konformatorische Spannung nicht aufweisen, enthalten, wird als „präcyclisch" bezeichnet. Alternativ kann in beliebigen der Syntheseschemata der Schritt der Gerüstcyclisierung durchgeführt werden und im Anschluss können dann zusätzliche Kopplungszyklen von Aminosäureresten durchgeführt werden.
Je nach Bedarf können vor dem Test der biologischen Aktivität Teile des Peptids vom Harz abgespalten werden und Schutzgruppen können entfernt werden. Die Peptide werden von dem Harzträger durch im Fachbereich bekannte Verfahren abgespalten, wobei das genaue Verfahren von den Eigenschaften des Harzes abhängen kann. Für einen Fachmann ist verständlich, dass die Entfernung bestimmter Schutzgruppen gleichzeitig mit der Abspaltung des Peptids von dem Harz erfolgen kann.
Typischerweise bildet die Kopplung zwischen dem Harz und der ersten Aminosäure eine Esterbindung, was zu einer Carbonsäuregruppe an dem Peptid führt, wenn es von dem Harz abgespalten wird. Beispiele dafür sind HMPB, Rink, PAM, Hycram und Hydroxymethylharze. Außerdem kann die Carboxy-terminale Aminosäuregruppe in ein Amid, einen Ester umgewandelt oder zu einem terminalen Alkohol reduziert werden.
Die reaktiven funktionellen Gruppen der Seitenketten jeder Aminosäure oder jedes Peptids sind auf geeignete Weise geschützt, wie im Peptidbereich bekannt. Beispielsweise kann die Boc-, Cbz- oder Fmoc-Gruppe für den Schutz einer Aminogruppe verwendet werden, insbesondere bei einer α-Aminogruppe. Ein Alkyl- (z.B. t-Bu, Me), cHex-, Benzyl- oder Allylester kann zum Schutz der Seitenkettencarboxyle von Asp oder Glu verwendet werden. Eine Benzyl- oder geeignet substituierte Benzyl-, Trityl-, Alloc- oder t-Bu-Gruppe wird verwendet, um die Mercaptogruppe von Cystein oder andere Thiol enthaltende Reste oder die Hydroxylgruppe von Tyr, Ser oder Thr zu schützen. Cys und andere Schwefel enthaltende Aminosäuren können auch über die Acm-Gruppe oder durch Bildung eines Disulfids mit einem Thioalkyl (z.B. Ethylmercaptan) oder einer Thioarylgruppe geschützt werden. Die Benzyl-/Benzyloxymethyl-Gruppe oder eine geeignet substituierte Benzyl-/Benzyloxymethyl-, Boc- oder Formyl-Gruppe kann für den Schutz der Imidazolylgruppe von His verwendet werden und die Pmc-, Nitro- oder eine geeignet substituierte Benzolsulfonyl-Gruppe (z.B. Ts, Mts) kann zum Schutz des Guanidino-Stickstoffs von Arg verwendet werden. Die Phthalamido-, Boc-, Fmoc-, Alloc-Carbobenzyloxy- oder Benzyl-Gruppe oder geeignet substituierte Benzyl- oder Benzyloxygruppe kann zum Schutz der ε-Aminogruppe von Lysin verwendet werden. Eine geeignete Substitution der Carbobenzyloxy- oder Benzyl-Schutzgruppen ist die Substitution mit einer 1 bis 5 Chlor-, Brom-, Nitro-, Methoxy- oder Methylgruppen, üblicherweise in ortho- und/oder para-Position, und sie wird verwendet, um die Reaktivität der Schutzgruppe zu verändern. Diese Schutzgruppen werden durch Verfahren wie etwa die katalytische Hydrierung, Natrium in flüssigem Ammoniak, Hydrazin, Base, TFA oder HF-Behandlung entfernt, wie im Fachbereich bekannt ist. Die Wahl der Seitenkettenschutzgruppen erfolgt so, dass sie unter den Bedingungen, die verwendet werden, um die reaktive funktionelle Gruppe zu entschützen, die zur Kopplungsreaktion unter Bildung des Peptidgerüsts der Peptidkette verwendet wird, (z.B. im Allgemeinen die α-Aminogruppe) nicht entfernt wird. Die Schutzgruppe der reaktiven funktionellen Gruppe wird vor der Kopplung jeder anschließenden Aminosäure entfernt.
Die verbrückenden Gruppen der Baueinheiten (d.h. G in Formel IV) werden erfindungsgemäß in einem orthogonalen Schutzschema eingesetzt, so dass diese Schutzgruppen selektiv entfernt werden können, unter Bedingungen, welche die Schutzgruppen an den Seitenketten oder die Abspaltung des Peptids von dem Harz nicht beeinträchtigen. Dies ermöglicht eine Gerüstcyclisierung auf dem Harz, die synthetisch bevorzugt ist. Alternativ kann das vollständig geschützte Peptid von dem Harz entfernt werden und die Cyclisierung wird nach selektiver Entfernung der Schutzgruppen der Baueinheiten in Lösung durchgeführt.
Die Cyclisierungsreaktion wird über die selektive Kopplung der verbrückenden Gruppe einer Baueinheit an eine verbrückende Gruppe einer anderen Baueinheit oder Aminosäureseitenkette durchgeführt. Beispielsweise ist PyBOP ein besonders nützliches Reagenz, um die Kopplungsreaktion durchzuführen, wenn eine Amidbindung gebildet wird. Um eine Disulfidbrücke zu bilden, werden oxidative Bedingungen eingesetzt.
In einer erfindungsgemäß am meisten bevorzugten Ausführungsform beruht das Aminosäuresequenzgerüst auf bekannten aktiven Sequenzen natürlicher oder synthetischer Peptide mit Somatostatin-Aktivität. Es ist so möglich, die Aktivität solcher bekannter Sequenzen durch Versteifung des aktiven Konformers weiter zu verbessern.
Aminosäuren in bestimmten Positionen werden durch Gerüstcyclisierungsbaueinheiten oder durch natürliche und nicht natürliche trifunktionale Aminosäuren wie etwa Asp, Glu, Cys, Hcys, Lys, Orn und deren D-Gegenstücke ersetzt. Somit werden Positions- und Strukturabfragen durchgeführt, indem die Position der Cyclisierung, die Verknüpfung des Rings an das Gerüst, die Chiralität an der Position der Cyclisierung, die Ring-bildende Bindung, die Ringgröße und die genaue Platzierung der Bindung innerhalb des Rings verändert werden. Diese Variationen können auch in Verbindung mit der Veränderung der Aminosäuresequenz des Peptids erfolgen.
Allgemeine Synthese von Bibliotheken von Somatostatin-Analoga
Um die optimalen Verbindungen zu bestimmen, wird eine Bibliothek unterschiedlich gespannter Analoga erzeugt und dann durchmustert. Die Bibliotheken werden auf TentaGel-Amidharz (Substitutionsgrad 0,2 bis 0,3 mmol/g) unter Verwendung herkömmlicher Festphasenpeptidsynthese (dem Fachmann bekannt) synthetisiert.
In den meisten Fällen wurde NMP als Lösungsmittel verwendet, in einigen Fällen DMF. Der Synthesemaßstab war 0,2 bis 2 μmol für jedes Peptid der Bibliothek oder Unterbibliothek. Wenn nicht anders angegeben, wurden alle Reaktionen bei Raumtemperatur durchgeführt.
Bei jedem Kopplungsschritt, bei dem mehr als eine Aminosäure gekoppelt werden sollte, wurde das Harz in die entsprechende Zahl von Portionen unterteilt und zu jeder Portion wurde eine andere Aminosäure zugegeben. Die Kopplung wurde zweimal für jede Position mit einem 3-molaren Überschuss jeder Aminosäure, 3-molarem Überschuss an PyBrop und 6-molarem Überschuss an DIEA für eine Dauer von 1-16 h durchgeführt. Alle Aminosäuren wurden mit Fmoc an ihrem α-Amin geschützt. Die Seitenketten wurden wie folgt geschützt: His (Trt); Lys (Boc oder Dde); Orn (Boc); Ser (tBu); Thr (tBu); Tyr (tBu).
Nach zweifacher Kopplung wurden die Harzportionen gewaschen, wieder vereinigt und es wurde ein Fmoc-Entschützen durchgeführt unter Verwendung von 20% Piperidin in NMP für insgesamt 20-40 min. Nach weiterem Waschen wurde das Harz erneut geteilt (falls erforderlich), um die nächste(n) Aminosäure(n) zu koppeln.
Vor der Cyclisierung wurde der Allyl-/Alloc-Schutz des Amins und Carboxyls der Baueinheiten durch Behandlung mit einer Lösung von 2 mol Äquivalenten (eines für jedes Allyl-/Alloc-Molekül im Peptid) an Pd (PPh3)₄ gelöst in Chloroform mit 2,5% AcOH und 5% NMM für 2-2,5 h oder zweimal für 1 h entfernt, die Harze wurden mit dem obigen Lösungsmittel ohne Palladium vor und nach der Behandlung gewaschen, weitere Waschungen mit NMP erfolgten am Ende des Entfernungsprozesses.
Die Peptide wurden von den Harzportionen nach Waschen mit DCM durch zweifache Behandlung mit TFA 70%, H₂O 5%, TIS 1%, EDT 2,5%, DCM (Gemisch A) oder mit TFA 70%, H₂O 5%, TIS 1%, Phenol 5%, DCM (Gemisch B) oder 60% TFA, 10% H₂O und 30% DCM (Gemisch C) und zusätzliches Waschen mit reinem TFA abgespalten. Die drei Abspaltungslösungen jeder Harzportion wurden zusammen gesammelt, unter Stickstoffstrom eingedampft, 0,5 bis 1 ml H₂O wurden zu jeder Probe zugegeben, die anschließend gefriergetrocknet wurde. Die Peptidgemische wurden dann teilweise auf C-18 SEP-PAK (Millipore Corp.) gereinigt, wobei 0,1% Essigsäure oder TFA in H₂O als Puffer A und 50-80% CH₃CN in 0,1% Essigsäure/H₂O als Puffer B verwendet wurde, und gefriergetrocknet.
Jede synthetisierte Unterbibliothek wird durch Massenspektroskopie (MALDI-TOF MS) und Aminosäureanalyse charakterisiert.
Die Baueinheiten werden durch den Dreibuchstabencode der entsprechenden modifizierten Aminosäure, gefolgt von der Art der reaktiven Gruppe (N für Amin, C für Carboxyl) und eine Angabe der Anzahl der beabstandenden Methylengruppen abgekürzt. Beispielsweise beschreibt Gly-C2 einen modifizierten Gly-Rest mit einer Carboxy-reaktiven Gruppe und 2 Kohlenstoffmethylen-Spacern, und Phe-N3 bezeichnet eine modifizierte Phenylalaningruppe mit einer Amino-reaktiven Gruppe und 3 Kohlenstoffmethylen-Spacern.
Allgemeines Screening von Somatostatin-Analoga
Die synthetisierten Somatostatin-Analoga werden typischerweise in vitro auf ihre Hemmung der natürlichen Peptid (SRIF-14)-Bindung an dessen 7-transmembrane Rezeptoren und auf ihren Einfluss auf zweite Boten und Zellwachstum untersucht, und in vivo auf die Hemmung von Hormonen und Enzymsekretion untersucht.
Die Analoga werden weiter in vitro auf ihren Einfluss auf die Werte von cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP), Thyrosinphosphataseaktivität, Wachstumshormonsekretion und Zellwachstum untersucht. Die Bibliotheken werden weiter in vivo auf die Hemmung der Wachstumshormon-Freisetzung und Amylase-, Magensäure-, Insulin- und Glucagonsekretion in Tieren untersucht.
Metabolische Stabilitätstests als Parameter für die Selektion:
Die Analoga werden auf die Stabilität untersucht, indem ihre Beständigkeit gegenüber enzymatischem Abbau durch Inkubation in Serum oder in Gewebehomogenat, Auftrennung der Proteine und Aufzeichnung der Peptidpeaks durch HPLC vor und nach der Inkubation bestimmt wird. Die Peptidpeaks, die bei längerer Inkubatinszeit nicht verändert sind, sind am stabilsten. Diese Peaks werden abgetrennt und durch Massenspektrometrie, N-terminale Sequenz und Vergleich mit gereinigten Peptidpeaks charakterisiert. Auf diese Weise werden die stabilsten Peptide der Bibliothek oder Unterbibliothek rasch identifiziert.
Die erzeugten Somatostatin-Analoga mit gespannter Konformation, die teilweise auf den Sequenzen mehrerer bekannter biologisch aktiver Peptide beruhen oder auf zuvor unbekannten neuen Sequenzen beruhen, sind in den nachstehenden Beispielen dargestellt. Die folgenden Beispiele sollen veranschaulichen, wie die erfindungsgemäßen Verbindungen hergestellt und verwendet werden und sind in keiner Weise als Einschränkung zu verstehen.
BEISPIELE
Synthesebeispiele
Es wurden unterschiedliche Reihen von Somatostatin-Analoga synthetisiert, entweder als einzelne Peptide mit cyclisiertem Gerüst oder als Bibliotheken.
Drei Gruppen von Octapeptid-Somatostatin-Analoga entsprechend der allgemeinen Formel (Va) der vorliegenden Erfindung wurden einzeln synthetisiert, charakterisiert und auf ihre biologische Aktivität untersucht. [Diese Analoga sind nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst, werden hier aber erwähnt, da die Beteiligung einiger dieser Analoga in den Beispielen 88 und 90 beispielhaft für vorteilhafte Verhaltensweisen der erfindungsgemäßen Analoga sein kann].

1) Die erste Gruppe von Verbindungen entspricht der allgemeinen Formel (Va), worin R⁵ (D)Phe ist; R⁷ Phe ist; R¹⁰ Thr ist und R¹² Thr ist. Diese Gruppe umfasst daher Verbindungen der speziellen Formel: H-(D) Phe-R⁶-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-R¹¹-Thr-NH₂, worin R⁶ und R¹¹ N^α ω-funktionalisierte Alkylenaminosäure-Baueinheiten sind.
2) Die zweite Gruppe von Verbindungen entspricht der allgemeinen Formel (Va), worin R⁵ (D)Phe ist; R⁷ Phe ist; R¹⁰ nicht vorhanden ist und R¹¹ Thr ist. Diese Gruppe umfasst daher Verbindungen der speziellen Formel H-(D)Phe-R⁶-Phe-(D)Trp-Lys-R¹¹-Thr-NH₂, worin R⁶ und R¹¹ Nα ω-funktionalisierte Alkylenaminosäure-Baueinheiten sind.
3) Die dritte Gruppe von Verbindungen entspricht der allgemeinen Formel (Va), worin R⁵ (D)Phe ist und R⁷ Phe ist. Diese Gruppe umfasst daher Verbindungen der speziellen Formel H-(D)Phe-R⁶-Phe-(D)Trp-Lys-R¹⁰-R¹¹-R¹¹-NH₂, worin R⁶ und R¹¹ N^α ω-funktionalisierte Alkylenaminosäure-Baueinheiten sind.

Die Strukturen dieser neuen synthetischen Peptidanaloga, in die N^α ω-funktionalisierte Aminosäurebaueinheiten aufgenommen wurden, sind in den Tabellen 1, 2 und 3 zusammengefasst. In diesen drei Gruppen waren die verwendeten Baueinheiten Glycin-Baueinheiten, wobei die verbrückenden Gruppen, die über die α-Stickstoffe an das Peptidgerüst angebunden waren, variiert wurden.
Zur Vereinfachung werden diese drei Gruppen hierin als SST Gly⁶, Gly¹¹; SST Gly⁶, Gly¹⁰; bzw. SST Gly⁶ Gly¹¹ R¹⁰ R¹² bezeichnet.
In jeder Gruppe war die Position der Cyclisierungspunkte konstant; bei der ersten und zweiten Gruppe wurden die Länge und Richtung der Brücke variiert, während in der dritten Gruppe die Brücke konstant war und die Reste an den Positionen 10 und 12 variiert wurden. Somit bezieht sich C2, N2 auf eine Brücke, die aus einer Amidbindung besteht, in der die Carbonylgruppe dichter bei dem Aminoende des Peptids liegt und die eine Zwei-Kohlenstoff-Methylengruppe zwischen dem Brückenamid und jedem der an der Brücke beteiligten Gerüststickstoffe enthält.

Die Peptidassemblierung erfolgte entweder manuell oder mit einem automatischen Peptidsynthesizer (Applied Biosystems, Modell 433A). Nach der Peptidassemblierung wurde das Entschützen der verbrückenden Gruppen, welche die Cyclisierungsarme bilden, mit Pd(PPh₃)₄ (Palladiumtetrakistriphenylphosphin) bei Allyl-/Alloc-Schutzgruppen oder mit TFA bei tBu-/Boc-Schutzgruppen durchgeführt. Um das nicht cyklische Analogon zu erhalten, wurden die Peptide von dem Harz in dieser Stufe abgespalten. Die Cyclisierung der Peptide wurde mit PyBOP durchgeführt. Die Abspaltung der Peptide von dem polymeren Träger wurde mit geeigneten Reagenzien je nach Art des Harzes, das verwendet wurde, durchgeführt, z.B. mit TFA für Rink-Amidharze und mit HF für mBHA (Paramethylbenzhydrylamin)-Harze. Die Rohprodukte wurden durch analytische HPLC charakterisiert. Die Peptide wurden durch präparative Reversphasen-HPLC aufgereinigt. Die gereinigten Produkte wurden durch analytische HPLC, Massenspektroskopie und Aminosäureanalyse charakterisiert. Tabelle 1 SST Gly⁶, Gly¹¹-Analoga

Beispiel Nr.	Verbrückende Gruppen	Verbindung Nr.	Verfahren	Rohausbeute
1	C1,N2 cyclisch	DE-3-32-4	1	NA**
2	C1,N2 nicht cyclisch	DE-3-32-2	1	NA
3	Cl,N3 cyclisch	PTR 3004	2	79 mg
4	C1,N3 nicht zuyklisch	PTR 3005	2	34 mg
5	C2,N2 cyclisch	PTR 3002	1	NA
6	C2,N2 nicht cyclisch	PTR 3001	1	NA
7	C2,N3 cyclisch	PTR 3007	2	40 mg
8	C2,N3 nicht cyclisch	PTR 3008	2	40 mg
9	N2,C2 cyclisch	YD-9-166-1	2	NA
10	N2,C2, nicht cyclisch	YD-9-168-1	2	NA
11	N3,C2 cyclisch	PTR 3010	2	100 mg
12	N3,C2 nicht cyclisch	PTR 3011	2	NA
13	linear*	PTR 3003	3	96 mg
* linear bezieht sich auf die identische Sequenz mit nicht-derivatisierten Gly-Resten anstelle von R⁶ und R¹¹. ** NA bedeutet nicht verfügbar.

Verfahren von Tabelle 1:

1) Manuelle Synthese auf mBHA-Harz. HF-Spaltung.
2) Manuelle Synthese auf Rapp TentaGel-Harz. TFA-Spaltung.
3) Rink-Amidharz; Assemblierung in automatisiertem Peptidsynthesizer, 0,1 mmol Maßstab.

Tabelle 2 SST Gly⁶, Gly¹⁰-Analoga

Beispiel Nr.	Verbrückende Gruppen	Verbindung Nr.	Verfahren	Rohausbeute
14	C1,N2 cyclisch	YD-9-171-3	1	20 mg
15	C1,N2 nicht cyclisch	YD-9-171-2	1	10 mg
16	C1,N3 cyclisch	YD-9-175-3	1	44,9 mg
17	C1,N3 nicht cyclisch	YD-9-175-2	1	25,4 mg
18	C2,N2 cyclisch	PTR 3019	1	40 mg
19	C2,N2 nicht cyclisch	PTR 3020	1	26 mg
20	C2,N3 cyclisch	YD-5-28-3	3	101,5 mg
21	C2,N3 nicht cyclisch	YD-5-28-2	3	48,3 mg
22	N2,C2 cyclisch	PTR 3016	2	60 mg
23	N2,C2 nicht cyclisch	PTR 3017	2	40 mg
24	N3,C2 cyclisch	YS-8-153-1	2	93 mg
25	N3,C2 nicht cyclisch	YS-8-152-1	2	54 mg
26	*linear	PTR 3021	1	100 mg
27	N3,C2 cyclisch**	PTR 3013		67 mg
28	N3,C2 nicht cyclisch	PTR 3014		48 mg
* linear bezeichnet die identische Sequenz mit Gly-Resten anstelle von R⁶ und R¹⁰. ** Diese Analoga umfassen dieselbe SST-Sequenz, in der das N-terminale D-Phe⁵ nicht vorhanden ist und der N-Terminus acetyliert ist.

Verfahren von Tabelle 2:

1) Assemblierung in automatisiertem Peptidsynthesizer, 0,1 mmol-Maßstab. (HBTU).
2) Manuelle Synthese; PyBROP.
3) Assemblierung in automatisiertem Peptidsynthesizer, 0,25 mmol-Maßstab. (HBTU).

Tabelle 3 Somatostatin-Analoga auf Basis von: H-(D)Phe-R⁶-Phe-(D)Trp-Lys-R¹⁰-R¹¹-R¹²-NH₂

Beispiel Nr.	Analogon	R¹⁰	R¹²	Ausbeute (mg)
29	GGP-22-65	Nva	Thr	390
30	GGP-22-63	Val	Thr	300
31	GGP-22-61	Abu	Thr	340
32	GGP-22-59	Ser	Thr	350
33	GGP-22-75	Thr	Nal	125
34	GGP-22-81	Val	Nal	210
35	GGP-22-82	Abu	Nal	200
36	GGP-22-77	Ser	Nal	190
37	GGP-22-83	Thr	(D)Nal	68
38	GGP-22-89	Val	(D)Nal	58
39	GGP-22-87	Abu	(D)Nal	65
40	GGP-22-85	Ser	(D)Nal	58

Beispiel 41. Ausführliche Synthese des SST Gly⁶, Gly¹⁰ N3,C2-Analogons
5 g Rink-Amidharz (NOVA) (0,49 mmol/g) wurden in N-Meythylpyrrolidon (NMP) in einem Reaktionsgefäß, das mit einem Sinterglasboden ausgestattet war, gequollen und auf einen Schüttler gegeben. Die Fmoc-Schutzgruppe wurde von dem Harz durch Umsetzung mit 20% Piperidin in NMP (2 × 10 min jeweils 25 ml) entfernt. Die Fmoc-Entfernung wurde durch UV-Absorptionsmessung bei 290 nm überwacht. Ein Kopplungszyklus wurde mit Fmoc-Thr(OtBu)-OH (3 Äquivalente) PyBrop (3 Äquivalente) DIEA (6 Äquivalente) in NMP (20 ml) für 2 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Beendigung der Reaktion wurde durch den qualitativen Ninhydrintest (Kaiser-Test) überwacht. Nach der Kopplung wurde das Peptid-Harz mit NMP 7-mal mit 25 ml NMP, jeweils 2 min) gewaschen. Das Capping erfolgte durch Umsetzung des Peptid-Harzes mit Essigsäureanhydrid (Capping-Gemisch: HOBT 400 mg, NMP 20 ml, Essigsäureanhydrid 10 ml, DIEA 4,4 ml) für 0,5 h bei Raumtemperatur. Nach dem Capping erfolgten wie oben NMP-Waschungen (7-mal; jeweils 2 min). Die Fmoc-Entfernung erfolgte wie oben. Fmoc-Phe-OH wurde auf dieselbe Weise gekoppelt und die Fmoc-Gruppe wurde wie oben entfernt. Das Peptidharz wurde mit Fmoc-Gly-C2 (Allyl)-Baueinheit umgesetzt: Kopplungsbedingungen waren wie oben. Die Fmoc-Entfernung erfolgte wie oben. Fmoc-Lys(Boc)-OH wurde an das Peptidharz durch Umsetzung mit HATU (3 Äquivalente) und DIEA (6 Äquivalente) bei Raumtemperatur über Nacht und dann bei 50°C für 1 h durchgeführt. Weiteres DIEA wurde während der Reaktion zugegeben, um ein basisches Medium beizubehalten (entsprechend der Bestimmung durch pH-Papier bei etwa 9). Diese Kopplung wurde wiederholt. Die Beendigung der Kopplung wurde durch den Fmoc-Test überwacht (eine Probe des Peptidharzes wurde genommen und gewogen, das Fmoc wurde wie oben entfernt und die UV-Absorption wurde gemessen). Fmoc-D-Trp-OH wurde an das Peptidharz mit PyBrop gekoppelt, wie oben beschrieben. Nach Fmoc-Entfernung wurde Fmoc-Phe-OH auf dieselbe Weise gekoppelt. Die Synthese wurde mit einem Fünftel des Peptidharzes fortgesetzt.
Nach Fmoc-Entfernung wurde die zweite Baueinheit eingefügt: Fmoc-Gly-N3(Alloc)-OH, durch Umsetzung mit PyBrOP wie oben beschrieben. Capping erfolgte wie oben beschrieben. Nach Fmoc-Entfernung wurde das Peptid-Harz in zwei gleiche Portionen geteilt. Die Synthese wurde mit einer dieser Portionen fortgesetzt. Boc-D-Phe-OH wurde durch Umsetzung mit HATU gekoppelt, wie oben für Fmoc-Lys(Boc)-OH beschrieben. Capping erfolgte wie oben.
Die Allyl- und Alloc-Schutzgruppen wurden durch Umsetzung mit Pd(PPh₃)₄ und Essigsäure 5%, Morpholin 2,5% in Chloroform unter Argon für 2 h bei Raumtemperatur entfernt. Das Peptidharz wurde wie oben mit NMP gewaschen. Zwei Drittel des Harzes wurden für die Cyclisierung verwendet. Die Cyclisierung wurde mit 3 Äquivalenten PyBOP, 6 Äquivalenten DIEA in NMP bei Raumtemperatur über Nacht durchgeführt. Das Peptidharz wurde gewaschen und getrocknet. Das Peptid wurde von dem Harz durch Umsetzung mit TFA 81,5%, Phenol 5%, Wasser 5%, EDT 2,5%, TIS (Triisopropylsilan) 1% und 5% Methylenchlorid bei 0°C für 15 min und 2 h bei Raumtemperatur unter Argon durchgeführt. Das Gemisch wurde in kalten Ether (30 ml, 0 °C) filtriert und das Harz wurde mit einem kleinen Volumen an TFA gewaschen. Das Filtrat wurde in einen Rotationsverdampfer gegeben und alle flüchtigen Bestandteile wurden entfernt. Ein öliges Produkt wurde erhalten. Es wurde mit Ether trituriert und der Ether wurde dekantiert, 3-mal. Ein weißes Pulver wurde erhalten. Dieses Rohprodukt wurde getrocknet. Das Gewicht des Rohprodukts betrug 93 mg.

Eine weitere Reihe von neuen Somatostatin-Analoga mit cyclisiertem Gerüst gemäß Formel Vb wurde synthetisiert, welche die Heptapeptidgruppe: NPhe-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-NPhe-Thr-NH₂ umfasst; diese Verbindungen liegen im Rahmen der vorliegenden Erfindung. In dieser Gruppe (Tabelle 4) wurde die Länge und Richtung der Brücke variiert. Tabelle 4 Heptapeptid-Somatostatin-Analoga auf Basis von: R⁶-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-R¹¹-Thr-NH₂

Beispiel Nr.	Analogon	R⁶	R¹¹	Ausbeute (mg)
42*	GGP-22-151	Phe-N2	Phe-C3	290
43	GGP-22-135	Phe-N3	Phe-C3	25
44	GGP-22-159a	Phe-N2	Phe-C2	28
45	GGP-22-159b	Phe-N3	Phe-C2	30
46	GGP-22-161a	Phe-C2	Phe-N2	56
47	GGP-22-161b	Phe-C3	Phe-N2	65
48	GGP-22-163a	Phe-C1	Phe-N3	61
49	GGP-22-163b	Phe-C1	Phe-N3	68
50	GGP-22-163c	Phe-C3	Phe-N3	10
*PTR-3046

Beispiel 61. Ausführliche Synthese von PTR 3046
1 g Rink-Amid-MBHA-Harz (NOVA) (0,55 mmol/g) wurde für 1,5 h in NMP in einem Reaktionsgefäß mit gesintertem Glasboden gequollen und auf einen Schüttler gegeben. Die Fmoc-Schutzgruppe wurde von dem Harz durch Umsetzung mit 20% Piperidin in NMP (2-mal 15 min, jeweils 5 ml) entfernt. Die Fmoc-Entfernung wurde über einen Ninhydrintest überwacht. Ein Kopplungszyklus wurde mit Fmoc-Thr (OtBu)-OH (4 Äquivalente) PyBrop (4 Äquivalente) DIEA (12 Äquivalente) in NMP (5 ml) für 0,5 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Beendigung der Reaktion wurde durch den qualitativen Ninhydrintest (Kaiser-Test) überwacht. Nach der Kopplung des Peptidharzes wurde mit NMP gewaschen (3-mal mit 5 ml NMP, 5 ml DCM und 5 ml NMP für 2 min). Capping wurde durch Umsetzung des Peptidharzes mit Essigsäureanhydrid (Capping-Gemisch: HOAt 40 mg, NMP 5 ml, Essigsäureanhydrid 1 ml, DIEA 0,5 ml und DMAP (cat)) für 0,5 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach dem Capping wurden NMP-Waschungen wie oben durchgeführt. Fmoc-Entfernung erfolgte wie oben. Fmoc-Phe(C3)-Allyl BU wurde gekoppelt (BU 2 eq., PyBrop 2 eq. DIEA 6 eq., NMP 5 ml, 0,5 h). Die Fmoc-Entfernung erfolgte wie oben. Das Peptidharz wurde wie oben gewaschen. Das Peptidharz wurde mit Fmoc-Val-Cl umgesetzt (4 eq., Colidin 12 eq., 1 h, 38°C) durch zweifache Kopplung. Die Vollständigkeit der Kopplung wurde über die Umwandlung von Dipeptid zu Tripeptid überwacht (eine Probe des Peptidharzes wurde abgespalten und rohes Tripeptid wurde in HPLC injiziert (0,1% Wasser/Acetonitril). Fmoc-Entfernung erfolgte wie oben. Fmoc-Lys(Boc)-OH wurde an das Peptidharz unter den gleichen Reaktionsbedingungen wie für Fmoc-Thr(OtBu)-OH gekoppelt (siehe oben). Die Vollständigkeit der Kopplung wurde durch den Ninhydrintest überwacht. Fmoc-D-Trp-OH wurde an das Peptidharz mit PyBrop wie oben beschrieben gekoppelt. Nach Fmoc-Entfernung wurde Fmoc-Tyr(tBu)-OH auf dieselbe Weise gekoppelt. Nach Fmoc-Entfernung wurde die zweite Baueinheit eingefügt: Fmoc-Phe-N2(Alloc)-OH durch Umsetzung mit PyBrop, wie für Fmoc-Phe (C3)-Allyl B beschrieben. Die Allyl- und Alloc-Schutzgruppen wurden durch Umsetzung mit Pd(PPh₃)₄ und Essigsäure 5%, N-Methylmorpholin 2,5% in Chloroform unter Argon für 1,5 h bei Raumtemperatur entfernt. Das Peptidharz wurde wie oben gewaschen. Cyclisierung wurde durchgeführt mit 3 Äquivalenten PyBOP, 6 Äquivalenten DIEA, in NMP bei Raumtemperatur für 0,5 h. Das Peptidharz wurde wie oben gewaschen. Nach Fmoc-Entfernung wurde das Peptidharz gewaschen (DCM 3 × 5 ml), getrocknet und von dem Harz abgespalten durch Umsetzung mit TFA 94%, Wasser 2,5%, EDT 2,5%, TIS (Triisopropylsilan) 1%, bei 0°C für 15 min und 1,5 h bei Raumtemperatur. Das Gemisch wurde filtriert und das Harz wurde mit einem kleinen Volumen TFA gewaschen. Das Filtrat wurde in einen Rotationsverdampfer gegeben und alle flüchtigen Bestandteile wurden entfernt. Ein öliges Produkt wurde erhalten. Es wurde mit Ether trituriert und der Ether wurde dekantiert. Gelbes Pulver wurde erhalten. Dieses Rohprodukt wurde getrocknet. Das Gewicht des Rohprodukts betrug 290 mg.
Physiologische Beispiele
Erfindungsgemäße Somatostatin-Analoga wurden in Bioaktivitätsassays in vitro und in vivo auf ihre Aktivität untersucht, im Vergleich zu: natürlichem Somatostatinpeptid, d.h. SRIF; dem bekannten Somatostatin-Analogon Octreotid, den nicht cyclisierten Somatostatinderivaten und/oder irrelevanten Peptiden als Negativkontrollen.
Beispiel 84: In-vitro-Radioligand-Bindungsessay für Somatostatin.
Die Somatostatin-Analoga wurden (auf Basis des von Raynor et al., Molecular Pharmacology 43, 838-844, 1993 beschriebenen Verfahrens) auf ihre Wirksamkeit der Hemmung der Bindung von ¹²⁵I-Tyr¹¹-SRIF an Membranpräparationen, welche die transmembranen Somatostatin-Rezeptoren (SSTR-1, 2, 3, 4 oder 5) exprimieren, untersucht. Die für diese Tests verwendeten Rezeptorpräparationen stammten entweder von den selektiv und stabil in chinesischen-Hamster-Eierstock (CHO)-Zellen klonierten Rezeptoren oder von Zelllinien, welche die SSTRs natürlich exprimieren. Typischerweise wurden Zellmembranen in Tris-Puffer in Gegenwart von Proteasehemmern homogenisiert und für 30-40 min mit ¹²⁵I-Tyr¹¹-SRIF mit unterschiedlichen Konzentrationen der untersuchten Probe inkubiert. Die Bindungsreaktionen wurden filtriert, die Filter wurden gewaschen und die gebundene Radioaktivität wurde in einem Gamma-Zähler gezählt. Nicht spezifische Bindung wurde definiert als die Radioaktivität, welche in Gegenwart von 1 μm unmarkiertem SRIF-14 gebunden bleibt.
Um die positiven Signale der Bindungstests zu bestätigen und nicht spezifische Signale zu eliminieren, wurden Proben irrelevanter Peptide wie etwa GnRH, die unter Verwendung derselben Verfahren synthetisiert und behandelt wurden, in denselben Assays als Negativkontrollproben untersucht. Diese Proben wiesen in keinem der Assays eine Bindungsaktivität auf.
Beispiel 85: Rezeptorbindungsspezifität cyclischer Peptidanaloga
Man nimmt an, dass die verschiedenen Somatostatin-Rezeptoruntertypen an verschiedenen Signalübertragungswegen beteiligt sind. Dies hat Auswirkungen im Hinblick auf die Auswahl eines Somatostatin-Analogons, welches eine spezifische und selektive Bindung an solche Rezeptoruntertypen zeigt, die für die zu behandelnde Erkrankung relevant sind. Wie von Reisine und Bell zusammengefasst (Endocrine Rev. 16, 427-442, 1995), nimmt man an, dass die Aktivitäten verschiedener Rezeptoruntertypen wie folgt sind:
SSTR-1 und SSTR-2: Aktivierung von Thyrosinphosphatase, was zu einer Hemmung der EGF-Rezeptor-Autophosphorylierung führen kann, einem Prozess, der in Bezug der antiproliferativen Wirkung von SST steht.
SSTR-2: Hemmung der Wachstumshorm- und Gastrinfreisetzung, Prozesse, die für die Behandlung von Akromegalie und antiproliferative Effekten über Wachstumsfaktoren relevant sind.
SSTR-5: Hemmung der Insulin-, Lipase-, Amylase-Freisetzung, Aktivitäten, die für die Hemmung der Calciumzufuhr und antiproliferative Wirkungen von SST relevant sind.
SSTR-3: beteiligt an der Angiogenese.

Ein Vergleich der Bindung der Peptide der Beispiele 1-50 an unterschiedliche Somatostatinrezeptoren wurde in vitro in chinesischen-Hamster-Eierstock(CHO)-Zellen, welche die verschiedenen Rezeptoren exprimieren, untersucht. Ein Beispiel für die mit den cyclischen Peptiden erreichte Selektivität ist in Tabelle 21 dargestellt. Die gezeigten IC₅₀-Werte sind die benötigte Konzentration, um 50% der Bindung von radioaktiv iodiertem Somatostatin (SRIF-14) zu hemmen. Tabelle 21 Geschätzte IC₅₀-Werte (nM) für die Hemmung der ¹²⁵I-SRIF-14- Bindung an klonierte SSTRs durch ausgewählte Analoga mit cyclisiertem Gerüst.

PTR Nr.	SSTR-1	SSTR-2	SSTR-3	SSTR-4	Human-SSTR-5	Ratten-SSTR-5
3004		> 10000	> 10000			> 2000
3007		> 10000	> 10000			> 2000
3010	2500	> 10000	> 1000	> 10000	> 2000	500
3013		> 10000	> 10000			> 2000
3016	2500		> 2000	> 2000	> 2000	1000
3019		> 10000	> 10000
3022					> 2000
3025			> 10000	> 2000	> 2000	> 2000
3034			> 10000	> 2000		> 2000
3040	100	> 1000	2500	1000	2000	100
3043	2000	2000	> 2000	1000	400	400
3046	3000	500	500	250	22	30

Die IC₅₀-Werte wurden berechnet, indem die Analoga mit Konzentrationen von 10^–6, 10^–7, 10^–8 M in dem in Beispiel 84 beschriebenen Radioligand-Bindungsassay untersucht wurden.
Die Affinitäten von PTR 3046 (Synthesebeispiel Nr. 42) an die klonierten SSTRs sind in 1 gezeigt. Die unerwarteten Vorteile des erfindungsgemäßen PTR 3046 gegenüber anderen Somatostatin-Analoga, die nicht Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, liegen in seiner Selektivität. Das Analogon bindet mit hoher Affinität an humanes SSTR-5 und viel weniger an die anderen SSTRs.

Außerdem ist die Affinität für die Ratten-SSTRs und humane SSTRs für PTR 3046 ähnlich, so dass ausgehend von den Wirkstoffdosierungen in Rattenmodellen eine Vorhersage über die Wirksamkeit bei Menschen getroffen werden kann. Zum Vergleich sind die Affinitäten von PTR 3046 in Tabelle 22 zusammen mit denjenigen, die für bekannte SST-Analoga erhalten wurden, dargestellt. Tabelle 22. Selektivität von PTR 3046 im Vergleich zu bekannten SST-Analoga für SSTR-Untertypen.

Analogon	IC₅₀-Wert (nM)
	SSTR 1	SSTR 2	SSTR 3	SSTR 4	hSSTR 5	rSSTR 5
SRIF-14*	0,1	0,3	0,1	1,2	0,2	0,3
Octreotid*	> 1000	0,4	150	> 1000	32	0,2
Somatulin (BIM-23014)*	800	2	6	> 100 0	14	0,5
RC-160**	200	0,2	0,1	620	21	0,2
BIM-23052*	23	32	0,4	18	4	0,004
PTR 3046	3000	500	500	250	22	30
* Reisine und Bell (1995), Endocrine Reviews 16; 427-442 ** L. Buscail et al. (1995), PNAS 92; 1580-1584.

Ein weiteres cyclisches Peptidanalogon, PTR 3040, zeigte ein interessantes Selektivitätsprofil. Dieses Analogon zeigt eine relativ hohe Affinität für den Rezeptoruntertyp SSTR-1 und eine sehr niedrige Affinität für die anderen Rezeptoruntertypen. Während PTR 3040 eine hohe Bindung an den Ratten-SSTR-5 zeigte, war seine Affinität für den klonierten humanen Rezeptor signifikant geringer.
Die Hemmung der ¹²⁵I-SRIF-Bindung an Mäuse-Hypophysen-AtT20-Zellen wurde ebenfalls für verschiedene Analoga untersucht. Die mit PTR 3046 und PTR 3040 erhaltenen Ergebnisse sind in 2 im Vergleich zu SRIF-14 dargestellt. Die Ergebnisse stellen die prozentuale Hemmung pro spezifische Konzentration jeder der Verbindungen dar.
In-vivo-Beispiele:
Ausgewählte Analoga wurden in vivo auf die Hemmung von Wachstumshormon-Freisetzung, Amylase-, Lipase-, Gastrin-, Insulin-, Cholecystokinin (CCK)-, VIP- und Glucagonsekretion in Tieren untersucht. Wachstumshormon(GH)-Freisetzung steht im Zusammenhang mit Akromegalie. Gastrinsekretion steht im Zusammenhang mit Gastrinom (Zollinger-Ellison-Syndrom) und Ulcus. Insulinfreisetzung steht im Zusammenhang mit Insulinom, Hyperinsulinom, Fettleibigkeit und NIDDM. Glucagonfreisetzung steht im Zusammenhang mit Hyperglykämie, NIDDM und Glucagonämie. Amylase- und Lipasefreisetzung stehen im Zusammenhang mit akuter und chronischer Pankreatitis, enterokutanen und pankreatischen Fisteln und Pankreasoperationen. VIP-Freisetzung steht im Zusammenhang mit VIPoma und sekretorischer Diarrhöe. Außerdem können die antiproliferativen Wirkungen von Somatostatin direkt oder indirekt über GH-IgF oder CCK-Freisetzung erfolgen.
Beispiel 87: Assays der biologischen Aktivität von Somatostatin (In-vivo-Assays)
Die biologischen Wirkungen in vivo von SST-Analoga auf Wachstumshormon-, Insulin- und Glucagonfreisetzung wird durch Messung der Werte dieser Hormone unter Verwendung von kommerziell verfügbaren RIA-Testkits gemessen. Pharmakologische Wirkungen von SST bei Patienten mit neuroendokrinen Tumoren des Darms erfordern eine Bestimmung von 5-Hydroxyindolessigsäure (für karzinoide Tumore) und VIP (für VIPoma). In-vivo-Visualisierung von SST-Rezeptorpositiven Tumoren wird wie von Lambert et al. beschrieben (New England J. Med., 323:1246-1249 1990), nach i.v.-Verabreichung radioiodierter SST-Analoga durchgeführt.
Beispiel 88: Beständigkeit von SST-Analoga gegenüber biologischem Abbau.
Die In-vitro-Biostabilität eines cyclischen SST-Peptidanalogons, PTR 3002, wurde in humanem Serum gemessen und mit derselben Sequenz in einem nicht cyclischen Peptidanalogon (PTR 3001), mit Octreotid (Sandostatin^TM) und mit nativem Somatostatin (SRIF) verglichen. In diesem Assay ist das erfindungsgemäße cyclische Peptid ebenso stabil wie Octreotid und stabiler als die entsprechende nicht cyclische Struktur und viel stabiler als SRIF. Der Assay beruhte auf der HPLC-Bestimmung der Peptidzersetzung als Funktion der Zeit in Serum bei 37 °C.
Beispiel 89: Hemmung der Wachstumshormonfreisetzung durch SST-Analoga.
Die In-vivo-Bestimmung der pharmakodynamischen Eigenschaften von cyclischen Peptid-SST-Analoga wurde in Ratten gemäß bekannten Verfahren durchgeführt. Die Hemmung der Wachstumshormon(GH)-Freisetzung als Ergebnis der Peptidverabreichung wurde in männlichen Sprague-Dawley-Ratten gemessen. Die Aktivität des cyclischen SST-Peptidanalogons wurde in dieser Studie mit SRIF oder mit Octreotid verglichen, wobei in jeder Gruppe 4 Ratten verwendet wurden. Die Zeitverlaufsprofile für die GH-Freisetzung unter konstanten Versuchsbedingungen wurden gemessen.
Methoden
Männliche erwachsene Sprague-Dawley-Ratten, spezifisch pathogenfrei (SPF) mit einem Gewicht von 200-350 g wurden bei einem konstanten Licht-Dunkel-Zyklus (Licht von 8-20 Uhr), Temperatur (21 ± 3 °C) und relativer Feuchtigkeit (55 ± 10%) gehalten. Laborfutter und Leitungswasser waren nach Belieben verfügbar. Am Tag des Experiments wurden die Ratten mit Pentobarbiton (50 mg/kg) anästhetisiert. Die mit Pentobarbiton anästhetisierten Ratten zeigten niedrige Somatostatin-Werte in portalen Blutgefäßen (Plotsky, P.M., Science, 230, 461-463, 1985). Eine einzelne Blutprobe (0,6 ml) wurde aus der freigelegten kanülierten Vena jugularis entnommen, um die basalen GH-Werte zu bestimmen (–15 min). Unmittelbar danach wurde die entsprechende Peptidbehandlung verabreicht. Die Tiere erhielten 10 mg/kg entweder des nativen Somatostatins (SRIF), des synthetischen Analogons Octreotid (Sandostatin) oder des cyclischen Peptidanalogons. Eine physiologische Salinelösung (0,9% NaCl) wurde als Kontrolle verabreicht. Alle Peptide wurden subkutan in einem Endvolumen von 0,2 ml verabreicht. Weitere Probenentnahmen erfolgten 15, 30, 60 und 90 min nach Peptidverabreichung. Die Blutproben wurden in Röhrchen gesammelt, die Heparin enthielten (15 Einheiten pro ml Blut) und unmittelbar zentrifugiert. Plasma wurde abgetrennt und bei –20 °C bis zur Untersuchung gefroren gehalten.
Die Werte an Ratten-Wachstumshormon (rGH) [¹²⁵I] wurden mittels eines Radioimmunassaykits (Amersham) bestimmt. Der Standard wurde bei diesem Kit gegen eine Referenzstandardpräparation (NIH-RP2) des National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases kalibriert. Alle Proben wurden zweifach gemessen.
Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, dass Octreotid signifikant die Freisetzung von Wachstumshormon hemmt, wohingegen das cyclische Analogon PTR 3046, welches den SSTR-2 nicht bindet, sich in diesem Test nicht signifikant von Saline unterscheidet, wie für ein Somatostatin-Analogon, das für den SSTR-5-Rezeptoruntertyp selektiv ist, zu erwarten ist.
Die Daten dieser Studien sind in 3 zusammengefasst.
Beispiel 90: Fehlende Toxizität cyclisierter Peptidanaloga
PTR 3007 in einer Dosis von 1,5 mg/kg wurde bei einer einmaligen intraperitonealen Anwendung gut vertragen. PTR 3013 war für die Ratten nicht toxisch, selbst bei Dosierungen von 4 mg/kg. Diese beiden Dosierungen sind um mehrere Größenordnungen höher als erforderlich, um die gewünschte endokrine Wirkung auszulösen. Die in Saline gelösten Peptide führten zu keinen ungünstigen Nebenwirkungen auf das zentrale Nervensystem, Herz-Kreislauf-System oder die Umgebung der Tiere. Die Ratten wurden für 4 h nach der Verabreichung der Peptide beobachtet. PTR 3007 und 3013 erzeugten keine Atmungsstörungen, führten nicht zum Auftreten eines stereotypen Verhaltens und erzeugten keinerlei Veränderungen des Muskeltonus. Nach 3 h wurden bei einer Postmortem-Untersuchung keinerlei Anomalien in der Leber, den Nieren, Arterien und Venen, dem Magen-Darm-Trakt, den Lungen, dem Genitalsystem und der Milz gefunden.
Beispiel 91: Die In-vivo-Wirkung von Somatostatin-Analoga auf Glucose-induzierte Insulinfreisetzung in Ratten.
Auf Grundlage der bekannten Physiologie des nativen Somatostatins als Hemmer der Insulinfreisetzung war das Ziel dieser Studie die Bewertung der Wirkung des Analogons PTR 3046 mit cyclischem Gerüst auf die postalimentäre Sekretion von Insulin.
Versuch:
Erwachsene männliche Wistar-Ratten, spezifisch pathogenfrei (SPF) mit einem Gewicht von 200-220 g wurden verwendet. Die Tiere wurden bei einem konstanten Licht-Dunkelheitszyklus (Licht von 8-20 Uhr), Temperatur (21 °C) und Feuchtigkeit (55%) Gehalten. Den Tieren wurde bis 18-20 h vor dem Experiment ein freier Zugang zu Nahrung und Wasser ermöglicht, dann wurde sämtliche Nahrung (aber nicht das Wasser) entfern. Die Tiere wurden in Kunststoffkäfigen mit weitmaschigen Drahtböden gehalten, um Koprophagie (Ernährung von Exkrement) zu verhindern. Am Tag des Experiments wurden die Ratten mit Pentobarbiton (60 mg/kg IP) anästhetisiert. 15 min nach der Verabreichung von Pentobarbital wurde ein Katheter in die rechte äußere Jugularvene eingeführt, um die Entnahme von Blutproben zu ermöglichen. Die Körpertemperatur wurde unter Verwendung eines digitalen Rektaltemperatur-Thermometers überwacht und bei einem konstanten Wert (37-37,5 °C) gehalten, indem eine Heizdecke unter der Ratte angeordnet wurde und der Operationstisch mit zwei 100 W-Birnen aus einem Abstand von 50 cm bestrahlt wurde. Nach Kanülierung wurde eine 0,7 ml-Blutprobe aus der Jugularvene entnommen und in Röhrchen übertragen, in denen zuvor 20 IU Heparinlösung 5000 IU/ml präpariert worden war. Diese Blutprobe wurde für die Bestimmung der basalen Insulinwerte gesammelt. Unmittelbar im Anschluss wurde die entsprechende Peptidvorbehandlung verabreicht.
Die Tiere erhielten die folgenden Peptide: Das synthetische Analogon Octreotid mit 10 μg/kg (n = 15), das Peptid PTR 3046 mit cyclischem Gerüst mit 7 μg/kg (n = 18). Saline (0,9% NaCl) 0,2 ml wurde als Kontrolle verabreicht (n = 16). Alle Peptide wurden subkutan in einem Endvolumen von 0,2 ml verabreicht. 10 min nach der Wirkstoffverabreichung wurde die nächste Blutprobe entnommen, unmittelbar danach wurde eine Glucoselösung i.v. mit einer Enddosis von 0,5 g/kg verabreicht. Eine weitere Probenentnahme erfolgte 2 und 5 min nach der Glucoseverabreichung.
Unmittelbar nach der Entnahme jeder Blutprobe wurde ein entsprechendes Volumen (0,7 ml) Saline i.v. verabreicht. Die Blutproben wurden in Röhrchen gesammelt, welche Heparin enthielten (15 Einheiten pro ml Blut) und unmittelbar zentrifugiert (1500 g) und Plasma wurde abgetrennt und sie wurden bei –20°C (bis zur Untersuchung) gefroren gehalten. Die Ratten-Insulin (rlns)[¹²⁵I]-Werte wurde mittels eines Ratten-Insulin-RIA-Kits bestimmt. Dieser Kit verwendet einen Antikörper, der spezifisch gegen Ratten-Insulin ist (Linco). Die Sensitivität des Kits betrug 0,1 ng/ml. Alle Proben wurden zweifach gemessen.
Ergebnisse:
Die Verabreichung von 7 μg/kg PTR 3046 führte zu einer signifikanten (p < 0,05) Verringerung (43%) der Insulinfreisetzung im Vergleich zu unbehandelten Kontrollratten. Die Verringerung der Insulinwerte bei Octreotid-vorbehandelten Ratten war in diesem Experiment nicht statistisch signifikant.
Diese Ergebnisse zeigten, dass das Peptid PTR 3046 mit cyclischem Gerüst ein wirkungsvoller Hemmer der postalimentären Insulinfreisetzung in vivo ist. Auf Grundlage der vorliegenden Studie und der für Octreotid berichteten Daten des Herstellers (ED50 für Insulinfreisetzung von 26 μg/kg) wird gefolgert, dass PTR 3046 in vivo gegenüber der Insulinfreisetzung viermal wirkungsvoller ist als Octreotid.
Hyperinsulinämie ist einer der mit der Pathologie von Fettleibigkeit und dem frühen Stadium von nicht insulinabhängigem Diabetes mellitus (NIDDM) verbundenen äthiologischen Faktoren. Daher sollte angesichts der starken Hemmung der Insulinsekretion mit diesem neuen SST-Analogon die potenzielle Anwendung von PTR 3046 als anti-sekretagoges Mittel für die Insulinfreisetzung in Betracht gezogen werden.
Die Daten dieser Studien sind in 4 zusammengefasst.
Beispiel 92: Wirkung von Somatostatin-Analoga auf Bombesin-stimulierte Plasmaamylase- und Lipasefreisetzung.
Es wurde berichtet (Reisine und Bell, ibid.), dass die Hemmung der Insulin- oder Amylasefreisetzung hoch korreliert ist mit der Affinität für den SST-Rezeptoruntertyp SSTR-5, während die Hemmung der Freisetzung von Hypophysenwachstumshormon (GH), der Sekretion von pankreatischem Glucagon und der Sekretion von Magensäure durch SSTR-2 vermittelt werden. Die oben gezeigten Bindungsaffinitätsdaten (Beispiel 85) zeigten die Selektivität des cyclischen Heptapeptids PTR 3046 für hSSTR-5 (Affinität 20 nM) im Vergleich zu dessen geringer Affinität (> 1000 nM) für SSTR-1, 2, 3 und 4. Auf Grundlage dieser Ergebnisse erfolgte die vorläufige Bewertung der physiologischen Aktivität von PTR 3046 unter Verwendung des In-vivo-Modells der Bombesin-stimulierten Lipase- und Amylasefreisetzun. Die Dosisantwort von PTR 3046 im Hinblick auf die Hemmung der Amylase- und Lipasefreisetzung in Ratten wurde nach Verabreichung des Peptidanalogons in drei verschiedenen Dosierungen, d.h. 3 μg/kg, 12,5 μg/kg und 25 μg/kg gemessen. Diese Dosierungen wurden mit dem synthetischen Analogon SMS-201 995, welches in einer Dosis von 10 μg/kg verabreicht wurde, verglichen.
Methoden
Männliche Wistar-Ratten (Gewicht 200-220 g) wurden mit Pentobarbital (60 mg/kg) auf intraperitonealem Weg (i.p.) anästhetisiert. Die Tiere erhielten bis 18 h vor dem Experiment freien Zugang zu Nahrung und Wasser, dann wurde alle Nahrung (aber nicht das Wasser) entzogen. Weiter wurden die Tiere in Käfigen mit grobmaschigen Drahtböden gehalten, um Koprophagie (Ernährung von Exkrement) zu verhindern.
Probenentnahme
Nach Kanülierung wurde eine 0,7 ml-Blutprobe aus der Jugularvene entnommen und in ein Eppendorf-Röhrchen, welches IU Heparinlösung 5000 IU/ml enthielt, überführt. 1 min später wurden die Peptide subkutan verabreicht (sc in 0,2 ml 0,9%-igem NaCl). Kontrollratten wurden mit 0,2 ml 0,9%-igem NaCl vorbehandelt. Zum Zeitpunkt 0 (5 min nach Entnahme der Ausgangsblutprobe-1) wurde bei allen Tieren eine Bombesin-Infusion (50 nmol/kg/h) begonnen. Weitere Blutproben wurden in konstanten Zeitabständen von 60, 90 und 120 min während der Bombesininfusion entnommen.
Behandlung der Proben
Blutproben wurden in eisgekühlten Röhren, welche Heparin enthielten (20 IU/ml), gesammelt und zentrifugiert (1500 g × 10 min). Plasmaproben wurden gefroren und bis zur Untersuchung auf Amylase und Lipase bei –20 °C gehalten.
Analytische Assays
Amylasewerte wurden im Plasma mit dem kommerziellen (Raichem^TM) Amylasereagenz gemessen.
Lipasewerte wurden im Plasma mit einem kommerziellen Kit (Randox^TM) gemessen.
Ergebnisse
Verhinderung der Bombesin-stimulierten Amylasesekretion durch SST-Analoga:
Kontrolle (Salinevorbehandlung):
Bombesininfusion i.v. in einer Dosis von 50 nmol/kg/h führte zu einer zeitabhängigen Steigerung von Plasmaamylase (um das Zehnfache oberhalb Basalwert nach 60 und 90 min) und Lipase (um das Vierzehnfache oberhalb Basalwert nach 60 und 90 min).
PTR 3046:
Die Vorbehandlung mit PTR 3046 führte zu einer signifikanten dosisabhängigen Hemmung der Bombesin-induzierten Freisetzung von Plasmaamylase im Vergleich zu Kontrollratten. Die Hemmung betrug 31% nach 90 min und 23% nach 120 min für 3 μg/kg und 60% nach 90 min und 52% nach 120 min für die Dosis von 25 μg/kg.
Die Vorbehandlung mit Octreotid mit 10 μg/kg führte an diesen Zeitpunkten zu einer signifikanten Hemmung von 23%.
Verhinderung der Bombesin-stimulierten Lipasesekretion durch SST-Analoga:
PTR 3046:
Die Vorbehandlung mit PTR 3046 führte zu einer signifikanten dosisabhängigen Hemmung der Bombesin-induzierten Freisetzung von Plasmaamylase im Vergleich zu Kontrollratten. Die Hemmung betrug 33% nach 90 min und 25% nach 120 min für 3 μg/kg, 30% nach 90 min und 25% nach 120 min für 12,5 μg/kg und 51% nach 90 und 35% nach 120 min für die Dosis von 25 μg/kg. Während die Vorbehandlung mit SMS mit 10 μg/kg zu einer signifikanten Hemmung von 27 und 30% nach 90 bzw. 120 min führte.
Ähnliche Ergebnisse wurden mit PTR 3010 erhalten (Daten nicht gezeigt).
Diese Ergebnisse zeigen, dass PTR 3046 ein selektives Analogon für SSTR-5 ist, wie in den vorläufigen Bindungsassays und dem physiologischen Modell der Enzym- und Endokrinsekretion gezeigt wurde.
Die Bombesin-induzierte pankreatische und gastritische Sekretion ist ein gängiges In-vivo-Modell für die Bewertung der antisekretorischen Wirkung von Bombesin-Antagonisten, Bombesin-Antikörpern und Somatostatin-Analoga.
Die mutmaßliche Rolle von Bombesin bei verschiedenen Lungen- und Darmerkrankungen bei Menschen lassen vermuten, dass Wirkstoffe, welche die sekretorische Wirkung von Bombesin hemmen, wie etwa PTR 3010 und PTR 3046, als Pharmakotherapie für verschiedene therapeutische Ziele im Zusammenhang mit Bombesin verwendet werden könnten, einschließlich sekretorische Erkrankungen wie Pankreatitis, Rhinitis und Gastrinom; neurokrine Zellhyperplasie-Erkrankungen wie bronchiopulmonale Dysplasie, zystische Fibrose und chronische Bronchitis und Emphysem; proliferative Erkrankungen wie Prostatahypertrophie, Prostatakrebs, Pankreaskrebs und Magenkrebs.
Außerdem könnten auch portale Hypertonie, GI-Blutung und kolorektales Karzinom mögliche Anwendungen sein.
Beispiel 93: Duodenal-pankreatische Perfusion
Eine Einschränkung der Bombesin- oder der Caerulein-Modelle bestand darin, dass beide Tests auf der indirekten Detektion von Enzymwerten im Serum beruhen. Da Amylase aus Speichel und anderen Stellen im GI-Trakt freigesetzt werden kann, ist eine direkte Messung der Auswirkung auf die pankreatische Freisetzung von Enzymen notwendig. Zu diesem Zweck wurde das Perfusionsmodell in der Ratte entwickelt. Die Ergebnisse (5) zeigen, dass PTR 3046 und Sandostatin (verabreicht durch i.v.-Infusion) beide die pankreatische Freisetzung von Enzymen hemmen, wie direkt im Duodenalperfusat nachgewiesen wurde.
Das Duodenalsegment, welches die pankreatische Freisetzung ablässt, wurde proximal vom Magen und distal vom Jejunum gelöst. Das Segment wurde mit physiologischer Saline perfundiert, das Perfusat wurde in Zeitabständen von 15 min gesammelt. Die Stimulierung der pankreatischen Freisetzung erfolgte durch i.v.-Infusion von Bombesin oder Caerulein, 1 nMol/kg/h bzw. 4 nMol/kg/h. Während der Perfusion (nachdem die Enzymwerte Plateauwerte erreichten) wurden die Wirkstoffe für weitere 2 h i.v. eingeleitet. Die pankreatischen Enzymwerte wurden in den Perfusatproben gemessen. Die Daten sind als Prozentsatz der durchschnittlichen Enzymwerte von Bombesin-induzierten Plateauwerten dargestellt.
Beispiel 94: Antiproliferative Wirkung
Auf Grundlage der Hemmung der endokrinen Freisetzung, die durch Caerulein (ein CCK-Analogon) induziert wird und aufgrund der Tatsache, dass CCK ein wirkungsvoller Wachstumsfaktor im Magendarmtrakt ist, war es sinnvoll, die potenzielle antiproliferative Wirkung von PTR 3046 auf von Magendarmtrakt- Tumoren gewonnene Krebszelllinien zu untersuchen.
Eine signifikante antiproliferative Wirkung von PTR 3046 auf die humane Pankreaszelllinie MiaPaca-2 wurde gefunden (6).
Die Zellen wurden in DMEM-Kulturmedium, welches mit 10% FCS ergänzt war, gezüchtet. Man ließ die Zellen anhaftend nach 24 h an die Platte. Wirkstoffe wurden zu dem Kulturmedium im Konzentrationsbereich von 10^–6 M bis 10^–11 M zugegeben. Die Proliferation der Zellen wurde durch MTT-Assay 24, 48 und 72 h nach der Verabreichung des Wirkstoffs bewertet.

Claims

Somatostatinanalog mit zykliertem Gerüst, das aus folgender Struktur besteht: Zyklo[N-Phe-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-N-Phe]-Thr-X wobei X eine carboxyterminale Säure, ein carboxyterminales Amid, einen carboxyterminalen Ester oder einen carboxyterminalen Alkohol bezeichnet zur Anwendung als Medikament.
Somatostatinanalog mit zykliertem Gerüst nach Anspruch 1, das aus folgender Struktur besteht:
wobei X eine carboxyterminale Säure, ein carboxyterminales Amid, einen carboxyterminalen Ester oder einen carboxyterminalen Alkohol bezeichnet.
Somatostatinanalog mit zykliertem Gerüst nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Medikament in Einheitsdosierungsform vorliegt.
Anwendung des Somatostatinanalogs nach Anspruch 1 oder 2 bei der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung endokriner Störungen, Neoplasien oder Stoffwechselstörungen.