KR20000029654A - 기본구조에고리가형성된소마토스태틴유사체 - Google Patents

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Abstract

신규한 펩티드에 대해 설명한다. 신규한 펩티드는 구조적으로 구속된 기본구조 고리형 소마토스태틴 유사체이다. 소마토스태틴 유사체를 합성하고, 소마토스태틴 라이브러리를 생산하는 방법에 대해 설명한다. 또는 소마토스태틴 유사체로 구성된 제약학적 조성물 및 이와 같은 조성물을 엔도크린 질환, 신조직형성 및 대사 질환을 치료하는데 이용하는 방법에 대해 설명을 하고 있다.

Description

기본구조에 고리가 형성된 소마토스태틴 유사체{CONFORMATIONALLY CONSTRAINED BACKBONE CYCLIZED SOMATOSTATIN ANALOGS}
소마토스태틴은 말초 조직 및 중추 신경계에 있는 고리형 테트라데카펩티드이다. 이는 포유류 시상하부에서 처음으로 분리하였고, 이는 전방 뇌하수체로부터 생장 호르몬의 주요 방해물질로 확인되었다. 이의 여러가지 생물학적 활성에는 췌장으로부터 글루카곤 및 인슐린 분비를 방해하고, 대부분 내장 호르몬을 조절하고, 운동 활성에 연관된 다른 신경전달물질의 방출 및 중추 신경제를 통하여 인지 과정에 연관된 신경전달물질의 방출을 조절한다(Lamberts, Endocrine Rev., 9:427, 1988). 또한, 소마토스태틴과 이의 유사체는 다양한 형태의 종양을 치료하는데 상당히 유용한 항-증식억제 물질이다.
다음의 구조로 된 천연 소마토스태틴(이는 또한 소마토트로핀 방출 저해인자, SRIF)은 Guillemin 및 그의 동료(Bruzeau et al. Science, 179:78, 1973)에 의해 처음으로 분리되었다;
이는 수용체 족과 상호작용을 하여 이의 효과를 나타낸다. 최근에는 SSTR1-5라고 명한 다섯개 수용체 서브타입이 확인되어 클론되었다. 이의 천연형에서, 소마토스태틴은 생체이용성이 나쁘고 작용하는 시간이 짧은 등의 두 가지 바람직하지 못한 성질을 나타내기 때문에 치료제로 사용에 제한을 받아왔다. 이와 같은 이유로, 지난 20년간 성능, 작용 시간, 생장 호르몬, 인슐린 또는 글루카곤등의 방출을 방해하는데 있어서 선택성등에 우수한 성질을 가지는 소마토스태틴 유사체를 발견하는데 상당한 노력을 기울였다.
구조-활성 연관 연구; CD, 핵 자기 공명과 같은 스펙트로스코피 기술, 분자 모델링 방식으로 다음과 같은 사실을 밝혀내었다; 천연 소마토스태틴의 고리 일부 모양은 안티페어랠 β-쉬트와 상당히 비슷하였고; Phe6와 Phe11는 두개의 방향족 고리사이에 소수성 작용을 통한 약제 모양의 안정성에 상당히 주요한 기능을 하고; 안티패어랠 β-쉬트에서 β-턴 주변에 있는 네개 아미노산 Phe7-Trp9-Lys9-Thr10이 약제 활성에 필수적인 것이고; (D)Trp8이 소마토스태틴 수용체 서브타입 2-5와 상호작용을 하는데 (L)Trp8보다 더 바람직하다는 것이다.
그럼에도불구하고, 이황화결합에 의해 서로 서로 가까이 있는 이들 네개 아미노산을 포함하는 헥사펩티드 소마토스태틴 유사체는 천연 소마토스태틴에서 Phe6-Phe11소수성 상호작용을 대체하는 공유 이왕화결합을 가지는 장점이 있지만, in vivo 및 in vitro에서 모두 활성을 가지지 못한다.
이와 같은 헥사펩티드 소마토스태틴 유사체의 활성을 증가시키기 위해 4 가지 방식을 시도하였다. (1) 시스-아미드 결합을 조장하여 이황화결합을 대체하거나 또는 분자에 제 2 고리화반응을 시켜 두개 고리 유사체를 만든다. 이 두가지 경우에 생성된 유사체는 구조적 자유도가 감소된다. (2) Phe7-(D)Trp8-Lys9-Thr10에서 원래 잔기를 다른 천연 또는 비-천연 아미노산으로 대체를 하는데, Phe7은 Tyr7으로 대체를 하고, Thr10은 Val10으로 대체를 하였다. (3) 천연 소마토스태틴으로부터 추가 기능기를 결합을 시키는데, 이와 같은 새로운 요소들이 수용체와 상호작용을 할 수 있는 것으로 본다. (4) 네가지 아미노산 Phe7-(D)Trp8-Lys9-Thr10중 하나를 제거하는데 이와 같은 유사체가 더 선택성이 있다는 가정하에 실시한다.
다음과 같은 소마토스태틴 유사체, MK-678는
cyclo(N-Me-Ala6-Tyr7-(D)Trp8-Lys9-Val10-Phe); 상기 처음 세 가지 방법을 이용하여 고안된 매우 강력한 소마토스태틴 유사체의 예이다(Veber, et al., Life Science, 34:371, 1984). 이와 같은 헥사펩티드 유사체에서, 시스-아미드 결합이 N-Me-Ala와 Phe11사이에 위치하고, Tyr7와 Val10는 각각 Phe7와 Thr10로 대체되었고; Phe11는 천연 소마토스태틴으로부터 결합되었다.
또 다른 그룹의 소마토스태틴 유사체(미국 특허 4,310,518와 4,235,886)에는 다음의 옥트레오티드(Octreotide)를 포함하는데 유일하게 승인된 현재 이용할 수 있는 소마토스태틴 유사체이다;
이는 상기 세번째 방식을 이용하여 개발된 것이다. 여기에서, (D)Phe5와 환원된 C-말단 Thr12-CH2OH은 천연 Phe6와 Thr12에서 이용할 수 있는 공간의 일부를 점유하는 것으로 가정을 한다.
화합물 TT-232은 다음과 같고;
이는 상기 네번째 방법을 이용한 예로써 옥트레오티드와 상당한 연관이 있다. Thr10이 부족한 것이 항-종양 활성에 높은 기능적인 선택성을 가지는 원인인 것으로 본다.
이와 같은 매우 강한 소마토스태틴 유사체의 예를 보면, 6번과 11번의 페닐알라닌이 약제의 활성을 가지는 모양을 안정화시킬뿐만아니라 수용체와의 상호작용에 기능적인 역할도 한다는 것을 나타낸다. 또한 한개 페닐알라닌(Phe6또는 Phe11)으로 수용체와 상호작용을 하는데 충분하지 또는 두개 모두가 필요한지는 아직 의문으로 남아있다.
소마토스태틴 수용체는 다섯가지 다른 수용체 서브타입족으로 구성되는데(Bell and Reisine, Trends Neurosci., 16, 34-38, 1993), 이들은 이들의 조직 특이성 및 생물학적 활성을 기초로하여 구별을 한다. 당 분야에 공지된 소마토스태틴 유사체는 충분한 선택성 또는 수용체 서브타입 선택성 특히 항-신조직형성제로써의 선택성을 제공하지는 못한다(Reubi and Laissue, TIPS, 16, 110-115, 1995).
전이성 암양종(설사) 및 혈관활성 내장 펩티드(VIP) 분비 아데노마(장액성 설사)와 연관된 증상은 소마토스태틴 유사체로 치료를 한다. 소마토스태틴은 또한 심각한 위장 출혈을 치료하는데 이용되어 왔다. 소마토스태틴은 또한 이의 항-분비 활성으로 인하여 다른 호르몬-분비성 종양(가령 췌장 섬-세포 종양 및 선단거대증) 및 호르몬 의존성 종양(연골육종, 골육종)을 완화 치료하는데 유용하다.
펩티드모방물질
유기화학 및 분자생물학이 상당한 발전하여, 약리학적 임상학적으로 이용할 수 있는데 충분한 양으로 많은 생활성 펩티드를 준비할 수 있게 되었다. 따라서, 지만 수년간 펩티드로 실행하는 질병 치료 및 처리를 하는 새로운 방법이 정립되었다. 그러나, 약물로써 펩티드를 이용하는데에는 다음과 같은 인자에 의해 제한을 받는다; (a) 위장관 및 혈청에서 단백질분해에 대해 대사적으로 안정성이 낮고; (b) 경구 투여후에 흡수도가 낮고, 특히 상대적으로 큰 분자량 또는 특정 운반 시스템의 부족으로 인하여 흡수도가 낮고; (c) 간과 신장을 통하여 신속하게 방출되고; (d) 펩티드 수용체가 유기체에 방대하게 분포되어 있기때문에 표적이 아닌 기관에서는 부작용이 나타난다.
또한, 몇가지 예외적인 사항을 제외하고는, 작은 또는 중간 크기(30개 아미노산이하)의 펩티드는 희석 수용액에서 동적 평행에 여러가지 형태로 질서없이 존재하여, 이는 수용체 선택성, 대사 감응성이 부족하게 하고, 생물학적 활성 모양을 결정하는 시도를 방해한다. 펩티드가 원래 생물학적으로 활성인 모양 즉, 수용체-결합된 모양을 가진다면, 수용체에 대한 친화성이 증가될 것을 예츨할 수 있는데, 그 이유는 결합에서 엔트로피는 유연성 펩티드의 결합시보다 적기때문이다. 따라서, 질서를 가진 균질한 생물학적으로 활성이 있는 펩티드를 찾고 개발하는 노력이 중요하다.
최근에는, 프로토타입 펩티드보다 좀더 우수한 약리학적 성질을 가지는 펩티드모방물질 또는 펩티드 유사체를 개발하는데 상당한 노력을 기울였다. 고유 펩티드 그 자체가 이의 약리학적 성질이 최적화된 경우에 일반적으로 펩티드모방물질을 개발하는데 리더 역할을 한다. 그러나, 이와 같은 물질을 개발하는데 주요 문제점은 생물학적 활성 펩티드의 활성 부분을 결정하는데 있다. 가령, 흔히 아주 소수의 아미노산(통상 4 내지 8개)만이 수용체에 의해 펩티드 리간드를 인지하는 역할을 한다. 이와 같은 생물학적 활성 부분을 결정하기만 하면, 펩티드 모방물질을 개발하기 위한 리더 구조를 최적화할 수 있는데, 이는 구조-활성 상관관계 연구를 통하여 최적화한다.
여기에서 사용된 것과 같이, "펩티드 모방물질"은 수용체의 리간드로써, 수용체 수준에서 펩티드의 생물학적 효과를 모방하는(작용제) 또는 방해하는(길항제) 기능을 할 수 있다. 최적의 작용 펩티드 모방물질을 얻기위해서는 다음의 인자들을 고려해야 한다; (a) 대사 안정성; (b) 우수한 생체 이용성; (c) 높은 수용체 친화성 및 수용체 선택성; (d) 부작용은 최소화.
최근에 일반적인 이용할 수 있는 성공적인 방법은 가능한한 근접하게 내생 펩티드 리간드의 수용체 결합된 모양에 유사한 공간적으로 제한된 펩티드 모방물질을 개발하는 것이다(Rizo and Gierasch, Ann. Rev. Biochem., 61:387, 1992). 이와 같은 형태의 유사체를 연구하면, 프로테아제에 대해 저항성이 증가된 것을 볼 수 있는데, 즉 대사 안정성이 증가되었을 뿐만아니라 선택성이 증가되었고 부작용이 적다는 것을 알 수 있다(Veber and Friendinger, Trends Neurosci., p. 392, 1985).
정확한 모양의 이들 펩티드 모방물질 화합물이 생성되면, 구조-호라성 관계를 연구하여 가장 활성이 큰 구조를 선택한다. 이와 같은 구조적인 속박은 국소적인 구조 변형 또는 포괄적인 모양의 제한등과 연관이 있다(Giannis and Kolter, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32:1244, 1993).
구조적으로 속박된 펩티드 유사체
펩티드에서 두개의 이웃하는 아미노산사이에 다리가 연결되면 국소 모양 변형을 유도하고, 이의 유연성이 정상적인 이가펩티드의 것에 비교하여 제한을 받게 도니다. 이와 같은 다리를 형성하는데 일부 가능한 것은 락탐 및 피페라지논 결합을 포함한다. γ-락탐 및 δ-락탐은 "모방물질로 변환(turn mimetics)"으로써 어느정도 고안되었다; 일부 경우에 이와 같은 구조가 펩티드에 결합됨으로써 생물학적으로 활성이 있는 화합물을 유도한다.
고리화를 통하여 펩티드 가닥의 유연성을 제한함으로써 펩티드 모양을 전체적으로 제한하는 것이 가능하다(Hruby et al., Biochem. J., 268:249, 1990). 생활성이 있는 펩티드를 고리화하면 안정성 및 수용체 선택성을 개선시킬 수 있고 또한 고리화반응은 모양상의 균질성을 강화시키는 구속력을 부여하고, 모양 분석을 실행할 수 있게 한다. 고리화반응의 통상적인 방식은 자연적으로 발생하는 고리 펩티드에서 발견되는 것과 동일하다. 여기에는 측쇄에 측쇄가 연결되어 고리를 형성하거나 또는 단부 기에 측쇄가 연결되는 고리형성등을 포함한다. 이를 위해서는, 수용체 인지에 관여하지 않는 아미노산 측쇄가 서로 또는 펩티드 기본구조에 연결된다. 또다른 통상적인 고리형성은 말단에 말단이 연결되는 고리형성과정이다.
이와 같은 전통적인 고리 형성 방식에 주요 제한점은 고리형성을 위해서 아미노산 측쇄에 치환이 있어야 한다는 것이다.
펩티드의 구조적인 속박방법에 또 다른 개념적인 접근 방식은 Gilon, et al., (Bio-polymers 31:745, 1991)에 의해 소개되었는데, 그는 펩티드의 기본 구조에 기본 구조가 고리를 형성하는 것을 제안하였다. 이 전략의 이론적인 장점은 주어진 펩티드에서 특정 수용체와 상호작용하는데 중요한 측쇄를 간섭하지 않고 펩티드 기본 구조의 탄소 또는 질소를 통하여 고리를 형성할 수 있는 능력이 포함된다. 이 개념은 임의 관심이 있는 선형 펩티드에 이용할 수 있으나, 제안된 과정에서 제한 인자는 적절한 빌딩 유닛으로 이는 연결기를 통하여 연결될 아미노산에 대체하여 이용되어야 한다. 이와 같은 개념의 기본 구조 고리형성을 실행하는데 있어서 실제 환원은 글리신이 아닌 다른 아미노산 빌딩 단위를 분지하는 임의 방법을 고안하는 능력이 없기때문에 방해를 받는다(Gilon et al., J. Org. Chem, 587:5687, 1992).
Gilon의 EPO 출원 No. 564,739 A2; J. Org. Chem., 57:5687, 1992,에서는 빌딩 유닛을 합성하는 두 가지 기본적인 방식에 대해 설명을 하고 있다. 첫째는 브롬산과 디아민의 반응으로 시작된다. ω아민의 선택적인 보호 및 보호기를 만들어 Boc 화학적인 펩티드 합성에 적합한 빌딩 단위를 제공한다. 두번째 방식은 디아민의 선택적 보호와 생성물을 염화아세트산으로 반응하는 것으로 시작을 하여 Fmoc 펩티드 합성에 적합한 보호된 글리신 유도체를 제공한다.
기본 구조의 고리를 형성된 펩티드 유사체의 개념을 이용하는 방식은 WO95/33765에 설명되어 있는데 이는 글리신이 아닌 빌딩 유닛을 합성하는 새로운 방법을 제공한다. WO95/33765에서 설명을 하고 있는 펩티드 유사체족가운데에는 다양한 소마토스태틴 유사체가 있다. 상기 출원에서 설명을 하고 있는 유사체 족에서 수용체 서브타입에 결합하는데 독특한 기여 또는 예상하지 못한 장점을 가지는 것은 없었다.
기본 구조가 고리를 만든 펩티드 유사체의 라이브러리
전술한 바와 같이, 선형 펩티드는 효능이 있는 약물로써 이용하는데에는 몇가지 심각한 단점을 가지는데, 이들인 생체에서 불안정하고, 이들의 수용체에 결합하는데 친화력이 부족하고, 한 종류의 수용체에 대해 선택성이 부족하고, 일반적으로 경구 생체이용성이 작다. 이와 같은 문제점을 극복하기 위해서는, 고리 펩티드, 신규한 생체중합체 및 새로운 분지형 올리고머 화합물을 만들기 위해 합성 펩티드 라이브러리와 연관되어 개발된 방법을 이용하는 것이 가능하다(Zuckermann, Current Opinion in Structural Biology 3, 580-584, 1993).
임의 전술한 고려사항이외에도, 고리 펩티드의 라이브러리를 만드는데에는 다량의 수득율을 가질 수 있는 고리화 반응 및 추가 조절을 최소화해야 한다. 불행하게도, 전통적인 고리화 반응은 예상 수득율에 대해 의존성이 매우 강하여 균일한 펩티드 혼합물을 만들 수 없다.
고형 서포트에서 직접 펩티드의 고리형성에 상당한 발전으로 합성 과정이 개선되었고, 공지의 고리화 반응에 기초하여 고리형성 반응이 자동화될 수도 있다. 과거에는, 고리형성 반응은 일반적으로 매우 희석된 용액하에서 실행하였다. 고분자-서포트된 고리형성 반응은 올리고머형성과 같은 곁반응을 피하게 하고, 생성물을 정제할 수 있게 한다. 예를 들면, 수지상에 고리형성 방법을 이용하여 티오에테르, 이황화결합으로 형성된 다리를 가지는 고리펩티드 또는 두개 측쇄사이에 락탐, 아미노단부와 측쇄간에 락탐, 아미노단부와 카르복시단부간에 락탐을 가지는 고리펩티드를 만든다(Zuckermann, Current Opinion in Structural Biology 3, ibid).
수지-결합된 고리 펩티드과 복합 라이브러리에서 자유 고리 펩티드를 이용하는 것에 대해서는 WO92/00091에서 설명을 하고 있다. 그러나, 이와 같은 고리 펩티드에는 임의 모양상의 억제 요소를 포함하지 않고 있으며, 고리를 형성한 경우에도, 이들 펩티드는 많은 모양을 채택하여 선형 펩티드가 가지는 동일한 단점을 가진다.
WO95/01800에서 설명을 하고 있는 고리형 반-무작위 펩티드 라이브러리는 하나이상의 무작위 아미노산과 인접한 아미노산 잔기의 베타 회전 각을 고정시키는 프롤린과 같은 아미노산형에서 모양상의 구속 요소를 포함하는 고리 펜타- 및 헥사-펩티드 라이브러리이다. 발명자는 이와 같은 모양상의 구속 요소의 장점을 강조한다. 그러나, 펩티드 서열에 특정 아미노산 잔기가 결합되어 이와 같은 구속 요소가 포함되면 수용체 인지에 요구되는 잔기 또는 다른 생물학적 활성에 요구되는 잔기에 결정적인 영향을 가질 것이다. 또한, 문헌에 따르면(WO95/01800), 고리형성 반응은 선형 펩티드의 단부 아미노기에 펩티드의 단부 카르복시 기가 결합되는 또 다른 형태의 결합반응일 뿐이라는 것이다.
발명의 요약
본 발명에 따르면, 알파 아미노산의 알파 질소에 부착된 연결기가 있는 새로운 빌딩 유닛에 결합되는 특징을 가지는 새로운 펩티드 모방물질을 만들었다.
이 방법의 가장 놀라운 장점은 다음과 같다; (1) 이 방법은 펩티드의 임의 측쇄를 손상시키지 않으면서 펩티드 서열을 고리형성하는 것이 가능하여, 생물학적 인지 및 기능에 필수적인 기능기를 손상하게 되는 가능성이 감소된다. (2) 이 방법은 연결 길이, 방향 및 결합 형태(가령, 아미드, 이황화물, 티오에테르, 티오에스테르,등) 및 고리에서의 결합 위치 등을 변형시켜 펩티드 모양을 최적화할 수 있다. (3) 활성을 알고 있는 선형 펩티드의 고리형성에 적용을 시켰을 때, 펩티드의 활성 부분과 이의 인지 수용체와의 상호작용을 최소화하는 방식으로 결합을 고안하는 것이다. 이는 인지 및 기능을 간섭하는 고리형성 기회를 감소시켜, 방사능활성 추적물질, 세포독성 약물, 빛을 포집하는 물질 또는 임의 다른 원하는 라벨등과 같은 꼬리를 부착하는데 적절한 부의를 만들 수 있다.
본 발명에 따라 설명되는 새로 만든 라이브러리는 작용제 또는 길항제로 역할을 하는 펩티드의 최적 기본구조 모양을 발견하기 위해 다양한 모양 및 유연성 정도(구속)를 변화시킬 수 있다. 이는 연결머리의 위치를 다양하게 하고(가령, 고리를 이루게되는 잔기가 서열에서의 위치), 그 길이, 방향, 이들 단위사이에 연결되는 형태등을 다양하게 하여 이룰 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 기본 구조를 고리화시킨 소마토스태틴 유사체를 제공하는 것인데, 이는 하기에서 설명하는 것과 같이 연결기에 결합된 펩티드 기본구조의 한개 질소 워자를 포함하는 펩티드 서열로 구성된다. 본 발명에서, 빌딩 유닛의 한개 이상의 쌍이 서로 결합되어 고리 구조를 이룬다. 따라서, 본 발명의 한 특징에 따르면, 기본구조를 고리화시킨 소마토스태틴 유사체는 다음의 일반 구조식 I을 가지는 것이다.
이때, a - c는 각각 1-8 또는 0이 되는 정수를 나타낸다; (AA)는 아미노산 잔기를 나타내는 것으로, 각 사슬에서 아미노산 잔기는 동일하거나 상이할 수 있다; Q는 H 또는 아실기를 나타내고; E는 하이드록시기, 카르복시 보호기 또는 아미노기 또는 CH2-OH로 환원된 말단 카르복시기가 되고; R1와 R2는 각각 특정 보호기에 결합된 아미노산 측쇄를 나타내고; 라인은 구조식 (i) -X-M-Y-W-Z-; 또는 (ii) -X-M-Z-의 연결 기를 나타내는데 이때, M과 W는 독립적으로 아미드, 티오에스테르, 이황화에서 선택되고; X, Y, Z는 각각 독립적으로 알킬렌, 치환된 알킬렌, 아릴렌, 호모- 또는 헤테로 사이클로알킬렌 및 치환된 사이클로알켈렌에서 선택된다.
특정 구체예에서, 구조식 I의 말단 카르복시기는 카르복시 말단 아미드로 대체되거나 또는 CH2OH로 환원된다.
본 발명의 또 다른 구체예는 일반 구조식 II 측쇄 고리를 형성한 소마토스태틴 유사체에 N-기본구조가 관련된다;
이때, d - f는 각각 1-8 또는 0이 되는 정수를 나타낸다; (AA)는 아미노산 잔기를 나타내는 것으로, 각 사슬에서 아미노산 잔기는 동일하거나 상이할 수 있다; Q는 H 또는 아실기를 나타내고; E는 하이드록시기, 카르복시 보호기 또는 아미노기 또는 CH2-OH로 환원된 말단 카르복시기가 되고; R1는 특정 보호기에 결합된 아미노산 측쇄를 나타내고; 라인은 구조식 (i) -X-M-Y-W-Z-; 또는 (ii) -X-M-Z-의 연결 기를 나타내는데 이때, M과 W는 독립적으로 아미드, 티오에스테르, 이황화에서 선택되고; X, Y, Z는 각각 독립적으로 알킬렌, 치환된 알킬렌, 아릴렌, 호모- 또는 헤테로 사이클로알킬렌 및 치환된 사이클로알켈렌에서 선택된다.
본 발명의 바람직한 구체예는 구조식 I과 II의 기본 구조에 고리형성된 소마토스태틴 유사체에 관계하는데, 이때 선은 구조식 -(CH2)x-M-(CH2)y-에서 연결 기를 나타내고; M은 아미드, 티오에테르, 티오에스테르 및 이황화물에서 선택되고; x 와 y는 각각 1 내지 10의 정수를 나타낸다.
더욱 바람직하게는 구조식 I 또는 II의 기본구조에 고리가 형성된 소마토스태틴 유사체가 되는데 이때, R1과 R2는 H이외의 다른 것 가령, CH3, (CH3)2CH-, (CH3)2CHCH2-, CH3CH2CH(CH3)-, CH3S(CH2)2-, HOCH2-, CH3CH(OH)-, HSCH2-, NH2C(=O)CH2-, NH2C(=O)(CH2)2-, NH2(CH2)3-, HOC(=O)CH2-, HOC(=O)(CH2)2-, NH2(CH2)4-, C(NH2)2NH(CH2)3-, HO-페닐-CH2-, 벤질, 메틸인돌, 메틸이미다졸이 된다.
본 발명의 또 다른 적절한 측면은 6번과 11번이 연결되고, 연결안된 페닐알라닌 측쇄는 남아있는 새로운 소마토스태틴 유사체를 만들기 위해 기본구조에 고리가 형성된 것에 관계한다. 이와 같은 구조의 안전성은 자연 소마토스태틴에 있는 Phe6, Phe11의 소수성 상호작용보다 더 견고한 것이고, 이는 Cys-Cys 이황화결합보다 환원/산화반응에 더욱 안정하다. 환언하면, 원래 Phe6와 Phe11중 하나 또는 둘다 보유하면서 안정된 공유 결합을 얻을 수 있다.
또한, 기본구조에 고리를 형성하는 것은 6번위치와 11번위치 뿐만아니라 Phe7-(D)Trp8-Lys9-Thr10의 활성 반응 내부에도 β-회전을 고정시켜 바람직한 모양의 한개고리 유사체를 만들거나 또는 매우 정확한 두개 고리 유사체를 만드는데 이용된다. 여기에서 다시, 약리학적으로 활성이 있는 아미노산 또는 측쇄는 그대로 남아있고 구조적으로 공간을 한정하는데 한개 변화가 있다.
여기에서 바람직한 기본구조에 고리형성된 펩티드 유사체에서 청구하고 이용된 것과 같이, 아미노산에 윗첨자는 고유 소마토스태틴에 있는 이들의 위치를 나타낸다.
좀더 바람직한 기본구조에 고리를 이룬 소마토스태틴 유사체는 다음의 구조식(Va)을 가진다;
가장 바람직한 유사체는 다음의 구조식(Vb)을 가진다;
이때, m 과 n은 1 내지 5이고; X는 카르복시 말단 아미드 또는 알코올을 나타내고; R5는 없거나 또는 Gly, (D)-또는 (L)-Ala, (D)- 또는 (L)-Phe, Nal, β-Asp(Ind)이고; R6와 R11는 각각 독립적으로 Gly 또는 (D)- 또는 (L)-Phe이고; R7는 Phe 또는 Tyr이고; R10는 없거나 Gly, Abu, Thr 또는 Val이고; R12는 없거나 또는 Val, Thr 또는 Nal이고, Y2는 아미드, 티오에테르, 티오에스테르 및 이황화물이다. 단고리 소마토스태틴 유사체의 경우에, 기본구조 고리형성은 Cys6-Cys11이황화결합으로 대체되어, 천연 소마토스태틴에 있는 것과 같이 페닐알라닌 측쇄는 남아있게 된다. 더욱 바람직한 유사체는 Phe7이 Tyr7로 치환되고, Thr10은 Val10으로 치환된 것이다.
위치 6과 11이외에 활성 부분안에 위치한 분자에 고정된 다른 바람직한 단고리 유사체는 다음의 구조식VI (a 와 b) 그리고 VII (a-c)이다;
이때, i와 j는 각각 1 내지 5이고; X는 카르복시 말단 아미드 또는 알코올을 나타내고; R5는 없거나 또는 (D)- 또는 (L)-Phe, Nal 또는 β-Asp(Ind)가 되고; R6은 (D) 또는 (L)-Phe이고; R10은 없거나 Gly, Abu 또는 Thr이고; R11은 (D)- 또는 (L)-Phe이고; R12은 없거나 Thr 또는 Nal이고, Y1는 아미드, 티오에테르, 티오에스테르, 이황화물에서 선택된다.
또 다른 적절한 유사체는 구조식 V에서와 같이 위치 6과 11에서 기본구조 고리형성이 되고, 구조식 VI와 VII에서 볼 수 있는 것과 같이 기본구조 고리형성되어 정확한 이중고리 유사체를 만든다.
또 다른 적절한 이중고리 유사체는 6번과 11번에 있는 아미노산이 이황화결합을 형성하기 위해 시스테인에 의해 대체되고, 구조식 VIII(a 와 b), IX (a 와 b)에서 한개의 기본구조 고리형성만 남게되는 것이 구조식 V-VII와의 다른 점이다.
이때, i와 j는 각각 독립적으로 1 내지 5가 되고; X는 카르복시 말단 아미드 또는 알코올이고; R5는 없거나 (D)- 또는 (L)-Phe, Nal 또는 β-Asp(Ind)이고; R6와 R11는 각각 Gly 또는 Phe이고; R10는 없거나 Gly, Abu 또는 Thr이고; R12는 없거나 Thr 또는 Nal이고; Y1은 아미드, 티오에테르, 티오에스테르 및 이황화물에서 선택된다.
본 발명의 가장 바람직한 구체예는 다음과 같다;
이때, X는 카르복시 말단산, 아미드, 에스테르, 알코올이다. 이들 두 가지 유사체는 특정 소마토스태틴 수용체 서브타입에 선택성으로 인하여 기대이상의 유용한 성질을 가진다.
좀더 바람직한 단고리 소마토스태틴 유사체는 활성 유사체의 라이브러리로 준비할 수 있는데, 이는 선택적인 구조를 스크린하는데 유용하다.
본 발명에 따른 또 다른 바람직한 소마토스태틴 유사체에는 구조식 X 내지 XIV의 조성물을 포함한다;
이때, i와 j는 각각 독립적으로 1 내지 5이고; X는 카르복시 말단 아미드 또는 알코올을 나타내고; R5는 (D)Phe 또는 2-Nal이고; R6는 Phe, Gly 또는 Ala이고; R7는 Tyr 또는 pClPhe이고; R10은 Thr, Val, Ser 또는 Abu이고; R11은 Phe, Gly or Ala이고; R12은 Thr, Val, 2-Nal 또는 (D)2-Nal이고; Y1은 아미드, 티오에테르, 티오에스테르 및 이황화물이다.
이때, i와 j는 각각 독립적으로 1 내지 5이고; X는 카르복시 말단 아미드 또는 알코올이고; R5은 (D)Phe 또는 (L)Phe, Ala 또는 Lys이고; R6는 없거나 Phe이고; R7는 Tyr 또는 Phe이고; R10는 없거나 또는 Thr, Val, Ser 또는 Abu이고; R11는 Phe, Gly 또는 Ala이고; R12는 Trp, Thr, Val, 2-Nal 또는 (D)2-Nal이고; Y1는 아미드, 티오에테르, 티오에스테르, 이황화물에서 선택된다.
이때, i와 j는 각각 독립적으로 1 내지 5이고; X는 카르복시 말단 아미드 또는 알코올이고; R5은 Phe, (L)2-Nal 또는 (D)2-Nal이고; R6는 Phe, Gly 또는 Ala이고; R7은 (D)Phe, pCl(D)Phe, pNH2Phe 또는 (D)Tyr이고; R10은 (D)Thr, (D)Val (D)Ala, (D)Leu 또는 (D)Glu이고; R11은 Phe, Gly 또는 Ala이고; R12은 없거나 또는 Thr 또는 Val이고; Y1는 아미드, 티오에테르, 티오에스테르, 이황화물에서 선택된다.
이때, i와 j는 각각 독립적으로 1 내지 5이고; X는 카르복시 말단 아미드 또는 알코올이고; R5는 없거나 또는 (D)Phe 또는 2-Nal이고; R6는 Phe, Gly 또는 Ala이고; R7는 (D)Phe, pCl(D)Phe, pNH2Phe 또는 (D)Tyr이고; R8는 (D) 또는 (L)Trp이고; R10는 (D)Thr, (D)Val, (D)Ala, (D)Leu 또는 (D)Glu이고; R11는 Phe, Gly or Ala이고; R12는 Thr, Val, Ala, β-Ala, (L)2-Nal 또는 (D)2-Nal이고; Y1는 아미드, 티오에테르, 티오에스테르, 이황화물에서 선택된다.
이때, i와 j는 각각 독립적으로 1 내지 5이고; X는 카르복시 말단 아미드 또는 알코올이고; R1은 Ala 또는 (D)2-Nal이고; R3은 Phe, Gly, Ala 또는 Lys이고; R4은 Lys 또는 Arg이고; R5은 (L)Asn 또는 (D)Asn이고; R7은 Phe, Gly, Ala 또는 Lys, 이고; Y1는 아미드, 티오에테르, 티오에스테르, 이황화물에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 특징은 다음의 일반 구조식의 고리 펩티드를 준비하는 방법에 관한 것이다;
이때, a-c는 각각 1-8 또는 0이 되는 정수를 나타낸다; (AA)는 아미노산 잔기를 나타내는 것으로, 각 사슬에서 아미노산 잔기는 동일하거나 상이할 수 있다; Q는 H 또는 아실기를 나타내고; E는 하이드록시기, 카르복시 보호기 또는 아미노기 또는 CH2-OH로 환원된 말단 카르복시기가 되고; R1내지 R4는 각각 특정 보호기에 결합된 아미노산 측쇄를 나타내고; 라인은 구조식 (i) -X-M-Y-W-Z-; 또는 (ii) -X-M-Z-의 연결 기를 나타내는데 이때, M과 W는 독립적으로 아미드, 티오에스테르, 이황화물에서 선택되고; X, Y, Z는 각각 독립적으로 알킬렌, 치환된 알킬렌, 아릴렌, 호모- 또는 헤테로 사이클로알킬렌 및 치환된 사이클로알켈렌에서 선택된다.
이 방법은 다음의 구조식(III)으로 된 아미노산 Nα-ω-기능화된 유도체가 펩티드 서열에 결합되어 펩티드 서열에서 아미노산 측쇄중 하나에 기능기가 선택적으로 고리를 형성하거나 또는 또 다른 ω-기능화된 아미노산 유도체에 적어도 한개의 기능기가 고리를 형성하는 단계로 구성된다;
이때, X 는 알킬렌, 치환된 알킬렌, 아릴렌, 사이클로알킬렌 및 치환된 사이클론알킬렌에서 선택되고; R1는 선택적으로 특정 보호기에 결합되어 있는 아미노산 측쇄이고; B는 알킬옥시, 치환된 알킬옥시 또는 아릴 카르보닐에서 선택된 보호기이고; G는 아민, 티올, 알코올, 카르복실산, 에스테르, 알데히드, 알코올, 알킬 할로겐화물에서 선택된 기능기이고; A는 G의 특정 보호기이고;
바람직한 빌딩 유닛은 공동 기능을 하는 아미노산 유도체로써, X는 알킬렌이고, G는 티올기, 아미노기 또는 카르복실기이고; R은 페닐, 메틸, 이소부틸이고; 조건은 G가 아민기일때, R은 H가 아니라는 것이다.
좀더 바람직한 것은 R이 특정 보호기로 보호된 ω-기능화된 아미노산 유도체이다.
더욱 바람직한 것은 구조식 III의 ω-기능화된 아미노산 유도체로써, 이때 G는 아미노기, 카르복실기 또는 티올기가 된다;
이때, X, R, A, B는 전술한 정의와 같다.
본 발명의 또 다른 측면에서는 새로운 기본구조에 고리를 형성한 소마토스태틴 유사체를 만드는 방법을 제공하는 것인데, 아미노산의 Nα-ω-기능화된 유도체가 펩티드 서열에 결합되고, 연속하여 펩티드 서열에 있는 아미노산의 측쇄중 한개에 기능기가 선택적으로 고리를 형성하거나 또는 또 다른 ω-기능화도니 아미노산 유도체와 기능기가 선택적으로 고리를 형성하는 단계로 구성된다. 본 발명의 기본구조 고리형성된 유사체를 제약학적 조성물로 이용하여, 수술후 통증, 모든 형태의 염증, 특히 췌장염증의 치료 방법, 암, 엔도크린 질환 및 위장 질환의 치료에 이용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가 목적은 여기에서 설명을 하고 있는 방법에 따라 준비되는 제약학적으로 활성이 있는 기본구조 고리형성된 펩티드 작용제 및 길항제와 제약학적으로 수용가능한 담체 또는 희석제로 구성된 제약학적 조성물 및 염증, 암 또는 엔도크린 질환 및 이와 함께 위장 질환을 치료하는 방법에 관계한다.
본 발명은 새로운 결합을 통하여 고리를 형성한 구조적으로 속박된 Nα기본구조의 고리형 소마토스태틴(somatostatin), 이와 같은 기본 구조의 고리형 펩티드 유사체를 준비하는 공정, 이와 같은 펩티드 유사체를 이용하는 방법 및 이를 포함하는 제약학적 조성물에 관계한다.
도 1은 기본구조에 고리가 형성된 소마토스태틴 유사체 PTR 3046의 농도에 따른 함수로써 상이한 SSTR 서브타입에 소마토스태틴(SRIF-14)이 결합되는 것을 방해하는 것을 그래프로 나타낸 것이다.
도 2은 기본구조에 고리가 형성된 소마토스태틴 유사체 PTR 3046, PTR 3040의 농도에 따른 함수로써 쥐 뇌하수체 AtT20 세포주에서 소마토스태틴 수용체에 소마토스태틴(SRIF-14)이 결합되는 것을 방해하는 것을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 쥐에서 성장 호르몬 방출시에 옥트레오티드 및 기본구조에 고리가 형성된 소마토스태틴 유사체 PTR 3046의 효과를 비교한 것이다.
도 4는 쥐에서 인슐린 방출시에 옥트레오티드 및 기본구조에 고리가 형성된 소마토스태틴 유사체 PTR 3046의 효과를 비교한 것이다.
도 5는 봄베신(bombesin) 유도후에 췌장 엑소크린 방출시에 옥트레오티드 및 기본구조에 고리가 형성된 소마토스태틴 유사체 PTR 3046의 효과를 비교한 것이다.
도 6은 MiaPaca-2 세포에서 성장 호르몬 방출시에 옥트레오티드 및 PTR 3046의 항-증식효과를 비교한 것이다.
여기에서 설명을 하고 있는 화합물은 비대칭 중심을 가질 수 있다. 본 발명에는 모든 키랄, 부분입체이성질체, 라셈체형을 포함한다. 올레핀 및 이와 유사한 것의 많은 구조 이성체가 본 발명의 화합물에 존재할 수 있고, 이와 같은 안정된 이성체는 본 발명에 포함된다.
"안정한 화합물" 또는 "안정한 구조"는 반응 혼합물로부터 유용한 순도로 분리할 때 살아남을 수 있을 정도의 충분한 강도를 가지고, 효과적인 치료제로 제조할 수 있는 화합물을 말한다.
여기에서 설명을 하고 청구하는 것과 같이, "알킬" 또는 "알킬레닐"은 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 분지쇄, 직쇄 포화된 지방족 탄화수소기를 포함하고; "알케닐"은 2개 내지 10개 탄소원자를 가지고, 사슬을 따라 임의 안정한 지점에서 발생할 수 있는 하나이상의 불포화 탄소-탄소결합을 가지는 직쇄 또는 분지쇄 모양의 탄화수소 가령 에테닐, 프로페닐등이 되고; "알키닐"은 2개 내지 10개 탄소원자를 가지고, 사슬을 따라 임의 안정한 지점에서 발생할 수 있는 하나이상의 불포화 삼중 탄소-탄소결합을 가지는 직쇄 또는 분지쇄 모양의 탄화수소 가령, 에티닐, 프로피닐등이 된다.
여기에서 설명되고, 청구되는 것과 같이, "아릴"은 임의 안정한 5 내지 7-구성원의 단고리 또는 이중고리 또는 7-14개 구성원의 이중고리 또는 삼중 탄소고리를 말하고, 이들중 임의의 것은 포화되거나 부분적으로 불포화되거나 방향족이 될 수 있는데 예를 들면, 페닐, 나프틸, 인다닐 또는 테트라하이드로나프틸 테트랄린등이 될 수 있다.
여기에서 설명되고, 청구된 것과 같이, "알킬 할로겐화물"은 1 내지 10개 탄소원자를 가지는 분지쇄 및 직쇄 포화된 지방족 탄화수소를 포함하는데, 이때 1 내지 3개 수소원자는 Cl, F, Br, I와 같은 할로겐 원자로 대체될 수 있다.
여기에서 설명되고, 청구된 것과 같이, "치료요법적으로 효과량"이란 염증, 암, 엔도크린 질환 및 위장관 질환등을 포함하나 이에 국한되지 않은 질환에 대해 원하는 결과를 얻기 위해 숙주에게 투여되는 새로운 기본구조에 고리를 형성한 펩티드 유사체 또는 이를 포함하는 조성물의 양을 의미한다.
여기에서 사용되고, 청구되는 "치환"이라는 용어는 지정된 원자에서 하나이상의 수소원자가 지정된 기에서 선택된 것으로 대체되는 것으로 단 지정된 원자의 정상적인 원자가를 초과해서는 안되며, 치환결과로 안정한 화합물이 되어야 한다.
여기에서 임의 구조식에서 1회이상 임의 변수(가령, R, X, Z,등)이 있을 경우에 각 발생지점에 있는 각 변수는 매 다른 발생 지점에서 정의된 것과는 독립적이다. 또한, 치환체와 변수가 복합되는 것은 이와 같은 복합으로 인하여 화합물이 안정화되는 경우에만 허용된다.
여기에서 사용된 "펩티드"에는 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 서열을 나타낸다. 본 발명의 소마토스태틴 펩티드 유사ㅔ는 4 내지 24개의 아미노산 잔기로 된 아미노산 서열, 바람직하게는 6 내지 14개 잔기로 된 아미노산 서열을 말하는 것으로, 이때 각 잔기는 아미노단부와 카르복시 단부를 가지는 것을 특징으로 한다.
"빌딩 유닛"은 일반 구조식 IV의 Nα유도된 α아미노산이 펩티드 서열에 결합되어 연속하여 기능기 G를 통하여 펩티드 서열에 있는 아미노산 측쇄중 하나와 고리를 형성하거나 또는 다른 ω-기능화된 아미노산 유도체와 고리를 형성한 것을 을 나타내는 것이다;
이때, X는 알킬렌, 치환된 알킬렌, 아릴렌, 호모- 또는 헤테로 사이클로알킬렌 및 치환된 사이클로알켈렌에서 선택된 스페이스기이고, R'는 특정 보호기에 선택적으로 결합된 아미노산 측쇄이고; G는 아민, 티올, 알코올, 카르복실산, 에스테르에서 선택된 기능기이다.
이와 같은 빌딩 유닛을 만드는 방법은 PCT/IB95/00455에서 설명을 하고 있으며, 이는 참고문헌으로 전문 첨부된다. 빌딩 유닛은 상응하는 변형 아미노산의 삼문자 코드에 연속하여 반응기의 형태(가령, 아민의 경우는 N. 카르복실의 경우에는 C)와 스페이스 메틸렌기의 수를 나타내는 약어로 표시를 한다. 예를 들면, Gly-C2는 카르복실 반응기에 변형된 Gly 잔기와 두개의 탄소 메틸렌 스페이스가 있다는 것을 나타내고, Phe-N3은 아미노반응기에 변형된 페닐알라닌 기가 세개의 탄소 메틸렌 스페이스를 가진다는 것을 나타낸다.
여기에서 사용된 것과 같이, "선형 펩티드"는 임의 빌딩 유닛없이 아미노산 잔기만으로 구성된 펩티드 서열을 말하는 것이다.
여기에서 사용된 것과 같이, "기본구조 고리형 펩티드" 적어도 하나의 빌딩 유닛을 포함하는 선형 펩티드 유사체로써, 이때 빌딩 유닛은 펩티드 기본구조의 알파 질소를 통하여 또 다른 빌딩 유닛에 연결되거나 서열에 있는 또 다른 아미노산에 연결된 다리형을 가진다. 여기에서 이용된 것과 같이 "프레(pre)-고리형 펩티드"는 새물학적 또는 다른 스크리닝 검사동안에 기준으로 작용하기 위해 고리형성이 안된 형태를 보유하는 것이외에는 고리형 유사체와 동일한 유사체를 말한다. 여기에서 사용된 고리가 아닌 형태(non-cyclic)란 프레-고리형과 상호 교환하면서 사용할 수 있다. 여기에서 사용된 특정 약어는 본 발명을 설명하고, 이를 만들고 이용하는 것을 설명하기 위해 사용된 것이다. 가령, AcOH는 아세트산을 의미하고, Ada는 아다만탄아세틸(adamantanacetyl)을 말하고, Adac는 아다만탄카르보닐을 말하고, Alloc는 알릴옥시카르보닐을 말하고, Boc는 t-부틸옥시카르보닐 라디칼을 말하고, BOP는 벤조트리아조일-1-일옥시-트리스-(디메틸아미노)포스포니움 헥사플로로포스페이트를 말하고, BSA는 소 혈청 알부민을 말하고, Cbz는 카르보벤질옥시 라디칼을 말하고, DCC는 디사이클로헥실카르보디이미드를 말하고, DCM는 디클로로메탄을 말하고, Dde는 1-(4,4-디메틸 12,6-디옥소사이클로헥스-1-일리덴-에틸)을 말하고, DIEA는 디이소프로필-에틸 아민을 말하고, DMF는 디메틸 포름아미드를 말하고, DPPA는 디페닐포스포릴 아지드를 말하고, Dtc는 5,5-디메틸티아졸리딘-4-카르복실산을 말하고, EDC는 N-에틸-N'(디메틸아미노프로필)-카르보디이미드를 말하고, EDT는 에탄에디티올을 말하고, Fmoc는 플로레닐메톡시카르보닐 라디칼을 말하고, GPI는 기니아 피그의 회장을 말하고, HATU는 [O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3-3-테트라메틸 우로니움 헥사플로오르포스페이트를 말하고, HBTU는 하이드록시벤즈트리아졸일테트라메틸-우라니움 헥사플로오르포스페이트를 말하고, HF은 하이드로플로오르산을 말하고, HOBT는 1-하이드록시벤조트리아졸을 말하고, HPLC는 고압 액상 크로마토그래피를 의미하고, MALDI-TOF MS는 매트릭스에 의한 레이져 탈락을 말하고, Mts는 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐을 말하고, NBT는 니트로 블루 테트라졸리움을 말하고, NMM은 N-메틸몰포린을 말하고, NMP는 1-메틸-2-피롤리돈을 말하고, PBS는 인산완충염을 말하고, Pmc는 펜타메틸크로만-6-설포닐을 말하고, PNPP는 p-니트로페닐 포스페이트를 말하고, PPA는 1-프로판포스포린산 고리혀 무수물을 말하고, PyBOP는 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포니움 헥사플로오르포스페이트를 말하고, PyBrOP는 브로모-트리스-피롤리디노-포스포니움 헥사플로오르포스페이트를 말하고, RT는 실온을 의미하는 것이고, SMPS는 동시에 다중 펩티드 합성을 의미하는 것이고, SRIF는 소마토스태틴 방출 저해 인자를 의미하는 것이고, TBTU는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우라니움 테트라플로오르보레이트를 말하는 것이고, t-Bu는 4차 부틸 라디칼을 의미하고, TFA는 트리플로오르아세트산을 말하고, TIS는 트리이소프로필실란을 말하고, TIS는 트리이소프로필실란을 말하고, Tpr은 티아졸이딘-4-카르복실산을 말하고, Trt는 티리틸을 말하고, Ts는 톨루엔설포닐을 말한다.
본 발명에서 이용한 아미노산은 시판되는 것이나 또는 일상적인 합성 방법을 이용하여 합성할 수 있다. 특정 잔기를 펩티드내에 결합시키는데에는 특정 방법이 요구되고, 펩티드 서열에 대해 연속적인, 다양한 집중적인 합성 방식이 본 발명에 유용하다. 자연 코드 아미노산 및 이의 유도체는 IUPAC 협의에 따라 3문자 코드로 나타내었다. 다른 언급이 없는 한, L 이성체를 이용하였다. D 이성체는 잔기의 약어 앞에 "D"로 나타내었다. 코드에 없는 아미노산은 다음과 같다; Abu는 2-아미노부틸산이고; Aib는 2-아미노-이소부틸산이고; Cha는 사이클로헥실알라닌을 말하는 것이도; Hcys는 호모시스테인을 말하고; 1Nal는 1-나프틸알라닌이고; 2Nal는 2-나프틸알라닌을 말하는 것이고; Nva는 노르발린이고; Oic는 옥타하이드로인돌카르복실산이고; Phg는 페닐글리시이고; pClPhe는 p-클로로-페닐알라닌이고; pFPhe는 p-플로오르-페닐알라닌이고; pNO2Phe는 p-니트로-페닐알라닌이고; Thi는 티에닐알라닌이다.
합성 방법
본 발명에 따르면, 새로운 비-펩티드 결합을 만들기 위해 아미노산의 알파 질소에 부착된 연결기를 통하여 펩티드 유도체는 고리를 형성한다. 일반적으로 이들 빌딩 유닛으로부터 이와 같은 펩티드 유사체를 만드는데 이용되는 과정은 공지의 펩티드 합성 원리에 의존하는데, 가장 통상적으로는 이와 같은 과정은 고형 상 펩티드 합성의 공지 원리에 따라 실행한다. 본 발명은 펩티드 서열에 있는 하나이상의 아미노산에 다음의 일반 구조식을 가지는 새로운 빌딩 유닛을 대체하는 것을 요구한다.
이때, R은 아미노산의 측쇄이고, X는 스페이스기이고, G는 기능기로 이에 의해 고리형성이 영향을 받는다. 측쇄 R은 임의 자연 또는 합성 아미노산의 측쇄로써 이는 선택된 펩티드 서열에 결합되도록 선택되는 것이다. X는 펩티드 유사체의 적절한 구조적인 구속을 얻기 위해 유연정도를 크게하거나 또는 적게하기위해 선택되는 스페이스기이다. 이와 같은 스페이스기에는 알킬렌 사슬, 치환된, 분지형, 불포화된 알킬렌, 아릴렌, 사이클로알킬렌, 불포화된 치환 사이클로알킬렌등을 포함한다. 또한, X과 R은 복합되어 헤테로사이클로 구조를 만들 수 있다.
본 발명의 적절한 구체예에서는 두개 내지 10개 탄소원자를 포함하는 알킬렌 사슬을 이용한다.
펩티드 유사체의 고리형성에 이용될 수 있는 말단(ω) 기능기는 다음을 포함하나 이에 국한하지는 않는다;
a. 아민; 이는 활성화된 카르복실 기, 알데히드, 케톤(연속적인 환원 유무하에), 알킬 또는 치환된 알킬 할로겐화물과 같은 친전자성 반응용.
b. 알코올; 활성화된 카르복실기와 같은 친전자성과 반응용.
c. 티올; 활성화된 카르복실기, 알킬 또는 치환된 알킬 할로겐화물과 같은 친전자성과 반응 및 이황화결합을 형성하기 위한 용도.
d. 1,2 디올 및 1,3 디올; 아세탈 및 케탈을 형성하기 위한 용도.
e. 알킨 또는 치환된 알킬; 아민, 티올 또는 카르바니온과 같은 친핵성; 자유 라디칼; 알데히드 및 케톤, 알킬 또는 치환된 알킬 할로겐화물과 같은 친전자성; 또는 유기금속 복합체와의 반응용;
f. 카르복실산 및 에스테르; 아민, 알코올, 티올과 같은 친핵성(사전 활성화반응 유무하에)과의 반응용.
g.알킬 또는 치환된 알킬 할로겐화물 또는 에스테르; 아민, 알코올, 티올, 카르바니온(아세토아세테이트 또는 말로네이트와 같은 활성 메틸렌기로부터)와 같은 친핵성물질과의 반응; 알켄 또는 치환된 알켄, 알킬렌 또는 치환된 알킬렌과 같은 연속 반응을 위한 자유 라디칼 형성용.
h. 알킬 또는 아릴 알데히드 및 케톤; 아민(연속적인 환원반응 유무하에), 카르바니온(아세토아세테이트 또는 말로네이트와 같은 활성 메틸렌기로부터), 디올(아세탈 및 케탈을 형성하기 위함)과 같은 친핵성 물질과의 반응용.
i. 알켄 또는 치환된 알켄; 아민, 티올, 카르바니온, 자유 라디칼 또는 유기금속 복합체와 같은 친핵성물질과의 반응용.
j. 활성 메틸렌기 가령, 말로네이트 에스테르, 아세토아세테이트 에스테르, 알데히드, 케톤, 알킬 또는 치환된 알킬 할로겐화물과 같은 친전자성물질과 반응하는 다른 물질.
펩티드를 합성하는 동안에 이들 반응 말단기 및 임의 반응성이 있는 측쇄는 적절한 보호기로 보호를 해야한다는 것은 인지할 것이다.
아민에 대한 적절한 보호기는 알킬옥시, 치환된 알킬옥시, 아릴옥시 카르보닐인데 예를 들면, 3차 부틸옥시카르보닐(Boc), 플로로레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc), 아릴옥시카르보닐(Alloc), 벤질옥시카르보닐(Z)등이 되나 이에 한정하지는 않는다.
고리를 형성하기 위한 카르복실 말단기는 이들 알킬 또는 치환된 알킬 에스테르 또는 티오 에스테르 또는 아릴 또는 치환된 아릴 에스테르 또는 티오 에스테르로 보호될 수 있다. 예를 들면, 3차 부틸 에스테르, 아릴 에스테르, 벤질 에스테르, 2-(트리메틸실릴)에틸 에스테르 및 9-메틸 플로레닐등을 포함하나 이에 한정하지는 않는다.
고리를 형성하기 위한 티올 기는 이들의 알킬 또는 치환된 알킬 티오 에테르 또는 이황화물 또는 아릴 또는 치환된 아릴 티오 에테르 또는 이황화물로 보호받을 수 있다. 이와 같은 기에는 3차 부틸, 트리틸(트리페닐메틸), 벤질, 2-(트리메틸실릴)에틸, 픽실(9-페닐산텐-9-일), 아세타아미드메틸, 카르복시메틸, 2-티오-4-니트로피리딜등을 포함하나 이에 국한하지는 않는다.
당업자는 이들을 선택적으로 제거를 하기위해서 상이한 보호기에 의해 이와 같은 다양한 반응 기를 보호할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 특정 아미노산은 펩티드 서열에서 이에 인접하는 부분에 결합이 될 수도 있는데, Nα는 보호 기 A에 의해 보호를 받을 수 있다. 아미노산이 반응식에서 고리형성을 위한 말단기로 이용되는 경우에, Nω는 보호기 B에 의해 보호를 받거나 또는 임의 리신에 있는 ε아미노기는 보호기 C등에 의해 보호를 받는다.
다른 아미노산에 아미노산이 결합되는 것은 펩티드 합성 분야에 공지된 일련의 반응에 의해 실행할 수 있다. 본 발명의 신규한 빌딩 유닛 즉, Nα-ω기능화된 아미노산 유도체는 펩티드 서열에 결합되어 아미노산중 하나이상과 대체한다. 이와 같은 Nα-ω기능화된 아미노산 유도체가 한개만 선택된 경우에, 서열에서 또 다른 아미노산의 측쇄에 고리를 형성할 수 있다. 예를 들면, (a) Nα-(ω- 아미노 알킬렌) 아미노산은 아스파르트산 또는 글루타민산 잔기의 카르복실기에 결합될 수 있고; (b) Nα-(ω-카르복실 알킬렌)아미노산은 리신 잔기의 ε-아미노기에 연결될 수 있고; (c) Nα-(ω-티오 알킬렌) 아미노산은 시스테인 잔지의 티올기에 연결될 수 있다. 본 발명의 좀더 바람직한 구체예는 이와 같은 두개의 Nα-ω기능화된 아미노산 유도체가 결합되어 이들은 다른 것에 연결되어 N-기본구조에 N-기본구조가 고리를 만든 펩티드 유사체를 형성한다. 이와 같은 빌딩 유닛 세개 이상이 펩티드 서열에 결합되어 하기에서 상술하게 되는 이중-고리 펩티드 유사체를 만든다. 따라서, 펩티드 유사체는 N-기본구조에 대해 N-기본구조의 고리 형성, 측쇄에 기본구조의 고리 형성 또는 임의 다른 펩티드 고리형성등을 포함하는 두개 이상의 고리형성 구조를 만들게 된다.
전술한 것과 같이, 새로운 빌딩 유닛으로 본 발명의 소마토스태틴 유사체를 만드는데 이용되는 공정은 공지의 펩티드 합성 원리에 일반적으로 의존한다. 그러나, 본 발명의 좀 큰 빌딩 유닛에 적합한 과정이 필요하다는 것인 인지할 것이다. 고형성 펩티드 화학에 아미노산을 결합시키는 것은 디사이클로헥시카르보디이미드(DCC), 비스(2-옥소-3 옥사졸리디닐)포스피닌 클로라이드(BOP-Cl), 벤조트리아졸일-N-옥시트리스디메틸-아미노포스포니움 헥사플로오르 포스페이트(BOP), 1-옥소-1-클로로포스포란(Cpt-Cl), 하이드록시벤조트리아졸(HOBT) 또는 이의 혼합물을 포함하나 이에 국한시키지 않는 결합제에 의해 이루어진다.
본 발명의 큰 빌딩 유닛에 연속하여 아미노산이 결합하는데에는 추가 결합 시약을 이용해야 하는데, 이와 같은 결합 시약으로는 PYBOPⓡ(벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포니움 헥사플로오르포스페이트), PyBrOPⓡ(브로모-트리스-피롤리디노-포스포니움 헥사플로오르포스페이트), HBTU(2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우라니움 헥사플로오르-포스페이트), TBTU(2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우라니움 테트라플로오르보레이트)등을 포함하나 이에 국한하지는 않는다.
새로운 결합 화학물질이 이용될 수 있는데, 가령, 미리 형성된 루레탄-보호된 N-카르복시 무수물(UNCA'S), 미리 형성된 아실 할로겐화물, 가장 바람직하게는 염화 아실물이 된다. 이와 같은 결합은 실온에서 또는 상승된 온도에서 톨루엔, DCM(디클로로메탄), DMF(디메틸포름아미드), DMA(디메틸아세타아미드), NMP(N-메틸 피롤리돈) 또는 상기 혼합물과 같은 용매하에서 발생한다.
본 발명은 한 가지 목적은 일반 구조식(I)의 기본구조에 고리를 형성한 소마토스태틴 유사체를 만드는 방법을 제공하는데;
이때, 치환체는 전술한 것과 같고,
이 방법은 다음과 같다;
(i) 다음 구조식(III)의 아미노산의 Nα-ω-기능화된 유도체 적어도 두개를 아미노산 서열에 결합시켜, 다음 구조식(IV)의 화합물을 만들고;
이때, X는 일킬렌, 치환된 알킬렌, 아릴렌, 사이클로알킬렌, 치환된 사이클로알킬렌에서 선택된 스페이스기이고; R'는 H, CH3등과 같은 아미노산 측쇄이고, 이는 선택적으로 특정 보호기에 결합되어 있고; B는 알킬옥시, 치환된 알킬옥시, 아릴옥시 카르보닐에서 선택된 보호기이고; G는 아민, 티올, 알코올, 카르복실산, 에스테르, 알데히드, 알코올, 알킬 할로겐화물에서 선택된 기능기이고; A는 G의 특정 보호기이다.
ii) 보호기 A와 A'를 선택적으로 제거하고, 말단 기 G와 G'와 반응을 시켜 다음의 구조식(I)의 화합물을 만들고;
이때, d, e, f는 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수이고; (AA)는 아미노산 잔기로, 각 사슬에 있는 아미노산 잔기는 동일하거나 상이할 수 있고; E는 하이드록시 기, 카르복실 보호기 또는 아미노기이고; R 과 R'는 각각 독립적으로 H, CH3,등과 같은 아미노산 측쇄이고; 선은 구조식 -X-M-Y-W-Z-의 연결기를 나타내고;
이때, M과 W는 각각 독립적으로 이황화물, 아미드, 티오에테르, 이민, 에테르, 알켄에서 선택되고; X, Y, Z는 각각 독립적으로알킬렌, 치환된 알켈렌, 아릴렌, 사이클로알켈렌, 치환된 사이클로알켈렌에서 선택된다.
iii) 모든 남아 있는 보호기를 제거하여 구조식(Ia)의 화합물을 만든다.
두개 고리 유사체는 단계 (ii)와 (iii)을 반복하는 동일한 방식으로 준비할 수 있다. 다른 잔기에 고리를 형성하는 잔기를 결정하는 것은 차단기를 선택함으로써 만들 수 있다. 다양한 차단기는 선택적으로 제거하고, 고리형성을 위해 선택된 반응기에 노출시킨다.
구조식(I)의 기본구조에 고리가 형성된 펩티드 유사체를 준비하는 방법이 바람직한데, 이때 G는 아민, 티올, 카르복실산이고, R과 R1는 H이외의 다른 것 가령, CH3, (CH3)2CH-, (CH3)2CHCH2-, CH3CH2CH(CH3)-, CH3S(CH2)'2-, HOCH2-, CH3CH(OH)-, HSCH2-, NH2C(=O)CH2-, NH2C(=O)(CH2)2-, HOC(=O)CH2-, HOC(=O)(CH2)2-, NH2(CH2)4-, C(NH2)2NH(CH2)3-, HO-페닐-CH2-, 벤질, 메틸인돌, 메틸이미다졸등이고, 이때 E는 불용성 고분자 서포트에 공유 결합된 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 구조식(II)의 기본구조에 고리를 형성한 펩티드 유사체를 준비하는 방법이다;
이때, 치환체는 상기 정의된 바와 같다; 방법은 다음의 단계로 구성된다; 일반 구조식(III)의 적어도 한개의 ω-기능화된 아미노산 유도체를 펩티드 서열에 결합을 시키고, 연속하여 펩티드 서열에 있는 아미노산 측쇄중 하나와 기능기를 선택적으로 고리화시키는 것이다.
이때, X는 일킬렌, 치환된 알킬렌, 아릴렌, 사이클로알킬렌, 치환된 사이클로알킬렌에서 선택된 스페이스기이고; R는 H, CH3등과 같은 아미노산 측쇄이고, 이는 선택적으로 특정 보호기에 결합되어 있고; B는 알킬옥시, 치환된 알킬옥시, 아릴옥시 카르보닐에서 선택된 보호기이고; G는 아민, 티올, 알코올, 카르복실산, 에스테르, 알데히드, 알코올, 알킬 할로겐화물에서 선택된 기능기이고; A는 G의 특정 보호기이다.
구조식(II)의 기본구조에 고리가 형성된 펩티드 유사체를 준비하는 방법이 바람직한데, 이때 G는 아민, 티올, 카르복실산이고, R과 R1는 H이외의 다른 것 가령, CH3, (CH3)2CH-, (CH3)2CHCH2-, CH3CH2CH(CH3)-, CH3S(CH2)'2-, HOCH2-, CH3CH(OH)-, HSCH2-, NH2C(=O)CH2-, NH2C(=O)(CH2)2-, HOC(=O)CH2-, HOC(=O)(CH2)2-, NH2(CH2)4-, C(NH2)2NH(CH2)3-, HO-페닐-CH2-, 벤질, 메틸인돌, 메틸이미다졸등이고, 이때 E는 불용성 고분자 서포트에 공유 결합된 것이다.
측쇄에 기본구조가 고리를 형성한 펩티드의 제조
워하는 기본구조에 고리를 이룬 펩티드를 만드는 한 가지 적절한 방법은 고형성 서포트에 선형 펩티드를 합성하고, 고형 소포트에 또는 서포트를 제거한 후에 펩티드의 기본구조를 고리화하는 단계로 만드는 것이다. C- 말단 아미노산은 카르복실산 에스테르 또는 아미드와 같은 다른 연결기에 의해 불용성 고분자 서포트에 공유결합된다. 이와 같은 서포트의 예로는 폴리스티렌-co-디비닐 벤젠 수지이다. 이용된 고분자 서포트는 Fmoc, Boc와 같은 화학물질과 필적하는 것으로 PAM 수지, HMP 수지 및 클로로메틸화된 수지등을 포함한다. 수지에 결합된 아미노산은 TFA등으로 보호를 제거하고, BOP와 같은 결합 시약을 이용하여 Fmoc에 의해 Nα에서 보호된 제 2 아미노산에 결합된다. 제 2 아미노산은 피페리딘 20%/DMF 용액을 이용하여 탈보호시킨다. 연속하여 실온에서 보호된 아미노산을 결합시킬 수 있고, 탈보호시킬 수 있다. 펩티드를 제공하기 위해 탈보호 및 결합 과정을 몇회 반복한 후에, 카르복시 측쇄를 가지는 아미노산을 원하는 펩티드에 결합시킨다. 이와 같은 아미노산중 하나는 Fmoc-아스파르트산 t-부틸 에스테르이다. NαFmoc 보호기의 탈보호후에, 펩티드는 당분야에 공지의 방법으로 연장시킨다. 탈보호후에, 기본구조의 고리화반응을 위한 빌딩 유닛은 결합 시약 BOP등을 이용하여 펩티드 수지에 결합을 시킨다. 이와 같은 빌딩 유닛중 하나는 Fmoc-Nα-(ω-Boc-아미노 알킬렌)아미노산이다. 탈보호후에, 펩티드는 공지의 방법으로 원하는 길이로 연장을 시킨다. PyBrOP와 같은 결합 시약으로 빌딩 유닛에 보호된 아미노산을 결합시켜 수득율을 높인다. 선형의 수지에 결합된 펩티드를 준비한 후에, TFA와 같은 약산을 이용하여, Boc 및 t-Bu을 제거한다. 일부는 고리화반응제로써 TBTU/DMF를 이용하여 수지상에서 고리화반응을 시켜, 고리화반응율을 높이고, 측쇄에 N-기본구조가 고리를 형성된 펩티드 수지를 제공한다. 수지에서 고리화반응을 한 후에, 피페리딘과 같은 물질을 이용하여 말단 아미노 보호기를 제거하고, HF와 같은 강산으로 처리를 한 후에 측쇄에 기본구조가 고리를 형성한 펩티드를 얻는다. 또는, 수지로부터 기본구조에 고리를 이룬 펩티드를 제거하기 전에, 말단 아미노기는 아세트산 무수물, 벤조익 무수물과 같은 시약으로 아실반응을 하거나 또는 BOP와 같은 결합제에 의해 활성화된 아다만틸 카르복실산과 같은 다른 산에 의해 아실반응을 하여 차단시킨다.
펩티드-수지의 또 다른 부분은 고리화반응에 이용되는 측쇄 가령 ω-아미노산 카르복시기를 보호한다. 이는 Ac2O 와 DMAP/DMF 와 ω-아미노기를 반응시키고, DIC와 HOBT에 의해 자유 ω-카르복시기를 활성화시켜, 활성 에스테르를 제공하고, 이는 CH3NH2와 반응하여, 고리 펩티드의 비-고리 유사체를 만든다. 수지로부터 펩티드를 제거하고, HF와 같은 강산에 의해 측쇄 보호기를 연속하여 제거하면, 측쇄에 기본구조가 고리형성한 펩티드의 비-고리형 유사체를 얻는다.
선형/또는 비-고리형 유사체는 이에 상응하는 고리 화합물의 생물학적 활성에 대해 기준 화합물로 이용된다.
기본구조에 고리를 형성한 소마토스태틴 라이브러리를 만드는 합성 방법
본 발명의 고리형 펩티드 라이브러리를 준비하는 일반적인 방법은 직교 보호 과정을 이용하여 고형상 펩티드 합성에 관계하는 것으로 이는 사슬 연장, 보호기의 선택적인 제거, 보호된 펩티드의 고리화반응, 수지로 부터 절단하거나 절단하지 않고 모든 측쇄 보호기의 제거를 할 수 있다. 라이브러리에 다양한 펩티드 서열이 동량 존재하는 것이 바람직하다.
결합 반응은 아미드 또는 에스테르 결합을 만들기 위한 방법으로 실행하는데, 이는 여기에서 설명하는 당분야에 친숙한 방법으로 실행할 수 있다. 일반적인 결합 시약은 카르보디이미드, 활성화된 무수물, 에스테르, 아실 알로겐화물이 된다. EDC, DCC, DPPA, PPA, BOP, PyBOP, PyBrop, HATU, HBTU, TBTU, HOBT, N-하이드록시숙시니미드와 같은 시약이 일반적이다.
임의 과정에 의해 고형성 펩티드 연장이 완료된 후에, 펩티드의 일부는 빌딩 유닛의 기본구조 아민 결합 질소에 부착된 연결기를 통하여 고리화반응을 한다. 일부분은 고리를 형성하지 않은 형으로 유지되어, 생물학적 또는 다른 스크리닝 검사동안에 기준으로 사용하는 것이 바람직하다. 기본구조 고리형 라이브러리의 빌딩 유닛과 실제 동일한 빌딩 유닛을 포함하나, 기본구조 고리형 라이브러리의 구조적인 구송모양이 없는 펩티드 유사페 라이브러리 일부분은 "프레-고리형(pre-cyclic)"이라고 칭한다. 또는, 임의 합성 과정에서, 기본구조 고리화반응 단계를 실행하거나 아미노산 잔기의 추가 결합 과정을 실행할 수 있다.
펩티드의 일부분은 수지로부터 절단하여, 생물학적 활성 검사전에 요구되는 것과 같이 보호기를 제거한다. 당분야에 공지의 방법으로 수지 서포트로부터 ㅔㅂ티드를 절단하고, 정확한 방법은 수지의 특징에 따라 달라진다. 당업자는 특정 보호기를 제거하는 것은 수지로부터 펩티드를 제거하는 것과 동시에 발생될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
일반적으로 수지와 제 1 아미노산사이에 결합이 에스테르 결합을 형성하여, 이는 수지로부터 절단될 때 펩티드에 있는 카르복실 산기를 만들게 된다. HMPB, Rink, PAM, Hycram, 하이드록시메틸 수지를 예로 들 수 있다. 또한, 카르복시 말단 아미노산이 아미드, 에스테르로 변환시키거나 또는 말단 알코올로 환원될 수 있다.
각 아미노산 또는 펩티드의 측쇄의 반응성이 있는 기능기는 펩티드 분야에 공지된 바와 같이 적절하게 보호를 할 수 있다. 예를 들면, Boc, Cbz, Fmoc기를 이용하여 아미노기 특히, α-아미노기를 보호할 수 있다. 알킬(가령, t-Bu, Me), cHex, 벤질 또는 아릴 에스테르를 이용하여 Asp 또는 Glu의 측쇄 카르복실을 보호할 수 있다. 벤질, 적절하게 치환된 벤질, 트리틸, Alloc 또는 T-Bu기를 이용하여 시스테인의 멀캅토기; 또는 다른 잔기를 포함하는 티올; 또는 Tyr, Ser 또는 Thr의 하이드록실기를 보호한다. Cys 및 다른 황을 포함하는 아미노산은 Acm 기에 의해 보호를 받을 수 있고 또는 티오알킬(가령, 에틸 멀캅탄) 또는 티오아일기와 이황화물을 형성하여 보호를 받을 수 있다. 벤질/벤질옥시메틸 또는 적절하게 치환된 벤질/벤질옥시메틸, Boc 또는 포르밀기를 이용하여 His의 이미다졸기를 보호하고; Pmc, 니트로 또는 다른 적절하게 치환된 벤젠-설포닐기(가령, Ts, Mts)를 이용하여 구아니디노 질소 또는 Arg을 보호한다. 프탈아미도, Boc, Fmoc, Alloc 카르보벤질옥시 또는 벤질기 또는 다른 적절하게 치환된 벤질 또는 벤질옥시기를 이용하여 리신의 ε-아미노기를 보호할 수 있다. 카르보벤질옥시 또는 벤질 보호기를 적절하게 치환하는 경우에는 1 내지 5개 염소, 브롬, 니트로, 메톡시 또는 메틸기(통상 오르소 또는 파라)로 치환되고, 이를 이용하여 보호기의 반응성을 변형시킬 수 있다. 이와 같은 보호기는 촉매 수소화반응, 액체 암모니아에 나트륨, 하이드라진, 염기, TFA 또는 HF 처리등의 공지의 방법으로 제거할 수 있다. 측쇄 보호기가 선택되면, 펩티드 사슬의 펩티드 기본구조를 만들기 위한 결합반응에서 이용되는 반응성이 있는 기능기(가령, α-아미노기)를 탈보호하는데 이용된 조건하에서는 제거되지 않는다. 반응성이 있는 기능기의 보호기는 연속하여 아미노산의 결합전에 제거한다.
직교 보호 과정을 이용하는 본 발명에 따라 빌딩 유닛(구조식 IV에서 G)의 연결기를 이용하는데, 이와 같은 보호기는 측쇄에 있는 보호기 또는 수지로부터 펩티드를 제거하는데 영향을 주지 않는 조건하에서 선택적으로 제거한다. 이로써, 합성된 구지로부터 기본구조의 고리화반응이 가능하게 한다. 또는, 수지로부터 완전하게 보호된 펩티드를 제거할 수 있고, 빌딩 유닛의 보호기를 선택적으로 제거한 후에 용액에서 고리화반응을 실행할 수 있다.
고리화반응은 한 개의 빌딩 유닛을 또 다른 빌딩 유닛 또는 아미노산 측쇄에서 연결기에 선택적으로 결합을 시켜 실행을 한다. 예를 들면, PyBOP는 아미드 결합을 형성하는 경우에 결합 반응을 실행하는데 특히 유용한 시약이다. 이황화결합을 만들기 위해서는 산화 조건을 이용한다.
본 발명에 따른 가장 적절한 구체예에서, 아미노산 서열 골격은 소마토스태틴 활성을 가지는 천연 또는 합성 펩티드로부터 공지의 활성 서열에 기초한다. 또한 활성 규칙의 엄격한 상태에서 이와 같은 공지의 서열의 활성을 개선시키는 것이 추가로 가능하다.
특정 위치에서의 아미노산은 기본구조-고리형성 빌딩 유닛으로 대체되거나 또는 Asp, Glu, Cys, Hcys, Lys, Orn와 같은 자연상태의 삼가기능성 아미노산 또는 이의 D-짝으로 대체될 수 있다. 따라서, 고리화반응의 위치를 변화시키고, 기본구조에 고리 연결을 변화시키고, 고리화반응에서 chirality를 변화시키거나, 고리 형성 결합을 변화시키거나, 고리 크기, 및 고리내에 결합의 정확한 정치 등을 변화시켜 위치 뿐만아니라 구조 스캔을 할 수 있다. 이와 같은 변수들은 펩티드의 아미노산 서열을 변화시키면서 같이 실행을 할 수 있다.
소마토스태틴 유사체 라이브러리의 일반적인 합성
최적의 화합물을 결정하기 위해서, 상이하게 구속한 유사체 라이브러리를 만들고 그다음 스크리닝한다. 통상적인 고형-상 펩티드 합성(당분야에 공지되어 있슴)을 이용하여 TentaGel 아미드 수지(치환수준은 0.2-0.3 mmol/g)에서 합성하였다. 대부분의 경우에 NMP를 용매로 이용하고, 극소수의 경우에 DMF를 이용한다. 합성 규모는 라이브러리 또는 서브-라이브러리에서 각 펩티드당 0.2-2μmole이다. 다른 말이 없는 한, 모든 반응은 실온에서 실행한다.
한 개 이상의 아미노산이 결합되는 각 결합 단계에서, 수지는 적정 수의 부분으로 나누고, 다른 아미노산을 각 부분에 참가를 한다. 1-16시간동안 3 몰라 초과량의 PyBrop와 6몰라 초과량의 DIEA로 2회씩 각 위치에서 결합을 실행한다. 모든 아미노산은 이들의 α-아민 위치에서 FMOC로 보호를 한다. 측쇄는 다음과 같다; His(Trt); Lys(Boc or Dde); Orn(Boc); Ser(tBu); Thr(tBu); Tyr(tBu).
이중 결합 후에, 수지 일부분은 세척을 하고, 총 20-40분간 20% 피페라진/NMP 용액을 이용하여, FMOC 탈보호를 실행한다. 추가 세척후에, 수지는 다시 그 다음 아미노산 결합을 위해 분리한다(필요에 따라).
고리화반응전에, 빌딩 유닛의 아민과 카르복실의 Allyl/Alloc 보호는 2.5% AcOH, 5% NMM을 포함하는 클로로포름에 용해된 Pd(PPh3)4용액 2 당량으로 2-2.5시간 동안 또는 1시간에 2회 처리하여 제거한 다음, 처리전후에 팔라디움이 없는 상기 용매로 수지를 세척하고, 제거 공정이 끝나는 시점에서 NMP로 추가 세척을 한다.
DCM로 세척한 후에, TFA 70%, H2O 5%, TIS 1%, EDT 2.5%, DCM(혼합물 A) 또는 TFA 70%, H2O 5%, TIS 1%, 페놀 5%, DCM(혼합물 B) 또는 60% TFA, 10% H2O, 30% DCM(혼합물 C)와 순수 TFA의 추가 세척하는 2중 처리를 함으로써 펩티드를 수지 부분으로부터 잘라낸다. 각 수지 부분의 세가지 절단 용액을 함께 수득하여 질소 증기로 기화시키고, 0.5-1㎖ H2O를 각 샘플에 첨가하고, 냉동 건조를 시킨다. 펩티드 혼합물은 C-18 SEP-PAK(Millipore Corp.)에서 완충액 A로써 0.1% 아세트산 또는 TFA/H2O를 이용하고, 완충액 B로써 50-80% CH3CH/0.1% 아세트산 또는 H2O를 이용하여 부분적으로 정제를 하고, 냉동-건조를 시킨다.
각 합성된 서브-라이브러리는 질량 스펙스로메터를 이용하여(MALDI-TOF MS) 특징화시키고, 아미노산 분석을 한다.
빌딩 유닛은 삼문자 아미노산 코드에 각 반응기(아민의 경우에는 N, 카르복실기의 경우에는 C)의 약어에 이어, 스페이스 메틸기의 숫자를 나타내는 것으로 구성된다. 예를 들면, Gly-C2는 카르복실 반응기와 두 개 탄소의 메틸렌 스페이스가 있는 변형 Gly를 나타내는 것이고, Phe-N3은 아미노 반응기에 세 개 탄소 메틸렌 스페이스를 가지는 변형된 페닐알라닌 기를 나타내는 것이다.
소마토스태틴 유사체의 일반적인 스크리닝
합성된 소마토스태틴 유사체는 일반적으로 in vitro에서 이의 7-막통과 수용체에 천연 펩티드(SRIF-14)가 결합하는 것을 방해하는데 대해서 테스트를 받았고, 2차 메센져와 세포 생장에 대해 이들의 영향에 대해서 테스트를 받았고; in vivo에서는 호르몬 및 효소 분비 저해에 대해서 테스트를 받았다.
유사체는 또한 고리 아데노신 모노포스페이트(cAMP) 수준, 티로신 포스포타제 활성, 생장 호르몬 분비 및 세포 생장에 대한 이들의 영향에 대해서 테스트를 받았다. 라이브러리는 또한 동물의 in vivo에서 생장 호르몬, 아밀라제, 위산, 인슐린 및 글루카곤 분비의 저해에 대해서 테스트를 추가로 실시하였다.
선택 변수로써 대사 안정성 테스트
유사체는 또한 혈청 또는 ??직 균질물에서 배양을 하고, 배양 전후에 HPLC에 의해 펩티드 피크를 기록하여 효소 분해에 대한 이들의 저항성으로 안정성 테스트를 하였다. 배양 시간을 증가시켜도 펩티드 피크에 변화가 없는 것이 더욱 안정한 것이다. 이와 같은 피크를 분리하여 질량 스펙트럼, N-말단 서열 및 정제된 펩티드 피크와의 비교로 특징을 조사하였다. 이와 같은 방식으로 라이브러리 또는 서브-라이브러리에서 가장 안정한 펩티드를 신속하게 확인한다.
하기 실시예에서는 기존에 알지못한 새로운 서열에 기초하여 또는 공지의 생물학적으로 활성이 있는 다수의 펩티드 서열에 일부 기초하여 제작된 구조적으로 구속된 소마토스태틴 유사체를 제시한다.
다음의 실시예는 본 발명의 화합물 및 그 방법을 어떻게 만들고 이용하는 가를 설명하기 위함이고, 이에 한정하고자 함은 아니다.
합성 실시예
일련의 상이한 소마토스태틴 유사체를 개별 기본구조 고리화된 펩티드 또는 라이브러리로써 합성하였다.
본 발명의 일반 구조식(Va)에 상응하는 옥타펩티드 소마토스태틴 유사체 세가지를 개별적으로 합성을 하고, 특징을 조사하고, 생물학적 활성에 대해 테스트를 하였다.
1) 일반 구조식(Va)에 상응하는 화합물; 이때, R5은 (D)Phe이고; R7는 Phe이고; R10는 Thr이고; R12는 Thr이며; 따라서, 이 화합물은 다음과 같은 특정 구조의 화합물이 된다;
H-(D)Phe-R6-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-R11-Thr-NH2
이때, R6와 R11는 Nαω-기능화된 알킬렌 아미노산 빌딩 유닛이다.
2) 일반 구조식(Va)에 상응하는 화합물; 이때, R5은 (D)Phe이고; R7는 Phe이고; R10는 없고; R12는 Thr이며; 따라서, 이 화합물은 다음과 같은 특정 구조의 화합물이 된다;
H-(D)Phe-R6-Phe-(D)Trp-Lys-R11-Thr-NH2
이때, R6와 R11는 Nαω-기능화된 알킬렌 아미노산 빌딩 유닛이다.
3) 일반 구조식(Va)에 상응하는 화합물; 이때, R5은 (D)Phe이고; R7는 Phe이며; 따라서, 이 화합물은 다음과 같은 특정 구조의 화합물이 된다;
H-(D)Phe-R6-Phe-(D)Trp-Lys-R10-R11-R12-NH2
이때, R6와 R11는 Nαω-기능화된 알킬렌 아미노산 빌딩 유닛이다.
Nαω-기능화된 아미노산 빌딩 유닛이 결합되엉 LT는 이들 새로운 합성 펩티드 유사체의 구조는 표 1, 2, 3에 요약하였다. 이와 같은 세 가지 일련의 화합물에서, 이용된 빌딩 유닛은 글리신 빌딩 유닛으로 펩티드 기본구조에 있는 알파 질소에 부착된 연결기는 다양하다.
간단하게는 이들 세가지 일련의 화합물은 여기에서 각각 다음과 같이 언급한다; SST Gly6, Gly11; SST Gly6, Gly10; SST Gly6Gly11R10R12.
각 일련의 화합물에서, 고리화 지점의 위치는 일정하고, 제 1과 제 2 시리즈에서 연결 다리의 위치와 길이는 다양하나, 세 번째 시리즈에서는 다리는 일정하나 10번과 12번 위치의 잔기는 변화되었다. 따라서, C2, N2는아미드 결합으로 구성된 다리를 말하고, 이때 카르보닐기는 펩티드의 아미드 결합에 근접하고, 이는 다리 아미드와 다리에 관련된 기본구조 질소사이에 두 개 탄소 메틸렌 기를 포함한다.
수작업으로 또는 자동 펩티드 합성기(Applied Biosystems Model 433A)를 이용하여 펩티드 어셈블리를 한다. 펩티드를 어셈블리한 후에, 고리를 형성하는 연결 기의 탈보호는 Ally/Alloc 보호기의 경우에는 Pd(PPh3)4(팔라디움 테트라키스 트리페닐 포스핀)를, tBu/Boc 보호기의 경우에는 TFA를 이용하여 실시한다. 비-고리 유전자를 수득하기 위해서는, 이 단계에서 펩티드를 수지로부터 절단해낸다. PyBOP를 이용하여 펩티드의 고리화반응을 실시한다. 이용된 수지의 형태에 따라 적절한 시약을 이용하여 고분자 서포트에서 펩티드를 절단하는데, Rink 아미드 타입의 수지의 경우에는 TFA를 이용하고, mBHA(파라-메틸 벤질하이드릴 아민) 형 수지의 경우에는 HF를 이용한다. 펩티드는 준비된 역상 HPLC를 이용하여 정제한다. 정제된 생성물은 분석 HPLC, 질량 스펙트럼분석, 아미노산 분석등으로 특징을 조사하였다.
실시예 번호 연결기 화합물번호 방법 생성물
1 C1, N2 Cyclic DE-3-32-4 1 NA**
2 C1, N2 Non-cyclic DE-3-32-2 1 NA
3 C1, N3 Cyclic PTR 3004 2 79㎎
4 C1, N3 Non-cyclic PTR 3005 2 34㎎
5 C2, N2 Cyclic PTR 3002 1 NA
6 C2, N2 Non-cyclic PTR 3001 1 NA
7 C2, N3 Cyclic PTR 3007 2 40㎎
8 C2, N3 Non-cyclic PTR 3008 2 40㎎
9 N2, C2 Cyclic YD-9-166-1 2 NA
10 N2, C2 Non-cyclic YD-9-168-1 2 NA
11 N3, C2 Cyclic PTR 3010 2 100㎎
12 N3, C2 Non-cyclic PTR 3011 2 NA
13 Linear* PTR 3003 3 96㎎
*선형은 R6와 R11자리에 유도안된 글리신이 있는 동일한 서열을 말한다.
**NA는 이용할 수 없다는 것을 나타낸다.
표 1의 방법;
1) mBHA 수지에서 수작업으로 합성, HF 절단.
2) Rapp TentaGel 수지에서 수작업으로 합성. TFA 절단.
3) Rink 아미드 수지; 자동화된 펩티드 분석기에서 0.1 mmol 규모로 어셈블리.
SST Gly6, Gly10유사체
실시예번호 연결기 화합물번호 방법 수득률
14 C1, N2 Cyclic YD-9-171-3 1 20㎎
15 C1, N2 Non-Cyclic YD-9-171-2 1 10㎎
16 C!, N3 Cyclic YD-9-175-3 1 44.9㎎
17 C1, N3 Non-cyclic YD-9-175-2 1 25.4㎎
18 C2, N2 Cyclic PTR 3019 1 40㎎
19 C2, N2 Non-cyclic PTR 3020 1 26㎎
20 C2, N3 Cyclic YD-5-28-3 3 101.5㎎
21 C2, N3 Non-cyclic YD-5-28-2 3 48.3㎎
22 N2, C2 Cyclic PTR 3016 2 60㎎
23 N2, C2 Non-cyclic PTR 3017 2 40㎎
24 N3, C2 Cyclic YS-8-153-1 2 93㎎
25 N3, C2 Non-cyclic YS-8-152-1 2 54㎎
26 * Linear PTR 3021 1 100㎎
27 N3, C2 Cyclic** PTR 3013 67㎎
28 N3, C2 Non-cyclic** PTR 3014 48㎎
*선형은 R6와 R10자리에 글리신이 있는 동일한 서열을 말한다.
**이들 유사체는 동일한 SST 서욜로써, D-Phe5가 없고. N-말단은 아세틸화되어있다.
표 2의 방법;
1) 자동화된 펩티드 합성기에서 어셈블리, 0.1mmol scale. (HBTU).
2) 수작업으로 합성; PyBrop.
3) 자동화된 펩티드 합성기에서 어셈블리, 0.25mmol scale. (HBTU)
H-(D)Phe-R6-Phe-(D)Trp-Lys-R10-R11-R12-NH2에 기초한 소마토스태틴 유사체
실시예번호 유사체 R10 R12 생성양(㎎)
29 GGP-22-65 Nva Thr 390
30 GGP-22-63 Val Thr 300
31 GGP-22-61 Abu Thr 340
32 GGP-22-59 Ser Thr 350
33 GGP-22-75 Thr Nal 125
34 GGP-22-81 Val Nal 210
35 GGP-22-82 Abu Nal 200
36 GGP-22-77 Ser Nal 190
37 GGP-22-83 Thr (D)Nal 68
38 GGP-22-89 Val (D)Nal 58
39 GGP-22-87 Abu (D)Nal 65
40 GGP-22-85 Ser (D)Nal 58
실시예 41. SST Gly6, Gly10, N3, C2 유사체의 자세한 합성
5g Rink 아미드 수지(NOVA)(0.49mmol/g)를 소결된 유리 바닥이 있고 교반기를 배치한 반응 용기에서 N-메틸피롤리돈(NMP)에서 팽창시킨다. Fmoc 보호기는 20% 피페라진/NMP(10분씩 2회, 각 25㎖)과 반응을 시켜 수지로부터 제거한다. 290㎚에서 UV 흡수도를 측정하여, Fmoc 제거되는 것을 모니터한다. 결합 과정은 실온에서 2시간동안 Fmoc-Thr(OtBu)-OH(3당량), PyBrop(3당량), DIEA(6당량)/NMP(20㎖)로 실행한다. 정량적인 닌하이드린 테스트(Kaiser 테스트)를 이용하여 반응이 종료되는 것을 모니터한다. 결합후에, 펩티드-수지는 NMP(25㎖ NMP로 7회, 각2분씩)로 세척을 한다. 실온에서 0.5시간동안 무수 아세트산 혼합물(캐핑(capping) 혼합물; HOBt 400㎎, NMP 20㎖, 무수 아세트산 10㎖, DIEA 4.4㎖)과 펩티드-수지를 반응시켜 캐핑을 실행한다. 캐핑후에, 전술한 것과 같이 NMP(7회, 각 2분씩) 세척을 한다. 상기와 같이 Fmoc를 제거한다. 동일한 방식으로 Fmoc-Phe-OH를 결합시키고, 상기와 같이 Fmoc기를 제거한다. 펩티드 수지는 Fmoc-Gly-C2(Allyl) 빌딩 유닛으로 반응을 하고; 결합 반응은 상기와 같다. Fmoc 제거는 상기와 같다. 실온에서 하룻밤동안 그리고 50E에서 1시간동안 HATU(3당량), DIEA(6당량)으로 반응을 하여 펩티드 수지에 Fmoc-Lys(Boc)-OH를 결합을 시킨다. 반응동안에 추가로 DIEA를 첨가하여, 염기성 배지(pH 종이로 측정하였을 경우에 약 9가 되도록)를 유지시킨다. 이와 같은 결합을 반복한다. Fmoc 테스트(펩티드 수지의 샘플을 취하고, 무게를 달고, 상기와 같이 Fmoc를 제거하고, UV 흡수도를 즉정)를 하여 결합 완료를 모니터한다. 전술한 것과 같이, PyBrop와 함께 펩티드 수지에 Fmoc-D-Trp-OH를 결합시킨다. Fmoc를 제거한 후에, Fmoc-Phe-OH를 동일한 방식으로 결합을 시킨다. 펩티드 수지의 1/5로 합성을 계속한다.
Fmoc를 제거한 후에, 전술한 것과 같이 PyBrOP과 반응을 시켜 두 번째 빌딩 유닛 Fmoc-Gly-N3(Alloc)-OH을 도입한다. 캐핑은 전술한 것과 같이 실행한다. Fmoc를 제거한 후에, 펩티드-수지는 두 개의 동일한 부분으로 나눈다. 이들 부분중 하나은 합성을 지속한다. 전술한 것과 같이 Fmoc-Lys(Boc)-OH의 경우에 HATU와 함께 반응을 시켜 Boc-D-Phe-OH를 결합시킨다. 캐핑은 상기와 같이 실행한다.
Allyl과 Alloc 보호기는 실온에서 2시간동안 아르곤하에서 Pd(PPh3)4, 아세트산 5%, 몰포린 2.5%/클로로포름으로 반응을 시켜 제거한다. 펩티드 수지는 상기와 같이 NMP로 세척을 한다. 수지의 ⅔는 고리화반응을 위해 취한다. 실온에서 PyBOP 3당량, DIEA 6당량/NMP로 고리화반응을 실행한다. 펩티드 수지는 세척하고 건조시킨다. 아르곤하에서 0EC에서 15분간, 실온에서 2시간동안 TFA 81.5%, 페놀 5%, 물 5%, EDT 2.5%, TIS(트리스-이소프로필-실란) 1%, 5% 염화메틸렌으로 반응을 시켜 수지로부터 펩티드를 절단해낸다. 혼합물은 냉각 에테르(30㎖, 0EC)에 여과를 시키고, 소량의 TFA로 세척을 한다. 여과물은 회전 증발기에 두고, 모든 휘발성분은 제거한다. 오일성 생성물을 수득한다. 에테르로 저작하고, 에테르는 버리고, 흰색 분말을 수득한다. 이와 같은 성긴 생성물은 건조를 시킨다. 생성물의 중량은 93㎎이다.
구조식 Vb에 따른 새로운 기본구조 고리형 소마토스태틴 유사체를 추가로 합성하는데 이는 다음과 같다;
1) 헵타펩티드 시리즈 ; NPhe-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-NPhe-Thr-NH2
2) 헵타펩티드 시리즈 ; NPhe-Phe-(D)Trp-Lys-R10-NPhe-R12-NH2
3) 헵타펩티드 시리즈 ; NPhe-Phe-Trp-Lys-Gly-NPhe-R12-NH2
제 1 시리즈(표 4)의 경우에, 다리의 길이 및 방향이 변화되나, 제 2 시리즈(표 5)의 경우와 제 3 시리즈(표 6)에서는 10번 또는 12번에 잔기가 변화되었다.
R6-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-R11-Thr-NH2에 기초한 헵타펩티드 소마토스태틴 유사체
실시예번호 유사체 R6 R11 수득량(㎎)
42* GGP-22-151 Phe-N2 Phe-C3 290
43 GGP-22-135 Phe-N3 Phe-C3 25
44 GGP-22-159a Phe-N2 Phe-C2 28
45 GGP-22-159b Phe-N3 Phe_C2 30
46 GGP-22-161a Phe-C2 Phe-N2 56
47 GGP-22-161b Phe-C3 Phe_N2 65
48 GGP-22-163a Phe-C1 Phe_N3 61
49 GGP-22-163b Phe-C1 Phe-N3 68
50 GGP-22-163c PHE_C3 Phe-N3 10
*PTR-3046
R6-Phe-(D)Trp-Lys-R10-R11-R12-NH2에 기초한 추가 헵타펩티드 소마토스태틴 유사체
실시예번호 유사체 R6 R10 R11 R12 수득량(㎎)
51 GGP-22-53 Phe-N2 Val Phe-C3 Val 200
52 GGP-22-55 Phe-N2 Val Phe-C3 Thr 460
53 GGP-22-41 Phe-N2 Thr Phe-C3 Thr 120
54 GGP-22-137 Phe-N3 Thr Phe-C3 Thr 30
55 GGP-22-37 Phe-N2 Thr Phe-C3 Val 146
R6-Phe-Trp-Lys-Gly-R11-R12-NH2에 기초한 헵타펩티드 소마토스태틴 유사체
실시예번호 R6 7 R8 R9 R10 R11 R12
56 Phe-N2 Phe Trp Lys Gly Phe-C3 Thr
57 Phe-N2 Phe Trp Lys Gly Phe-C3 Val
58 Phe-N2 Phe Trp Lys Gly Phe-C3 Ala
59 Phe-N2 Phe Trp Lys Gly Phe-C3 b-Ala
60 Phe-N2 Phe Trp Lys Gly Phe-C3 D2Nal
실시예 61. PTR 3046의 자세한 합성
1g Rink 아미드 수지(NOVA)(0.55mmol/g)를 소결된 유리 바닥이 있고 교반기를 배치한 반응 용기내에서 1.5시간동안 NMP에서 팽창시킨다. Fmoc 보호기는 20% 피페라진/NMP(15분씩 2회, 각 5㎖)과 반응을 시켜 수지로부터 제거한다. 닌하이드린 테스트를 하여, Fmoc 제거되는 것을 모니터한다. 결합 과정은 실온에서 0.5시간동안 Fmoc-Thr(OtBu)-OH(4당량), PyBrop(4당량), DIEA(12당량)/NMP(5㎖)로 실행한다. 정량적인 닌하이드린 테스트(Kaiser 테스트)를 이용하여 반응이 종료되는 것을 모니터한다. 펩티드 수지에 결합 후에, 펩티드-수지는 NMP(5㎖ NMP, 5㎖ DCM, 5㎖ NMP로 3회, 각2분씩)로 세척을 한다. 실온에서 0.5시간동안 무수 아세트산 혼합물(캐핑(capping) 혼합물; HOBt 40㎎, NMP 5㎖, 무수 아세트산 1㎖, DIEA 0.5㎖, DMAP(cat))과 펩티드-수지를 반응시켜 캐핑을 실행한다. 캐핑후에, 전술한 것과 같이 NMP 세척을 한다. 상기와 같이 Fmoc를 제거한다. Fmoc-Phe(C3)-Allyl BU를 결합시키고(BU 2eq. PyBrop 2 eq. DIEA 6eq., NMP 5㎖, 0.5h). 상기와 같이 Fmoc기를 제거한다. 펩티드 수지는 상기와 같이 세척을 한다. 펩티드 수지는 이중 결합에 의해 Fmoc-Val-C1(4eq. 콜리딘 12eq., 1h, 38℃)으로 반응을 시키고, 결합 완료는 이가펩티드가 삼가펩티드로 전환하여 모니터를 한다(펩티드 수지 샘플을 절단하고, 정제 안된 삼가펩티드를 HPLC(0.1% 물/아세토니트릴)에 주입한다)). Fmoc 제거는 상기와 같다. Fmoc-Thr(OrBu)-OH의 경우와 같은(상기참조) 반응 조건에서 반응을 시켜, 펩티드 수지에 Fmoc-Lys(Boc)-OH를 결합을 시킨다. 반응 완료는 닌하이드린 테스트를 통하여 모니터한다. 전술한 것과 같이, PyBrop와 함께 펩티드 수지에 Fmoc-D-Trp-OH를 결합시킨다. Fmoc를 제거한 후에, Fmoc-Phe-OH를 동일한 방식으로 결합을 시킨다. Fmoc를 제거한 후에, Fmoc-Phe(C3)-Allyl B에서 전술한 것과 같이 PyBrOP과 반응을 시켜 두 번째 빌딩 유닛 Fmoc-Phe-N2(Alloc)-OH을 도입한다. Allyl과 Alloc 보호기는 실온에서 1.5시간동안 아르곤하에서 Pd(PPh3)4, 아세트산 5%, 메틸몰포린 2.5%/클로로포름으로 반응을 시켜 제거한다. 펩티드 수지는 상기와 같이 NMP로 세척을 한다. 수지의 ⅔는 고리화반응을 위해 취한다. 실온에서 PyBOP 3당량, DIEA 6당량/NMP로 고리화반응을 실행한다. 펩티드 수지는 세척시킨다. 고리화반응은 0.5시간동안 실온에서 PyBOP 3eq., DIEA 6eq./NMP에서 실행한다. 상기와 같이 펩티드를 세척한다. Fmoc를 제거한 후에, 펩티드 수지는 세척을 하고(DCM 3×5㎖), 건조시키고, 0℃에서 15분간, 실온에서 1.5시간동안 TFA 94%, 물 2.5%, EDT 2.5%, TIS(트리-이소프로필-실란) 1%로 반응을 하여 수지로부터 절단한다. 혼합물은 여과를 시키고, 소량의 TFA로 세척을 한다. 여과물은 회전 증발기에 두고, 모든 휘발성분은 제거한다. 오일성 생성물을 수득한다. 에테르로 저작하고, 에테르는 버리고, 흰색 분말을 수득한다. 이와 같은 성긴 생성물은 건조를 시킨다. 생성물의 중량은 290㎎이다.
개별 소마토스태틴 유사체의 추가 실시예
본 발명에 따라 만들어진 새로운 소마토스태틴 유사체의 추가 실시예를 표 7에 요약하였다.
추가 합성된 소마토스태틴 유사체
실시예번호 R5 R6 7 R8 R9 R10 R11 R12
61 Phe-N2 Tyr (D)Trp Lys Val Phe-C3
62 Phe-N2 Tyr (D)Trp Lys Val Phe-C3
63 Phe-N2 pNO2Phe (D)Trp Lys Val Phe-C3 Thr
64 Phe-N2 Tyr (D)Trp Lys (D)Val Phe-C3 Thr
65 Phe-N2 pClPhe (D)Trp Lys Val Phe-C3 Thr
66 Phe-N2 Nal (D)Trp Lys Val Phe-C3 Thr
67 (D)Phe Phe-N2 Tyr (D)Trp Lys (D)Val Phe-C3
소마토스태틴 유사체의 라이브러리
소마토스태틴 서열에 위치 번호는 고유 소마토스태틴 펩티드에 기초한 것이다(SRIF-14, Raynor et. al. ibid).
실시예 68: VH-SST1 라이브러리
라이브러리는 다섯가지 최종 서브-라이브러리에 40개 기본구조 고리형 펩티드를 포함하도록 고안되었고, 각각에는 8개 다른 펩티드를 포함한다.
마지막 결합 단계(R5)전에, 수지는 5개 부분으로 나누고, 각 부분에 대해 다른 AA으로 결합을 실시하고, 다음 단계를 위해 별도 서브-라이브러리를 남겨둔다. 이들 5개 일부분은 40개 유사체를 만들기 위해 각 위치에 이용된 모든 잔기를 나타내는 것으로 표 8에 설명을 하는 것과 같은 서브-라이브러리이다.
VH-SST1 라이브러리의 조성물.
서브라이브러리 위치에 해당하는 잔기
R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12
A DPhe Gly-C2 Phe DTrp Lys Gly Gly-N2 Val
B Pro Leu Pro Val
C Val
D Leu
E Gly
실시예 69: IG-SST1 라이브러리
이 라이브러리에서, 다리는 6번위치의 Gly-C2와 10번 위치의 Gly-N2에 일정하다. 라이브러리에는 4개 서브-라이브러리에 36개 펩티드를 포함하는데, 서브-라이브러리는 이들 R5위치만이 상이하다. 이 라이브러리의 조성물은 표 9에 나타내었다.
IG-SSTI 라이브러리의 조성물
서브라이브러리 위치에 해당하는 잔기
R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12
A DPhe Gly-C2 Phe DTrp Lys Cyl-N2 Phe Val
B Phe Phe Ala
C Dtrp Leu Leu
D Trp
실시예 70: YS-SST1 라이브러리
이 라이브러리는 표 10에서 설명하는 것과 같이, 4개 서브-라이브러리에 16개 유사체를 나타낸다. 서브-라이브러리는 4개의 다른 연결기(R6위치와 R11또는 R10사이)를 가지고, 각 서브-라이브러리는 4개 유사체를 가진다.
YS-SST1 라이브러리의 조성물
서브라이브러리 위치에 해당하는 잔기
R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12
Al-2 DPhe Gly-ClGly-C2 Phe DTrp Lys Thr Gly-N2Gly-N3 Thr
A3-4 DPhe Gly-N2Gly-N3 Phe DTrp Lys Thr Gly-C1Gly-C2 Thr
B1-2 DPhe Gly-C2Gly-C2 Phe DTrp Lys Gly-N2Gly-N3 Phe Thr
B3-4 DPhe Gly-NlGly-N3 Phe DTrp Lys Gly-C1Gly-C2 Phe Thr
실시예 71; YS-SST2 라이브러리
라이브러리에는 4게 서브-라이브러리에 48개 펩티드를 포함한다. 서브-라이브러리는 이들의 R7위치가 다르며, 각 12개의 펩티드를 가진다. 이 라이브러리의 조성물은 표 11에 나타내었다.
YS-SST2 라이브러리의 조성물
서브라이브러리 위치에 해당하는 잔기
R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12
A DPhe Gly-N3 Phe DTrp Lys Thr Gly-C2 Thr
B Tyr Ser 2Nal
C pClPhe Val D2Nal
D pNO2Phe Abu
실시예 72 ; YS-SST3 라이브러리
라이브러리에는 2개 서브-라이브러리에 12개 펩티드를 포함한다. 서브-라이브러리는 R6빌딩 유닛에서 상이하고, 각 6개 펩티드를 포함한다. 이 라이브러리의 조성물은 표 12에 나타내었다.
YS-SST3 라이브러리의 조성물
서브라이브러리 위치에 해당하는 잔기
R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12
A DPhe Phe-N2 Phe DTrp Lys Thr Phe-C2 Thr
B Gly Phe-N3 SerGly
실시예 73; YS-SST4 라이브러리
이 라이브러리에는 두 개 서브-라이브러리에 48개 펩티드를 포함한다. 서브-라이브러리 B는 표 13에서 나타내는 것과 같이 R5위치에 Thr이 존재하는 것이 A와 다른 점이다.
YS-SST4 라이브러리 조성물
서브라이브러리 위치에 해당하는 잔기
R12 R11 R10 R9 R8 R7 R6 R5
A Phe-C2 DValDAlaDLeu DLysDOrn TrpThi DTyr Gly-N2Gly-N3 Phe
B Thr Phe-C2 DValDAlaDLeu DLysDOrn TrpThi DTyr Gly-N2Gly-N3 Phe
실시예 74; YS-SST5 A 와 B 라이브러리
이들 라이브러리들은 6번 위치와 11번위치에 연결다리 크기 및 방향을 최적화시키고, 5번 위치에서 다양한 나프틸알라닌 잔지의 영향을 동시에 결정하도록 고안되어 있다. YS-SST-5A 라이브러리는 각각에서 16개 펩티드가 있는 4개 서브-라이브러리로 구성된다. YS-SST-5B 라이브러리는 서브-라이브러리 C와 D의 간단화시킨 합성 과정으로 나타낼 수 있는데, 이때 각 4개 펩티드의 서브-라이브러리로 구성된다. 라이브러리 합성은 다음의 과정으로 설명을 할 수 있다.
실시예 75 ; VH-SST6 라이브러리
24개 헥사펩티드를 포함하는 이 라이브러리는 표 14에서 설명을 한다. 두 개의 상이한 Phe-빌딩 유닛이 R6위치에 결합을 하고, R7, R8, R9에는 추가 변수가 있다. 펩티드는 R6와 R10위치의 기본구조사이에 고리를 형성한다. 5번 위치와 12번 위치는 생략되었다.
VH-SST6 라이브러리의 조성물
위치에 해당하는 잔기
R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12
Phe-C1Phe-C2 PhepNO2PhePhg DTrpDThi LysOrn Gly-C2 Phe
실시예 76; VH-SST7와 VH-SST7A 라이브러리
이들 라이브러리 각각에는 45개 서브-라이브러리에 290304 기본구조-고리형 펩티드를 포함한다. 펩티드들은 비-절단형 수지(TentaGel-NH2)에서 합성되어 고형-상 검사에서 스크리닝을 하기 위해 비드-부착된 펩티드를 생성한다. 이들 라이브러리의 조성물은 표 15에 나타내었다. 라이브러리에서 VH-SST7는 8번 위치에 Trp를 포함을 하고, 반면에 VH-SST7A는 동일한 위치에 D-Trp를 포함하는 것이 유일한 차이점이다.
VH-SST7 라이브러리의 조성물
위치 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12
기 A B C D E F G H
1 DPhe Gly-N2 Phe Trp or D-Trp Lys Thr Gly-C1 Thr
2 Phg Gly-N3 Tyr Tic Arg Val Gly-C2 Ser
3 1Nal Phe-N2 Phg Ser Gly-C3 Val
4 D1Nal Phe-N3 pClPhe Abu Phe-C1 1Nal
5 2Nal Ala-N2 pFPhe Phe-C2 D1Nal
6 D2Nal Ala-N3 pNO2Phe Phe-C3 2Nal
7 Thi D2Nal
8 DThi
9 pClPhe
10 pFPhe
11 pNO2Phe
12 Des 총계
기 12 6 6 2 2 4 6 7 45
집단에서 펩티드 24192 12096 12096 145152 145152 72576 12096 41472 290304
이들의 정해진 위치에 대해 서브-라이브러리의 이름을 붙인다; A1, A2, ..An, B1.. Bn, ...H1.. Hn. 각 집단에서 정해진 위치이외의 위치에는 아미노산 혼합물을 포함한다. 각 결합 단계에서, 각 정해지지않은 위치는 아미노산 혼합물을 얻고(각 아미노산 결합이 완료되도록 하고, 운동 효과를 없애어, 동일하지 않은 펩티드를 제공하기 위해 각 단계에서 총 1 당량의 아미노산을 제공), 이 위치에 나타나게 된다. A 부터 H 까지의 각 집단에서 가장 활성이 있는 서브-라이브러리를 확인하는 방법은 고형-상 검사를 이용하고, 이로써 라이브러리에 있는 290304 펩티드로부터 가장 활성이 있는 기본구조-고리형 펩티드 조성물을 유도한다.
실시예 77 ; YS-SST6 라이브러리
이 라이브러리는 표 16에 나타낸 것과 같이 8개 서브-라이브러리에 128개 기본구조-고리형성된 소마토스태틴 유사체로 구성된다. 두 개의 기본적인 고리화반응이 이용되는데; 위치 3이 위치 7에 그리고 위치 2가 위치 6에 고리를 형성한다. 각 서브-라이브러리는 연결 다리의 위치, 연결 형태, 방향 또는 위치 1의 아미노산(Ala 또는 D2Nal)이 상이하다.
YS-SST6 서브-라이브러리의 구조
서브라이브러리 위치당 잔기
R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9
A1 Ala Gly Gly-C1Gly-C2 LysArg AsnDAsn Phe Gly-N2Gly-N3 DTrp Lys
A2 D2Nal Gly Gly-C1Gly-C2 LysArg AsnDAsn Phe Gly-N2Gly-N3 DTrp Lys
A3 Ala Gly Gly-N2Gly-N3 LysArg AsnDAsn Phe Gly-C1Gly-C2 DTrp Lys
A4 D2Nal Gly Gly-N2Gly-N3 LysArg AsnDAsn Phe Gly-C1Gly-C2 DTrp Lys
B1 Ala Gly-C1Gly-C2 Gly LysArg AsnDAsn Gly-N2Gly-N3 Phe DTrp Lys
B2 D2Nal Gly-C1 Gly LysArg AsnDAsn Gly-N2Gly-N3 Phe DTrp Lys
B3 Ala Gly-N2Gly-N3 Gly LysArg AsnDAsn Gly-C1Gly-C2 Phe DTrp Lys
B4 D2Nal Gly-N2Gly-N3 Gly LysArg AsnDAsn Gly-C1Gly-C2 Phe DTrp Lys
실시예 78; IG-SST9 라이브러리
유사체의 생물학적 활성을 위한 SRIF 서열에서 임의 주어진 프레임의 필요성을 좀더 체계적으로 테스트를 하기 위해, SRIF 구조의 길이에서 상이한 부분이 있는 서로 다른 옥타펩티드 라이브러리를 나란히 합성을 하였다. 각 옥타펩티드 서브-라이브러리는 한 개 잔기식 그 다음으로 이동된다. 따라서, 제 1 서브-라이브러리는 SRIF의 잔기 7에서 14까지 이어지고, 제 2 서브-라이브러리는 SRIF의 잔기 6에서 13까지로 이어지는 등과 같이 구성된다.
이 라이브러리는 각 서브-라이브러리간에 한 개의 잔기씩 이동하는 총 14개 겹쳐지는 기본구조-고리형성된 옥타펩티드로 구성된다.
다른 시작점으로부터 동시에 유사체를 합성하여 합성이 이루어지게 되어 동시에 모든 서브-라이브러리에서 빌딩 유닛의 결합이 일어난다. 이와 같은 모든 서브-라이브러리에서, 펩티드 서열의 N-말단의 끝에 있는 한 개 글리신-C2와 펩티드 서열의 N-말단에 전단에 있는 한 개 글리신 N3 단위사이에 기본구조 고리형성이 일어난다.
라이브러리 IG-SST9는 다음과 같이 나타낼 수 있다;
실시예 79; SST14 라이브러리
SRIF 서열 4-11(IG-SST9 라이브러리에서 서브-라이브러리 D)의 기본구조-고리형성된 유사체를 만들기 위해서 연결 기로 라이브러리에서 상이한 페닐알라닌-빌딩 유닛(PheBU: Phe-N2, Phe-N3, Phe-C2, Phe-C3)을 이용한다. 또한, 비-연결기인 Phe 잔기(위치 6 또는 7)는 다양한 Phe과 Nal 유도체로 치환된다; DPhe, pNO2Phe, pClPhe, pFPhe, Phenylglycine (Phg), DPhg, L2Nal, D2Nal. 이로써 다음의 표에서 설명을 하고 있는 18기와 한 기(group)당 16개 유사체의 라이브러리를 제공한다.
SST14 라이브러리 조성물
위치당 잔기
R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11
Lys/DLys Asn PhePheBU(4)DPhepNO2PhepClPhepFPhePhgDPhgL2NalD2Nal PhePheBU(4)DPhepNO2PhepClPhepFPhePhgDPhgL2NalD2Nal Trp/DTrp Lys Thr PheBu(4)
실시예 80: YS-SST7 라이브러리
라이브러리에는 다음의 조성물로된 48개 유사체를 포함한다;
YS-SST7 라이브러리
위치당 잔기
R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12
L2Nal Gly-N3 pCl-Phe DTrp Lys Ser Gly-C2 Thr
DPhe Tyr Thr L2Nal
Val D2Nal
Abu
실시예 81; YS-SST10 라이브러리
이 라이브러리에는 다음과 같은 구조로 설명되는 각 라이브러리에 24개 펩티드를 가지는 5개 서브-라이브러리를 포함한다.
실시예 82; YSS-SST12
표 19에서 설명을 하고 있는 것과 같은 라이브러리는 역-기본구조 고리화된 소마토스태틴 유사체를 나타내는데, 이는 각 서브-라이브러리에 18개 유사체를 포함하는 6개 서브-라이브러리로 구성된다. 상이한 서브-라이브러리는 연결 형(Phe-C211내지 Gly-N36또는 Phe-N311내지 Gly-C26) 및 R10위치에서 잔기에 의해 정의된다.
YS-SST12 라이브러리의 조성물.
서브라이브러리 위치당 잔기
R12 R11 R10 R9 R8 R7 R6 R5
ABC Phe-C2 DValDThrDGlu DLys TrpDTrp DPhepNH2PhePClDPhe Gly-N3 PheL2NalD2Nal
DEF Phe-N3 DValDThrDGlu DLys TrpDTrp DPhepNH2PhepClDPhe Gly-C2 PheL2NalD2Nal
실시예 83; YS-SST15 라이브러리
이 라이브러리는 R6와 R7위치의 잔기에 의해 정의되는 8개 서브-라이브러리에 96개 유사체로 구성된다.
YS-SST15 라이브러리의 조성물.
서브라이브러리 위치당 잔기
R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12
ABCD Phe-N2Phe-N3Lys-N2Gly-N2 Phe DTrpTrp LysDLys Gly Phe-C3 ThrValβ-Ala
EFGH Phe-N2Phe-N3Lys-N2Gly-N2 Tyr DTrpTrp LysDLys Gly Phe-C3 ThrValβ-Ala
생리학적 실시예
본 발명에 따르는 소마토스태틴 유사체는 다음과 같이 비교하면서 in vitro 와 in vivo에서 생활성 검사에 이들의 활성에 대해 테스트를 하였다; 천연 소마토스태틴 펩티드 예를 들면 SRIF; 공지의 소마토스태틴 유사체 옥트레오티드; 비-고리를 형성한 소마토스태틴 유도체 또는 음성 기준으로써 무관한 펩티드.
실시예 84; in vitro에서 소마토스태틴에 대한 방사능 리간드 결합 검사
막통과 소마토스태틴 수용체(SSTR-1,2,3,4,5)를 발현하는 막 준비물에125I-Tyr11-SRIF의 결합을 방해하는 이들의 능력에 대해 소마토스태틴 유사체를 테스트하였다(Raynor et. al., Molecular Pharmacology 43, 838-844, 1993에서 설명하는 방법에 준함). 이들 테스트에 이용된 수용체 준비물은 차이니즈 햄스터 오바리(CHO)세포에서 선택적이고 안정적으로 발현하는 클론된 수용체 또는 SSTRs를 발현하는 자연 세포주의 것이다. 일반적으로 세포막은 프로테아제 저해물질 존재하에 트리스 완충액에서 균질화시키고, 테스트된 샘플의 여러 농도를 가지고125I-Tyr11-SRIF와 30-40분간 배양을 하였다. 결합 반응물은 여과를 시키고, 여과물은 세척을 하고, 결합된 방사능활성은 감마 카운터에서 측정한다. 1μM 라벨안된 SRIF-14 존재하에 방사능활성이 결합된 것은 비-특이적인 결합으로 정의한다. 결합 테스트의 양성 시그날을 확인하기 위해, 그리고 비-특이적인 시그날을 제거하기 위해, GnRH와 같은 무관한 펩티드 샘플을 합성하고 동일한 과정으로 처리한 다음, 음성 기준 샘플과 동일한 검사에서 테스트를 한다. 이들 샘플은 임의 검사에서 결합 활성을 가지지 않는다.
실시예 85; 고리 펩티드 유사체의 수용체 결합 특이성
다른 시그날 변환 경로에는 다양한 소마토스태틴 수용체 서브타입이 관련되는 것으로 본다. 이는 치료를 할 질병과 관계가 있는 이들 수용체 서브타입에 특이적이고 선택적으로 결합을 하는 소마토스태틴 유사체를 선택하는 것을 의미한다. Reisine and Bell(Endocrine Rev. 16, 427-442, 1995)에서 설명을 하는 것과 같이, 몇가지 수용체 서브타입의 활성은 다음과 같다고 볼 수 있다;
SSTR-1 과 SSTR-2: EGF 수용체 자가포스포릴화반응의 방해를 유도하는 티로신 포스포타제의 활성화, 이 공정은 SST의 항-증식억제 효과와 연관이 있다.
SSTR-2: 생장 호르몬 및 위산 방출의 방해, 이 공정은 생장 인자를 통한 항-증식억제 효과 및 선단비대증과 연관이 있다.
SSTR-5: 인슐린, 리파제, 아밀라제 방출 및 칼슘 유입 방해 및 SST의 항-증식억제 효과와 연관이 있는 활성의 방해.
SSTR-3: 맥관형성과 연관이 있음.
다른 소마토스태틴 수용체에 실시에 1-50의 대표적인 펩티드의 결합은 다양한 수용체를 발현하는 차이니즈 햄스터 오바리(CHO) 세포에서 in vitro상태에서 측정을 한다. 고리 펩티드로 얻은 선택성은 표 21에 나타내었다. 나타낸 IC50값은 방사능활성이 있는 요오드가 결합된 소마토스태틴(SRIF-14) 결합의 50%를 방해하는데 필요한 농도를 말한다.
선택된 기본구조-고리형성된 유사체에 의해 클론된 SSTRs에125I-SRIF-14 결합을 방해하는데 측정된 IC50값(nM)
PTR No. SSTR-1 SSTR-2 SSTR-3 SSTR-4 human SSTR-5 ratSSTR-5
3004 ＞10000 ＞10000 ＞2000
3007 ＞10000 ＞10000 ＞2000
3010 2500 ＞10000 ＞1000 ＞10000 ＞2000 500
3013 ＞10000 ＞10000 ＞2000
3016 2500 ＞2000 ＞2000 ＞2000 1000
3019 ＞10000 ＞10000
3022 ＞2000
3025 ＞10000 ＞2000 ＞2000 ＞2000
3034 ＞10000 ＞2000 ＞2000
3040 100 ＞1000 2500 1000 2000 100
3043 2000 2000 ＞2000 1000 400 400
3046 3000 500 500 250 22 30
IC50값은 실시예 84에서 설명하는 방사능리간드 결합에서 10-6, 10-7, 10-8M 농도에서 유사체를 테스트하여 계산하였다.
도 1에는 클론 SSTRs에 PTR 3046(합성 실시예 42)의 친화성을 나타내었다. 선택성에 대해 다른 소마토스태틴 유사체에 비해 PTR 3046은 기대이상의 장점을 가진다. 사람 SSTR-5에 높은 친화력으로 결합하는 유사체는 다른 SSTRs에서는 다소 친화성이 적다.
따라서, 쥐와 사람의 SSTRs에 대한 친화성은 PTR 3046의 경우에 비슷하여, 쥐 모델에 제공되는 약량이 사람에서도 효과가 있을 것으로 본다. PTR 3046의 친화력을 비교하는 것은 공지의 SST 유사체에서 수득한 것과 함께 표 22에서 나타내었다.
SSTR 서브-타입에 대해 다양한 공지의 SST 유사체와 PTR 3046의 선택성
유사체 IC50값 (nM)
SSTR1 SSTR2 SSTR3 SSTR4 hSSTR5 rSSTR5
SIRF-14* 0.1 0.3 0.1 1.2 0.2 0.3
Octreotide* ＞1000 0.4 150 ＞1000 32 0.2
Somatuline(BIM-23014)* 800 2 6 ＞1000 14 0.5
RC-160** 200 0.2 0.1 620 21 0.2
BIM-23052* 23 32 0.4 18 4 0.004
PTR 3046 3000 500 500 250 22 30
* Reisine and Bell (1995), Endocrine Reviews 16; 427-442.
** L. Buscail et. al. (1995), PNAS 92; 1580-1584.
또 다른 고리 펩티드 유사체, PTR 3040이 흥미로운 선택성 프로파일을 나타낸다. 이 유사체는 수용체 서브타입 SSTR-1에 대해서는 상대적으로 높은 친화력을 나타내고, 다른 수용체 서브타입에서는 매우 낮은 친화력을 나타낸다. PTR 3040에서는 쥐 SSTR-5에는 매우 높은 결합을 가지나, 클론된 사람 수용체에 대한 친화력은 상당히 낮다.
쥐 뇌하수체 AtT20 세포에125I-SRIF 결합의 방해에 대해서도 다양한 유사체에 대해서 테스트를 하였다. PTR 3046와 PTR 3040을 이용한 수득된 결과는 SRIF-14와 비교하여 도 2에 나타내었다. 결과는 각 화합물에 특정 농도에 대해 저해도를 나타낸 것이다.
실시예 86; 고리 펩티드 유사체의 라이브러리의 수용체 결합 특이성
상이한 소마토스태틴 수용체에 실시에 68-83의 펩티드 서브-라이브러리의 결합은 다양한 수용체를 발현하는 차이니즈 햄스터 오바리(CHO) 세포에서 in vitro에서 측정하였다. 고리형 펩티드 라이브러리에서 수득된 선택성의 예는 표 23에 나타내었다. 제시된 값은 방사능활성이 있는 요오드가 결합된 소마토스태틴(SRIF-14의 저해도를 나타낸다.
선택된 기본구조-고리형 서브-라이브러리에 의해 클론된 SSTRs에125I-SRIF-14의 방해에 대한 측정된 IC50값(nM)
서브라이브러리 Pep.* SSTR-1 SSTR-2 SSTR-3 SSTR-4 human SSTR-5 ratSSTR-5
VH1-AVH1-BVH1-CVH1-DVH1-E 88888 1600 ＞2000 8000 6400 8000640072001600640
YS1-A1-2YS1-A3-4YS1-B1-2YS1-B1-4 4444 360 6000 3600 ＞5000＞5000600＞5000 1600 32008002008000
YS2-AYS2-BYS2-CYS2-D 12121212 110960 1200300 3004800 3600360010001800 1003000 1001002525
YS4 24 3500 2400 2400 2000
VH6 24 7200
YS5A-AYS5A-BYS5A-CYS5A-D 16161616 320130013001300 1300 6400640064006400 3200140013001300 1300
YS5B-A1YS5B-A2YS5B-B1YS5B-B2YS5B-C1YS5B-C2YS5B-D1YS5B-D2 44444444 4004004004001000400400400 3000200015001500100025001500800 700600100010003000300020001000
*는 각 서브-라이브러리에 있는 다른 펩티드의 수를 나타낸다.
측정된 IC50값은 각 서브-라이브러리 혼합물에 있는 전체 펩티드의 농도에 기초하여 계산된다. 그러나, 각 서브-라이브러리는 다른 활성을 가지는 상이한 펩티드로 구성된다. 따라서 임의 주어진 서브-라이브러리에 있는 최상의 펩티드 활성은 서브-라이브러리당 펩티드 수로 나눈 주어진 값보다 휠씬 높다(가령, IC50값이 낮음). 또한, 정제된 개별 펩티드의 활성 값은 농도를 계산하는데 이용되는 서브-라이브러리의 총 중량에 염 및 불순물이 존재하기 때문에 더 클 수 있다.
in vivo 실시예:
동물에서 생장-호르몬, 아밀라제, 리파제, 위산, 인슐린, 콜레시스토키닌(CCK), VIP, 글루카곤 분비를 방해하는데 대해 선택된 유사체를 in vivo에서 테스트하였다. 생장 호르몬(GH) 방출은 선단비대증과 관련이 있다. 위산 분비는 위산과다분비로 인한 다발성 위궤양(Zollinger-ellison 증후군) 및 궤양과 연관이 있다. 인슐린 방출은 인슐린혈증, 과인슐린증, 비만, NIDDM와 관계가 있다. 글루카곤 방출은 과혈당증, NIDDM, 글루카곤증과 연관이 있다. 아밀라제, 리파제 방출은 급성 및 만성 췌장염, 내장 피부 및 췌장 치루 및 췌장 외과술과 연관이 있다. VIP는 VIPoma와 분비성 설사와 연관이 있다. 또한, GH-IGF 또는 CCK 방출을 통하여 직간접적으로 소마토스태틴의 항-증식효과를 줄 수 있다.
실시예 87; 소마토스태틴 생물학적 활성 검사(in vivo 검사)
생장 호르몬, 인슐린, 글루카곤 방물에서 in vivo SST 유사체의 생물학적 효과는 시판되는 RIA 테스트 키트를 이용하여 이들 호르몬 수준을 측정하여 테스트를 하였다. 장의 신경엔도크린 종양이 있는 환자에 SST의 약리학적 효과는 5-하이드록시인돌 아세트산(암양종 종양의 경우) 및 VIP(VIPoma의 경우)를 결정하는 것을 요구한다. 방사능-요오드가 결합된 SST 유사체를 i.v.투여후에 Lambert et al. (New England J. Med., 323:1246-1249 1990)의 방법에 따라 SST 수용체-양성 종양을 보는 것을 실행한다.
실시예 88; SST 유사체의 생분해 저항
사람의 혈청에서 SST 고리 펩티드 유사체, PTR 3002의 in vitro 생체 안정성을 측정하고, 이를 비-고리형 펩티드 유사체(PTR 3001), 옥트레오티드(SandostatinTM), 고유 소마토스태틴(SRIF)의 동일 서열과 비교를 하였다. 이 검사에서, 본 발명에 따른 고리형 펩티드는 옥트레오티드 만큼 안정하고, 이에 상응하는 비-고리형 구조보다는 더 안정적이고, SRIF보다는 휠씬 안정하였다. 이 검사는 37℃에서 혈청에서 시간에 대한 함수로써 펩티드 분해를 HPLC로 측정한 것에 기초한다.
실시예 89: SST 유사체에 의한 생장 호르몬 방출 방해
공지의 과정에 따라 쥐에서 고리형 펩티드 SST 유사체의 약리역학적 성질을 in vivo에서 결정하였다. 펩티드 투여 결과로 생장 호르몬(GH) 방출이 방해받는 것은 Sprague-Dawley 수컷 쥐에서 측정하였다. 이 연구에서는 SST 고리 펩티드 유사체의 활성을 각 집단에 있는 4마리 쥐를 이용하여 SRIF 또는 옥트레오티드와 비교를 하였다. 일정한 실험조건에서 GH 방출에 대한 시간에 따른 과정을 측정하였다.
방법
특정 병인균이 없는(SPF), 체중이 200-350g인 어른 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 일정한 명암 과정(8:00 부터 20:00시까지 조명을 제공), 온도(21 ±3℃), 상대습도(55 ±10%)하에 유지시킨다. 실험실 음식 및 수돗물은 자유롭게 이용할 수 있다. 실험하는 날에, 쥐는 펜토바르비톤(50㎎/㎏)으로 마취를 시켰다. 펜토바르비톤으로 마취된 쥐는 문맥 혈관에서 소마토스태틴 수준이 낮게 나타났다(Plotsky, P.M., Science, 230, 461-463, 1985). 기저수준의 GH를 결정하기 위해 노출된 캐뉼라 경부정맥으로부터 1회 혈액 샘플(0.6㎖)을 취한다(15분간). 동물에는 고유 소마토스태틴(SRIF) 또는 고리형 유사체 옥트레오티드(Sandostatin) 또는 고리형 펩티드 유사체 10㎎/㎏을 제공한다. 기분으로는 생리염 용액(0.9% NaCl)을 투여한다. 모든 펩티드는 최종 용적이 0.2㎖이 되도록 피하로 투여한다. 펩티드 투여후에 추가로 15, 30, 60, 90분에 추가 샘플링을 한다. 혈액 샘플은 헤파린(혈액 1㎖당 15Unit)을 포함하는 튜브에 모으고, 바로 원심분리하였다. 혈장은 분리하여 검사를 할 때 까지 -20℃에 냉동 보관한다.
쥐 생장 호르몬(rGH) [125I] 수준은 방사능면역검사 키트(Amersham)를 이용하여 결정한다. 이 키트의 표준은 National Institute of Diebetes and Digestice and Kidney Disease로부터 구한 기준 준비물(NIH-RP2)에 대해 계산을 한 것이다. 모든 샘플은 2회 반복 측정하였다.
이들 실험 결과를 보면, 옥트레오티드는 생장 호르몬 방출을 상당히 방해하는 반면에, SSTR-5에 결합을 할 수 없는 고리 유사체 PTR 3046는 이 테스트에서 염과 거의 차이가 없었고, 이는 SSTR-5 수용체 서브-타입에 대한 소마토스태틴 유사체의 선택성으로 예측된다.
이들 연구의 데이터는 도 3에 나타내었다.
실시예 90; 고리형 펩티드 유사체의 독성 결여
1회 복막 투여후에 PTR 3007은 1.5㎎/㎏약량에서 내성이 있었다. PTR 3013은 4㎎/㎏의 약량으로 사용을 하여도 쥐에 독성이 없었다. 이들 두 약량은 원하는 엔도크린 효과를 유도하는데 필요한 것보다 휠씬 높은 수준의 것이다. 염에 용해된 펩티드는 중추 신경에, 심장혈관계, 체온, 또는 동물의 말초에 부작용을 유도하지 않았다. 펩티드 투여후에 4시간동안 관찰하였다. PTR 3007과 3013에서는 호흡곤란이 없었고, 이는 전형적인 거동에 영향을 주지 않았고, 또는 근육 톤에도 변화가 없었다. 3시간 후에, 부검에서도 간, 신장, 동맥, 정맥, 위장관, 폐, 생식기 또는 지라에서도 이상이 감지되지 않았다.
실시예 91; 쥐에서 포도당 유도된 인슐린 방출시에 소마토스태틴 유사체의 in vivo 효과
인슐린 방출에 방해물질로써, 고유 소마토스태틴의 공지 생리학에 기초하여, 이 연구의 목적은 인슐린의 식후 분비에 기본구조에 고리를 형성한 PTR 3046 유사체의 영향을 평가한 것이다.
실험
특정 병인균이 없는(SPF), 체중이 200-220g인 어른 수컷 Wister 쥐를 일정한 명암 과정(8:00 부터 20:00시까지 조명을 제공), 온도(21℃), 상대습도(55%)하에 유지시킨다. 동물은 실험하기 18-20시간까지 물과 음식에 자유롭게 근접을 할 수 있다. 동물은 애분증(배설물을 먹는)을 막지위해 바닥에 넓은 와이어 매쉬가 있는 플라스틱 우리에 가둔다. 실험을 하는 날에, 쥐는 펜토바르비톤(60㎎/㎏ IP)으로 마취를 시키고, 펜토바르비톤으로 마취후 15분경에, 혈액을 샘플링하기 위해, 우측 외부 경정맥에 카테테르를 삽입을 한다. 직장에 디지탈 온도계를 삽입하여 체온을 모니터하고, 50㎝ 거리의 실험 테이블에 두 개 100W 전구를 조명을 가하고, 쥐아래에 가열된 담요를 넣어 일정하게 체온(37-37.5℃)을 유지시킨다. 캐뉼레이션후에, 혈액 0.7㎖을 경정맥으로부터 취하고, 이를 20IU 헤파린 (5000 IU/㎖)처리된 튜브에 옮긴다. 이와 같은 혈액 샘플은 기저 인슐린 수준을 결정하기 위해 수집한다. 바로 적절한 펩티드 선-처리를 투여한다.
동물은 다음의 펩티드를 수용한다; 합성된 유사체 옥트레오티드10㎍/㎏ (n=15), 기본구조 고리형 펩티드 PTR 3046 7㎍/㎏(n=18). 염(0.9% NaCl) 0.2㎖은 기준으로 투여한다(n=16). 모든 펩티드는 최종 용적이 0.2㎖가 되도록 피하로 투여한다. 약물 투여후 10분뒤에 혈액 샘플을 빼내고, 최종 약량이 0.5g/㎏이 되도록 포도당 용액을 IV로 바로 투여한다. 샘플링은 포도당 투여후 2분과 5분에 실시한다.
각 혈액 샘플을 수집한 후에 바로 적정량의 염(0.7㎖)을 IV로 투여한다. 혈액 샘플은 헤파린(혈액 ㎖당 15Unit)을 포함하는 튜브에 넣고, 원심분리(1500g)한다음 혈장은 분리하고, -20℃에 냉동 보관한다(검사할 때 까지).
쥐 인슐린(rIns)[125I] 수준은 쥐 인슐린 RIA 키트를 이용하여 결정한다. 이 키트는 쥐 인슐린(Linco)에 특이적인 항체를 이용한다. 키트의 감응성은 0.1ng/㎖이다. 모든 샘플은 이중으로 측정을 한다.
결과
7㎍/㎏ PTR 3046을 투여하면, 처리안된 기준 쥐와 비교를 하였을 때, 인슐린 방출에서 유의성(p＜ 0.05)이 감소된다(43%). 옥트레오티드 선처리된 쥐에서 인슐린 수준의 감소는 이 실험에서는 통계학적으로 의미가 없다.
이들 결과에서, 기본구조 고리형 펩티드 PTR 3046은 in vivo에서 식후 인슐린 방출의 강력한 방해물질이라는 것을 설명한다. 현재 연구와 옥트레오티드(26㎍/㎏의 인슐린 방출에 대한 ED50)에서 보고된 것에 기초하면, in vivo에서 PTR 3046은 인슐린 방출에 대해 옥트레오티드보다 4배 이상 강력하다.
비만과 비-인슐린 의존성 진성당뇨병(NIDDM)의 초기 단계의 질병과 연관된 병인 인자중의 하나이다. 따라서, 인슐린 방출에서 항-분비물질로써 PTR 3046의 이용 가능성은 이와 같은 신규한 SST 유사체로 인슐린 분비를 강력하게 방해한다고 볼 수 있다.
본 연구의 데이터는 도 4에 요약하였다.
실시예 92: 봄베신에 의해 자극을 받은 혈장 아밀라제 및 리파제 방출에 소마토스태틴 유사체의 효과
인슐린 또는 아밀라제 방출을 방해하는 것에 대해서, SST 수용체 서브타입 SSTR-5에 친화력과 매우 유관하다고 보고를 하고 있고(Reisine and Bell, ibid.), 뇌하수체 생장 호르몬(GH) 방출, 췌장 글루카곤, 위산 방출의 방해는 SSTR-2이 중개한다. 상기 제시한 결합 친화력 데이터(실시예 85)에서는 SSTR-1, 2, 3, 4에 대한 낮은 친화력(＞1000nM)과 비교를 하였을 때, hSSTR-5에 대한 고리형 헵타펩티드 PTR 3046의 선택성(친화력 20nM)을 설명한다. 이와 같은 결과에 기초하여, 봄베신 자극을 받은 리파제 및 아밀라제 방출의 in vivo 모델을 이용하여 PTR 3046의 생리학적 활성을 예비로 평가하였다. 쥐에서 아밀라제 및 리파제 방출의 저해에 대해 PTR 3046의 약량 반응은 세가지 다른 약량 즉, 3㎍/㎏, 12.5㎍/㎏, 25㎍/㎏에서 펩티드 유사체를 투여한 후에 측정하였다. 이들 약량은 10 ㎍/㎏의 약량에서 투여된 합성 유사체 SMS-201 995의 것과 비교하였다.
방법
수컷 Wister 쥐(체중 200-220g)는 복막 경로(IP)를 통하여 펜토바르비탈(60㎎/㎏)로 마취를 시킨다. 동물은 실험하기 18시간전까지 음식 및 물에 가유롭게 근접을 할 수 있고 실험시에는 모든 음식(물을 제외한)을 제외한다. 또한, 동물은 배설물을 먹는 것을 방지하기 위해 성긴 메쉬 와이어가 있는 우리에 가둔다.
샘플의 수집
캐률레이션후에, 경정맥으로 부터 혈액 샘플 0.7㎖를 취하고, 이는 20 IU 헤파린 용액 5000 IU/㎖이 포함된 에펜도르프 튜브에 옮긴다. 1분 후에, 펩티드는 피하로 피하로(SC 0.2㎖ 0.9% NaCl) 투여한다. 기준 쥐는 0.2㎖ 0.9% NaCl로 처리한다. 0시간(기준 혈액 샘플-1의 수집후 5분경)에, 봄베신 주입(50nmol/㎏/hr)을 모든 동물에서 시작한다. 봄베신 주입하는 동안에 60, 90, 120분의 일정 간격으로 추가 혈액을 수집한다.
샘플의 처리
혈액 샘플은 헤파린(20 IU/㎖)이 포함된 얼음 냉각된 튜브안에 모으고, 원심분리(1500g ×10min.)한다. 혈장 샘플은 냉동시키고, 아밀라제 및 리파제로 검사를 할 때 까지 -20℃에 보관한다.
분석학적-검사
아밀라제 수준은 시판되는 (RaichemTM) 아밀라제 시약으로 혈장에서 측정한다.
리파제 수준은 시판되는 키트(RandoxTM)로 혈장에서 측정한다.
결과
SST-유사체에 의해 봄베신-자극을 받은 아밀라제 분비는 방해를 받는다.
기준(염 선처리);
50nmol/㎏/h 약량으로 봄베신을 I.V. 주입하면, 혈장에 아밀라제는 시간에 대한 함수로 증가된다(60과 90분에서 기준에 10배), 리파제는(60분과 90분에서 기준보다 14배).
PTR 3046:
PTR 3046로 선처리를 하면 기준 쥐와 비교를 하였을 때, 혈장 아밀라제의 봄베신 유도된 방출이 약량에 따라 상당히 방해되었다. 3㎍/㎏ 약량의 경우에 90분에서는 31% 저해, 120분에서는 23% 저해되었고, 25㎍/㎏ 약량의 경우에, 90분에서는 60%, 120분에서는 52% 저해되었다. 10㎍/㎏ 약량에서 옥트레오티드로 선처리한 경우에는 이들 시간대에서 약 23% 저해가 있었다.
SST 유사체에 의한 봄베신-자극을 받은 리파제 분비의 방해
PTR 3046:
PTR 3046로 선처리를 하면, 기준 쥐와 비교를 하였을 때, 혈장 아밀라제의 봄베신 유도된 방출이 약량에 따라 상당히 방해되었다. 3㎍/㎏ 약량의 경우에 90분에서는 33% 저해, 120분에서는 26% 저해되었고, 12.5㎍/㎏ 약량의 경우에, 90분에서는 30%, 120분에서는 25% 저해되었고, 25㎍/㎏ 약량의 경우에, 90분에서는 51%, 120분에서는 35% 저해되었다. SMS를 10㎍/㎏에서 선처리를 하면, 90분과 120분에서 각각 27%, 30%의 상당한 저해가 있었다.
PTR 3010(데이터는 나타내지 않음)를 이용하여도 유사한 결과를 얻는다.
이와 같은 결과에서 PTR 3046는 효소 및 엔도크린 분비의 생리학적 모델 및 예비 결합 검사에서 나타낸 것과 같이 SSTR-5에 대해 선택적인 유사체라는 것이다.
췌장 및 위산 분비를 자극하는 봄베신은 봄베신 길항제, 봄베신 항체, 소마토스태틴 유사체의 항-분비 효과를 평가하기 위한 in vivo 모델이다.
사람에서 몇가지 폐와 장 질환에서 봄베신의 가상 역할은 PTR 3010과 PTR 3046과 같이, 봄베신의 분비 효과를 방해하는 약물이 봄베신과 연관된 다양한 치료요법적 표적에 약리치료제로 이용될 수 있는데; 예를 들면, 췌장염, 비염, 위염과 같은 분비성 질환; 폐기관지 이상, 낭포성 섬유증, 만성 기관지염 및 객담과 같은 뉴로크린 세포 과형성 질환; 전립선 비대증, 전립선 암, 췌장 암, 위암과 같은 증식성 질환.
또한, 문맥 고혈압, GI 출혈, 직장 암육종에도 이용될 수 있을 것이다.
실시예 93: 십이지장 관주
봄베신 또는 케룰렌(Caerulein) 모델로 한정하는 것이, 이들 테스트가 혈장에서 효소 수준을 간접적으로 감지하는 것에 기초하기 때문이다. 아밀라제는 타액 및 GI 기관의 다른 부위로부터 방출되기 때문에, 효소가 췌장 방출에 영향을 직접측정할 필요가 있다. 이를 위해, 쥐에서 관주 모델을 개발하였다. 결과(도 5)에서는 PTR 3046과 소마토스태틴(IV 관주에 의한 투여)은 모두 십이지장 관주에 의해 간접적으로 감지되는 것과 같이, 효소의 췌장 방출을 방해하는 것을 알 수 있다.
췌장 방출을 하는 십이지장 단편은 위장 전단과 공장 말단에서 분리하였다. 단편은 생리학적 염으로 관주를 시키고, 관주물은 15분 간격으로 수집한다. 봄베신 또는 케룰렌(Caerulein)으로 각각 1 nMole/㎏/h 또는 4 nMole/㎏/h을 I.V. 주입하여 췌장 방출을 자극한다. 관주하는 동안에(효소 수준이 평탄부 수준에 도달 한 후에), 약물은 추가 2시간동안 I.V.로 주입한다. 관주물 샘플에서 췌장 효소 수준을 측정한다. 데이터는 봄베신 유도된 평탄부 수준에 대한 평균 효소 수준의 비율로 나타낸다.
실시예 94; 항-증식성 활성
케룰렌(CCK 유사체)에 의해 유도되는 엑소크린 방출에 기초하여, 그리고 CCK는 GI관에 강력한 생장 인자이기 때문에, GI 종양에서 유도한 암 세포주에서 PTR 3046의 항-증식 활성을 테스트하는 것이 바람직하다.
사람 췌장 세포 주 MiaPaca-2(도 6)에서 PTR 3046의 항 증식 효과가 크다는 것을 발견하였다.
세포는 10% FCS 보충된 DMEM 배양 배지에 생장을 시킨다. 세포는 24시간후에 플레이트에 부착된다. 약물을 10-5M-10-11M 농도 범위로 배양 배지에 참가한다. 세포 증식은 약물을 사용후에, 24, 48, 72 시간에서 MTT 검사에 의해 평가를 한다.

Claims (18)

  1. 다음의 일반 구조식 I을 가지는 것을 특징으로 하는 기본구조에 고리가 형성된 소마토스태틴 유사체.
    이때, a - c는 각각 1-8 또는 0이 되는 정수를 나타낸다; (AA)는 아미노산 잔기를 나타내는 것으로, 각 사슬에서 아미노산 잔기는 동일하거나 상이할 수 있다; Q는 H 또는 아실기를 나타내고; E는 하이드록시기, 카르복시 보호기 또는 아미노기 또는 CH2-OH로 환원된 말단 카르복시기가 되고; R1와 R2는 각각 특정 보호기에 결합된 아미노산 측쇄를 나타내고; 라인은 구조식 -(CH2)x-M-(CH2)y-에서 연결 기를 나타내고; M은 아미드, 티오에테르, 티오에스테르 및 이황화물에서 선택되고; x 와 y는 각각 1 내지 10의 정수를 나타낸다.
  2. 제 1 항에 있어서, 다음의 일반 구조식(Va)를 가지는 것을 특징으로 하는 기본구조에 고리가 형성된 소마토스태틴 유사체.
    이때, m 과 n은 1 내지 5이고; X는 카르복시 말단 아미드 또는 알코올을 나타내고; R5는 없거나 또는 Gly, (D)-또는 (L)-Ala, (D)- 또는 (L)-Phe, Nal, β-Asp(Ind)이고; R6와 R11는 각각 독립적으로 Gly 또는 (D)- 또는 (L)-Phe이고; R7는 Phe 또는 Tyr이고; R10는 없거나 Gly, Abu, Thr 또는 Val이고; R12는 없거나 또는 Val, Thr 또는 Nal이고, Y2는 아미드, 티오에테르, 티오에스테르 및 이황화물이다.
  3. 제 2 항에 있어서, 일반구조식(Vb)를 가지는 것을 특징으로 하는 기본구조에 고리가 형성된 소마토스태틴 유사체.
    이때, m 과 n은 1 내지 5이고; X는 카르복시 말단 아미드 또는 알코올을 나타내고; R6와 R11는 각각 독립적으로 Gly 또는 (D)- 또는 (L)-Phe이고; R7는 Phe 또는 Tyr이고; R10는 없거나 Gly, Abu, Thr 또는 Val이고; Y2는 아미드, 티오에테르, 티오에스테르 및 이황화물이다.
  4. 제 3 항에 있어서, 다음의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 기본구조에 고리가 형성된 소마토스태틴 유사체.
    cyclo[NPhe-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-NPhe]-Thr-X
    이때, X는 카르복시 말단 산, 아미드, 에스테르 또는 알코올이다.
  5. 제 4 항에 있어서, 다음의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 기본구조에 고리가 형성된 소마토스태틴 유사체.
    이때, X는 카르복시 말단 산, 아미드, 에스테르 또는 알코올이다.
  6. 제 3 항에 있어서, 다음의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 기본구조에 고리가 형성된 소마토스태틴 유사체.
    cyclo[NPhe-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-NPhe]-Val-X
    이때, X는 카르복시 말단 산, 아미드, 에스테르 또는 알코올이다.
  7. 제 4 항에 있어서, 다음의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 기본구조에 고리가 형성된 소마토스태틴 유사체.
    이때, X는 카르복시 말단 산, 아미드, 에스테르 또는 알코올이다.
  8. 제 1 항에 있어서, 다음의 구조식(XI)를 가지는 것을 특징으로 하는 기본구조에 고리가 형성된 소마토스태틴 유사체.
    이때, i와 j는 각각 독립적으로 1 내지 5이고; X는 카르복시 말단 아미드 또는 알코올이고; R5은 (D)Phe 또는 (L)Phe, Ala 또는 Lys이고; R6는 없거나 Phe이고; R7는 Tyr 또는 Phe이고; R10는 없거나 또는 Thr, Val, Ser 또는 Abu이고; R11는 Phe, Gly 또는 Ala이고; R12는 Trp, Thr, Val, 2-Nal 또는 (D)2-Nal이고; Y1는 아미드, 티오에테르, 티오에스테르, 이황화물에서 선택된다.
  9. 제 1 항에 있어서, 다음의 구조식(XII)를 가지는 것을 특징으로 하는 기본구조에 고리가 형성된 소마토스태틴 유사체.
    이때, i와 j는 각각 독립적으로 1 내지 5이고; X는 카르복시 말단 아미드 또는 알코올이고; R5은 Phe, (L)2-Nal 또는 (D)2-Nal이고; R6는 Phe, Gly 또는 Ala이고; R7은 (D)Phe, pCl(D)Phe, pNH2Phe 또는 (D)Tyr이고; R10은 (D)Thr, (D)Val (D)Ala, (D)Leu 또는 (D)Glu이고; R11은 Phe, Gly 또는 Ala이고; R12은 없거나 또는 Thr 또는 Val이고; Y1는 아미드, 티오에테르, 티오에스테르, 이황화물에서 선택된다.
  10. 제 1 항에 있어서, 다음의 구조식(XIII)를 가지는 것을 특징으로 하는 기본구조에 고리가 형성된 소마토스태틴 유사체.
    이때, i와 j는 각각 독립적으로 1 내지 5이고; X는 카르복시 말단 아미드 또는 알코올이고; R5는 없거나 또는 (D)Phe 또는 2-Nal이고; R6는 Phe, Gly 또는 Ala이고; R7는 (D)Phe, pCl(D)Phe, pNH2Phe 또는 (D)Tyr이고; R8는 (D) 또는 (L)Trp이고; R10는 (D)Thr, (D)Val, (D)Ala, (D)Leu 또는 (D)Glu이고; R11는 Phe, Gly or Ala이고; R12는 Thr, Val, Ala, β-Ala, (L)2-Nal 또는 (D)2-Nal이고; Y1는 아미드, 티오에테르, 티오에스테르, 이황화물에서 선택된다.
  11. 제 1 항에 있어서, 다음의 구조식(XIV)를 가지는 것을 특징으로 하는 기본구조에 고리가 형성된 소마토스태틴 유사체.
    이때, i와 j는 각각 독립적으로 1 내지 5이고; X는 카르복시 말단 아미드 또는 알코올이고; R1은 Ala 또는 (D)2-Nal이고; R3은 Phe, Gly, Ala 또는 Lys이고; R4은 Lys 또는 Arg이고; R5은 (L)Asn 또는 (D)Asn이고; R7은 Phe, Gly, Ala 또는 Lys, 이고; Y1는 아미드, 티오에테르, 티오에스테르, 이황화물에서 선택된다.
  12. 제 1-11항중 어느 한 항에 따른 소마토스태틴 유사체와 제약학적으로 수용가능한 담체 또는 희석제로 구성된 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 소마토스태틴 유사체는
    cyclo[NPhe-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-NPhe]-Thr-X이고, 이때, X는 카르복시 말단 산, 아미드, 에스테르 또는 알코올인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 단위 약량형인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  15. 제 12 항에 있어서, 소마토스태틴 유사체는
    cyclo[NPhe-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-NPhe]-Val-X이고, 이때, X는 카르복시 말단 산, 아미드, 에스테르 또는 알코올인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 단위 약량형인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  17. 엔도크린 질환, 신조직형성 질환 또는 대사 질환을 치료하는 방법에 있어서, 이와 같은 치료를 요하는 환자에게 제1항-제11항중 어느 한 항에 따른 소마토스태틴 유사체 치료효과량을 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 엔도크린 질환, 신조직형성 질환 또는 대사 질환을 치료하기 위한 약물을 제조하는데 제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 따른 소마토스태틴 유사체를 이용하는 것을 특징으로 하는 소마토스태틴 유도체의 이용 방법.
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