KR100689402B1

KR100689402B1 - 기본구조에 고리가 형성된 소마토스태틴 유사체

Info

Publication number: KR100689402B1
Application number: KR1020007014431A
Authority: KR
Inventors: 베레드 호니크; 미쉘엠. 아파르간; 가리 겔러만
Original assignee: 디벨로겐 이스라엘 엘티디
Priority date: 1998-06-19
Filing date: 1999-06-15
Publication date: 2007-03-08
Also published as: JP2002518339A; US20020052315A1; JP4637352B2; IL139956A0; US6930088B2; DK1085896T3; CA2335488C; ATE362371T1; US20050043226A1; DE69936100T2; CA2335488A1; WO1999065508A1; EP1085896A1; ES2288029T3; AU4288499A; DE69936100D1; KR20010071523A; EP1085896B1; US6355613B1; CY1106781T1

Abstract

소마토스태틴 수용체 서브타입 선택성을 가지고, 모양적으로 억압된 기본구조가 고리화된 소마토스태틴 유사체인 신규한 펩티드에 대해 설명한다. 수용체 서브타입 선택성 패턴으로 치료요법적으로 이용성이 개선된 화합물을 제공한다. 소마토스태틴 유사체를 합성하는 방법 및 소마토스태틴 유사체를 선별하는 방법도 설명한다. 또한, 소마토스태틴 유사체로 구성된 제약학적 조성물, 이와 같은 조성물을 이용하는 방법에 대해서도 설명한다.

Description

기본구조에 고리가 형성된 소마토스태틴 유사체{CONFORMATIONALLY CONSTRAINED BACKBONE CYCLIZED SOMATOSTATIN ANALOGS}

본 발명은 새로운 결합을 통하여 고리를 형성한 구조적으로 속박된 N^α기본구조의 고리형 소마토스태틴(somatostatin), 유사체 및 이를 포함하는 제약학적 조성물에 관계한다.

소마토스태틴은 말초 조직 및 중추 신경계에 있는 고리형 테트라데카펩티드이다. 이는 포유류 시상하부에서 처음으로 분리하였고, 이는 전방 뇌하수체로부터 생장 호르몬의 주요 방해물질로 확인되었다. 이의 여러가지 생물학적 활성에는 췌장으로부터 글루카곤 및 인슐린 분비를 방해하고, 대부분 내장 호르몬을 조절하고, 운동 활성에 연관된 다른 신경전달물질의 방출 및 중추 신경제를 통하여 인지 과정에 연관된 신경전달물질의 방출을 조절한다(Lamberts, Endocrine Rev., 9:427, 1988). 또한, 소마토스태틴과 이의 유사체는 다양한 형태의 종양을 치료하는데 상당히 유용한 항-증식억제 물질이다.

다음의 구조로 된 천연 소마토스태틴(이는 또한 소마토트로핀 방출 저해인자, SRIF)은 Guillemin 및 그의 동료(Bruzeau et al. Science, 179:78, 1973)에 의 해 처음으로 분리되었다;

이는 수용체 족과 상호작용을 하여 이의 효과를 나타낸다. 최근에는 SSTR1-5라고 명한 다섯개 수용체 서브타입이 확인되어 클론되었다. 이들 수용체 서브타입간에 정확한 기능 차이에 대해서는 아직 밝혀진 바가 없다. 이의 천연형에서, 소마토스태틴은 생체이용성이 나쁘고 작용하는 시간이 짧은 등의 두 가지 바람직하지 못한 성질을 나타내기 때문에 치료제로 사용에 제한을 받아왔다. 이와 같은 이유로, 지난 20년간 성능, 작용 시간, 생장 호르몬, 인슐린 또는 글루카곤등의 방출을 방해하는데 있어서 선택성등에 우수한 성질을 가지는 소마토스태틴 유사체를 발견하는데 상당한 노력을 기울였다.

구조-활성 연관 연구; CD, 핵 자기 공명과 같은 스펙트로스코피 기술, 분자 모델링 방식으로 다음과 같은 사실을 밝혀내었다; 천연 소마토스태틴의 고리 일부 모양은 안티페어랠 β-쉬트와 상당히 비슷하였고; Phe⁶와 Phe¹¹는 두개의 방향족 고리사이에 소수성 작용을 통한 약제 모양의 안정성에 상당히 주요한 기능을 하고; 안티패어랠 β-쉬트에서 β-턴 주변에 있는 네개 아미노산 Phe⁷-Trp⁹-Lys⁹-Thr ¹⁰이 약제 활성에 필수적인 것이고; (D)Trp⁸이 소마토스태틴 수용체 서브타입 2-5와 상호작용을 하는데 (L)Trp⁸보다 더 바람직하다는 것이다.

그럼에도불구하고, 이황화결합에 의해 서로 서로 가까이 있는 이들 네개 아미노산을 포함하는 헥사펩티드 소마토스태틴 유사체는 천연 소마토스태틴에서 Phe⁶-Phe¹¹ 소수성 상호작용을 대체하는 공유 이왕화결합을 가지는 장점이 있지만, in vivo 및 in vitro에서 모두 활성을 가지지 못한다.

이와 같은 헥사펩티드 소마토스태틴 유사체의 활성을 증가시키기 위해 4 가지 방식을 시도하였다. (1) 시스-아미드 결합을 조장하여 이황화결합을 대체하거나 또는 분자에 제 2 고리화반응을 시켜 두개 고리 유사체를 만든다. 이 두가지 경우에 생성된 유사체는 구조적 자유도가 감소된다. (2) Phe⁷-(D)Trp⁸-Lys⁹-Thr ¹⁰에서 원래 잔기를 다른 천연 또는 비-천연 아미노산으로 대체를 하는데, Phe⁷은 Tyr⁷으로 대체를 하고, Thr¹⁰은 Val¹⁰으로 대체를 하였다. (3) 천연 소마토스태틴으로부터 추가 기능기를 결합을 시키는데, 이와 같은 새로운 요소들이 수용체와 상호작용을 할 수 있는 것으로 본다. (4) 네가지 아미노산 Phe⁷-(D)Trp⁸-Lys⁹-Thr ¹⁰ 중 하나를 제거하는데 이와 같은 유사체가 더 선택성이 있다는 가정하에 실시한다.

다음과 같은 소마토스태틴 유사체, MK-678는

cyclo(N-Me-Ala⁶-Tyr⁷-(D)Trp⁸-Lys⁹-Val¹⁰-Phe); 상기 처음 세 가지 방법을 이 용하여 고안된 매우 강력한 소마토스태틴 유사체의 예이다(Veber, et al., Life Science, 34:371, 1984). 이와 같은 헥사펩티드 유사체에서, 시스-아미드 결합이 N-Me-Ala와 Phe¹¹ 사이에 위치하고, Tyr⁷와 Val¹⁰는 각각 Phe⁷ 와 Thr¹⁰ 로 대체되었고; Phe¹¹ 는 천연 소마토스태틴으로부터 결합되었다.

또 다른 그룹의 소마토스태틴 유사체(미국 특허 4,310,518와 4,235,886)에는 다음의 옥트레오티드(Octreotide)를 포함하는데 처음으로 승인된 현재 이용할 수 있는 소마토스태틴 유사체이다;

이는 상기 세번째 방식을 이용하여 개발된 것이다. 여기에서, (D)Phe⁵와 환원된 C-말단 Thr¹²-CH₂OH은 천연 Phe⁶ 와 Thr¹²에서 이용할 수 있는 공간의 일부를 점유하는 것으로 가정을 한다.

화합물 TT-232은 다음과 같고;

이는 상기 네번째 방법을 이용한 예로써 옥트레오티드와 상당한 연관이 있다. Thr¹⁰이 부족한 것이 항-종양 활성에 높은 기능적인 선택성을 가지는 원인인 것으로 본다.

이와 같은 매우 강한 소마토스태틴 유사체의 예를 보면, 6번과 11번의 페닐알라닌이 약제의 활성을 가지는 모양을 안정화시킬뿐만아니라 수용체와의 상호작용에 기능적인 역할도 한다는 것을 나타낸다. 또한 한개 페닐알라닌(Phe⁶ 또는 Phe¹¹)으로 수용체와 상호작용을 하는데 충분하지 또는 두개 모두가 필요한지는 아직 의문으로 남아있다.

소마토스태틴 수용체는 다섯가지 다른 수용체 서브타입족으로 구성되는데(Bell and Reisine, Trends Neurosci., 16, 34-38, 1993), 이들은 이들의 조직 특이성 및 생물학적 활성을 기초로하여 구별을 한다.

소마토스타틴 유사체는 약리학적 저해특성으로 인해, 호르몬-분비 종양과 호르몬-의존 종양에 걸린 환자의 치료에 사용할 수 있다. 현재, 전이 카르시노이드 종양과 관련된 증상(홍조, 설사, 심장판막 질환, 복통)과 혈관수축작용 내장 펩티드(VIP) 분비 선종과 관련된 증상(수성 설사)은 옥트레오티드로 치료한다. 옥트레오티드는 또한 중증 위장 출혈과 선단비대증의 치료에 승인받았다. 게다가 다양한 종양에서 고 친화성 소마토스타틴 수용체가 풍부하게 존재하면, 방사선-라벨된 소마토스타틴은 이들 종양의 시각화를 위해 생체내에서 사용할 수 있다(Lamberts et al. N. Engl. J. med., 334:246 1996). 신경내분비 종양, 특히, 카르시노이드와 VIP 종양에서, 옥트레오티드는 활성 작용제의 분비와 효과를 저해한다. 따라서, 다량의 분비 설사로 특징지어지는 VIP 종양에서, 소마토스타틴 유사체는 VIP 분비저해 및 장 분비에 대한 직접적인 효과를 통하여 설사를 감소시킨다. 하지만, 약 물에 대한 반응은 시간이 경과함에 따라 감소하는데, 이것은 종양 세포에 대한 소마토스타틴 수용체의 하향-조절 또는 수용체 네거티브 클론 생성에 기인한 것으로 보인다. 지속적인 항증식 효과의 부재는 이들 종양에서 발견되는 소마토스타틴 수용체 아유형 일부와 옥트레오티드의 낮은 친화성에 관계할 가능성이 높다(Lambert et al. ibid.).

고유 소마토스타틴과 옥트레오티드는 신경내분비 종양과 관련된 증상을 제외한 다른 분비성 설사 증상을 개선하는 것으로 알려지고 있다. 단 배변 증상과 관련된 분비성 설사, 회장조루형 설사, 고유 분비성 설사, 아밀로이드증과 관련된 설사, 당뇨성 설사의 조절이 보고되고 있다. 두 화합물은 또한, 확인가능한 병원균이 존재하지 않는 환자에서 AIDS와 관련된 불응성 설사에 약간의 효과를 보인다. 당분야에 공지된 소마토스타틴 유사체는 특히 항-신생물형성 작용제로서 충분한 선택성 또는 수용체 아유형 선택성을 제공하지 못한다(Reubi and Laissue, TIPS, 16, 110-115, 1995).

인슐린을 제외한 성장 호르몬 방출을 저해하는 2형과 5형 수용체에 선택적인 소마토스타틴 유사체는 비 인슐린 의존형 당뇨병(NIDDM)의 치료에 잠재적으로 사용할 수 있다. 글루카곤-방출 저해에 대한 낮은 효능은 인슐린에 대한 말초 저항의 감소와 당뇨-조절의 향상을 위해 바람직하다.

성장 호르몬은 말초에서 인슐린 수용체의 직접적인 길항물질이고, 성장 호르몬 과다생산은 인슐린 말초 저항과 관계한다. 성장 호르몬의 가장 중요한 생물 시그널인 상승된 IGF는 혈관장애, 망막병증, 신장장애와 같은 당뇨성 합병증과 관계 한다. 신장장애는 당뇨성 혈관장애의 주요 합병증으로, 당뇨환자의 말기 신장부전과 사망의 주요 원인중의 하나다. GH-IGF 축이 당뇨병 및 다른 신장장애에 상당히 관여한다는 것이 여러 가지 조사에서 밝혀졌다(Flyvbjerg A. Kidney Int. S12-S19, 1997). 최근에, 비-비만-당뇨병(NOD) 생쥐에서 상승된 혈청 성장 호르몬 수준이 사람에서 전술된 변화와 유사하다는 것이 밝혀졌다(Landau et al. J. Am. Soc. Nephrol. 8:A2990, 1997). 이들 발견에서, 당뇨성 망막병증에서 성장 호르몬-IGF 축의 역할이 자세히 밝혀졌고, 이차 당뇨-관련된 합병증에서 소마토스타틴의 잠재적인 치료요법적 효과에 대하여 검사하게 되었다

향상된 펩티드 유사체.

수용체 아유형에 대한 특이성이 높은 펩티드를 유사체를 수득하고, 따라서, 강화된 임상 선택성을 달성하는 것이 바람직하다.

유기화학과 분자생물학의 급속한 발전의 결과로, 약리학적 용도와 임상 용도에 충분한 양으로 다양한 생물활성 펩티드를 생산할 수 있게 되었다. 따라서, 최근에 펩티드가 관련된 질병의 치료와 섭생에 새로운 방법이 등장하고 있다. 하지만, 약물로서 펩티드의 용도는 다음의 요소: a) 위장관과 혈청에서 단백분해에 대한 낮은 대사 안정성; b) 특히, 상대적으로 높은 분자량, 특이적 수송 시스템의 부재 또는 둘 모두에 기인한 경구 섭취후 낮은 흡수; c) 간과 신장을 통한 급속한 배출; d) 펩티드 수용체의 기관내 광범위한 분산에 따른 비-표적 장기 시스템에서 불필요한 부작용으로 인해 제한된다.

고유 펩티드 분자의 단점을 극복하고, 따라서, 향상된 치료요법적 성질을 제 공하는 형태적으로 압축된 펩티드 유사체를 만드는 것이 가장 바람직하다.

기본 골격으로의 고리화을 제안한 Gilon, et al., (Bio-polymers 31:745, 1991)에 의해 형태적으로 압축된 펩티드에 대한 신규한 개념적 방법이 펩티드의 기본골격에서 도입되었다. 이런 전략의 이론적 장점에는 임의 펩티드의 특이적 수용체와 상호작용에 필수적인 측쇄를 간섭하지 않고, 펩티드 기본골격의 탄소 또는 질소를 통한 고리화을 달성하는 능력이 포함된다. 이런 개념은 임의의 관심있는 선형펩티드에 적용할 수 있는데, 제안된 전략에서 제한 요소는 결합기에 의해 연결되는 아미노산을 대체하는데 사용되는 적절한 구조단위의 이용가능성이었다. 기본골격 고리화 개념의 실제적인 실시는 글리신을 제외한 아미노산의 구조 단위를 제조하는 실용적인 방법을 고안하지 못해 실패하였다(Gilon et al., J. Org. Chem, 587:5687, 1992).

Gilon등에 의한 다른 공개공보(WO 95/33765; WO 97/09344)는 기본골격 고리화되는 펩티드 유사체의 합성에 필요한 구조 단위를 생산하는 방법을 제시하였다. 최근에, 소마토스타틴 활성을 보유한 기본골격 고리화 유사체를 만드는 방법의 성공적인 사용이 공개되었다(WO 98/04583). 이들 방법 모두는 여기에 참고문헌으로 한다.

당분야에서 이 글에서 제시한 향상된 치료요법적 선택성을 보유한 소마토스타틴 유사체가 제시 또는 제안된 바 없다.

본 발명의 요약

본 발명에 따른 신규한 펩티드 유사체는 결합기가 알파 아미노산의 알파 질소에 부착되는 신규한 구조단위를 포함한다는 점에서 특징적이다. 특히, 이들 화합물은 4 내지 24개의 아미노산 펩티드 서열로 구성된 기본골격 고리화 소마토스타틴 유사체인데, 각 유사체는 한가지이상의 구조단위를 통합하고, 상기 구조단위는 결합기에 연결되는 펩티드 기본골격의 질소 원자를 보유하고, 상기 결합기는 아미드, 티오에테르, 티오에스테르 또는 이황화물로 구성되고, 여기서, 한가지이상의 구조 단위는 환형 구조를 형성하는 상기 결합기를 통해 제 2 구조단위, 서열의 아미노산 잔기의 측쇄 또는 N-단부 아미노산 잔기에서 선택되는 성분과 연결된다. 가급적, 펩티드 서열은 4 내지 14개 잔기, 좀더 바람직하게는 4 내지 12개 아미노산, 가장 바람직하게는 5 내지 9개 아미노산을 포함한다.

지금까지, 형태적으로 압축된 기본골격 고리화 소마토스타틴 유사체는 주로 수용체 5아유형에 선택성을 보였다. 이들 유사체는 한정된 치료용도 또는 진단용도로 사용되었다.

본 발명에 따라, 적절한 유사체는 5아유형보다는 SST 3아유형에 향상된 선택성을 보이는 헥사펩티드 유사체가 된다. 가장 바람직한 유사체에는 SST 2아유형과 5아유형에 수용체 선택성을 보이는 소마토스타틴 유사체의 신규한 옥타펩티드 유사체가 포함된다. 다른 좀더 바람직한 소마토스타틴 유사체는 2개의 구조단위를 연결하는 제 1 환형 구조 및 제 2 환형 구조를 보유한 이중 환형 구조가 포함되는데, 이중 환형 구조는 측쇄 내지 측쇄; 기본골격 내지 기본골격; 기본골격 내지 단부에서 선택된다. 이들 이중 환형 유사체중 일부는 SST 2아유형에 대한 수용체 선택성을 보인다.

본 발명의 적절한 특정 헥사펩티드 유사체(이후 PTR 숫자 3123, 3113, 3171로 표시)의 경우, 아미노산 Asn은 5번 위치에서 기본골격 Phe 구조단위로 치환되었다. 8번 위치에서 고유 L-Trp의 D-Trp로의 입체이성질체 치환은 유사체의 안정성을 향상하기 위하여 실시하였다. 10번 위치에서 Thr 잔기는 상응하는 기본골격 Phe 구조단위로 치환하였다. PTR 3113과 비교할 때 PTR 3123과 3171에서 나타나는 9번 위치에서 L-Lys에서 D-Lys로의 독특한 형태 치환은 SST-R5보다는 SST 수용체 아유형 SST-R3에 대한 결합의 선택성을 향상시켰다.

본 발명의 가장 적절한 유사체는 SST 수용체 아유형 SST-R2와 SST-R5에 대한 결합의 선택성이 향상된 PTR 3173이다. 다른 가장 적절한 유사체의 경우, 결합은 아미노산의 { N}^{ alpha } - omega -기능 유도체와 펩티드 서열의 N-단부사이에 연결된다. 본 발명의 다른 적절한 유사체의 경우, 결합은 단부 티오기를 보유한 { N}^{ alpha } - omega 기능 유도체와 아미노산의 다른 유도체로 구성된 구조단위 및 Cys 잔기의 측쇄, 멀캡토-포함 산 또는 임의의 다른 SH 보유 성분사이에 연결되어, 이황화결합을 형성하게 된다.

아미노산 치환된 다른 적절한 유사체를 제시한다. 이의 예로는 화합물의 생체-이용효율을 향상시키기 위한 Phe 잔기의 N-메틸-Phe 잔기로의 치환 및 경구 생체-이용효율을 향상시키기 위한 아미노단부에서 단일-와 이중-사카라이드의 공액을 들 수 있다.

본 발명에 따른 가장 적절한 기본골격 고리화 소마토스타틴 유사체는 표1에 제시한다

표 1. 본 발명의 가장 적절한 유사체

여기서, X는 -NH₂또는 -OH이고, 결합기는 하기에 표시한 바와 같이 2개의 구조단위사이에 걸쳐있다: PTR 3171과 PTR 3173의 경우, 별표는 결합기가 아미노산의 { N}^{ alpha } - omega -기능 유도체와 펩티드의 N-단부사이에 연결된다는 것을 나타낸다. PTR 3197과 PTR 3207의 경우, 별표는 결합기가 아미노산의 { N}^{ alpha } - omega -기능 유도체와 Cys 잔기의 측쇄에 연결된다는 것을 나타낸다. PTR 3205는 이중 환형 화합물인데, 여기서 제 1 결합은 2개의 구조단위(Phe-C3과 Phe-N3)를 연결하고 제 2 결합은 2개의 Cys 잔기사이에 형성된 이황화결합이다. SST-R은 각 유사체가 선택성인 소마토스타틴 수용체 아유형을 나타낸다. 이들 기본골격 고리화 소마토스타틴 펩티드 유사체는 한가지이상의 아미노산 { N}^{ alpha } - omega -기능 유도체를 펩티드 서열로 통합하고, 이후, 펩티드 서열에서 아미노산의 측쇄중 하나 또는 다른 ω-기능 아미노산 유도체로 기능기를 선택적으로 고리화시켜 만든다. 아미노산의 { N}^{ alpha } - omega -기능 유도체는 가급적 다음의 화학식을 갖는다:

여기서, X는 알킬렌, 치환된 알킬렌, 아릴렌, 사이클로알킬렌, 치환된 사이클로알킬렌에서 선택되는 이격(spacer) 기이고; R'은 특이적 보호기와 선별적으로 결합되는 아미노산 측쇄이고; B는 알킬옥시, 치환된 알킬옥시 또는 아릴 카르보닐에서 선택되는 보호기이고; G는 아민, 티올, 알코올, 카르복실산과 에스테르, 알데하이드, 알코올, 알킬 할라이드에서 선택되는 기능기이고; A는 G의 특이적 보호기이다. 적절한 구조단위는 ω-기능 아미노산 유도체인데, 여기서, X는 알킬렌이고; G는 티올기, 아미노기 또는 카르복실기이고; R'은 아미노산의 측쇄다. ω-기능 아미노산 유도체 또한 바람직한데, 여기서, R'은 특이적 보호기로 보호한다. 좀더 바람직한 것은 ω-기능 아미노산 유도체인데, 여기서, G는 다음 화학식의 아미노기, 카르복실기 또는 티올기이다:

여기서, X, R', B는 상기 정의한 바와 같다.

이들 방법의 가장 큰 장점은 다음과 같다:

1) 펩티드 서열의 고리화은 펩티드의 임의 측쇄를 약화시키지 않고 달성함으로써, 생물 인식과 기능에 필수적인 기능기가 희생될 확률이 감소된다.

2) 결합 길이, 방향, 결합형태(예, 아미드, 이황화물, 티오에테르, 티오에스테르등)의 교환이 가능하여 펩티드 형태의 최적화를 달성할 수 있다.

3) 공지된 활성을 보유한 선형 펩티드를 고리화시켜 펩티드의 활성 영역과 이의 인식 수용체의 상호작용이 최소화되도록 결합을 고안할 수 있다. 이것은 고리화 부분이 인식과 기능을 간섭하는 기회를 감소시키고, 또한, 표식, 예를 들면, 방사성 탐침, 세포독성 약물, 광포획 물질 또는 임의의 다른 적절한 라벨을 부착시키는데 적합한 위치를 창출한다.

본 발명의 기본골격 고리화 유사체는 다음과 같은 질환: 암(카르시노이드 증후군 포함), 내분비 질환(선단 비대증과 NIDDM 포함), 당뇨-관련 합병증(당뇨성 신장장애, 당뇨성 혈관장애, 당뇨성 망막병증 포함), 위장 질환, 췌장염, 자가면역질환(류머티스 관절염과 건선 포함), 동맥경화증, 동맥차단, 수술후 통증, 염증질환을 치료하기 위한 제약학적 조성물 및 방법에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 소마토스타틴 유사체는 동맥경화증과 동맥차단에 관여하는 성장 인자를 저해하여 이들 질환을 예방하는데 사용할 수 있다.

본 발명에서 공개한 적절한 유사체는 대사 안정성, in-vivo 활성에서 선택성, 안정성의 독특한 특징을 보유한다. 가장 적절한 유사체(PTR 3173)는 카르시노이드 종양, 선단 비대증, 당뇨-관련 합병증의 치료를 위한 치료요법적으로 잠재성있는 약물-후보를 제공한다. 이런 가장 적절한 유사체는 현재 사용중인 다른 소마토스타틴 유사체에 비하여, 인슐린 또는 글루카곤에 대한 별다른 영향없이 성장 호르몬 저해에서 소마토스타틴 유사체와 동등한 효능을 보인다는 점에 상당히 유리하다.

제약학적 활성 기본골격 고리화 소마토스타틴 작용물질 또는 길항물질 및 제약학적으로 수용가능한 담체 또는 부형제로 구성된 제약학적 조성물은 암, 내분비 질환, 당뇨-관련 합병증, 위장 질환, 췌장염, 자가면역질환, 동맥경화증, 동맥차단, 수술후 통증, 염증질환을 치료하기 위하여 이런 조성물을 이용하는 방법과 같이 본 발명의 또 다른 구체예가 된다. 본 발명에 따른 제약학적 조성물은 가급적, 1개 또는 2개의 소마토스타틴 수용체 아유형에 선택적인 한가지이상의 기본골격 고리화 펩티드로 구성된다. 이들 제약학적 조성물은 임의의 적절한 투여 경로, 예를 들면, 경구, 국소 또는 전신에 투여할 수 있다. 적절한 투여 형태에는 정맥내 주사와 근육내 주사와 같은 장관외 경로 및 비강 또는 경구 섭취가 포함되지만, 이들에 국한시키지 않는다. 본 발명의 기본골격 고리화 유사체는 또한, 암을 진단하고, 종양 또는 이들의 전이 존재를 화상진찰하기 위한 방법에서 제약학적 조성물로 사용할 수 있다. 암을 진단하는 방법은 사람 환자를 비롯한 포유동물에 검출가능한 프로브, 예를 들면, 방사성 동위원소와 비-방사성 탐침으로 라벨된 기본골격 고리화 유사체를 투여하는 것으로 구성된다. 이런 조성물을 이용하여 암을 진단하고 화상진찰하는 방법은 본 발명의 다른 구체예가 된다.

도 1은 5개 사람 클론된 소마토스타틴 수용체와 SRIF 결합의 PTR-3173에 의한 저해%를 보여주는 그래프다.

도 2는 다양한 G-단백질 결합된 수용체에 대한 소마토스타틴 유사체의 비특이적 결합(100nM 농도에서 측정)을 보여주는 그래프다.

도 3은 본 발명에 따른 소마토스타틴 유사체의 성장 호르몬 방출에 대한 효과를 옥트레오티드와 비교하여 보여주는 그래프다.

도 4는 본 발명에 따른 소마토스타틴 유사체의 글루카곤 방출에 대한 효과를 보여주는 그래프다.

도 5a와 5b는 3가지 개별 실험에서, 본 발명에 따른 소마토스타틴 유사체의 인슐린 방출에 대한 효과를 옥트레오티드와 비교하여 보여주는 그래프다.

여기에서 설명을 하고 있는 화합물은 비대칭 중심을 가질 수 있다. 본 발명 에는 모든 키랄, 부분입체이성질체, 라셈체형을 포함한다. 올레핀 및 이와 유사한 것의 많은 구조 이성체가 본 발명의 화합물에 존재할 수 있고, 이와 같은 안정된 이성체는 본 발명에 포함된다.

quot;안정한 화합물" 또는 "안정한 구조"는 반응 혼합물로부터 유용한 순도로 분리할 때 살아남을 수 있을 정도의 충분한 강도를 가지고, 효과적인 치료제로 제조할 수 있는 화합물을 말한다.

여기에서 설명을 하고 청구하는 것과 같이, "알킬" 또는 "알킬레닐"은 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 분지쇄, 직쇄 포화된 지방족 탄화수소기를 포함하고; "알케닐"은 2개 내지 10개 탄소원자를 가지고, 사슬을 따라 임의 안정한 지점에서 발생할 수 있는 하나이상의 불포화 탄소-탄소결합을 가지는 직쇄 또는 분지쇄 모양의 탄화수소 가령 에테닐, 프로페닐등이 되고; "알키닐"은 2개 내지 10개 탄소원자를 가지고, 사슬을 따라 임의 안정한 지점에서 발생할 수 있는 하나이상의 불포화 삼중 탄소-탄소결합을 가지는 직쇄 또는 분지쇄 모양의 탄화수소 가령, 에티닐, 프로피닐등이 된다.

여기에서 설명되고, 청구되는 것과 같이, "아릴"은 임의 안정한 5 내지 7-구성원의 단고리 또는 이중고리 또는 7-14개 구성원의 이중고리 또는 삼중 탄소고리를 말하고, 이들중 임의의 것은 포화되거나 부분적으로 불포화되거나 방향족이 될 수 있는데 예를 들면, 페닐, 나프틸, 인다닐 또는 테트라하이드로나프틸 테트랄린등이 될 수 있다.

여기에서 설명되고, 청구된 것과 같이, "알킬 할로겐화물"은 1 내지 10개 탄소원자를 가지는 분지쇄 및 직쇄 포화된 지방족 탄화수소를 포함하는데, 이때 1 내지 3개 수소원자는 Cl, F, Br, I와 같은 할로겐 원자로 대체될 수 있다.

여기에서 설명되고, 청구된 것과 같이, "치료요법적으로 효과량"이란 염증, 암, 엔도크린 질환 및 위장관 질환등을 포함하나 이에 국한되지 않은 질환에 대해 원하는 결과를 얻기 위해 숙주에게 투여되는 새로운 기본구조에 고리를 형성한 펩티드 유사체 또는 이를 포함하는 조성물의 양을 의미한다.

여기에서 사용되고, 청구되는 "치환"이라는 용어는 지정된 원자에서 하나이상의 수소원자가 지정된 기에서 선택된 것으로 대체되는 것으로 단 지정된 원자의 정상적인 원자가를 초과해서는 안되며, 치환결과로 안정한 화합물이 되어야 한다.

여기에서 임의 구조식에서 1회이상 임의 변수(가령, R, X, Z,등)이 있을 경우에 각 발생지점에 있는 각 변수는 매 다른 발생 지점에서 정의된 것과는 독립적이다. 또한, 치환체와 변수가 복합되는 것은 이와 같은 복합으로 인하여 화합물이 안정화되는 경우에만 허용된다.

여기에서 사용된 "펩티드"에는 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 서열을 나타낸다. 본 발명의 소마토스태틴 펩티드 유사ㅔ는 4 내지 24개의 아미노산 잔기로 된 아미노산 서열, 바람직하게는 6 내지 14개 잔기로 된 아미노산 서열을 말하는 것으로, 이때 각 잔기는 아미노단부와 카르복시 단부를 가지는 것을 특징으로 한다.

quot;빌딩 유닛"은 일반 구조식 5의 N^α유도된 α아미노산을 나타낸다.

이때, X는 알킬렌, 치환된 알킬렌, 아릴렌, 호모- 또는 헤테로 사이클로알킬렌 및 치환된 사이클로알켈렌에서 선택된 스페이스기이고, R'는 특정 보호기에 선택적으로 결합된 아미노산 측쇄이고; G는 아민, 티올, 알코올, 카르복실산, 에스테르 및 알킬 할로겐화물에서 선택된 기능기하고 이들은 펩티드 서열에 결합하여 연속하여 기능기 G를 통하여 펩티드 서열에 있는 아미노산 측쇄중 하나와 고리를 형성하거나 또는 다른 ω-기능화된 아미노산 유도체와 고리를 형성한 것을 을 나타내는 것이다.

이와 같은 빌딩 유닛을 만드는 방법은 WO95/33765, WO98/04583, 미국특허 5,770,687; 5,883,293에서 설명을 하고 있으며, 이는 참고문헌으로 전문 첨부된다. 빌딩 유닛은 상응하는 변형 아미노산의 삼문자 코드에 연속하여 반응기의 형태(가령, 아민의 경우는 N. 카르복실의 경우에는 C)와 스페이스 메틸렌기의 수를 나타내는 약어로 표시를 한다. 예를 들면, Gly-C2는 카르복실 반응기에 변형된 Gly 잔기와 두개의 탄소 메틸렌 스페이스가 있다는 것을 나타내고, Phe-N3은 아미노반응기에 변형된 페닐알라닌 기가 세개의 탄소 메틸렌 스페이스를 가진다는 것을 나타낸 다.

일반구조에서, 빌딩유닛은 N문자 다음에 소문자 R을 사용하여 위치를 나타내는데, 이는 이들위치에서 기본이 되는 질소에 특정한 결합기가 부착됨을 나타내는 것이다.

여기에서 사용된 것과 같이, "기본구조 고리형 펩티드" 적어도 하나의 빌딩 유닛을 포함하는 선형 펩티드 유사체로써, 이때 빌딩 유닛은 펩티드 기본구조의 알파 질소를 통하여 또 다른 빌딩 유닛에 연결되거나 서열에 있는 또 다른 아미노산에 연결된 다리형을 가진다.

여기에서 사용된 특정 약어는 본 발명을 설명하고, 이를 만들고 이용하는 것을 설명하기 위해 사용된 것이다. 가령, AcOH는 아세트산을 의미하고, Alloc는 알릴옥시카르보닐을 말하고, Boc는 t-부틸옥시카르보닐 라디칼을 말하고, BOP는 벤조트리아조일-1-일옥시-트리스-(디메틸아미노)포스포니움 헥사플로로포스페이트를 말하고, DCC는 디사이클로헥실카르보디이미드를 말하고, DCM는 디클로로메탄을 말하고, DIEA는 디이소프로필-에틸 아민을 말하고, DMF는 디메틸 포름아미드를 말하고, EDT는 에탄에디티올을 말하고, Fmoc는 플로레닐메톡시카르보닐 라디칼을 말하고, GH는 생장호르몬을 말하고, MS는 질량 분광계를 말하고, NIDDM은 비-인슐린 의존성 진성 당뇨병을 말하고, NMM은 N-메틸몰포린을 말하고, NMP는 1-메틸-2-피롤리돈을 말하고, PyBOP는 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포니움 헥사플로오르포스페이트를 말하고, PyBrOP는 브로모-트리스-피롤리디노-포스포니움 헥사플로오르포스페이트를 말하고, RT는 실온을 의미하는 것이고, SRIF는 소마토스태틴 방출 저해 인자를 의미하는 것이고, TBTU는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우라니움 테트라플로오르보레이트를 말하는 것이고, t-Bu는 4차 부틸 라디칼을 의미하고, TFA는 트리플로오르아세트산을 말하고, VIP는 혈관 활성 내장 펩티드를 말한다.

본 발명에서 이용한 아미노산은 시판되는 것이나 또는 일상적인 합성 방법을 이용하여 합성할 수 있다. 특정 잔기를 펩티드내에 결합시키는데에는 특정 방법이 요구되고, 펩티드 서열에 대해 연속적인, 다양한 집중적인 합성 방식이 본 발명에 유용하다. 자연 코드 아미노산 및 이의 유도체는 IUPAC 협의에 따라 3문자 코드로 나타내었다. 다른 언급이 없는 한, L 이성체를 이용하였다. D 이성체는 잔기의 약어 앞에 "D"로 나타내었다. 코드에 없는 아미노산은 다음과 같다; Abu는 2-아미노부틸산이고; Aib는 2-아미노-이소부틸산이고; β-Ala은 β-알라닌을 말하고, ChxGly는 사이클로헥실 글리신을, Dab는 Di 아미노 부틸산은; GABA는 감마 아미노 부틸산; Hcys는 호모시스테인; (p-Cl)Phe는 파라 클로로 페닐알라닌, (p-NH₂)Phe는 파라 아미노 페닐알라닌; (p-F)Phe는 파라플로로 페닐알라니, (p-NO₂)Phe는 파라 인트로 페닐알라닌; 1Nal는 1-나프틸알라닌이고; 2Nal는 2-나프틸알라닌을 말하는 것이고; Nva는 노르발린이고; Thi는 티에닐알라닌이다.

당업자는 본 발명의 범위내에서 보존성 아미노산 치환도 속한다는 것을 인지할 것이다. 보존성 아미노산 치환에는 동일한 기능이 또는 측쇄를 가지는 것이 한개 아미노산과 치환된다는 것을 의미하는데 예를 들면, 지방족, 방향족, 양전하, 음전하등이 포함된다. 이와같은 치환에는 Phe 잔기가 N-메틸-Phe 잔기로 치환되어 화합물의 생체이용성을 증가시키고, 경구 이용성을 증가시키기 위해 아미노 말단에 모노-사카라이드 및 이중-사카라이드 부분을 결합시킨다거나(Nelson-Piercy et al. J. Clin. Endocrinol and Metab. 78:329; 1984)또는 경구 생체이용성을 강화시키는 치환, 중추신경계로 침투 강화, 특정 세포집단에 표적화를 강화시키는 것등이 포함된다.

합성 방법

본 발명에 따르면, 새로운 비-펩티드 결합을 만들기 위해 아미노산의 알파 질소에 부착된 연결기를 통하여 펩티드 유도체는 고리를 형성한다. 일반적으로 이들 빌딩 유닛으로부터 이와 같은 펩티드 유사체를 만드는데 이용되는 과정은 공지의 펩티드 합성 원리에 의존하는데, 가장 통상적으로는 이와 같은 과정은 고형 상 펩티드 합성의 공지 원리에 따라 실행한다. 본 발명은 펩티드 서열에 있는 하나이상의 아미노산에 다음의 일반 구조식을 가지는 새로운 빌딩 유닛을 대체하는 것을 요구한다.

이때, R은 아미노산의 측쇄이고, X는 스페이스기이고, G는 기능기로 이에 의해 고리화이 영향을 받는다. 측쇄 R은 임의 자연 또는 합성 아미노산의 측쇄로써 이는 선택된 펩티드 서열에 결합되도록 선택되는 것이다. X는 펩티드 유사체의 적절한 구조적인 구속을 얻기 위해 유연정도를 크게하거나 또는 적게하기위해 선택되는 스페이스기이다.

이와 같은 스페이스기에는 알킬렌 사슬, 치환된, 분지형, 불포화된 알킬렌, 아릴렌, 사이클로알킬렌, 불포화된 치환 사이클로알킬렌등을 포함한다. 또한, X과 R은 복합되어 헤테로사이클로 구조를 만들 수 있다.

펩티드 유사체의 고리화에 이용될 수 있는 말단(ω) 기능기는 다음을 포함하나 이에 국한하지는 않는다;

a. 아민; 이는 활성화된 카르복실 기, 알데히드, 케톤(연속적인 환원 유무하에), 알킬 또는 치환된 알킬 할로겐화물과 같은 친전자성 반응용.

b. 알코올; 활성화된 카르복실기와 같은 친전자성과 반응용.

c. 티올; 활성화된 카르복실기, 알킬 또는 치환된 알킬 할로겐화물과 같은 친전자성과 반응 및 이황화결합을 형성하기 위한 용도.

d. 1,2 디올 및 1,3 디올; 아세탈 및 케탈을 형성하기 위한 용도.

e. 알킨 또는 치환된 알킬; 아민, 티올 또는 카르바니온과 같은 친핵성; 자유 라디칼; 알데히드 및 케톤, 알킬 또는 치환된 알킬 할로겐화물과 같은 친전자성; 또는 유기금속 복합체와의 반응용;

f. 카르복실산 및 에스테르; 아민, 알코올, 티올과 같은 친핵성(사전 활성화반응 유무하에)과의 반응용.

g.알킬 또는 치환된 알킬 할로겐화물 또는 에스테르; 아민, 알코올, 티올, 카르바니온(아세토아세테이트 또는 말로네이트와 같은 활성 메틸렌기로부터)와 같은 친핵성물질과의 반응; 알켄 또는 치환된 알켄, 알킬렌 또는 치환된 알킬렌과 같은 연속 반응을 위한 자유 라디칼 형성용.

h. 알킬 또는 아릴 알데히드 및 케톤; 아민(연속적인 환원반응 유무하에), 카르바니온(아세토아세테이트 또는 말로네이트와 같은 활성 메틸렌기로부터), 디올(아세탈 및 케탈을 형성하기 위함)과 같은 친핵성 물질과의 반응용.

i. 알켄 또는 치환된 알켄; 아민, 티올, 카르바니온, 자유 라디칼 또는 유기금속 복합체와 같은 친핵성물질과의 반응용.

j. 활성 메틸렌기 가령, 말로네이트 에스테르, 아세토아세테이트 에스테르, 알데히드, 케톤, 알킬 또는 치환된 알킬 할로겐화물과 같은 친전자성물질과 반응하는 다른 물질.

펩티드를 합성하는 동안에 이들 반응 말단기 및 임의 반응성이 있는 측쇄는 적절한 보호기로 보호를 해야한다는 것은 인지할 것이다.

아민에 대한 적절한 보호기는 알킬옥시, 치환된 알킬옥시, 아릴옥시 카르보닐인데 예를 들면, 3차 부틸옥시카르보닐(Boc), 플로로레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc), 아릴옥시카르보닐(Alloc), 벤질옥시카르보닐(Z)등이 되나 이에 한정하지는 않는다.

고리를 형성하기 위한 카르복실 말단기는 이들 알킬 또는 치환된 알킬 에스테르 또는 티오 에스테르 또는 아릴 또는 치환된 아릴 에스테르 또는 티오 에스테르로 보호될 수 있다. 예를 들면, 3차 부틸 에스테르, 아릴 에스테르, 벤질 에스 테르, 2-(트리메틸실릴)에틸 에스테르 및 9-메틸 플로레닐등을 포함하나 이에 한정하지는 않는다.

고리를 형성하기 위한 티올 기는 이들의 알킬 또는 치환된 알킬 티오 에테르 또는 이황화물 또는 아릴 또는 치환된 아릴 티오 에테르 또는 이황화물로 보호받을 수 있다. 이와 같은 기에는 3차 부틸, 트리틸(트리페닐메틸), 벤질, 2-(트리메틸실릴)에틸, 픽실(9-페닐산텐-9-일), 아세타아미드메틸, 카르복시메틸, 2-티오-4-니트로피리딜등을 포함하나 이에 국한하지는 않는다.

당업자는 이들을 선택적으로 제거를 하기위해서 상이한 보호기에 의해 이와 같은 다양한 반응 기를 보호할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 특정 아미노산은 펩티드 서열에서 이에 인접하는 부분에 결합이 될 수도 있는데, N^α는 보호 기 A에 의해 보호를 받을 수 있다. 아미노산이 반응식에서 고리화을 위한 말단기로 이용되는 경우에, N^ω는 보호기 B에 의해 보호를 받거나 또는 임의 리신에 있는 ε아미노기는 보호기 C등에 의해 보호를 받는다.

다른 아미노산에 아미노산이 결합되는 것은 펩티드 합성 분야에 공지된 일련의 반응에 의해 실행할 수 있다. 본 발명의 신규한 빌딩 유닛 즉, N^α-ω기능화된 아미노산 유도체는 펩티드 서열에 결합되어 아미노산중 하나이상과 대체한다. 이와 같은 N^α-ω기능화된 아미노산 유도체가 한개만 선택된 경우에, 서열에서 또 다른 아미노산의 측쇄에 고리를 형성할 수 있다. 예를 들면, (a) N^α-(ω- 아미노 알 킬렌) 아미노산은 아스파르트산 또는 글루타민산 잔기의 카르복실기에 결합될 수 있고; (b) N^α-(ω-카르복실 알킬렌)아미노산은 리신 잔기의 ε-아미노기에 연결될 수 있고; (c) N^α-(ω-티오 알킬렌) 아미노산은 시스테인 잔지의 티올기에 연결될 수 있다. 본 발명의 좀더 바람직한 구체예는 이와 같은 두개의 N^α-ω기능화된 아미노산 유도체가 결합되어 이들은 다른 것에 연결되어 N-기본구조에 N-기본구조가 고리를 만든 펩티드 유사체를 형성한다. 이와 같은 빌딩 유닛 세개 이상이 펩티드 서열에 결합되어 하기에서 상술하게 되는 이중-고리 펩티드 유사체를 만든다.

따라서, 펩티드 유사체는 N-기본구조에 대해 N-기본구조의 고리 형성, 측쇄에 기본구조의 고리 형성 또는 임의 다른 펩티드 고리화등을 포함하는 두개 이상의 고리화 구조를 만들게 된다.

전술한 것과 같이, 새로운 빌딩 유닛으로 본 발명의 소마토스태틴 유사체를 만드는데 이용되는 공정은 공지의 펩티드 합성 원리에 일반적으로 의존한다. 그러나, 본 발명의 좀 큰 빌딩 유닛에 적합한 과정이 필요하다는 것인 인지할 것이다. 고형성 펩티드 화학에 아미노산을 결합시키는 것은 디사이클로헥시카르보디이미드(DCC), 비스(2-옥소-3 옥사졸리디닐)포스피닌 클로라이드(BOP-Cl), 벤조트리아졸일-N-옥시트리스디메틸-아미노포스포니움 헥사플로오르 포스페이트(BOP), 1-옥소-1-클로로포스포란(Cpt-Cl), 하이드록시벤조트리아졸(HOBT) 또는 이의 혼합물을 포함하나 이에 국한시키지 않는 결합제에 의해 이루어진다.

본 발명의 큰 빌딩 유닛에 연속하여 아미노산이 결합하는데에는 추가 결합 시약을 이용해야 하는데, 이와 같은 결합 시약으로는 PyBOP (벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포니움 헥사플로오르포스페이트), PyBrOP (브로모-트리스-피롤리디노-포스포니움 헥사플로오르포스페이트), HBTU(2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우라니움 헥사플로오르-포스페이트), TBTU(2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우라니움 테트라플로오르보레이트)등을 포함하나 이에 국한하지는 않는다.

새로운 결합 화학물질이 이용될 수 있는데, 가령, 미리 형성된 루레탄-보호된 N-카르복시 무수물(UNCA'S), 미리 형성된 아실 할로겐화물, 가장 바람직하게는 염화 아실물이 된다. 유익하게는, in situe 상태에서의 염화아미노산을 이용하는 것도 가능하다. 염화아미노산은 트리포스포진으로 알려진 비스-(트리클로로메틸)탄산염과 같은 시약을 이용하는 것이 가능하다.

이와 같은 결합은 실온에서 또는 상승된 온도에서 톨루엔, DCM(디클로로메탄), DMF(디메틸포름아미드), DMA(디메틸아세타아미드), NMP(N-메틸 피롤리돈) 디옥신, 테트라하이드로퓨란, 디글리미, 1,3-디클로로프로판 또는 상기 혼합물과 같은 용매하에서 발생한다.

본 발명의 적절한 기본 구조가 고리화된 소마토스태틴 유사체를 설명한다;

한 구체예는 다음의 일반 구조를 가진다;

이때, n은 1 내지 5이고;

X는 말단 카르복실 산, 아미드 또는 알콜기이고;

Q는 수소, 모노-사카라이드 또는 디-사카라이드이고;

R⁵는 감마 아미노 부틸산, 디아미노 부틸산, Gly, β-Ala, 5-아미노 펜타논산 또는 아미노 헥사논 산이고;

R⁶는 (D)-Phe, (L)-Phe 또는 Tyr이고;

R⁷는 (D)-Trp, (L)-Trp, (D)-Phe, (L)-Phe, (D)-1Nal, (L)-1Nal, (D)-2Nal, (L)-2Nal 또는 Tyr이고;

R⁸는 (D)-Trp 또는 (L)-Trp이고;

R⁹는 (D)-Lys 또는 (L)-Lys이고;

R¹⁰는 Thr, Gly, Abu, Ser, Cys, Val, (D)-Ala, (L)-Ala, (D)-Phe 또는 (L)-Phe이고;

R¹¹는 (D)-Phe, (L)-Phe, (D)-Ala, (L)-Ala, Nle 또는 Cys이고;

R¹²는 Gly, Val, Leu, (D)-Phe, (L)-Phe, 1Nal 또는 2Nal이다;

한 구체예에 따른 가장 적절한 화합물은 PTR 3173이고, 이때 잔기는 다음과 같다;

Q는 수소;

R⁵는 GABA이고;

R⁶는 Phe이고;

R⁷는 Trp이고;

R⁸는 (D)Trp이고;

R⁹는 Lys이고;

R¹⁰는 Thr이고;

R¹¹는 Phe이고;

R¹²는 Gly이고;

n은 3이고; X는 아미드이다.

한 구체예에 따른 가장 적절한 화합물은 PTR 3229이고, 이때 잔기는 다음과 같다;

Q는 갈락토즈이고;

R⁵는 Dab이고;

R⁶는 Phe이고;

R⁷는 (L)-Trp이고;

R⁸는 (D)-Trp이고;

R⁹는 Lys이고;

R¹⁰는 Thr이고;

R¹¹는 Phe이고;

R¹²는 Gly이고;

n은 3이고; X는 아미드이다.

또 다른 구체예는 다음의 일반식을 가진다;

이때, m과 n은 1 내지 5이고;

X는 말단 카르복시산, 아미드 또는 알코올기이고;

R⁶는 (D)-Phe, (L)-Phe, (D)-Ala 또는 (L)-Ala이고;

R⁷는 Tyr, (D)-Ala, (L)-Ala, (D)-Phe 또는 (L)-Phe이고;

R¹⁰는 Thr, Val, Ser 또는 Cys이고;

R¹¹는 Val, (D)-1Nal, (L)-1Nal, (D)-2Nal, (L)-2Nal, (D)-Phe 또는 (L)-Phe이고;

R¹²는 Gly, (D)-Ala, (L)-Ala, (D)-Phe 또는 (L)-Phe이고;

Y는 아미드, 티오에테르, 티오에스테르 또는 디설파이드이다.

바람직하게는

R⁶는 (D)- 및 (L)-Phe이고;

R⁷는 Tyr 또는 Phe이 되고;

R¹⁰는 Thr, val, Ser이 되고;

R¹¹는 Val, 1Nal, 2Nal이 되고;

R¹²는 Gly이고; 그리고 Y는 아미드이다.

또 다른 구체예는 다음의 일반식을 가지는데;

이때, m과 n은 1 내지 5이고;

X는 말단 카르복시산, 아미드 또는 알코올기이고;

R⁶는 (D)-Phe, (L)-Phe, (D)-Ala 또는 (L)-Ala이고;

R⁷는 Tyr, (D)-Phe 또는 (L)-Phe이고;

R⁸는 (D)-Trp, (L)-Trp, (D)-1Nal, (L)-1Nal, (D)-2Nal 또는 (L)-2Nal이고;

R¹⁰는 Thr, Val, Ser 또는 Cys이고;

R¹¹는 Gly, (D)-Phe 또는 (L)-Phe이고;

R¹²는 Thr, GABA, (D)-1Nal, (L)-1Nal, (D)-2Nal, (L)-2Nal, (D)-Phe 또는 (L)-Phe이고;

바람직하게는

R⁶는 (D)- 및 (L)-Phe이고;

R⁷는 Tyr이고;

R⁸는 (D)-Trp, (D)-1Nal, (D)-2Nal이고;

R¹⁰는 Val이고;

R¹¹는 Gly이고;

R¹²는 쏙, 1Nal 또는 2Nal이고; 그리고 Y는 아미드이다.

또 다른 구체예는 다음의 일반식을 가지는데;

이때, m과 n은 1 내지 5이고;

X는 말단 카르복시산, 아미드 또는 알코올기이고;

R⁴는 없거나, 1 내지 4개 아미노기의 말단기이고;

R⁵는 1Nal, 2Nal, β-Asp(Ind), Gly, Tyr, (D)-Ala, (L)-Ala, (D)-Phe 또는 (L)-Phe이고;

R⁶은 없거나 Gly, Tyr,(D)-Ala, (L)-Ala, (D)-Phe 또는 (L)-Phe이고;R⁷은 없거나 Gly, Tyr,(D)-Ala, (L)-Ala, (D)-Phe 또는 (L)-Phe이고;

R⁸는 (D)-Trp 또는 (L)-Trp이고;

R⁹는 (D)-Lys 또는 (L)-Lys이고;

R¹⁰는 없거나 Gly, Abu, Cys, Thr, Val, (D)-Ala, (L)-Ala, (D)-Phe 또는 (L)-Phe이고;

R¹¹는 Cys, (D)-Ala, (L)-Ala, (D)-Phe 또는 (L)-Phe이고;

R¹²는 없거나 Val, Thr, 1Nal 또는 2Nal이고;

적절하게는

R⁴는 없거나;

R⁵는 (D)- 및 (L)-Phe, (D)- 및 (L)-Ala이고;

R⁶는 (D)- 및 (L)-Phe, Ala, Tyr이고;

R⁷는 (D)- 및 (L)-Phe, Ala, Tyr이고;

R¹⁰는 없거나 Thr, Val, (D)- 및 (L)-Phe이고;

R¹¹는 (D)- 및 (L)-Ala, (D)- 및 (L)-Phe이고;

R¹²는 없다;

또 다른 구체예는 다음의 구조식을 가진다;

이때 m 및 n은 1 내지 5이고;

R⁵는 (L)-Phe, (D)-Phe, Tyr, (D)-Ala 또는 (L)-Ala이고;

R⁶는 (L)-Phe, (D)-Phe, Tyr, (D)-Ala 또는 (L)-Ala이고;

R⁷는 없거나 (L)-Phe, (D)-Phe, Tyr, (L)-Ala 또는 (D)-Ala이고;

R⁸는 (D)-Trp 또는 (L)-Trp이고;

R⁹는 (D)-Lys 또는 (L)-Lys이고;

R¹⁰는 없거나 또는 Thr, Val, Cys, (D)-Ala 또는 (L)-Ala이고;

R¹¹는 (L)-Phe, (D)-Phe, Cys, (D)-Ala 또는 (L)-Ala이고;

바람직하게는

R⁶는 (D)- 및 (L)-Ala이고;

R⁷는 없거나 (D)- 또는 (L)-Phe이고;

R¹⁰는 Thr이고;

R¹¹는 Cys이고; 그리고

X는 알코올기이다.

또 다른 적절한 구체예는 다음의 구조식을 가진다;

이때, 점선은 한 단부에서 NR⁶또는 NR⁷에 연결되고 다른 단부에서 NR¹¹또는 NR¹²에 연결되는 다리를 의미하고;

R⁶은 없거나 (D)-Phe, (L)-Phe 또는 Ala이고;

R⁷는 (D)-Phe, (L)-Phe, Ala 또는 Tyr이고;

R⁸는 Thr, Ala, Val 또는 Cys이고;

R¹¹는 없거나 (D)-Phe, (L)-Phe, Ala 또는 Cys이고;

R¹²는 없거나 Thr 또는 알코올로 환원되는 Thr이고;

바람직하게는, 상기 다리는 NR⁶과 NR¹¹ 또는 NR⁶과 NR¹²에 연결되며, R¹²는 알코올로 환원되는 Thr이다.

또 다른 적절한 구체예는 다음의 일반식을 가진다;

이때, m과 n은 1 내지 5이고;

X는 말단 카르복시산, 아미드 또는 알코올기이고;

R⁶는 (D)-Phe, (L)-Phe 또는 Tyr이고;

R⁷은 (D)-Trp, (L)-Trp, (D)-Phe, (L)-Phe, (D)-1Nal, (L)-1Nal, (D)-2Nal, (L)-2Nal 또는 Tyr이고;

R¹⁰은 Thr, Gly, Abu, Ser, Cys, Val, (D)-Ala, (L)-Ala, (D)-Phe 또는 (L)-Phe이고;

R¹¹는 (D)-Phe, (L)-Phe, (D)-Ala 또는 (L)-Ala이고;

R¹²는 Gly, Val, (D)-Phe 또는 (L)-Phe이고;

Y는 티오에테르, 티오에스테르 또는 디설파이드이다.

바람직하게는

R⁶은 Phe이고;

R⁷는 Trp이고;

R¹⁰는 Thr이고;

R¹¹는 Phe이고;

R¹²는 Gly이고; 그리고

Y는 디설파이드이다.

또 다른 적절한 구체예는 다음의 일반식을 가진다;

이때, m과 n은 1 내지 5이고;

X는 말단 카르복시산, 아미드 또는 알코올기이고;

R⁴는 (D)-Phe, (L)-Phe 또는 Tyr이고;

R⁶은 (D)-Phe, (L)-Phe 또는 Tyr이고;

R¹¹은 (D)-Phe, (L)-Phe, (D)-Ala 또는 (L)-Ala이고;

R¹²는 Gly, Val, (D)-Phe 또는 (L)-Phe이고;

바람직하게는

R⁴는 (D)Phe이고;

R⁶는 Phe이고;

R⁷는 Trp이고;

R¹⁰는 Thr이고;

R¹¹는 Phe이고;

R¹²는 Gly이고; 그리고

Y는 디설파이드이다.

또 다른 좀더 적절한 구체예는 다음의 일반식을 가지는데;

이때 m과 n은 1 내지 5를 나타내고;

X는 말단 카르복실산, 아미드 또는 알코올기이고;

R⁵는 (D)-Phe, (L)-Phe, (D)-Ala 또는 (L)-Ala이고;

R¹²는 없거나 Gly, Val, (D)-Phe 또는 (L)-Phe이고;

R¹³은 (D)-Phe, (L)-Phe, (D)-Ala 또는 (L)-Ala이고;

바람직하게는

R⁵는 Phe이고;

R⁷는 Phe이고;

R¹⁰는 Thr이고;

R¹²는 없거나 Gly, Val, (D)-Phe 또는 (L)-Phe이고;

R¹³는 Phe이고; 그리고

Y는 아미드이다.

추가 적절한 구체예는 다중의 펩티드 합성 과정을 이용하여 합성할 수 있다. 이는 하기에서 설명하는 것과 같이 4군(A-D)에 있는 헵타펩티드 및 옥타펩티드 유 사체로 구성된다.

A군

이때 m 및 n은 1 내지 5이고;

X는 말단 카르복실산, 아미드, 알코올기를 나타내고;

R⁵는 없거나 2Nal이고;

R⁶는 Phe, Gly이고;

R⁷는 (p-Cl)Phe, (p-NH₂)Phe, (p-F)Phe, (p-NO₂)Phe, ChxGly이고;

R¹⁰는 Val, Gly, (D)ChxGly이고;

R¹¹는 Trp, Gly이고;

R¹²는 2Nal, Thr이고; 그리고

Y는 아미드, 티오에테르, 티오에스테르, 디설파이드이다.

B군

이때 m 및 n은 1 내지 5이고;

X는 말단 카르복실산, 아미드, 알코올기를 나타내고;

R⁷는 (p-Cl)Phe, (p-NH₂)Phe, (p-NO₂)Phe, Tyr이고;

R¹¹는 Ile, Val, Ala이고;

Y는 아미드이다.

C군

이때, m 및 n은 1 내지 5이고;

X는 말단 카르복실산, 아미드, 알코올기를 나타내고;

R¹⁰는 Ala, Abu, Nle, Val, Thr이고;

R¹¹는 Phe, Tyr, (p-Cl)Phe, (p-NH₂)Phe, (p-NO₂)Phe, (p-F)Phe이고;

Y는 아미드, 티오에테르, 티오에스테르, 디설파이드이다.

D군

이때, m 및 n은 1 내지 5이고;

X는 말단 카르복실산, 아미드, 알코올기를 나타내고;

R⁶는 Val, Phe, (p-F)Phe, (p-Cl)Phe이고;

R⁷는 Trp, Tyr, (p-Cl)Phe, (p-NH₂)Phe, (p-F)Phe, (p-NO₂)Phe, ChxGly이고;

R¹¹는 Val, ChxGly이고; 그리고

Y는 아미드이다.

다음의 표 2에서는 다중 합성 군의 적절한 유사체를 설명하고 있다.

표 2

본 발명에 따른 가장 적절한 기본골격 고리화 소마코스타틴 유사체는 표3에 제시한다.

표 3. 가장 적절한 유사체

여기서, X는 -NH₂ 또는 -OH이고, 결합기가 하기에 표시한 바와 같이 2개의 구조단위사이에 걸쳐있다: PTR 3171과 PTR 3173의 경우, 별표는 결합기가 아미노산의 { N}^{ alpha } - omega -기능 유도체와 펩티드의 N-단부사이에 연결된다는 것을 나타낸다. PTR 3197과 PTR 3207의 경우, 별표는 결합기가 아미노산의 { N}^{ alpha } - omega -기능 유도체와 Cys 잔기의 측쇄에 연결된다는 것을 나타낸다. PTR 3205는 이중 환형 화합물인데, 여기서 제 1 결합은 2개의 구조단위(Phe-C3과 Phe-N3)를 연결하고 제 2 결합은 2개의 Cys 잔기사이에 형성된 이황화결합이다.

소마토스타틴은 테트라데카펩티드 호르몬으로, 이의 다양한 조절 기능은 5개 수용체 페밀리에 의해 매개되고, 이의 발현은 조직 의존성이다. 소마토스타틴의 수용체 특이적 유사체는 다양한 질병의 치료에 귀중한 치료요법적 약물로서 간주되고 있다. 이런 선택성을 보유한 소형 펩티드 유사체를 고안하는 시도는 별로 성공을 거두지 못하고 있다. 예상치 않게, 본 발명의 형태적으로 압축된 기본골격 고리화 소마토스타틴 유사체가 SST 수용체 아유형에 매우 선택적이라는 것이 발견되었다.

본 발명의 기본골격 고리화 펩티드는 신규한 선택성 유사체로, 주로 소마토스타틴 수용체 페밀리의 단일 수용체와 상당히 높은 친화성 결합을 한다. PTR 3113과 PTR 3123은 이전에 조사한 유사체로는 수용체 아유형에 특이성을 보이지 못했던 3형 소마토스타틴 수용체에 대하여 선택적이다. PTR 3183, 3185, 3201는 5형 소마토스타틴 수용체에 대하여 선택적이다. PTR 3209는 1형 수용체에 대하여 선택적이다. PTR 3203은 3형과 5형 수용체에 대하여 선택적이고, PTR 3173은 2형과 5형 수용체에 대하여 선택적이다. PTR 3205는 2형 소마토스타틴 수용체에 선택적인 이중 환형 유사체다.

상응하는 기본골격 헥사환형 유사체(PTR 3113, 3123, 3171)의 아미노산 서열은 가장 중요한 아미노산으로 간주되는 고유 SRIF-14로부터 유래된 아미노산에 기초한다. 기존 문헌(Bauer, et al. Life Sciences, 31:1133, 1982)의 데이터로부터, 적어도 7 내지 10번 위치의 고유 SRIF-14 아미노산(즉, Phe⁷, Trp⁸, Lys⁹, Thr¹⁰), 바람직하게는 6 내지 10번 위치의 고유 SRIF-14 아미노산(즉, Phe⁶, Phe⁷, Trp⁸, Lys⁹, Thr¹⁰)은 호르몬의 약물특이분자단에 필수적인 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 기본골격 유사체에는 가급적, 특이적으로 아민산 변형된 5 내지 8개 아미노산이 포함된다. 바람직한 특정 유사체의 경우, 아미노산 Asn은 5번위치에서 기본골격 Phe 구조단위로 치환시켰다. 8번 위치에서 고유 L-Trp의 D-Trp으로 형태 치환되면 유사체의 안정성이 향상되었다. 10번 위치에서 Thr 잔기는 결실되고, 서열은 상응하는 기본골격 Phe 구조단위로 종결되었다. 9번 위치에서 L-Lys에서 D-Lys으로의 독특한 형태 치환은 PTR 3113과 비교할 때 PTR 3123과 3171에서 보이는데, 이것은 SST-R5보다는 SST 수용체 아유형 SST-R3과의 결합 선택성을 향상시킨다.

좀 더 적절한 유사체에서, 아미노산의 추가 변형을 실시하였다. 예로는 요오드를 용이하게 하기 위한 Phe 잔기의 Tyr 잔기로의 치환 및 화합물의 생체-이용효율을 증가시키기 위한 Phe 잔기의 N-메틸-Phe 잔기로의 치환(예, PTR 3223을 만들기 위한 PTR 3173에서 Phe⁶의 치환, PTR 3225를 만들기 위한 PTR 3173에서 Phe⁶와 Phe¹¹의 치환)을 들 수 있다. 특정 화합물의 아미노단부에서 단일- 및 이중-사카라이드 성분의 첨가는 경구 생체-이용효율을 증가시키기 위하여 실시한다(Nelson-Piercy et al., ibid.). 가령, 갈락토오스는 PRT 3173과 유사한 화합물의 N-단부에 공액시켜 다음의 서열: 갈락토오스-Dab-Phe-Trp-(D)Trp-Lys-Thr-Phe-Gly (C3)-NH₂를 보유한 유사체(이후 PTR 3229로 지칭)를 만들었다.

가장 적절한 특정 유사체(예, PTR 3171과 3173)에서, 결합은 아미노산의 { N}^{ alpha } - omega -기능 유도체와 펩티드 서열의 N-단부사이에 연결시킨다. 본 발명의 다른 적절한 유사체의 경우, 결합은 단부 티오기를 보유한 { N}^{ alpha } - omega 기능 유도체 및 다른 아미노산 유도체로 구성된 구조 단위와 Cys 잔기의 측쇄, 멀캡토-포함 산 또는 다른 SH 보유 성분사이에 결합시켜 이황화결합을 형 성한다.

본 발명의 신규한 유사체는 단 기본골격 결합(즉, 펩티드 결합을 제외한 1 내지 3가지 메틸렌 결합)의 이용측면에서 기본골격 고리화 기술의 신규성에 대한 다른 특질을 부여한다. 이런 방식으로 펩티드의 더 향상된 강도를 획득하고, 고유 약물특이분자단의 원하는 형태를 압축할 수 있다.

본 발명의 헥사펩티드 유사체의 다른 장점은 일반적으로 헵타 또는 옥타펩티드인 가장 흔한 소마토스타틴 합성 유사체와 비교할 때, 1000달톤 정도의 상대적으로 낮은 분자량(이들 서열은 단지 6개의 아미노산으로 구성된다)이라는 것이다.

본 발명의 기본골격 고리화 소마토스타틴 유사체(예, PTR 3123, 3173, 3202, 3205)는 효소에 의한 분해에 저항하는 상당한 대사적 생체-안정성을 보유한 것으로 밝혀졌다. 이런 특성은 체내에서 상당히 긴 기간동안 지속되는 활성의 원인인 것으로 보인다. 기본골격 고리화 유사체의 안정성은 다양한 효소 혼합물(예, 신장 호모게네이트, 쥐 간 호모게네이트, 사람 혈청)에 기초한 실험적인 안정성 수치를 이용하여, 대사적으로 안정된 약물 옥트레오티드(Octreotide)의 안정성과 비교하였다. 모든 실험 화합물은 고유 호르몬 SRIF-14보다 상당히 높은 생체-안정성을 보였다. 상응하는 비-고리화 펩티드중 일부에서, 배양 2시간후 약간의 분해가 관찰되었는데, 이것은 고리화이 펩티드의 안정성에 상당히 기여한다는 것을 시사한다. 기본골격 고리화에 사용되는 N-알킬화된 아미노산의 통합은 이들 펩티드에 대해 대사적 생체-안정성을 공여할 것으로 예상된다.

본 발명의 기본골격 고리화 유사체는 시험관내에서 사람 소마토스타틴 수용체의 한정된 일부와 매우 친화적인 결합을 한다. 이런 수용체 선택성은 이의 강력한 생리학적 생체선택성을 시사한다.

본 발명의 기본골격 고리화 유사체는 시험관내 수용체 결합에서와 같이, 체내에서 한정된 조직에 선택적으로 영향을 주면서, 고유 호르몬 소마토스타틴의 다른 공지된 생리 활성에는 영향을 주지 않는다. 가령, PTR 3173은 장기간동안 옥트레오티드 약물과 유사한 정도로 성장 호르몬-IGF-1 축을 저해하지만, 여기에는 인슐린 분비의 저해와 같은 옥트레오티드의 단점이 없다. PTR 3173은 또한, 옥트레오티드보다 글루카곤 방출에 훨씬 적은 영향을 주고, 따라서, 고혈당증을 유발하지 않기 때문에, 2형 당뇨병(NIDDM) 치료를 위한 매우 매력적인 화합물이 된다.

표4에서 요약한 바와 같이, PTR 3173은 옥트레오티드 약물에 비하여 상당히 높은 생리 선택성을 보유한다. PTR 3173은 성장 호르몬의 강력한 저해물질이지만, 글루카곤에 대한 활성이 훨씬 적고, 인슐린에는 거의 영향을 주지 않는다.

표4: 옥트레오티드와 비교한 PTR 3173의 생리 선택성

유사체	GH ID50㎍/㎏	글루카곤 ID50㎍/㎏	인슐린 ID50㎍/㎏	GH/ 인슐린	GH/글루카곤
옥트레오티드	0.08	0.65	26	309	8
PTR 3173	0.1	>100	>1,000	>10,000	>1,000

PTR 3123은 글루카곤 분비의 방출을 저해하면서도 성장 호르몬과 인슐린의 방출은 저해하지 않기 때문에, 성장 호르몬과 인슐린의 방출저해에 대한 부작용없이 글루카곤종양에 대한 강력한 치료요법적 약물이 된다. 또한, SST-R3만을 발현하는 악성종양에 대한 항종양 후보중의 하나다. 고유 호르몬 SRIF와 이의 합성 유사체(옥트레오티드)는 성장 호르몬, 글루카곤, 인슐린을 동시에 저해하고, 따라서, 선택적이지 않다.

PTR 3205는 이중 환형 화합물인데, 여기서 제 1 결합은 2개의 구조단위를 연결하고, 제 2 결합은 2개의 Cys 잔기사이에 형성된 이황화결합이다. 이 유사체는 2형 소마토스타틴 수용체에 대하여 선택적이고, 따라서, 다른 소마토스타틴 활성에 영향을 주지 않으면서 이런 수용체 아유형을 발현하는 악성종양을 화상진찰하고 치료하는 항종양 후보중의 하나다. 유사하게, PTR 3201과 같은 유사체는 5형 소마토스타틴 수용체에 대하여 선택적이고, 따라서, 이런 수용체 아유형을 발현하는 악성종양의 섭생을 화상진찰하는 후보가 된다.

PTR 3173은 클론된 사람 SST-R5를 발현하는 CHO-세포의 성장을 상당히 저해하는 것으로 보이는데, 이것은 종양(예, 카르시노이드, 뇌하수체 종양)을 발현하는 SST-R5의 치료에 잠재적 역할을 시사한다. 이 유사체는 또한, 사람 카르시노이드 세포주로부터 크로모그라닌 A 방출을 저해하는데, 이것은 항-종양 효과를 시사한다(실시예 5).

동물에서 평가한 PTR 3173의 독특한 약동학 프로파일은 in-vitro에서 평가한 대사적 생체-안정성과 일치한다. 이런 기본골격 고리화 소마토스타틴 유사체는 플립플롭(서방 동태)약동학을 보인다. 피하 투여후, 고리화 반감기는 제거율이 아닌 흡수율에 기인한다. 쥐 피하 투여후, PTR 3173은 3시간정도의 고리화 반감기를 가졌다. 이런 활성은 옥트레오티드 약물의 작용 반감기를 훨씬 초과하는데, 옥트레오티드의 고리화 반감기는 대략 40분이다. PTR 3173 대 옥트레오티드의 주요 약동학 변수는 표5에 요약한다.

표5: 의식있는 Wistar 쥐에 IV & SC 투여후, PTR 3173 대 옥트레오티드의 주요 약동학 변수

경로	약물	F(%)	Vss(㎖/㎏)	T_{1/2 β}(분)	E%	제거(㎖/분/㎏)
IV	PTR 3173	-	653	31	10.3	13.0
IV	옥트레오티드*	-	602	49	21.3	17.6
SC	PTR 3173	99.6	-	170	15.9	13.3
SC	옥트레오티드*	103	-	40	23.0	17.1

* 산도스타틴(옥트레오티드 아세테이트), Overview and clinical summary. Sandoz Pharmaceutical Corporation, 1992.

F-생체이용효율 Vs.-분산 부피

T_1/2- 고리화 반감기 E-소변에서 추출

기본골격 고리화 소마토스타틴 유사체 PTR 3173은 소마토스타틴 수용체에 대하여 선택적이고, 옥트레오티드보다 다른 G-단백질 결합된 수용체와 훨씬 적게 결합하는데, 이것은 이런 여러 가지 수용체와의 결합에 대하여 유사체와 SRIF를 모두 선별하여 밝혀냈다(실시예 6). 이런 특성은 상당한 이점이 되는데, 그 이유는 비-소마토스타틴 수용체와의 결합은 체내에 잠재적인 부작용을 유발할 수 있기 때문이다.

PTR 3173은 또한, 사람 말초혈 림프구(PBL) 증식 분석에서, 사람 림프구에 대한 유사분열 물질이 아니라는 것이 밝혀졌다.

PTR 3113과 PTR 3123은 6㎎/㎏의 단일 분량을 쥐의 정맥내에 투여하여도 안전한 것으로 밝혀졌다. PTR 3173은 다양한 종에서 초기 안정성을 검사하였다. 이 약물은 유럽 안전 검사 약물 기준하에 이런 개발단계에서 안전한 약물 후보로서 공표되었다. 성장 호르몬 방출을 저해하는 효과량보다 10,000-배 더 많은 분량으로 주사한 설취류와 개에서 독성의 징후는 전혀 관찰되지 않았다.

기본골격 고리화 펩티드의 합성, 정제, 특성화를 위한 일반적 방법

합성:

수지: 0.2-0.7mmol/gr 적하된 1g Rink 아미드 또는 Tenta-겔 수지

Fmoc-탈보호: NMP에 녹인 7㎖의 20% 피페리딘으로 실시. 2분동안 교반하면서 10㎖ NMP로 5번 세척후, 15분동안 2회.

결합:

1. 정상적인 결합(간단한 아미노산과의 결합): 3당량 아미노산, 3당량 PyBroP, 7㎖ NMP에 녹인 6당량 DIEA를 함유한 용액으로 실시. 0.5-2 시간동안 교반. 결합은 닌하이드린 실험으로 모니터하고, 닌하이드린 용액이 황색으로 될 때까지 반복한다.

2. 5당량 DIC 및 10㎖ DMF에 녹인 5당량 HOBT를 함유한 용액과 His와 Asn의 결합.

3. Gly 구조단위와의 결합: 3당량 아미노산, 3당량 PyBrop, 7㎖ NMP에 녹인 6당량 DIEA을 함유한 용액으로 실시. 1-4시간동안 교반하면서 2회.

4. Gly이 아닌 구조단위와의 결합: 5당량 아미노산, 1.5당량 트리포스겐, 15㎖ 디옥산 또는 THF에 녹인 13당량 콜리딘을 함유한 용액으로 실시. 50℃ 교반하면서 0.5-2시간동안 2회 실시.

구조단위의 Allyl과 Alloc 보호기의 제거 :

5% 아세트산과 2.5% NMM을 함유한 30㎖ DCM을 용매로 하는 펩티드당 1.5당량의 Pd(PPH3)4로 실시. 1-4시간동안 교반.

결정화:

3당량 PyBOP 및 7㎖ NMP에 녹인 DIEA을 함유한 용액으로 실시. 0.5-2시간동안 교반. 결정화는 닌하이드린 실험으로 모니터하고, 필요한 경우 반복한다.

절단: 불순불 제거제: 1-15% H₂0, 1-5% TIS, 1-5% EDT를 보충한 82%-95% TFA로 실시.

정제

각 기본골격 고리화 펩티드에 대한 개별 정제 방법은 분석 HPLC을 기초로 개발하여, 다른 정제되지 않은 성분으로부터 고리화 펩티드를 최대 분리시킨다. 분석 방법은 일반적으로, 정지상인 C-18 Vydac 칼럼 250X4.6mm 및 0.1% TFA 혼합성분을 함유한 물/ACN을 이용하여 실시한다.

준비 방법은 분석 분리방법을 2" C-18 Vydac 준비 방법에 포함시켜 고안한다. 정제 과정동안, 고리화 펩티드를 보유한 피크는 반-자동화된 분취물 수거기를 이용하여 수거한다. 수거된 분취물은 순도 검사를 위해 분석 HPLC를 실시한다. 순수한 분취물은 모으고 동결건조시킨다.

특성화:

모아진 순수한 동결건조 물질은 HPLC, MS, 모세혈관 전기영동으로 순도를 분석하고, 아미노산 분석으로 펩티드 함량과 아미노산 비율을 측정한다.

소마토스타틴 유사체의 일반적인 선별

기본골격 고리화 소마토스타틴 유사체는 G-단백질 결합된 수용체와 고유 펩티드(SRIF-14) 결합의 저해를 시험관내에서 검사하여 선별한다. 높은 친화성을 보이며 결합하는 유사체는 이후, 이차 메신저(예, 환형 아데노신 모노인산염(cAMP) 수준, 티로신 포스파타제 활성, 성장 호르몬과 크로모그라닌 A 분비)와 세포 성장에 대한 효과를 검사한다. 활성 유사체는 또한, 호르몬과 효소 분비의 저해를 생체내에서 검사하는데, 특히, SST-R2와 SST-R5가 소마토스타틴의 내분비 효과 대부분을 매개한다는 것을 시사하는 기존의 문헌 자료에 기초한 유관한 모델 시스템은 성장-호르몬 방출의 저해 및 고유 호르몬 SRIF와 소마토스타틴 유사체(옥트레오티드)의 공지된 내분비 활성에 기초한 아밀라아제, 위산, 인슐린 글루카곤 분비가 된다.

가장 적절한 기본골격 고리화 소마토스타틴 유사체: PTR-3201, PTR-3205 PTR-3173(이들은 각각 SST-R5, SST-R2, SST-R2 + SST-R5에 대한 수용체 특이성을 보유한다)은 내분비 프로파일에 대한 각 소마토스타틴 수용체의 생리 역할을 설명하고, 이들의 약물 후보로서의 잠재성을 찾는데 사용하였다.

공지된 다수의 생물 활성 펩티드 서열 또는 이전에 알려지지 않은 신규한 서열에 기초하여 작제된 형태적으로 압축된 소마토스타틴 유사체는 하기 실시예에서 제시한다. 다음의 실시예는 본 발명의 화합물 만들고 이용하는 방법을 설명하기 위한 것으로, 이들은 본 발명을 제한하지 않는다.

실시예 1: PTR 3173의 합성

5g Rink 아미드 수지(NOVA) (0.56 mmol/g)는 소결된 유리 바닥이 장착된 반응용기에서 N-메틸피롤리돈(NMP)에 녹여 팽창시키고, 교반기에 넣었다. Fmoc 보호기는 NMP에 녹인 20% 피페리딘과 반응시켜 수지로부터 제거하였다(10분동안 2회 각 25㎖). Fmoc 제거는 290nm에서 자외선 흡수도를 측정하여 모니터하였다. 결합 사이클은 실온에서 1시간동안 Fmoc-Gly-C3(Allyl)(3당량), PyBrop(3당량), NMP(20㎖)에 녹인 DIEA(6당량)으로 실시하였다. 반응 종결은 정량 닌하이드린 검사(Kaiser 실험)로 모니터하였다. 결합후, 펩티드-수지는 NMP로 세척하였다(25㎖ NMP로 7회, 각 2분). 캡핑은 실온에서 0.5시간동안 펩티드-수지와 무수아세트산(캡핑 혼합물: HOBt 400 mg, NMP 20㎖, 무수아세트산 10㎖, DIEA 4.4㎖)을 반응시켜 실시하였다. 캡핑후, NMP 세척은 상기와 같이 실시하였다(7회, 각 2분). Fmoc 제거는 상기와 같이 실시하였다. Fmoc-Phe-OH는 동일한 방식으로 결합시키고, Fmoc기는 상기와 같이 제거하였다. 펩티드 수지는 Fmoc-Thr (OtBu)-OH와 반응시켰다: Fmoc 제거는 상기와 같이 실시하였다. Fmoc-Lys(Boc)-OH는 동일한 결합 조건으로 펩티드 수지와 결합시켰다. 결합 종결은 Fmoc 실험으로 모니터하였다(펩티드 수지 시료는 취하고 칭량하고, Fmoc는 상기와 같이 제거하고, 자외선 흡수도를 측정하였다). Fmoc-D-Trp-OH는 전술한 바와 같이 PyBrop로 펩티드 수지와 결합시켰다. Fmoc 제거후, Fmoc-Trp-OH는 동일한 방식으로 결합시켰다. Fmoc제거후, Fmoc-Phe-OH는 동일한 방식으로 결합시켰다. Fmoc제거후, Fmoc-GABA-OH는 동일한 방식으로 결합시켰다. Allyl 보호기는 실온에서 2시간동안 아르곤하에 Pd(PPh₃)₄, 아세트산 5%, 클로로포름에 녹인 모르폴린 2.5%와 반응시켜 제거하였다. 펩티드 수지는 상기와 같이 NMP로 세척하였다. Fmoc 보호기는 NMP에 녹인 20% 피페리딘과 반응시켜 펩티드로부터 제거하였다(10분동안 2회, 각 25㎖). 고리화화는 실온에서 2시간동안 3당량 PyBOP 및 NMP에 녹인 6당량 DIEA로 실시하였다. 펩티드 수지는 세척하고 건조시켰다. 펩티드는 0℃ 15분동안 그리고 아르곤하의 실온에서 2시간동안 TFA 94%, 물 2.5%, EDT 2.5%, TIS(트리-이소프로필-실란)1%와 반응시켜 수지로부터 절단하였다. 혼합물은 차가운 에테르(30㎖, 0℃)에 여과하고, 수지는 소량의 TFA로 세척하였다. 여과물은 순환 증발기에 넣고, 모든 휘발성 성분을 제거하였다. 지성 산물을 수득하였다. 이것은 에테르로 적정하였는데, 에테르는 3회에 걸쳐 따라낸다. 백색 분말을 수득하였다. 이 정제되지 않은 산물은 건조시켰다. 정제안된 산물의 중량은 4g이었다. HPLC 정제후, 100% 순도의 단일 피크를 얻었는데, 이것은 분석 HPLC와 모세혈관 전기영동으로 검출하였다. 1123 달톤의 예상 중량은 질량 분광경검사법으로 검출하였다.

실시예 2: 트리포스겐 방법에 의한 PTR 3205 합성의 세부 과정

2g Rink 아미드 수지(MBHA 수지, NOVA, 0.46 mmol/gr)는 소결된 유리 바닥이 장착된 반응용기에서 하룻밤동안 N-메틸피롤리돈(NMP)에 녹여 팽창시키고, 교반기에 넣었다. Fmoc 보호기는 15분동안 2번 NMP(16㎖)에 녹인 25% 피페리딘을 이용하여 수지로부터 제거하였다. 각 2분동안 NMP(10-15㎖)로 조심스럽게 7회 세척한 후, Phe-N3의 결합은 NMP(16㎖)에 녹인 Fmoc-Phe-N3-OH(3 당량, 2.76 mmol, 1.46 g')을 이용하여 달성하고, 실온에서 4분동안 PyBrop (2.76 mmol, 1.28 g')와 DIEA (6 당량, 5.52 mmol, 0.95㎖)로 활성화시키고, 반응기로 이전하여 실온에서 1시간동안 결합시켰다. 결합후, 펩티드-수지는 각 2분동안 7회 NMP (10-15㎖)로 세척하였다. 반응종결은 정량 닌하이드린 검사(Kaiser 실험)로 모니터하였다. Fmoc 제거와 세척은 전술한 바와 같이 실시하고, 이후 각 2분동안 3회 THF (10-15㎖)로 세척하고, Fmoc-Cys(Acm)-OH (5 eq, 4.6 mmol, 1.9 g')는 50℃에서 1시간동안 비스-(트리클로로메틸)탄산염(1.65 eq, 1.518 mmol, 0.45 g') 및 THF(30-35㎖)에 녹인 콜리딘(14 eq, 12.88 mmol, 1.7㎖)을 이용하여 BU-펩티딜-수지에 결합시키고, 0.14M 혼합물을 만들었는데, 이런 결합 과정은 반복하였다. Thr, Lys, (D)Trp, Phe, Cys, PheC3의 조합은 각각 Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-(D)Trp (Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-PheC3-OH를 이용한 결합 사이클(정량 닌하이드린 검사로 모니터링)로 달성하였는데, 각 결합 사이클에서 아미노산은 NMP에 녹이고, PyBrop와 DIEA로 활성화시키고, 결합후 펩티드-수지는 세척하고, 제 1 결합에서 전술한 바와 같이 광범위한 NMP 세척으로 Fmoc를 제거하였다. 최종 조합에서, 펩티드-수지는 다음의 조건하에서 Allyl/Alloc 탈보호한다: 펩티딜 수지는 각 2분동안 3회 DCM (10-15㎖)로 세척하고, 각 2분동안 3회 DCM-AcOH-NMM(각각, 92.5%, 5%, 2.5%) 혼합물로 세척하였다. 3g의 Pd(P(Ph)₃)₄는 상기 혼합물(80㎖)에 녹이고, 수득된 황색 현탁액은 반응기로 이전하고, 펩티드-수지를 함유한 혼합물은 가스를 제거하고(반응기의 소결된 유리 바닥을 통하여 아르곤을 요설함), 2시간동안 암실에서 활발하게 교반하였다. 펩티딜-레신은 DCM, CHCl₃, NMP(각 2분동안 15번 세척)로 세척하였다. PyBOP(3eq, 2.76 mmol, 1.436 g') 및 NMP(20㎖)에 녹인 DIEA(6eq, 5.52 mmol, 0.95㎖)를 이용한 결정화와 이후 하룻밤동안 제 2 결정화(동일 조건하에서)를 실시하였다. 펩티딜 수지는 NMP로 세척하고, 이후 2분동안 3회 DMF-물(15㎖, 4:1)세척하였다. DMF-물(23㎖, 4:1)에 녹인 I₂ 용액(5 eq, 4.6mmol, 1.16 g')은 펩티드-레신에 첨가하고, Cys-Cys 결정화를 용이하게 하기 위하여 40분동안 교반하였다. 펩티딜 수지는 여과하고, DMF/물 DMF, NMP, DCM, CHCl₃, DMF에 녹인 2% 아스코브산으로 광범위하게 세척하였다. 상기와 같은 최종 Fmoc 탈보호와 세척, MeOH 세척후, 펩티들 수지는 진공하에서 20분동안 건조시켰다. 펩티드는 전체 30㎖ 칵테일 혼합물에서 95% TFA, 2.5% TIS, 2.5% 물을 이용하여 아르곤하의 0℃에서 30분동안, 이후 실온에서 1.5시간동안 수지로부터 절단하였다. 용액은 추출필터를 통하여 폴리프로필렌 튜브로 여과하고, 수지는 5-6㎖ 칵테일과 4-5㎖ TFA로 세척하고, 용액은 N₂증기로 증발시켜 지성 잔류물을 만들었는데, 여기에 차가운 Et₂O를 처리하여 고체화시켰다. 원심분리와 Et₂O 상층제거, 이후의 차가운 Et₂O 일부 처리, 하룻밤동안 진공하에서 백색 고체의 건조로 정제안된 PTR-3205-02 (0.388 g', 30%)를 만들었다.

실시예 3: 생체분해에 대한 저항

SST 고리화 펩티드 유사체: PTR 3113, 3123, 3171의 시험관내 생체이용효율은 신장 호모기네이트에서 측정하고, 옥트레오티드(산도스타틴^TM)와 고유 소마토스타틴(SRIF-14)을 비교하였다. 결과는 하기 표 6에 제시한다. 이런 분석에서, 본 발명의 기본골격 고리화 펩티드 유사체는 옥트레오티드만큼 안정하고, SRIF보다는 훨씬 더 안정하였다. 이런 분석은 37℃ 신장 호모기네이트에서 시간함수인 펩티드 분해의 HPLC 측정에 기초한 것이다.

실시예 4: 소마토스타틴 수용체와 유사체의 결합

소마토스타틴 유사체에서 막통 소마토스타틴 수용체(SST-R1, 2, 3, 4, 5)를 발현하는 막 제조물과 ¹²⁵I-Tyr¹¹-SRIF의 결합을 저해하는 효능을 검사하였다(Raynor et. al., Molecular Pharmacology 43: 838, 1993). 이들 실험에 사용하기 위한 수용체 제조물은 중국 햄스터 난소(CHO)세포에서 선택적으로, 안정적으로 발현되는 클론된 사람 수용체 또는 SST-Rs를 자연적으로 발현하는 세포주로부터 얻었다. 일반적으로, 세포막은 프로테아제 저해물질의 존재하의 Tris 완충액에서 균질화시키고, 상이한 농도의 실험 시료와 함께 ¹²⁵I-Tyr¹¹-SRIF로 30-40분동안 배양하였다. 결합 반응물은 여과하고, 여과물은 세척하고, 결합된 방사활성은 감마 계수기에서 계산하였다. 비특이적 결합은 1μM 라벨되지 않은 SRIF-14의 존재하에 결합되어 남아있는 방사활성으로 정의하였다.

결합 실험의 파지티브 신호를 유효하게 하고, 비특이적 신호를 제거하기 위하여, 동일 과정을 이용하여 합성하고 조작한 무관한 펩티드, 예를 들면, GnRH 시료는 동일분석에서 네거티브 컨트롤 시료로 검사하였다. 이들 샘플은 임의 분석에서 결합 활성을 보이지 않았다. 결과는 하기 표 7, 8, 9, 도1에서 제시한다.

전체 계수	12000	CPM	3600	CPM
비-특이적	1200	CPM	900	CPM
결합
공백	400	CPM	400	CPM

실시예 5: 적절한 기본골격 고리화 소마토스타틴 유사체의 시험관내 생리-반응

A. 사람 카르시노이드 BON-1 세포에서 기본골격 고리화 소마토스타틴 유사체 PTR 3173에 의한 cAMP의 저해:

SST-R5의 활성화는 아데닐레이트 사이클라제의 활성 감소를 유도한다. 5형 수용체를 비롯한 소마토스타틴 수용체는 사람 카르시노이드 유도된 세포주 BON-1에서 발현된다. 이런 사람 세포 배양은 신규한 카르시노이드 치료제에 대한 시험관내 발견 분석법 역할을 한다. 따라서, 이런 시스템에서 발현되는 소마토스타틴 수용체와 소마토스타틴 유사체의 상호작용은 BON-1의 세포기능에 영향을 주게 된다. 본 발명의 적절한 기본골격 고리화 유사체는 포스콜린 자극후 cAMP 생산을 저해하는 것으로 밝혀졌다. 이런 신호 전달 경로에서 PTR 3173은 임상적으로 사용된 옥트레오티드 약물과 동등한 효능을 보인다.

B. 기본골격 고리화 소마토스타틴 유사체 PTR 3173에 의한 시험관내 세포-성장 저해

성장 저해의 약리학적 평가하는 사람 클론된 SST-R5을 발현하는 CHO 세포를 이용하여 실시하였다. 세포내 수준에서 SST-R5의 PTR 3173 인식은 고유 호르몬과 옥트레오티드 약물에 비하여 상대적으로 훨씬 높은 성장 저해 효능과 연관하였다.

C. 기본골격 고리화 소마토스타틴 유사체 PTR 3173에 의한 크로모그라닌 A 방출의 저해

BON-1로부터 크로모그라닌 A 방출의 평가는 잠재적인 안티 카르시노이드 약물을 확인하기 위한 분석이다. 크로모그라닌 A는 종양 과립의 탈과립화에 중요한 매개물질중의 하나인데, 상기 종양 과립은 카르시노이드 종양으로부터 과량의 혈관수축작용 물질을 분비한다. PTR 3173은 이런 경로에 대한 현저한 항-방출 효과를 보유한다. 사람 BON-1 분석에서 기본골격 고리화 유사체의 가장 흥미로운 발견중의 하나는 고유 호르몬 소마토스타틴과 동등한 효능인데, 이것은 카르시노이드 증후군에서 잠재적으로 유익한 효과를 시사한다.

실시예 6: 비-소마토스타틴 G-결합된 수용체와의 결합에 대한 PTR 3173, 옥트레오티드, SRIF의 비교

소마토스타틴 수용체는 7개의 막통 G-단백질 결합된 수용체 상과에 속한다. G-단백질 결합된 수용체는 체내에 광범위하게 분산되어 있고, 다양한 호르몬, 예를 들면, 아드레날린, 아세틸콜린, 마취제(아편제), 뉴로키닌, 가스트린, 다른 다양한 호르몬의 생리 활성을 매개한다. 약물 후보는 과내(科內) 수용체의 한정된 아유형으로 인식할 수도 있다. 하지만, 이것은 상이한 다른 수용체의 인식에 의해 체내에서 잠재적으로 부작용을 유발할 수 있다. 이런 측면에서 생리 선택성 약물을 개발하는데 있어 수용체-사이 대 수용체-내 선택성의 중요성이 제기되었다. NovaScreen(Hanover, MD)은 다양한 G-단백질 결합된 수용체와의 비특이적 결합을 평가하였다. 뉴로키닌, 마취제, 무스카린 수용체에 대한 결합 연구는 고유 호르몬 소마토스타틴, 옥트레오티드, PTR 3173간의 비교에 기초한 것이다. NovaScreen이 실시한 선별분석에서, 옥트레오티드와 마취제 수용체에서 현저하게 높은 친화성이 발견된 반면, 동일한 실험 조건하에서 PTR 3173과 고유 호르몬 소마토스타틴은 이들 수용체와 결합하지 않았다(도 2). 옥트레오티드는 PTR 3173과 고유 호르몬에 비하여 현저하게 높은 무스카린-2 수용체 친화성을 보유한 것으로 밝혀졌다. 옥트레오티드와 마취제 수용체의 교차반응성 결합의 중요성은 돼지 쥐 회장에서 추가로 조사하였다. 예비 결과에서 옥트레오티드의 마취제 길항물질로서의 효과가 확인된 반면, 동일 실험조건에서 PTR 3173은 met-엔케팔린-야기된 경련수축에 아무런 영향을 주지 않았다.

실시예 7: 성장 호르몬 방출에 대한 수용체-특이적 기본골격 고리화 소마토스타틴 유사체의 생체내 효과

펩티드 투여에 따른 성장 호르몬(GH) 방출의 억제는 Wistar 수컷 쥐에서 측정하였다. 각 쥐 군에서 4마리씩을 사용한 이번 연구에서, 유사체 활성은 SRIF 또는 옥트레오티드와 비교하였다. 200-250g 중량의 수컷 Wistar 쥐 성체는 지속적인 빛-어둠 사이클(빛, 8:00 내지 20:00 시), 온도(21±3℃), 상대습도(55±10%)하에 유지시켰다. 실험용 음식물과 음료수는 임의로 사용하였다. 실험 당일, 쥐는 넴부탈(IP, 60 mg/kg)로 마취시켰다. 마취 10분후, 약물은 0.01-100㎍/㎏ 분량으로 S.C.에 투여하였다. GH의 자극은 대퇴부 정맥을 통하여 0.5g/kg L-아르기닌을 I.V. 투여하여 실시하였다. 샘플링은 자극 5분후, 펩티드 투여 15분후 또는 투여 30분후에 실시하였다. 혈액 시료는 복부 대정맥으로부터 뽑아내 헤파린(혈액㎖당 15개 유닛)을 함유한 튜브로 모으고, 즉시 원심분리하였다. 혈장은 분리하고, 분석할 때까지 -20℃로 동결보관하였다. 쥐 성장 호르몬(rGH)[¹²⁵I]수준은 방사성면역분석 키트(Amersham)로 측정하였다. 이런 키트에서 표준은 the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases로부터 구한 참고 표준 제조물(NIH-RP2)을 기준으로 하여 정하였다. 모든 시료는 2번씩 측정하였다. 이들 실험의 결과는 도 3에 제시한다.

결과:

쥐에서 성장 호르몬 방출은 넨부탈 마취하에 L-아르기닌을 정맥내(IV) 거환 주사하여 자극하였다. 이런 모델에서 옥트레오티드(Bauer, et al. ibid.)에 대한 ED50은 대략 0.1㎎/㎏으로 알려져 있다. 결과적으로, 옥트레오티드 및 실험한 수용체-특이적 기본골격 고리화 유사체는 상대적으로 높은 100㎎/㎏ 분량으로 투여하였다. 이들 실험 조건하에서, PTR-3205와 PTR 3173은 옥트레오티드와 동등한 효능의 성장 호르몬 방출 저해물질이었다(도 3). 흥미로운 결과는 5형 수용체 특이적 유사체인 PTR-3201에서 발견되었다. 이런 선택적 유사체는 성장 호르몬 방출에 아무런 영향을 주지 않았는데, 이것은 성장 호르몬 저해가 5형 소마토스타틴 수용체 아유형에 의해 매개된다는 것을 입증한다. 다른 한편, 2형 수용체 아유형에 선택적인 PTR-3205에서 발견된 상당한 저해는 이것이 성장 호르몬 저해를 매개하는 주요 수용체라는 것을 시사한다. 따라서, 옥트레오티드 또는 PTR 3173에서 발견되는 성장 호르몬에 대한 효과는 이들의 2형 수용체 아유형 인식에 따른 것이라고 추론할 수 있다.

PTR 3132에 의한 GH 저해의 다른 결과는 옥트레오티드와 비교하여 표 10에 제시한다.

실시예 8: 글루카곤 방출에 대한 수용체-특이적 기본골격 고리화 소마토스타틴 유사체의 생체내 효과

펩티드 투여에 따른 글루카곤 방출의 생체내 측정은 Wistar 수컷 쥐에서 측정하였다. 각 쥐 군에서 4마리씩을 사용한 이번 연구에서, 유사체 활성은 SRIF 또는 옥트레오티드와 비교하였다. 일정 실험 조건하에서 글루카곤 방출에 대한 시간 경과 프로파일을 측정하였다. 수컷 Wistar 쥐는 하룻밤동안 굶겼다. 동물은 넴부탈(IP, 60 mg/kg)로 마취시켰다. 마취 10분후, 약물은 0.01-100㎍/㎏ 분량으로 S.C.에 투여하였다. 글루카곤 분비의 자극은 문맥으로부터 혈액 수거 5분전, L-아르기닌(0.5 g/kg)을 I.V. 투여하여 실시하였다. 호르몬 농도는 RIA로 측정하였다. 글루카곤 수준에서 컨트롤과 비교하여 통계학적으로 유의성 있는 유일한 차이는 성장 PTR 3173의 호르몬 방출에 대한 ED50에 비하여 1000배 더 높은 분량인 100㎎/㎏의 PTR 3173(도 4) 분량에서 달성되었다. 이들 결과는 상기 표 4에서 요약한 바와 같이 이런 기본골격 고리화 유사체가 옥트레오티드에 비하여 현저한 생리 선택성을 보인다는 것을 뒷받침한다.

PTR 3132에 의한 글루카곤 저해의 다른 결과는 옥트레오티드와 비교하여 표 11에 제시한다.

실시예 9: 인슐린 방출에 대한 수용체-특이적 기본골격 고리화 소마토스타틴 유사체의 생체내 효과

소마토스타틴 유사체에 의한 인슐린 방출의 저해는 기존 문헌에 잘 정리되어 있다(Bauer, et al. ibid., Lamberts et al. 1996, ibid). 하지만, 생리 활성이 장기간 지속되는 합성 소마토스타틴 유사체는 성장 호르몬 또는 글루카곤 방출의 강력한 저해에 비하여 인슐린에 대해서는 그다지 활성을 보이지 않는 것으로 보고되었다(Bauer, et al. ibid., Lamberts et al. 1996, ibid). Sandoz는 성장 호르몬 대 인슐린에 대한 옥트레오티드의 생리활성을 주장하고 있다. 하지만, 2형 당뇨병에서, 장기간 지속되는 옥트레오티드 유사체가 인슐린과 글루카곤 방출을 억제함으로써 글루코오스 수준은 불변하거나 또는 약간 상승한다. 다른 임상 실험에서, 옥트레오티드가 글루카곤과 성장 호르몬을 줄일 수 있는 능력에도 불구하고 2형 당뇨병에서 당뇨수치를 줄이기 못하는 것은 이의 투여에 따른 잔류한 외인성 인슐린 분비의 일시적 차단에 기인한 것으로 보인다. 건강한 개체에 옥트레오티드를 투여하면, 경미한 단식 혈당증과 현저한 단식 저인슐린증이 발병한다. 또한, 옥트레오티드는 췌장으로부터 과도한 인슐린 방출과 관련된 증상인 랑게르한스섬 섬유증의 치료에 처방되는데, 이것은 인슐린에 대한 옥트레오티드의 생리 비특이적 효과를 뒷받침한다(Kane et al. J. Clin. Inves. 100:1888, 1997). 인슐린 방출에 대한 수용체 특이적 기본골격 소마토스타틴 유사체의 생리 효과를 평가하기 위하여, 옥트레오티드 평가에서 Sandoz가 사용한 것과 동일한 실험 프로토콜을 실시하였다. 인슐린 자극은 하룻밤동안 굶긴 쥐에 D-글루코오스를 IV 거환 주사하여 유도하였다.

방법:

펩티드 투여에 따른 인슐린 방출의 생체내 측정은 Wistar 수컷 쥐에서 측정하였다. 각 쥐 군에서 4마리씩을 사용한 이번 연구에서, 유사체 활성은 SRIF 또는 옥트레오티드와 비교하였다. 일정 실험 조건하에서 GH 방출에 대한 시간 경과 프로파일을 측정하였다. 수컷 Wistar 쥐는 하룻밤동안 굶겼다. 동물은 넴부탈(IP, 60 mg/kg)로 마취시켰다. 마취 10분후, 약물은 0.01-100㎍/㎏ 분량으로 S.C.에 투여하고, 30분후 인슐린 분비의 자극은 복부 대정맥으로부터 혈액 수거 5분전, L-아르기닌(0.5 g/kg)을 I.V. 투여하여 실시하였다. 호르몬 수준은 RIA로 측정하였다.

결과:

PTR-3205와 옥트레오티드는 인슐린 방출의 활성 저해물질이다(도 5a). 옥트레오티드 피하주사후의 ED50은 10 내지 100㎍/㎏이였는데, 이것은 Sandez가 보고한 ED50 - 26㎍/㎏과 일치하였다. PTR-3205에서 발견되는 현저한 효과는 소마토스타틴 수용체 아유형 2가 성장 호르몬과 인슐린에 대한 효과를 매개한다는 것을 시사한다. 이런 수용체-주효체 관계는 소마토스타틴이 분리된 사람 췌장에서 수용체 아유형 2를 통해 β-세포 분비를 저해한다고 제시한 기존의 데이터와 서로 연관되어 있다. PTR-3205와 옥트레오티드에서 발견되는 현저한 효과와는 대조적으로, 고 분량(100㎍/㎏)의 PTR-3201과 PTR 3173은 인슐린에 대하여 불활성이었다. 유사한 분량의 PTR 3173은 성장 호르몬의 방출에 상당한 영향을 주었다. PTR 3173의 이런 흥미로운 생리 선택성에 따라, 최대 1㎎/㎏ 분량까지 이 실험을 반복하였다. 이들 실험 조건하에서, PTR 3173은 옥트레오티드 약물에 비하여 인슐린에 어떤 감지가능한 영향도 주지 않는 생리 선택적 소마토스타틴 유사체로 정의하였다(도 5b).

PTR 3132에 의한 인슐린 저해의 다른 결과는 옥트레오티드와 비교하여 표 12에 제시한다.

실시예 10: 다른 적절한 기본골격 고리화 소마토스타틴 유사체

합성한 다른 적절한 소마토스타틴 유사체는 표 13과 14에 제시한다.

별표는 결합기가 아미노산의 { N}^{ alpha } - omega -기능 유도체와 표시한 잔기의 측쇄사이에 연결된다는 것을 나타낸다. 마지막 4개의 유사체(PTR 3189, 3191, 3193, 3195) 의 경우, 2개의 동일한 구조단위는 지시한 바와 같이 상이한 디아민 결합으로 연결된다.

별표는 결합기가 아미노산의 { N}^{ alpha } - omega -기능 유도체와 펩티드의 N 단부사이에 연결된다는 것을 나타낸다. PTR 3965와 PTR 3975에서 12번 위치의 Thr 잔기는 가급적, 단부 알코올기로 환원된다.

실시예 11. SH-구조단위를 보유한 다른 적절한 기본골격 고리화 소마토스타틴 유사체

한가지 이상의 SH-형 구조단위를 보유한 다른 적절한 유사체는 SST-Rs와의 결합 친화성에 따라 표 12에 제시한다. 각 PTR 서열에서 별표는 고리화화 위치를 표시한다. 결합기는 아미노산의 표시된 N^α-ω-S-기능 유도체 및 아미노산의 다른 표시된 N^α- ω-S-기능 유도체, Cys 잔기의 측쇄 또는 다른 SH-성분과 연결시킨다.

본 발명은 무제한적 실시예로 예시하였다. 당업자가 인지하는 바와 같이 본 발명의 추가적인 변형과 변이는 하기 청구범위로 구성되는 본 발명의 개념을 벗어나지 않는다.

Claims

삭제
삭제
다음으로 구성된 기본 구조 고리화된 소마토스태틴 유사체.

GABA*-Phe-Trp-(D)Trp-Lys-Thr-Phe-Gly(C3)-X

이때, X는 말단 카르복시산, 아미드 또는 알코올기이고;

별표는 아미노산의 N^α-ω-기능화된 유도체와 펩티드의 N-말단 또는 Cys 잔기의 측쇄사이에 결합기가 연결되어 있음을 의미한다.
제3항에 따른 소마토스태틴 유사체를 활성 성분으로 하고, 암(카르시노이드 증후군 포함), 내분비 질환(선단 비대증과 인슐린 비의존성 당뇨병(NIDDM) 포함), 당뇨-관련 합병증(당뇨성 신장장애, 당뇨성 혈관장애, 당뇨성 망막병증 포함), 위장 질환, 췌장염, 자가면역질환(류머티스 관절염과 건선 포함), 동맥경화증, 동맥차단, 수술후 통증, 염증질환 치료용 제약학적 조성물.
제 4 항에 있어서, 제약학적으로 수용가능한 담체를 함유하는 제약학적 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제