DE69910019T2 - Verwendung von derivaten der 2-hydroxy-4-trifluormethylbenzoe säure als hemmer der aktivierung des nuklearischen transkriptionsfaktors nf-(k)b - Google Patents

Verwendung von derivaten der 2-hydroxy-4-trifluormethylbenzoe säure als hemmer der aktivierung des nuklearischen transkriptionsfaktors nf-(k)b Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von 2-Hydroxy-4-trifluormethylbenzoesäurederivaten für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der beanspruchten Erkrankungszustände.
  • Beschreibung des Standes der Technik
  • Die Kontrolle der Expression von Proteinen spielt eine Schlüsselrolle sowohl bei der Aufrechterhaltung der normalen Funktion der Zellen und hiermit der Organismen sowie bei der Entwicklung von pathologischen Prozessen. Diese Kontrolle erfolgt über die sogenannten Transkriptionsfaktoren. Einer dieser Faktoren ist die Gruppe von Proteinen, die bekannt ist als nuklearer Transkriptionsfaktor NF-κB, der von einer Familie eng verwandter dimerer Komplexe gebildet wird. NF-κB existiert in einer aktiven Form in dem Cytoplasma zahlreicher Zelltypen. Bei der Reaktion auf einen Stimulus bzw. Reiz wird er aktiviert und anschließend zu dem Kern verlagert, wo er die DNA bindet und die Transkription verschiedener Gene reguliert. Die Aktivierung von NF-κB kann durch verschiedene Agenzien, wie inflammatorische Zytokine (zum Beispiel Tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α) und Interleukin-1beta (IL-1β)), Mitogene, bakterielle Lipopolysaccharide (LPS), Viren, Oxidantien (zum Beispiel H2O2 und Ozon), Phorbolester und ultraviolettes Licht induziert werden. Unter den verschiedenen Genen, deren Expression durch NF-κB reguliert wird, befinden sich zahlreiche Gene, die bei Immun- und inflammatorischen Antworten eine Rolle spielen. So reguliert unter anderem NF-κB die Expression von proinflammatorischen Zytokinen wie IL-1ß, Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-6 (IL-6), TNF-α und Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF); Chemokine wie Interleukin-8 (IL-8), RANTES, Makrophagen-inflammatorisches Protein-1α (MIP-1α), Monozytchemotaktisches Protein-1 (MCP-1) und Eotaxin; inflammatorische Enzyme wie induzier bare Stickoxid-Synthase (iNOS), Cyclooxygenase-2 (COX-2), 5-Lipoxygenase (5-LO) und zytosolische Phospholipase A2 (cPLA2); Adhäsionsmoleküle wie interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1), vaskuläres Zelladhäsionsmolekül-1 (VCAM-1) und E-Selektin; und Rezeptoren wie der Interleukin-2-Rezeptor und der T-Zellenrezeptor (P. J. Barnes und I. M. Adcock, Trends Pharmacol. Sci., 1997, 18, 46–50).
  • Dysfurilctionen bei der Aktivierung von NF-κB und seinen dependenten Genen wurden verschiedenen pathologischen Erscheinungen zugeordnet wie akute Inflammation, septischer Schock, Transplantatabstoßung, Strahlungsschäden, Ischämie und Reperfusionsschädigung und neurodegenerativen Erkrankungen (P. A. Baeuerle und T. Henkel, Annu. Rev. Immunol. 1994, 12, 141–179), Asthma und anderen chronischen inflammatorischen Erkrankungen (P. J. Barnes und I. M. Adcock, Trends Pharmacol. Sci., 1997, 18, 46–50), Osteoporose (Y. Abu-Amer und M. Mehrad Tondravi, Nature Med., 1997, 3(11), 1189-1190) und Krebs (M. A. Sovak et al., J. Clin. Invest., 1997, 100(12), 2952–2960). Darüber hinaus wurden erhöhte NF-κB-Spiegel bei Synovialgewebe-Patienten mit rheumatoider Arthritis (H. Asahara et al., Biochem. Mol. Biol. Int., 1995, 37(5), 827–32), bei Proben des Zentralnervensystems von Patienten mit Multipler Sklerose (D. Gveric et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 1998, 57(2), 168–78) und bei atherosklerotischen Gewebeproben (K. Brand et al., J. Clin. Invest., 1996, 97(7), 1715–22) nachgewiesen, und es wurde beschrieben, dass amyloides β-Peptid, welches sich in Plättchen von Alzheimer-Patienten ansammelt, NF-κB in den Zellen des Zentralnervensystems aktiviert (C. Behl et al., Cell, 1994, 77, 817–827). Eine starke Zunahme bei der nuklearen Verlagerung von NF-κB wurde auch in dopaminergischen Neuronen von Patienten mit Parkinson-Erkrankung beobachtet (S. Hunot et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 1997, 94(14), 7531–7536). Darüber hinaus wurde auch berichtet, dass NF-κB bei der transkriptionalen Aktivierung von Viren, wie dem menschlichen Immundefizienzvirus (HIV), Cytomegaloviren, Adenoviren und Herpesviren eine Rolle spielt.
  • Andererseits wurde gezeigt, dass Zytokine, inflammatorische Enzyme, Adhäsionsmoleküle und andere Proteine, deren Expression durch NF-κB reguliert wird, eine wichtige Rolle innerhalb eines breiten Bereichs von Störungen spielen wie Inflammation, Asthma, respi ratorisches Distresssyndrom des Erwachsenen (ARDS), immunoinflammatorische und Autoimmun-Erkrankungen wie rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose, Psoriasis, entzündliche Darmerkrankungen, Lupus und Glomerulonephritis, Arthrose, septischer Schock, Atherosklerose, Krebs, Osteoporose, vorzeitige Wehen, Transplantatabstoßung, neurodegenerative Erkrankungen wie Demenz einschließlich Alzheimer-Erkrankung, Partinson-Krankheit und amyotrophische Lateralsklerose und Virusinfektionen.
  • Im Hinblick auf das Vorstehende könnten Mittel, die imstande sind, die Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB und/oder die Expression von Genen, die von diesem Transkriptionsfaktor abhängig sind, zu modulieren, von großem Nutzen als therapeutische Mittel für die Behandlung oder Prävention der vorstehenden Störungen sein. Es ist somit von großem Interesse, Mittel aufzufinden, die imstande sind, die NF-κB-Aktivität zu regulieren.
  • 2-Acetyloxy-4-trifluormethylbenzoesäure, welche besser mit ihrem internationalen Freinamen (INN) Triflusal bekannt ist, ist ein Plättchenaggregationsinhibitor, der zur Behandlung von thromboembolischen Erkrankungen unter der Handelsbezeichnung Disgren(R) vertrieben wird. Sein wesentlicher Metabolit 2-Hydroxy-4-trifluormethylbenzoesäure (auch bekannt durch das Acronym HTB) besitzt ebenfalls eine bemerkenswerte Aktivität als Plättchen-Antiaggregationsmittel. Beide Verbindungen werden in dem US-Patent 4 096 252 beschrieben.
  • Die vorliegenden Erfinder fanden in überraschender Weise, dass sowohl Triflusal als auch sein Metabolit, HTB, die NF-κB-Aktivierung inhibieren. Darüber hinaus wurde gefunden, dass beide Verbindungen potente Inhibitoren der Expression von Genen sind, die transkriptional durch NF-κB reguliert werden. Auf Grund dieser nun aufgefundenen neuen Aktivität sind Triflusal und HTB potentiell wertvoll bei der Behandlung oder Prävention von Störungen, bei denen die Aktivierung von NF-κB und seinen dependenten Genen eine Rolle spielt, wie den vorstehend genannten.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Auffinden des Sachverhalts, dass Triflusal und sein Metabolit, HTB, potente Inhibitoren der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB sind. Wie vorstehend erwähnt, ist NF-κB ein allgegenwärtiger Transkriptionsfaktor, der durch Bindung an DNA wirkt, wobei er auf diese Weise die Expression von verschiedenen Genen aktiviert, von denen zahlreiche bei der Immun- und inflammatorischen Reaktion eine Rolle spielen. Die vorliegende Erfindung zeigt, dass Triflusal und HTB die Aktivierung von NF-κB inhibieren, die eingeleitet wird durch verschiedene Mittel wie TNF-α, Immunkomplexe und LPS in verschiedenen Zelltypen, wie humane umbilikale Venen-Endothelzellen (HUVEC), Makrophagen und Monozyten. Darüber wird auch gezeigt, dass Triflusal und HTB die Expression von verschiedenen Proteinen inhibieren, bei deren transkriptionaler Regulierung NF-κB eine Rolle spielt, wie zum Beispiel VCAM-1, iNOS, COX-2, MCP-1 und TNF-α. Daher sind Triflusal und HTB als therapeutische oder präventive Mittel bei derartigen pathologischen Situationen wertvoll, bei denen NF-κB und/oder die Proteine, deren Expression durch diesen Transkriptionsfaktor reguliert wird, eine Rolle spielen.
  • Triflusal und HTB können generisch durch die Formel I ausgedrückt werden:
    Figure 00040001
    worin R für Wasserstoff (HTB) oder COCH3 (Triflusal) steht.
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung der Verwendung einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder Prodrugs hiervon für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prävention von Störungen, die mit der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB und/oder der Expression von Genen, die von diesem Transkriptionsfaktor abhängen, assoziiert sind.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder Prodrugs hiervon für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prävention von immunoinflammtorischen und Autoimmun-Erkrankungen wie rheumatoide Arthritis und andere arthritische Zustände, Multiple Sklerose, Psoriasis, inflammatorische Darmerkrankung, Lupus und Glomerulonephritis, Arthrose, Krebs, Inflammation, Asthma oder respiratorisches Distressyndrom des Erwachsenen, septischer Schock, Osteoporose, vorzeitige Wehen, Virusinfektionen und Transplantatabstoßung.
  • Die pharmazeutisch verträglichen Salze einer Verbindung der Formel I umfassen jegliche Salze, die üblicherweise in der pharmazeutischen Chemie eingesetzt werden, wie zum Beispiel die Salze mit anorganischen Kationen wie Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium, Lithium, Aluminium, Zink, etc. sowie die Salze, die mit Ammoniak und anderen pharmazeutisch verträglichen Aminen gebildet werden.
  • Durchgängig bedeutet in der Beschreibung die Bezeichnung Prodrug eine Verbindung der Formel I, jede Vorläuferverbindung einer Verbindung der Formel I, die imstande ist, metabolisiert zu werden und in vivo eine Verbindung der Formel I, nämlich Triflusal oder HTB, freizusetzen.
  • Unter NF-κB ist jegliches Glied der unter diesen Namen bekannten Proteinfamilie zu verstehen.
  • Unter Gen, das abhängig ist von und/oder reguliert wird durch, zumindest teilweise, den Transkriptionsfaktor NF-κB, ist jegliches Gen zu verstehen, das in seinem Promotorbereich eine oder mehrere NF-κB-Bindungsstellen aufweist. Die vorstehend unter der Überschrift "Beschreibung des Standes der Technik" erwähnte Liste von Genen, die durch NF-κB reguliert werden, ist lediglich beispielshalber aufgeführt.
  • Unter einer Störung, die mit der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB und/oder der Expression von Genen, die von dem Transkriptionsfaktor abhängig sind, assoziiert ist, ist jegliche Erkrankung oder jeglicher pathologische Zustand wie beansprucht zu verstehen, wo die Aktivierung von NF-κB und/oder die Proteine, deren Expression (d.h. die Expression des Gens, das für sie codiert) durch den Transkriptionsfaktor reguliert wird, zumindest teilweise eine Rolle spielen.
  • Die Bezeichnung inflammatorische Darmerkrankung beinhaltet sowohl die ulcerative Colitis als auch die Crohn'sche Erkrankung ebenso wie jeglichen anderen varianten Typ der inflammatorischen Darmerkrankung.
  • Die Bezeichnung Transplantatabstoßung bezieht sich sowohl auf die Gewebetransplantatabstoßung wie zum Beispiel die Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung ebenso wie die Organtransplantaterkrankung.
  • Verfahren zur Herstellung von Triflusal oder HTB werden in dem vorstehend genannten US-Patent ( US 4 096 252 ) offenbart.
  • Wie vorstehend erwähnt, inhibieren die Verbindungen der Formel I die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB und werden daher zur Inhibierung dieser Aktivierung bei Säugern vorzugsweise bei Menschen eingesetzt. Die Dosis einer Verbindung der Formel I, die nötig ist, um die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB für die beanspruchten Erkrankungen zu modulieren, wird von der zu behandelnden Störung, der Schwere der Symptome, dem Alter und dem Körpergewicht des Patienten ebenso wie von dem gewählten Verabreichungsweg abhängen. Ein jeder Fachmann wird imstande sein, unmittelbar die geeigneten Dosen in Abhängigkeit von diesen Faktoren zu bestimmen, ohne eine übermäßige Experimentation auf sich nehmen zu müssen. In der Humantherapie werden die Dosen im Allgemeinen im Bereich zwischen etwa 30 mg und etwa 3000 mg täglich einer Verbin dung der Formel I liegen, die in einer Einzeldosis oder in verschiedenen Dosiseinheiten verabreicht werden können. In Abhängigkeit von der speziellen zu behandelnden Erkrankung und der Patientensituation könnten auch Dosen außerhalb dieses Bereichs erforderlich sein, was wie vorstehend erwähnt jedoch ohne weiteres durch den Fachmann ohne übermäßige Experimentation ermittelt werden kann.
  • Die Verbindungen der Formel I können in Form einer jeden pharmazeutischen Formulierung verabreicht werden, deren Natur bekanntermaßen von dem Verabreichungsweg und der Natur der zu behandelnden Erkrankung abhängen wird. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können nach herkömmlichen Methoden unter Verwendung von kompatiblen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten oder Vehikeln hergestellt werden. Beispiele für solche Zusammensetzungen umfassen Kapseln, Tabletten, Sirupe, Pulver und Granulate zur Herstellung von zum Anwendungszeitpunkt hergestellten Lösungen, injizierbare Präparate, etc. Ein bevorzugter Verabreichungsweg der Verbindungen der Formel I ist der orale Weg. Zum Beispiel können sie als Hartgelatinekapseln, die zum Beispiel 50, 100, 200, 300, 400 oder 500 mg einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder Prodrugs hiervon enthalten, verabreicht werden.
  • Kurze Erläuterun der Figuren
  • 1 zeigt die inhibierende Wirkung von Triflusal und HTB bei der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB, induziert durch TNF-α in humanen umbilikalen Venen-Endothelzell (HUVEC)-Kulturen.
  • 2 zeigt die inhibierende Wirkung von Triflusal und HTB bei der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB, induziert durch Immunkomplexe (IC) bei Ratten-Makrophagen.
  • 3 (A und B) zeigt die inhibierende Wirkung von HTB bei der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB, induziert durch bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) in humanen mononuklaren Zellen von peripherem Blut.
  • 4 zeigt die inhibierende Wirkung von Triflusal und HTB auf die Expression von VCAM-1 mRNA, induziert durch TNF-α in HUVEC.
  • 5 zeigt die inhibierende Wirkung von HTB (5A) und Triflusal (5B) auf die Produktion von Nitrit, induziert durch Immunkomplexe in Ratten-Makrophagen.
  • 6 zeigt die Wirkung von Triflusal und HTB auf LPS-induziertes COX-2 in humanen mononuklearen Zellen: (6A) inhibierende Wirkung von Triflusal auf die COX-2-Expression; (6B) inhibierende Wirkung von HTB auf die COX-2-Expression; (6C) Inhibierung der Prostaglandin-E2(PGE2)-Produktion, ausgelöst durch Triflusal; (6D) Inhibierung der PGE2-Produktion, ausgelöst durch HTB.
  • 7 zeigt die inhibierende Wirkung von oral verabreichtem Triflusal auf die COX-2-Expression (7A) und auf die PGE2-Produktion (7B) bei dem Carrageen-induzierten Inflammationsmodell bei der Ratte.
  • 8 zeigt die inhibierende Wirkung von HTB auf die MCP-1-Expression, induziert durch Immunkomplexe (IC) in humaner monozytischer Zelllinie THP-1.
  • 9 zeigt die inhibierende Wirkung von Triflusal und HTB auf die TNF-α-Expression, induziert durch bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) in humanen mononuklearen Zellen des peripheren Bluts.
  • Die folgenden Beispiele erläutern die Nützlichkeit von Triflusal und HTB als Inhibitoren für die Aktivierung von NF-κB und seinen dependenten Genen. Die folgenden Abkürzungen wurden in den Beispielen verwendet:
    EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure
    DTT: 1,4-Dithiothreit
    bp: Basenpaare
    PBS: Phosphat-gepufferte Salzlösung
    RT-PCR: reverse Transkriptase-Polymersase-Kettenreaktion
    dNTP: Desoxyribonucleosid-triphosphat
    DNA: Desoxyribonucleinsäure
    RNA: Ribonucleinsäure
    MTT: Thiazolyl-Blau
    TBS: Tris-gepufferte Salzlösung
    ATP: Adenosyltriphosphat
    DMSO: Dimethylsulfoxid
    FCS: fötales Kälberserum
  • Beispiel 1
  • Inhibierung der Aktivierung von NF-κB, induziert durch TNF-α in HUVEC
  • A.ZELLKULTUR
  • Humane umbilikale Venen-Endothelzellen (HUVEC) wurden nach dem Verfahren von Dejana et al. (J. Cell Biol., 1987, 104(5), 1403–1411) erhalten durch Behandlung der umbilikalen Vene mit 0,2% Collagenase P aus C. histolyticum (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Deutschland) während 20 Minuten bei 37°C. Als nächstes wurden Zellen in M199-Medium (Flow Lab, Herts, U.K.), enthaltend 100 E/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 2,5 μg/ml Amphotericin B und 20% fötales Kälberserum. Primärkulturen wurden in 25 cm2-Kunststofflcolben belegt. Nach 24 Stunden wurden die Zellen zur Entfernung jener Zellen gewaschen, die nicht an der Kolbenoberfläche haften geblieben waren. Anschließend wurde das gleiche Medium, enthaltend 10% fötales Kälberserum, 50 μg/ml endothelialen Zellwachstums-Supplementfaktor und 100 μg/ml Heparin zugesetzt. Nach Kultivieren während 5 bis 7 Tagen erreichten die Zellen Konfluenz und wurden von der Kolbenoberfläche mit 0,05% Trypsin und 0,02% EDTA (Flow Lab) abgelöst. Die Reaktion wurde durch Zusatz von fötalem Kälberserum inhibiert und hiernach wurden die Zellen gewaschen und erneut in Kulturmedium belegt. Man ließ die Zellen bis zur Konflu enz in Gelatine-beschichteten Kolben wachsen. Die für die Experimente verwendeten Zellen stammten von den Passagen 2–7.
  • B. BEHANDLUNG VON HUVEC-ZELLEN MIT TNF-α UND ELEKTROPHORETISCHER MOBILITÄTS-SHIFT-ASSAY (EMSA)
  • Bei diesem Experiment wurden HUVEC-Zellen mit Triflusal und HTB bei Konzentrationen in beiden Fällen von 2 und 4 mM präinkubiert. Hiernach wurden diese Zellen mit 100 E/ml TNF-α (Genzyme Diagnostics, Cambridge, MA USA) während 90 Minuten stimuliert. Als nächstes wurden die HUVEC-Zellen mit kaltem hypotonischem Lysepuffer (10 mM HEPES-KOH, pH 7,9, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT (1,4-Dithiothreit), 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 5 μg/ml Aprotinin, 5 μg/ml Leupeptin und 0,6% Nonidet P-40) gewaschen und 10 Minuten auf Eis gehalten. Anschließend wurden sie kräftig 10 Sekunden verwirbelt. Nicht-gebrochene Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 1000 x g während 10 Minuten eliminiert. Die Kerne wurden durch Zentrifugieren bei 15000 x g während 1 Minute in einer Mikrozentrifuge gesammelt. Das Kernpellet wurde in einem Extraktionspuffer mit hohem Salzgehalt (25% Glyzerin und 0,5 M KCl) resuspendiert. Der Kernextrakt wurde durch Zentrifugieren während 30 Minuten bei 105000 x g in einer Optima T1-Ultrazentrifuge (Beckmann) unter Verwendung eines TLA 100.2 Rotors erhalten. Ein 22 bp-doppelsträngiges Oligonucleotid, enthaltend NF-κB-Sequenzen, wurde als Meßgrößenprobe verwendet. Diese Probe wurde endständig mit (γ-32P)ATP unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase markiert und durch Minisäulenchromatographie gereinigt. Die verwendete κB-Sequenz war 5'-AGTTCAGGGGAATTTCCCAGGC-3' und die komplementäre 5'-GCCTGGGAAATTCCCCTGAACT-3'. 10 μg des gereinigten Kernproteins wurde 20 Minuten auf Eis mit der radiomarkierten Oligonucleotidprobe (2–6 x 104 cpm) in 25 μl Reaktionspuffer, bestehend aus 2 μg Poly(dl-dC), 10 mM Tris HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 8% Ficoll und 4% Glyzerin, inkubiert. Die Nucleoprotein-Oligonucleotid-Komplexe wurden durch Elektrophorese in einem nichtdenaturierenden Polyacrylamidgel in Tris-Borat/EDTA-Puffer 3 Stunden bei 175 V und bei 4°C wieder aufgelöst. Das Gel wurde getrocknet und mit einem verstärkenden Film bei –80°C während 2 bis 12 Stunden einer Autoradiographie unterzogen. Die Spezifität des DANN (Probe)-Proteinkomplexes wurde durch Konkurrenz der 32P-markierten Probe mit einem 300-fachen Überschuss an nicht-markierter Probe bestätigt, welche keine Anwesenheit an markierter Probe in dem DNA-Proteinkomplex (Daten nicht gezeigt) zeigte. Die als Kontrolle bezeichnete Bahn entspricht den während 90 Minuten in Abwesenheit von TNF-α inkubierten Zellen.
  • C. ERGEBNISSE
  • Die Ergebnisse dieses Experiments finden sich in 1. Sowohl Triflusal als auch HTB inhibieren konzentrationsabhängig die Aktivierung von NF-κB induziert durch TNF-α in HUVEC.
  • Beispiel 2
  • Inhibierung der Aktivierung von NF-κB, induziert durch Immunkomplexe (IC in Ratten-Makrophagen
  • A. ISOLIERUNG UND KULTUR VON PERITONEALEN RATTEN-MAKROPHAGEN
  • Man extrahierte Zellen der Ratten-Peritonealhöhle und resuspendierte sie in Abwesenheit von Serum in DMEM-Kulturmedium, das zuvor ergänzt worden war mit 100 E/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 50 μg/ml Gentamycin, 2 mM Glutamin und 0,5 mM L-Arginin. Die Zellen wurden 2 Stunden in Kulturplatten bei 37°C inkubiert und diejenigen, die nicht an den Platten haften blieben, wurden durch dreimaliges Waschen mit dem gleichen frischen Medium entfernt. Mehr als 95% der anhaftenden Zellen waren Makrophagen, wie durch ihre Befähigung Zymosanteilchen zu verschlingen und nicht-spezifische Esterasefärbung ermittelt wurde. Die Makrophagen wurden bei 37°C unter einer 5% CO2-Atmosphäre gehalten und 2 Stunden später wurden die nicht-anhaftenden Zellen entfernt, und die an den Platten anhaftenden peritonealen Makrophagen wurden mit 100 μg/ml aus Kaninchen-Antiserum hergestellten IgG/0valbumin-Immunkomplexen 2 Stunden in Gegenwart oder Abwesenheit (Vehikel) von Triflusal oder HTB (4 mM, beide) inkubiert.
  • B. ELEKTROPHORETISCHER MOBILITÄTS-SHIFT-ASSAY (EMSA)
  • Nach Inkubation wurden die Makrophagen zweimal mit PBS gewaschen und man bestimmte den Aktivierungsgrad (Bindung an DNA) des Transkriptionsfaktors NF-κB unter Anwendung des EMSA-Assays, wie im Einzelnen in Beispiel 1 beschrieben.
  • C. ERGEBNISSE
  • 2 zeigt die mit Triflusal und HTB bei diesem Experiment erhaltenen Ergebnisse. Eine repräsentative Probe der in den zwei unabhängigen Experimenten erhaltenen wird gezeigt. Sowohl Triflusal als auch HTB inhibieren merklich die Aktivierung von NF-κB, die durch Immunkomplexe in Ratten-Makrophagen ausgelöst worden war.
  • Beispiel 3
  • Inhibierung der Aktivierung von NF-κB induziert durch bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) in humanen mononuclearen Zellen des peripheren Bluts (PBMC)
  • A. ISOLIERUNG UND KULTUR VON HUMANEN MONONUCLEAREN ZELLEN
  • Mononucleare Zellen (PBMC) wurden aus Blut von gesunden Spendern vom Hospital de Sant Pau (Barcelona) erhalten, die während eines Zeitraums von nicht weniger als 2 Wochen vor der Blutentnahme keinen antiinflammatorischen Wirkstoff eingenommen hatten. Ausgehend von einem Volumen von etwa 80 ml heparinisiertem menschlichen Blut (10 E/ml) wurde dieses mit PBS (pH 7,4; Dulbecco) ohne Calcium, Magnesium oder Natriumbicarbonat verdünnt (1 : 1).
  • 15 ml Ficoll-Lösung (d = 1,077 bei 20°C; Biochrom KG) wurden in 50 ml Falcon-Röhrchen gegeben. Zu dieser Lösung gab man vorsichtig ein Volumen von etwa 25 ml je Röhrchen des zuvor mit PBS verdünnten Bluts und die Röhrchen wurden dann bei 1200 g 20 Minuten zentrifugiert. Mononucleare Zellen konzentrieren sich an einer weißlichen Grenzphase zwischen dem Plasma und der Ficoll-Lösung. Diese Grenzphase wurde mit einer Pasteur-Pipette gesammelt und 1 : 1 mit PBS verdünnt. Sie wurde dann bei 300 g 10 Minuten zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde erneut in 50 ml PBS suspendiert und wiederum bei 200 g 10 Minuten zentrifgugiert, um Plättchenverunreinigung zu entfernen. Schließlich wurde das resultierende Pellet in 20 ml RPMI-1640-Kulturmedium (GibcoBRL), ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, suspendiert.
  • Isolierte PBMCs wurden durch Standard-Wright-Giemsa-Färbung analysiert, um zu ermitteln, ob die Zellen die morphologischen Merkmale lebensfähiger mononuclearer Zellen aufweisen und um die verschiedenen isolierten Zelltypen zu bestimmen (im Durchschnitt 90% Lymphozyten und 10% Monozyten). Vor den verschiedenen Behandlungen wurde die Zelllebensfähigkeit durch den Trypan-Blau-Ausschluß-Assay bestimmt. Die Zellen wurden in einer Konzentration von 2,5 Millionen/ml mit RPMI-Medium, enthaltend 10% fötales Kälberserum, verdünnt und 1 Stunde (37°C, 5% CO2) in 6-Tüpfelplatten (2 ml/Tüpfel, 5 Millionen PBMC) ohne Zusatz irgendeines Wirkstoffs (Kontrolle) oder unter Zusatz von HTB (1–3 mM) inkubiert. Als nächstes wurden die Zellen weitere 10 Minuten in Anwesenheit von 10 μg/ml E. coli Lipopolysaccharid (LPS, 026 : B6 Serotyp; Sigma) inkubiert. Nach der Inkubation wurde eine Probe (100 μl) entnommen, um eine Zellzählung sowie Zelllebensfähigkeitskontrollen durch Messung der Befähigung von mitochondrialen Dehydrogenasen zur Umwandlung von löslichem Tetrazoliumsalz, MTT, in das unlösliche Formazanprodukt (MTT-Assay) vorzunehmen. Die Zellen wurden auch mit HTB (3 mM) in Abwesenheit von LPS inkubiert. In sämtlichen Fällen war die Zelllebensfähigkeit gleich oder höher als 95%.
  • B. ELEKTROPHORETISCHER MOBILITÄTS-SHIFT-ASSAY (EMSA)
  • Nach Inkubation wurden PBMCs zweimal mit PBS gewaschen und man bestimmte den Aktivierungsgrad (Bindung an DNA) des Transkriptionsfaktors NF-κB unter Verwendung des EMSA-Assays, wie im Einzelnen in Beispiel 1 beschrieben.
  • C. ERGEBNISSE
  • 3 zeigt die in diesem Experiment mit HTB erhaltenen Ergebnisse. Es wird ein repräsentatives Beispiel der in zwei unabhängigen Experimenten erhaltenen gezeigt. HTB inhibiert erheblich die Aktivierung von NF-κB, die durch LPS in humanen PBMCs induziert wurde.
  • Beispiel 4
  • Inhibierung der Expression von VCAM-1 in HUVEC, induziert durch TNF-α
  • A. SYNTHESE DES ERSTEN STRANGS cDNA UND PCR VON VCAM-1
  • Die für den Nachweis von VCAM-1 mRNA durch RT-PCR verwendeten Primer wurden aus der humanen Gen-Sequenz (EMBL/GenBank AC: M30257) unter Verwendung der Wisconsin Package Version 9.1, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin, gebildet. Ihre Sequenzen waren 5'-TGTCACTGTAAGCTGCAAG-3' und 5'-TTCCAGCCTGGTTAATTC-3' entsprechend den Nucleotiden 1090–1108 und 1589–1572 (L. Osborn et al., Cell 1989, 59(6),1203–1211). Die vollständige RNA wurde aus kultivierten Zellen unter Anwendung der Guanidiumisothiocyanat-Methode (P. Chromczynski und N. Sacchi, Anal Biochem. 1987, 162(1), 156–159) extrahiert. Der erste cDNA-Strang wurde aus gesamter RNA durch reverse Transkriptionsreaktion synthetisiert. Die Reaktion wurde unter Verwendung von 0,2 mg/ml Gesamt-RNA (vorerhitzt bei 68°C währen 10 Minuten), 2,5 μl H2O, 20 E RNAase-Inhibitor, 4 μl Puffer 5X, 2 μl 0,1 M DTT, 4 μl 2,5 mM dNTP, 1 μl 0,1 mM Hexanucleotide und 200 E Moloney-Murines Leukämie-Virus-reverse Transkriptase durchgeführt. Die Reaktion wurde bei 37°C 60 Minuten in einem Volumen von 20 μl durchgeführt. VCAM-1 cDNA wurde durch PCR in einer Reaktionsmischung, enthaltend 2 μl DNA, 10 μl H2O, 2,5 μl Puffer 10X, 0,75 μl 50 mM MgCl2, 1,0 μl 2,5 mM dNTP, 1,25 μl eines jeden Primers (Sense und Antisense) und 0,25 μl Taq DNA-Polymerase 5 E/ml amplifiziert. Eine Negativkontrolle unter Verwendung von Wasser war bei jeder PCR-Reaktion eingeschlossen. Die Amplifikationsbedingungen waren wie folgt: Ein anfänglicher Denaturierungszyklus bei 94°C während 5 Minuten und dann 30 Zyklen umfassend: Denaturierung bei 90°C während 30 Sekunden, Primer-Annealing bei 59°C während 30 Sekunden und Extension bei 72°C während 1 Minute; und schließ lich ein Extensionszyklus bei 72°C während 7 Minuten. Die relativen Mengen einer jeden amplifizierten cDNA wurden bestimmt durch Messung der Dichte der mit Ethidiumbromid gefärbten Banden unter Verwendung des Gel Doc-Dokumentationssystems und der Molecular Analyst-Software von Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA. Die Expression von β-Aktin wurde als Kontrolle für den Assay der Expression eines konstitutiv exprimierten Gens verwendet.
  • Im Einzelnen wurde der Effekt von Triflusal (4 mM) und HTB (4 mM) hinsichtlich der Regulierung der Expression von VCAM-1 mRNA, induziert durch TNF-α (100 E/ml) in HUVEC untersucht. Es wurden so die Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von TNF-α und mit Triflusal und HTB inkubiert. Nach 1 Stunde wurde die Gesamt-RNA extrahiert und der reversen Transkriptionsreaktion unterzogen. Anschließend wurde eine Amplifikationsreaktion durch PCR mit den für die Sequenzen der VCAM-1-Moleküle und humanes β-Aktin entwickelten Primer durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese in einem 1,8% Agarosegel getrennt und hiernach quantifiziert. Das Molekulargewicht der Amplifikationsprodukte wurde aus der elektrophoretischen Migration von DNA-Größenstandards bestimmt.
  • B. ERGEBNISSE
  • Die bei diesem Versuch erhaltenen Ergebnisse sind in 4 gezeigt. Sowohl Triflusal als auch HTB inhibieren bei einer Konzentration von 4 mM vollständig die durch TNF-α in HUVEC induzierte Expression von VCAM-1 mRNA. Die Abwesenheit eines Effekts auf die Expression von β-Aktin mRNA zeigt die Selektivität der untersuchten Verbindungen hinsichtlich des Transkriptionsfaktors NF-κB.
  • Beispiel 5
  • Inhibierung der durch Immunkomplexe induzierten Expression von iNOS bei peritonealen Ratten-Makrophagen
  • A. BESTIMMUNG DER PRODUKTION VON NO DURCH PERITONEALE RATTEN-MAKROPHAGEN
  • Man erhielt peritoneale Rattenzellen und resuspendierte in DMEM-Kulturmedium in Abwesenheit von Serum und mit Antibiotika ergänzt. Die Makrophagen wurden auf Grund ihrer Befähigung, an den Kulturplatten nach der Inkubation während 2 Stunden bei 37°C anzuhaften, isoliert. Nicht-haftende Zellen wurden entfernt und es wurde dann ermittelt, dass mehr als 95% der anhaftenden Zellen Makrophagen waren, wie durch ihre Fähigkeit Zyinosanpartikel zu verschlingen und nicht-spezifische Esterasefärbung festgestellt wurde. Die Kulturplatten wurden bei 37°C unter einer 5% CO2-Atmosphäre gehalten und die peritonealen Makrophagen, die an den Platten anhafteten, wurden mit 100 μg/ml IgG/Ovalbumin-Immunkomplexe in Gegenwart oder Abwesenheit (Kontrolle) von Triflusal oder HTB (0,1–20 mM, beide) inkubiert. Die Wirkstoffe wurden 10 Minuten vor der Zugabe von IgG/Ovalbumin zugegeben und die Produktion von NO wurde als nach 24 Stunden anwesendes Nitrit bestimmt.
  • B. BESTIMMUNG VON NO UND NITRIT
  • INOS-Expression wurde direkt als NO-Produktion gemessen. Das aus den Makrophagenkulturen freigesetzte NO wurde indirekt durch die Akkumulation von Nitriten bestimmt. Zu 1 ml Zellkultur (0,5 Millionen Zellen in Medium ohne Phenol-Rot) gab man 100 μl einer 1 mM Sulphanilsäurelösung und 100 mM HCl (Endkonzentration). Nach 5 Minuten Inkubation wurde das Medium abgezogen und in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge zentrifugiert. 50 μl Naphthalindiamin (1 mM Endkonzentration) wurden zugesetzt und nach 15 Minuten Inkubation wurde das Absorptionsvermögen der Probe bei 548 nm gemessen und mit einem NaNO2-Standard verglichen. Die NO-Produktion wurde als nMol NO2 –/mg Protein ausgedrückt.
  • C. ERGEBNISSE
  • Die bei diesem Versuch erhaltenen Ergebnisse finden sich in 5A für HTB und in 5B für Triflusal. Die Punkte repräsentieren die durchschnittliche ±-Standardabweichung vom Mittelwert (SEM) aus 7 bis 9 Experimenten, von denen ein jedes doppelt durchgeführt wurde. Die für Triflusal und HTB aus den entsprechenden Kurven berechneten IC50-Werte betrugen 1,13 ± 0,12 bzw. 1,84 ± 0,34 mM.
  • Ähnliche Ergebnisse erhielt man, wenn Makrophagen mit LPS anstelle von Immunkomplexen inkubiert wurden.
  • Beispiel 6
  • Inhibierung der durch bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) in humanen peripheren mononuclearen Blutzellen (PBMC) induzierten COX-2-Expression
  • A. ISOLIERUNG UND KULTUR VON HUMANEN MONONUCLEAREN ZELLEN
  • Mononucleare Zellen (PBMC) wurden aus Blut gesunder Spender des Hospital de Sant Pau (Barcelona) erhalten, die keinen antiinflammatorischen Wirkstoff während eines Zeitraums von nicht weniger als 2 Wochen vor der Blutentnahme eingenommen hatten. Ausgehend von einem Volumen von etwa 80 ml heparinisiertem Humanblut (10 E/ml), wurde dieses mit PBS (pH 7,4; Dulbecco) ohne Calcium, Magnesium oder Natriumbicarbonat verdünnt (1 : 1).
  • 15 ml Ficoll-Lösung (d = 1,077 bei 20°C, Biochrom KG) wurden in 50 ml Falcon-Röhrchen eingebracht. Zu dieser Lösung gab man vorsichtig ein Volumen von etwa 25 ml je Röhrchen des zuvor mit PBS verdünnten Bluts und die Röhrchen wurden dann 20 Minuten bei 1200 g zentrifugiert. Mononucleare Zellen konzentrieren sich an einer weißlichen Grenzfläche zwischen dem Plasma und der Ficoll-Lösung. Diese Grenzfläche wurde mit einer Pasteur-Pipette gesammelt und mit PBS 1 : 1 verdünnt. Sie wurde dann bei 300 g 10 Minuten zentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde in 50 ml PBS resuspendiert und wiederum bei 200 g 10 Minuten zentrifugiert, um Plättchenverunreinigung zu entfernen.
  • Schließlich wurde das entstandene Pellet in 20 ml RPMI-1640-Kulturmedium (GibcoBRL), das ergänzt war mit 10% fötalem Kälberserum, resuspendiert.
  • Isolierte PBMCs wurden durch Standard-Wright-Giemsa-Färbung analysiert, um zu prüfen, ob die Zellen die morphologischen Merkmale lebensfähiger mononuclearer Zellen aufweisen und die verschiedenen Typen der isolierten Zellen (durchschnittlich 90% Lymphozyten und 10% Monozyten) zu bestimmen. Die Zellen wurden bei einer Konzentration von 2,5 Millionen/ml mit RPMI-Medium, das 10% fötales Kälberserum enthielt, verdünnt und 19 Stunden in 6-Tüpfelplatten (2 ml/Tüpfel, 5 Millionen PBMC) inkubiert (37°C, 5% CO2). Die Inkubationen wurden in Gegenwart von 10 μg/ml E. coli Lipopolysaccharid (LPS, 026 : B6 Serotyp, Sigma) ohne Zusatz irgendeines Wirkstoffs (Kontrolle) oder unter Zusatz von Triflusal oder HTB (0,1–5 mM) durchgeführt. Vor den Inkubationen wurden Kontrollen der Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung des Trypan-Blau-Ausschlußtests durchgeführt. Nach der Inkubation wurde eine Probe (100 μl) entnommen, um eine Zellzählung sowie Kontrollen der Lebensfähigkeit der Zellen durch Messen der Befähigung mitochondrialer Dehydrogenasen lösliches Tetrazoliumsalz, MTT, in das unlösliche Formazanprodukt (MTT-Assay) umzuwandeln, vorgenommen. Die Zellen wurden auch mit HTB und Triflusal bei den gleichen Konzentrationen jedoch ohne Zusatz von LPS inkubiert. In sämtlichen Fällen war die Lebensfähigkeit der Zellen gleich oder höher als 95 %, sowohl zu Beginn des Experiments als auch nach 19-stündiger Inkubation.
  • B. IMMUNOBLOT-ASSAYS
  • Nach der Inkubation wurden die Zellen 5 Minuten bei 1000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und bei –70°C für die spätere Bestimmung von PGE2 gehalten, als Maß der COX-2-Aktivität aufbewahrt und die pelletisierten Zellen wurden in 5 ml PBS resuspendiert und wiederum zentrifugiert (5 Minuten, 1000 g). Das entstandene Pellet wurde in 50 μl Zelllysepuffer (PBS mit 1% Nonidet-40 und 1 mM EDTA) resuspendiert und in Eis 15 Minuten inkubiert. Die entstandene Mischung wurde bei 20000 g 15 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde gesammelt. 5 μl des Überstands wurden entnommen und 1/20 mit PBS verdünnt, um die Proteinkonzentration unter Verwendung von BCA-Protein-Assay-Reagens (Pierce) zu bestimmen.
  • Der verbliebene Überstand wurde dann im Verhältnis 1 : 1 mit Elektrophoresegel- Beladungspuffer (50 mM Tris; SDS, 2% Gew./Vol.; Glyzerin, 10% Vol./Vol.; β-Mercaptoethanol, 50 μl/ml und Bromphenol-Blau, 2 mg/ml) gemischt und 5 Minuten gekocht. Die Proben wurden bei 10000 g 2 Minuten zentrifugiert und hiernach einer diskontinuierlichen Elektrophorese in SDS-Polyacrylamidgel (4% Sammelgel/7,5% Trenngel) bei variabler Intensität und einer festgelegten Spannung von 200 V unterzogen, bis sich die Front lediglich einige Millimeter vom Gelende befand (etwa 1 Stunde).
  • Die Proteine wurden unter Verwendung eines gekühlten TE 22 Mighty Small Transfer Unit (Hoefer)-Systems bei einer Spannung von 100 V während 2 Stunden zu einer Nitrocellulosemembran transferiert. Nach Beendigung des Transfers wurden die Membranen noch über Nacht bei 4°C in blockierendem Puffer (1 : 4 getrocknete fettfreie Milch in TBS, enthaltend 0,1% Tween 20) gerührt.
  • Die blockierten Membranen wurden 1 Stunde unter Rühren mit einem gegen humanes COX-2 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) vermehrten polyklonalen Antikörper der Ziege gerührt und nach dem Waschen 1 Stunde mit Meerrettich-Peroxidase-markiertem Antikörper (Kaninchen-Anti-Ziege IgG-Meerrettich-Peroxidase, Immunopure, Pierce) inkubiert und der an das Protein gebundene Antikörper wurde durch Chemolumineszenz (ECL, Amershan) sichtbar gemacht.
  • Schließlich wurden die Überstände aus jedem Versuch, die bei –70°C aufbewahrt worden waren, aufgetaut und die Menge an PGE2 in der Lösung wurde unter Verwendung spezifischer ELISA-Kits (Amershan-Biotrak RPN22) bestimmt.
  • C. ERGEBNISSE
  • Die bei diesem Versuch erhaltenen Ergebnisse werden in 6 gezeigt. Die gezeigten Ergebnisse entsprechen den beiden repräsentativen Immunoblots aus den in fünf unabhängigen Versuchen erhaltenen (6A: Triflusal; 6B: HTB) und den mittleren ± SEM der Quantifizierung von PGE2 in den Überständen der den genannten Experimenten entsprechenden Kulturen (6C: Triflusal; 6D: HTB). Sowohl Triflusal als auch HTB inhibieren konzentrationsabhängig die COX-2-Expression ebenso wie die PGE2-Produktion.
  • Beispiel 7
  • Inhibierung der COX-2-Expression in inflammatorischen Exudatzellen der Ratte
  • A. ALLGEMEINE METHODE
  • Lewis-Ratten (175–200 g) wurden bei dieser Untersuchung verwendet. Die Ratten wurden willkürlich in Gruppen von 5 Tieren aufgeteilt. Es wurde durch subkutane Injektion von 20 ml steriler Luft in den intraskapularen Bereich der Tiere bei jeder Gruppe ein Luftsack erzeugt. Alle zwei Tage wurden erneut 10 ml Luft in die Höhle injiziert, um den Raum offen zu halten. Sieben Tage nach der ersten Luftinjektion wurden 2 ml einer 1% Karrageenlösung in den Luftsack bei sämtlichen Gruppen injiziert, um eine inflammatorische Reaktion zu erzeugen. Die Testverbindung wurde oral 30 Minuten vor der Karrageenverabreichung verabreicht. Die Tiere wurden 6 Stunden später getötet und man bestimmte das Volumen des Exudats. Der Typ und die Anzahl der vorhandenen Zellen wurden unter Anwendung einer Standard-Wright-Giemsa-Färbung bzw. eines Counter Counter-Zellzählers bestimmt. Das Exudat wurde bei 400 g bei 4°C während 7 Minuten zentrifugiert und man bestimmte die PGE2-Konzentration durch Enzym-Immuno-Assay (Amershan-Biotrak RPN222). Das Zellpellet wurde in 2 ml kalter 0,85% NaCl resuspendiert. Zur Entfernung von roter Zellverunreinigung wurden die Zellen einer selektiven zellularen Lyse durch Zusatz von 6 ml kaltem Wasser während 20 Sekunden unterzogen. Die Isotonizität der zellularen Suspension wurde durch Zusatz von 2 ml 3,5% NaCl wieder hergestellt. Schließlich wurde die zellulare Suspension unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend erwähnt zentrifugiert und das Pellet wurde in Lysepuffer bei einer Dichte von 2 × 108 Zellen für die Immunoblot-Assays (siehe Beispiel 6) resuspendiert.
  • B. ERGEBNISSE
  • Die Ergebnisse finden sich in 7. 7A entspricht einem repräsentativen Immunoblot und 7B zeigt die durchschnittliche ± SEM der Quantifizierung von PGE2 in dem Rattenexudat (n = 4). Die orale Verabreichung von Triflusal (3–30 mg/kg) inhibiert dosisabhängig die COX-2-Expression in den in dem Exudat vorhandenen Zellen sowie die PGE2-Produktion.
  • Beispiel 8
  • Inhibierung der durch Immunkomplexe in der humanen monozytären Zelllinie THP-1 induzierten Expression von monozytärem chemotaktischen Protein-1 (MCP-1)
  • A. ZELLKULTUR UND BESTIMMUNG VON MCP-1-SPIEGELN
  • Humane monozytäre THP-1-Zellen (3 × 106 Zellen/Tüpfel) wurden in Kunststoffschalen in RPMI 1640-Kulturmedium, welches ergänzt worden war mit Penicillin (100 E/ml), Streptomycin (100 μg/ml), Gentamycin (50 μg/ml), Glutamin (2 mM) und 2% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, kultiviert. Die Zellen wurden in Anwesenheit von HTB (2 und 4 mM) oder Vehikel kultiviert und wurden mit 100 μg/ml Immunkomplexaggregaten (A-IgG) aktiviert. Die Produktion von löslichem MCP-1 wurde durch ELISA unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits (R&D Systems Inc.; Minneapolis, MN) bestimmt. Die Nachweisgrenze des Systems betrug 5 pg/ml.
  • B. ERGEBNISSE
  • Die bei diesem Assay erzielten Ergebnisse sind in 8 gezeigt. HTB fürht sowohl bei einer Konzentration von 4 mM als auch 2 mM zu einer vollständigen Inhibierung der durch Immunkomplexe in THP-1 induzierten MCP-1-Expression.
  • Beispiel 9
  • Inhibierung der durch bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) in humanen mononuclearen peripheren Blutzellen (PBMC) induzierten Expression von TNF-α
  • A. ISOLIERUNG UND KULTUR VON HUMANEN MONONUCLEAREN ZELLEN
  • Mononucleare Zellen (PBMC) wurden aus Blut von gesunden Spendern des Hospital de Sant Pau (Barcelona) nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren erhalten. Die Zellen wurden auf eine Konzentration von 2 Millionen/ml in RPMI-Medium, das ergänzt worden war mit 10% fötalem Kälberserum, verdünnt und mit Triflusal, HTB oder Vehikel (DMSO) in Gegenwart von 10 μg/ml E. coli Lipopolysaccharid (LPS, 026 : B6 Serotyp; Sigma) während 19 Stunden inkubiert (37°C, 5% CO2). Die Zellsuspension wurde hiernach bei 2000 g 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert und der entstandene Überstand wurde bei –70°C für die spätere Analyse aufbewahrt. Der Zytokingehalt wurde durch enzymatischen Immuno-Assay nach 1/100 Verdünnung der Proben bestimmt.
  • B. ERGEBNISSE
  • Die mit Triflusal und HTB bei diesem Experiment erzielten Ergebnisse sind in 9 gezeigt. Sowohl Triflusal als auch HTB (1 und 0,3 mM) inhibieren fast vollständig die LPS-induzierte TNF-α-Produktion. Die Ergebnisse werden als mittlere ±-Standardabweichung des Durchschnitts von 2–5 getrennten Experimenten, die jeweils dreifach durchgeführt wurden, ausgedrückt.
  • Beispiel 10
  • Inhibierung der Aktivierung von NF-κB in postnatalen Long Evans-Schwarzkorifratten-Gliazellen
  • A. ALLGEMEINE METHODE
  • Diese Untersuchung wurde unter Verwendung von postnatalen (P9) Long Evans-Schwarzkopfratten durchgeführt. Jede Gruppe bestand aus 6 Tieren, die einer experimentellen Läsion unterzogen wurden plus zwei Kontrolltieren gleichen Alters. Die experimentelle Läsion wurde durch intracortikale Injektion (sensorimotorischer Bereich) von N-Methyl-D-aspartat (NMDA) herbeigeführt, das eine ausgeprägte lokale neuronale Degeneration verursacht. Triflusal (30 mg/kg) wurde oral in drei Dosen (von Tag 7 bis 9) alle 24 Stunden verabreicht. Die gliale Reaktivität wurde durch NMDA-Injektion am postnatalen Tag 9 eine Stunde nach der letzten Triflusal-Dosis herbeigeführt. Zu verschiedenen Zeiten (2–24 Stunden) nach der letzten Dosis wurden die Tiere getötet, ihr Hirn wurde extrahiert und in einem Cryostaten zerschnitten und es wurden Sektionen unter Verwendung immunocytochemischer und histochemischer Techniken zur Bestimmung der NF-κB-Aktivierung in Mikroglia und Astroglia unter Anwendung von Doppelfärbung behandelt: NF-κB-Lektin und NF-κB-GFPA. Parallel wurden Scheiben auf einem Vibratom zur Bestimmung des Grades der mikroglialen und astroglialen Reaktivität mit Hilfe von histoenzymatischen Techniken (B. Castellano et al., J. Histochem. Cytochem., 1991, 39(5), 561-568) geschnitten.
  • B. ERGEBNISSE
  • Bei den Kontrolltieren zeigten cortikale Neurone jedoch nicht Gliazellen konstitutiv aktiviertes NF-κB. Diese basale Aktivierung wird durch Vorbehandlung mit Triflusal inhibiert. Bei denjenigen Tieren, bei denen eine exzitotoxische Läsion mit NMDA durchgeführt wurde, wurde eine rasche NF-κB-Aktivierung in Gliazellen beobachtet. Die Vorbehandlung mit Triflusal bei 30 mg/kg p.o. inhibierte vollständig die NF-κB-Aktivierung sowohl in astrogialen als auch mikroglialen Zellen.
  • Beispiel 11
  • Triflusal verhindert neuronalen Zelltod in Co-Kulturen von Neuronen und Astrozyten, induziert durch Sauerstoff/Glukose-Verarmung(OGD)
  • A. ALLGEMEINE METHODE
  • Um diese Untersuchung durchzuführen wurde ein in vitro-Modell der neuronalen Ischämie, basierend auf Co-Kulturen von Neuronen und Gliazellen angewandt. Primärkulturen vom Typ 1-Astrozyten wurden aus 1-Tag alten Wistar-Ratten hergestellt. Astrozyten wurden auf 60 mm Poly-D-lysin-beschichteten Platten anhaften gelassen. Diese Zellen ließ man wachsen, bis sie konfluent waren (etwa 11 Tage) und hiernach wurden primäre Ratten-Neuronen auf sie aufgebracht und man ließ 10 Tage wachsen. Zusätzlich wurden separate Kulturen eines jeden der beiden Zelltypen hergestellt.
  • Die Hälfte der Kulturen wurde vier Stunden einer Sauerstoff-Glukose-Verarmung (OGD) unterzogen, gefolgt von einer 24-ständigen Erholungsperiode. Sowohl die der OGD ausgesetzten Zellen als auch die Kontrollzellen wurden zu Beginn der OGD mit 0, 10 und 30 μg/ml Triflusal in einer Reihe von Experimenten und mit 0, 20 und 100 μg/ml HTB in einer anderen Reihe behandelt. Nach der 24-ständigen Erholungsperiode wurde die Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase (LDH) in das Medium als Maß des Zelltodes ebenso wie der Grad der Apoptosis in den Kulturen (unter Verwendung des TUNEL-Assays) und die in der Co-Kultur vorhandenen vollständigen Neuronen- und Astrozyten-Zahlen (unter Verwendung der Hoescht-Färbung) bestimmt.
  • B. ERGEBNISSE
  • In den der OGD ausgesetzten Kulturen wurde eine ausgeprägte Zunahme der LDH-Freisetzung ebenso wie in der Anzahl der apoptotischen Neuronen im Vergleich zu den Kontrollen beobachtet. Die verschiedenen Konzentrationen von Triflusal bzw. HTB, die bei dieser Untersuchung getestet wurden, inhibierten vollständig beide Effekte. Daher können bei diesem Modell sowohl Triflusal als auch sein Metabolit HTB die durch Sauerstoff und Glukose-Verarmung herbeigeführte Apoptosis und neuronale Degeneration verhindern.
  • Beispiel 12
  • Inhibierung der Adjuvans-induzierten Arthritis bei der Ratte
  • A. ARTHRITIS-INDUKTION
  • Die Adjuvans-induzierte Arthritis ist gekennzeichnet durch die Entwicklung ab Tag 14 nach der Adjuvans-Injektion einer chronischen Inflammation immunologischen Ursprungs in verschiedenen Gelenken unter Akkumulation von inflammatorischen Zellen und Freisetzung von Zytokinen.
  • Für diese Untersuchung wurden männliche Lewis-Ratten mit einem Körpergewicht zwischen 100 und 150 g verwendet. Vor Beginn der Untersuchung wurden die Tiere für einen Zeitraum von zumindest 5 Tagen akklimatisiert. Die Tiere ließ man 18 Stunden vor der Untersuchung unter Wassergabe ad libitum fasten.
  • Während der gesamten Untersuchung erlaubte man den Tieren freien Zugang zu Trinkwasser, mit Ausnahme der Beobachtungsperioden.
  • Es wurden Gruppen von fünf Tieren beliebig zusammengestellt (Sham, Kontrolle und Triflusal). Die Dauer der Untersuchung betrug 28 Tage. Die Arthritis wurde am Tag 1 der Untersuchung durch subplantare Verabreichung von 0,1 ml einer Emulsion, gebildet aus 10 mg M. butyricum und 10 ml Freund's inkompletten Adjuvans (Difco) an die rechte Hinterpfote der Tiere aus den Kontroll- und Triflusal-Gruppen verabreicht. Die Sham-Tiere erhielten 0,1 ml Freund's inkomplettes Adjuvans. Triflusal wurde täglich ab Tag 1 der Untersuchung in einer Dosis von 10 mg/kg p.o. in Tween 80 (1%) verabreicht. Am Tag 28 der Arthritisentwicklung wurde das Volumen der kontralateralen Pfote zu derjenigen, die die Adjuvansinjektion erhalten hatte, unter Verwendung eines UGO BASILE 7150-Plethysmometers bestimmt. Die Inhibierung der Volumenzunahme wurde wie folgt berechnet: Inh. = 100 – ((T – S)/(C – s))*100worin: T = Triflusal-Gruppe; C = Kontrollgruppe; und S = Sham-Gruppe
  • B. ERGEBNISSE
  • Die orale Verabreichung von Triflusal während 28 Tagen in einer Dosis von 10 mg/kg erzeugte eine 63,1 ± 8,0% Inhibierung der Volumenzunahme immunologischen Ursprungs induziert durch M. butyricum und Adjuvans bei Kontrolltieren.
  • Beispiel 13
  • Untersuchung der Lebensfähigkeit verschiedener Zelllinien nach HTB-Verabreichung
  • A. ALLGEMEINE METHODE
  • Verschiedene von der American Type Culture Collection (ATCC) erhaltene Zelllinien wurden bei 37°C unter einer 5% CO2-Atmosphäre kultiviert. Jede Zelllinie ließ man in einem geeigneten Kulturmedium und innerhalb der exponentiellen Phase (Tabelle I) wachsen.
  • Tabelle I
    Figure 00260001
  • Für die Untersuchungen der Zellenlebensfähigkeit wurden 24-Tüpfelplatten verwendet, wo 0,5 × 106 Zellen/ml (während 24-stündiger Untersuchungen), 0,25 × 106 Zellen/ml (während 48-stündiger Untersuchungen) bzw. 0,125 × 106 Zellen/ml (während 72-stündiger Untersuchungen) inkubiert wurden. Als nächstes wurden verschiedene Konzentrationen an HTB (1–3 mM) zugesetzt und die Zellen wurden verschiedene Zeitperioden inkubiert (37 °C, 5% CO2). Nach der Inkubation wurden die Überstände aus jedem Tüpfel extrahiert und die Zellen wurden mit dem Kulturmedium ohne fötalem Kälberserum gewaschen. Hiernach wurde der Überstand extrahiert und 200 μl Kulturmedium ohne fötales Kälberserum wurde zu jedem Tüpfel zugesetzt. Zusätzlich wurden 20 μl Substrat zugesetzt, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Diese Methode basiert auf der Befähigung lebensfähiger Zellen, das farblose Substrat in eine gefärbte Substanz umzuwandeln, die durch Exkretion in den Überstand gelangt (EZ4U, Biomedica GmbH). Nach Inkubation der Zellen während 1 Stunde bei 37°C und 5% CO2 wurden 200 μl Überstand gesammelt und das Absorptionsmaß wurde bei 450 nm gemessen. Das Absorptionsmaß wurde auch bei 620 nm als Maß für den existierenden nicht-spezifischen Wert bestimmt.
  • B. ERGEBNISSE
  • Die Ergebnisse der Zelllebensfähigkeitsbestimmungen finden sich in Tabelle II. Die Inkubation mit HTB führt zu dem Zelltod der verschiedenen untersuchten Tumorzelllinien. Dieser Zelltod ist konzentrations- und zeitabhängig.
  • Tabelle II Prozentuale Lebensfähigkeit der Zellen
    Figure 00280001
  • Die Ergebnisse aus den in den Beispielen 1, 2 und 3 beschriebenen Assays zeigen, dass Triflusal und HTB die Aktivierung des Transkriptionsfaktor NF-κB inhibieren. Sie zeigen auch, dass diese Inhibierung unabhängig ist von dem Induktionsmittel und dem Zelltyp. Diese Ergebnisse zeigen die Verwertbarkeit von Triflusal und HTB bei der Behandlung oder Prävention von solchen Störungen, bei denen NF-κB eine Rolle spielt.
  • Die Ergebnisse aus Beispiel 4 zeigen, dass Triflusal und HTB die VCAM-1-Expression inhibieren. Es wurde beschrieben, dass das VCAM-1-Gen NF-κB-Bindestellen besitzt (C. Weber et al., Arterioscler. Thromb., 1994, 14(10), 1665–1673). Es wurde auch gezeigt, dass Adhäsionsmoleküle wie VCAM-1 bei Störungen wie der Atherosklerose (K. D. O'Brien et al., J. Clin. Invest., 1993, 92, 945–951), rheumatoide Arthritis, Lupus, Multiple Sklerose, inflammtorische Darmerkrankung, Asthma, allergische Rhinitis und Tumormetastasierung eine Rolle spielen. Durch Inhibierung der NF-κB-Aktivierung und VCAM-1-Expression können sowohl Triflusal als auch HTB von besonderer Nützlichkeit bei der Behandlung oder Prävention von VCAM-1-bedingten Störungen wie all den vorstehend erwähnten und speziell Atherosklerose sein.
  • In Beispiel 5 wird gezeigt, dass Triflusal und HTB auch die iNOS-Expression inhibieren, die im transkriptionalen Bereich, zumindest teilweise, durch NF-κB reguliert wird (U. Förstermann et al., Biochem. Pharmacol., 1995, 50(9), 1321–1332). Es wurde auch gezeigt, dass iNOS bei pathologischen Befunden wie Inflammation, septischer Schock, inflammatorische Darmerkrankung und neurodegenerative Erkrankungen wie Demenz und Parkinson-Erkrankung eine Rolle spielen (J. E. Ogden und P. K. Moore, Trends Biotechnol., 1995, 13(2), 70–78). Durch Inhibierung der NF-κB-Aktivierung und iNOS-Expression können Triflusal und HTB von spezieller Nützlichkeit bei der Behandlung oder Prävention von iNOS-bedingten Störungen und insbesondere Inflammation, septischen Schock, inflammatorischer Darmerkrankung und neurodegenerativen Erkrankungen wie Demenz und Parkinson-Erkrankung sein.
  • Die Ergebnisse der Beispiele 6 und 7 zeigen, dass Triflusal und HTB die COX-2-Expression sowohl in vivo als auch in vivo inhibieren. Es wurde beschrieben, dass das COX-2-codierende Gen NF-κB-Bindestellen aufweist (S. B. Appleby et al., Biochem., J., 1994, 302, 723–727). COX-2 wurde mit pathologischen Befunden in Verbindung gebracht wie rheumatoide Arthritis und andere arthritische Zustände, Arthrose, vorzeitige Wehen, Demenz, insbesondere Alzheimer-Erkrankung (T. A. Sandson und 0. Felician, Exp. Opin. Invest. Drugs, 1998, 7(4), 519–526) und Krebs (M. Oshima et al., Cell, 1996, 87(5), 803-809; K. Subbaramaiah et al., Cancer Res., 1996, 56(19), 4424–4429). Durch Inhibierung der NF-κB-Aktivierung und COX-2-Expression können Triflusal und HTB von besonderer Nützlichkeit bei der Behandlung oder Prävention von COX-2-bedingten Störungen und insbesondere rheumatoider Arthritis und anderen arthritischen Zuständen, Arthrose, vorzeitigen Wehen, Demenz und Krebs sein.
  • Die Ergebnisse von Beispiel 8 zeigen, dass HTB auch die MCP-1-Expression inhibiert, die im transkriptionalen Bereich, zumindest teilweise, durch NF-κB reguliert wird (T. Martin et al., Eur. J. Immunol., 1997, 27(5), 1091–1097). Es wurde beschrieben, dass eine exzessive oder nicht-regulierte MCP-1-Produktion bei Störungen wie Glomerulonephritis (B. H. Rovin et al., Lab. Invest., 1994, 71(4), 536–542), rheumatoide Arthritis (P. M. Villiger et al., J. Immunol., 1992, 149(2), 722–727), pulmonale Fibrose (H. N. Antoniades et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89(12), 5371–5375), Restenose, Asthma, Psoriasis, inflammatorische Darmerkrankung, Multiple Sklerose und Transplantatabstoßung eine Rolle spielt, und der einflussreichste chemotaktische Faktor ist der in Makrophagen-reichen atherosklerotischen Plättchen nachgewiesen wurde (S. Yla-Herttuala et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88(12), 5252–5256). Durch Inhibierung der NF-κB-Aktivierung und MCP-1-Expression können Triflusal und HTB von besonderer Nützlichkeit bei der Behandlung oder Prävention von MCP-1-bedingten Störungen wie den vorstehend erwähnten sein.
  • Die Ergebnisse von Beispiel 9 zeigen, dass Triflusal und HTB auch die Expression von TNF-α inhibieren, die zumindest teilweise im transkriptionalen Bereich durch NF-κB reguliert wird (J. Yao et al., J. Biol. Chem., 1997, 272(28), 17795–17801). Es wurde beschrieben, dass eine exzessive oder nicht-regulierte TNF-α-Produktion bei einem breiten Bereich von Störungen eine Rolle spielt, wie rheumatoide Arthritis, rheumatoide Spondylitis, gichtige Arthritis und andere arthritische Zustände, Arthrose, Sepsis, septischer Schock, endotoxischer Schock, toxisches Schocksyndrom, respiratorisches Distresssyndrom beim Erwachsenen, cerebrale Malaria, chronische pulmonale inflammatorische Erkrankung, Silikose, pulmonale Sarkoidose, pulmonale Fibrose, Heptatis, Osteoporose und andere Knochenresorptionsstörungen, Reperfusionsschädigungen, Transplantatabstoßung, Multiple Sklerose, Lupus, Fieber und Myalgien auf Grund von Infektionen, Kachexie, acquired immune deficiency syndrome (AIDS), inflammatorische Darmerkrankung und Pyresis (L. Sekut und K. M. Connolly, Drug News Perspect., 1996, 9(5), 261–269). Durch Inhibierung der NF-κB-Aktivierung und TNF-α-Expression können Triflusal und HTB von besonderer Nützlichkeit bei der Behandlung oder Prävention von TNF-α-bedingten Störungen wie den vorstehend erwähnten sein.
  • Die Ergebnisse der Beispiele 11, 12 und 13 zeigen weiterhin die Nützlichkeit von Triflusal und HTB bei der Behandlung oder Prävention von neurodegenerativen Erkrankungen, Arthritis bzw. Krebs.
  • Die Konzentrationen bei denen in den in den Beispielen 1 bis 13 beschriebenen Versuchen Effekte beobachtet werden, werden bei therapeutischen Dosen von Triflusal erreicht, die üblicherweise beim Menschen bei oraler Verabreichung verwendet werden.
  • Ohne an das was vorliegend festgestellt wird gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass die Inhibierung der Expression von Proteinen wie VCAM-1, iNOS, COX-2, MCP-1 und TNF-α durch Triflusal und HTB zumindest teilweise durch eine Inhibierung der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB bedingt ist. Dennoch ist bekannt, dass die Expression von Genen, die diese Proteine codieren, durch andere Agenzien aktiviert werden kann. Da wir gezeigt haben, dass Triflusal und HTB die Expression dieser Gene (sowohl in vivo als auch in vivo im Fall von COX-2) inhibieren, können beide Produkte auch bei der Behandlung oder Prävention von Störungen wertvoll sein, wo eine erhöhte Expression dieser Gene die von NF-κB unabhängig ist, vorliegt.

Claims (11)

  1. Verwendung einer Verbindung der Formel I
    Figure 00320001
    worin R Wasserstoff oder COCH3 bedeutet, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder eines Prodrugs hiervon, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Prävention von immunoinflammatorischen oder Autoimmunerkrankungen.
  2. Verwendung gemäß Anspruch 1, bei der die immunoinflammatorische oder Autoimmunerkrankung eine Erkrankung ist, ausgewählt unter rheumatoider Arthritis und anderen arthritischen Zuständen, multipler Sklerose, Psoriasis, entzündlichen Darmerkrankungen, Lupus und Glomerulonephritis.
  3. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in Anspruch 1 definiert, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder eines Prodrugs hiervon zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Prävention von Arthrose.
  4. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in Anspruch 1 definiert, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder eines Prodrugs hiervon zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Prävention von Krebs.
  5. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in Anspruch 1 definiert, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder eines Prodrugs hiervon zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Prävention von Entzündungen.
  6. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in Anspruch 1 definiert, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder eines Prodrugs hiervon zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Prävention von Asthma oder von adultem respiratorischem Distress-Syndrom.
  7. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in Anspruch 1 definiert, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder eines Prodrugs hiervon zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Prävention des septischen Schocks.
  8. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in Anspruch 1 definiert, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder eines Prodrugs hiervon zur Herstellung eines Arzneimittels für die Prävention von vorzeitigen Wehen.
  9. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in Anspruch 1 definiert, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder eines Prodrugs hiervon zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Prävention von Osteoporose.
  10. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in Anspruch 1 definiert, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder eines Prodrugs hiervon zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Prävention von viralen Infektionen.
  11. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in Anspruch 1 definiert, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder eines Prodrugs hiervon zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Prävention von Transplantatrejektionen.
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