ES2204129T3 - Uso de derivados del acido 2-hidroxi-4-trifluorometilbenzoico como inhibidores de la activacion del factor de transcripcion nuclear nf- (k)b. - Google Patents
Uso de derivados del acido 2-hidroxi-4-trifluorometilbenzoico como inhibidores de la activacion del factor de transcripcion nuclear nf- (k)b.Info
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Abstract
La invención se refiere al uso de derivados del ácido 2-hidroxi-4-trifluorometilbenzoico para inhibir la activación del factor de transcripción NF-kappaB. La invención se refiere también a la utilización de derivados del ácido 2-hidroxi-4-trifluorometilbenzoico para la preparación de medicamentos para el tratamiento o prevención de patologías asociadas a la activación del NF-kappaB y/o la expresión de genes dependientes o regulados, al menos en parte, a través del NF-kappaB en mamíferos, incluido el hombre.
Description
Uso de derivados del ácido
2-hidroxi-4-trifluorometilbenzoico.
La presente invención se refiere al uso de
derivados del ácido
2-hidroxi-4-trifluorometilbenzoico
para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de las
enfermedades reivindicadas.
El control de la expresión de proteínas juega un
papel clave tanto en el mantenimiento del normal funcionamiento de
las células y por extensión de los organismos, como en el desarrollo
de procesos patológicos. Este control se realiza a través de los
llamados factores de transcripción. Uno de estos factores es el
conjunto de proteínas conocido como el factor de transcripción
nuclear NF-\kappaB, formado por una familia de
complejos diméricos íntimamente relacionados. El
NF-\kappaB existe en forma inactiva en el
citoplasma de muchos tipos de células. En respuesta a un estímulo,
se activa y se transloca al núcleo, donde se une al ADN y regula la
transcripción de diferentes genes. La activación del
NF-\kappaB puede ser inducida por diferentes
agentes como citocinas inflamatorias (por ejemplo, el factor de
necrosis tumoral-alfa (TNF-\alpha)
y la interleucina-1beta
(IL-1\beta)), mitógenos, lipopolisacáridos
bacterianos (LPS), virus, agentes oxidantes (por ejemplo,
H_{2}O_{2} y ozono), ésteres de forbol y luz ultravioleta.
Entre los diferentes genes cuya expresión se halla regulada a través
del NF-\kappaB se encuentran muchos genes
implicados en la respuesta inmune e inflamatoria. Así, entre otros,
el NF-\kappaB regula la expresión de citocinas
proinflamatorias como IL-1\beta,
interleucina-2 (IL-2),
interleucina-6 (IL-6),
TNF-\alpha y factor estimulante de la formación
de colonias de granulocitos y macrófagos
(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,
GM-CSF); quimiocinas como
interleucina-8 (IL-8), RANTES,
proteína inflamatoria de los macrófagos-1\alpha
(macrophage inflammatory protein-1\alpha,
MIP-1\alpha), proteína quimiotáctica de los
monocitos-1 (monocyte chemotactic
protein-1, MCP-1) y eotaxina;
enzimas inflamatorios como la óxido nítrico sintasa inducible
(iNOS), ciclooxigenasa-2 (COX-2),
5-lipoxigenasa (5-LO) y fosfolipasa
A_{2} citosólica (cPLA_{2}); moléculas de adhesión como la
molécula de adhesión intercelular-1 (intercellular
adhesion molecule-1, ICAM-1), la
molécula de adhesión vascular-1 (vascular cell
adhesion molecule-1, VCAM-1) y
E-selectina; y receptores como el receptor de la
interleucina-2 y el receptor de células T (P.J.
Barnes y I.M. Adcock, Trends Pharmacol. Sci. 1997, 18,
46-50).
Se ha asociado disfunciones en la activación del
NF-\kappaB y sus genes dependientes con diversas
patologías como inflamación aguda, shock séptico, rechazo de
trasplantes, daño por radiación, daño por isquemia y reperfusión y
enfermedades neurodegenerativas (P.A. Baeuerle y T. Henkel, Annu.
Rev. Immunol. 1994, 12, 141-179), asma y otras
enfermedades inflamatorias crónicas (P.J. Barnes y I.M. Adcock,
Trends Pharmacol. Sci. 1997, 18, 46-50),
osteoporosis (Y. Abu-Amer y M. Mehrad Tondravi,
Nature Med. 1997, 3(11), 1189-1190), y
cáncer (M.A. Sovak y cols., J. Clin. Invest. 1997, 100 (12),
2952-2960). Asimismo, se han detectado niveles
elevados de NF-\kappaB en tejido sinovial de
pacientes con artritis reumatoide (H. Asahara y cols., Biochem.
Mol. Biol. Int., 1995, 37(5), 827-32),
en muestras de sistema nervioso central de enfermos de esclerosis
múltiple (D. Gveric y cols., J. Neuropathol. Exp. Neurol.
1998, 57(2), 168-78) y en muestras de tejido
aterosclerótico (K. Brand y cols., J. Clin. Invest. 1996,
97(7), 1715-22), y se ha visto que el
péptido amiloide \beta, que se deposita en placas de enfermos de
Alzheimer, activa el NF-\kappaB en células del
sistema nervioso central (C. Behl y cols., Cell 1994, 77,
817-827). También se ha observado un gran incremento
de la translocación nuclear de NF-\kappaB en
neuronas dopaminérgicas de enfermos de Parkinson (S. Hunot y cols.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94(14),
7531-7536). Igualmente, se ha descrito que el
NF-\kappaB interviene en la activación
transcripcional de virus como el virus de la inmunodeficiencia
humana (VIH), citomegalovirus, adenovirus y herpesvirus.
Por otro lado, se ha demostrado que las
citocinas, enzimas inflamatorios, moléculas de adhesion y otras
proteínas cuya expresión se halla regulada por el
NF-\kappaB juegan un papel importante en un amplio
abanico de patologías como inflamación; asma; síndrome del distrés
respiratorio del adulto (adult respiratory distress syndrome,
ARDS); enfermedades inmunoinflamatorias y autoinmunes como artritis
reumatoidea, esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedad
inflamatoria intestinal, lupus y glomerulonefritis; artrosis; shock
séptico; aterosclerosis; cáncer; osteoporosis; parto prematuro;
rechazo de trasplantes; enfermedades neurodegenerativas como la
demencia, incluido la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de
Parkinson y la esclerosis lateral amiotrófica; e infecciones
víricas.
A la vista de lo anterior, los agentes que sean
capaces de modular la actividad del factor de transcripción
NF-\kappaB y/o la expresión de genes dependientes
de este factor de transcripción podrían ser de gran utilidad como
agentes terapéuticos para el tratamiento o prevención de las
patologías anteriormente citadas. Es por ello que es de gran interés
encontrar agentes que sean capaces de regular la actividad del
NF-\kappaB.
El ácido
2-acetiloxi-4-trifluorometilbenzoico,
más conocido por su Denominación Común Internacional (DCI)
triflusal, es un inhibidor de la agregación plaquetaria
comercializado para el tratamiento de enfermedades tromboembólicas
bajo la marca Disgren®. Su principal metabolito, el ácido
2-hidroxi-4-trifluorometilbenzoico
(conocido también por las siglas HTB), posee también una notable
actividad como antiagregante plaquetario. Ambos compuestos se hallan
descritos en la patente US 4,096,252.
Los presentes inventores han encontrado que,
sorprendentemente, tanto el triflusal como su metabolito, el HTB,
inhiben la activación del NF-\kappaB. Asimismo, se
ha encontrado que ambos compuestos son potentes inhibidores de la
expresión de genes regulados transcripcionalmente por el
NF-\kappaB. Debido a esta nueva actividad ahora
descubierta, el triflusal y el HTB son potencialmente útiles en el
tratamiento o prevención de patologías en las que la activación del
NF-\kappaB y sus genes dependientes se halla
implicada, como las anteriormente citadas.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que el triflusal y su metabolito, el HTB, son
potentes inhibidores de la activación del factor de transcripción
NF-\kappaB. Como se ha mencionado anteriormente,
el NF-\kappaB es un factor de transcripción
ubicuo que actúa uniéndose al ADN, activando de este modo la
expresión de diferentes genes, muchos de ellos relacionados con la
respuesta inmune e inflamatoria. La presente invención demuestra que
el triflusal y el HTB inhiben la activación del
NF-\kappaB inducida por diferentes agentes como
TNF-\alpha, inmunocomplejos y LPS en diferentes
tipos de células, como células endoteliales de vena de cordón
umbilical humano (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC),
macrófagos y monocitos. Asimismo, se demuestra también que el
triflusal y el HTB inhiben la expresión de diversas proteinas en
cuya regulación transcripcional interviene el
NF-\kappaB, como por ejemplo
VCAM-1, iNOS, COX-2,
MCP-1 y TNF-\alpha. Por ello, el
triflusal y el HTB son útiles como agentes terapéuticos o
preventivos en aquellas situaciones patológicas en las que
participa el NF-\kappaB y/o las proteinas cuya
expresión se halla regulada por este factor de transcripción.
El triflusal y el HTB se pueden representar de
una forma genérica mediante la fórmula I:
donde R representa hidrógeno (HTB) o COCH_{3}
(triflusal).
Es objeto de la presente invención el uso de un
compuesto de fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable o un
profármaco del mismo para la manufactura de un medicamento para el
tratamiento o prevención de patologías asociadas con la activación
del factor de transcripción NF-\kappaB y/o la
expresión de genes dependientes de este factor de transcripción.
La presente invención proporciona el uso de un
compuesto de fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable o
profármaco del mismo para la manufactura de un medicamento para el
tratamiento o prevención de enfermedades inmunoinflamatorias y
autoinmunes como artritis reumatoidea y otras enfermedades de tipo
artrítico, esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedad inflamatoria
intestinal, lupus y glomerulonefritis; artrosis; cáncer;
inflamación; asma o síndrome del distrés respiratorio del adulto;
shock séptico; osteoporosis; parto prematuro; infecciones víricas y
rechazo de trasplantes.
Las sales farmacéuticamente aceptables de un
compuesto de fórmula I incluyen cualquiera de las sales utilizadas
habitualmente en química farmacéutica, como por ejemplo las sales
con cationes inorgánicos como sodio, potasio, calcio, magnesio,
litio, aluminio, zinc, etc. así como las sales formadas con amoníaco
y otras aminas farmacéuticamente aceptables.
A lo largo de la presente descripción, se
entiende por profármaco de un compuesto de fórmula I cualquier
compuesto precursor de un compuesto de fórmula I que es capaz de
metabolizarse y liberar in vivo un compuesto de fórmula I,
es decir el triflusal o el HTB.
Por NF-\kappaB se entiende
cualquier miembro de la familia de proteínas conocidas por este
nombre.
Por gen dependiente y/o regulado, al menos en
parte, a través del factor de transcripción
NF-\kappaB se entiende cualquier gen que posea en
su región promotora uno o más puntos de unión con el
NF-\kappaB. La lista de genes regulados por el
NF-\kappaB mencionada anteriormente en el apartado
"Descripción del Estado de la técnica" se cita solamente a
modo de ejemplo.
Por patología asociada a la activación del factor
de transcripción NF-\kappaB y/o la expresión de
genes dependientes de este factor de transcripción se entiende
cualquier enfermedad o estado patológico donde intervenga, al menos
en parte, la activación del NF-\kappaB y/o las
proteinas cuya expresión (es decir la expresión del gen que las
codifica) se halla regulada por este factor de transcripción.
El término enfermedad inflamatoria intestinal
incluye tanto colitis ulcerosa como la enfermedad de Crohn así como
cualquier otro tipo de variante de enfermedad inflamatoria
intestinal.
El término rechazo de trasplantes se refiere
tanto al rechazo de trasplantes de tejidos, como por ejemplo la
enfermedad de injerto contra huésped, como de órganos.
Procedimientos para preparar el triflusal o el
HTB se hallan descritos en la patente americana antes citada (US
4,096,252).
Como se ha dicho anteriormente, los compuestos de
fórmula I inhiben la activación del factor de transcripción
NF-\kappaB y por tanto pueden utilizarse para
inhibir dicha activación en mamíferos, preferiblemente en seres
humanos. La dosis de un compuesto de fórmula I necesaria para
modular la activación del factor de transcripción
NF-\kappaB por las enfermedades reivindicadas
dependerá de la patología tratada, de la gravedad de los síntomas,
de la edad y peso corporal del paciente así como de la vía de
administración elegida. Cualquier entendido en la materia podrá
fácilmente determinar las dosis adecuadas en función de estos
factores sin tener que recurrir a una excesiva experimentación. En
terapia humana, generalmente las dosis estarán comprendidas entre
aproximadamente 30 mg y aproximadamente 3000 mg al día de un
compuesto de fórmula I, que podrán ser administrados en una o varias
unidades de dosis. Dependiendo de la patología concreta a tratar y
de la situación del paciente, sin embargo, podrían ser necesarias
dosis fuera de este rango, que como ya se ha mencionado antes podrán
ser determinadas por un entendido en la materia sin necesidad de
excesiva experimentación.
Los compuestos de fórmula I pueden ser
administrados en forma de cualquier formulación farmacéutica, la
naturaleza de la cual, como es bien sabido, dependerá de la vía de
administración y de la naturaleza de la patología a tratar. Estas
composiciones farmacéuticas se pueden preparar por técnicas
convencionales, empleando excipientes o vehículos compatibles y
farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de estas composiciones
incluyen cápsulas, comprimidos, jarabes, polvos y granulados para la
formación de soluciones extemporáneas, preparaciones inyectables,
etc. Una vía preferida de administración de los compuestos de
fórmula I es por vía oral. Por ejemplo, pueden administrarse en
forma de cápsulas de gelatina dura que contengan por ejemplo 50,
100, 200, 300, 400 ó 500 mg de un compuesto de fórmula I o una sal
farmacéuticamente aceptable o profármaco del mismo.
La Figura 1 ilustra el efecto inhibidor del
triflusal y HTB sobre la activación del factor de transcripción
NF-\kappaB inducida por
TNF-\alpha en cultivos de células endoteliales de
vena de cordón umbilical humano (HUVEC).
La Figura 2 ilustra el efecto inhibidor del
triflusal y HTB sobre la activación del factor de transcripción
NF-\kappaB inducida por inmunocomplejos (IC) en
macrófagos de rata.
La Figura 3 (A y B) ilustra el efecto inhibidor
del HTB sobre la activación del factor de transcripción
NF-\kappaB inducida por lipopolisacárido
bacteriano (LPS) en células mononucleares de sangre periférica
humana.
La Figura 4 ilustra el efecto inhibidor del
triflusal y HTB sobre la expresión del ARNm de
VCAM-1 inducida por TNF-\alpha en
HUVEC.
La Figura 5 ilustra el efecto inhibidor del HTB
(5A) y triflusal (5B) sobre la producción de nitrito inducida por
inmunocomplejos en macrófagos de rata.
La Figura 6 ilustra el efecto del triflusal y HTB
sobre la COX-2 inducida por LPS en células
mononucleares humanas: (6A) efecto inhibidor del triflusal sobre la
expresión de COX-2; (6B) efecto inhibidor del HTB
sobre la expresión de COX-2; (6C) inhibición de la
producción de prostaglandina E_{2} (PGE_{2}) producida por
triflusal; (6D) inhibición de la producción de PGE_{2} producida
por HTB.
La Figura 7 ilustra el efecto inhibidor del
triflusal administrado por vía oral sobre la expresión de
COX-2 (7A) y la producción de PGE_{2} (7B) en un
modelo de inflamación inducido por carragenina en rata.
La Figura 8 ilustra el efecto inhibidor del HTB
sobre la expresión de MCP-1 inducida por
inmunocomplejos (IC) en la línea monocítica humana
THP-1.
La Figura 9 ilustra el efecto inhibidor del
triflusal y HTB sobre la expresión de TNF-\alpha
inducida por lipopolisacárido bacteriano (LPS) en células
mononucleares de sangre periférica humana.
\newpage
Los siguientes ejemplos ilustran la utilidad del
triflusal y el HTB como inhibidores de la activación del
NF-\kappaB y sus genes dependientes. Las
siguientes abreviaturas se han utilizado en los ejemplos:
EDTA: | ácido etilendiamintetraacético |
DTT: | 1,4-ditiotreitol |
pb: | pares de bases |
PBS: | tampón fosfato salino (phosphate-buffered saline) |
RT-PCR: | reacción de cadena de la polimerasa transcriptasa inversa |
(reverse transcriptase polymerase chain reaction) | |
dNTP: | desoxirribonucleósidos trifosfato |
ADN: | ácido desoxirribonucleico |
ARN: | ácido ribonucleico |
MTT: | azul de tiazolio |
TBS: | tampón Tris salino (Tris-buffered saline) |
ATP: | adenosil trifosfato |
DMSO: | dimetilsulfóxido |
SFB: | suero fetal bovino |
Las células endoteliales de vena de cordón
umbilical humano (HUVEC) fueron obtenidas por el procedimiento de
Dejana y cols. (J. Cell Biol 1987, 104(5),
1403-1411), mediante el tratamiento del cordón
umbilical con 0,2% de colagenasa P de C.histolyticum
(Boehringer Manheim GmbH, Manheim, Alemania) durante 20 minutos a
37ºC. Posteriormente, se cultivaron las células en el medio M199
(Flow Lab, Herts, U.K.) con 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de
estreptomicina, 2,5 \mug/ml de anfotericina B y 20% de suero fetal
bovino. El cultivo inicial fue realizado en frascos de 25 cm^{2}
de plástico. Después de 24 horas se lavaron las células para
extraer aquellas células no adheridas a la superficie del frasco. A
continuación se añadió el mismo medio de cultivo reconstituido con
10% de suero fetal bovino, 50 \mug/ml de factor suplementario de
crecimiento endotelial y 100 \mug/ml de heparina. Después de
5-7 días de cultivo, las células llegaron a la
confluencia y fueron despegadas de la superficie del frasco con
0,05% de tripsina y 0,02% de EDTA (Flow Lab). La reacción fue
inhibida con la adición de suero fetal bovino y posteriormente las
células se lavaron y resembraron en medio de cultivo. Las células
crecieron hasta la confluencia en frascos cubiertos con gelatina.
Las células usadas en los experimentos pertenecían a los estadios
2-7.
En este experimento, las células HUVEC fueron
preincubadas con Triflusal y HTB, a concentraciones en ambos casos
de 2 y 4 mM. Posteriormente estas células fueron estimuladas con 100
U/ml de TNF-\alpha (Genzyme Diagnostics,
Cambridge, MA USA) durante 90 minutos. A continuación, las células
HUVEC fueron lavadas en tampón de lisis hipotónico frío (10 mM
tampón HEPES-KOH, pH 7,9, 10 mM KCl, 1,5 mM
MgCl_{2}, 0,5 mM DTT (1,4-ditiotreitol), 0,5 mM
fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 5 \mug/ml aprotinina, 5 \mug/ml
leupeptina y 0,6% Nonidet P-40) y mantenidas en
hielo durante 10 minutos. Posteriormente, se aplicó una fuerte
agitación con vortex durante 10 segundos. Las células no lisadas se
eliminaron por centrifugación a 1000 x g durante 10 minutos. Los
núcleos se aislaron por centrifugación a 15000 x g durante 1 minuto
en una microcentrífuga. El pellet nuclear se resuspendió en
un tampón de extracción altamente salino (25% glicerol y 0,5 M KCl).
El extracto nuclear se obtuvo mediante una centrifugación durante 30
minutos a 105000 x g en una ultracentrífuga Optima Tl (Beckmann)
usando un rotor TLA 100.2. Un oligonucleótido de 22 pb de doble
cadena que contenía secuencias de NF-\kappaB fue
usado como sonda. Esta sonda fue marcada en su extremo terminal con
(\gamma-^{32}P)ATP mediante el enzima T4
polinucleótido quinasa y purificada por minicolumna de
cromatografía. La secuencia \kappaB utilizada fue,
5'-AGTTCAGGGGAATTTCCCAGGC-3' y su
complementario
5'-GCCTGGGAAATTCCCCTGAACT-3'. 10
\mug de la proteína nuclear purificada fueron incubados durante 20
minutos en hielo con la sonda marcada radiactivamente
(2-6 x 10^{4} cpm) en 25 \mul de tampón de
reacción compuesto por 2 \mug de
poli(dI-dC), 10 mM Tris HCl pH 7,5, 100 mM
NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 8% Ficoll y 4% glicerol. Los complejos
nucleoprotein- oligonucleótido fueron resueltos por electroforesis
en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante en tampón
Tris-borato/EDTA durante 3 horas a 175 V y a 4ºC. El
gel fue secado y autorradiografiado con una pantalla intensificadora
a -80ºC y de 2 a 12 horas. La especificidad del complejo
ADN(sonda)-proteína fue confirmada por la
competición de la sonda marcada con ^{32}P con un exceso 300 veces
superior de sonda no marcada, con lo cual no se observó presencia de
sonda marcada en el complejo ADN-proteína (datos no
mostrados). La muestra señalada como control corresponde a células
incubadas durante 90 minutos en ausencia de
TNF-\alpha.
Los resultados de este experimento se muestran en
la figura 1. Tanto triflusal como HTB inhiben de forma
concentración-dependiente la activación de
NF-\kappaB inducida por
TNF-\alpha en HUVEC.
Se extrajeron células de la cavidad peritoneal de
rata y se resuspendieron en medio de cultivo DMEM sin suero al que
se había añadido previamente 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml
de estreptomicina, 50 \mug/ml de gentamicina, 2 mM de glutamina y
0,5 mM de L-arginina. Las células se incubaron 2
horas en placas de cultivo a 37ºC y aquellas que no se adhirieron a
las placas se eliminaron mediante tres lavados consecutivos con el
mismo medio fresco. Más del 95% de las células adheridas a la placa
resultaron ser macrófagos, como se comprobó por su capacidad para
fagocitar partículas de zimosan y marcaje no específico de esterasa.
Los macrófagos se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera de 5% CO_{2}
y dos horas después se eliminaron las células en suspensión y los
macrófagos peritoneales adheridos a la placa se incubaron con 100
\mug/ml de Inmunocomplejos IgG/ovoalbúmina preparados a partir de
antisuero de conejo durante dos horas en presencia o ausencia
(vehículo) de triflusal o HTB (4 mM, ambos).
Una vez terminada la incubación los macrófagos se
lavaron dos veces con PBS y se determinó el grado de activación
(unión al ADN) del factor de transcripción
NF-\kappaB mediante la técnica de EMSA, descrita
detalladamente en el Ejemplo 1.
En la figura 2 se muestran los resultados
obtenidos con triflusal y HTB en este experimento. Se muestra un
ejemplo representativo de los obtenidos en dos experimentos
independientes. Tanto el triflusal como el HTB inhiben de forma
pronunciada la activación del NF-\kappaB inducida
por inmunocomplejos en macrófagos de rata.
Las células mononucleares (PBMC) fueron obtenidas
a partir de sangre de voluntarios sanos del Hospital de Sant Pau
(Barcelona) que no habían ingerido ningún tipo de fármaco
antinflamatorio durante un periodo no inferior a las dos semanas
previas a la extracción. Se partió de un volumen aproximado de 80 ml
de sangre humana heparinizada (10 U/ml) que se diluyó (1:1) con PBS
(pH 7,4; Dulbecco) sin calcio, ni magnesio ni bicarbonato
sódico.
En tubos Falcon de 50 ml se pipetearon 15 ml de
una solución de Ficoll (d = 1,077 a 20ºC; Biochrom KG). Sobre esta
solución se añadió cuidadosamente un volumen aproximado de 25 ml
por tubo de la sangre previamente diluida con PBS y se centrifugaron
a 1200 g durante 20 minutos. Las células mononucleares se concentran
en una interfase blanca entre el plasma y la solución de Ficoll. Se
extrajo esta interfase con una pipeta Pasteur y se diluyó 1:1 en
PBS. Se centrifugó a 300g durante 10 min. El precipitado resultante
se resuspendió en 50 ml de PBS y se volvió a centrifugar a 200 g
durante 10 min, con el fin de eliminar la contaminación por
plaquetas. Por último, el precipitado de esta centrifugación se
resuspendió en 20 ml de medio de cultivo RPMI 1640 (GibcoBRL) con
un 10% de suero fetal bovino.
Las PBMC aisladas se analizaron mediante una
tinción Wright-Giemsa estándar para comprobar que
mostraban una morfología de células mononucleares normales y
determinar los distintos tipos celulares aislados (una media de 90%
de linfocitos y 10% de monocitos). Previamente a los distintos
tratamientos se analizó la viabilidad celular mediante la prueba de
exclusión del azul Tripan. Las células se diluyeron a una
concentración de 2,5 millones/ml con medio RPMI al 10% de suero
fetal bovino y se incubaron (37ºC, 5% CO_{2}) 1 hora en placas de
6 pocillos (2 ml/pocillo, 5 millones de PBMC) sin añadir ningún
fármaco (control) o añadiendo HTB (1-3 mM). A
continuación las células se incubaron durante 10 minutos más en
presencia de 10 \mug/ml de lipopolisacárido de E.coli
(LPS, serotipo 026:B6; Sigma). Una vez terminada la incubación, se
tomó una muestra (100 \mul) para efectuar un recuento celular y
controles de viabilidad mediante la capacidad de conversión de la
sal soluble de tetrazolio, MTT, en el producto insoluble formazán
por las deshidrogenasas mitocondriales(test de MTT). Se
realizaron además incubaciones de las células con HTB (3 mM) pero
sin añadir LPS. En todos los casos la viabilidad fue igual o
superior al 95%.
Una vez terminada la incubación las PBMC se
lavaron dos veces con PBS y se determinó el grado de activación
(unión al ADN) del factor de transcripción
NF-\kappaB mediante la técnica de EMSA, descrita
detalladamente en el Ejemplo 1.
En la figura 3 se muestran los resultados
obtenidos con HTB en este experimento. Se muestra un ejemplo
representativo de los obtenidos en dos experimentos independientes.
El HTB inhibe de forma pronunciada la activación del
NF-\kappaB inducida por LPS en PBMC humanas.
Los cebadores (primers) utilizados para la
detección del ARNm de VCAM-1 por
RT-PCR fueron diseñados a partir de la secuencia del
gen humano (EMBL/GenBank AC: M30257), usando la versión 9.1 del
programa Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison,
Wisconsin. Fueron las secuencias
5'-TGTCACTGTAAGCTGCAAG-3' y
5'-TTCCAGCCTGGTTAATTC-3',
correspondientes a los nucleótidos 1090-1108 y
1589-1572 (L. Osborn y cols., Cell 1989,
59(6), 1203-1211). El ARN total de las
células cultivadas es extraido según el método de isotiocianato de
guanidinio (P. Chomczynski y N. Sacchi, Anal Biochem. 1987,
162(1), 156-159). La primera cadena de ADNc
es sintetizada a partir del ARN total mediante una reacción de
transcripción inversa. La reacción se realiza con 0,2 mg/ml de ARN
total (precalentado a 68ºC durante 10 minutos), 2,5 \mul H_{2}O,
20 U de inhibidor de ARNasa ribonucleica, 4 \mul de tampón 5X, 2
\mul de 0,1 M DTT, 4 \mul de dNTP 2,5 mM, 1 \mul de
hexanucleótidos 0,1 mM y 200 U de transcriptasa inversa del virus de
la leucemia murina de Moloney. La reacción se realiza a 37ºC,
durante 60 minutos y con un volumen de 20 \mul. El ADNc de
VCAM-1 se amplifica por PCR en una reacción
conteniendo 2 \mul de ADN, 10 \mul de H_{2}O, 2,5 \mul de
tampón 10X,0,75 \mul de MgCl_{2} 50 mM, 1,0 \mul de dNTP 2,5
mM, 1,25 \mul de cada uno de los cebadores (sentido y
antisentido) y 0,25 \mul de Taq ADN polimerasa 5 U/ml. El control
negativo se realiza con agua, incluyéndose en cada una de las
reacciones de PCR. Las condiciones de amplificación son las
siguientes: un ciclo inicial de desnaturalización a 94ºC durante 5
minutos, y a continuación 30 ciclos compuestos por:
desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, unión de los cebadores
(annealing) a 59ºC durante 30 segundos, y extensión a 72ºC
durante 1 minuto; finalmente se realizó un ciclo de extensión a 72ºC
durante 7 minutos. La cantidad relativa de cada ADNc amplificado se
determina por la densidad de las bandas teñidas con bromuro de
etidio y analizadas por el sistema de documentación Gel Doc y el
software Molecular Analyst de Bio-Rad Laboratories,
Hercules, CA. La expresión de \beta-actina se usa
como control para el ensayo de la expresión de un gen expresado
constitutivamente.
En concreto, se estudió el efecto de Triflusal (4
mM) y HTB (4 mM) en la regulación de la expresión del ARNm de la
molécula VCAM-1 inducida por
TNF-\alpha (100 U/ml) en HUVEC. Así, las células
fueron incubadas en presencia o ausencia de
TNF-\alpha y con Triflusal y HTB. Una hora
después, el ARN total fue extraido y sometido a la reacción de
transcripción inversa. Posteriormente, se realizó una reacción de
amplificación por PCR con los cebadores diseñados para las
secuencias de las moléculas VCAM-1 y
\beta-actina humana. Los productos de PCR fueron
separados por electroforesis en un gel de agarosa al 1,8% y
cuantificados posteriormente. El peso molecular de los productos de
amplificación fue determinado a partir de la migración
electroforética de los marcadores de ADN.
Los resultados obtenidos en este experimento se
muestran en la figura 4. Tanto triflusal como HTB a una
concentración 4 mM producen una inhibición completa de la expresión
del ARNm de VCAM-1 inducida por
TNF-\alpha en HUVEC. La falta de actividad sobre
la expresión del ARNm de \beta-actina evidencia la
selectividad de los compuestos ensayados por el factor de
transcripción NF-\kappaB.
Se obtuvieron células peritoneales de rata que se
resuspendieron en un medio de cultivo DMEM sin suero y suplementado
con antibióticos. Los macrófagos se aislaron por su capacidad para
adherirse a las placas de cultivo tras 2 horas de incubación a 37ºC.
Las células no adherentes se descartaron y se comprobó por su
capacidad para fagocitar partículas de zimosan y marcaje no
específico de esterasa que el 95% de las células adheridas eran
macrófagos. Las placas de cultivo se mantuvieron a 37ºC en una
atmósfera de 5% CO_{2}, y los macrófagos peritoneales adheridos a
la placa se incubaron con 100 \mug/ml de inmunocomplejos de
IgG/ovoalbumina en presencia o ausencia (Control) de triflusal o HTB
(0,1-20 mM, ambos). Los fármacos se añadieron 10
minutos antes de la adición de IgG/ovoalbúmina y la producción de
NO se determinó como el nitrito presente al cabo de 24 horas.
La expresión de iNOS se midió de forma indirecta
como producción de NO. El NO liberado por los cultivos de macrófagos
se determinó indirectamente mediante la acumulación de nitritos. A
un mililitro de cultivo celular (0,5 millones de células en medio
sin rojo fenol) se le añadió 100 \mul de una solución de 1 mM de
ácido sulfanílico y 100 mM HCl (concentración final). Tras incubar
la mezcla durante cinco minutos, se aspiró el medio y se centrifugó
en una microcentrífuga de eppendorf. Se añadieron 50 \mul de
naftilendiamina (1 mM en la mezcla) y después de 15 minutos de
incubación se midió la absorbancia de la muestra a 548 nm
comparándola con un patrón de NaNO_{2}. La producción de NO se
expresó como nmoles de NO_{2}^{-}/mg de proteína.
Los resultados obtenidos en este experimento se
muestran en la figura 5A para el HTB y en la figura 5B para el
triflusal. Los puntos representan la media \pm error estándar de
la media (EE) de 7 a 9 experimentos por duplicado. Las Cl_{50}
calculadas para el triflusal y el HTB a partir de las gráficas
correspondientes fueron 1,13 \pm 0,12 y 1,84 \pm 0,34 mM,
respectivamente.
Resultados similares se obtuvieron al incubar los
macrófagos con LPS en lugar de inmunocomplejos.
Las células mononucleares (PBMC) fueron obtenidas
a partir de sangre de voluntarios sanos del Hospital de Sant Pau
(Barcelona) que no habían ingerido ningún tipo de fármaco
antiinflamatorio durante un periodo no inferior a las dos semanas
previas a la extracción. Se partió de un volumen aproximado de 80 ml
de sangre humana heparinizada (10 U/ml) que se diluyó (1:1) con PBS
(pH 7,4; Dulbecco) sin calcio, ni magnesio ni bicarbonato
sódico.
En tubos Falcon de 50 ml se pipetearon 15 ml de
una solución de Ficoll (d = 1,077 a 20ºC; Biochrom KG). Sobre esta
solución se añadió cuidadosamente un volumen aproximado de 25 ml
por tubo de la sangre previamente diluida con PBS y se
centrifugaron a 1200 g durante 20 minutos. Las células mononucleares
se concentran en una interfase blanca entre el plasma y la solución
de Ficoll. Se extrajo esta interfase con una pipeta Pasteur y se
diluyó 1:1 en PBS. Se centrifugó a 300 g, 10 min. El precipitado
resultante se resuspendió en 50 ml de PBS y se volvió a centrifugar
a 200 g durante 10 min con el fin de eliminar la contaminación por
plaquetas. Por último, el precipitado de esta centrifugación se
resuspendió en 20 ml de medio de cultivo RPMI 1640 (GibcoBRL) con
un 10% de suero fetal bovino.
Las PBMC aisladas se analizaron mediante una
tinción Wright-Giemsa estándar para comprobar que
mostraban una morfología de células mononucleares normales y
determinar los distintos tipos celulares aislados (una media de 90%
de linfocitos y 10% de monocitos). Las células se diluyeron a una
concentración de 2,5 millones /ml con medio RPMI al 10% de suero
fetal bovino y se incubaron (37ºC, 5% CO_{2}) 19 horas en placas
de 6 pocillos (2 ml/pocillo, 5 millones de PBMC). Las incubaciones
se realizaron en presencia de 10 \mug/ml de lipopolisacárido de
E.coli (LPS, serotipo 026:B6; Sigma) sin añadir ningún
fármaco (control) o añadiendo además Triflusal o HTB
(0,1-5 mM). Previamente a la incubación se
realizaron pruebas de viabilidad celular mediante la prueba de
exclusión del azul Tripan. Una vez terminada la incubación, se tomó
una muestra (100 \mul) para efectuar un recuento celular y
controles de viabilidad mediante la capacidad de conversión de la
sal soluble de tetrazolio, MTT, en el producto insoluble formazán
por las deshidrogenasas mitocondriales (test de MTT). Se realizaron
además incubaciones de las células con HTB y Triflusal a iguales
concentraciones pero sin añadir LPS. En todos los casos la
viabilidad fue igual o superior al 95% tanto al principio del
experimento como al cabo de 19 horas de incubación.
Una vez terminada la incubación, las células se
centrifugaron 5 min a 1000g. Se recogió el sobrenadante y se guardó
a -70ºC para la posterior determinación de niveles de
prostaglandina E_{2} como índice de la actividad
COX-2, y el precipitado se resuspendió en 5 ml de
PBS y se volvió a centrifugar (5 min, 1000 g). El precipitado de
esta última centrifugación se resuspendió en 50 \mul de tampón de
lisis celular (PBS con 1% de Nonidet P-40 y 1 mM de
EDTA) y se incubó en hielo 15 minutos. La mezcla resultante se
centrifugó a 20000 g 15 min y se recuperó el sobrenadante, del cual
se extrajeron 5 \mul que se diluyeron 1/20 con PBS para la
determinación de la concentración de proteína, mediante el Reactivo
de Ensayo de Proteínas BCA (Pierce).
El sobrenadante restante fue entonces mezclado
1:1 con tampón de carga de electroforesis (Tris 50 mM; SDS 2% p/v;
glicerol 10% v/v; \beta-mercaptoetanol, 50
\mul/ml y azul de bromofenol, 2 mg/ml) y hervido durante 5 min.
Las muestras fueron centrifugadas a 10000g durante 2 min y
posteriormente sometidas a una electroforesis discontínua en un gel
SDS-Poliacrilamida (4% gel concentrador/7,5% gel
separador) a una intensidad variable y un voltaje fijo de 200 V,
hasta que el frente se acerca a unos milímetros del final del gel
(1 hora, aproximadamente).
Las proteínas se transfirieron a una membrana de
nitrocelulosa, mediante un sistema refrigerado TE 22 Mighty
Small Transfer Unit (Hoefer), a un voltaje de 100 V durante 2
horas. Una vez finalizada la transferencia, las membranas se
dejaron toda la noche en agitación a 4ºC en tampón de bloqueo (1:4
leche en polvo descremada en TBS con Tween 20 al 0,1%).
Las membranas bloqueadas se incubaron 1 hora en
agitación con un anticuerpo policlonal de cabra contra
COX-2 humana (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) y una
vez lavadas se incubaron 1 hora más con un segundo anticuerpo
marcado con peroxidasa de rábano (Rabbit Anti-goat
IgG-Horseradish Peroxidase, Immunopure, Pierce) y el
anticuerpo unido a la proteína se visualizó mediante
quimioluminiscencia (ECL, Amershan).
Posteriormente, los sobrenadantes de cada
experimento que se habían conservado a -70ºC se descongelaron y se
valoró la cantidad de PGE_{2} en solución utilizando kits de
ELISA específicos (Amershan-Biotrak RPN22).
En la figura 6 se muestran los resultados
obtenidos en este experimento.
Los resultados mostrados corresponden a dos
inmunoblots representativos de los obtenidos en cinco experimentos
independientes (Fig. 6A: triflusal; Fig. 6B: HTB) y a la media
\pm EE de la cuantificación de PGE_{2} en los sobrenadantes de
los cultivos correspondientes a dichos experimentos (Fig. 6C:
triflusal; Fig. 6D: HTB). Tanto el triflusal como el HTB inhiben de
forma concentración-dependiente la expresión de
COX-2 y la producción de PGE_{2}.
Para llevar a cabo este estudio se han utilizado
ratas Lewis (175-200 g). Las ratas se distribuyeron
al azar en grupos de 5 animales. A cada grupo se les produjo un
"saco de aire" ("air pouch") por la inyección subcutánea e
interescapular de 20 ml de aire estéril. Para mantener el saco de
aire, cada dos días se les inyectó 10 ml de aire adicional.
Transcurridos 7 días de la inyección inicial de aire, a cada grupo
se le administró en el saco de aire, 2 ml de una solución de
carragenina al 1% para producir una reacción inflamatoria. El
compuesto a ensayar se administra por vía oral 30 min. antes de la
administración de carragenina. Los animales se sacrificaron 6 horas
más tarde y se procedió a valorar el volumen de exudado. El tipo y
número de células presentes se determinó con una tinción estándar de
Wright-Giemsa y un contador de células Coulter
Counter, respectivamente. El exudado fue centrifugado a 400 x g a
4ºC durante 7 min y la concentración de PGE_{2} se determinó
mediante una técnica de inmunoensayo enzimático
(Amershan-Biotrak RPN222). El sedimento celular se
resuspendió en 2 ml de NaCl 0,85% frío. Para eliminar la
contaminación con glóbulos rojos las células fueron sometidas a una
lisis celular selectiva mediante la adición de 6 ml de agua fría
durante 20 segundos. Para restablecer la isotonía de la suspensión
celular se adicionaron 2 ml de NaCl 3,5%. Finalmente, la suspensión
celular se centrifugó en las mismas condiciones descritas
anteriormente y el sedimento se resuspendió en tampón de lisis a una
densidad de 2x10^{8} células para realizar los estudios de
inmunoblot (ver Ejemplo 6).
Los resultados se muestran en la figura 7. La
Fig. 7A corresponde a un inmunoblot representativo y la Fig. 7B
muestra la media \pm EE de la cuantificación de PGE_{2} en el
exudado de rata (n = 4). La administración oral de triflusal
(3-30 mg/kg) inhibe de forma
dosis-dependiente la expresión de la
COX-2 en las células presentes en el exudado y la
producción de PGE_{2}.
Las células de la línea monocítica humana
THP-1 (3x10^{6} células/pozo) se cultivaron en
placas de plástico con medio de cultivo RPMI 1640 al que se añadió
penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 \mug/ml), gentamicina
(50 \mug/ml), glutamina (2 mM) y un 2% de suero fetal bovino
inactivado por calor. Las células se cultivaron en presencia de HTB
(2 y 4 mM) o vehículo y se activaron con 100 \mug/ml de agregado
de inmunocomplejo (A-IgG). La aparición de
MCP-1 soluble se determinó mediante ELISA con un kit
comercial (R&D Systems Inc.; Minneapolis, MN). El límite de
detección del sistema fue de 5 pg/ml.
\newpage
Los resultados obtenidos en esta prueba se
muestran en la figura 8. El HTB, tanto a una concentración de 4 mM
como de 2 mM, produce una inhibición completa de la expresión de
MCP-1 inducida por inmunocomplejos en
THP-1.
Las células mononucleares (PBMC) fueron obtenidas
a partir de sangre de voluntarios sanos del Hospital de Sant Pau
(Barcelona) según el protocolo descrito en el ejemplo 3. Las
células se diluyeron a una concentración de 2 millones/ml con medio
RPMI al 10% de suero fetal bovino y se incubaron (37ºC, 5% CO_{2}
con triflusal, HTB o vehículo (DMSO) en presencia de 10 \mug/ml de
lipopolisacárido de E.coli (LPS, serotipo 026:B6; Sigma)
durante 19 horas. Seguidamente la suspensión celular se centrifugó a
2000 g durante 10 minutos a 4ºC, y el sobrenadante resultante se
almacenó a -70ºC para su posterior análisis. El contenido de
citocina se determinó mediante inmunoensayo enzimático, tras
dilución 1/100 de las muestras.
En la figura 9 se muestran los resultados
obtenidos con triflusal y HTB en este experimento. Tanto triflusal
como HTB (1 y 0,3 mM) producen una inhibición prácticamente
completa de la producción de TNF-\alpha inducida
por LPS. Los resultados se expresan como la media \pm error
estándar de la media de 2-5 experimentos
independientes, cada punto por triplicado.
El estudio se realizó en ratas postnatales (P9)
de la estirpe Long Evans black-hooded. Cada grupo
experimental lo constituyeron 6 animales que sufrieron una lesión
experimental, más dos animales controles de la misma edad. La lesión
experimental se realizó mediante la inyección intracortical (área
sensitomotora) de
N-metil-D-aspartato
(NMDA), lo que provoca una intensa degeneración neuronal local. El
triflusal (30 mg/kg) se administró por vía oral en tres dosis (desde
el día 7 al 9) cada 24 horas. La reactividad glial se indujo por la
inyección de NMDA al noveno día tras el nacimiento, una hora después
de la última dosis de triflusal. A distintos tiempos
(2-24h) tras esta última dosis, los animales se
sacrificaron, se extrajeron los cerebros y se cortaron mediante un
criostato y estas secciones se procesaron mediante técnicas
inmunocitoquímicas e histoquímicas para evaluar la activación de
NF-\kappaB en microglía y astroglía mediante
doble marcaje: NF-\kappaB-lectina
y NF-\kappaB-GFPA. Paralelamente
se realizaron cortes vibratómicos para determinar el grado de
reactividad microglial y astroglial mediante técnicas
histioenzimáticas (B. Castellano y cols., J. Histochem.
Cytochem., 1991, 39(5), 561-568).
En los animales control, las neuronas corticales,
pero no las células gliales, mostraron una activación constitutiva
de NF-\kappaB. Esta activación basal es inhibida
con el pretratamiento con triflusal. En aquellos animales a los que
se les practicó una lesión excitotóxica con NMDA se produjo una
rápida activación de NF-\kappaB en las células
gliales. El pretratamiento con triflusal a 30 mg/kg p.o. inhibe por
completo la activación de NF-\kappaB, tanto en
astroglía como en microglía.
Para realizar este estudio se ha utilizado un
modelo de isquemia neuronal in vitro, basado en cocultivos de
neuronas y células gliales. Se realizaron cultivos primarios de
astrocitos de tipo 1 obtenidos a partir de ratas Wistar recién
nacidas (1 día). Los astrocitos se sembraron en placas de 60 mm,
recubiertas con poli-D-lisina. Una
vez que estas células alcanzaron la confluencia (aproximadamente 11
días) se sembró sobre ellas neuronas primarias de rata y se dejaron
crecer durante 10 días. Además, se prepararon cultivos de cada uno
de los dos tipos celulares por separado.
A la mitad de los cultivos se los sometió a
cuatro horas de deprivación de glucosa y oxígeno (OGD), seguido por
un periodo de 24 horas de recuperación. Tanto las células sometidas
a OGD como las controles se trataron al inicio de la OGD con 0, 10 y
30 \mug/ml de triflusal en un grupo de experimentos y 0, 20 y 100
\mug/ml de HTB en otro. Al finalizar las 24 horas de recuperación,
se determinó la liberación al medio de lactato deshidrogenasa (LDH)
como medida de la muerte celular, así como el grado de apoptosis de
los cultivos (mediante la técnica de TUNEL) y el número total de
neuronas y astrocitos presentes en el cocultivo (mediante la tinción
de Hoescht).
En los cultivos sometidos a OGD se observó tanto
un fuerte incremento en la liberación de LDH como en el número de
neuronas apoptóticas, comparados con los controles. Las distintas
concentraciones de triflusal o HTB probadas en este estudio
inhibieron por completo ambos efectos. Por lo tanto, en este modelo
tanto triflusal como su metabolito HTB pueden prevenir la apoptosis
y degeneración neuronal provocada por la deprivación de oxígeno y
glucosa.
La artritis inducida por adyuvante se caracteriza
por el desarrollo, a partir del día 14 de la inyección del
adyuvante, de una inflamación crónica de origen inmunológico en
diversas articulaciones, con acumulación de células inflamatorias y
liberación de citocinas.
Para llevar a cabo este estudio se han utilizado
ratas Lewis macho, de peso comprendido entre 100 y 150 g. Antes de
iniciar el estudio se sometieron a un período de aclimatación de al
menos 5 días. Los animales se mantuvieron en ayunas durante las 18
horas previas a su utilización, con agua ad libitum.
Durante el tiempo que duró el estudio se permitió
el libre acceso de los animales al agua de bebida, excepto en los
períodos de observación.
Se randomizaron diferentes lotes de 5 animales
(Blanco, Control y Triflusal). La duración de este protocolo fue de
28 días. El día 1 del estudio se indujo la artritis por la
administración subplantar de 0,1 ml de una emulsión formada por 10
mg de M. butyricum y 10 ml de adyuvante de Freund incompleto
(Difco) en la pata derecha trasera de los animales en los lotes
Control y Triflusal. A los animales Blancos se les administró 0,1
ml de adyuvante de Freund incompleto. El triflusal se administró
diariamente desde el día 1 del estudio a una dosis de 10 mg/kg p.o.
en Tween 80 (1%). El día 28 del desarrollo de la artritis se valoró
el volumen de la pata contralateral a la de la inyección del
adyuvante de los animales con un pletismómetro UGO BASILE 7150. La
inhibición del incremento del volumen se calculó de la siguiente
forma:
% Inh. = 100 -
((T-B)/(C-B)) *
100
Donde: T = grupo Triflusal; C = grupo Control; y
B = grupo Blanco
La administración oral de triflusal durante 28
días a la dosis de 10 mg/kg inhibió un 63,1\pm8,0% el incremento
de volumen de origen inmunológico inducido por M. butyricum y
adyuvante en los animales controles.
Diferentes líneas celulares obtenidas de la
American Type Culture Collection (ATCC) fueron mantenidas en cultivo
a 37ºC y en una atmósfera al 5% de CO_{2}. Cada línea celular se
hizo crecer en un medio de cultivo adecuado y dentro de la fase
exponencial (Tabla I).
Línea celular | Medio crecimiento |
U-937 | RPMI 1640 + 10% SFB |
(linfoma histiocítico humano) | |
143.98.2 | DMEM + 10% SFB |
(osteosarcoma humano) | |
1321N1 | DMEM + 5% SFB + 0,5% Penicilina-Estreptomicina |
(astrocitoma humano) | |
Jurkat | RPMI 1640 + 10% SFB |
(leucemia aguda de células T humana) | |
COLO 205 | RPMI 1640 + 10% SFB |
(adenocarcinoma de colon humano) |
Para realizar los estudios de viabilidad celular
se utilizaron placas de 24 pozos donde se incubaron 0,5x106
células/ml (para estudios de 24 horas), 0,25x10^{6} células/ml
(para estudios de 48 horas) o 0,125x10^{6} células/ml (para
estudios de 72 horas). A continuación se añadió diferentes
concentraciones de HTB (1-3 mM) y se incubaron las
células durante diferentes periodos de tiempo (37ºC, 5% CO_{2}).
Una vez terminada la incubación, se extrajo el sobrenadante de cada
pocillo, y se lavaron las células con medio de cultivo sin suero
fetal bovino. Seguidamente, se extrajo el sobrenadante y se
añadieron 200 \mul de medio de cultivo sin suero fetal bovino en
cada pozo. También se adicionaron 20 \mul de substrato para medir
la viabilidad celular. Este método se basa en la capacidad que
poseen las células vivas para transformar el substrato incoloro en
una substancia coloreada excretada al sobrenadante (EZ4U, Biomedica
Gmbh.). Después de incubar las células durante 1 hora a 37ºC y 5%
CO_{2} , se recogieron 200 \mul de sobrenadante y se midió la
absorbancia a 450 nm. También se midió la absorbancia a 620 nm como
medida del valor inespecífico existente.
Los resultados de la medición de la viabilidad
celular se muestran en la Tabla II. La incubación con HTB lleva a la
muerte celular de las diferentes líneas tumorales ensayadas. Esta
muerte celular se produce de una forma concentración y tiempo
dependientes.
U-937 | 0 horas | 2 horas | 5 horas | 24 horas | 48 horas | 72 horas |
1 mM HTB | 100 | 100 | 98,8 | 74,4 | 39,6 | 4,8 |
3 mM HTB | 100 | 96,1 | 92,6 | 13,9 | 7,5 | N.D. |
JURKAT | 0 horas | 2 horas | 5 horas | 24 horas | 48 horas | 72 horas |
1 mM HTB | 100 | 100 | 76,8 | 11,3 | 3,6 | 1,6 |
3 mM HTB | 100 | 100 | 62,6 | 6,2 | 5,4 | N.D. |
1321N1 | 0 horas | 2 horas | 5 horas | 24 horas | 48 horas | 72 horas |
1 mM HTB | 100 | 99,7 | 94,2 | 87,5 | 67,6 | N.D. |
3 mM HTB | 100 | 85,3 | 67,2 | 62,2 | 17,8 | N.D. |
COLO 205 | 0 horas | 2 horas | 5 horas | 24 horas | 48 horas | 72 horas |
1 mM HTB | 100 | 100 | 87,2 | 84,8 | 37,4 | 7,6 |
3 mM HTB | 100 | 94,5 | 69,2 | 39,6 | 14,3 | N.D. |
143.98.2 | 0 horas | 2 horas | 5 horas | 24 horas | 48 horas | 72 horas |
1 mM HTB | 100 | 100 | 100 | 93,9 | 83,2 | 50,4 |
3 mM HTB | 100 | 98,1 | 82,7 | 52,2 | 16,1 | N.D. |
N.D.: no determinado
Los resultados de los ensayos descritos en los
ejemplos 1, 2 y 3 demuestran que el triflusal y el HTB inhiben la
activación del factor de transcripción NF-\kappaB.
Se demuestra también que esta inhibición es independiente del agente
inductor y del tipo de célula. Estos resultados demuestran la
utilidad de triflusal y HTB en el tratamiento o prevención de
aquellas patologías en las que el NF-\kappaB se
halle implicado.
Los resultados del ejemplo 4 demuestran que el
triflusal y el HTB inhiben la expresión de VCAM-1.
Se ha descrito que el gen de VCAM-1 tiene puntos de
unión al NF-\kappaB (C. Weber y cols.,
Arterioscler. Thromb. 1994, 14(10),
1665-1673). Se ha demostrado que moléculas de
adhesión como VCAM-1 están implicadas en patologías
como la aterosclerosis (K.D. O'Brien y cols., J. Clin.
Invest. 1993, 92, 945-951), artritis
reumatoidea, lupus, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria
intestinal, asma, rinitis alérgica y metástasis de tumores. Al
inhibir la activación del factor NF-\kappaB y la
expresión de VCAM-1, tanto el triflusal como el HTB
podrían ser de especial utilidad en el tratamiento o prevención de
las enfermedades mediadas por VCAM-1 como todas las
arriba mencionadas y muy especialmente la aterosclerosis.
En el ejemplo 5 se demuestra que triflusal y HTB
inhiben también la expresión de iNOS, que está regulada a nivel
transcripcional, al menos en parte, por el
NF-\kappaB (U. Förstermann y cols., Biochem.
Pharmacol. 1995, 50(9), 1321-1332). Se
ha demostrado que la iNOS está implicada en patologías como
inflamación, shock séptico, enfermedad inflamatoria intestinal y
enfermedades neurodegenerativas como demencia y enfermedad de
Parkinson (J. E. Ogden y P.K. Moore, Trends Biotechnol. 1995,
13(2), 70-78). Al inhibir la activación del
factor NF-\kappaB y la expresión de iNOS, el
triflusal y el HTB podrían ser de especial utilidad en el
tratamiento o prevención de las enfermedades mediadas por la iNOS y
en especial inflamación, shock séptico, enfermedad inflamatoria
intestinal y enfermedades neurodegenerativas como demencia y
enfermedad de Parkinson.
Los resultados de los ejemplos 6 y 7 demuestran
que el triflusal y HTB inhiben la expresión de la
COX-2 tanto in vitro como in vivo. Se
ha descrito que el gen que codifica la COX-2 tiene
puntos de unión al NF-\kappaB (S.B. Appleby y
cols., Biochem. J. 1994, 302, 723-727). Se ha
relacionado la COX-2 con patologías como artritis
reumatoidea y otras enfermedades de tipo artrítico, artrosis, parto
prematuro, demencia, especialmente la enfermedad de Alzheimer (T.A.
Sandson y O. Felician, Exp. Opin. Invest. Drugs 1998,
7(4), 519-526) y cáncer (M. Oshima y cols.,
Cell 1996, 87(5), 803-809; K.
Subbaramaiah y cols., Cancer Res. 1996, 56(19),
4424-4429). Al inhibir la activación del factor
NF-\kappaB y la expresión de la
COX-2, el triflusal y el HTB podrían ser de especial
utilidad en el tratamiento o prevención de patologías mediadas por
la COX-2 y más especialmente artritis reumatoidea y
otras enfermedades de tipo artrítico, artrosis, parto prematuro,
demencia y cáncer.
Los resultados del ejemplo 8 demuestran que el
HTB inhibe también la expresión de MCP-1, que está
regulada a nivel transcripcional, al menos en parte, por el
NF-\kappaB (T. Martin y cols., Eur. J.
Immunol. 1997, 27(5), 1091-1097). Se ha
descrito que una producción excesiva o no regulada de
MCP-1 está implicada en patologías como
glomerulonefritis (B.H. Rovin y cols., Lab. Invest. 1994,
71(4), 536-542), artritis reumatoidea (P.M.
Villiger y cols., J. Immunol. 1992, 149(2),
722-727), fibrosis pulmonar (H.N. Antoniades y
cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89(12),
5371-5375), restenosis, asma, psoriasis, enfermedad
inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple y rechazo de
trasplantes, y constituye el factor quimiotáctico más potente
detectado en placas de ateroma ricas en macrófagos (S.
Yla-Herttuala y cols., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 1991, 88(12), 5252-5256). Al inhibir
la activación del factor NF-\kappaB y la expresión
de MCP-1, el triflusal y el HTB podrían ser de
especial utilidad en el tratamiento o prevención de las enfermedades
mediadas por la MCP-1 como las arriba
mencionadas.
Los resultados del ejemplo 9 demuestran que
triflusal y HTB inhiben también la expresión del
TNF-\alpha, que está regulada a nivel
transcripcional, al menos en parte, por el
NF-\kappaB (J. Yao y cols, J. Biol. Chem.
1997, 272(28), 17795-17801). Se ha descrito
que una producción excesiva o no regulada de
TNF-\alpha está implicada en un amplio abanico de
patologías como artritis reumatoidea, espondilitis reumatoidea,
artritis gotosa y otras enfermedades artríticas, artrosis, sepsis,
shock séptico, shock endotóxico, síndrome de shock tóxico, síndrome
del distrés respiratorio del adulto, malaria cerebral, enfermedad
inflamatoria pulmonar crónica, silicosis, sarcoidosis pulmonar,
fibrosis pulmonar, hepatitis, osteoporosis y otras enfermedades
relacionadas con la resorción ósea, daño por reperfusión, rechazo de
trasplantes, esclerosis múltiple, lupus, fiebre y mialgias debidas
a infecciones, caquexia, síndrome de la inmunodeficiencia adquirida
(SIDA), enfermedad inflamatoria intestinal y piresis (L. Sekut y
K.M. Connolly, Drug News Perspect. 1996, 9(5),
261-269). Al inhibir la activación del factor
NF-\kappaB y la expresión de
TNF-\alpha, el triflusal y el HTB podrían ser de
especial utilidad en el tratamiento o prevención de las enfermedades
mediadas por el TNF-\alpha como las arriba
mencionadas.
Los resultados de los ejemplos 11, 12 y 13
demuestran adicionalmente la utilidad del triflusal y HTB para el
tratamiento o prevención de enfermedades neurodegenerativas,
artritis y cáncer, respectivamente.
Las concentraciones en las que se observan
efectos en los experimentos descritos en los ejemplos 1 a 13 se
alcanzan a las dosis terapéuticas de triflusal empleadas
habitualmente en humanos por vía oral.
Sin querer quedar vinculados por lo que aquí se
expresa, se cree que la inhibición de la expresión de proteinas como
VCAM-1, iNOS, COX-2,
MCP-1 y TNF-\alpha por parte del
triflusal y el HTB está mediada, al menos en parte, por una
inhibición de la activación del factor de transcripción
NF-\kappaB. Esto no obstante, se sabe que la
expresión de los genes que codifican estas proteinas puede ser
activada por otros agentes. Al haber demostrado que tanto triflusal
como HTB inhiben la expresión de estos genes (tanto in vitro
como in vivo, en el caso de la COX-2), ambos
productos podrían ser útiles también en el tratamiento o prevención
de patologías en las que exista una elevada expresión de estos genes
independiente de NF-\kappaB.
Claims (11)
1. Uso de un compuesto de fórmula I
donde R representa hidrógeno o COCH_{3}, o una
sal farmacéuticamente aceptable o profármaco del mismo para la
manufactura de un medicamento para el tratamiento o prevención de
enfermedades inmunoinflamatorias o
autoinmunes.
2. Uso según la reivindicación 1 donde la
enfermedad inmunoinflamatoria o autoinmune es una enfermedad
seleccionada de entre artritis reumatoidea y otras enfermedades de
tipo artrítico, esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedad
inflamatoria intestinal, lupus y glomerulonefritis.
3. Uso de un compuesto de fórmula I según se ha
definido en la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente
aceptable o profármaco del mismo para la manufactura de un
medicamento para el tratamiento o prevención de la artrosis.
4. Uso de un compuesto de fórmula I según se ha
definido en la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente
aceptable o profármaco del mismo para la manufactura de un
medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer.
5. Uso de un compuesto de fórmula I según se ha
definido en la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente
aceptable o profármaco del mismo para la manufactura de un
medicamento para el tratamiento o prevención de la inflamación.
6. Uso de un compuesto de fórmula I según se ha
definido en la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente
aceptable o profármaco del mismo para la manufactura de un
medicamento para el tratamiento o prevención del asma o el síndrome
del distrés respiratorio del adulto.
7. Uso de un compuesto de fórmula I según se ha
definido en la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente
aceptable o profármaco del mismo para la manufactura de un
medicamento para el tratamiento o prevención del shock séptico.
8. Uso de un compuesto de fórmula I según se ha
definido en la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente
aceptable o profármaco del mismo para la manufactura de un
medicamento para la prevención de parto prematuro.
9. Uso de un compuesto de fórmula I según se ha
definido en la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente
aceptable o profármaco del mismo para la manufactura de un
medicamento para el tratamiento o prevención de la osteoporosis.
10. Uso de un compuesto de fórmula I según se ha
definido en la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente
aceptable o profármaco del mismo para la manufactura de un
medicamento para el tratamiento o prevención de infecciones
víricas.
\newpage
11. Uso de un compuesto de fórmula I según se ha
definido en la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente
aceptable o profármaco del mismo para la manufactura de un
medicamento para el tratamiento o prevención del rechazo de
trasplantes.
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