KR100713601B1 - 핵전사인자 ＮＦ-κＢ의 활성화의 억제제로서의2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산 유도체의 용도 - Google Patents

핵전사인자 ＮＦ-κＢ의 활성화의 억제제로서의2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산 유도체의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵전사인자 NF-κB의 활성화의 억제제로서 2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산 유도체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간을 포함한 포유동물에서 NF-κB의 활성화 및/또는 NF-κB 의존성 또는 NF-κB에 의해 적어도 부분적으로 조절되는 유전자의 발현에 관련된 병의 치료 또는 예방용 약물의 제조를 위한 2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조사 유도체의 용도에 관한 것이다.
2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산 유도체

Description

핵전사인자 ＮＦ-κＢ의 활성화의 억제제로서의 2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산 유도체의 용도{UTILIZATION OF 2-HYDROXY-4-TRIFLUOROMETHYLBENZOIC ACID DERIVATIVES AS INHIBITORS OF THE ACTIVATION OF THE NUCLEAR TRANSCRIPTION FACTORS NF-κB}
본 발명은 핵전사인자 카파B(NF-κB)의 억제제 및 치료에서 그들의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 전사인자 NF-κB의 활성화를 억제하기 위한 2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산 유도체의 용도에 관한 것이다.
단백질 발현의 조절은 병리학적인 과정의 발달 뿐만 아니라 세포의 정상기능 유지 및 그로 인한 조직의 정상기능의 유지에서 주요한 역할을 한다. 이러한 조절은 소위 전사인자를 통해 달성된다. 이러한 인자중 하나는 이량체 복합체와 밀접하게 관련된 패밀리에 의해 형성되는 핵전사인자 NF-κB로 공지된 단백질 군이다. NF-κB는 여러 종류의 세포의 세포질에 불활성형으로 존재한다. 자극에 반응하여, 활성화되고, 핵으로 전위되어 DNA에 결합하고, 핵에서 여러 유전자의 전사를 조절한다. NF-κB의 활성화는 염증 사이토카인(예를 들면, 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)및 인터루킨-1베타(IL-1β), 미토젠, 박테리아 지다당(LPS), 바이러스, 산화제(예를 들면, H2O2 및 오존), 포르볼(phorbol) 에스테르 및 자외선과 같은 여러 제제에 의해 유도될 수 있다. NF-κB에 의해 발현이 조절되는 여러 유전자 중에서, 면역 및 염증 반응과 관련된 많은 유전자가 포함된다. 그러므로, 다른 것들 중, NF-κB는 IL-1β, 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-6(IL-6), TNF-α 및 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF)와 같은 전염증 사이토카인; 인터루킨-8(IL-8), RANTES, 마크로파지 염증 단백질-1α(MIP-1α), 단구 주화성 단백질-1(MCP-1) 및 에오택신과 같은 케모카인; 유도 산화 질소 합성효소(iNOS), 시클로옥시게나제-2(COX-2), 5-리포옥시게나제(5-LO) 및 세포질 포스포리파제 A2(cPLA2)와 같은 염증성 효소; 세포간 부착 분자-1(ICAM-1), 소포성 세포 부착 분자-1(VCAM-1) 및 E-셀렉틴과 같은 부착 분자; 및 인터루킨-2 수용체 및 T-세포 수용체(P.J.Barnes and I.M.Adcock, Trends Pharmacol. Sci. 1997, 18, 46-50)와 같은 수용체의 발현을 조절한다.
NF-κB 활성화 및 그에 의존성 유전자의 기능장애는 심한 염증, 패혈성 쇼크, 이식거부, 방사능 손상, 이케미아 및 재관류(reperfusion) 손상 및 신경퇴행성 질환(P.A.Baeuerle and T.Henkel, Annu.Rev.Immunol. 1994, 12, 141-179), 천식 및 기타 만성염증성 질환(P.J.Barnes and I.M.Adcock, Trends Pharmacol.Sci.1997, 18, 46∼50), 골다공증(Y.AbuAmer and M.Mehrad Tondravi, Nature Med.1997, 3(11), 1189∼1190), 및 암(M.A.Sovak et al., J.Clin.Invest.1997,100(12), 2952∼2960)과 같은 여러 병리와 관련되었다. 더욱이, 증가된 수준의 NF-κB는 류마티스성 관절염(H.Asahara et al.,Biochem.Mol.Biol.Int.,1995,37(5),827-32) 환자의 활액 조직, 다발성 경화증 환자의 중추신경계 샘플(D.Gveric et al., J.Neuropathol.Exp.Neurol.1998,57(2), 168∼78) 및 죽상동맥경화증 조직의 샘플 (K. Brand et al.,J.Clin.Invest.1996, 97(7), 1715∼22)에서 감지되고, 알츠하이머 환자의 플라크에 축적되는 아밀로이드 β펩티드는 중추 신경계 세포에서 NF-κB를 활성화시킨다고 기재되어 있다(C.Behl et al., Cell 1994, 77, 817-827). NF-κB의 핵 전위에서 높은 증가는 또한 파킨슨 질환을 갖는 환자의 도파민작용성 뉴런에서 관찰되었다(S.Hunot et al., Proc. Natl.Acad.Sci.USA 1997, 94(14), 7531-7536). 또한, NF-κB는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 사이토메갈로바이러스, 아데노바이러스 및 헤르페스바이러스와 같은 바이러스의 전사 활성화에 관련되어 있음이 보고되었다.
한편, 사이토카인, 염증성 효소, 부착 분자 및 NF-κB에 의해 발현이 조절되는 기타 단백질은 염증; 천식; 성인호흡곤란증상(ARDS); 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 건선, 염증성 장질환, 루푸스 및 사구체신염과 같은 면역염증성 및 자가면역 질환; 관절증; 패혈성 쇼크; 죽상동맥경화증; 암; 골다공증; 조산(preterm labour); 이식거부; 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환 및 근위축성 측경화증을 포함하는 치매와 같은 신경퇴행성질환; 및 바이러스 감염과 같은 광범위의 장애에서 중요한 역할을 한다.
상기 관점에서, 전사인자 NF-κB의 활성 및/또는 이 전사인자 의존성 유전자의 발현을 조절할 수 있는 제제는 상기 언급된 장애의 치료 또는 예방용 치료제로서 매우 유용할 수 있었다. 그러므로, NF-κB 활성을 조절할 수 있는 제제를 발견하는 데에 관심이 주목되고 있다.
국제 비특정명(INN) 트리플루살(triflusal)로 더 잘 알려진 2-아세틸옥시-4-트리플루오로메틸벤조산은 상표 Disgren
Figure 112004021276646-pct00001
으로 시판되는 혈전색전증의 치료용 혈소판 응집 억제제이다. 그의 주 대사산물인, 2-히드록시-4-트리플루오로메틸벤조산 (두문자 HTB로도 공지됨)은 또한 혈소판 항응집제로서 눈에띨만한 활성을 갖는다. 양 화합물은 미국특허 4,096,252에 기재되어 있다.
본 발명자들은 놀랍게도 트리플루살 및 그의 대사산물인 HTB 둘다 NF-κB 활성화를 억제한다는 것을 발견하였다. 더욱이, 양 화합물은 NF-κB에 의해 전사조절되는 유전자 발현의 유능한 억제제임을 발견하였다. 현재 발견된 이러한 신규 활성으로인해, 트리플루살 및 HTB는 상기 언급된 것들과 같은, NF-κB 및 그의 의존성 유전자의 활성화가 관련된 장애의 치료 또는 예방에 잠재적으로 유용하다.
본 발명은 트리플루살 및 그의 대사산물인 HTB가 전사인자 NF-κB의 활성화의 유능한 억제제라는 발견을 기초로 한다. 상기 언급된 바와 같이, NF-κB는 DNA에 결합하여, 이러한 방법으로 대부분 면역 및 염증 반응과 관련된 여러 유전자들의 발현을 활성화함으로써 작용하는 편재하는 전사인자이다. 본 발명은 트리플루살 및 HTB가 인체 태정맥 내피세포(HUVEC), 마크로파지 및 단구와 같은 여러 종류 세포에서 TNF-α, 면역 복합체 및 LPS와 같은 여러 제제에 의해 유도되는 NF-κB의 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다. 더욱이, 트리플루살 및 HTB가 전사조절 NF-κB 가 관련된 여러 단백질, 예를 들면, VCAM-1, iNOS, COX-2, MCP-1 및 TNF-α의 발현을 억제한다는 것 또한 나타낸다. 그러므로, 트리플루살 및 HTB는 NF-κB 및/또는 이 전사인자에 의해 발현이 조절되는 단백질이 관련된 병리학적 상태에서 치료 또는 예방제로서 유용하다.
트리플루살 및 HTB는 본래 화학식 Ⅰ에 의해 표시될 수 있다:
Figure 112000025063279-pct00002
[식중, R은 수소(HTB) 또는 COCH3(트리플루살)을 나타낸다].
본 발명의 목적은 전사인자 NF-κB의 활성화를 억제하는 데에 유용한 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물의 용도이다. 화학식 Ⅰ 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 그의 프로드럭(prodrug)의 용도는 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 또다른 목적은 전사인자 NF-κB 에 의존적이고/이거나, NF-κB에 의해 적어도 부분적으로 조절되는 유전자의 발현을 억제하는 데에 유용한 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다. 바람직한 구현예에서, 유전자는 IL-1β, IL-2, IL-6, TNF-α, GM-CSF, IL-8, RANTES, MIP-1α, MCP-1, 에오택신, iNOS, COX-2, 5-LO, cPLA2, ICAM-1, VCAM-1, E-셀렉틴, IL-2 수용체 또는 T-세포 수용체를 코딩하고, 더욱 바람직하게는 VCAM-1, iNOS, COX-2, MCP-1 또는 TNF-α를 코딩한다.
본 발명의 목적은 또한 전사인자 NF-κB의 활성화 및/또는 이 전사인자 의존성 유전자의 발현과 관련된 장애의 치료 또는 예방용 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다. 바람직한 구현예에서, 장애는 염증; 천식; 성인호흡곤란증(ARDS); 류마티스성 관절염 및 기타 관절염 증상, 다발성 경화증, 건선, 염증성 장질환, 루푸스 및 사구체신염과 같은 면역염증성 및 자가면역질환; 관절증; 패혈성 쇼크; 죽상동맥경화증; 암; 골다공증; 조산; 이식거부; 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환 및 근위축성 외측경화증을 포함하는 치매와 같은 신경퇴행성질환; 및 바이러스 감염이다.
또한, 본 발명의 목적은 COX-2의 발현을 억제하는 데에 유용한 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다.
또한, 본 발명의 목적은 COX-2에 의해 매개되는 질환의 치료 또는 예방용 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다. 바람직한 구현예에서, COX-2에 의해 매개되는 질환은 류마티스성 관절염 및 기타 관절염 증상, 관절증, 조산, 치매 또는 암이다.
본 발명의 목적은 또한 VCAM-1의 발현을 억제하는 데에 유용한 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다.
본 발명의 목적은 또한 VCAM-1에 의해 매개되는 질환의 치료 또는 예방용 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다. 바람직한 구현예에서, VCAM-1에 의해 매개되는 질환은 죽상동맥경화증, 류마티스성 관절염, 루푸스, 다발성 경화증, 염증성 장질환, 천식, 알레르기성 비염 및 종양 전이이다.
본 발명의 목적은 또한 iNOS의 발현을 억제하는 데에 유용한 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다.
본 발명의 목적은 또한 iNOS에 의해 매개되는 질환의 치료 또는 예방용 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다. 바람직한 구현예에서, iNOS에 의해 매개되는 질환은 염증, 패혈성 쇼크, 염증성 장질환 및 신경퇴행성 질환이다.
본 발명의 목적은 또한 TNF-α의 발현을 억제하는 데에 유용한 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다.
본 발명의 목적은 또한 TNF-α에 의해 매개되는 질환의 치료 또는 예방용 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다. 바람직한 구현예에서, TNF-α에 의해 매개되는 질환은 류마티스성 관절염, 류마티스성 척추염, 통풍성 관절염 및 기타 관절염 증상, 관절염, 패혈증, 패혈성 쇼크, 내독성 쇼크, 독성 쇼크증, 성인호흡곤란증, 뇌 말라리아, 만성폐렴질환, 규폐증, 폐 유육종증, 폐 섬유증, 간염, 골다공증 및 기타 골흡수질환, 재관류 손상, 이식거부, 다발성 경화증, 루푸스, 감염으로 인한 열 및 근육통, 악액질(cachexia), 후천성 면역 결핍증(AIDS), 염증성 장질환 및 열병이다.
본 발명의 목적은 또한 MCP-1의 발현을 억제하는 데에 유용한 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다.
본 발명의 목적은 또한 MCP-1에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다. 바람직한 구현예에서, MCP-1에 의해 매개되는 질환은 죽상동맥경화증, 사구체신염, 류마티스성 관절염, 폐 섬유증, 재발협착증, 천식, 건선, 염증성 장질환, 다발성 경화증 및 이식거부이다.
본 발명의 목적은 또한 신경퇴행성 질환, 특히 치매, 파킨슨 질환 및 근위축성 외측경화증의 치료 또는 예방용 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다.
본 발명의 목적은 또한 면역염증성 및 자가면역 질환, 바람직하게는 류마티스성 관절염 및 기타 관절염 증상, 다발성 경화증, 건선, 염증성 장질환, 루푸스 및 사구체신염의 치료 또는 예방용 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다.
본 발명의 목적은 또한 관절증의 치료 또는 예방용 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다.
본 발명의 목적은 또한 암의 치료 또는 예방용 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다.
본 발명의 목적은 또한 죽상동맥경화증의 치료 또는 예방용 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다.
본 발명의 목적은 또한 조산의 치료 또는 예방용 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다.
본 발명의 목적은 또한 염증의 치료 또는 예방용 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다.
본 발명의 목적은 또한 천식 또는 성인호흡곤란증의 치료 또는 예방용 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다.
본 발명의 목적은 또한 패혈성 쇼크의 치료 또는 예방용 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다.
본 발명의 목적은 또한 골다공증의 치료 또는 예방용 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다.
본 발명의 목적은 또한 바이러스 감염의 치료 또는 예방용 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다.
본 발명의 목적은 또한 이식거부의 치료 또는 예방용 약물의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도이다.
본 발명은 또한 전사인자 NF-κB의 활성화를 억제하기 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 전사인자 NF-κB에 의존적이고/이거나 NF-κB에 의해 적어도 부분적으로 조절되는 유전자의 발현을 억제하기 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 전사인자 NF-κB 활성화 및/또는 이 전사인자 의존성 유전자의 발현과 관련된 장애의 치료 또는 예방을 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 COX-2의 발현을 억제하기 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도를 제공한다.
본 발명은 COX-2에 의해 매개되는 질환, 바람직하게는 류마티스성 관절염 및 기타 관절염 증상, 관절증, 조산, 치매 또는 암의 치료 또는 예방을 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 VCAM-1의 발현을 억제하기 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 VCAM-1에 의해 매개되는 질환, 바람직하게는 죽상동맥경화증, 류마티스성 관절염, 루푸스, 다발성 경화증, 염증성 장질환, 천식, 알레르기성 비염 및 종양 전이의 치료 또는 예방을 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 iNOS의 발현을 억제하기 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 iNOS로 매개되는 질환, 바람직하게는 염증, 패혈성 쇼크, 염증성 장질환 및 신경퇴행성 질환의 치료 또는 예방을 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 TNF-α의 발현을 억제하기 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 TNF-α에 의해 매개되는 질환, 바람직하게는 류마티스성 관절염, 류마티스성 척추염, 통풍성 관절염 및 기타 관절염 증상, 관절증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 내독성 쇼크, 독성 쇼크증, 성인호흡곤란증, 뇌 말라리아, 만성폐렴질환, 규폐증, 폐 유육종증, 폐 섬유증, 간염, 골다공증 및 기타 골흡수질환, 재관류 손상, 이식거부, 다발성 경화증, 루푸스, 감염으로 인한 열 및 근육통, 악액질, 후천성 면역 결핍증(AIDS), 염증성 장질환 및 열병의 치료 또는 예방을 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 MCP-1의 발현을 억제하기 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도를 제공한다.
본 발명은 MCP-1에 의해 매개되는 질환, 바람직하게는 죽상동맥경화증, 사구체신염, 류마티스성 관절염, 폐 섬유증, 재발성협착증, 천식, 건선, 염증성 장질환, 다발성 경화증 및 이식거부의 치료 또는 예방을 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 치료학적인 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 필요한 포유동물에서 전사인자 NF-κB의 활성화를 억제하는 방법을 제공한다. 포유동물은 바람직하게는 인간이다.
본 발명은 또한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 치료학적인 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 필요한 포유동물에서 전사인자 NF-κB에 의존적이고/이거나 NF-κB에 의해 적어도 부분적으로 조절되는 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 치료학적인 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 필요한 포유동물에서 전사인자 NF-κB의 활성화 및/또는 전사인자 의존성 유전자의 발현과 관련된 장애의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 치료학적인 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 필요한 포유동물에서 COX-2의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 치료학적인 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 필요한 포유동물에서 COX-2에 의해 매개되는 질환, 바람직하게는 류마티스성 관절염 및 기타 관절염 증상, 관절증, 조산, 치매 또는 암의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 치료학적인 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 필요한 포유동물에서 VCAM-1의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 치료학적인 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 필요한 포유동물에서 VCAM-1에 의해 매개되는 질환, 바람직하게는 죽상동맥경화증, 류마티스성 관절염, 루푸스, 다발성 경화증, 염증성 장질환, 천식, 알레르기성 비염 및 종양 전이의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 치료학적인 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 필요한 포유동물에서 iNOS의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 치료학적인 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 필요한 포유동물에서 iNOS에 의해 매개되는 질환, 바람직하게는 염증, 패혈성 쇼크, 염증성 장질환 및 신경퇴행성 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 치료학적인 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 필요한 포유동물에서 TNF-α의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 치료학적인 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 필요한 포유동물에서 TNF-α에 의해 매개되는 질환, 바람직하게는 류마티스성 관절염, 류마티스성 척추염, 통풍성 관절염 및 기타 관절염 증상, 관절증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 내독성 쇼크, 독성 쇼크증, 성인호흡곤란증, 뇌 말라리아, 만성폐렴질환, 규폐증, 폐 유육종증, 폐 섬유증, 간염, 골다공증 및 기타 골흡수질환, 재관류 손상, 이식거부, 다발성 경화증, 루푸스, 감염으로 인한 열 및 근육통, 악액질, 후천성 면역 결핍증(AIDS), 염증성 장질환 및 열병의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 치료학적인 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 필요한 포유동물에서 MCP-1의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 치료학적인 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 필요한 포유동물에서 MCP-1에 의해 매개되는 질환, 바람직하게는 죽상동맥경화증, 사구체신염, 류마티스성 관절염, 폐 섬유증, 재발협착증, 천식, 건선, 염증성 장질환, 다발성 경화증 및 이식거부의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
전사인자 NF-κB의 활성화 및/또는 이 전사인자 의존성 유전자의 발현과 관련된 장애의 치료 또는 예방, 더욱 바람직하게는 염증; 천식; 성인호흡곤란증 (ARDS); 류마티스성 관절염 및 기타 관절염 증상, 다발성 경화증, 건선, 염증성 장질환, 루푸스 및 사구체신염과 같은 면역염증성 및 자가면역질환; 관절증; 패혈성 쇼크; 죽상동맥경화증; 암; 골다공증; 조산; 이식거부; 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환 및 근위축성 외측경화증을 포함하는 치매와 같은 신경퇴행성 질환; 및 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 위한 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 치료학적인 유효량을 함유하는 약제 조성물도 본 발명의 범주에 포함된다.
화학식 Ⅰ의 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염은 예를 들면 암모니아 및 다른 약제학적으로 허용가능한 아민으로 형성된 염 뿐만 아니라, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마스네슘, 리튬, 알루미늄, 아연 등과 같은 무기 양이온을 갖는 염과 같이 약제화학에서 통상 사용되는 임의 염을 포함한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 화학식 Ⅰ의 화합물의 프로드럭 용어는 생체내에서 대사되어 화학식 Ⅰ의 화합물로 방출될 수 있는 화학식 Ⅰ의 화합물의 전구체, 즉 트리플루살 또는 HTB를 의미한다.
NF-κB은 이 명칭으로 공지된 단백질의 패밀리의 모든 구성원으로 이해된다.
전사인자 NF-κB에 의존적이고/이거나 NF-κB에 의해 적어도 부분적으로 조절되는 유전자는 그의 프로모터 영역에 하나 이상의 NF-κB 결합부위를 갖는 임의 유전자로 이해된다. "배경기술"에서 상기 언급된 NF-κB에 의해 조절되는 유전자의 목록은 단지 예로서 인용되고, 어떠한 경우에도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되지 않는다.
전사인자 NF-κB의 활성화 및/또는 이 전사인자 의존성 유전자의 발현과 관련된 장애는 NF-κB의 활성화 및/또는 발현(즉, 그들을 코딩하는 유전자의 발현)이 이 전사인자에 의해 적어도 부분적으로 조절되는 단백질이 관련된 임의 질환 또는 병리학적 상태로 이해된다. 상기 언급된 이러한 질환의 목록은 단지 실시예로서 인용되고, 어떠한 경우에도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되지 않는다.
용어 신경퇴행성 질환은 다른 것들 중에서, 알츠하이머 질환과 같은 치매; 파킨슨 질환과 같은 운동기능장애를 포함하는 질환; 진행성 운동실조증; 및 근위축성 외측경화증과 같은 뉴런기원의 근위축증을 포함한다.
용어 치매(dimentia)는 예를 들면, 알츠하이머 질환, 외상후 치매 또는 복합 상황 뿐만 아니라 감염에 수반되는 치매와 같은 인식 기능의 손상을 특징으로 하는 병으로 이해된다.
용어 염증성 장질환은 다른 종류의 다양한 염증성 장질환 뿐만 아니라, 궤양성 대장염 및 크론(Crohn's) 질환을 포함한다.
용어 이식거부는 기관이식거부 뿐만 아니라 예를 들면, 이식편대숙주(graft- versus-host) 질환과 같은 조직이식거부 모두를 언급하는 것이다.
트리플루살 또는 HTB의 제조 공정은 상기 인용된 미국특허(US 4,096,252)에 개시되어 있다.
상기 언급된 바와 같이, 화학식 Ⅰ의 화합물은 전사인자 NF-κB의 활성화를 억제하고, 그러므로 포유동물에서, 바람직하게는 인체에서 상기 활성화를 억제하는 데에 사용될 수 있다. 전사인자 NF-κB의 활성화를 조절하는 데에 필요한 화학식 Ⅰ의 화합물의 복용량은 선택되는 투여경로 뿐만 아니라 치료될 장애, 증상의 중한정도, 환자의 연령 및 체중에 따라 상이할 것이다. 당업자는 불필요한 실험없이 이러한 요인에 따라 적당한 복용량을 용이하게 결정할 것이다. 인간 치료에서, 복용량은 일반적으로 1 또는 수 복용 단위로 투여될 수 있는 1 일당 약 30 mg 내지 약 3000 mg의 화학식 Ⅰ의 화합물일 것이다. 그러나, 치료될 특정 질환 및 환자 상태에 따라, 상기 범위를 벗어나는 복용량은 상기 언급된 바와 같이, 불필요한 실험없이 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
화학식 Ⅰ의 화합물은 임의 약제학적 제제의 형태로 투여될 수 있으며, 그의 성질은 주지된 바와 같이 투여 경로 및 치료될 질환의 성질에 따라 상이할 것이다. 이러한 약제 조성물은 혼화가능하고, 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 운반체 (vehicle)를 사용하여 통상적인 방법으로 제조될 수 있다. 상기 조성물의 예로는 캡슐, 정제, 시럽, 임시 용액, 주사용 제제 등의 제조를 위한 분말 및 과립이 포함된다. 화학식 Ⅰ의 화합물의 바람직한 투여 경로는 경구 경로이다. 예를 들면, 50, 100, 200, 300, 400 또는 500 mg의 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 약제학적으로 허용가능한 염 도는 그의 프로드럭을 함유하는 경성의 젤라틴 캡슐로서 투여될 수 있다.
도 1 은 인간 태정맥 내피세포(HUVEC) 배양에서 TNF-α에 의해 유도되는 전사인자 NF-κB의 활성화에 대한 트리플루살 및 HTB의 억제효과를 나타낸다.
도 2 는 래트 마크로파지에서 면역 복합체(IC)에 의해 유도되는 전사인자 NF-κB의 활성화에 대한 트리플루살 및 HTB의 억제효과를 나타낸다.
도 3 (A 및 B) 은 인간 말초혈액단핵세포에서 박테리아 지다당(LPS)에 의해 유도되는 전사인자 NF-κB의 활성화에 대한 HTB의 억제효과를 나타낸다.
도 4 는 HUVEC에서 TNF-α에 의해 유도되는 VCAM-1 mRNA의 발현에 대한 트리플루살 및 HTB의 억제효과를 나타낸다.
도 5 는 래트 마크로파지에서 면역 복합체에 의해 유도되는 아질산염의 생성에 대한 HTB(5A) 및 트리플루살(5B)의 억제효과를 나타낸다.
도 6 은 인간 단핵 세포에서 LPS-유도 COX-2에 대한 트리플루살 및 HTB의 효과: (6A) COX-2 발현에 대한 트리플루살의 억제효과; (6B) COX-2 발현에 대한 HTB의 억제효과; (6C) 트리플루살에 의해 유도된 프로스타글란딘 E2(PGE2) 생성의 억제; (6D) HTB에 의해 유도된 PGE2의 생성의 억제를 나타낸다.
도 7 은 래트에서 카라기난에 의해 유도된 염증 모델에서 COX-2 발현(7A) 및 PGE2 생성(7B)에 대한 경구투여된 트리플루살의 억제효과를 나타낸다.
도 8 은 인간 단구 세포주 THP-1에서 면역 복합체(IC)에 의해 유도된 MCP-1 발현에 대한 HTB의 억제효과를 나타낸다.
도 9 는 인간 말초 혈액 단핵 세포에서 박테리아 지다당(LPS)에 의해 유도된 TNF-α 발현에 대한 트리플루살 및 HTB의 억제효과를 나타낸다.
하기의 실시예는 NF-κB 및 그에 의존성 유전자의 활성화의 억제제로서 트리플루살 및 HTB의 유용성을 설명할 것이다. 어떠한 경우에도, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 설명되는 것은 아니다. 하기 약어가 실시예에서 사용되었다:
EDTA: 에틸렌디아민테트라아세트산
DTT:1,4-디티로트레이톨
bp: 염기쌍
PBS: 인산완충식염수
RT-PCR: 역전사효소 중합효소 사슬반응
dNTP: 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트
DNA: 데옥시리보핵산
RNA: 리보핵산
MTT: 타아졸릴 블루
TBS: 트리스-완충 식염수
ATP: 아데노실 트리포스페이트
DMSO: 디메틸술폭시드
FCS: 우태혈청
실시예 1: HUVEC에서 TNF-α에 의해 유도된 NF-κB의 활성화의 억제
A. 세포배양
태정맥을 C. histolyticum(베링거 만하임 게엠베하, 만하임, 독일)으로부터 0.2 %의 콜라게나제 P로 20 분간 37 ℃에서 처리에 의한 Dejana 등의 공정(J. Cell Biol 1987, 104(5), 1403∼1411)에 의해 인간 태정맥내피세포(HUVEC)를 수득하였다. 그 다음, 세포를 100 U/ml의 페니실린, 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신, 2,5 ㎍/ml의 암포테리신 B, 및 20 %의 우태혈청을 함유하는 M199 배지(Flow Lab, Herts, U.K.)에서 배양하였다. 1차 배양물을 25 ㎠ 플라스틱 플라스크에 깔았다. 24 시간후, 세포를 세척하여 플라스크 표면에 부착되지 않은 것들을 제거하였다. 그 다음, 10 % 우태혈청, 50 ㎍/ml의 내피세포 성장보충물 및 100 ㎍/ml 헤파린을 함유하는 동일한 배지를 첨가하였다. 5∼7 일간 배양 후, 세포가 콘플루언스 (confluence)에 도달하였고, 0.05 % 트립신 및 0.02 % EDTA (Flow Lab)으로 플라스크 표면으로부터 분리하였다. 반응을 우태혈청의 첨가로 억제한 후, 세포를 세척하고 배양배지에 다시 깔았다. 세포는 젤라틴 코팅된 플라스크에서 콘플루언스까지 성장하였다. 실험에 사용된 세포는 2∼7 계대였다.
B. HUVEC 세포를 TNF-α로 처리 및 전기영동 이동 위치 변화 분석(EMSA)
이 실험에서는, HUVEC 세포를 트리플루살 및 HTB로 2 및 4 mM의 농도에서 미리 항온배양하였다. 그 다음, 상기 세포를 100 U/ml의 TNF-α(Genzyme Diagnosis, Cambridge, MA USA)로 90 분간 자극하였다. 다음, HUVEC 를 차가운 저장 용해 완충액(10 mM HEPES-KOH, pH 7.9, 10 mM KCl, 1.5 MgCl2, 0.5 mM DTT(1,4-디티오트레이톨), 0.5 mM 페닐메틸술포닐 플루오리드, 5 ㎍/ml 아프로티닌, 5 ㎍/ml 로이펩틴 및 0.6 % Nonidet P-40)으로 세척하고, 10 분간 빙냉하였다. 그 다음, 10 초간 격렬하게 와류시켰다. 깨지지 않은 세포를 10 분간 1,000 ×g 에서 원심분리함으로써 제거하였다. 핵을 미세원심분리기에서 1분간 15,000 ×g에서 원심분리에 의해 수합하였다. 핵 펠렛을 고염추출완충액(25 % 글리세롤 및 0.5 M KCl)에서 재현탁하였다. 핵 추출물을 TLA 100.2 로터를 사용하여 Optima TI 초원심분리기 (Beckmann)에서 30 분간 105,000 ×g에서 원심분리에 의해 수합하였다. NF-κB 서열을 함유하는 22 bp 이중가닥의 올리고뉴클레오티드를 프로브로서 사용하였다. 상기 프로브는 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 (γ-32P)ATP로 말단표지하였고, 미니칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 사용된 κB 서열은 5'-AGTTCAGGGGAATTTCCCAGGC-3' 및 상보적인 5'-GCCTGGGAAATTCCCCTGAACT-3'이다. 10 ㎍의 정제된 핵단백질을 20 분간 빙냉하에 2 ㎍의 폴리(dl-dC), 10 mM 트리스 HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 8 % 피콜(Ficoll) 및 4 % 글리세롤으로 구성된 25 ㎕의 반응완충액에서 방사능표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(2∼6 ×104 cpm)와 함께 항온배양하였다. 핵단백질-올리고뉴클레오티드 복합체를 트리스-보레이트/EDTA 완충액에서 3 시간동안 175 V로 4 ℃에서 비변성 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동에 의해 분해하였다. 겔을 건조시키고, - 80 ℃ 에서 2 내지 12 시간 동안 강화 스크린으로 자가방사능사진을 감광하였다. DNA(프로브)-단백질 복합체의 특이성을 300 배의 과량의 표지되지 않은 프로브와 32P-표지 프로브의 경쟁에 의해 확인하였고, 이는 DNA-단백질 복합체에서 표지된 프로브가 존재하지 않음을 나타내었다(데이타를 나타내지 않음). 대조군으로 표지된 줄은 TNF-α의 부재하에 90 분동안 항온배양된 세포에 상응한다.
C. 결과
이 실험의 결과를 도 1에 나타내었다. 트리플루살 및 HTB 모두 농도 의존적으로 HUVEC에서 TNF-α에 의해 유도된 NF-κB의 활성화를 억제한다.
실시예 2: 래트 마크로파지에서 면역 복합체 (IC) 에 의해 유도된 NF-κB의 활성화의 억제
A. 래트 복막 마크로파지의 분리 및 배양
래트 복막강 세포를 꺼내고, 혈청 부재하에 미리 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 50 ㎍/ml 겐타마이신, 2 mM 글루타민 및 0.5 mM L-아르기닌으로 미리 보충된 DMEM 배양배지에서 재현탁하였다. 세포를 2 시간동안 37 ℃에서 배양판에서 항온배양하고, 판에 부착되지 않은 세포를 동일한 새로운 배지로 3회 세척함에 의해 제거하였다. 지모산(zymosan) 입자를 삼키는 능력 및 비특이성 에스테라제 염색에 의해 확인되는 바와 같이, 부착세포의 95 % 이상이 마크로파지였다. 마크로파지를 37 ℃에서 5 % CO2 대기하에 유지시켰고, 2시간 후 비 부착 세포를 제거하고, 판에 부착된 복막 마크로파지를 토끼 항혈청으로부터 제조된 100 ㎍/ml의 IgG/난백알부민 면역 복합체로 2시간동안 트리플루살 또는 HTB(둘 다 4 mM)의 (운반체) 존재 또는 부재하에 항온배양하였다.
B. 전기이동 위치변화 분석(EMSA)
항온배양후, 마크로파지를 PBS로 2회 세척하였고, 실시예 1에 상세하게 기재된 바와 같이 전사인자 NF-κB의 (DNA에 결합하는) 활성화도를 EMSA 분석을 사용하여 측정하였다.
C. 결과
도 2 는 이 실험에서 트리플루살 및 HTB로 얻어진 결과를 나타낸다. 두 독립적인 실험에서 얻어진 대표예를 나타낸다. 트리플루살 및 HTB 둘 다 래트 마크로파지에서 면역 복합체에 의해 유도된 NF-κB의 활성화를 눈에띠게 억제한다.
실시예 3: 인간 말초혈액단핵세포(PBMC)에서 박테리아 지다당(LPS)에 의해 유도된 NF-κB의 활성화의 억제
A. 인간 단핵 세포의 분리 및 배양
단핵세포(PBMC)를 Sant Pau 병원(바르셀로나)으로부터 혈액 채취 전 2주 이상의 기간동안 항염증 약물을 섭취하지 않은 건강한 공여자의 혈액으로부터 수득하였다. 헤파린화된 인간 혈액(10 U/ml) 약 80 ml의 부피로 시작하여, 이를 칼슘, 마그네슘, 및 중탄산나트륨 없이 PBS(pH 7.4; 둘베코) (1:1) 희석하였다.
15 ml의 피콜 용액(20 ℃에서 d=1.077; Biochrom KG)을 50 ml Falcon 튜브에 위치시켰다. 상기 용액에 미리 PBS로 희석된 혈액의 튜브 당 약 25 ml 부피를 조심스럽게 첨가한후, 20 분간 1,200 g 에서 원심분리한다. 단핵세포를 혈장 및 피콜 용액간의 흰 중간상에 집중한다. 이 중간상을 파스퇴르 피펫으로 수합하고, PBS로 1:1 희석한다. 그 다음, 10 분간 300 g에서 원심분리하였다. 생성된 펠렛을 50 ml PBS에서 재현탁하고, 다시 10 분간 200 g에서 원심분리하여 혈소판 오염을 제거한다. 최종적으로, 생성된 펠렛을 10 % 우태혈청으로 보충된 20 ml의 RPMI-1640 배양배지(GibcoBRL)에서 재현탁한다.
분리된 PBMC를 표준 Wright-Giemsa 염색에 의해 분석하여 세포가 생 단핵세포의 형태학적 특징을 나타내는지 확인하고, 분리된 상이한 종류의 세포를 결정하였다(평균 90 %의 림프구 및 10 %의 단구). 다양한 처리에 앞서, 세포 생존도를 트리판 블루 배제 분석에 의해 결정하였다. 세포를 10 %의 우태혈청을 함유하는 RPMI 배지를 사용하여 2.5 백만/ml의 농도로 희석하고, 어떠한 약물(대조군) 첨가또는 HTB(1∼3 mM) 의 첨가 없이 6-웰 판(2 ml/웰, 5 백만 PBMC)에서 1시간 동안 항온배양하였다 (37 ℃, 5 % CO2). 그 다음, 세포를 10 ㎍/ml의 E. coli 지다당(LPS, 0.26:B6 혈청형; 시그마)의 존재하에 10 분간 더 항온배양하였다. 항온배양후, 샘플(100㎕)을 취하여 세포수를 세고, 미토콘드리아 탈수소효소의 가용성 테트라졸륨 염인 MTT를 불용성 생성물 포르마잔으로 전환능을 측정(MTT 분석)함으로써 세포 생존도를 계산하였다. 또한, 세포를 LPS의 부재하에 HTB(3 mM)로 항온배양하였다. 모든 경우에서, 세포 생존도는 95 % 이상이다.
B. 전기이동위치변화분석(EMSA)
항온배양 후, PBMCs를 PBS로 2회 세척하고, 전사인자 NF-κB의 (DNA에 결합하는) 활성화도를 실시예 1에 상세하게 기재되어 있는 EMSA 분석을 사용하여 측정 하였다.
C. 결과
도 3은 이 실험에서 HTB로 수득된 결과를 나타낸다. 두 독립적인 실험에서 수득되는 대표예를 나타낸다. HTB는 눈에 띠게 인간 PBMC에서 LPS에 의해 유도된 NF-κB의 활성화를 억제한다.
실시예 4: TNF-α에 의해 유도된 HUVEC에서 VCAM-1의 발현억제
A. cDNA의 첫번째 가닥의 합성 및 VCAM-1의 PCR
RT-PCR에 의해 VCAM-1 mRNA의 탐지를 위해 사용된 프라이머는 인간 유전자 서열로부터 위스콘신 패키지 버전 9.1(유전학 컴퓨터 그룹(GCC), 매디슨, 위스콘신)을 사용하여 고안되었다(EMBL/GeneBank AC:M30257). 상기는 뉴클레오티드 1090∼1108 및 1589∼1572(L. Osborn et al., Cell 1989, 59(6), 1203∼1211)에 상응하는 서열 5'-TGTCACTGTAAGCTGCAAG-3' 및 5'-TTCCAGCCTGGTTAATTC-3' 이다. 총 RNA를 배양된 세포로부터 구아니듐 이소티오시아네이트 방법(P. Chomczynski and N. Sacchi, Anal Biochem. 1987, 162(1), 156∼159)에 따라 추출하였다. cDNA 제 1 가닥을 총 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성하였다. 반응을 0.2 mg/ml의 총 RNA(68 ℃에서 10분간 미리가열), 2.5 ㎕ H2O, 20 U의 RNA 중합효소 억제제, 4 ㎕ 완충액 5×, 2 ㎕ DTT 0.1M, 4 ㎕ dNTP 2.5 mM, 1 ㎕ 헥사뉴클레오티드 0.1 mM 및 200 U의 몰로니-무린(Moloney-murine) 류케미아 바이러스 역전사효소를 사용하여 수행하였다. 반응을 부피 20 ㎕로 37 ℃에서 60 분간 수행하였다. VCAM-1 cDNA를 2 ㎕ DNA, 10 ㎕ H2O, 2.5 ㎕ 완충액 10×, 0.75 ㎕ MgCl2 50 mM, 1.0 ㎕ dNTP 2.5 mM, 1.25 ㎕의 각 프라이머(센스 및 안티센스) 및 0.25 ㎕ Taq DNA 중합효소 5U/ml를 함유하는 반응 혼합물에서 PCR에 의해 증폭하였다. 물을 사용하는 음성 대조군이 각 PCR 반응에 포함되었다. 증폭 조건은 하기와 같다: 90℃에서 5분간 변성 1 주기, 그 다음 하기를 포함하는 30 주기: 94 ℃에서 30 초간 변성, 59 ℃에서 30 초간 프라이머 어닐링(annealing), 및 72 ℃에서 1분간 신장; 및 72 ℃에서 7 분간 신장 최종 주기. 각 증폭된 cDNA의 상대량을 겔 Doc 자료조사 시스템 및 분자분석 소프트웨어(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 사용하여 에티듐 브로미드로 염색된 선의 밀도를 측정함으로써 결정하였다. β-액틴의 발현을 구조적 발현 유전자의 발현을 분석하기 위한 대조군으로 사용하였다.
구체적으로, HUVEC에서 TNF-α(100 U/ml)에 의해 유도된 VCAM-1 mRNA의 발현의 조절에 대한 트리플루살(4 mM) 및 HTB(4 mM)의 효과를 연구하였다. 그러므로, 세포를 TNF-α의 존재 또는 부재하에 트리플루살 및 HTB와 함께 항온배양하였다. 1 시간 후, 총 RNA를 추출하고, 역전사반응을 하였다. 그 다음, PCR에 의한 증폭반응을 분자 VCAM-1 및 인간 β-액틴의 서열에 대해 고안된 프라이머로 수행하였다. PCR 생성물을 1.8 %의 아가로즈 겔에서 전기영동에 의해 분리한 후, 정량하였다. 증폭 생성물의 분자량을 DNA 크기 표준의 전기이동으로부터 결정하였다.
B. 결과
이 실험에서 얻어진 결과를 도 4에 나타낸다. 4 mM의 농도에서 트리플루살 및 HTB 둘다 완전하게 HUVEC에서 TNF-α에 의해 유도된 VCAM-1 mRNA의 발현을 억제한다. β-액틴 mRNA의 발현에 대한 효과가 없음은 전사인자 NF-κB에 대한 시험 화합물의 선택성을 나타낸다.
실시예 5: 면역 복합체에 의해 유도된 래트 복막 마크로파지에서 iNOS의 발현억제
A. 래트 복막 마크로파지에 의한 NO의 생성 결정
래트 복막 세포를 수득하고, 혈청 부재하에 항생제로 보충된 DMEM 배지에 재현탁하였다. 마크로파지를 배양판에 대한 부착능에 의해 분리한 후, 37 ℃에서 2시간동안 항온배양하였다. 비부착 세포를 제거한 후, 지모산 입자를 삼키는 능력 및 비특이성 에스테라제 염색에 의해 확인되는 바와 같이, 부착 세포의 95 % 이상이 마크로파지임을 확인하였다. 배양판을 37 ℃에서 5 % CO2 대기하에 유지시키고, 판에 부착된 복막 마크로파지를 트리플루살 또는 HTB(모두 0.1∼20 mM)의 존재 또는 부재(대조군)하에 100 ㎍/ml IgG/난백알부민 면역 복합체와 함께 항온배양하였다. 약물을 IgG/난백알부민의 첨가 10분전에 첨가하였고, NO의 생성을 24 시간후 존재하는 아질산염으로 결정하였다.
B. NO 및 아질산염의 측정
iNOS 발현을 간접적으로 NO의 생성으로 측정하였다. 마크로파지 배양으로부터 방출되는 NO는 아질산염의 축적에 의해 간접적으로 측정된다. 세포 배양물(페놀레드 없는 배지의 0.5 백만개의 세포)의 1 ml에 1 mM 술파닐산의 용액 100 ㎕ 및 100 mM HCl을 첨가하였다(최종 농도). 5분 동안의 항온배양 후, 배지를 수거하고, 에펜도르프 미세원심분리에서 원심분리하였다. 50 ㎕ 나프틸렌디아민(1 mM 최종농도)를 첨가하고, 항온배양 15 분 후 샘플의 흡수량을 548 nm에서 측정하였고, NaNO2 표준과 비교하였다. NO의 생성을 nmol NO2/mg 단백질로서 나타내었다.
C. 결과
이 실험에서 수득된 결과를 HTB에 대한 도 5A 및 트리플루살에 대한 도 5B 에 나타내었다. 점은 평균 ±각각 두번씩 수행된 7 내지 9 실험으로부터의 평균 표준오차(SEM)를 나타낸다. 상응하는 그래프로부터 트리플루살 및 HTB에 대해 계산된 IC50 값은 각각 1.13 ±0.12 및 1.84 ±0.34 mM이다.
유사한 결과가 마크로파지를 면역 복합체 대신 LPS와 함께 항온배양한 경우에 수득되었다.
실시예 6: 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC)에서 박테리아 지다당(LPS)에 의해 유도된 COX-2 발현의 억제
A. 인간 단핵 세포의 분리 및 배양
단핵세포(PBMC)를 Sant Pau 병원(바르셀로나)으로부터 혈액 채취 전 2주 이상의 기간동안 항염증 약물을 섭취하지 않은 건강한 공여자의 혈액으로부터 수득하였다. 헤파린화된 인간 혈액(10 U/ml) 약 80 ml의 부피로 시작하여, 이를 칼슘, 마그네슘, 및 중탄산나트륨 없이 PBS(pH 7.4; 둘베코) 희석하였다(1:1).
15 ml의 피콜 용액(20 ℃에서 d=1.077; Biochrom KG)을 50 ml Falcon 튜브에 위치시켰다. 상기 용액에 미리 PBS로 희석된 혈액의 튜브 당 약 25 ml 부피를 조심스럽게 첨가한후, 20 분간 1,200 g 에서 원심분리한다. 단핵세포를 혈장 및 피콜 용액간의 흰 중간상에 집중한다. 이 중간상을 파스퇴르 피펫으로 수합하고, PBS로 1:1 희석한다. 그 다음, 10 분간 300 g에서 원심분리하였다. 생성된 펠렛을 50 ml PBS에서 재현탁하고, 다시 10 분간 200 g에서 원심분리하여 혈소판 오염을 제거한다. 최종적으로, 생성된 펠렛을 10 % 우태혈청으로 보충된 20 ml의 RPMI-1640 배양배지(GibcoBRL)에서 재현탁한다.
분리된 PBMC를 표준 Wright-Giemsa 염색에 의해 분석하여 세포가 생단핵세포의 형태학적 특징을 나타내는지 확인하고, 분리된 상이한 종류의 세포를 결정하였다(평균 90 %의 림프구 및 10 %의 단구). 세포를 2.5 백만/ml의 농도에서 10 %의 우태혈청을 함유하는 RPMI 배지로 희석하고, 6-웰 판(2 ml/웰, 5 백만 PBMC)에서 19시간 동안 항온배양하였다 (37 ℃, 5 % CO2). 항온배양을 10 ㎍/ml의 E. coli 지다당(LPS, 0.26:B6 혈청형; 시그마)의 존재하에 어떠한 약물의 첨가(대조군) 또는 트리플루살 또는 HTB(0.1 ∼5 mM)의 첨가 없이 수행하였다. 항온배양 전에, 세포 생존 조절을 트리판 블루 배제분석을 사용하여 수행하였다. 항온배양후, 샘플(100㎕)을 취하여 세포수를 세고, 미토콘드리아 탈수소효소의 가용성 테트라졸륨 염, MTT를 불용성 생성물 포르마잔으로 전환능을 측정(MTT 분석)함으로써 세포 생존도를 계산하였다. 또한, 세포를 LPS의 첨가없이 동일한 농도에서 HTB 및 트리플루살로 항온배양하였다. 모든 경우에서, 실험의 초기 및 배양 19 시간 후에 세포 생존도는 95 % 이상이다.
B. 면역블롯 분석
배양 후, 세포를 1,000 g에서 5 분간 원심분리하였다. 상층액을 수합하고, COX-2 활성의 척도로서 PGE2 수준의 결정을 위해 - 70℃ 에서 보관하고, 펠렛화된 세포를 5 ml의 PBS에서 재현탁하고, 다시 원심분리하였다(5 분, 1,000 g). 생성된 펠렛을 50 ㎕ 세포 용균 완충액에서 재현탁하고(1 % Nonidet-40 및 1 mM EDTA 함유 PBS), 15 분간 빙냉하에 항온배양하였다. 생성된 혼합물을 20,000 g에서 15 분간 원심분리하고, 상층액을 수합하였다. PBS로 1/20 희석하여 BCA 단백질 분석 시약(Pierce)에 의한 단백질 농도를 결정하였다.
남은 상층액을 겔 로딩 완충액(Tris 50 mM; SDS, 2 % w/v; 글리세롤, 10 % v/v; β-메르캅토에탄올, 50 ㎕/ml 및 브로모페놀 블루 2 mg/ml)으로 1:1 비로 혼합하고, 5 분간 비등하였다. 샘플을 10,000 g에서 2 분간 원심분리한후, SDS-폴리아크릴아미드겔(4 % 스태킹 겔/7.5 % 분리겔)에서 다양한 강도 및 200 V의 고정전위로 앞선이 겔 말단으로부터 수 mm가 될때까지 불연속 전기영동하였다(약 1시간).
단백질을 냉각된 TE 22 Mighty Small Transfer Unit(Hoefer) 시스템을 사용하여 100 V 의 전압에서 2시간 동안 니트로셀룰로즈막으로 이동시켰다. 이동이 완료되었을 때, 막을 밤새 4 ℃의 블로킹 완충액 중에서 교반하였다(0.1 % Tween 20 을 함유하는 TBS 중의 1:4 건조탈지우유).
블로킹된 막을 교반하에 인간 COX-2에 대해 생성된 염소 다클론성 항체(산타크루즈 바이오테크놀로지사)와 함께 1 시간동안 항온배양하고, 세척한후 2차 호스래디쉬 퍼옥시다제 표지된 항체(토끼 항-염소 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제, Immunopure, Pierce)로 1시간 항온배양하고, 단백질에 결합된 항체를 화학발광 (ECL, Amershan)에 의해 가시화하였다.
최종적으로, -70℃ 에서 보관된 각 실험으로부터 상층액을 해동하고, 용액중의 PGE2의 양을 특이적인 ELISA 키트(Amershan-Biotrak RPN22)를 사용하여 결정하였다.
C. 결과
이 실험으로부터 얻어진 결과를 도 6에 나타내었다. 결과는 5 개의 독립적인 실험으로부터 얻어진 두 대표적인 면역 블롯에 상응하고(도 6A: 트리플루살; 도 6B:HTB), 평균 ±상기 실험에 따른 배양물의 상층액중의 PGE2의 정량의 SEM은 상기 실험에 상응한다(도 6C: 트리플루살; 도 6D:HTB). 트리플루살 및 HTB 모두 PGE2 생성 뿐만 아니라 COX-2 발현을 농도-의존적으로 억제한다.
실시예 7: 래트 염증성 삼출 세포에서 COX-2 발현 억제
A. 일반 방법
루이스 래트(175∼200 g)를 이 연구에 사용하였다. 래트를 무작위로 5 마리 동물의 군으로 나누었다. 20 ml의 무균 공기를 견갑골내 부위로 각 군의 동물에 피하 주사에 의해 공기낭을 생성하였다. 이틀 마다, 10 ml의 공기를 다시 강 내로 주입하여 공간이 열어져 있도록 하였다. 공기의 첫 번째 주입 7일후, 2 ml의 1 % 카라기난 용액을 모든 군의 공기낭에 주입하여 염증 반응을 일으켰다. 시험 화합물을 경구로 카라기난 투여 30 분전에 투여하였다. 동물을 6 시간후 도살하고, 삼출물의 부피를 측정하였다. 세포의 종류 및 수를 각각 표준 Wright-Giemsa 염색 및 카울터 카운터 세포 카운터에 의해 결정하였다. 삼출물을 400 g로 4 ℃에서 7 분간 원심분리하고, PGE2 농도를 효소-면역 분석법에 의해 결정하였다(Ameshan-Biotrak RPN222). 세포 펠렛을 2 ml의 차가운 0.85 % NaCl에 재현탁하였다. 적세포 오염을 제거하기 위해, 세포를 선택적 세포 용균을 20 초간 6 ml의 냉수의 첨가에 의해 수행하였다. 세포 현탁액의 등장성을 2 ml 3.5 % NaCl의 첨가에 의해 복구하였다. 최종적으로, 세포 현탁액을 상기 언급된 동일한 조건하에 원심분리하고, 펠렛을 면역블롯 분석을 위해 용균 완충액중에 2 ×108 세포의 밀도로 재현탁하였다(실시예 6 참조).
B. 결과
결과를 도 7에 나타내었다. 7A는 대표적 면역블롯에 상응하고, 도 7B는 평균 ±래트 삼출물 중의 PGE2 의 정량의 SEM를 나타낸다(n=4). 트리플루살(3∼30 mg/kg)의 경구 투여 복용량은 독립적으로 PGE2의 생성뿐만 아니라 삼출물중에 존재하는 COX-2 발현을 억제한다.
실시예 8: 인간 단구 세포주 THP-1에서 면역 복합체에 의해 유도된 단구 화학주성 단백질-1(MCP-1)의 발현 억제
A. 세포 배양 및 MCP-1 수준의 결정
인간 단구 THP-1 세포(3 ×106 세포/웰)을 플라스틱 접시에 페니실린(100 U/ml), 스트렙토마이신(100 ㎍/ml), 겐타마이신(50 ㎍/ml), 글루타민(2 mM) 및 2 % 열 불활성 우태혈청으로 보충된 RPMI 1640 배양 배지에서 배양하였다. 세포를 HTB(2 및 4 mM) 또는 운반체 존재하에 배양하였고, 100 ㎍/ml 면역 복합체 응집물 (A-IgG)로 활성화하였다. 가용성 MCP-1의 생성을 시판되는 키트(R&D Systems Inc.;Minneapolis, MN)를 사용하여 ELISA에 의해 결정하였다. 시스템의 탐지 한계는 5 pg/ml이었다.
B. 결과
이 분석에서 얻어진 결과를 도 8에 나타내었다. HTB는 4 mM 및 2 mM의 농도에서, THP-1에서 면역 복합체에 의해 유도된 MCP-1 발현의 완전한 억제를 일으켰다.
실시예 9: 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 박테리아 지다당(LPS)에 의해 유도된 TNF-α의 발현 억제
A. 인간 단핵 세포의 분리 및 배양
단핵 세포(PBMC)를 Sant Pau 병원(바르셀로나)의 건강한 공여자의 혈액으로부터 수득하였고, 실시예 3에 기재된 공정을 하였다. 세포를 10 % 우태혈청으로 보충된 RPMI 배지에서 2 백만/ml의 농도로 희석하였고, 10 ㎍/ml E.coli 지다당(LPS, 026:B6 혈청형; 시그마)의 존재하에 19 시간동안 트리플루살, HTB 또는 운반체(DMSO)와 함께 항온배양하였다. 세포 현탁액을 2,000 g, 4 ℃에서 10 분간 원심분리하였고, 생성된 상층액을 후 분석을 위해 -70 ℃에서 보관하였다. 사이토카인 함량을 샘플의 1/100 희석후, 효소 면역 분석법에 의해 결정하였다.
B. 결과
이 실험에서 트리플루살 및 HTB로 얻어진 결과를 도 9에 나타내었다. 트리플루살 및 HTB(1 및 0.3 mM) 둘다 거의 완전히 LPS-유도 TNF-α생성을 억제한다. 결과를 평균 ±각각 3회 반복수행된 2∼5의 별개의 실험으로부터 평균 표준오차로 나타내었다.
실시예 10: 생후 롱 에반스 검은 머리 래트(Long Evans black hooded rat) 신경교 세포에서 NF-κB의 활성화 억제
A. 일반 방법
이 연구를 생후(P9) 롱 에반스 검은 머리 래트를 사용하여 수행하였다. 각 군은 실험 부위에 실행되는 6 마리 및 동일령의 두 마리의 대조군으로 구성된다. 실험 부위는 N-메틸-D-아스파르테이트(NMDA)의 피하 주사(감각운동 부위)에 의해 유도되었고, 이는 심한 국소 뉴런의 변성을 일으킨다. 트리플루살(30 mg/kg)를 3 복용량으로 (7 일 부터 9일 까지) 매 24 시간마다 경구투여하였다. 신경교 반응성을 최종 트리플루살 복용 한시간후, 생후 9일령에 NMDA 주사에 의해 유도하였다. 최종 투여후, 상이한 시간(2∼24 시간)에 동물을 도살하고, 뇌를 꺼내어, 저온유지장치에서 절단하고, 절단 부위를 면역세포화학 및 조직화학 기술을 사용하는 공정을 거쳐 NF-κB 활성화를 소교세포 및 대교세포에서 이중 염색(NF-κB-렉틴 및 NF-κB-GFPA)을 사용하여 결정하였다. 병행하여, 단편을 비브라톰상에서 절단하여 소교세포 및 대교세포 반응성의 정도를 조직효소적 기술에 의해 결정하였다(B. Castellano et al., J.Histochem. Cytochem.,1991,39(5), 561∼568).
B. 결과
대조군 동물에서, 신경교세포를 제외한 피질의 뉴런은 구성적으로 활성화된 NF-κB를 나타낸다. 이 기저 활성화는 트리플루살로 예비처리에 의해 억제된다. 독성자극 부위가 NMDA로 수행되는 동물에서, NF-κB의 빠른 활성화가 신경교세포에서 관찰된다. 30 mg/kg p.o. 트리플루살로 예비처리는 대교세포 및 소교세포에서 완전히 NF-κB 활성화를 억제한다.
실시예 11: 뉴런 및 산소/글루코스 부족(OGD)에 의해 유도된 대교세포의 공배양에서 트리플루살에 의한 뉴런 세포의 치사 예방
A. 일반방법
이 연구를 수행하기 위해, 뉴런 및 신경교세포의 공배양을 기초로한 뉴런 국소빈혈의 시험관 모델을 사용하였다. 1 형의 대교세포의 1차 배양을 1일령 위스터(Wister) 래트로부터 준비하였다. 대교세포를 60 mm, 폴리-D-라이신-코팅판 상에 위치시켰다. 세포가 콘플루언트(confluent)할 때까지 성장시킨 후(약 11일), 1차 래트 뉴런을 세포위에 깔고, 10일간 성장시킨다. 부가적으로, 두종류의 세포중 각 하나의 분리 배양을 준비하였다.
배양의 반을 4 시간동안 산소-글루코스 부족(OGD)에 노출시킨후, 24 시간 회복 기간을 주었다. 두 세포 모두 OGD에 노출시켰고, 대조군 세포를 OGD의 개시시 한 실험의 일련으로 0, 10 및 30 ㎍/ml 트리플루살로, 또 다른 일련으로 0, 20 및 100 ㎍/ml HTB로 처리하였다. 24 시간 회복 기간후에, 배지로의 락테이트 탈수소효소(LDH)의 방출을 세포 치사, 배양중의 세포의 아포토시스(apoptpsis) 정도의 측정(TUNEL 분석 사용), 및 공 배양중에 존재하는 총 뉴런 및 대교세포 수(Hoescht 염색 사용)로서 결정하였다.
B. 결과
OGD에 노출된 배양중에, 대조군에 비해 아포토시스를 일으킨 뉴런의 수 뿐만 아니라 LDH 방출의 눈에 띠는 증가가 관찰되었다. 이 연구에서 시험된 트리플루살 또는 HTB의 다양한 농도는 완전히 두 효과 모두 억제하였다. 그러므로, 이 모델에서 트리플루살 및 그의 대사산물인 HTB는 아포토시스 및 산소 및 글루코스 부족에 의해 유도되는 뉴런 변성을 예방할 수 있다.
실시예 12: 래트에서 보강제-유도 관절염의 억제
A. 관절염 유도
보강제-유도 관절염은 보강제 주사후 14일부터 여러 관절에서 염증 세포 및 사이토카인의 축적으로 면역 기원의 만성 염증의 발달을 특징으로 한다.
이 연구를 위해, 100 내지 150 g의 체중을 갖는 수컷 루이스 래트를 사용하였다. 연구시작 전, 동물을 5일 이상의 기간동안 순응시켰다. 연구전 18 시간동안 임의로 물로 단식시켰다.
연구를 통해, 동물을 관찰기간동안을 제외하고, 물을 마시는 데는 자유롭게 접근하게 하였다.
5 마리의 군을 무작위로 형성하였다(샴(Sham), 대조군 및 트리플루살). 연구 기간은 28 일 이었다. 관절염을 1일 연구에 대조군 및 트리플루살 군의 동물의 오른쪽 뒷 다리로 10 mg M. butyricum 및 10 ml 프로운트(Freund's) 불완전 보강제(Difco)로 형성된 0.1 ml의 에멀션을 발바닥아래 주입함으로써 유도하였다. 샴 동물은 0.1 ml의 프로운트 불완전 보강제를 주었다. 트리플루살을 연구 1일부터 매일 트윈(Tween) 80(1 %) 중에 10 mg/kg p.o.의 복용량으로 투여하였다. 관절염의 발달의 28일에, 보강제 주입의 수여에 대한 부피는 UGO BASILE 7150 혈량계를 사용하여 결정하였다. 부피의 증가의 억제를 하기와 같이 계산하였다:
% 억제 = 100 - ((T - S)/(C - S)) * 100
[식중, T = 트리플루살 군; C = 대조군; 및 S = 샴 군이다].
B. 결과
28일 동안 10 mg/kg의 복용량으로 트리플루살의 경구투여는 M. butyricum 및 대조군의 보강제에 의해 유도된 면역 기원의 부피에서 63.1 ±8.0 % 억제를 일으켰다.
실시예 13 : HTB의 투여후 다양한 세포주의 생존도 연구
A. 일반 방법
아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)로부터 수득된 여러 세포주를 37 ℃ 및 5 %의 CO2 대기하에 배양하였다. 각 세포주를 적당한 배양 배지에서 지수적으로 성장시켰다(표 Ⅰ).
세포주 배양 배지
U-937 (인간 조직구의 림프종) RPMI 1640 + 10 % FCS
143.98.2 (인간 골육종) DMEM + 10 % FCS
1321N1 (인간 대교세포) DMEM + 5 % FCS + 0.5 % 페니실린-스트렙토마이신
Jurkat (인간 급성 T 세포 백혈병) RPMI 1640 + 10 % FCS
COLO 205 (인간 결장 선암) RPMI 1640 + 10 % FCS
세포 생존도 연구를 위해, 0.5 ×106 세포/ml(24 시간 연구를 위해), 0.25 ×106 세포/ml(48-시간 연구를 위해) 또는 0.125 ×106 세포/ml(72 시간 연구를 위해)이 항온 배양된 24-웰 판이 사용되었다. 다음, 상이한 농도의 HTB(1∼3 mM)을 첨가하였고 세포를 상이한 시간동안 항온배양하였다(37 ℃, 5% CO2). 항온배양후, 각 웰로부터 상층액을 추출하였고, 세포를 우태혈청 배양 배지로 세척하였다. 그 다음, 상층액을 추출하였고, 우태혈청 없이 200 ㎕ 배양 배지를 각 웰에 첨가하였다. 또한, 20 ㎕의 기질을 첨가하여 세포 생존도를 결정하였다. 이 방법은 생세포의 무색 기질을 상층액 중에 분비되는 유색 기질로 전환시키는 능력에 기초한다(EZ4U, 바이오메디카 게엠베하). 37 ℃ 및 5 % CO2에서 1 시간 동안 세포를 항온배양한후, 200 ㎕ 상층액을 수합하고, 흡수량을 450 nm에서 측정하였다. 흡수량을 비특이성 값을 나타내는 척도로서 620 nm에서 측정하였다.
B. 결과
세포 생존도 측정의 결과를 표 Ⅱ에 나타내었다. HTB로의 항온배양은 시험된 다양한 세포주의 세포 치사를 초래한다. 이 세포 치사는 농도 및 시간 의존적이다.
세포 생존도의 백분율
U-937 0 시간 2 시간 5 시간 24 시간 48 시간 72 시간
1 mM HTB 100 100 98.8 74.4 4.8 4.8
3 mM HTB 100 96.1 92.6 13.9 7.5 N.D.
JURKAT 0 시간 2 시간 5 시간 24 시간 48 시간 72 시간
1 mM HRB 100 100 76.8 11.3 3.6 1.6
3 mM HTB 100 100 62.6 6.2 5.4 N.D.
1321N1 0 시간 2 시간 5 시간 24 시간 48 시간 72 시간
1 mM HTB 100 99.7 94.2 87.5 67.6 N.D.
3 mM HTB 100 85.3 67.2 62.2 17.8 N.D.
COLO 205 0 시간 2 시간 5 시간 24 시간 48 시간 72 시간
1 mM HTB 100 100 87.2 84.8 37.4 7.6
3 mM HTB 100 94.5 69.2 39.6 14.3 N.D.
143.98.2 0 시간 2 시간 5 시간 24 시간 48 시간 72 시간
1 mM HTB 100 100 100 93.9 83.2 50.4
3 mM HTB 100 98.1 82.7 52.2 16.1 N.D.
N.D.: 측정되지 않음
실시예 1, 2 및 3에 기재된 분석 결과는 트리플루살 및 HTB가 전사인자 NF-κB의 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다. 또한 이 억제는 유도제 및 세포의 종류와는 독립적이라는 것을 보여준다. 이러한 결과는 NF-κB가 관련된 장애의 치료 또는 예방에서 트리플루살 및 HTB의 유용성을 나타낸다.
실시예 4의 결과는 트리플루살 및 HTB 가 VCAM-1 발현을 억제함을 나타낸다. VCAM-1 유전자는 NF-κB 결합 부위를 가짐이 기재되어 있다(C. Weber et al., Arterioscler. Thromb. 1994, 14(10). 1665∼1673). VCAM-1과 같은 부착분자가 죽상동맥경화증(K.D. O'Brien et al., J. Clin. Invest. 1993, 92, 945∼951), 류마티스성 관절염, 루푸스, 다발성 경화증, 염증성 장질환, 천식, 알레르기성 비염 및 종양 전이와 같은 장애에 관련되어 있다는 것을 나타낸다. NF-κB 활성화 및 VCAM-1 발현을 억제함으로써, 트리플루살 및 HTB 둘다 상기 언급된 모든 것들 특히 죽상동맥경화증과 같은 VCAM-1 매개 장애의 치료 또는 예방에 특히 유용할 수 있다.
실시예 5 에서, 트리플루살 및 HTB는 또한 NF-κB에 의해 적어도 부분적으로 전사수준에서 조절되는 iNOS 발현을 억제하는 것을 나타낸다(U. Forstermann et al., Biochem. Pharmacol. 1995, 50(9), 1321∼1332). iNOS가 염증, 패혈성 쇼크, 염증성 장질환 및 치매 및 파킨슨 질환과 같은 신경퇴행성 질환과 같은 병에 관련되어 있음을 나타낸다(J.E.Ogden and P.K.Moore, Trends Biotechnol. 1995, 13(2), 70∼78). NF-κB 활성화 및 iNOS 발현의 억제에 의해, 트리플루살 및 HTB는 iNOS 매개 장애, 구체적으로 염증, 패혈성 쇼크, 염증성 장질환 및 치매 및 파킨슨 질환과 같은 신경퇴행성 질환의 치료 또는 예방에 특히 유용할 수 있다.
실시예 6 및 7의 결과는 트리플루살 및 HTB가 시험관내 및 생체내에서 COX-2 발현을 억제함을 나타낸다. COX-2를 코딩하는 유전자가 NF-κB 결합부위를 갖는다는것이 기재되어 있다(S.B.Appleby et al., Biochem.J.1994, 302, 723∼727). COX-2가 류마티스성 관절염 및 기타 관절염 증상, 관절증, 조산, 치매, 특히 알츠하이머 질환(T.A.Sandson and O.Felician, Exp. Opin. Invest. Drugs, 1998, 7(4), 519∼526) 및 암(M.Oshima et al., Cell 1996, 87(5), 803∼809; K. Subbaram)과 같은 병과 연관되어 있다. NF-κB 활성화 및 COX-2 발현을 억제함으로써, 트리플루살 및 HTB는 COX-2 매개 장애, 구체적으로 류마티스성 관절염 및 기타 관절염 증상, 관절증, 조산, 치매 및 암의 치료 또는 예방에 특히 유용할 수 있다.
실시예 8의 결과는 HTB가 NF-κB에 의해 적어도 부분적으로 전사 수준에서 조절되는 MCP-1 발현을 또한 억제함을 나타낸다(T.Martin et al., Eur. J. Immunol. 1997, 27(5), 1091∼1097). 과도한 또는 조절되지 않은 MCP-1 생성은 사구체신염(B.H.Rovin et al., Lab. Invest. 1994, 71(4), 536∼542), 류마티스성 관절염(P.M.Villiger et al., J.Immunol. 1992, 149(2), 722∼727), 폐 섬유증(H.N.Antoniades et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89(12), 5371∼5375), 재발성협착증, 천식, 건선, 염증성 장질환, 다발성 경화증 및 이식거부와 같은 장애에 관련되어 있음이 기재되어 있고, 이것은 마크로파지가 풍부한 죽상통맥경화의 플라크 중에 탐지되는 가장 유능한 화학주성 인자이다(S. Yla-Herttuala et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88(12), 5252∼5256). NF-κB 활성화 및 MCP-1 발현을 억제함으로써, 트리플루살 및 HTB는 상기 언급된 것들과 같은 MCP-1 매개 장애의 치료 또는 예방에 특히 유용할 수 있다.
실시예 9의 결과는 트리플루살 및 HTB가 NF-κB에 의해 적어도 부분적으로 전사 수준에서 조절되는 TNF-α의 발현을 억제함을 나타낸다(J. Yao et al, J. Biol. Chem. 1997, 272(28), 17795∼17801). 과도한 또는 조절되지 않은 TNF-α 생성은 류마티스성 관절염, 류마티스성 척추염, 통풍성 관절염 및 기타 관절염 증상, 관절증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 내독성 쇼크, 독성 쇼크증, 성인호흡곤란증, 뇌 말라리아, 만성폐렴질환, 규폐증, 폐 유육종증, 폐 섬유증, 간염, 골다공증 및 기타 골흡수질환, 재관류 손상, 이식거부, 다발성 경화증, 루푸스, 감염으로 인한 열 및 근육통, 악액질, 후천성 면역 결핍증(AIDS), 염증성 장질환 및 열병과 같은 광범위의 장애에 관련되어 있음이 기재되어 있다(L. Sekut y K.M. Connolly, Drug News Perspect. 1996, 9(5), 261∼269). NF-κB 활성화 및 TNF-α 발현을 억제함으로써, 트리플루살 및 HTB가 상기 언급된 것들과 같은 TNF-α매개 장애의 치료 또는 예방에 특히 유용할 수 있다.
실시예 11, 12 및 13의 결과는 신경퇴행성질환, 관절염 및 암 각각의 치료 또는 예방에 트리플루살 및 HTB의 유용함을 나타낸다.
실시예 1 내지 13에 기재된 실험에서 효과가 관찰되는 농도는 경구로 인간에 통상 사용되는 트리플루살의 치료적인 복용량에 도달된다.
본 명세서에서 언급한 것에 의해 제한되지 않고, 트리플루살 및 HTB에 의한 VCAM-1, iNOS, COX-2, MCP-1 및 TNF-α와 같은 단백질 발현의 억제는 전사인자 NF-κB의 활성화의 억제에 의해 적어도 부분적으로 매개된다고 여겨진다. 이러한 단백질을 코딩하는 유전자의 발현은 기타 제제에 의해 활성화될 수 있다고 공지되어 있다. 트리플루살 및 HTB가 이러한 유전자(COX-2의 경우, 시험관내 및 생체내 모두)의 발현을 억제하는 것을 본 발명에서 나타내었기 때문에,두 생성물 모두 또한 NF-κB에 독립적인 이러한 유전자의 증가된 발현이 있는 장애의 치료 또는 예방에 유용할 수 있으며, 이는 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

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  42. 하기 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 재발협착증(restenosis)의 치료 또는 예방용 약학 조성물:
    [화학식 Ⅰ]
    Figure 112006092582545-pct00019
    [식중, R은 수소 또는 COCH3를 나타낸다].
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