KR20090125077A

KR20090125077A - 염증 질환 치료를 위한 새로운 조합

Info

Publication number: KR20090125077A
Application number: KR1020097018088A
Authority: KR
Inventors: 요한 라우드
Original assignee: 카르도스 아베
Priority date: 2007-03-30
Filing date: 2008-03-31
Publication date: 2009-12-03
Also published as: CN101668521A; DE602008004469D1; WO2008119988A1; CA2682572A1; US20100056552A1; EP2129368A1; IL201168A0; MX2009010477A; ES2385940T3; ZA200906188B; ATE494892T1; BRPI0809302A2; EP2129368B1; AU2008234667A1; JP2010523486A; EA200901327A1

Abstract

본 발명은 (a) 서플라타스트 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물; 및 (b) 스타틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 포함하는 조합 산물을 제공한다. 조합 산물은 죽상경화증과 이와 관련있는 병태를 치료하는데 특히 유용하다.

Description

염증 질환 치료를 위한 새로운 조합{NEW COMBINATION FOR USE IN THE TREATMENT OF INFLAMMATORY DISORDERS}

본 발명은 신규한 약학적 조합에 관한 것이다.

관상 심장 질환 및 발작과 같은 심혈관 질환은 특히 선진국에서의 사망, 장애 및 건강관리 지출의 주된 요인이다. 이러한 질환은 흡연자 및/또는 고혈압, 당뇨병, 고콜레스테롤 혈증, 저밀도 지단백질(LDL) 및 트리글리세라이드의 증가와 같은 위험 요인이 있는 개체들에서 주로 발병하는 다인성 병태인 죽상경화증의 직접적인 결과이다.

죽상경화증 병변(또는 플라그)은 흔히 수년간 때로는 수십년간에 걸쳐 진행된다. 동맥벽의 콜레스테롤 축적, 포말 세포(foam cell) 생성, 염증 및 세포 증식과 같은 병리학적 진행이 일반적으로 이루어진다.

고밀도 지단백질(HDL), LDL, 총 콜레스테롤 및 트리글리세라이드의 농도는 모두 죽상경화증, 및 관상 동맥 질환(예, 협심증, 심근 경색증 등), 발작(뇌혈관 질환 및 일과성 허혈성 발작이 포함됨) 및 말초 동맥 폐색증과 같은 관련있는 심혈관 장애의 발병 위험성을 결정하는 지표이다.

총 콜레스테롤 및/또는 트리글리세라이드의 수치가 높은 환자는, 환자의 HDL 수치가 양호한지의 여부와는 상관없이, 유의한 위험성 수준에 있다. 총 콜레스테롤 수치는 정상이지만 HDL 수치는 낮은 환자 역시 증가된 위험성을 갖는다. 최근들어, 또한, 아포리포단백질 B(ApoB: 초저밀도 지단백질(VLDL) 및 LDL 형태로 지질을 수송함)의 수치가 높고, 및/또는 아포리포단백질 A-I(ApoA-I; HDL 형태로 지질을 수송함)의 수치가 낮은 경우의 심혈관 질환의 위험 수준은 매우 높은 것으로 나타났다.

혈청내 LDL 수치를 낮추는 약물은 죽상경화성 플라그의 발생을 감소시킬 수 있으며, 플라그 파열 및 이와 관련있는 혈전색전성 합병증의 위험성을 (장기간) 감소시킬 수 있다. 혈중 콜레스테롤 수치의 감소에 도움이 되는 여러가지 타입의 약물들이 있다. 가장 일반적으로 처방되고 있는 약물은, 심바스타틴 및 아토르바스타틴 등의 하이드록시메틸글루타릴-CoA(HMG-CoA) 리덕타제 저해제(이하, 일반 명칭과 상관없이 "스타틴"이라고 함)이다. 이 약물은 간에서의 콜레스테롤의 생성을 직접적으로 예방하여, 심혈관 질환의 위험성을 감소시킨다.

그외 처방되고 있는 약물 카테고리로는, 담즙산과의 결합에 의해 작용하여 간으로 하여금 담즙산을 더 많이 생산하게 하여 그 과정에서 콜레스테롤을 소모시키는 수지(콜레스티라민 및 콜레스티폴)가 있다. 추가로, 비타민 B 니아신이 고투여량에서 트리글리세라이드와 LDL 수치를 낮추며 HDL 수치를 증가시키는 것으로 보고되었다. 피브레이트(예, 겜피브로질 및 페노피브레이트)는 트리글리세라이드를 낮추고, HDL 수치를 높일 수 있는 것으로 알려져 있다.

스타틴과 같은, 콜레스테롤을 낮추는 약물의 도입으로 관상 심장 질환 및 발 작으로 인한 사망률이 현저하게 낮아지고 있다. 그러나, 이들 약물은 환자들 모두에게 동일하게 효과적이지는 않다는 문제점이 있으며, 특정한 부작용(예, 간 기능 변화, 근질환, 횡문근 용해증(rhabdomyolysis))이 있는 것으로 알려져 있으며, 죽상경화증은 주된 사망 및 장애 요인으로 남아있다. 실제, 최근 리뷰 논문(Briel et al, JAMA, 295, 2046 (2006))에서는, 급성 관상 증후군을 앓고 있는 환자의 처음 4달간의 치료 시기에, 스타틴이 중증 심혈관 질환 발생을 낮추지 못하는 것으로 기술하고 있다.

따라서, 죽상경화증과 이와 관련있는 심혈관 장애를, 특히 급성 관상 증후군을 앓고 있는 환자들에서, 보다 안전하고 및/또는 보다 효과적으로 치료하기 위한 실질적인 임상 필요성이 제기되고 있다.

서플라타스트(suplatast)는 Th2 세포로부터 IL-4와 IL-5의 분비 뿐만 아니라 비만 세포로부터 화학적 매개체의 분비를 저해하는 Th2 사이토카인 저해제이다. 서플라타스트는 따라서 천식, 알레르기성 비염, 아토피 피부염, 간질성 방광염 및 만성 비세균성 전립선염과 같은 병태의 치료제로 기술되어 있다. 예컨대, Tamoaki, Allergology International, 53, 55 (2004) and Suwaki et al, International Immunopharmacology, 1, 2163 (2001)을 참조한다. 또한, 서플라타스트는 급성 호산구성 신근염에 가능성있는 치료제로 기재되어 있다(Umemoto et al, Heart Vessels, 18, 100 (2003)).

미국 특허 공개 번호 2007/0014733에는 네비볼롤(nebivolol)의 대사산물을 포함하는 심혈관 장애 치료용 약제 조성물이 기술되어 있다. 서플라타스트는 상기 한 조성물에서 이러한 대사산물과 조합될 수 있는 수많은 활성 성분들 중 한가지로 열거되어 있다.

미국 특허 공개 번호 2006/0135577 및 2006/0148830에는 특히 비뇨계, 염증 등의 장애에 사용하기 위한 LPA 수용체(특히, EDG-2 수용체)의 신규 길항제가 개시되어 있다. 서플라타스트 및 스타틴은 이런 신규 화합물과 조합될 수 있는 여러가지 많은 활성 성분들로 각각 언급되어 있다.

미국 특허 공개 번호 2003/0104048에는 외피에 캡슐화된 약학적으로 활성인 성분을 포함하는 친수성 계면활성제-함유 충진제를 포함하는, 신규한 약제학적 조제를 개시하고 있다. 본원에 언급된 것들 중 일부가 포함된 여러가지 화합물들이 상기 조제 형태로 사용하기 위한 가능성있는 수많은 약물 후보물질들 중 하나로 열거되어 있다.

마지막으로, 미국 특허 공개 번호 US 2006/0084695에는 죽상경화증 등의 심혈관 병태 치료에 이용하기 위한 MAP 키나제의 저해제 및/또는 HMG-CoA 리덕타제의 저해제가 개시되어 있다.

특히 서플라타스트 및 스타틴을 포함하는 조합 제품의 사용은 전술한 문헌들 어디에도 구체적으로 개시되어 있지 않다. 또한, 이러한 조합 제품을 죽상경화증과 이와 관련있는 심혈관 장애, 특히 급성 관상 증후군을 앓고 있는 환자들을 치료하는데 사용하는 것에 대한 내용은 이들 문헌들 어디에도 언급되어 있지 않다.

본 발명은,

(a) 서플라타스트 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물; 및

(b) 스타틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 포함하는 조합 산물을 제공하며,

상기 조합 산물은 이하 "본 발명의 조합 산물"이라 한다.

"스타틴"이라는 표현은 하나 이상의 스타틴을 포함한다. "스타틴" 및 "HMG-CoA 리덕타제 저해제"는 본 발명의 내용에서 동의어로 사용되며, 플루바스타틴(fluvastatin), 심바스타틴(simvastatin), 로바스타틴(lovastatin), 로수바스타틴(rosuvastatin), 피타바스타틴(pitavastatin), 글렌바스타틴(glenvastatin), 세리바스타틴(cerivastatin), 프라바스타틴((pravastatin), 메바스타틴((mevastatin), 베르바스타틴((bervastatin), 달바스타틴((dalvastatin) 및 아토르바스타틴(atorvastatin)을 포함한다..

언급될 수 있는 그외 스타틴으로는, 액시테메이트(acitemate), 벤플루오렉스(benfluorex), 클레스틴(clestin), 콜레스톨론(colestolone), 디하이드로메비놀린(dihydromevinolin), 메글루톨(meglutol), 로소놀(rawsonol) 뿐만 아니라 다음의 코드 네임: ATI-16000, BAY-10-2987, BAY-x-2678, BB-476, BIO-002, BIO-003, BIO-2, BMS-180431, CP-83101, DMP-565, FR-901512, GR-95030, HBS-107, KS-01-019, L-659699, L-669262, NR-300, P-882222, PTX-023595, RP 61969, S-2468, SC-32561, sc-45355, SDZ-265859, SQ-33600, U-20685의 화합물과, NO-강화/방출성 스타틴, 예컨대 NCX-6560(니트로프라바스타틴(nitropravastatin))이 있다.

보다 바람직한 스타틴으로는, 피타바스타틴(pitavastatin)(예, Livalo^®, Pitava^®)이 있으며, 더 바람직하기로는, 플루바스타틴(fluvastatin)(예, Lescol^®), 심바스타틴(simvastatin)(예, Zocor^®, Lipex^®), 로바스타틴(lovastatin)(예, Mevacor^®, Altocor^®), 로수바스타틴(rosuvastatin)(예, Crestor^®), 프라바스타틴(pravastatin)(예, Pravachol^®, Selektine^®, Lipostat^®) 및 아토르바스타틴(atorvastatin)(예, Lipitor^®, Torvast^®)이 있다. 특히 바람직한 스타틴은 심바스타틴이고, 특히 아토르바스타틴, 보다 특히 로수바스타틴이다.

언급할 수 있는 약학적으로 허용가능한 염으로는 산 부가 염과 염 부가 염이 있다. 이러한 염은 통상적인 수단에 의해, 예컨대 활성 성분의 유리 산 또는 유리 염 형태를 1 당량 이상의 적합한 산 또는 염기와 선택적으로 용매 중에서 또는 염이 용해될 수 없는 매질 중에서 반응시키고, 상기 용매나 매질을 표준 기법(예, 진공하, 동결 건조에 의해 또는 여과에 의해)으로 제거함으로써, 만들 수 있다. 또한, 염은 예컨대 적합한 이온 교환 수지를 이용하여 염 형태의 활성 성분의 카운터-이온을 다른 카운터-이온으로 교환함으로써 제조할 수 있다.

서플라타스트의 바람직한 염은 서플라타스트 토실레이트이다.

바람직한 스타틴 염은 피타바스타틴 칼슘, 플루바스타틴 소듐, 프라바스타틴 소듐, 로수바스타틴 칼슘 및 아토르바스타틴 칼슘과 같은 소듐염, 포타슘염 및 칼슘염이다.

본 발명의 조합 산물에 사용되는 활성 성분 및 특히 서플라타스트는 부분입체이성체가 농화된(diastereomerically-enriched) 형태 및/또는 거울상이성체가 농화된(enantiomerically-enriched) 형태로 사용될 수 있다. "부분입체이성체가 농화된" 및 "거울상이성체가 농화된"이라는 것은, 각각 한가지 이성체가 다른 이성체 보다 높은 비율로 존재하는, 활성 성분의 부분입체이성체 혼합물/거울상이성체 혼합물임을 의미한다. 예로, 광학 순도가 90%% 이상인 거울상이성체(예, 서플라타스트)를 사용할 수 있다(거울상이성체 과잉(enantiomeric excess); e.e).

본 발명의 조합 산물은 이하 명시된 서플라타스트를 본원에서 정의된 스타틴과 병용(in conjunction with) 투여하는 것으로 제공하며, 따라서 하나 이상의 제형이 서플라타스트를 포함하고 하나 이상의 제형이 스타틴을 포함하는 개별 제형으로 제시되거나, 또는 조합 조제물(즉, 서플라타스트와 스타틴이 포함된 하나의 제형으로 존재)로서 제시(즉, 제형화)될 수 있다.

따라서, 본 발명은 추가적으로 하기를 제공한다:

(1) 서플라타스트 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물; 스타틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물; 및 약학적으로 허용가능한 보강제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약학 제형(제형은 이하 "조합 조제물"이라 함); 및

(2) (A) 서플라타스트 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 약학적으로 허용가능한 보강제, 희석제 또는 담체와 혼합된 형태로 포함하는 약학 제형; 및

(B) 스타틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 약학적으로 허용가능한 보강제, 희석제 또는 담체와 혼합된 형태로 포함하는 약학 제형을 포함하며,

성분 (A)와 (B)는 각각 서로 병용 투여하기에 적합한 형태로 제공되는, 키트.

본 발명의 다른 측면은, 상기 성분 (A)를 상기 성분 (B)와 조합하여, 2가지 성분이 서로 병용 투여하기에 적합하게 만드는 것을 포함하는, 전술한 키트의 제조 방법을 제공한다.

2가지 성분을 서로 "조합"하는 것은, 키트의 성분 (A) 및 (B)가

(i) 이후 조합 요법에서 병용하기 위해 합쳐지는, 개별 제형(즉, 서로 독립적)으로서 제공되거나; 또는

(ii) 조합 요법에서 병용하기 위한 "조합 팩"의 개별 성분으로서 함께 패키지되어 존재될 수 있는 것을 포함한다.

따라서, (I) 전술한 성분 (A) 및 성분 (B) 중 하나;

(II) 상기 성분을 2가지 성분 중 다른 성분과 병용 투여하여 사용하기 위한 사용 안내서를 포함하는, 키트를 추가로 제공한다.

본원에 언급된 키트는 반복 투약을 위해, 적절한 양/용량의 서플라타스트/염/용매화물을 포함하는 2가지 이상의 제형, 및/또는 적절한 양/용량의 스타틴/염/용매화물을 포함하는 2가지 이상의 제형을 포함할 수 있다. 2가지 이상의 제형(활성 화합물 중 하나를 포함함)이 제시된다면, 이러한 제형은 각 화합물, 화학 조성(들) 및/또는 물리적 형태(들)의 투약 측면에서 동일하거나, 또는 상이할 수 있다.

본 발명의 조합 산물에 사용되는 스타틴은 바람직하기로는 이른바 "스타틴 락톤" 형태일 수 있다. 본 발명의 조합 산물은 피타바스타틴 락톤, 메바스타틴 락톤, 바람직하기로는 플루바스타틴 락톤, 로수바스타틴 락톤, 프라바스타틴 락톤 및 아토르바스타틴 락톤, 특히 로바스타틴 락톤 및 심바스타틴 락톤을 포함할 수 있다.

본 발명의 조합 산물은 염증 병태의 치료에 유용성이 있다. 염증 병태는 전형적으로 숙주에 이롭기보다는 해로운 효과를 초래하는 면역 방어 메카니즘의 활성화가 특징이다. 이러한 병태는 일반적으로 다양한 수준의, 조직 발적 또는 충혈, 부종, 이상 고열, 통증, 가려움, 세포 사멸 및 조직 파괴, 세포 증식 및/또는 기능 상실과 관련있다. 언급될 수 있는 염증 병태로는, 알레르기(알레르기성 결막염 및 당뇨병성 비염 포함), 강직성 척추염, 천식, 아토피 피부염, 만성 폐색성 폐 질환, 접촉성 피부염, 방광염, 통풍성 관절염, 염증성 장 질환(예, 크론 질환 및 궤양성 대장염), 다발성 경화증, 골관절염, 췌장염, 전립선염, 건선, 건선 관절염, 류마티스 관절염, 건염, 활액낭염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 포도막염, 두드러기, 당뇨병성 혈관 합병증, 편두통, 죽상경화증 및 관련 심혈관 장애가 있다. 언급할 수 있는 병태로는, 편두통, 더 바람직하기로는 천식, 만석 폐색성 폐질환, 크론 질환, 다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 궤양성 대장염, 특히 죽상경화증 및 관련 심혈관 장애가 있다.

"죽상경화증"이라는 용어는 혈관, 특히 동맥벽에 콜레스테롤의 축적, 포말 세포 형성, 염증 및 세포 증식을 특징으로 하는 모든 질환을 포함하는 것으로 당업자에게 이해될 것이다. 죽상경화증과 "관련있는" 심혈관 장애로는 대동맥류(aortic aneurysm)(복부 및/또는 죽상경화성 대동맥류 포함), 더 바람직하게는, 죽상경화증, 말초 동맥 폐색성 질환, 관상 동맥 질환(예, 협심증, 심근 경색, 심장 마비 등), 관상 질환(허혈성심장병과 같은 심장병(cardiac disease 및 heart disease)이 있으며, 또한, 플라그 또는 죽종 파열 및/또는 불안정성, 혈관 또는 동맥의 질환, 허혈성 질환/허혈증 및 발작(뇌-혈관 발병 및 일과성 허혈성 발작 포함)을 포함할 수도 있다.

언급될 수 있는 환자 그룹은 관상 증후군을 가진 환자를 포함한다. 용어 "급성 관상 증후군(들)"은 당업자는 모든 비정상적인 심근 상태 및 허혈성 상태를 포함하지만, 전적으로 흉통 및/또는 비정상적인 심전도(ECG)와 연관되는 것은 아닌 것으로 이해할 것이다. 이러한 증후군들은 심근 경색(심장 마비)의 가장 일반적인 징후이다. 당업자는, 이런 용어가 대게 용어 "불안정형 협심증"과는 동의의이고 "안정형 협심증"(즉, 힘쓰는 동안에 발생하고 휴식하는 동안에 해소되는 협심증)과는 대치되는 것으로 인지할 것이다. 마찬가지로 당업자는 악화되는 비율로 발생하는("증가성 협심증") 노작성 협심증이 "불안정형" 정의에 포함되는 것으로 간주할 것이다.

본 발명의 다른 측면은, 치료가 필요한 환자에게 본 발명의 조합 산물을 투여하는 단계를 포함하는 염증 장애, 특히 죽상경화증 및/또는 이와 관련있는 심혈관 장애의 치료 방법을 제공한다.

혼동을 피하기 위해, 본 발명의 내용에서, 용어 "치료", "요법" 및 "치료 방법"은 필요한 환자의 치료학적, 또는 경감적 치료 뿐만 아니라 죽상 경화증과 관련 심혈관 장애 등에 민감한 환자에 대한 예방학적 치료 및/또는 진단을 포함한다.

본원에 기술된 키트에 있어서, "병용 투여"는 서플라타스트(또는 그의 염/용매화물) 및 스타틴(또는 그의 염/용매화물)을 포함하는 각 제형이 순차적으로, 분리하여 및/또는 동시에 해당 병태의 치료 기간 동안 투여되는 것을 포함한다.

따라서, 본 발명의 조합 산물에 있어서, 용어 "병용 투여"는, 조합 산물의 2가지 구성 성분(서플라타스트 및 스타틴)이 함께 또는 서플라타스트를 포함하는 제형이나 스타틴을 포함하는 제형 중 어느 하나를 다른 성분 없이 단독으로 동일한 치료 기간 동안에 (선택적으로 반복) 투여하는 경우에 비해, 상응하는 병태의 치료 기간 동안에, 더 높은, 환자에게 유익한 효과를 주기에 매우 충분한 시기에 투여되는 것을 포함한다. 조합이 특정 병태에 대해 증가된 유익한 효과를 치료 기간 동안에 제공하는지의 결정은 치료하거나 또는 예방할 병태에 따라 의존되지만, 당업자라는 일상적으로 달성할 수 있다.

나아가, 본 발명의 키트에 있어서, 용어 "병용"은 2가지 제형 중 어느 하나 또는 다른 하나는 다른 성분을 투여하기 전, 투여한 후 및/또는 투여하는 동일 시기에 (선택적으로 반복) 투여할 수 있음을 포함한다. 문맥에 사용되었을 때, 용어 "동시 투여되는" 및 "동일 시기에 투여되는"은 서플라타스트와 스타틴의 각각의 투여가 서로 48시간 이내(예, 24시간)에 이루어지는 것을 포함한다.

"환자"는 포유류(인간 포함) 환자를 포함한다.

본 발명에서, 서플라타스트 및 스타틴은 바람직하기로는 국소 또는 전신, 예컨대, 경구, 정맥내 또는 동맥내(혈관내 스텐트 및 그외 말초혈관 장치/투약 형태 포함), 근육내, 피부에, 피하, 경점막하(예, 설하 또는 볼), 직장으로, 경피, 코로, 폐로(예, 기관으로(tracheally) 또는 기관지로(bronchially)), 국소 또는 그외 모든 비경구 경로로, 약학적으로 허용가능한 투약 형태(들)로 화합물(들)을 포함하는 약제학 조제물의 형태로 투여된다. 바람직한 전달 모드는 경구(특히), 정맥내, 피부에 또는 피하에, 코에, 근육내 또는 복막내 전달을 포함한다.

서플라타스트 및 스타틴은 일반적으로 의도한 투여 경로와 표준 약제학 실무에 의한 이유로 선택될 수 있는, 약학적으로 허용가능한 보강제, 희석제 또는 담체와 혼합된 하나 이상의 약학 제형 형태로 함께 또는 분리되어 투여될 수 있다. 이러한 약학적으로 허용가능한 담체는 활성 화합물에 화학적으로 불활성일 수 있으며, 사용 병태에 유해한 부작용이나 독성이 없을 수 있다. 이러한 약학적으로 허용가능한 담체는 또한 조합 조제물이나 또는 키트의 형태로 함께 투여되었을 때, 각 활성 성분의 즉시 또는 변형된 방출성을 부여할 수 있다.

적합한 약학 제형은 상업적으로 이용할 수 있거나, 문헌, 예컨대 Remington The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed., Mack Printing Company,　Easton, Pennsylvania (1995) and Martindale - The Complete Drug Reference (34^th Edition) 와 이에 참조된 문헌에 기술되어 있으며, 이들 문헌들 모두 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 그 밖에, 서플라타스트 및 스타틴 둘다를 포함하는 적합한 제형, 특히 조합 조제물의 제조는 일상적인 기법을 이용하여 당업자는 진보적인 측면없이 달성할 수 있다.

제형내 활성 성분의 양은 치료할 환자와 병태의 중증도 뿐만 아니라 이용되는 화합물(들)에 따라 결정되지만, 당업자는 진보적인 측면없이 달성할 수 있다.

치료할 장애와 환자에 따라 그리고 투여 경로에 따라, 활성 성분을 필요로 하는 환자에게 치료학적 유효량을 다양하게 투여할 수 있다.

그러나, 본 발명에서 포유류, 특히 인간에게 투여되는 투여량은 적당한 시간대에 포유류에게 치료 반응을 실현시키는데 충분하여야 한다. 당업자는 실제 투여량과 조성물 및 최대 적절한 전달 요법의 선택이 특히 제형의 약제학적 특성, 치료중인 병태의 성질과 중증도, 및 수여자의 신체 상태와 지력(mental acuity), 뿐만 아니라 치료할 환자의 특이적인 화합물의 효력, 나이, 병태, 체중, 성별 및 반응 그리고 환자들 간의 유전자 상이성에 따라 영향을 받을 수 있음을 인지할 것이다.

활성 성분의 투여는 연속적이거나 또는 간혈적(예, 볼러스 주사)일 수 있다. 투여량은 투여 시기 및 횟수에 따라 결정될 수 있다.

활성 성분의 적정 용량은 의학 문헌, 예컨대 Martindale - The Complete Drug Reference (34^th Edition)과 이에 기재되어 있는 문헌에 기재된 것을 포함하며, 개방 문헌들 모두 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 따라서, 활성 성분의 적합한 용량은 체중 1 kg 당 약 0.01 mg/kg 내지 약 1,000 mg/kg이다. 더 바람직한 범위는 경구 투약시 매일 약 0.1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg이다.

그러나, 서플라타스트의 적량은 당업자들에게 알려져 있다. 경구 용량은, 따라서, 사용되는 제형이 전술한 조합 조제물 또는 키트의 일부인지와는 관계없이, 1 일 당, 약 2 mg 내지 약 800 mg과 같은 약 0.5 mg 내지 약 1000 mg, 바람직하게는, 약 20 mg 내지 약 600 mg, 예컨대, 약 200 mg(예, 300 mg) 내지 약 450 mg이다.

마찬가지로, 스타틴의 적정 용량은 당업자들에게 공지되어 있다. 따라서, 경구 용량은 사용되는 제형이 전술한 조합 조제물 또는 키트인지와는 상관없이, 전형적으로 1일 약 5 mg 내지 약 100 mg과 같이 약 2 mg 내지 약 150 mg, 바람직하기로는 약 8 mg 내지 약 90 mg, 예컨대 약 10 mg 내지 약 80 mg이다. 피타바스타틴의 적량은 사용되는 제형이 전술한 조합 조제물 또는 키트인지와는 상관없이, 1일 당 약 0.75 mg 내지 약 5 mg 등의 약 0.5 mg 내지 약 10 mg, 바람직하게는 약 1 mg 내지 약 4 mg, 예컨대 약 2 mg이다.

어떤 경우에, 의학 실무자 또는 당업자는 개별 환자에 가장 적합한 실제 투여량을 통상적으로 결정할 수 있을 것이다. 전술한 투여량은 평균적인 경우의 예이며, 물론 보다 많거나 낮은 투여량 범위가 좋을 수 있으며, 이 역시 본 발명의 범위내에 포함된다.

"약"이라는 단어가 본원에 사용되는 경우에, 예컨대 활성 성분의 용량과 관련하여 사용되는 경우에, 이러한 변수는 대략치이며, 본원에 명시된 수치에서 ± 10%, 예컨대 ± 5% 및 바람직하게는 ± 2%일 수 있다,

본원에 기술된 조합 산물/방법은, 전술한 병태의 치료시, 염증 장애(예, 죽상경화증 및 관련 심혈관 병태)의 치료에 사용하는 것으로 종래에 알려져 있는 유사한 방법(치료) 등에 비해, 보다 효과적이고, 독성이 낮으며, 활성 범위가 넓으며, 보다 강력하고, 부작용이 적으며, 또는 그 이상의 다른 유용한 약제학적 특징을 가질 수 있다는, 장점을 가질 수 있다.

본 발명은 하기 실시예들을 들어 설명된다.

실시예 1

MonoMac -6 세포 염증 매개체 방출 분석

MonoMac-6(MM6) 세포(Ziegler-Heitbrock et al , Int . J. Cancer, 41, 456 (1988))를 1 mM 소듐 피루베이트, 1x 비필수 아미노산, 1-100 ㎍/mL 인슐린, 1 mM 옥살아세트산, 100 units/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 및 10% (v/v) 소 태아 혈청이 첨가된 RPMI-1640 배지에서 배양(37℃/5% CO₂)하였다. 분화를 위해, TGFβ(2 ng/ml) 및 1,25(OH)₂D3(50 nM)을 약 2-4일간 통상적으로 첨가한다.

염증 매개체 루코트리엔 B₄(LTB₄)의 방출을 자극하기 위해, 분화되거나 되지 않은 MM6 세포(1 - 15 x 10⁶/mL; 0.5-1 mL)를 25-50 μM 아라키돈산과 2-10 μM 칼슘 이온포어(ionophore) A23187(A23187은 또한 아라키돈산 없이 사용할 수 있음)과 함께 5-30분간(37℃, 칼슘이 첨가된 PBS 중에서) 인큐베이션하였다. 또한, MM6 세 포는. 입증된 생물학적 활성 농도의. 아데노신 디포스페이트(ADP), 및/또는 트롬복산 유사체U-46619를 이용하여, 전술한 A23187 및/또는 아라키돈산 첨가 또는 무첨가 상태로 자극하였다. 상기 MM6 인큐베이션/자극은 또한 (건강한 공여자 혈액 유래의) 인간 혈소판 존재 하에, MM6:혈소판이 1:10 내지 1`:10000인 비율에서 수행하였다. 인큐베이션/자극은, 내부 표준 물질로서 첨가한 2배 부피의 차가운 메탄올과 프로스타글란딘 B₂(PGB₂)로 중지시켰다. 샘플을 원심분리하여, 상층액을 물로 희석하여 메탄올 최종 농도가 30%가 되게 하였고, pH는 3-4로 조정하였다. 상층액내의 아라키돈산 대사산물은, 미리 조정한(1 mL 메탄올 -> 1 mL H₂O) C18 고상 컬럼(Sorbent Technology, U.K.)에서 추출하였다. 대사산물을 메탄올로 용출시킨 후, 1배수의 물을 용출물에 첨가하였다. 역상 HPLC에서는 각 샘플 76 ㎕에 39 ㎕ H₂O(다른 부피 비율도로 사용할 수 있음)를 혼합하였다. Waters RCM 8 x 10 컬럼을 메탄올/아세토니트릴/H₂O/아세트산(30:35:35:0.01 v/v)으로 유속 1.2 mL/min으로 용리시켰다. PGB₂ 및 LTB₄를 검출 및 정량하기 위해 용출물의 흡광도를 270 nm에서 모니터링하였다. 시판되는 효소 면역-분석 키트를 LTB₄ 측정을 위해 키트 제조사의 설명서에 따라 사용하였다. 제조사의 설명서에 따른 시판되는 효소 면역-분석 키트(EIA/ELISA 키트)를 이용하여, 또한 상기 MM6 인큐베이션/자극으로부터 수득한 상층액을 염증 매개체인 프로스타글란딘 E₂(PGE₂) 및/또는 트롬복산 B₂(TXB₂)의 함량에 대해 분석할 수 있다.

서플라타스트 및 스타틴(피타바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴, 또는 바람직하게는 심바스타틴, 로수바스타틴, 또는 아토르바스타틴)의 스톡 용액을, 필요에 따라 음파처리, 가열 및 pH 조정(다른 비히클이 사용될 수도 있음)을 이용하여, 에탄올, DMSO, N-메틸-2-피롤리돈, PEG 400, 프로필렌 글리콜 및/또는 탈이온수 또는 생리식염수 중에, 제조한다. 세포를, 염증 매개체 방출을 위한 MM6 자극하기 전 1분 내지 24시간 동안, 테스트 약물(들)(서플라타스트와 스타틴의 조합, 서플라타스트 단독 및 스타틴 단독)과 함께 (37℃/5% CO₂, 칼슘이 무첨가된 PBS, 또는 1-10% 소태아 혈청이 첨가되고 첨가제가 첨가 또는 무첨가된 RPMI-1640 배지에서) 인큐베이션한다(테스트 약물(들)은 또한 MM6 자극과 동시에 첨가될 수 있음). 약물은 최종 농도 1 nM - 100 μM로 첨가한다(비교를 위해, 일부 실험은 약물 첨가없이 수행함).

IL-1β, IL-6, TNF, IL-8, IL-10, IL-12p70, MCP-1과 같은 염증성 사이토카인 및 케모카인의 방출을 자극하기 위해, 분화되거나 되지 않은 MM6 세포(1-10 x 10⁶/mL)를 리포폴리사카라이드(LPS, 최종 농도 1-100 ng/mL), 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA, 최종 농도 1-100 ng/mL) 또는 LPS/PMA 혼합물과 함께, (1-10% 소태아 혈청이 첨가되고 첨가제가 첨가 또는 무첨가된 RPMI-1640 배지에서) 4-24시간 동안 인큐베이션(37℃/5% CO₂)하였다. 또한, MM6 세포를, 상기 PMA 및/또는 LPS의 첨가 또는 무첨가한 상태에서, 아데노신 디포스페이트(ADP), 아라키돈산, 칼슘 이온포어 A23187 및/또는 트롬복산 유사체 U-46619를 입증된 생물학적으로 활성 인 농도로 사용하여, 자극할 수 있다. MM6 세포의 인큐베이션/자극은 또한 (건강한 공여자 혈액 유래의) 인간 혈소판 존재 하에, MM6:혈소판이 1:10 내지 1`:10000인 비율에서 수행하였다. 세포를, MM6 자극하기 전 1분 내지 24시간 동안, 테스트 약물(들)(서플라타스트와 스타틴의 조합, 서플라타스트 단독 및 스타틴 단독; 상기 스톡 용액 및 농도)과 함께 (37℃/5% CO₂, 1-10% 소태아 혈청이 첨가되고 첨가제가 첨가 또는 무첨가된 RPMI-1640 배지에서) 인큐베이션하였다(비교를 위해, 일부 실험에서는 약물 없이 수행하며; 테스트 약물(들)은 또한 MM6 자극과 동시에 첨가될 수 있음). 인큐베이션/자극 후 세포를 스핀 다운한 다음, 인간의 사이토카인과 케모카인의 상층액내 농도를 세포측정 비드 분석(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, USA)을 이용하여 제조사의 설명에 따라 정량하였다. 또한, 사이토카인과 케모카인 측정을 위한 상업적으로 시판되는 효소 면역-분석 키트(EIA/ELISA 키트)를 제조사의 설명서에 따라 사용할 수 있다. 세포 펠렛은 마이크로어레이 실험을 위해 추가적으로 가공할 때까지 RLT 완충액(QIAGEN, Valencia, CA) 중에 동결(-80 ℃) 저장하였다(하기 실시예 12 참조)

실시예 2

인간 혈소판 혈액 세포 염증성 매개체 방출 분석

인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 다핵형 세포(PMN)를 건강한 공여자 혈액으로부터 확립된 프로토콜에 따라 Lymphoprep 또는 Ficoll-Paque 분리(Polymorphoprep 분리 및/또는 덱스트란 침강 이용 또는 이용하지 않음)에 의해, 분리한다.

염증성 매개체 루코트리엔 B₄(LTB₄)의 방출을 자극하기 위해, PBMC 또는 PMN(1-15 x 10⁶/mL; 0.5-1 mL)을, 25-50 μM 아라키돈산과 2-10 μM 칼슘 이온포어 A23187(A23187은 또한 아라키돈산 없이 사용할 수 있음)과 함께 5-30분간(37℃, 칼슘이 첨가된 PBS 중에서) 인큐베이션하였다. 또한, PBMC/PMN은 입증된 생물학적 활성 농도의, 아데노신 디포스페이트(ADP), 및/또는 트롬복산 유사체U-46619를 이용하여, 전술한 A23187 및/또는 아라키돈산 첨가 또는 무첨가 상태로 자극하였다. 상기 PBMC/PMN 인큐베이션/자극은 또한 (건강한 공여자 혈액 유래의) 인간 혈소판 존재 하에, PBMC/PMN:혈소판이 1:10 내지 1:10000인 비율에서 수행하였다. 인큐베이션/자극은, 내부 표준 물질로서 첨가한 2배 부피의 차가운 메탄올과 프로스타글란딘 B₂로 중지시켰다. 샘플을 원심분리하여, 상층액을 물로 희석하여 메탄올 최종 농도가 30%가 되게 하였고, pH는 3-4로 조정하였다. 상층액내의 아라키돈산 대사산물을 미리 조정한(1 mL 메탄올 후 1 mL H₂O) C18 고상 컬럼(Sorbent Technology, U.K.)에서 추출하였다. 대사산물을 메탄올로 용출시킨 후, 1배수의 물을 용출물에 첨가하였다. 역상 HPLC에서는 각 샘플 76 ㎕에 39 ㎕ H₂O(다른 부피 비율로 사용할 수 있음)를 혼합하였다. Waters RCM 8 x 10 컬럼을 메탄올/아세토니트릴/H₂O/아세트산(30:35:35:0.01 v/v)으로 유속 1.2 mL/min으로 용리시켰다. PGB₂ 및 LTB₄를 검출 및 정량하기 위해 용출물의 흡광도를 270 nm에서 모니터링하였다. 시판되는 효 소 면역-분석 키트(EIA/ELISA 키트) 를 LTB₄ 측정을 위해 키트 제조사의 설명서에 따라 사용하였다. 제조사의 설명서에 따른 시판되는 효소 면역-분석 키트(EIA/ELISA 키트)를 이용하여, 또한 상기 PBMC/PMN 인큐베이션/자극으로부터 수득한 상층액을 염증 매개체인 프로스타글란딘 E₂(PGE₂) 및/또는 트롬복산 B₂(TXB₂)의 함량에 대해 분석할 수 있다. 세포를, 염증 매개체 방출을 위한 PBMC/PMN 자극하기 전 1분 내지 24시간 동안, 테스트 약물(들)(서플라타스트와 스타틴(피타바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴 또는 바람직하게는 심바스타틴, 로수바스타틴 또는 아토르바스타틴)의 조합, 서플라타스트 단독 및 스타틴 단독)과 함께 (37℃/5% CO₂, 칼슘이 무첨가된 PBS, 또는 0-10% 소태아 혈청이 첨가된 RPMI-1640 배지에서) 인큐베이션한다(약물의 스톡 용액과 농도에 대해서는 상기 실시예 1 참조; 테스트 약물(들)은 또한 PBMC/PMN 자극과 동시에 첨가될 수 있음). 비교를 위해, 일부 실험은 약물 첨가없이 수행한다.

IL-1β, IL-6, TNF, IL-8, IL-10, IL-12p70, MCP-11과 같은 염증성 사이토카인 및 케모카인의 방출을 자극하기 위해, PBMC/PMN(1-10 x 10⁶/mL)를 리포폴리사카라이드(LPS, 최종 농도 1-100 ng/mL), 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA, 최종 농도 1-100 ng/mL) 또는 LPS/PMA 혼합물과 함께, (1-10% 소태아 혈청이 첨가된 RPMI-1640 배지에서) 4-24시간 동안 인큐베이션(37℃/5% CO₂)한다. 또한, PBMC/PMN을, 상기 PMA 및/또는 LPS의 첨가 또는 무첨가한 상태에서, 아데노신 디포 스페이트(ADP), 아라키돈산, 칼슘 이온포어 A23187 및/또는 트롬복산 유사체 U-46619를 입증된 생물학적으로 활성인 농도로 사용하여, 자극할 수 있다. PBMC/PMN의 인큐베이션/자극은 또한 (건강한 공여자 혈액 유래의) 인간 혈소판 존재 하에, PBMC/PMN:혈소판이 1:10 내지 1`:10000인 비율에서 수행할 수 있다. 세포를, 사이토카인/케모카인 방출을 위한 PBMC/PMN 자극 전 1분 내지 24시간 동안, 테스트 약물(들)(서플라타스트와 스타틴의 조합, 서플라타스트 단독 및 스타틴 단독)과 함께 (37℃/5% CO₂, 1-10% 소태아 혈청이 첨가된 RPMI-1640 배지에서) 인큐베이션한다(비교를 위해, 일부 실험에서는 약물 없이 수행하며; 테스트 약물(들)은 또한 PBMC/PMN 자극과 동시에 첨가될 수 있음). 인큐베이션/자극 후 세포를 스핀 다운한 다음, 인간 사이토카인과 케모카인의 상층액내 농도를 세포측정 비드 분석(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, USA)을 이용하여 제조사의 설명에 따라 정량한다. 또한, 사이토카인과 케모카인 측정을 위한 상업적으로 시판되는 효소 면역-분석 키트(EIA/ELISA 키트)를 제조사의 설명서에 따라 사용할 수 있다. 세포 펠렛은 마이크로어레이 실험을 위해 추가적으로 가공할 때까지 RLT 완충액(QIAGEN, Valencia, CA) 중에 동결(-80 ℃) 저장한다(하기 실시예 12 참조).

실시예 3

마우스 비만 세포 염증 매개체 방출 분석

골수 유래 배양한 마우스 비만 세포(mMC)는 C57BL/6 마우스의 골수 세포를 배양하여 수득한다. 골수 세포(PBS로 플러쉬한 마우스 대퇴부 유래)를 10% 열-불 활성화된 소 태아 혈청, 4 mM L-글루타민, 50 μM 2-머캅토에탄올, 1 mM 소듐 피루베이트, 0.1 mM 비필수 아미노산, 10 mM Hepes 및 100 ㎍/mL 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 10% WEHI-3 또는 X-63 강화 조정된 RPMI 1640 배지에서 배양(37℃/5% CO₂)한다. (현탁액에서 자라는) 비만 세포의 발생을 세포 표면상에서 Kit(유세포측정에 의해)의 발현에 의해 및/또는 톨루이딘 블루 염색(일반적으로 배양 3-5주 이상 후)에 의해 검증한다.

결합 조직 타입(CT-type)의 골수 유래 배양한 마우스 비만 세포는 C57BL/6 마우스의 골수 세포를 배양하여 수득한다. 골수 세포를 10% 여과한 FCS, 4 mM L-글루타민, 1 mM 소듐 피루베이트, 100 IU/mL 페니실린 G, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 및 50 μM 2-ME을 포함하며, 50 ng/mL 재조합 뮤라인 줄기 세포 인자 및 1 ng/mL 뮤라인 재조합 IL-4가 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양(37℃/5% CO₂)한다. 비만 세포의 발생을 세포 표면상에서 Kit(유세포측정에 의해)의 발현에 의해 및/또는 톨루이딘 블루 염색(일반적으로 배양 3-5주 이상 후)에 의해 검증한다.

마우스 비만 세포주 MC/9(ATCC로부터 구입, 제품 번호: CRL-8306) 및 C1.MC/C57.1(Young et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 84, 9175 (1987))도 사용할 수 있다. MC/9 세포를 ATCC의 지시에 따라 배양하고(http://www.atcc.org), C1.MC/C57.1 세포는 Rumsaeng et al (J. Immunol . 158, 1353 (1997))에 기술된 바 와 같이 배양한다.

IgE-수용체의 교차 연결을 통한 활성화/자극을 위해, 배양한 비만 세포를 우선 15% 하이브리도마 상층액을 이용한 단일클론 마우스 항-TNP IgE-항체(IgEl-b4, ATCC, Rockville, MD, USA)로 37℃ (5% CO₂)에서 90분간 감작시킨다. N-아세틸-β-D-헥소스아미니다제(또는 히스타민) 또는 사이토카인/케모카인 방출 분석(하기 참조)에서 사용할 세포는, PBS로 2번 헹구고, 0.2% 소 혈청 알부민(BSA)(Sigma)이 보충된 RPMI-1640 배지로 재현탁한 다음, 100 ng/mL TNP-BSA (Biosearch Technologies, San Francisco, CA)를 커플링 비율 9/1로 첨가하여 세포(0.5-10x10⁶/mL)를 활성화시킨다. TNP-BSA와의 인큐베이션(37℃/5% CO₂)은 β-헥소스아미니다제(또는 히스타민) 방출 분석의 경우에는 30분이고, 사이토카인과 케모카인의 방출의 경우에는 6-24시간이다. 세포는 TNP-BSA를 첨가하기 전 1분 내지 24시간 동안, 테스트 약물(들)(서플라타스트와 스타틴(피타바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴 또는 바람직하게는 심바스타틴, 로수바스타틴 또는 아토르바스타틴)의 조합, 서플라타스트 단독 및 스타틴 단독)과 함께 (37℃/5% CO₂) 인큐베이션한다(약물의 스톡 용액과 농도에 대해서는 상기 실시예 1 참조; 테스트 약물(들)은 또한 TNP-BSA 자극과 동시에 첨가될 수 있음). 비교를 위해, 일부 실험은 약물 첨가없이 수행한다. 인큐베이션/자극 후, 샘플을 원심분리하고, 후술되는 바와 같이 β-헥소스아미니다제(또는 히스타민) 및/또는 사이토카인/케모카인의 양에 대해 상층액을 분석한다. 세포 펠렛은 마이크로어레이 실험을 위해 추가적으로 가공할 때까지 RLT 완충액(QIAGEN, Valencia, CA) 중에 동결(-80 ℃) 저장한다(하기 실시예 12 참조).

과립형 비만세포 효소인 β-헥소스아미니다제의 IgE-의존적인 방출을 검출하기 위해, 효소적 색도계 분석을 이용한다. 각 웰 상층액 60 ㎕를 96웰 플레이트로 옮기고, 동일 부피의 기질 용액(80 mM 시트르산, pH 4.5에 용해된 7.5 mM p-니트로페닐-N-아세틸-b-D-글루코스아미니드)과 혼합한다. 이 혼합물은 37℃에서 2시간 동안 락커 플랫폼 상에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 글리신(0.2 M, pH 10.7) 120 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 405 및490 nm에서의 흡광도를 Emax Precision Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 측정한다. β-헥소스아미니다제의 방출은 세포 용혈 후 측정한 총β-헥소스아미니다제에 대한 퍼센트로 나타낸다. 과립형 비만 세포의 IgE-의존적인 히스타민 방출을 검출하기 위해, 히스타민 측정에 상업적으로 시판되는 효소 면역-분석 키트(EIA/ELISA 키트)를 제조사의 설명서에 따라 사용한다.

IL-6, IL-4, TNF, IL-1β, KC, MCP-1, IL-10, IL-12p70, IFNγ와 같은 마우스 비만 세포의 IgE-의존적인 사이토카인 및 케모카인 방출을 검출하기 위해, 제조사의 설명서에 따라 Cytometric Bead Array (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, USA)를 사용한다. 또한, 사이토카인 및 케모카인 측정에 상업적으로 시판되는 효소 면역-분석 키트(EIA/ELISA 키트)를 제조사의 설명서에 따라 사용할 수 있다.

상술한 비만 세포 실험 이외에도, (상기) 테스트 약물(들)의 비만 세포-저해 효과를 잘 확립되어 있으며 입증된 실험 방법을 이용하여 조사할 수 있으며, 막 분리한 복막의 랫 또는 마우스 비만 세포로부터 유발성(예, 항-IgE(랫 또는 마우스 IgE로 세포를 전처리하거나 하지 않고), 콘카나발린 A, 단백질 L, 화합물 48/80, 이온포어 A23187, PMA를 이용함) 히스타민, β-헥소스아미니다제 또는 트립타제의 방출을 분석한다.

실시예 4

RAW 264.7 세포 염증 매개체 방출 분석

RAW 264.7 세포는 100 units/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 및 10% 소 태아 혈청이 보충된 DMEM에서 배양(37℃/5% CO₂)한다.

IL-6, TNF, IL-1β, KC, MCP-1, IL-10, IL-12p70, IFNγ와 같은 염증성 사이토카인 및 케모카인의 방출을 자극하기 위해, RAW 264.7 세포(1-10 x 10⁶/mL)를 리포폴리사카라이드(LPS, 최종 농도 1-100 ng/mL), 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA, 최종 농도 1-100 ng/mL) 또는 LPS/PMA 혼합물과 함께, (1-10% 소태아 혈청이 첨가되고 첨가제가 첨가 또는 무첨가된 DMEM 배지에서) 4-24시간 동안 인큐베이션(37℃/5% CO₂)한다. 또한, RAW 264.7 세포를, 상기 PMA 및/또는 LPS의 첨가 또는 무첨가한 상태에서, 아데노신 디포스페이트(ADP), 아라키돈산, 칼슘 이온포어 A23187 및/또는 트롬복산 유사체 U-46619를 입증된 생물학적으로 활성인 농도로 사용하여, 자극할 수 있다. RAW 264.7 세포의 인큐베이션/자극은 또한 (건강한 공여자 혈액 유래의) 인간 혈소판 존재 하에, RAW 264.7:혈소판이 1:10 내지 1`:10000 인 비율에서 수행한다. 세포를, 사이토카인/케모카인의 방출을 위해 RAW 264.7을 자극하기 전 1분 내지 24시간 동안, 테스트 약물(들)(서플라타스트와 스타틴(피타바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴 또는 바람직하게는 심바스타틴, 로수바스타틴 또는 아토르바스타틴)의 조합, 서플라타스트 단독 및 스타틴 단독; 산기 스톡 용액 및 농도)과 함께 (37℃/5% CO₂, 1-10% 소태아 혈청이 첨가되고 첨가제가 첨가 또는 무첨가된 DMEM 배지에서) 인큐베이션한다(약물의 스톡 용액과 농도에 대한 상세한 사항은 상기 실시예 1 참조; 테스트 약물(들)은 또한 RAW 264.7 자극과 동시에 첨가될 수 있음). 비교를 위해, 일부 실험은 약물 첨가없이 수행한다. 인큐베이션/자극 후 세포를 스핀 다운한 다음, 마우스 사이토카인과 케모카인의 상층액내 농도를 세포측정 비드 분석(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, USA)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 정량한다. 또한, 사이토카인과 케모카인 측정을 위한 상업적으로 시판되는 효소 면역-분석 키트(EIA/ELISA 키트)를 제조사의 설명서에 따라 사용할 수 있다. 세포 펠렛은 마이크로어레이 실험을 위해 추가적으로 가공할 때까지 RLT 완충액(QIAGEN, Valencia, CA) 중에 동결(-80 ℃) 저장한다(하기 실시예 12 참조).

실시예 5

카라기난에 의한 랫 발에 염증 유도

본 분석은 근본적으로 Winter et al (Proc . Soc . Exp . Biol . Med ., 111, 544 (1962))에 기술된 방법에 따라 수행한다. 테스트 약물(들)(서플라타스트와 스 타틴(피타바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴 또는 바람직하게는 심바스타틴, 로수바스타틴 또는 아토르바스타틴)의 조합, 서플라타스트 단독 및 스타틴 단독)을 0.03 - 50 mg/kg의 용량으로 약 150-400 g 체중의 수컷 Sprague-Dawley 또는 Wistar 랫에 2-24시간 마다 피하, 정맥내, 복막내 또는 경구 투여한다(비교를 위해, 일부 실험은 약물 없이 수행함). 투여하기 전에, 약물의 스톡 용액(상기 실시예 1 참조)을 예컨대 수(경구 처리) 또는 염수(비경구 투여용) 중의 0.5% 또는 1% 메틸셀룰로스에 필요한 만큼 희석한다. 다른 비히클도 사용할 수 있다. 1차 약물 투약 후 1분 내지 24시간에, 0.9% 염수 중의 카라기난(Type IV Lambda, Sigma Chemical Co.) 용액 0.5, 1.0 또는 2.0%를 마취한 랫의 한쪽 뒷발 발바닥 부위에 주사한다. 그 전과 카라기난 주사한 후 3-24시간의 지정된 간격으로, 주사한 발의 부피를 디지탈 지시계가 부착된 압력 트랜스듀서와 연결되어 있는 디스플레이스먼트 플레티스모미터(displacement plethysmometer)로 측정한다. 부종의 정도는 염증 부종 정도를 나타낸다. 카라기난 주사 후 3-24시간에, 랫을 죽이고, 염수 또는 PBS(또한 다른 주입 매질도 사용할 수 있음)을 주입한다. 염증이 생긴 발에서 발바닥의 연한 조직 생검을 취하고, 중량을 측정한 다음, 동결 저장하고(마이크로어레이 분석용 샘플은 TRIzol 중에서 -80 ℃로 냉동, Invitrogen, Carlsbad, CA), 후술한 바와 같이(실시예 10 및 12), 하기에 대해 분석한다: 1) 염증성 호중구 백혈구 축적을 반영하는 마이엘로페록시다제(MPO)의 축적; 및/또는 2) 마이크로어레이 기법을 이용한 조직 유전자 발현. 무처리 랫의 염증이 발생하지 않은 발 조직을 MPO 및 유전자 발현의 베이스라인 수치로 제공한다. 또한, 조직 염증은 통상의 조직 및 면역조직화학 기법을 이용하여 조사할 수 있다. 발 염증은 또한 화합물 48/80 (48/80, 50-100 ㎕의 PBS 또는 염수 중의 1-5 ㎍)(카라기난 대신 사용)을 발바닥에 주사하여 유도할 수 있으며, 48/80 주사 후 30분 내지 8시간에 염증성 발의 부종을 측정하고 마이크로어레이 및/또는 MP 분석(상기 참조)을 위한 조직 생검을 채집한다.

실시예 6

크로톤 오일에 의한 마우스 귀에 염증 유도

본 분석은 근본적으로 Tonelli et al (Endocrinology 77, 625 (1965))에 기술된 방법에 따라 수행한다.(다른 마우스 균주도 사용할 수 있음) 테스트 약물(들)(서플라타스트와 스타틴(피타바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴 또는 바람직하게는 심바스타틴, 로수바스타틴 또는 아토르바스타틴)의 조합, 서플라타스트 단독 및 스타틴 단독)을 0.03 - 50 mg/kg의 용량으로 2-24시간 마다 피하, 정맥내, 복막내 또는 경구 투여한다(비교를 위해, 일부 실험은 약물 없이 수행함). 투여하기 전에, 약물의 스톡 용액(상기 실시예 1 참조)을 예컨대 수(경구 처리) 또는 염수(비경구 투여용) 중의 0.5% 또는 1% 메틸셀룰로스에 필요한 만큼 희석한다. 다른 비히클도 사용할 수 있다. 1차 약물 투약 후 1분 내지 24시간에, 아세톤 또는 에탄올 중의 크로톤 오일의 2.0 또는 4.0% 용액 10-30 ㎕를 한쪽 또는 양쪽 귀에 국소 도포한다. 크로톤 오일 적용 후 4-24시간에 동물을 죽이고, 귀의 펀치 생검의 중량을 측정하여, 귀의 염증성 부종을 결정한다(귀 두께를 측정하여 부종을 결정할 수도 있음). 염증이 발생한 귀에서 취한 생검을 채집하여 동결 저 장하고(마이크로어레이 분석용 샘플은 TRIzol 중에서 -80 ℃에서 냉동), 후술한 바와 같이(실시예 10 및 12), 하기에 대해 분석한다: 1) 염증성 호중구 백혈구 축적을 반영하는 마이엘로페록시다제(MPO)의 축적; 및/또는 2) 마이크로어레이 기법을 이용한 조직 유전자 발현. 무처리 마우스의 염증이 발생하지 않은 귀 생검을 이용하여 부종, MPO 및 유전자 발현의 베이스라인 수치로 제공한다. 또한, 조직 염증은 통상의 조직 및 면역조직화학 기법을 이용하여 조사할 수 있다.

실시예 7

포르볼 에스테르 또는 아라키돈산에 의한 마우스 귀의 염증 유도

본 분석은 근본적으로 Chang et al (Eur . J. Pharmacol . 142, 197 (1987))에 기술된 방법에 따라 수행한다.(다른 마우스 균주도 사용할 수 있음) 테스트 약물(들)(서플라타스트와 스타틴(피타바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴 또는 바람직하게는 심바스타틴, 로수바스타틴 또는 아토르바스타틴)의 조합, 서플라타스트 단독 및 스타틴 단독)을 0.03 - 50 mg/kg의 용량으로 2-24시간 마다 수컷 또는 암컷 마우스에 피하, 정맥내, 복막내 또는 경구 투여한다(비교를 위해, 일부 실험은 약물 없이 수행함). 투여하기 전에, 약물의 스톡 용액(상기 실시예 1 참조)을 예컨대 수(경구 처리) 또는 염수(비경구 투여용) 중의 0.5% 또는 1% 메틸셀룰로스에 필요한 만큼 희석한다. 다른 비히클도 사용할 수 있다. 1차 약물 투약 후 1분 내지 24시간에, 1-10 ㎍의 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA), 테트라데카노일 포르볼 아세테이트(TPA), 또는 1-10 ㎍ 아세톤 또는 에탄올 중의 1-5 mg 아라키돈산을 한쪽 또는 양쪽 귀에 국소 도포한다. PMA 또는 TPA 적용 후 4-12시간, 그리고 아라키돈산 적용 후 30분 내지 6시간에, 동물을 죽이고, 귀의 펀치 생검의 중량을 측정하여, 귀의 염증성 부종을 결정한다(귀 두께를 측정하여 부종을 결정할 수도 있음). 염증이 발생한 귀에서 취한 생검을 채집하여 동결 저장하고(마이크로어레이 분석용 샘플은 TRIzol 중에서 -80 ℃에서 냉동), 후술한 바와 같이(실시예 10 및 12), 하기에 대해 분석한다: 1) 염증성 호중구 백혈구 축적을 반영하는 마이엘로페록시다제(MPO)의 축적; 및/또는 2) 마이크로어레이 기법을 이용한 조직 유전자 발현. 무처리 마우스의 염증이 발생하지 않은 귀 생검을 이용하여 부종, MPO 및 유전자 발현의 베이스라인 수치로 제공한다. 또한, 조직 염증은 통상의 조직 및 면역조직화학 기법을 이용하여 조사할 수 있다.

실시예 8

마우스 및 랫에서 상해에 대한 반응으로 인한 급성 조직 반응 및 염증

약 15-30 g의 수컷 CBA 또는 NMRI 마우스, 또는 약 150-450 g의 수컷 Wistar 또는 Sprague-Dawley 랫을 사용한다(다른 마우스 및 랫 균주도 사용할 수 있음). 급성 조직 상해 및 급성 염증은 멸균 조건 하에서 메스를 이용하여 꼬리의 끝 부분 또는 한쪽 귀에 만든다. 피부의 모든 층을 통과하는, 1, 2 또는 3개의 평행한 약 5-15 mm 길이의 세로 방향으로 절개한다. 테스트 약물(들)(서플라타스트와 스타틴의 조합, 서플라타스트 단독 및 스타틴 단독)을 0.03 - 50 mg/kg의 용량으로 2-24시간 마다 피하, 정맥내, 복막내 또는 경구 투여하고, 1차 투약은 조직 상해 전 1분 내지 24시간에 수행한다(비교를 위해, 일부 실험은 약물 없이 수행함). 투여하기 전에, 약물의 스톡 용액(상기 실시예 1 참조)을 예컨대 수(경구 처리) 또는 염 수(비경구 투여용) 중의 0.5% 또는 1% 메틸셀룰로스에 필요한 만큼 희석한다. 다른 비히클도 사용할 수 있다. 상해 후 2-48시간에, 동물을 죽이고, 조직의 손상된 세그먼트를 적출하여 중량을 측정하고, 동결 저장하고(마이크로어레이 분석용 샘플은 TRIzol 중에서 -80 ℃에서 냉동), 후술한 바와 같이(실시예 10 및 12), 하기에 대해 분석한다: 1) 염증성 호중구 백혈구 축적을 반영하는 마이엘로페록시다제(MPO)의 축적; 및/또는 2) 마이크로어레이 기법을 이용한 조직 유전자 발현. 무처리 마우스의 대응되는 무-손상/무-염증 조직을 MPO 및 유전자 발현의 베이스라인 수치로 제공한다. 또한, 상해에 대한 조직 반응과 염증은 통상의 조직 및 면역조직화학 기법을 이용하여 조사할 수 있다.

실시예 9

랫에서의 상해에 대한 반응으로 인한 급성 조직 반응 및 염증

체중 350-500 g의 수컷 Sprague-Dawley 랫을 사용한다(다른 마우스 균주도 사용할 수 있음). 동물을 산소 중에 이소플루란으로 마취하고 급성 조직 손상 및 급성 염증을 다음과 같이 좌측 총경동맥에 야기한다: 좌측 총 외경동맥 및 내경동맥을 수술로 노출하고, 국소 혈액 흐름을 일시적인 결착시켜 일시 중지시킨 후, 벌룬 카테터(2-프렌치 포가티)를 외경동맥을 따라 통과시켜 대동맥에 넣었다. 그런 후, 벌룬을 총경동맥을 팽창시키는데 충분한 물을 이용하여 부풀린 다음, 외경동맥으로 밀어넣는다. 이 시술은 3번 반복하고, 카테터를 뺀 다음, 외경동맥을 결착시키고 상처를 봉합하였다. 테스트 약물(들)(서플라타스트와 스타틴(피타바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴 또는 바람직하게는 심바스타틴, 로수바스 타틴 또는 아토르바스타틴)의 조합, 서플라타스트 단독 및 스타틴 단독)을 0.03 - 50 mg/kg의 용량으로 2-24시간 마다 피하, 정맥내, 복막내 또는 경구 투여하고, 1차 투약은 조직 손상 전 1분 내지 24시간에 수행한다(비교를 위해, 일부 실험은 약물 없이 수행함). 투여하기 전에, 약물의 스톡 용액(상기 실시예 1 참조)을 예컨대 수(경구 처리) 또는 염수(비경구 투여용) 중의 0.5% 또는 1% 메틸셀룰로스에 필요한 만큼 희석한다. 다른 비히클도 사용할 수 있다. 상해 후 2-48시간에, 동물을 산소 중의 이소플루란으로 죽이고, 이의 좌측 경동맥을 노출시켰다. 클램프를 총 및 내경동맥 각각과 가장 근접한 부위에 놓고, 클램프 사이의 혈관을 멸균 염수 및/또는 TRIzol로 조심스럽게 헹군 다음, 적출하여 중량을 측정하고, 냉동 저장(마이크로어레이 분석용 샘플은 TRIzol 중에서 -80 ℃에서 냉동)한 후, 후술한 바와 같이(실시예 10 및 12), 하기에 대해 분석한다: 1) 염증성 호중구 백혈구 축적을 반영하는 마이엘로페록시다제(MPO)의 축적; 및/또는 2) 마이크로어레이 기법을 이용한 조직 유전자 발현. 무처리 마우스의 대응되는 무-손상/무-염증 조직을 MPO 및 유전자 발현의 베이스라인 수치로 제공한다. 또한, 상해에 대한 조직 반응과 염증은 통상의 조직 및 면역조직화학 기법을 이용하여 조사할 수 있다.

실시예 10

조직 마이엘로페록시다제의 염증 축적

효소 마이엘로페록시다제(MPO)는 호중구 백혈구에 다량 존재하며, 흔히 염증 조직내 호중구 축적을 검출하는 마커로 사용된다. 염증 마우스 및 랫 조직내 염증성 마이엘로페록시다제 축적을 검정하기 위해(상기 실시예 5-9 참조), 조직을 0.5% 헥사데실트리메틸-암모늄 브로마이드로 동질화하고, 냉동-해동하였다. 상층액의 MPO 활성은 MPO에 의해 촉매되는 H₂O₂-테트라메틸벤지딘의 레독스 반응에서 발생하는 650 nm(25 ℃)에서의 흡광도 변화로서 분광광도계로 결정한다. 그 값은 MPO unit/mg(조직)으로 표시한다.

실시예 11

평활근 세포 분석

랫의 대동맥 평활근 세포(RASMC)를 이전에 기술된 바(Hedin et al , Arterioscler. Thromb . Vasc . Biol ., 17, 1977 (1997))에 따라 분리한다. 세포를 10% 소 태아 혈청, 50 ㎍/mL L-아스코르브산, 50 ㎍/mL 스트렙토마이신, 50 IU/mL 페니실린 (F-12/10% 소 태아 혈청)이 보충된 함스 배지 F-12에서 배양(37℃/5% CO₂하고, 컨플루언스로 배양한 다음, 트립신 ㅊ리에 의해 연속 계대하여, 2-6 계대 후 실험에 사용한다. RASMC는 약 4x10⁴ 세포/웰의 밀도로 24-웰 플레이트에 F-12/10% 소 태아 혈청 중에 접종한다(플레이트에 웰 수가 많으며 웰 당 세포의 수가 적절하게 적은 플레이트도 사용될 수 있음). 24시간 후, 세포를 0.1% 소 혈청 알부민(BSA), 50 ㎍/mL L-아스코르브산, 50 ㎍/mL 스트렙토마이신 및 50 IU/mL 페니실린 (F-12/0.1% BSA)이 보충된 함스 배지 F-12에서 24-48 시간 동안 아사시켜, G0/G1 단계로 동조화한다. DNA 합성을 평가하기 위해, 아사시킨 RASMC를 10 ng/ml IGF-1 또는 10% 소 태아 혈청 중 어느 하나를 사용하여 12-48시간 동안 자극한다(그외 PDGF와 같이 잘 확립되어 있는 미토겐도 사용할 수 있음). 테스트 약물 (들)(서플라타스트와 스타틴(피타바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴 또는 바람직하게는 심바스타틴, 로수바스타틴 또는 아토르바스타틴)의 조합, 서플라타스트 단독 및 스타틴 단독)을 자극하기 전 1분 내지 24시간에 첨가한다(약물의 스톡 용액과 농도에 대해서는 상기 실시예 1 참조; 테스트 약물(들)은 또한 TNP-BSA 자극과 동시에 첨가될 수 있음). 비교를 위해, 일부 실험은 약물 첨가없이 수행한다. 자극 기간이 종료 전 8시간 동안 세포를, 1 μCi [3H]-티미딘으로 표지한다. 그런 후, 플레이트를 빙냉한 PBS로 헹구고, 빙냉한 10% (w/v) 트리클로로아세트산과 함께 하룻밤 인큐베이션하고, 0.2 M 소듐 하이드록사이드 중에서 용혈시킨 후, 액체 신틸레이션 카운터에서 방사활성을 측정한다. 자극한 RASMC의 증식은 또한 상업적으로 시판되는 브로모데옥시우리딘(BrdU) 세포 증식 분석(예컨대 Cell Proliferation ELISA, BrdU, Roche Applied Science), 세포 증식 시약 WST-1(Roche Diagnostics Scandinavia AB, Bromma, Sweden)(둘다 제조사의 설명서에 따름)을 이용하거나, 또는 세포 계수에 의해 분석할 수도 있다. 각 (유전자 발현을 연구하기 위한 실험)에서, 많은 수의 아사시킨 RASMC(1-5 x 10⁶ cell/웰)를, 10 ng/ml IGF-1 또는 10% 소 태아 혈청 (또는 PDGF)로, 또는 LPS (1-100 ng/mL), 1-10% 소 태아 혈청을 이용하여 4-48시간 자극시킨다(모든 자극은 테스트 약물(들)과 함께 및 무첨가하여 실시함). 그 후, 세포를 채집하여 마이크로어레이 실험을 위해 추가적으로 가공할 때까지 RLT 완충액(QIAGEN, Valencia, CA) 중에 동결(-80 ℃) 저장한다(하기 실시예 12 참조).

인간 기관지 평활근 세포(HBSMC, Promocell, Heidelberg, Germany)를 10% FBS, 100 units/mL 페니실린 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 0.12 IU/mL 인슐린이 첨가되고 2 ㎍/mL 암포테리신 B가 무첨가 또는 첨가된 DMEM에서 배양한다. 실험하기 전에, 세포를 FBS 저농도(0.3-5%)의 인슐린 결핍 배지 내에서 24시간 생장을 정지시킬 수 있다. IL-8 및 에오탁신과 같은 염증성 사이토카인과 케모카인의 생성과 방출을 자극하기 위해, HBSMC(80% 컨플루언스, 약 8 x 10⁵/25 cm² flask에 해당됨) 는, IL-1β 및 TNF-α(둘다 1-50 ng/mL)의 여러가지 조합과 더불어 24-48 시간 배양(1-10% 소 태아 혈청이 첨가되고 보충물이 첨가 또는 무첨가된 DMEM)한다. 세포를 테스트 약물(들)(서플라타스트와 스타의 조합, 서플라타스트 단독 및 스타틴 단독)과 함께 HBSMC 자극하기 1분 내지 24시간 동안 인큐베이션한다(37℃/5% CO₂, 0.3-10% 소 태아 혈청이 첨가되고 보충물이 첨가 또는 무첨가된 DMEM)(약물의 스톡 용액과 농도에 대해서는 상기 실시예 1 참조; 테스트 약물(들)은 또한 HBSMC 자극과 동시에 첨가될 수 있음). 비교를 위해, 일부 실험은 약물 첨가없이 수행한다. 인큐베이션/자극 후, 상층물내 인간 사이토카인 및 케모카인 농도를 상업적으로 시판되는 효소 면역-분석 키트(EIA/ELISA 키트)를 제조사의 설명서에 따라 사용하여 정량한다. 그 후 세포를 수집하여, 마이크로어레이 실험을 위해 추가적으로 가공할 때까지 RLT 완충액(QIAGEN, Valencia, CA) 중에 동결(-80 ℃) 저장한다(하기 실 시예 12 참조).

실시예 12

유전자 발현 분석

마우스 및 랫 조직 유래의 총 RNA(실시예 5 - 9, 15 및 16 참조)를 TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용한 후 RNeasy cleanup (QIAGEN, Valencia, CA)을 제조사의 프로토콜에 따라 분리한다. 상기 및 하기 실시예에 기술되어 있는 세포 인큐베이션/자극(마우스 비만 세포, MonoMac-6, PBMC, PMN, RAW 264.7, RASMC, HBSMC, NB4, HL-60)한 세포로부터 총 RNA를 RNeasy 미니 키트(QIAGEN)를 이용하여 RNase-Free DNase set(QIAGEN)와 함께 단독으로 제조사의 프로토콜에 따라 분리한다. 여러가지 조직 및 세포가 기원한 종에 따라, 마이크로어레이 분석은 GeneChip^®휴먼 게놈 U133 플러스 2.0 어레이, GeneChip^® 마우스 게놈 430 2.0 어레이 ㄸ또는 GeneChip^® 랫 게놈 230 2.0 어레이, 또는 이들 칩의 각 신규 버전(어레이 모두 Affymetrix사, Santa Clara, CA)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행한다. 마이크로어레이 발현 데이타는 예컨대 GeneChip 운영 소프트웨어(Affymetrix)와 바이오컨덕터/R (www.bioconductor.org)를 이용하여 분석한다. 그외 관련 소프트웨어도 사용할 수 있다.

여러가지 종의 유전자 발현은 또한 인간 게놈 서베이 마이크로어레이 V2.0, 마우스 게놈 서베이 마이크로어레이 V2.0 또는 랫 게놈 서베이 마이크로어레이(또는 이들 어레이의 해당 신규 버전)을 이용하여 제조사 Applied Biosystems (Foster City, CA)의 프로토콜에 따라 수행할 수도 있다. 이들 마이크로어레이 발현 데이타는, 예컨대 Oracle^® database of annotations, GeneSpring 7.2 (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA) 및 Microarray Suite version 5.0 software (MAS 5.0, Affymetrix)와 함께 제공되는 1700 화학발광 마이크로어레이 분석기(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 분석한다. 그외 관련 소프트웨어도 사용할 수 있다.

또한, 유전자 발현(mRNA 수준)은 정량 또는 반-정량 PCR로 분석할 수 있다. 단백질 수준에서의 유전자 발현 분석을 상업적으로 시판되는 효소 면역-분석 키트(EIA/ELISA 키트)를 (제조사의 설명서에 따라), 또는 통상적인 웨스턴 블롯 및/또는 면역조직화학적 방법으로 분석할 수 있다.

실시예 13

세포 증식 분석

자극한 마우스 비만 세포와 무자극 마우스 비만 세포인, 하기 및 상기 실시예에 언급된 MonoMac-6 세포, RAW 264.7 세포, NB4 세포, HL-60 세포 및 HBSMC 세포의 증식(하기 및 상기 실시예에 기술된 각 테스트 약물들 및/또는 자극의 가하기 전에, 0.1% - 5% 소 태아 혈청 중에 24-48시간 동안 증식을 정지시키거나 정지시키지 않고)을, 세포 증식 시약 WST-1(Roche Diagnostics Scandinavia AB, Bromma, Sweden) 또는 상업적으로 시판되는 브로모데옥시유리딘(BrdU) 세포 증식 분석(예, Cell Proliferation ELISA, BrdU, Roche Applied Science)을 제조사의 설명서에 따 라 이용하여 측정한다. 다른 기존의 세포 증식 테스트도 이용할 수 있다.

실시예 14

혈소판 응집 테스트

아데노신 디포스페이트(ADP), 아라키돈산, 콜라겐 또는 트롬복산 유사체 U046619에 의해 유도되는 토끼 또는 인간 혈소판의 응집을, 예컨대 Bertele et al (Eur. J. Pharmacol . 85, 331 (1982))에 기술된 바와 같이 응집측정(aggregometry)으로 분석한다. 유도된(상기와 같이) 혈소판 응집은 또한 세정한 인간 또는 토끼 혈소판을 이용하고 및/또는 그외 확립된 응집측정 또는 그외 대응되는 혈소판 응집 측정 방법으로 분석할 수 있다. 테스트 약물(들)(서플라타스트와 스타틴(피타바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴 또는 바람직하게는 심바스타틴, 로수바스타틴 또는 아토르바스타틴)의 조합, 서플라타스트 단독 및 스타틴 단독)을, 혈소판 응집을 유도하기 전 1-120분에 첨가한다(약물의 스톡 용액과 농도에 대한 상세한 사항은 상기 실시예 1 참조; 테스트 약물(들)은 또한 혈소판 응집 유도와 동시에 첨가될 수 있음). 비교를 위해, 일부 실험은 약물 첨가없이 수행한다.

실시예 15

자이모산 및 그외 자극에 의한 마우스 복막 염증 유도

본 분석은 근본적으로 Winter et al Rao et al (J. Pharmacol . Exp . Ther . 269, 917 (1994))에 기술된 방법에 따라 수행한다. (다른 마우스 균주도 사용할 수 있음) 테스트 약물(들)(서플라타스트와 스타틴(피타바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴 또는 바람직하게는 심바스타틴, 로수바스타틴 또는 아토 르바스타틴)의 조합, 서플라타스트 단독 및 스타틴 단독)을 0.03 - 50 mg/kg의 용량으로 2-24시간 마다 피하, 정맥내, 복막내 또는 경구 투여한다(비교를 위해, 일부 실험은 약물 없이 수행함). 투여하기 전에, 약물의 스톡 용액(상기 실시예 1 참조)을 예컨대 수(경구 처리) 또는 염수(비경구 투여용) 중의 0.5% 또는 1% 메틸셀룰로스에 필요한 만큼 희석한다. 다른 비히클도 사용할 수 있다. 1차 약물 투약 후 1분 내지 24시간에, 0.5-1 mL 멸균 PBS 중의 0.5-2 mg 자이모산 A(Sigma, cat. no. Z4250)를 복막내 주사한다(자이모산 A를 이용하는 대신, 복막 염증은 또한 항-마우스-IgE((마우스 IgE를 이용한 1-3일간 복막 전처리와 함께 전처리하지 않고), 콘카나발린 A, 카라기난, 프로테오세 펩톤, LPS, PMA, 티오글리콜레이트, 아라키돈산, fMLP, TNF, IL-1β와 같은 그외 잘 확립되어 있는 전-염증성 자극체를 전-염증성 농도로 복막내 주사하여 유도할 수도 있음). 또한, 테스트 약물(들)은 다른 전-염증성 자극 또는 자이모산의 복막내 주사와 동시에 투여할 수 있음). 자이모산(또는 그외 전-염증성 자극 한가지 이상) 주사 후 2-24시간에, 동물을 죽였다. 복강을 세척 완충액(3-5 mM EDTA 또는 5-10 units/ml 헤파린이 첨가 또는 무첨가된 빙냉한 PBS) 1-3 mL으로 헹군다. 세척액내 총 및 분화 백혈구 수를 헤모사이토미터와 이후의 터크 용액을 이용한 염색을 이용하거나 및/또는 May-Grunwald Giemsa 또는 변형된 Wright's (Diff-Quik) 염료 각각으로 염색한 사이토스핀 조제물 중에서 광 현미경으로 표준 형태 기준을 이용하여 측정한다. 또한 총 및 분화 백혈구 수 측정을 위한 다른 확립된 방법도 이용할 수 있다. 나머지 세척액을 원심분리(300-3000 x g, 4 ℃, 3-10 min)하고, 세포가 없는 세척액 상층물은 염증 매 개체 LTB₄, PGE₂, TXB₂ 및/또는 마우스 사이토카인/케모카인(예, IL-4, IL-6, TNF, IL-1β, KC, MCP-1, IL-10, IL-12p70, IFNγ)의 양을 상기 실시예 1 내지 47에 기술된 바와 같이 분석하기 전까지 냉동(-20 ℃ 내지 -80 ℃) 저장한다. 세척액 상층물내 히스타민의 함량은, 상업적으로 시판되는 히스타민 효소 면역-분석 키트(EIA/ELISA 키트)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 결정한다. 또한, 염증성 복막 세포 활성화를, 실시예 3에 기술된 β-헥소스아미니다제를 이용한 세척액내 β-헥소스아미니다제 활성 측정에 의해 조사할 수 있다. 세척액의 세포 펠렛은 0.1-1.0 mL 0.05 M KHPO₄ pH 6.0 + 0.5% HTAB에 재현탁하고, Rao et al (J. Pharmacol . Exp . Ther . 269, 917-25 (1994))에 기술된 바와 같이 마이엘로페록시다제(MPO)를 분석하기 전까지 냉동(-20 ℃ 내지 -80 ℃) 저장한다. 각 동물 유래의 동일한 세포 펠렛은 마이크로어레이 실험을 위해 추가적으로 가공할 때까지 RLT 완충액(QIAGEN, Valencia, CA) 중에 동결(-80 ℃) 저장한다(하기 실시예 12 참조). 세척 완충액으로 복강을 세정하는 시기에, 염증이 발생한 복막강으로부터 조직(복막벽, 장 및/또는 그외 복막내 또는 후복막 장기/조직) 생검을 취하여, 중량을 측정하고, (마이크로어레이 분석용 샘플은 -80 ℃에서 TRIzol(Invitrogen, Carlsbad, CA) 중에 동결됨)에서 동결 저장하며, 실시예 12에 기술된 바와 같이, 마이크로어레이 기법을 이용한 조직 유전자 발현에 대해 분석한다. 무처리 동물의 염증이 발생하지 않은 복강을 이용하여 MPO, 염증 매개체, 사이토카인/케모카인 및 유전자 발현의 베이스라인 수치로 제공한다. 또한, 조직 염증은 통상의 조직 및 면역조직화학 기법을 이용하여 조사할 수 있다.

실시예 16

자이모산 및 다른 자극에 의한 랫 복막 염증 유발

약 150-450 g의 수컷 Wistar 또는S prague Dawley 랫을 이용한다. 테스트 약물(들)(서플라타스트와 스타틴(피타바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴 또는 바람직하게는 심바스타틴, 로수바스타틴 또는 아토르바스타틴)의 조합, 서플라타스트 단독 및 스타틴 단독)을 0.03 - 50 mg/kg의 용량으로 동물에 2-24시간 마다 피하, 정맥내, 복막내 또는 경구 투여한다(비교를 위해, 일부 실험은 약물 없이 수행함). 투여하기 전에, 약물의 스톡 용액(상기 실시예 1 참조)을 예컨대 수(경구 처리) 또는 염수(비경구 투여용) 중의 0.5% 또는 1% 메틸셀룰로스에 필요한 만큼 희석한다. 다른 비히클도 사용할 수 있다. 1차 약물 투약 후 1분 내지 24시간에, 1-10 mL 멸균 PBS 중의 1-100 mg 자이모산 A(Sigma, cat. no. Z4250)를 (음파 처리하여 잘 혼합) 복막내 주사한다(자이모산 A를 이용하는 대신, 복막 염증은 또한 항-마우스-IgE((랫 IgE를 이용한 1-3일간 복막 전처리하거나 전처리하지 않고), 콘카나발린 A, 단백질 L, 화합물 48/80, 카라기난, 프로테오세 펩톤, LPS, PMA, 티오글리콜레이트, 아라키돈산, fMLP, TNF, IL-1β와 같은 그외 잘 확립되어 있는 전-염증성 자극체를 전-염증성 농도로 복막내 주사하여 유도할 수도 있음)(또한, 테스트 약물은 다른 전-염증성 자극 또는 자이모산의 복막내 주사와 동시에 투여할 수 있음). 자이모산(또는 그외 전-염증성 자극 한가지 이상) 주사 후 2-24시간에, 동물을 죽였다. 복강을 세척 완충액(3-5 mM EDTA 또는 5-10 units/ml 헤파린이 첨가 또는 무첨가된 빙냉한 PBS) 10-20 mL으로 헹군다. 세척액내 총 및 분화 백혈구 수를 헤모사이토미터와 이후의 터크 용액을 이용한 염색을 이용하거나 및/또는 May-Grunwald Giemsa 또는 변형된 Wright's (Diff-Quik) 염료 각각으로 염색한 사이토스핀 조제물 중에서 광 현미경으로 표준 형태 기준을 이용하여 측정한다. 또한 총 및 분화 백혈구 수 측정을 위한 다른 확립된 방법도 이용할 수 있다. 나머지 세척액을 원심분리(300-3000 x g, 4 ℃, 3-10 min)하고, 세포가 없는 세척액 상층물은 염증 매개체 LTB₄, PGE₂, TXB₂ 및/또는 랫 사이토카인/케모카인(예, IL-4, IL-6, TNF, IL-1β, KC, MCP-1, IL-10, IL-12p70, IFNγ)의 양을 상기 실시예 1 내지 47에 기술된 바를 기본으로하여 분석하기 전까지 냉동(-20 ℃ 내지 -80 ℃) 저장한다. 세척액 상층물내 히스타민의 함량은, 상업적으로 시판되는 히스타민 효소 면역-분석 키트(EIA/ELISA 키트)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 결정한다. 또한, 염증성 복막 세포 활성화를, 실시예 3에 기술된 β-헥소스아미니다제를 이용한 세척액내 β-헥소스아미니다제 활성 측정에 의해 조사할 수 있다. 세척액의 세포 펠렛은 0.1-1.0 mL 0.05 M KHPO₄ pH 6.0 + 0.5% HTAB에 재현탁하고, Rao et al (J. Pharmacol . Exp . Ther . 269, 917-25 (1994))에 기술된 바를 기본으로하여 마이엘로페록시다제(MPO)의 양을 분석하기 전까지 냉동(-20 ℃ 내지 -80 ℃) 저장한다. 각 동물 유래의 동일한 세포 펠렛은 마이크로어레이 실험을 위해 추가적으로 가공할 때까지 RLT 완충액(QIAGEN, Valencia, CA) 중에 동결(-80 ℃) 저장한다(하기 실시예 12 참조). 세척 완충액으로 복강을 세정하는 시기에, 염증이 발생 한 복강으로부터 조직(복막벽, 장 및/또는 그외 복막내 또는 후복막 장기/조직) 생검을 취하여, 중량을 측정하고, (마이크로어레이 분석용 샘플은 -80 ℃에서 TRIzol(Invitrogen, Carlsbad, CA) 중에 동결됨)에서 동결 저장하며, 실시예 12에 기술된 바와 같이, 마이크로어레이 기법을 이용한 조직 유전자 발현에 대해 분석한다. 무처리 동물의 염증이 발생하지 않은 복강을 이용하여 MPO, 염증 매개체, 사이토카인/케모카인 및 유전자 발현의 베이스라인 수치로 제공한다. 또한, 조직 염증은 통상의 조직 및 면역조직화학 기법을 이용하여 조사할 수 있다.

실시예 17

NB4 및 HL -60 세포 염증 매개체 방출 분석

인간 NB4 세포(Lanotte et al , Blood , 77, 1080 (1991))를 100 units/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 및 10% (v/v) 소 태아 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양(37℃/5% CO₂)한다. 분화를 위해, 1-5 μM의 모든-trans-레티노사(ATRA)를 통상 3일 마다 첨가한다.

인간 HL-60 세포(Steinhilber et al , Biochim . Biophys . Acta 1178, 1 (1993))는 100 units/mL 페니실린 100 ㎍/mL ,스트렙토마이신 및 10-20% (v/v) 소 태아 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양(37℃/5% CO₂)한다. 분화를 위해, 1ATRA (1-5 μM), DMSO (1-2%), PMA (100-500 ng/mL) 또는 비타민 D₃(1-15 μM)를 5일간 첨가한다.

염증 매개체 루코트리엔 B₄(LTB₄)의 생성과 방출을 자극하기 위해, 분화되거 나 미분화된 NB4 또는 HL-60 세포(1-15 x 10⁶/mL)를. 10-40 μM 아라키돈산 및/또는 2-10 μM 칼슘 이온포어 A23187와 함께 5-30분(37℃, 칼슘이 첨가된 PBS)기 인큐베이션한다. NB4 및 HL-60 세포는 또한, 아데노신 디포스페이트(ADP), fMLP, 및/또는 트롬복산 유사체 U-46619를 입증된 생물학적 활성 농도로, 상기한 A23187 및/또는 아라키돈산과 함께 또는 이용하지 않고, 자극할 수 있다. 상기 NB4 및 HL-60 인큐베이션/자극은 또한 (건강한 공여자 혈액 유래의) 인간 혈소판 존재 하에, NB4/HL-60:혈소판이 1:10 내지 1`:10000인 비율에서 수행하였다. 인큐베이션/자극은, 내부 표준 물질로서 1 mL 차가운 메탄올과 프로스타글란딘 B₂로 중지시켰다. 샘플을 원심분리하여, 상층액을 물로 희석하여 메탄올 최종 농도가 30%가 되게 하였고, pH는 3-4로 조정하였다. 상층액내의 아라키돈산 대사산물을 미리 조정한(1 mL 메탄올 후 1 mL H₂O) C18 고상 컬럼(Sorbent Technology, U.K.)에서 추출하였다. 대사산물을 메탄올로 용출시킨 후, 1배수의 물을 용출물에 첨가하였다. 역상 HPLC에서는 각 샘플 76 ㎕에 39 ㎕ H₂O(다른 부피 비율로 사용할 수 있음)를 혼합하였다. Waters RCM 8 x 10 컬럼을 메탄올/아세토니트릴/H₂O/아세트산(30:35:35:0.01 v/v)으로 유속 1.2 mL/min으로 용리시켰다. PGB₂ 및 LTB₄를 검출 및 정량하기 위해 용출물의 흡광도를 270 nm에서 모니터링하였다. 시판되는 효소 면역-분석 키트(EIA/ELISA 키트)를 LTB₄ 측정을 위해 키트 제조사의 설명서에 따라 사용하였다. 제조사의 설명서에 따라 시판되는 효소 면역-분석 키트(EIA/ELISA 키트)를 이용하 여, 또한 상기 NB4/HL-60 인큐베이션/자극으로부터 수득한 상층액을 염증 매개체인 프로스타글란딘 E₂(PGE₂) 및/또는 트롬복산 B₂(TXB₂)의 함량에 대해 분석할 수 있다. 세포를, 염증 매개체 방출을 위한 NB4 또는 HL-60 자극하기 전 1분 내지 24시간 동안, 테스트 약물(들)(서플라타스트와 스타틴(피타바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴 또는 바람직하게는 심바스타틴, 로수바스타틴 또는 아토르바스타틴)의 조합, 서플라타스트 단독 및 스타틴 단독)과 함께 (37℃, 칼슘이 무첨가된 PBS, 또는 1-20% 소태아 혈청이 첨가되고 보충제가 첨가 또는 무첨가된 RPMI-1640 배지에서) 인큐베이션한다(약물의 스톡 용액과 농도에 대해서는 상기 실시예 1 참조; 테스트 약물(들)은 또한 NB4/HL-60 자극과 동시에 첨가될 수 있음). 비교를 위해, 일부 실험은 약물 첨가없이 수행한다.

IL-1β, IL-6, TNF, IL-8, IL-10, IL-12p70, MCP-1, PAF, C5a와 같은 염증성 사이토카인 및 케모카인의 생성과 방출을 자극하기 위해, 분화되거나 미분화된 NB4 또는 HL-60 세포(1-10 x 10⁶/mL)를 리포폴리사카라이드(LPS, 1-100 ng/mL), 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA, 1-100 ng/mL), 칼슘 이온포어 A23187 (1-10 μM) 또는 이들 자극체의 조합과 함께, (1-10% 소태아 혈청이 첨가되고 보충제가 첨가 또는 무첨가된 RPMI-1640 배지에서) 4-24시간 동안 인큐베이션(37℃/5% CO₂)한다. 또한, NB4 및 HL-60 세포는, 상기 LPS, PMA 및/또는 A23187의 첨가 또는 무첨가한 상태에서, 아데노신 디포스페이트(ADP) 및/또는 트롬복산 유사체 U-46619를 입증된 생물학적으로 활성인 농도로 사용하여, 자극할 수 있다. NB4 및 HL-6의 인 큐베이션/자극은 또한 (건강한 공여자 혈액 유래의) 인간 혈소판 존재 하에, NB4/HL-60:혈소판이 1:10 내지 1`:10000인 비율에서 수행할 수 있다. 세포를, 사이토카인/케모카인/매개체 방출을 위한 NB4 또는 HL-60 자극 전 1분 내지 24시간 동안, 테스트 약물(들)(서플라타스트와 스타틴의 조합, 서플라타스트 단독 및 스타틴 단독)과 함께 (37℃/5% CO₂, 1-10% 소태아 혈청이 첨가되고 보충제가 첨가 또는 무첨가된 RPMI-1640 배지에서) 인큐베이션한다(비교를 위해, 일부 실험에서는 약물 없이 수행하며; 테스트 약물(들)은 또한 NB4/HL-60 자극과 동시에 첨가될 수 있음). 세포를 스핀 다운한 다음, 인간 사이토카인/케모카인 및 매개체의 상층액내 농도를 세포측정 비드 분석(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, USA)을 이용하여 제조사의 설명에 따라 정량한다. 또한, 사이토카인/케모카인 및 매개체 측정을 위한 상업적으로 시판되는 효소 면역-분석 키트(EIA/ELISA 키트)를 제조사의 설명서에 따라 사용할 수 있다. 세포 펠렛은 마이크로어레이 실험을 위해 추가적으로 가공할 때까지 RLT 완충액(QIAGEN, Valencia, CA) 중에 동결(-80 ℃) 저장한다(하기 실시예 12 참조).

호중구-유사 NB4 및 HL-60 세포로부터 매개체 및 케모카인/사이토카인의 방출에 대한 상기 약물의 효과 연구 외에도, 이들 세포의 자발적인 또는 자극성 유착 및/또는 이동에 대한 약물의 효과도 분석할 수 있다(표준 프로토콜에 따라 분리한 신선하게 분리된 인간 혈액 다핵형 세포(PMN)도 사용할 수 있음). PMN 또는 호중구-유사 세포의 예컨대 배양한 내피 세포 또는 단백질 코팅된 인공 표면으로의, 자 발성 또는 (fMLP, IL-8, PAF, LTB₄ 또는 다른 관련 PMN 활성화성 인자를 이용한) 자극에 의한 유착은 잘 확립되어 있으며 입증된 실험 방법과 분석, 예컨대 이러한 이동 연구용으로 고안된 시판되는 단백질 코팅된 막을 통한 이동으로 연구한다.

실시예 18

인간 전혈액에서의 혈소판 및 백혈구의 활성화

정맥혈을 부피의 1/10이 129 mM 트리소듐 사이트레이트(Becton Dickinson, Meylan, France)로 충진된 실리콘 진공 채혈관을 이용하여 정치하지 않으면서 정맥천자(venepuncture)로 채혈한다. 전혈액 혈소판 P-셀렉틴 발현(혈소판 활성을 반영함), 백혈구 CD11b 발현(백혈구 활성을 반영함), 단일 혈소판 및 혈소판-혈소판 미세응집 카운팅, 및 혈소판-백혈구 응집(PLA)은, 이전에 기술된 바(Li et al . Circulation 100, 1374 (1999))를 기본으로 하여 유세포 측정 분석으로 측정한다. 간략하게는, 전혈액 분획 5 ㎕를 , 아데노신 디포스페이트(ADP), U-46619, U-44069, 혈소판 활성화 인자(PAF), 아라키돈산, 콜라겐 또는 트롬빈과 같은 혈소판 활성화 자극, 및/또는 N-포르밀-메티오닐-루실-페닐알라닌(fMLP), 아라키돈산, PAF, LPS, A23187 또는 LTB₄와 같은 백혈구 활성화 자극의 존재 또는 부재하에, 대략적으로 희석한 항체(하기 참조)를 포함하는 헤르페스 완충 염수(150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 10 mM Hepes, pH 7.4) 45 ㎕에 첨가한다. 혈액을 혈소판 및/또는 백혈구 활성화 자극 + 항체에 노출하기 전에, 혈액 샘플(0.1-1 ml)을 테스트 약물(들)(서플라타스트와 스타틴(피타바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 프라바 스타틴 또는 바람직하게는 심바스타틴, 로수바스타틴 또는 아토르바스타틴)의 조합, 서플라타스트 단독 및 스타틴 단독)과 1-60분간 인큐베이션한다(테스트 약물(들)은 상기 자극과 동시 투여될 수 있음). 비교를 위해, 일부 실험은 약물 노출없이 수행한다. 혈소판 P-셀렉틴 발현은, R-피코에리트린(RPE)-CD62P 단일클론 항체(MAb) AC1.2 (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에 의해 결정한다. 백혈구 CD11b 발현은 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-접합된 MAb BEAR 1 (Immunotech, Marseille, France)에 의해 결정한다. FITC 및 RPE 접합된 이소타입의 MAb는 음성 대조군으로 사용된다. 혈소판 계수에 사용되는 플루오레센트 비드(SPHERO™ Rainbow particles, 1.8-2.2 μM)는 PharMingen 사(San Diego, CA, USA) 제품이다. 혈소판은 FITC 접합된 항-CD42a (GPIX) MAb Beb 1(Becton Dickinson)로 식별하고, 백혈구는 RPE 접합된 항-CD45 MAb J33(Immunotech)로 식별한다. (약물 처리하거나 무처리한 혈액 + 항체와 자극 처리 또는 자극 무처리) 샘플을 실온에서 암 조건으로 20분간 인큐베이션한다. 그 후, 샘플을 희석하여 0.5 % (v/v) 포름알데하이드 염수로 알맞게 고정하고, 다양한 혈소판 및 백혈구 파라미터에 대해 Beckman-Coulter EPICS XL-MCL 유세포 측정기(Beckman-Coulter Corp., Hialeah, FL)로 분석한다. 혈소판 P-셀렉틴 발현 데이타는 혈소판 집단에서의 P-셀렉틴 양성 세포의 비율로 그리고 P-셀렉틴 양성 혈소판의 절대 수(absolute count)로 기록한다. 백혈구 CD11b 발현은 총 백혈구 집단의 평균 형광 강도(MFI)와 백혈구 서브집단의 MFI로 기록한다. 혈소판-백혈구 응집(PLA)는 총 백혈구 집단, 특히 림프구, 단핵구 및 호중구에서의 혈소판-접합된 백혈구의 절 대 수 및 퍼센트로 나타낸다. 다른 관련 시약, 실험 조건/방법, 장비와 인간 전혈액에서의 해당 혈소판과 백혈구 활성화를 측정하기 위한 분석 방식을 사용할 수 있다.

실시예 19

서플라타스트 및 로수바스타틴에 의한 대식세포로부터 종양 괴사 인자의 분비 저해

인간 대식 세포주 MonoMac-6 (MM6) (Ziegler-Heitbrock et al , Int . J. Cancer, 41, 456 (1988)) 유래 세포를 1 mM 소듐 피루베이트, 1x 비필수 아미노산, 10 ㎍/mL 인슐린, 1 mM 옥살아세트산, 100 units/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 및 10% (v/v) 소 태아 혈청이 첨가된 RPMI-1640 배지에서 배양(37℃/5% CO₂)하였다. 실험 개시시에, MM6 세포를 96웰 플레이트에 1x10⁵ cells/mL(생활성 실험에서는 웰 당 100 ㎕, TNF 분비 실험에서는 웰 당 150 ㎕ - 하기 참조)로 접종하였다.

세포의 생활성/증식 정량 또는 포르볼-12-미리스트레이트-13-아세테이트(PMA; Sigma-Aldrich, Stockholm, Sweden)를 이용한 자극을 수행하기 48시간 전에, MM6 세포에 테스트 약물을 지정된 최종 농도로 처리(상기와 동일한 인큐베이션 조건)한 후, PMA-유도성 TNF-분비를 측정하였다(구체적인 내용은 하기 참조).

종양 괴사 인자(TNF)의 생성 및 분비를 자극하기 위해, MM6 세포를 최종 농도 10 ng/ml의 PMA와 5시간 동안 (상기 보충물이 첨가되고 5% 소 태아 혈청이 보강 된 RPMI-1640에서) 인큐베이션(37℃/5% CO₂)하였다.

여러가지 MM6 인큐베이션/자극(상기 및 하기 내용 참조) 후 세포를 스핀 다운한 다음, 상층액내 TNF의 농도를 BD Biosciences - Pharmingen (San Diego, USA)사의 인간 TNF ELISA 키트 II를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 정량하였다.

MM6 세포의 증식/생활성을 세포 증식 시약 WST-1(Roche Diagnostics Scandinavia AB, Bromma, Sweden)을 이용하여 측정하였다. WST-1 시약은 예컨대 세포의 증식 및 생활성을 분광광도법으로 정량하는데 사용하도록 고안된 것으로, 제조사의 설명서에 따라 사용하였다. 흡광도 측정 파장은 450 nm이고, WST-1 시약에 노출된 MM6 세포가 든 웰들은 모두 흡광도가 0.95 보다 높았다(각 조건에서 n = 3).

서플라타스트(토실레이트 염 구입, American Custom Chemicals Corporation, San Diego, USA) 및 로수바스타틴(소듐염; 로수바스타틴은 시판되는 Crestor^®로부터 추출 및 정제한 후, Bioorganic & Medicinal Chemistry, Vol. 5, No. 5, pp 437-444, 1997에 기술된 바와 같이 소듐염으로서 분리됨)의 스톡 용액은 멸균 염수 중에서 제조하였다.

PMA에 노출시키지 않은 MM6 세포에서는 TNF가 검출가능한 수준으로 생산되지 않았다. 그러나, PMA 자극 5시간 후, 평균적인 TNF의 농도는 무처리 MM6 세포의 상층액에서 41.1 pg/mL(n=2)이었다.

MM6 세포에 로수바스타틴을 단독으로 최종 농도 10 μM 또는 30 μM로 처리 한 후, PMA 자극 후 TNF 평균 농도는 각각 76.7 pg/mL 및 84.0 pg/mL로 증가하였다(각 농도, n=2).

MM6 세포에 서플라타스트를 단독으로 최종 농도 1 μM 또는 10 μM로 처리한 후, TNF 평균 농도는 각각 39.6 pg/mL(3.8% 감소) 및 34.8 pg/mL(15.4% 감소)로 조금 감소하였다(각 농도, n=2).

MM6 세포에 1 μM 서플라타스트를 10 μM 또는 30 μM의 로수바스타틴의 존재 하에 처리하였을 때, 로수바스타틴을 단독으로 각각 10 μM 또는 30 μM로 처리하였을 때(상기 참조)에 비해, PMA-유발성 TNF 분비는 각각 36.1% 및 34.6%(평균값, 각 조합에 대해 n=2)로 상승적으로 저해되었다. 또한, MM6 세포에 10 μM 서플라타스트를 10 μM 또는 30 μM의 로수바스타틴의 존재 하에 처리하였을 때, 로수바스타틴을 단독으로 각각 10 μM 또는 30 μM로 처리하였을 때(상기 참조)에 비해, TNF 분비는 각각 88.5% 및 75.1%(평균값, 각 조합에 대해 n=2)로 상승적으로 저해되었다.

무처리 MM6 세포와 비교하여, 10 μM 또는 30 μM의 로수바스타틴을 48시간 처리한 MM6 세포의 생활성(상기와 같인 WST-1을 이용하여 분석)은 각각 105% 및 102%였다. 1 μM 또는 10 μM의 서플라타스트 처리시의 결과는 각각 94% 및 92%였으며, 상기 4가지 로수바스타틴-서플라타스트 조합의 경우 그 결과는 각각 124% (서플라타스트 1 μM + 로수바스타틴 10 μM), 125% (서플라타스트 1 μM + 로수바스타틴 30 μM), 114% (서플라타스트 10 μM + 로수바스타틴 10 μM) 및 121% (서플라타스트 10 μM + 로수바스타틴 30 μM)였다. 따라서, 로수바스타틴-서플라타 스트 조합에 의한 상승적인 TNF 저해는 세포 증식 또는 생활성 감소에 의해 초래된 것은 아니었다.

실시예 20

서플라타스트 및 아토르바스타틴에 의한 대식세포로부터 종양 괴사 인자의 분비 저해

상기 실시예 19의 방법을 로수바스타틴 대신 아토르바스타틴(소듐염; 인도 방갈로 Biocon, Ltd. 사로부터 선물로 아토르바스타틴 칼슘염을 제공받았으며, 염화수소산 수용액을 첨가하여 상기 칼슘염을 유리산으로 먼저 변환시킨 후, NaOH 수용액을 등가로 첨가하여 추출에 의해 분리함)에 대해 반복 실시하였다.

MM6 세포에 아토르바스타틴을 단독으로 최종 농도 10 μM 또는 30 μM로 처리한 후, PMA 자극 이후의 TNF 평균 농도는 (무처리 세포에 비해) 각각 133.6 pg/mL 및 59.7 pg/m로 증가되었다(각 농도에 대해 n=2).

MM6 세포에 1 μM 서플라타스트를 10 μM 또는 30 μM의 아토르바스타틴의 존재 하에 처리하였을 때, 아토르바스타틴을 단독으로 각각 10 μM 또는 30 μM로 처리하였을 때(상기 참조)에 비해, PMA-유발성 TNF 분비는 각각 35.0% 및 76.9%(평균값, 각 조합에 대해 n=2)로 상승적으로 저해되었다. 또한, MM6 세포에 10 μM 서플라타스트를 10 μM 또는 30 μM의 아토르바스타틴의 존재 하에 처리하였을 때, 아토르바스타틴을 단독으로 각각 10 μM 또는 30 μM로 처리하였을 때(상기 참조)에 비해, TNF 분비는 각각 84.0% 및 93.9%(평균값, 각 조합에 대해 n=2)로 상승적 으로 저해되었다.

무처리 MM6 세포와 비교하여, 10 μM 또는 30 μM의 아토르바스타틴을 48시간 처리한 MM6 세포의 생활성(상기와 같이 WST-1을 이용하여 분석)은 각각 94% 및 79%였다. 4가지 아토르바스타틴-서플라타스트 조합의 경우 그 결과는 각각 110% (서플라타스트 1 μM + 아토르바스타틴 10 μM), 855% (서플라타스트 1 μM + 아토르바스타틴 30 μM), 97% (서플라타스트 10 μM + 아토르바스타틴 10 μM) 및 90%(서플라타스트 10 μM + 아토르바스타틴 30 μM)였다. 따라서, 아토르바스타틴-서플라타스트 조합에 의한 상승적인 TNF 저해는 세포 증식 또는 생활성 감소에 의해 초래된 것은 아니었다.

전술한 하나 이상의 실시예들은 서플라타스트와 스타틴(예, 심바스타틴 및 특히 로수바스타틴 및/또는 아토르바스타틴)의 조합에서의 명백한 상승 효과를 입증하고 있다.

Claims

(a) 서플라타스트(suplatast) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물; 및

(b) 스타틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 포함하는 조합 산물(combination product).
제1항에 있어서, 상기 스타틴이 피타바스타틴(pitavastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 심바스타틴(simvastatin), 로바스타틴(lovastatin), 로수바스타틴(rosuvastatin), 프라바스타틴(pravastatin) 및 아토르바스타틴(atorvastatin) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조합 산물.
제2항에 있어서, 상기 스타틴이 로수바스타틴 및 아토르바스타틴 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조합 산물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 서플라타스트 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물; 스타틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 포함하는 약학 제형; 및 약학적으로 허용가능한 보강제, 희석제 또는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조합 산물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 하기 성분을 포함하며, 성분 (A)와 (B)가 각각 서로 병용 투여하기에 적합한 형태로 제공되는 키트를 포함하는 것을 특징으로 하는 조합 산물:

(A) 서플라타스트 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 약학적으로 허용가능한 보강제, 희석제 또는 담체와 혼합된 형태로 포함하는 약학 제형; 및

(B) 스타틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 약학적으로 허용가능한 보강제, 희석제 또는 담체와 혼합된 형태로 포함하는 약학 제형.
성분 (A)를 성분 (B)와 조합하여, 상기 2가지 성분이 서로 병용 투여하기 적합하게 되도록 하는 단계를 포함하는 제5항에 따른 키트의 제조 방법.
(I) 제5항에 따른 성분 (A) 및 성분 (B) 중 한가지와

(II) 상기 한가지 성분을 상기 2가지 성분들 중 다른 성분과 병용하기 위한 사용 안내서를 포함하는 키트.
제1항 내지 제5항 또는 제7항 중 어느 한항에 있어서, 상기 스타틴이 스타틴 락톤 형태로 사용되지 않는 것을 특징으로 하는 조합 산물.
제1항 내지 제5항 또는 제7항 중 어느 한항에 있어서, 상기 사용되는 스타틴 이 로바스타틴 락톤 또는 심바스타틴 락톤인 것을 특징으로 하는 조합 산물.
제5항 또는 제7항 내지 제9항 중 어느 한항에 기재된 키트로서, 성분 (A)와 (B)가 염증 장애 치료에 순차적으로, 개별적으로 및/또는 동시에 사용하기에 적합한 것을 특징으로 하는 키트.
염증 장애의 치료용 약제 제조를 위한 제1항 내지 제5항 또는 제7항 내지 제10항 중 어느 한항에 따른 조합 산물의 용도.
치료가 필요한 환자에게 제1항 내지 제5항 또는 제7항 내지 제10항 중 어느 한항에 따른 조합 산물을 투여하는 단계를 포함하는 염증 장애의 치료 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한항에 있어서, 상기 장애가 편두통, 천식, 만성 폐색성 폐 질환, 편두통, 크론 질환, 다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스 또는 궤양성 대장염 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 키트, 용도 또는 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한항에 있어서, 상기 장애가 죽상경화증 또는 관련 심혈관 장애인 것을 특징으로 하는, 키트, 용도 또는 방법.
제14항에 있어서, 상기 장애가 죽상경화증인 것을 특징으로 하는, 키트, 용도 또는 방법.
제14항에 있어서, 상기 죽상경화증과 관련있는 심혈관 장애가 대동맥류, 죽상경화증, 말초 동맥 폐색성 질환, 관상 동맥 질환, 관상 질환, 플라그 파열 및/또는 불안정증, 죽종 파열 및/또는 불안정증, 혈관 질환, 동맥 질환, 허혈성 질환, 허혈증 및 발작 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 키트, 용도 또는 방법.
제16항에 있어서, 상기 관상 동맥 질환이 협심증, 심근경색 및 심장 마비 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 키트, 용도 또는 방법.
제16항에 있어서, 상기 관상 질환이 심장병(cardiac disease) 및 심장병(heart disease) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 키트, 용도 또는 방법.
제16항에 있어서, 상기 발작이 뇌-혈관 발병 및 일과성 허혈성 발작 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 키트, 용도 또는 방법.
제16항에 있어서, 상기 장애가 플라그 파열 및/또는 불안정증, 또는 죽종 파열 및/또는 불안정증인 것을 특징으로 하는, 키트, 용도 또는 방법.
제10항 내지 제20항 중 어느 한항에 있어서, 상기 환자가 급성 관상 증후군을 앓고 있는 것을 특징으로 하는, 키트, 용도 또는 방법.