CN101668521A - 用于治疗炎症的新组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供组合产品，其包含：(a)甲磺司特，或其药用盐或者溶剂化物；和(b)他汀，或其药用盐或者溶剂化物。这些组合产品在动脉硬化症和相关病症的治疗中存在特殊用途。

Description

用于治疗炎症的新组合物
技术领域
本发明涉及新的药物组合物。
背景技术
心血管病，比如冠心病和中风是死亡、残疾和卫生保健费用损失的主因，特别是在工业化国家中。这些病症常常是动脉粥样硬化症，即一种在抽烟的受试者中优先产生的多因素病症的直接后遗症，和/或存在危险因素比如高血压、糖尿病、高胆固醇血症、高血浆低密度脂蛋白(LDL)和甘油三酯。
通常经过几年，有时经过数十年产生动脉粥样硬化病灶(或者斑)。典型地涉及诸如在动脉壁中的胆固醇累积量、泡沫细胞形成、炎症和细胞增殖的病理过程。
高密度脂蛋白(HDL)、LDL、总胆固醇和甘油三酯的水平均是确定产生动脉粥样硬化症和相关心血管病症比如冠状动脉病(例如心绞痛，心肌梗死等)、中风(包括脑血管意外和瞬间局部缺血性发作)和周围动脉闭塞性疾病的风险的指标。
具有高的总胆固醇和/或甘油三酯水平的患者的风险是相当大的，与他们是否还具有有利的HDL水平无关。具有正常的总胆固醇水平但是具有较低的HDL水平的患者的风险也在增加。近来，还已经指出与高水平的脱脂载脂蛋白B(ApoB；其携带极低密度脂蛋白(VLDL)和LDL中的类脂)和/或低水平的脱脂载脂蛋白A-I(ApoA-I；其携带HDL中的类脂)相关的心血管病的风险水平是极高的。
降低血清中LDL水平的药物可以降低动脉粥样硬化斑的累积量，并且可以降低(长期)斑破裂和相关的血栓栓塞并发症的风险。有几种药物可以有助于降低血液胆固醇水平。最通常开出的处方是羟甲基戊二酰基-CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂(以下不管其类名均定义为“他汀”)，包括辛伐他汀和阿托伐他汀。这些药物直接防止肝中形成胆固醇，因此降低心血管病的风险。
其它处方药类包括树脂(resins)(比如考来烯胺和考来替泊)，其通过结合胆汁酸起作用，因而使肝产生更多的胆汁酸，并且在该过程中耗尽胆固醇。此外，维生素B烟酸已经被报道在高的剂量时除增加HDL水平以外，还降低甘油三酯和LDL水平。已知Fibrate(比如吉非贝齐和非诺贝特)降低甘油三酯并且可以增加HDL水平。
胆固醇降低药物比如他汀的引入显著地降低冠心病和中风的死亡率。然而，这些药物所遇到的缺点在于它们对于所有患者的效果并不是相同的，并且已知具有某种负面效应(例如肝功能变化，肌病和横纹肌溶解)，以及动脉粥样硬化症仍然是死亡和残疾的主要原因。事实上，最近的评论文章(Briel等，JAMA，295，2046(2006))提出他汀在患有急性冠状综合征的患者的前四个月治疗过程中并不减少急性心血管事件。
因此，对动脉粥样硬化症和相关的心血管病症，特别是对患有急性冠状综合征的那些患者的更安全和/或更有效的治疗存在实际临床需要。
甲磺司特是一种Th2细胞因子抑制剂，其抑制Th2细胞释放IL-4和IL-5以及肥大细胞释放化学调节剂。因此，表明甲磺司特适用于治疗诸如哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、间质性膀胱炎和慢性非细菌性前列腺炎的病症。参见，例如，Tamoaki，国际过敏学(Allergology International)，53，55(2004)和Suwaki等，国际免疫药理学(InternationalImmunopharmacology)，1，2163(2001)。已经表明甲磺司特适用于急性嗜酸性细胞性心肌炎的可能的治疗(参见，Umemoto等，心血管(HeartVessels)，18，100(2003))。
美国专利申请US 2007/0014733公开用于治疗心血管病症的药物组合物，其包括奈必洛尔的代谢物。甲磺司特是列出的可以与所述组合物中所述代谢物组合的许多种活性成分之一。
美国专利申请US 2006/0135577和US 2006/0148830公开LPA受体(且特别是EDG-2受体)的新型拮抗剂，其还用于泌尿系统的病症、炎症等。甲磺司特和他汀类分别提到属于可以与所述新型化合物组合的许多不同的活性成分。
美国专利申请US 2003/0104048公开新型药物剂型，其包括含有亲水性表面活性剂的填充剂，所述填充剂包括由外壳包封的药物活性成分。在许多可能用于所述剂型的药物候选中列出了多种化合物，包括本文提及的那些中的一些。
最后，美国专利申请US 2006/0084695公开了用于治疗心血管病，比如动脉粥样硬化症等的MAP激酶和/或HMG-CoA还原酶的抑制剂。
具体包含甲磺司特和他汀的组合产品的应用在上述任何一个文献中均没有具体被公开。此外，这种组合产品在治疗动脉粥样硬化症和相关的心血管病症，特别是患有急性冠状综合征的患者中的用途在这些文献的任何一个中均没有被公开。
发明内容
根据本发明，提供一种组合产品，其包含：
(a)甲磺司特，或者其药用盐或者溶剂化物；和
(b)他汀，或其药用盐或者溶剂化物，
所述组合产品以下被称为“根据本发明的组合产品”。
术语“他汀”包括一种或多种他汀。术语“他汀”和“HMG-CoA还原酶抑制剂”在本发明的范围内同义使用，并且包括氟伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、罗苏伐他汀、匹伐他汀、格仑伐他汀、西立伐他汀、普伐他汀、美伐他汀、柏伐他汀、达伐他汀和阿托伐他汀。
可以提及的其它他汀包括阿昔替酯、苯氟雷司、Clestin、考来酮、二氢洛伐他汀、美格鲁托、rawsonol以及具有下列代号的化合物：ATI-16000、BAY-10-2987、BAY-x-2678、BB-476、BIO-002、BIO-003、BIO-2、BMS-180431、CP-83101、DMP-565、FR-901512、GR-95030、HBS-107、KS-01-019、L-659699、L-669262、NR-300、P-882222、PTX-023595、RP61969、S-2468、SC-32561、sc-45355、SDZ-265859、SQ-33600、U-20685以及NO-增强/释放他汀，比如NCX-6560(硝基普伐他汀)。
更优选的他汀包括匹伐他汀(例如
Figure G2008800109115D00031
)，并且更优选氟伐他汀(例如
Figure G2008800109115D00032
)、辛伐他汀(例如
Figure G2008800109115D00033
)、洛伐他汀(例如)、罗苏伐他汀(例如
Figure G2008800109115D00035
)、普伐他汀(例如
Figure G2008800109115D00041
)以及阿托伐他汀(例如)。特别优选的他汀包括辛伐他汀、更优选阿托伐他汀，并且特别是罗苏伐他汀。
可以提及的药用盐包括酸加成盐和碱加成盐。这样的盐可以通过常规的方法形成，例如通过活性成分的游离酸或游离碱的形式与1当量以上适合的酸或碱任选在其中不溶解该盐的溶剂中，或者介质中反应，随后使用标准技术(例如在真空中，通过冷冻干燥或者通过过滤)除去所述的溶剂或者所述的介质。盐还可以通过例如使用适合的离子交换树脂将盐形式的活性成分的抗衡离子与另一种抗衡离子交换而制备。
优选的甲磺司特盐包括甲苯磺酸舒普拉司特(suplatast tosylate)。
优选的他汀盐包括钠、钾和钙盐，比如匹伐他汀钙、氟伐他汀钠、普伐他汀钠、罗苏伐他汀钙和阿托伐他汀钙。
在根据本发明的组合产品中(且特别是甲磺司特中)使用的活性成分可以以非对映异构体富含形式和/或对映异构体富含形式使用。发明人的用意是通过“非对映异构体富含”和“对映异构体富含”分别表示活性成分的非对映异构体/对映异构体的任意混合物，其中一种同分异构体以比另一种更大的比率存在。例如，可以使用具有大于90％的光学纯度(对映异构体过量；e.e.)的对映异构体(例如，甲磺司特的对映异构体)。
根据本发明的组合产品提供如前文限定的甲磺司特与如前文限定的他汀联合给药，因此可以以分开的制剂存在，其中这些制剂中的至少一种包括甲磺司特，并且至少一种包括他汀，或者可以以组合的制剂形式存在(即，配制的)(即，以包含甲磺司特和他汀的单一制剂的形式存在)。
因此，进一步提供：
(1)药物制剂，其包含甲磺司特或其药用盐或者溶剂化物；他汀或其药用盐或者溶剂化物；以及药用辅剂、稀释剂或载体(所述制剂以下被称为“组合制剂”)；以及
(2)包含以下组分的多部分试剂盒(a kit ofparts)：
(A)包含与药用辅剂、稀释剂或载体混合的甲磺司特或其药用盐或者溶剂化物的药物制剂；以及
(B)包含与药用辅剂、稀释剂或载体混合的他汀或其药用盐或者溶剂化物的药物制剂，
所述组分(A)和(B)各自是以适于彼此结合给药的形式提供的。
根据本发明的另一个方面，提供一种制备如上限定的多部分试剂盒的方法，所述方法包括使如上限定的组分(A)与如上限定的组分(B)结合，从而使这两种组分适于相互结合给药。
通过使两种组分相互“结合”，我们包括(include)多部分试剂盒的组分(A)和(B)可以为：
(i)以单独制剂的形式(即相互独立地)提供，其随后合并在一起以彼此结合用于组合治疗；或
(ii)以“组合包装”的单独组分形式包装并且放置在一起，以相互结合用于组合治疗。
因此，进一步提供一种多部分试剂盒，其包含：
(I)如本文中限定的组分(A)和(B)中的一种；以及
(II)所述组分与这两种组分中的另一种结合使用的说明。
本文中所述的多部分试剂盒可以包括多于一种的包含适合量/剂量的甲磺司特/盐/溶剂化物的制剂，和/或多于一种的包含适合量/剂量的他汀/盐/溶剂化物的制剂，以提供重复给药。如果多于一种制剂(包括任一种活性化合物)存在，则这些的制剂在化合物、化学组合物和/或物理形式中任何一种的剂量方面可以相同，或者可以不同。
用于根据本发明的组合产品的他汀可以优选地采取所谓的“他汀内酯”形式。根据本发明的组合产品可以包括匹伐他汀内酯和美伐他汀内酯，优选氟伐他汀内酯，罗苏伐他汀内酯，普伐他汀内酯和阿托伐他汀内酯，特别是洛伐他汀内酯和辛伐他汀内酯。
根据本发明的组合产品找到了治疗炎症的用途。炎症通常的特征在于免疫防护机制的激活，从而对宿主导致弊大于利的后果。这种病通常伴随有不同程度的组织发红或充血、肿胀、高热症、疼痛、瘙痒、细胞死亡和组织破坏，细胞增殖和/或丧失机能。可以提及的炎症包括敏感症(包括过敏性结膜炎和过敏性鼻炎)、关节强硬性脊椎柱炎、哮喘、过敏性皮炎、慢性阻塞性肺病、接触性皮炎、膀胱炎、痛风性关节炎、炎症性肠病(比如局限性回肠炎和溃疡性结肠炎)、多发性硬化、骨关节炎、胰腺炎、前列腺炎、银屑病、牛皮癣关节炎、类风湿性关节炎、腱炎、粘液囊炎、斯耶格伦综合征、系统性红斑狼疮、葡萄膜炎、风疹、血管炎、糖尿病血管并发症、偏头痛、动脉粥样硬化症和相关的心血管病症。可以提及的病包括偏头痛更优选哮喘、慢性阻塞性肺病、局限性回肠炎、多发性硬化、银屑病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎，且更特别是动脉粥样硬化症和相关的心血管病症。
本领域技术人员应理解术语“动脉粥样硬化症”包括特征在于血管、特别是动脉壁中的胆固醇累积、泡沫细胞形成、炎症和细胞增殖的任何疾病。与动脉粥样硬化症“相关”的心血管病症包括主动脉瘤(包括腹部和/或动脉粥样硬化主动脉瘤)，更优选动脉硬化、周围动脉闭塞性疾病、冠状动脉病(例如心绞痛、心肌梗死、心脏病发作等)、冠心病(包括心脏病和心脏疾病，比如局部缺血性(ischaemic)心脏病)，并且还可以包括斑破裂(plaquerupture)或粉瘤破裂和/或不稳定、血管或动脉疾病，局部缺血性疾病/局部缺血和中风(包括脑血管意外和瞬间局部缺血性发作)。
可以提及的患者群包括患有急性冠状综合征的患者。本领域技术人员应理解术语“急性冠状综合征”包括任何异常的心肌和局部缺血状态，通常但不绝对地与胸部疼痛和/或异常心电图(ECG)有关。这样的综合征是心肌梗死(心脏病发作)的最普通表现。技术人员应理解该术语很大程度上与术语“不稳定的绞痛”同义，与“稳定的绞痛”相反(即在劳累时产生并且在休息时减轻的绞痛)。以恶化速率发生的劳累性绞痛(exertional angina)(“渐强绞痛”)类似地被技术人员视为在“不稳定”的定义之内。
根据本发明的另一个方面，提供一种治疗炎症，和特别是动脉粥样硬化症和/或相关的心血管病症的方法，所述方法包括将根据本发明的组合产品对需要这种治疗的患者给药。
为了避免疑义，在本发明的上下文中，术语“治疗(treatment)”、“治疗(therapy)”和“治疗方法(therapy method)”包括有此需要的患者的治疗性或者减轻性治疗，以及易患炎症比如动脉粥样硬化症和相关的心血管病症的患者的预防性治疗和/或诊断。
对于如本文中所述的多部分试剂盒，发明人认为“与……联合给药”包括：在相关病症的治疗过程中顺序地、分开地和/或同时地给药包含甲磺司特(或者其盐/溶剂化物)和他汀(或其盐/溶剂化物)的相应制剂。
因此，对于根据本发明的组合产品，术语“与……联合给药”包括将组合产品的两种组分(甲磺司特和他汀)一起或者时间上非常接近地给药(任选重复地)，以在相关病症的治疗过程中能够为患者提供有益作用，所述有益作用比在相同治疗过程中将包含甲磺司特的制剂或者包含他汀的制剂在没有另一种组分的情况下单独地(任选重复地)给药所能够为患者提供的有益作用更大。确定组合是否对具体疾病和其治疗过程提供更大的有益作用将取决于待治疗或者预防的病症，但是可以由技术人员常规地实现。
此外，在根据本发明的多部分试剂盒的上下文中，术语“与……联合”包括这两种制剂中的一种或另一种可以在给药另一种组分之前、之后和/或同时给药(任选重复地)。当在本上下文中使用时，术语“同时给药”和“与……同时给药”包括各个剂量的甲磺司特和他汀彼此在48小时(例如24小时)内给药。
“患者”包括哺乳动物(包括人)患者。
根据本发明，优选将甲磺司特和他汀以包含采用药用剂型的化合物的药物制剂的形式，局部地或系统地给药，例如，口服地、静脉内地或动脉内地(包括血管内斯滕特固定模(stent)和其它血管周围装置/剂型)、肌肉地、皮肤地、皮下地、经粘膜地(transmucosally)(例如舌下地或者口腔地)、直肠地、经皮地、鼻子地、肺部地(例如气管地或者支气管地)、局部地、或者任何其它的肠胃外路线给药。优选的供给模式包括口服(很大程度上)、静脉内、皮肤或者皮下、鼻子、肌肉、腹膜内供给。优选的递送模式包括口服(特别地)、静脉内、皮肤或皮下、鼻子、肌肉、或腹膜内递送。
通常将甲磺司特和他汀一起或者分别以一种或多种与药用辅剂、稀释剂或载体混合的药物制剂形式给药，所述药用辅剂、稀释剂或载体可以通过应有考虑预期的给药途径和标准药物实践而选择。这些药用载体对活性化合物可以是化学惰性的，并且在使用条件下可以没有不利的副作用或者毒性。这些药用载体还可以赋予任一种活性成分即时或者改进的释放，而不论是以组合制剂还是以多部分试剂盒的形式一起给药。
适合的药物制剂可以是商购的，或者另外描述于文献，例如，Remington药学科学和实践(The Science and Practice of Pharmacy)，第19版，Mack印刷公司(Mack Printing Company)，Easton，Pennsylvania(1995)和Martindale-完全药物参考(Martindale-The Complete Drug Reference)(第34版)以及其中所引用的文献中，所有这些文献的相关内容通过引用结合在此。另外，包含甲磺司特和他汀的适合的制剂和特别是组合制剂的制备可以由技术人员采用常规技术非创造性地实现。
在一种或多种制剂中的活性成分的量将取决于要治疗的病症的严重性以及要治疗的患者，以及所使用的一种或多种化合物，但是可以由技术人员非创造性地确定。
根据要治疗的病症以及要治疗的患者，以及给药路线，活性成分可以以不同的治疗有效剂量对有此需要的患者给药。
然而，在本发明的范围内，对哺乳动物，特别是对人给药的剂量应当足以在合理的时限(timeframe)内在哺乳动物中的实现治疗响应。本领域技术人员应认识到准确剂量和组合物以及最适合的供给体系的选择此外还受到以下因素的影响：制剂的药物性质，治疗的疾病的性质和严重性，和接受者的身体状态和精神敏度，以及特定化合物的潜能，要治疗的患者的年龄、状态、体重、性别和响应，和疾病的阶段/严重性，以及患者之间的遗传差异。
活性成分的给药可以是连续或者间歇的(例如通过推注注射)。剂量还可以由给药的时机和频率决定。
活性成分的合适剂量包括在医学文献比如Martindale-完全药物参考(Martindale-The Complete Drug Reference)(第34版)和其中所提及的文献中所提及的那些，所有这些文献的相关内容都通过引用结合在此。因此，活性成分的合适剂量在约0.01mg/kg体重～约1,000mg/kg体重的范围内。在以口服形式给药时，更优选的范围是每天约0.1mg/kg至约20mg/kg。
然而，甲磺司特的合适剂量对于本领域技术人员是已知的。因此，每天的口服剂量在约0.5mg至约1000mg，诸如约2mg至约800mg，优选约20mg至约600mg，例如，约200mg(例如，300mg)至约450mg的范围内，与所用制剂是如上所述的组合制剂还是多部分试剂盒无关。
类似地，他汀的合适剂量对于本领域技术人员是已知的。因此，每天的口服剂量典型地在约2mg至约150mg，比如约5mg至约100mg，优选约8mg至约90mg，例如约10mg至约80mg的范围内，与所用制剂是如上所述的组合制剂还是多部分试剂盒无关。匹伐他汀的合适剂量按每天计在约0.5mg至约10mg，比如约0.75mg至约5mg，优选约1mg至约4mg，例如约2mg的范围内，与所用制剂是如上所述的组合制剂还是多部分试剂盒无关。
无论如何，医学专业人员或者其它技术人员能够常规地确定最适合个体患者的实际剂量。上述剂量是平均情况的示例；当然，可能存在更高或者更低的剂量范围是有利的个别情况，并且这些都在本发明的范围内。
无论在本文中何处使用单词“约”，例如在活性成分剂量的上下文中，都应当理解这些变量是近似的，并且照此，可以从本文中规定的数值变化±10％，例如±5％，和优选±2％(例如±1％)。
本文中所述的组合产品/方法可以具有的优点在于，在上述病症的治疗中，与现有技术中已知用于治疗炎症(比如动脉粥样硬化症和相关的心血管病)的类似方法(治疗)或者其它的类似方法相比，它们对于医生和/或患者可以更方便、更有效、毒性更小、具有更宽的活性范围、更有效力、产生更少的副作用，或者它/它们可以具有其它有用的药物性质。
本发明将通过下列实施例进行举例说明。
实施例
实施例1
MonoMac-6细胞炎性介体释放测定
在补充有1mM丙酮酸钠、1×非必需的氨基酸、1-100μg/mL胰岛素、1mM草乙酸、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素和10％(体积/体积)胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养(37℃/5％CO2)MonoMac-6(MM6)细胞(Ziegler-Heitbrock等，Int.J.Cancer (国际癌症杂志)，41，456(1988))。添加TGFβ(2ng/ml)和1,25(OH)2D3(50nM)以进行分化，通常要约2-4天。
为了刺激炎性介体白细胞三烯B4(LTB4)的释放，使用25-50μM花生四烯酸和2-10μM钙离子载体A23187(还可以在没有花生四烯酸的情况下使用A23187)，将分化或者未分化的MM6细胞(在1-15×106/mL；0.5-1mL)温育5-30分钟(在37℃，在含钙的PBS中)。还可以在有或没有上述的A23187和/或花生四烯酸的情况下利用经证明的生物活性浓度的腺苷二磷酸(ADP)和/或血栓烷类似物U-46619刺激MM6细胞。以上MM6温育/刺激也可以在人血小板(来自健康捐赠者血液)的存在下进行，其中MM6∶血小板比率为1∶10至1∶10000。使用2体积的冷甲醇和作为内标添加的前列腺素B2(PGB2)停止温育/刺激。将样品离心，并且用水稀释上清液，以达到30％的最终甲醇浓度，并且将pH调节至3-4。在预调节的(1mL甲醇，随后是1mL H2O)C 18固相柱(英国的Sorbent Technology(吸附剂技术))上提取上清液中的花生四烯酸代谢产物。使用甲醇洗脱代谢产物，之后将1体积的水添加到洗出液中。对于反相HPLC，将76μL的每一个样品与39μL H2O混合(也可以使用其它体积比)。使用甲醇/乙腈/H2O/乙酸(30∶35∶35∶0.01体积/体积)以1.2mL/min洗脱Waters RCM 8×10柱。在270nm监测洗出液的吸光度以检测并且量化PGB2和LTB4。还可以根据来自试剂盒生产商的说明使用用于测量LTB4的可商购的酶免疫测定试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)。根据来自生产商的说明使用可商购的酶免疫测定试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)，还可以分析来自上述MM6温育/刺激的上清液中炎性介体前列腺素E2(PGE2)和/或血栓烷B2(T×B2)的含量。
根据需要利用超声、加热和pH调节(还可以使用其它赋形剂)，在乙醇、DMSO、N-甲基-2-吡咯烷酮、PEG 400、丙二醇和/或去离子水或生理盐溶液中制备甲磺司特和他汀(匹伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或优选地辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀)的储液。在为了炎性介体释放进行MM6刺激之前，使用一种或多种试验药物(与他汀组合的甲磺司特，单独的甲磺司特和单独的他汀)将细胞温育(在37℃/5％CO2，在不含钙的PBS中，或者在含1-10％胎牛血清的RPMI-1640中，在有或者没有增补剂的情况下)1分钟至24小时(一种或多种试验药物还可以与MM6刺激同时添加)。添加药物以达到1nM至100μM的最终浓度(为了比较，一些实验在没有药物的情况下进行)。
为了刺激炎性细胞因子和趋化因子比如IL-1β、IL-6、TNF、IL-8、IL-10、IL-12p70、MCP-1的释放，使用脂多糖(LPS，最终浓度1-100ng/mL)、佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA，最终浓度1-100ng/mL)或LPS/PMA混合物，将分化或者未分化的MM6细胞(在1-10×106/mL)温育(37℃/5％CO2)4-24小时(在具有1-10％胎牛血清的RPMI-1640中，具有或者没有增补剂)。还可以在有或没有上述的PMA和/或LPS的情况下，利用经证明的生物活性浓度的腺苷二磷酸(ADP)、花生四烯酸、钙离子载体A23187和/或血栓烷类似物U-46619刺激MM6细胞。MM6温育/刺激也可以在人血小板(来自健康捐赠者血液)的存在下进行，其中MM6∶血小板比率为1∶10至1∶10000。在MM6刺激之前，使用一种或多种试验药物(与他汀组合的甲磺司特，单独的甲磺司特和单独的他汀；对于储液和浓度，同上)将细胞温育(在37℃/5％CO2，在含1-10％胎牛血清的RPMI-1640中，有或者没有增补剂的情况下)1分钟至24小时(为了比较，一些实验在没有药物的情况下进行；一种或多种试验药物还可以与MM6刺激同时添加)。在温育/刺激后离心沉淀(spinning down)细胞之后，使用细胞计数珠阵列(Cytometric Bead Array)(美国圣地亚哥的BD Biosciences Pharmingen)，根据生产商的说明，量化上清液中的人细胞因子和趋化因子浓度。还可以根据生产商的说明使用用于测量细胞因子和趋化因子的可商购的酶免疫测定试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)。将细胞沉淀冷冻保存(-80℃)在RLT缓冲液(QIAGEN，Valencia，CA)中，直至用于微阵列(microarray)实验的进一步处理(参见下面的实施例12)。
实施例2
人的外周血细胞炎性介体释放测定
采用成熟的方案，通过Lymphoprep或Ficoll-Paque分离(使用或者不使用Polymorphoprep分离和/或葡聚糖沉降)，从健康捐赠者血液中分离人外周血单核细胞(PBMC)或多形核细胞(PMN)。
为了刺激炎性介体白细胞三烯B4(LTB4)的释放，使用25-50μM花生四烯酸和2-10μM钙离子载体A23187(还可以在不使用花生四烯酸的情况下使用A23187)，将PBMC或PMN(在1-15×106/mL；0.5-1mL)温育5-30分钟(在37℃，在含钙的PBS中)。还可以在有或没有上述的A23187和/或花生四烯酸的情况下，利用经证明的生物活性浓度的腺苷二磷酸(ADP)和/或血栓烷类似物U-46619刺激PBMC/PMN。上述PBMC/PMN温育/刺激也可以在人血小板(来自健康捐赠者血液)的存在下进行，其中PBMC/PMN∶血小板比率为1∶10至1∶10000。使用2体积的冷甲醇和作为内标添加的前列腺素B2停止温育/刺激。将样品离心，并且用水稀释上清液，以达到30％的最终甲醇浓度，并且将pH调节至3-4。在预调节的(1mL甲醇，随后是1mL H2O)C18固相柱(英国的Sorbent Technology(吸附剂技术))上提取上清液中的花生四烯酸代谢产物。使用甲醇洗脱代谢产物，之后将1体积的水添加到洗出液中。对于反相HPLC，将76μL的每一个样品与39μL H2O混合(也可以使用其它体积比)。使用甲醇/乙腈/H2O/乙酸(30∶35∶35∶0.01体积/体积)以1.2mL/min洗脱Waters RCM 8×10柱。在270nm监测洗出液的吸光度以检测并且量化PGB2和LTB4。还可以根据来自生产商的说明使用用于测量LTB4的可商购的酶免疫测定试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)。根据来自生产商的说明使用可商购的酶免疫测定试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)，还可以分析来自上述PBMC/PMN温育/刺激的上清液中的炎性介体前列腺素E2(PGE2)和/或血栓烷B2(TXB2)的含量。在为了炎性介体释放进行PBMC/PMN刺激之前，使用一种或多种试验药物(与他汀(匹伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀)组合的甲磺司特，单独的甲磺司特和单独的他汀)将细胞温育(在37℃，在不含钙的PBS中，或者在含0-10％胎牛血清的RPMI-1640中)1分钟至24小时(关于药物储液和浓度的细节，参见上述实施例1；一种或多种试验药物还可以与PBMC/PMN刺激同时添加)。为了比较，一些实验在没有药物的情况下进行。
为了刺激炎性细胞因子和趋化因子比如IL-1β、IL-6、TNF、IL-8、IL-10、IL-12p70、MCP-1的释放，使用脂多糖(LPS，最终浓度1-100ng/mL)、佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA，最终浓度1-100ng/mL)或LPS/PMA混合物，将PBMC/PMN(在1-10×106/mL)温育(37℃/5％CO2)4-24小时(在具有1-10％胎牛血清的RPMI-1640中)。还可以在有或没有上述的PMA和/或LPS的情况下，利用经证明的生物活性浓度的腺苷二磷酸(ADP)、花生四烯酸、钙离子载体A23187和/或血栓烷类似物U-46619刺激PBMC/PMN细胞。PBMC/PMN温育/刺激也可以在人血小板(来自健康捐赠者血液)的存在下进行，其中PBMC/PMN∶血小板比率为1∶10至1∶10000。在为了细胞因子/趋化因子释放进行PBMC/PMN刺激之前，使用一种或多种试验药物(与他汀组合的甲磺司特，单独的甲磺司特和单独的他汀，同上)将细胞温育(在37℃/5％CO2，在含1-10％胎牛血清的RPMI-1640中)1分钟至24小时(为了比较，一些实验在没有药物的情况下进行；一种或多种试验药物还可以与PBMC/PMN刺激同时添加)。在温育/刺激后离心沉淀该细胞之后，使用细胞计数珠阵列(美国圣地亚哥的BD BiosciencesPharmingen)，根据生产商的说明，量化上清液中的人细胞因子和趋化因子浓度。还可以根据生产商的说明使用用于测量细胞因子和趋化因子的可商购的酶免疫测定试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)。将细胞沉淀冷冻保存(-80℃)在RLT缓冲液(QIAGEN，Valencia，CA)中，直至用于微阵列实验的进一步处理(参见下面的实施例12)。
实施例3
小鼠肥大细胞炎性介体释放测定
通过培养来自C57BL/6小鼠的骨髓细胞而得到由骨髓来源的培养的小鼠肥大细胞(mMC)。将骨髓细胞(来自用PBS冲洗过的小鼠大腿骨)在10％WEHI-3或富含X-63的经调节的RPMI 1640中培养(37℃/5％CO2)，其中补充有10％热灭活的胎牛血清、4mM L-谷氨酰胺、50μM 2-巯基乙醇、1mM丙酮酸钠、0.1mM非必需的氨基酸、10mM Hepes以及100μg/mL青霉素/链霉素。通过试剂盒在细胞表面上的表达(通过流式细胞计数)和/或通过甲苯胺蓝染色(通常在培养至少3-5周之后)证实肥大细胞(在悬浮液中生长)的发育。
通过培养来自C57BL/6小鼠的骨髓细胞获得由骨髓来源的经培养的结缔组织型(CT型)小鼠肥大细胞。将骨髓细胞在RPMI 1640培养基中培养(37℃/5％CO2)，所述RPMI 1640培养基含有10％经过滤的FCS、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100IU/mL青霉素G、100μg/mL链霉素、0.1mM MEM非必需的氨基酸和50μM 2-ME，补充有50ng/mL的重组鼠科干细胞因子和1ng/mL鼠科重组IL-4。通过试剂盒在细胞表面上的表达(通过流式细胞计数)和/或通过甲苯胺蓝染色(通常在培养至少3-5周之后)证实肥大细胞的发育。
还可以使用小鼠肥大细胞系MC/9(由ATCC得到，产品号CRL-8306)和C1.MC/C57.1(Young等，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国国家科学院学报)，84，9175(1987))。根据来自ATCC(http://www.atcc.org)的说明培养MC/9细胞，并且如在Rumsaeng等（J.Immunol.(免疫学杂志)158，1353(1997))中所述培养C1.MC/C57.1细胞。
对于通过IgE-受体的交联的激活/刺激，首先使用被用作15％杂交瘤上清液的单克隆小鼠抗-TNP IgE-抗体(IgEl-b4，ATCC，Rockville，MD，美国)将经培养的肥大细胞在37℃(5％CO2)敏化90分钟。然后在通过添加100ng/mL偶联比率为9/1的TNP-BSA(生物搜索技术(BiosearchTechnologies)，旧金山，CA)激活细胞(在0.5-10×106/mL)之前，使用PBS将用于N-乙酰基-β-D-氨基己糖苷酶(或组胺)或细胞因子/趋化因子释放测定(参见下面)的细胞进行两次洗涤，并且重新悬浮在补充有0.2％牛血清白蛋白(BSA)(西格玛(Sigma))的RPMI-1640培养基中。使用TNP-BSA的温育(37℃/5％CO2)进行30分钟，以分析β-氨基己糖苷酶(或组胺)释放，且进行6-24小时以分析细胞因子和趋化因子释放。在添加TNP-BSA之前，使用一种或多种试验药物(与他汀(匹伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀)组合的甲磺司特，单独的甲磺司特和单独的他汀)将细胞温育(在37℃/5％CO2)1分钟至24小时(关于药物储液和浓度的细节，参见上述实施例1；一种或多种试验药物还可以与TNP-BSA刺激同时添加)。为了比较，一些实验在没有药物的情况下进行。在温育/刺激之后，将样品离心，并且如下所述分析上清液的β-氨基己糖苷酶(或组胺)和/或细胞因子/趋化因子的含量。将细胞沉淀冷冻保存(-80℃)在RLT缓冲液(QIAGEN，Valencia，CA)中，直至用于微阵列实验的进一步处理(参见下面的实施例12)。
为了检测粒状肥大细胞酶β-氨基己糖苷酶的IgE依赖性释放，使用酶显色定量分析。将来自每个孔的60μL上清液转移到96孔板，并且与等体积的底物溶液(溶解在80mM柠檬酸中的7.5mM对硝基苯基-N-乙酰基-b-D-氨基葡糖苷，pH 4.5)混合。将该混合物在摇摆器平台上于37℃温育2小时。在温育之后，将120μL甘氨酸(0.2M，pH 10.7)添加至每一个孔内，并且使用Emax精确微板读取器(Emax Precision Microplate Reader)(分子装置(Molecular Devices)，Sunnyvale，CA)测量在405和490nm的吸光度。β-氨基己糖苷酶的释放表示为在细胞溶胞后确定的总β-氨基己糖苷酶的百分比。为了检测粒状肥大细胞组胺的IgE依赖性释放，根据来自生产商的说明，使用用于测量组胺的可商购的酶免疫测定试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)。
为了检测小鼠肥大细胞细胞因子和趋化因子比如IL-6、IL-4、TNF、IL-1β、KC、MCP-1、IL-10、IL-12p70、IFNγ的IgE依赖性释放，根据生产商的说明，使用细胞计数珠阵列(Cytometric Bead Array)(美国圣地亚哥的BD Biosciences Pharmingen)。还可以根据来自生产商的说明使用用于测量细胞因子和趋化因子的可商购的酶免疫测定试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)。
除上述肥大细胞实验以外，还可以使用已经确立并且经证明的用于分析组胺、β-氨基己糖苷酶或类胰蛋白酶从新分离的腹膜大鼠或小鼠肥大细胞中诱导释放(使用例如抗-IgE(在使用大鼠或小鼠IgE预处理细胞的情况下，或在没有该预处理的情况下)、刀豆球蛋白A、蛋白质L、化合物48/80、离子载体A23187、PMA)的实验方法和测定，研究一种或多种试验药物(同上)的肥大细胞抑制作用。
实施例4
RAW 264.7细胞炎性介体释放测定
将RAW 264.7细胞在补充有100单位/mL青霉素以及100μg/mL链霉素和10％胎牛血清的DMEM中培养(37℃/5％CO2)。
为了刺激炎性细胞因子和趋化因子比如IL-6、TNF、IL-1β、KC、MCP-1、IL-10、IL-12p70、IFNγ的释放，使用脂多糖(LPS，最终浓度1-100ng/mL)、佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA，最终浓度1-100ng/mL)或LPS/PMA混合物，将RAW 264.7细胞(在1-10×106/mL)温育(37℃/5％CO2)4-24小时(在具有1-10％胎牛血清的DMEM中，具有或者不具有增补剂)。还可以在有或没有上述的PMA和/或LPS的情况下，使用经证明的生物活性浓度的腺苷二磷酸(ADP)、花生四烯酸、钙离子载体A23187和/或血栓烷类似物U-46619刺激RAW 264.7细胞。RAW 264.7温育/刺激还可以在小鼠或人(来自健康捐赠者血液)的血小板存在下进行，其中RAW 264.7∶血小板的比率为1∶10至1∶10000。在为了细胞因子/趋化因子的释放进行RAW 264.7刺激之前，使用一种或多种试验药物(与他汀(匹伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀)组合的甲磺司特，单独的甲磺司特和单独的他汀)将细胞温育(在37℃/5％CO2，在含1-10％胎牛血清、具有或者不具有增补剂的DMEM中)1分钟至24小时(关于药物储液和浓度的细节，参见上述实施例1；一种或多种试验药物还可以与RAW 264.7刺激同时添加)。为了比较，一些实验在没有药物的情况下进行。在温育/刺激后离心沉淀细胞之后，使用细胞计数珠阵列(Cytometric Bead Array)(美国圣地亚哥的BDBiosciences Pharmingen)，根据生产商的说明，量化上清液中的小鼠细胞因子和趋化因子的浓度。还可以根据生产商的说明使用用于测量细胞因子和趋化因子的可商购的酶免疫测定试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)。将细胞沉淀冷冻保存(-80℃)在RLT缓冲液(QIAGEN，Valencia，CA)中，直至用于微阵列实验的进一步处理(参见下面的实施例12)。
实施例5
由角叉菜聚糖诱导的大鼠脚爪炎症
该测定是基本上根据由Winter等(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.(实验生物学和医学界学报)，111，544(1962))所述的测定。将一种或多种试验药物(与他汀(匹伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀)组合的甲磺司特、单独的甲磺司特和单独的他汀)以0.03至50mg/kg的剂量每2-24小时对重量约为150-400g的雄性Sprague-Dawley或Wistar大鼠进行皮下、静脉内、腹膜内或口服给药(为了比较，一些实验在没有药物的情况下进行)。在给药之前，根据需要将药物的储液(参见上面的实施例1)在例如处于水(用于口服治疗)或盐水(用于肠胃外给药)中的0.5％或I％的甲基纤维素中稀释。还可以使用其它赋形剂。在第一药物给药之后1分钟至24小时，将在0.9％盐水中的0.5、1.0或2.0％角叉菜聚糖溶液(型号IVλ，西格玛化学公司(SigmaChemical Co.))注入到麻醉大鼠的一个后爪的下脚底区域。在角叉菜聚糖注入之前和在角叉菜聚糖注入后3-24小时后以指定时间间隔，使用连接至具有数字显示器的压力传感器的移位体积测量器(displacementplethysmometer)测量被注射爪的体积。肿胀程度表示发炎浮肿的程度。在角叉菜聚糖注射之后的3-24小时后，处死大鼠并且用盐水或PBS灌流(还可以使用其它灌流介质)。将来自发炎爪的脚底软组织活检组织(biopsies)收集、称重、冷冻保存(用于微阵列分析的样品在TRIzol，Invitrogen，Carlsbad，CA中于-80℃冷冻)，并如下所述(实施例10和12)，随后对1)反映炎性嗜中性白细胞累积量的髓过氧化物酶(MPO)累积量进行分析和/或2)使用微阵列技术分析组织基因表达。来自未处理大鼠的未发炎爪组织提供了MPO和基因表达的基线水平。还可以使用常规的组织学和免疫组织化学技术研究组织炎症。爪炎症还可能通过化合物48/80(48/80，在50-100μl PBS或盐水中为1-5μg)(代替角叉菜聚糖)的下脚底注射诱导，随后在48/80注射后30分钟至8小时后测量发炎爪肿胀，并且收集组织活检组织以进行微阵列和/或MPO分析(同上)。
实施例6
由巴豆油诱导的小鼠耳炎
该测定基本上根据由Tonelli等(内分泌学(Endocrinology)77，625(1965))所述的测定(还可以使用其它小鼠品系)。每2-24小时将一种或多种试验药物(与他汀(匹伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀)组合的甲磺司特、单独的甲磺司特和单独的他汀)以0.03至50mg/kg的剂量通过皮下、静脉内、腹膜内或口服方式给药(为了比较，一些实验在没有药物的情况下进行)。在给药之前，根据需要将药物的储液(参见上面的实施例1)在例如处于水(用于口服治疗)或者盐水(用于肠胃外给药)中的0.5％或1％甲基纤维素中稀释。还可以使用其它赋形剂。在第一次药物给药后1分钟至24小时后，将10-30μL在丙酮或乙醇中的2.0或4.0％巴豆油溶液局部地涂敷在一只或两只耳朵上。在巴豆油涂敷之后4-12小时后以指定的时间间隔，处死动物，并且称量耳朵的穿孔活检组织，以确定耳朵的发炎肿胀(也可以测量耳朵厚度以确定肿胀)。收集来自发炎耳朵的活检组织、冷冻保存(将用于微阵列分析的样品在-80℃冷冻于TRIzol中)，并且如下所述(实施例10和12)，随后对1)反映炎性嗜中性白细胞累积量的髓过氧化物酶(MPO)累积量进行分析；和/或2)利用微阵列技术对组织基因表达进行分析。来自未处理的小鼠的未发炎的耳朵活检组织提供了肿胀、MPO和基因表达的基线水平。组织炎症也可以使用常规的组织学和免疫组织化学技术进行研究。
实施例7
由佛波醇酯或花生四烯酸诱导的小鼠耳炎
这些测定基本上根据由Chang等(欧洲药理学杂志(Eur.J.Pharmacol.)142，197(1987))所述的测定(尽管可以使用其它小鼠品系)。每2-24小时将一种或多种试验药物(与他汀(匹伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀)组合的甲磺司特、单独的甲磺司特和单独的他汀)以0.03至50mg/kg的剂量通过皮下、静脉内、腹膜内或口服方式对雄性或雌性小鼠给药(为了比较，一些实验在没有药物的情况下进行)。在给药之前，根据需要将药物的储液(参见上面的实施例1)在例如处于水(用于口服治疗)或者盐水(用于肠胃外给药)中的0.5％或1％甲基纤维素中稀释。还可以使用其它赋形剂。在第一次药物给药后1分钟至24小时后，将在10-30μl丙酮或乙醇中的1-10μg佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)、十四烷酰基佛波醇乙酸酯(TPA)或1-5mg花生四烯酸局部地涂敷在一只或两只耳朵上。在涂敷PMA或TPA后4-12小时后以及在涂敷花生四烯酸后30分钟至6小时后，处死动物，并且称量耳朵的穿孔活检组织，以确定耳朵的发炎肿胀(也可以测量耳朵厚度以确定肿胀)。收集来自发炎耳朵的活检组织、冷冻保存(用于微阵列分析的样品在-80℃冷冻于TRIzol中)，并且如下所述(实施例10和12)，随后对1)反映炎性嗜中性白细胞累积量的髓过氧化物酶(MPO)累积量进行分析；和/或2)利用微阵列技术对组织基因表达进行分析。来自未处理的小鼠的未发炎的耳朵活检组织提供了肿胀、MPO和基因表达的基线水平。组织炎症也可以使用常规的组织学和免疫组织化学技术进行研究。
实施例8
在小鼠和大鼠中响应受伤的急性组织反应和炎症
采用重约15-30g的雄性CBA或NMRI小鼠或重约150-450g的雄性Wistar或Sprague-Dawley大鼠(还可以采用其它小鼠和大鼠品系)。在无菌条件下使用解剖刀在尾巴末端部分或一个耳朵处获得急性组织创伤以及急性炎症。穿透所有皮肤层切出一个、两个或三个平行的约5-15mm长的纵向切口。每2-24小时将一种或多种试验药物(与他汀(匹伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀)组合的甲磺司特、单独的甲磺司特和单独的他汀)以0.03至50mg/kg的剂量通过皮下、静脉内、腹膜内或口服方式给药，其中第一次给药在组织受伤前1分钟至24小时提供(为了比较，一些实验在没有药物的情况下进行)。在给药之前，根据需要将药物的储液(参见上面的实施例1)在例如处于水(用于口服治疗)或者盐水(用于肠胃外给药)中的0.5％或1％甲基纤维素中稀释。还可以使用其它赋形剂。在受伤后2-48小时后，处死动物，并且将组织的受伤部分取出，称量并且冷冻保存(用于微阵列分析的样品在-80℃冷冻于TRIzol中)，并且如下所述(实施例10和12)，随后对1)反映炎性嗜中性白细胞累积量的髓过氧化物酶(MPO)累积量进行分析；和/或2)利用微阵列技术对组织基因表达进行分析。来自未处理动物的相应的未受伤/未发炎组织提供了MPO和基因表达的基线水平。响应受伤的组织反应和炎症也可以使用常规的组织学和免疫组织化学技术进行研究。
实施例9
在大鼠响应受伤的急性组织反应和炎症
采用重350-500g的雄性Sprague-Dawley大鼠(但是还可以使用其它大鼠品系)。动物被氧中的异氟烷麻醉，并且如下在左边颈总动脉中获得急性组织受伤和急性炎症：在通过手术暴露左边颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉和使用临时结扎临时停止局部血液流动之后，使气囊导管(2-法国Fogarty)穿过颈外动脉进入主动脉。接着，用足够的水使气囊膨胀以使颈总动脉扩张，然后拉回到颈外动脉中。该过程重复三次，然后移除导管，结扎颈外动脉并且封闭伤口。将一种或多种试验药物(与他汀(匹伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀)组合的甲磺司特、单独的甲磺司特和单独的他汀)以0.03至50mg/kg的剂量通过皮下、静脉内、腹膜内或口服方式每2-24小时给药，其中第一次给药在组织受伤之前的1分钟至24小时提供(为了比较，一些实验在没有药物的情况下进行)。在给药之前，根据需要将药物的储液(参见上面的实施例1)以例如在水(用于口服治疗)或盐水(用于肠胃外给药)中的0.5％或1％的甲基纤维素中进行稀释。还可以使用其它赋形剂。在受伤之后2-48小时后，动物被氧中的异氟烷麻醉，并且暴露它们的左边颈动脉。将夹子分别放在颈总动脉和颈内动脉的最近中心部分(very proximalpart)，然后将夹子之间的血管轻柔地用无菌盐水和/或TRIzol冲洗、取出、称重，并且冷冻保存(用于微阵列分析的样品在TRIzol中于-80℃冷冻)，以及如下所述(实施例10和12)，随后对1)反映炎性嗜中性白细胞累积量的髓过氧化物酶(MPO)累积量进行分析；和/或2)使用微阵列技术对组织基因表达进行分析。来自未处理大鼠的相应的未受伤/未发炎的血管提供了MPO和基因表达的基线水平。还可以使用常规的组织学和免疫组织化学技术研究对受伤响应的组织反应和炎症。
实施例10
组织髓过氧化酶的发炎累积量
酶髓过氧化物酶(MPO)富含于嗜中性白细胞中，通常被用作检测发炎组织中的嗜中性累积量的指标(marker)。为了确定在发炎的小鼠和大鼠组织中的炎性髓过氧化物酶累积量(如上述实施例5-9中所述)，将组织在0.5％溴化十六烷基三甲基铵中搅匀，并且进行冻融。将上清液的MPO活性以分光光度法确定为由MPO催化的H2O2-四甲基联苯胺的氧化还原反应中发生的650nm(25℃)的吸光度的变化。值以MPO单位/mg组织表示。
实施例11
平滑肌细胞测定
如前所述分离大鼠主动脉平滑肌细胞(RASMC)(Hedin等，动脉粥样硬化血栓血管生物学(Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.)，17，1977(1997))。将细胞在Ham培养基F-12中培养(37℃/5％CO2)，生长至汇合，通过胰蛋白酶消化作用连续地传代，并且在2-6代之后用于实验，所述Ham培养基补充有10％胎牛血清、50μg/mL L-抗坏血酸、50μg/mL链霉素、50IU/mL青霉素(F-12/10％胎牛血清)。将RASMC以每个孔约4×104个细胞的密度接种于24孔板中F-12/10％胎牛血清中(还可以使用每个板具有更大量的孔的板以及每个孔具有适当更少量的细胞的板)。在24小时之后，细胞在Ham培养基F-12中通过饥饿24-48小时而同步在G0/G1阶段(phase)，所述Ham培养基F-12补充有0.1％牛血清白蛋白(BSA)、50μg/mL L-抗坏血酸、50μg/mL链霉素和50IU/mL青霉素(F-12/0.1％BSA)。为了评估DNA合成，使用10ng/ml IGF-1或10％胎牛血清刺激饥饿的RASMC 12-48小时(还可以使用其它充分确定的促细胞分裂原比如PDGF)。在刺激之前1分钟至24小时，添加一种或多种试验药物(与他汀(匹伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀)组合的甲磺司特、单独的甲磺司特和单独的他汀)(关于药物储液和浓度的细节，参见上述实施例1；一种或多种试验药物还可以与刺激同时添加)。为了比较，一些实验在没有药物的情况下进行。在刺激周期结束之前将细胞用1μCi[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷标记8小时。然后将板用冰冷的PBS洗涤，采用冰冷的10％(w/v)三氯乙酸通宵温育，在0.2M氢氧化钠中溶胞，并且在液体闪烁计数器中测量放射性。还可以使用可商购的溴脱氧尿苷(BrdU)细胞增殖测定(例如细胞增殖ELISA、BrdU，来自Roche Applied Science(罗氏应用科学))、细胞增殖试剂WST-1(Roche Diagnostics Scandinavia AB，Bromma，瑞典)(两者都根据生产商说明)或者通过细胞计数分析受刺激的RASMC增殖。在单独的实验(为了研究基因表达)，同上使用10ng/ml IGF-1或10％胎牛血清(或PDGF)或者是使用LPS(1-100ng/mL)，使用1-10％胎牛血清(所有刺激物含有和不含如上的一种或多种试验药物)刺激更大量饥饿的RASMC(每个孔1-5×106细胞)4-48小时。然后将细胞收集并且冷冻保存(-80℃)在RLT缓冲液(QIAGEN，Valencia，CA)直至用于微阵列实验的进一步处理(参见下面的实施例12)。
将人的支气管平滑肌细胞(HBSMC，Promocell，Heidelberg，德国)在DMEM中培养，所述DMEM补充有10％FBS、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.12IU/mL胰岛素，并且含有或者不含2μg/mL两性霉素B。在实验之前，使细胞在低FBS(0.3-5％)、无胰岛素的培养基中生长停滞(growth arrested)24小时。为了刺激炎性细胞因子和趋化因子比如IL-8和eotaxin的形成和释放，使用IL-1β和TNF-α(两者均在1-50ng/mL)的不同组合，将HBSMC(在80％汇合处，对应约8×105/25cm2烧瓶)温育(37℃/5％CO2)24-48小时(在含有1-10％胎牛血清、具有或者不具有增补剂的DMEM中)。在HBSMC刺激之前，使用一种或多种试验药物(与他汀组合的甲磺司特，单独的甲磺司特和单独的他汀，同上)将细胞温育(在37℃/5％CO2，在含0.3-10％胎牛血清、具有或者不具有增补剂的DMEM中)1分钟至24小时(关于药物储液和浓度的细节，参见上述实施例1；一种或多种试验药物还可以与HBSMC刺激同时添加)。为了比较，一些实验在没有药物的情况下进行。在温育/刺激后，使用可商购的酶免疫测定试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)，根据生产商的说明，量化上清液中的人细胞因子和趋化因子的浓度。然后将细胞收集并且冷冻保存(-80℃)在RLT缓冲液(QIAGEN，Valencia，CA)中，直至用于微阵列实验的进一步处理(参见下面的实施例12)。
实施例12
基因表达的分析
根据生产商的方案，使用TRIzol(Invitrogen，Carlsbad，CA)，从小鼠和大鼠组织(参见实施例5至9、15和16)分离总RNA，随后进行Rneasy清洁(cleanup)(QIAGEN，Valencia，CA)。根据生产商的方案，在使用或不使用无RNA酶的DNA酶组(Rnase-Free Dnase set)(QIAGEN)的情况下，使用Rneasy小试剂盒(RNeasy Mini Kit)(QIAGEN)分离来自在上面和下面的实施例中所述的细胞温育/刺激(小鼠肥大细胞、MonoMac-6、PBMC、PMN、RAW 264.7、RASMC、HBSMC、NB4、HL-60)的总RNA。根据不同组织和细胞所来源的物种，使用
Figure G2008800109115D00221
人类基因组U133Plus2.0阵列、
Figure G2008800109115D00222
小鼠基因组4302.0阵列或
Figure G2008800109115D00223
大鼠基因组2302.0阵列或这些芯片的相应新版本(所有阵列来自Affymetrix，Santa Clara，CA)，根据生产商的方案进行微阵列分析。使用例如基因芯片操作软件(GeneChip Operating Software)(Affymetrix)和Bioconductor/R(www.bioconductor.org)分析微阵列表达数据。还可以使用其它相关软件。
还可以使用人类基因组测量微阵列(Human Genome SurveyMicroarray)V2.0、小鼠基因组测量微阵列(Mouse Genome Survey Microarray)V2.0或大鼠基因组测量微阵列(Rat Genome Survey Microarray)(或者这些阵列的相应新版本)，根据来自生产商Applied Biosystems(应用生物系统)(Foster City，CA)的方案，分析来自不同物种的基因表达。使用例如1700化学发光微阵列分析仪(Applied Biosystems(应用生物系统)，Foster City，CA)分析这些微阵列表达数据，所述分析仪配备有
Figure G2008800109115D00231
注释(annotation)数据库、GeneSpring 7.2(Agilent Technologies，Inc.(安捷伦技术公司)，PaloAlto，CA)和微阵列套件(Microarray Suite)版本5.0软件(MAS 5.0，Affymetrix)。还可以使用其它相关的软件。
还可以使用定量或半定量的PCR分析基因表达(mRNA水平)。可以使用可商购的酶免疫测定试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)(根据来自生产商的说明)，或常规的蛋白质印迹和/或免疫组织化学方法分析在蛋白质水平的基因表达的分析。
实施例13
细胞增殖测定
使用细胞增殖试剂WST-1(Roche Diagnostics Scandinavia AB，Bromma，瑞典)或可商购的溴脱氧尿苷(BrdU)细胞增殖测定(例如来自Roche Applied Science(罗氏应用科学)的细胞增殖ELISA、BrdU)，根据生产商的说明，测量上述和下述实施例(在添加上述和下述实施例中所述的各种试验药物和/或刺激物24-72小时之前，在0.1-5％胎牛血清中停滞或不停滞生长24-48小时)中所述的刺激和未刺激的小鼠肥大细胞、MonoMac-6细胞、RAW 264.7细胞、NB4细胞、HL-60细胞和HBSMC的增殖。还可以使用其它常规的细胞增殖试验。
实施例14
血小板聚集试验
使用例如Bertele等(欧洲药理学杂志(Eur.J.Pharmacol.)85，331(1982))所述的聚集法(aggregometry)，分析由腺苷二磷酸(ADP)、花生四烯酸、胶原蛋白或血栓烷类似物U-46619诱导的兔子或人血小板(在富含血小板的血浆或者全血中)的聚集。还可以使用经洗涤的人或兔子血小板和/或使用其它确定的聚集法或用于测量血小板聚集的其它相应方法分析诱导(同上)的血小板聚集。在诱导血小板聚集之前1-120分钟，添加一种或多种试验药物(与他汀(匹伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀)组合的甲磺司特、单独的甲磺司特和单独的他汀)(对于关于药物储液和浓度的细节，参见上述实施例1；一种或多种试验药物还可以在诱导血小板聚集的同时添加)。为了比较，一些实验在没有药物的情况下进行。
实施例15
由酵母聚糖和其它刺激物诱导的小鼠腹膜炎症
该测定基本上根据Rao等(药理学实验治疗杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)269，917(1994))(但是也可以使用其它小鼠品系)。每2-24小时将一种或多种试验药物(与他汀(匹伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀)组合的甲磺司特、单独的甲磺司特和单独的他汀)以0.03至50mg/kg的剂量通过皮下、静脉内、腹膜内或口服方式对动物给药(为了比较，一些实验在没有药物的情况下进行)。在给药之前，根据需要将药物的储液(参见上面的实施例1)在例如处于水(用于口服治疗)或者盐水(用于肠胃外给药)中的0.5％或1％甲基纤维素中稀释。还可以使用其它赋形剂。在第一次药物给药后1分钟至24小时后，将处于0.5-1mL无菌PBS中的0.5-2mg酵母聚糖A(西格玛(Sigma)，目录编号Z4250)(超声处理并且充分混合)通过腹膜内注射(代替使用酵母聚糖A，还可以通过腹膜内注射促炎浓度的其它充分确定的促炎刺激物比如抗小鼠IgE(进行或不进行使用小鼠IgE的1-3天的腹膜内预处理)、刀豆球蛋白A、角叉菜聚糖、朊蛋白胨、LPS、PMA、巯基乙醇酸酯、花生四烯酸、fMLP、TNF、IL-1β诱导腹膜炎症。一种或多种试验药物还可以与酵母聚糖或其它促炎刺激物的腹膜内注射同时给药)。在注射酵母聚糖(或一种或多种其它促炎刺激物)之后2-24小时后，处死动物。然后使用1-3mL灌洗缓冲液(含或不含3-5mM EDTA或5-10单位/mL肝素的冰冷PBS)冲洗腹膜腔。在灌洗液中的总白细胞计数和分化白细胞计数在被Türk溶液染色之后采用血细胞计数器进行和/或在分别用May-GrunwaldGiemsa或改良的Wright(Diff-Quik)染色剂染色的细胞离心涂片(cytospin)制剂中，通过使用标准形态学标准的光学显微镜法进行。还可以使用用于测定总白细胞计数和分化白细胞计数的其它已确立的方法。将其余灌洗液离心(300-3000×g，4℃，3-10分钟)，并且将无细胞的灌洗液上清液冷冻保存(-20℃至-80°)，直至如上面实施例1和4中所述分析炎性介体LTB4、PGE2、TXB2的含量和/或小鼠细胞因子/趋化因子(例如IL-4、IL-6、TNF、IL-1β、KC、MCP-1、IL-10、IL-12p70、IFNγ)的含量。通过使用可商购的组胺酶免疫测定试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)，根据来自生产商的说明确定灌洗液上清液中的组胺含量。还可以通过使用实施例3中所述的β-氨基己糖苷酶测定测量灌洗液中的β-氨基己糖苷酶活性，以研究炎性腹膜细胞活化。将灌洗液的细胞沉淀重新悬浮在具有0.5％HTAB的0.1-1.0mL 0.05MKHPO4pH 6.0中并且冷冻保存(-20℃至-80°)，直至如Rao等(药理学实验治疗杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther)269，917-25(1994))所述分析髓过氧化物酶(MPO)含量。将来自分别的动物的相同细胞沉淀冷冻保存(-80℃)在RLT缓冲液(QIAGEN，Valencia，CA)中，直至用于微阵列实验的进一步处理(参见实施例12)。在采用灌洗缓冲液冲洗腹膜腔时，将来自发炎的腹膜腔的组织(腹膜壁、肠和/或其它腹膜内或外器官/组织)的活检组织收集、称重、冷冻保存(用于微阵列分析的样品在-80℃下冷冻在TRIzol，Invitrogen，Carlsbad，CA中)，并且如实施例12所述，随后使用微阵列技术对组织基因表达进行分析。来自未处理的动物的未发炎的腹膜腔提供MPO、炎性介体、细胞因子/趋化因子和基因表达的基线水平。还可以使用常规的组织学和免疫组织化学技术研究组织炎症。
实施例16
由酵母聚糖和其它刺激物诱导的大鼠腹膜炎症
采用重约150-450g的雄性Wistar或Sprague Dawley大鼠。每2-24小时将一种或多种试验药物(与他汀(匹伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀)组合的甲磺司特、单独的甲磺司特和单独的他汀)以0.03至50mg/kg的剂量通过皮下、静脉内、腹膜内或口服方式对动物给药(为了比较，一些实验在没有药物的情况下进行)。在给药之前，根据需要将药物的储液(参见上面的实施例1)在例如处于水(用于口服治疗)或者盐水(用于肠胃外给药)中的0.5％或1％甲基纤维素中稀释。还可以使用其它赋形剂。在第一次药物给药后1分钟至24小时后，将处于1-10mL无菌PBS中的1-100mg酵母聚糖A(Sigma(西格玛)，目录编号Z4250)(超声处理并且充分混合)通过腹膜内注射(代替使用酵母聚糖A，还可以通过腹膜内注射促炎浓度的其它充分确定的促炎刺激物比如抗鼠IgE(进行或不进行使用大鼠IgE的1-3天的腹膜内预处理)、刀豆球蛋白A、蛋白质L、化合物48/80、角叉菜聚糖、朊蛋白胨、LPS、PMA、巯基乙醇酸酯、花生四烯酸、fMLP、TNF、IL-1β诱导腹膜炎症。一种或多种试验药物还可以与酵母聚糖或其它促炎刺激物的腹膜内注射同时给药)。在注射酵母聚糖(或一种或多种其它刺激物)之后2-24小时后，处死动物。然后使用10-20ml灌洗缓冲液(含或不含3-5mM EDTA或5-10单位/mL肝素的冰冷PBS)冲洗腹膜腔。在灌洗液中的总白细胞计数和分化白细胞计数在被Türk溶液染色之后采用血细胞计数器进行和/或在分别用May-Grunwald Giemsa或改良的Wright(Diff-Quik)染色剂染色的细胞离心涂片制剂中，通过使用标准形态学标准的光显微镜法进行。还可以使用用于测定总白细胞计数和分化白细胞计数的其它已确立的方法。将其余灌洗液离心(300-3000×g，4℃，3-10分钟)，并且将无细胞的灌洗液上清液冷冻保存(-20℃至-80°)，直至基本上如上面实施例1和4中所述分析炎性介体LTB4、PGE2、TXB2的含量和/或大鼠细胞因子/趋化因子(例如IL-4、IL-6、TNF、IL-1β、KC、MCP-1、IL-10、IL-12p70、IFNγ)含量。通过使用可商购的组胺酶免疫测定试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)，根据来自生产商的说明确定灌洗液上清液中的组胺含量。还可以通过使用实施例3中所述的β-氨基己糖苷酶测定测量灌洗液中的β-氨基己糖苷酶活性，以研究炎性腹膜细胞活化。将灌洗液的细胞沉淀重新悬浮在具有0.5％HTAB的0.1-1.0mL 0.05M KHPO4pH 6.0中并且冷冻保存(-20℃至-80°)，直至基本上如Rao等(药理学实验治疗杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)269，917-25(1994))所述分析髓过氧化物酶(MPO)含量。将来自分别的动物的相同细胞沉淀冷冻保存(-80℃)在RLT缓冲液(QIAGEN，Valencia，CA)中，直至用于微阵列实验的进一步处理(参见实施例12)。在采用灌洗缓冲液冲洗腹膜腔时，将来自发炎的腹膜腔的组织(腹膜壁、肠和/或其它腹膜内或腹膜后器官/组织)活检组织收集、称重、冷冻保存(用于微阵列分析的样品在-80℃冷冻在TRIzol，Invitrogen，Carlsbad，CA中)，并且，如实施例12所述，随后使用微阵列技术分析组织基因表达。来自未处理的动物的未发炎的腹膜腔提供MPO、炎性介体、细胞因子/趋化因子和基因表达的基线水平。还可以使用常规的组织学和免疫组织化学技术研究组织炎症。
实施例17
NB4和HL-60细胞炎性介体释放测定
将人的NB4细胞(Lanotte等，Blood(血液)，77，1080(1991))在RPMI-1640培养基中培养(37℃/5％CO2)，所述培养基补充有100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素和10％(体积/体积)胎牛血清。为了分化，通常每3天添加1-5μM全反式视黄酸(ATRA)。
将人的HL-60细胞(Steinhilber等，生物化学生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta)1178，1(1993))在RPMI-1640培养基中培养(37℃/5％CO2)，所述培养基补充有100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素和10-20％(体积/体积)胎牛血清。为了分化，通常添加ATRA(1-5μM)、DMSO(1-2％)、PMA(100-500ng/mL)或维生素D3(1-15μM)5天。
为了刺激炎性介体白细胞三烯B4(LTB4)的形成和释放，使用10-40μM花生四烯酸和2-10μM钙离子载体A23187，将分化或未分化的NB4或HL-60细胞(在1-15×106/mL)温育5-30分钟(在37℃，在含钙的PBS中)。还可以在有或没有上述的A23187和/或花生四烯酸的情况下，利用经证明的生物活性浓度的腺苷二磷酸(ADP)、fMLP和/或血栓烷类似物U-46619刺激NB4和HL-60细胞。上述NB4和HL-60温育/刺激也可以在人血小板(来自健康捐赠者血液)的存在下进行，其中NB4/HL-60∶血小板比率为1∶10至1∶10000。使用1mL的冷甲醇和作为内标添加的前列腺素B2停止温育/刺激。将样品离心，并且用水稀释上清液，以达到30％的最终甲醇浓度，并且将pH调节至3-4。在预调节的(1mL甲醇，随后是1mL H2O)C18固相柱(吸附剂技术(Sorbent Technology)，英国)上提取上清液中的花生四烯酸代谢产物。使用甲醇洗脱代谢产物，之后将1体积的水添加到洗出液中。对于反相HPLC，将76μL的每一种样品与39μL H2O混合(还可以使用其它体积比)。使用甲醇/乙腈/H2O/乙酸(30∶35∶35∶0.01体积/体积)以1.2mL/min洗脱Waters RCM 8×10柱。在270nm监测洗出液的吸光度以检测并且量化PGB2和LTB4。还可以根据来自试剂盒生产商的说明使用用于测量LTB4的可商购的酶免疫测定试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)。根据来自生产商的说明，使用可商购的酶免疫测定试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)，还可以分析来自上述NB4/HL-60温育/刺激的上清液的炎性介体前列腺素E2(PGE2)和/或血栓烷B2(TXB2)的含量。在为了炎性介体释放进行NB4或HL-60刺激之前，使用一种或多种试验药物(与他汀(匹伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀)组合的甲磺司特，单独的甲磺司特和单独的他汀)将细胞温育(在37℃，具有或者不具有增补剂的情况下，在不含钙的PBS中，或者在含1-20％胎牛血清的RPMI-1640中)1分钟至24小时(对于关于药物储液和浓度的细节，参见上述实施例1；一种或多种试验药物还可以与NB4/HL-60刺激同时添加)。为了比较，一些实验在没有药物的情况下进行。
为了刺激炎性细胞因子、趋化因子和介体比如IL-1β、IL-6、TNF、IL-8、IL-10、IL-12p70、MCP-1、PAF、C5a的形成和释放，使用脂多糖(LPS1-100ng/mL)、佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA 1-100ng/mL)、或钙离子载体A23187(1-10μM)或这些刺激物的组合，将分化或未分化的NB4或HL-60细胞(在1-10×106/mL)温育(37℃/5％CO2)4-24小时(在具有1-10％胎牛血清、具有或者不具有增补剂的RPMI-1640中)。还可以在有或没有上述的LPS、PMA和/或A23187的情况下，利用经证明的生物活性浓度的腺苷二磷酸(ADP)和/或血栓烷类似物U-46619刺激NB4和HL-60细胞。NB4和HL-60温育/刺激也可以在人血小板(来自健康捐赠者血液)的存在下进行，其中NB4/HL-60∶血小板比率为1∶10至1∶10000。在为了细胞因子/趋化因子/介体释放进行NB4或HL-60刺激之前，使用一种或多种试验药物(与他汀组合的甲磺司特，单独的甲磺司特和单独的他汀，同上)将细胞温育(在37℃，5％CO2，在含1-10％胎牛血清、具有或者不具有增补剂的RPMI-1640中)1分钟至24小时(为了比较，一些实验在没有药物的情况下进行；一种或多种试验药物还可以与NB4/HL-60刺激同时添加)。在离心沉淀细胞之后，使用细胞计数珠阵列(Cytometric Bead Array)(美国圣地亚哥的BD Biosciences Pharmingen)，根据生产商的说明，量化上清液中的人细胞因子/趋化因子和介体浓度。还可以根据生产商的说明使用用于测量细胞因子/趋化因子和介体的可商购的酶免疫测定试剂盒(EIA/ELISA试剂盒)。将细胞沉淀冷冻保存(-80℃)在RLT缓冲液(QIAGEN，Valencia，CA)中，直至用于微阵列实验的进一步处理(参见上面的实施例12)。
除研究上述药物对来从嗜中性粒细胞样NB4和HL-60细胞释放介体和趋化因子/细胞因子的影响以外，还可以分析药物对这些细胞的自发或受激的粘附和/或迁移的影响(还可以使用根据标准方案分离的新鲜分离的人血液多形核细胞(PMN))。使用充分确立并且经证明的实验方法和测定，研究PMN或嗜中性粒细胞样细胞对例如培养的内皮细胞或蛋白质包被的人造表面的自发或受激(使用fMLP、IL-8、PAF、LTB4或其它相关的PMN激活因子)粘附。使用充分确立并且经证明的实验方法和测定，研究PMN或嗜中性粒细胞样细胞的迁移(受到fMLP、IL-8、PAF、LTB4或其它相关的PMN趋化因子刺激)，例如穿过设计用于这种迁移研究的可商购的蛋白质包被的膜的迁移。
实施例18
在人全血中的血小板和白细胞激活
使用含有1/10体积的129mM柠檬酸三钠(Becton Dickinson，Meylan，法国)的硅化真空采血管(vacutainer)，通过没有停滞的静脉穿刺收集静脉血液。基本如前所述(参见例如用于参考的Li等，Circulation(循环)100，1374(1999))，使用流式细胞计数测定测量全血血小板P-选择蛋白表达(反映血小板活性)、白细胞CD11b表达(反映白细胞活性)、单血小板和血小板-血小板微聚集体计数，以及血小板-白细胞聚集体(PLA)。简言之，在缺乏或存在血小板激活刺激物比如腺苷二磷酸(ADP)、U-46619、U-44069、血小板激活因子(PAF)、花生四烯酸、胶原蛋白或凝血酶和/或白细胞激活刺激物比如N-甲酰基-甲二磺酰基-亮氨酰基-苯基丙氨酸(fMLP)、花生四烯酸、PAF、LPS、A23187或LTB4的情况下，将5μL全血等分试样添加到45μL含有适当稀释的抗体(参见下面)的Hepes缓冲盐水(150mM NaCl、5mM KCl、1mM MgSO4、10mM Hepes、pH 7.4)中。在将血液暴露于血小板激活刺激物和/或白细胞激活刺激物+抗体之前，使用一种或多种试验药物(与他汀(匹伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或者优选地，辛伐他汀、罗苏伐他汀或阿托伐他汀)组合的甲磺司特、单独的甲磺司特和单独的他汀)将血液样品(0.1-1m1)温育1-60分钟(一种或多种试验药物还可以与上述刺激物同时添加)。为了比较，在不暴露于药物的情况下如上述那样刺激一些血液样品。通过R-藻红蛋白(RPE)-CD62P单克隆抗体(MAb)AC1.2(美国加利福尼亚州圣何塞的Becton Dickinson)确定血小板P-选择蛋白表达。通过荧光素异硫氰酸酯(FITC)-缀合的MAb BEAR 1(Immunotech，Marseille，法国)确定白细胞CD11b表达。使用FITC和RPE缀合的同型MAb作为阴性对照。用于血小板计数的荧光珠子(SPHEROTMRainbow粒子，1.8-2.2μm)来自PharMingen(美国加利福尼亚州圣地亚哥)。使用FITC缀合的抗-CD42a(GPIX)MAb Beb 1(Becton Dickinson)识别血小板，并且使用RPE缀合的抗CD45MAb J33(Immunotech)识别白细胞。在黑暗中，在室温下将样品(含或不含刺激物的药物处理或未处理的血液+抗体，如上)温育20分钟。然后，使用0.5％(体积/体积)甲醛盐水将样品稀释并且温和地固定，并且使用Beckman-Coulter EPICS XL-MCL流式细胞计数器(Beckman-Coulter Corp.，Hialeah，FL)分析各种血小板和白细胞参数。血小板P-选择蛋白表达数据以血小板群中的P-选择蛋白阳性细胞的百分比和以P-选择蛋白阳性血小板的绝对计数的形式报告。白细胞CD11b表达以总的白细胞群和白细胞亚群的平均荧光强度(MFI)的形式报告。血小板-白细胞聚集体(PLA)以在总的白细胞群中和在淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞之中的血小板-缀合的白细胞的绝对计数和百分比的形式表示。还可以使用其它相关试剂、实验条件/方法、设备和分析方式，以测量人全血中相应的血小板和白细胞的活化。
实施例19
通过甲磺司特和罗苏伐他汀抑制巨噬细胞释放肿瘤坏死因子
在补充了下列各项的RPMI-1640培养基中培养(37℃/5％CO2)来自人巨噬细胞细胞系MonoMac-6(MM6)的细胞(Ziegler-Heitbrock等国际癌症杂志(Int.J.Cancer)，41，456(1988))：1mM丙酮酸钠，1×非必需氨基酸，10μg/mL胰岛素，1mM草乙酸，100单位/mL青霉素，100μg/mL链霉素和5％(v/v)胎牛血清。在实验开始时，将MM6细胞以1×105细胞/mL的密度接种在96-孔平板中(在细胞存活力实验中100μL/孔，且在TNF释放实验中150μL/孔----见下文)。
在量化细胞存活力/生长之前或在用佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA；西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)，Stockholm，瑞典)刺激之前，用所示终浓度的测试药物处理MM6细胞(温育条件如上)48小时，然后测量PMA-诱导的TNF-释放(详情见下)。
为了刺激肿瘤坏死因子(TNF)的形成和释放，用终浓度为10ng/mL的PMA温育MM6细胞(37℃/5％CO2)5小时(在具有上述增补剂的具有5％胎牛血清的RPMI-1640中)。
在不同的MM6温育/刺激(见上文和下文)后离心沉淀细胞之后，使用来自BD生物科学-Pharmingen(圣地亚哥，美国)的人TNF ELISA试剂盒II，按照供应商提供的指导，量化在上清液中的TNF的浓度。
使用细胞增殖试剂WST-1(Roche Diagnostics Scandinavia AB，Bromma，瑞典)测量MM6细胞生长/存活力。设计WST-1试剂用于例如细胞生长和存活力的分光光度量化，并且按照供应商的指导使用。用于测量吸光度的波长为450nm，且具有暴露于WST-1试剂的MM6细胞的所有孔的吸光度超过0.95(对于每种检测条件，n＝3)。
在无菌盐水中制备甲磺司特(甲苯磺酸盐，购自美国传统化学品公司(American Custom Chemicals Corporation)，圣地亚哥，美国)和罗苏伐他汀(钠盐；罗苏伐他汀按照生物有机和医学化学(Bioorganic&Medicinal Chemistry)，第5卷，No.5，第437-444页，1997中所述由可商购的
Figure G2008800109115D00311
片剂提取和纯化，且分离为钠盐)的储液。
不暴露于PMA的MM6细胞不产生可检测水平的TNF。然而，在PMA刺激5小时后，在未处理的MM6细胞上清液中的TNF浓度为41.1pg/mL(n＝2)。
在仅用终浓度为10μM或30μM的罗苏伐他汀处理MM6细胞后，在PMA刺激后平均TNF浓度(与未处理的细胞相比较)分别增加到76.7pg/mL和84.0pg/mL(对于每种浓度n＝2)。
在仅用终浓度为1μM或10μM的甲磺司特处理MM6细胞后，在相应的平均TNF浓度存在微小的减少(与未处理的细胞相比较)，分别减少至39.6pg/mL(3.8％减少)和34.8pg/mL(15.4％减少)(对于每种浓度n＝2)。
当在存在10μM或30μM罗苏伐他汀的条件下，用1μM甲磺司特处理MM6细胞时，与分别仅用10μM或30μM的罗苏伐他汀处理(见上)相比较，对PMA-诱导的TNF释放分别存在36.1％和34.6％的协同抑制(平均值，对于每种组合n＝2)。此外，当在存在10μM或30μM罗苏伐他汀的条件下，用10μM甲磺司特处理MM6细胞时，与分别仅用10μM或30μM的罗苏伐他汀处理(见上)相比较，对TNF释放分别存在88.5％和75.1％的协同抑制(平均值，对于每种组合n＝2)。
与未处理的MM6细胞相比较，用10μM或30μM罗苏伐他汀处理48小时的MM6细胞的存活力(如上述使用WST-1测定法测定)分别为105％和102％。关于1μM或10μM甲磺司特的相应的值分别为94％和92％，且关于上述4种不同的罗苏伐他汀-甲磺司特组合，该值为124％(甲磺司特1μM+罗苏伐他汀10μM)，125％(甲磺司特1μM+罗苏伐他汀30μM)，114％(甲磺司特10μM+罗苏伐他汀10μM)和121％(甲磺司特10μM+罗苏伐他汀30μM)。因此，罗苏伐他汀-甲磺司特组合对TNF释放的协同抑制不是由减少的细胞生长或存活力引起的。
实施例20
通过甲磺司特和阿托伐他汀抑制巨噬细胞释放肿瘤坏死因子
代替罗苏伐他汀，对阿托伐他汀(钠盐；作为来自Biocon有限公司(Biocon，Ltd.)，Bangalore，印度的礼物接收的阿托伐他汀钙，且通过添加水性盐酸首先将该钙盐转化为游离酸，然后在通过提取分离后，加入一当量的水性NaOH转化为钠盐)重复上述实施例19的步骤。
在仅用终浓度为10μM或30μM的阿托伐他汀处理MM6细胞后，在PMA刺激后的平均TNF浓度分别提高(与未处理的细胞相比较)至133.6pg/mL和59.7pg/mL(对于每种浓度n＝2)。
当在存在10μM或30μM阿托伐他汀的条件下，用1μM甲磺司特处理MM6细胞时，与分别仅用10μM或30μM的阿托伐他汀处理(见上)相比，对PMA-诱导的TNF释放分别存在35.0％和76.9％的协同抑制(平均值，对于每种组合n＝2)。此外，当在存在10μM或30μM阿托伐他汀的条件下，用10μM甲磺司特处理MM6细胞时，与分别仅用10μM或30μM的阿托伐他汀处理(见上)相比较，对TNF释放分别存在84.0％和93.9％的协同抑制(平均值，对于每种组合n＝2)。
与未处理的MM6细胞相比较，用10μM或30μM阿托伐他汀处理48小时的MM6细胞的存活力(如上述使用WST-1测定法测定)分别为94％和79％。对于上述4种不同的阿托伐他汀-甲磺司特组合的相应的值为110％(甲磺司特1μM+阿托伐他汀10μM)，85％(甲磺司特1μM+阿托伐他汀30μM)，97％(甲磺司特10μM+阿托伐他汀10μM)和90％(甲磺司特10μM+阿托伐他汀30μM)。因此，同样地，阿托伐他汀-甲磺司特组合对TNF释放的协同抑制不是由减少的细胞生长或存活力引起的。
一个或多个上述实施例证明关于甲磺司特和他汀组合(例如，辛伐他汀，且更特别地罗苏伐他汀和/或阿托伐他汀)的清楚的协同作用。

Claims (21)

1.一种组合产品，其包含：
(a)甲磺司特，或其药用盐或者溶剂化物；和
(b)他汀，或其药用盐或者溶剂化物。
2.如权利要求1所述的组合产品，其中所述他汀选自匹伐他汀、氟伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、罗苏伐他汀、普伐他汀和阿托伐他汀。
3.如权利要求2所述的组合产品，其中所述他汀选自罗苏伐他汀和阿托伐他汀。
4.如在前述权利要求中任一项所述的组合产品，所述组合产品包括药物制剂，所述药物制剂包含：甲磺司特，或其药用盐或者溶剂化物；他汀，或其药用盐或者溶剂化物；以及药用辅剂、稀释剂或载体。
5.如权利要求1至3中任一项所述的组合产品，所述组合产品包括包含如下组分的多部分试剂盒：
(A)药物制剂，其包含与药用辅剂、稀释剂或载体混合的甲磺司特、或其药用盐或者溶剂化物；以及
(B)药物制剂，其包含与药用辅剂、稀释剂或载体混合的他汀、或其药用盐或者溶剂化物，
所述组分(A)和(B)各自是以适于彼此联合给药的形式提供的。
6.一种制备如权利要求5所定义的多部分试剂盒的方法，所述方法包括使组分(A)与组分(B)结合，从而使两种组分适于相互联合给药。
7.一种多部分试剂盒，其包含：
(I)如权利要求5所定义的组分(A)和(B)中的一种；以及
(II)将该组分与所述两种组分中的另一组分联合使用的说明。
8.如权利要求1至5或7中任一项所述的组合产品，其中所述他汀不以他汀内酯形式使用。
9.如权利要求1至5中或7任一项所述的组合产品，其中所使用的他汀是洛伐他汀内酯或辛伐他汀内酯。
10.如权利要求5、权利要求7或权利要求8或权利要求9(从属于权利要求5或权利要求7)中任一项所述的多部分试剂盒，其中所述组分(A)和(B)适于顺序地、分别地和/或同时地用于治疗炎症。
11.如权利要求1至5或7至10中任一项所定义的组合产品用于制备治疗炎症的药物的用途。
12.一种治疗炎症的方法，所述方法包括将如权利要求1至5或7至10中任一项所定义的组合产品给药给需要这种治疗的患者。
13.如权利要求10所述的多部分试剂盒、如权利要求11所述的用途、或如权利要求12所述的方法，其中所述病症选自哮喘、慢性阻塞性肺病、偏头痛、局限性回肠炎、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮或溃疡性结肠炎。
14.如权利要求10所述的多部分试剂盒、如权利要求11所述的用途、或如权利要求12所述的方法，其中所述病症是动脉粥样硬化症或相关的心血管病症。
15.如权利要求14所述的多部分试剂盒、用途和方法，其中所述病症是动脉粥样硬化症。
16.如权利要求14所述的多部分试剂盒、用途和方法，其中所述与动脉粥样硬化症相关的心血管病症选自主动脉瘤、动脉硬化、周围动脉闭塞性疾病、冠状动脉病、冠心病、斑破裂和/或不稳定、粉瘤破裂和/或不稳定、血管疾病、动脉疾病、局部缺血性疾病、局部缺血和中风。
17.如权利要求16所述的多部分试剂盒、用途和方法，其中所述冠状动脉病选自心绞痛、心肌梗死和心脏病发作。
18.如权利要求16所述的多部分试剂盒、用途和方法，其中所述冠心病选自心脏病和心脏疾病。
19.如权利要求16所述的多部分试剂盒、用途和方法，其中所述中风选自脑血管意外和瞬间局部缺血性发作。
20.如权利要求16所述的多部分试剂盒、用途和方法，其中所述病症是斑破裂和/或不稳定、或粉瘤破裂和/或不稳定。
21.如权利要求10至20中任一项所述的多部分试剂盒、用途或方法，其中所述患者具有急性冠状综合征。
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