CN112654357B - 用于治疗非酒精性脂肪性肝炎的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

千金藤碱、瑞吡司特、半酒石酸艾芬地尔、布罗曼坦、阿克他利、氯苯扎利、伊索拉定、伊曲茶碱、瑞帕地、贝米特尔用于治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病或非酒精性脂肪性肝炎。

Description

用于治疗非酒精性脂肪性肝炎的组合物和方法
相关申请的引用
本申请要求2018年7月6日提交的美国临时申请62/694,848和2019年2月22日提交的美国临时申请62/809,351的优先权，所述申请的内容通过引用纳入本文。
发明领域
本发明涉及化合物用于治疗非酒精性脂肪肝疾病的用途，特别是化合物用于治疗非酒精性脂肪肝疾病、非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎的用途。
背景技术
非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)涵盖一系列特征为肝细胞中储存过多脂肪的肝病状。顾名思义，其原因通常与饮酒无关。这与大量饮酒引起的酒精性肝疾病不同。最常见的是，NAFLD是非酒精性单纯性脂肪肝或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
非酒精性脂肪肝是指肝脏中有脂肪、但很少或没有炎症或肝细胞损害的病状。它通常不会进展成引起肝损害或并发症。
NASH包括脂肪肝和肝炎。虽然仅患有非酒精性脂肪肝的对象通常无症状，但由NASH引起的炎症和肝细胞损伤可能导致肝脏纤维化或瘢痕化，在严重的情况下可能导致肝硬化(高级瘢痕化)或肝癌。在这方面，NASH和肝硬化的常见体征和症状可能包括腹胀、皮肤表面下方的血管扩张、男性乳房增大和黄疸。
会增加人们NASH风险的因素包括：糖尿病、肥胖症、高果糖饮食、遗传学和高龄。改善人们的饮食和运动是控制NAFLD和降低胰岛素耐受性的有效方法，但目前尚无用于NAFLD或NASH的对策，也没有一种用于每个个体的疗法。目前用于治疗NAFLD和NASH的药物可能有助于提高减脂和/或改善生物医学标记物水平，但是一旦肝脏瘢痕化开始，就没有药物能够逆转或降低NAFLD和NASH。
NAFLD和NASH的小鼠模型是特征鲜明的代谢诱导型肝损伤的实验模型，其最终导致自发性肝脂肪变性——这是许多慢性肝炎疾病的共同特征。在饮食模型中，向脂肪肝的进展是高度可预测和可再现的，导致基于胰岛素耐受性和肥胖的脂肪变性(Ishii等人，《雌性自发性糖尿病性Torri肥胖大鼠发展为非酒精性脂肪性肝炎样肝损伤》(Femalespontaneously diabetic Torii fatty rats develop nonalcoholic steatohepatitis-like hepatic lesions)，World J Gastroenterol，21(30)：9067-78(2015)；Kucera O和Cervinkova Z，《大鼠非酒精性脂肪肝疾病的实验模型》(Experimental models of non-alcoholic fatty liver disease in rats)，World J Gastroenterol，20(26)：8364-76(2014)；Takahashi等人，《非酒精性脂肪肝疾病非酒精性肝炎的动物模型》(Animal modelsof nonalcoholic fatty liver disease nonalcoholic steatohepatitis)，World JGastroenterol，18(19)；2300-08(2012))。
在小鼠NASH衍生肝细胞癌(“NASH-HCC”)的一种该模型(称为Stelic动物模型或STAMIM)中，皮下链脲佐菌素(“STZ”)暴露并随后持续高脂饮食会在短短的6到16周内导致糖尿病、严重的脂肪变性、慢性小叶炎症、细胞周围纤维化、肝硬化和类似于人类NASH-HCC整个级联的HCC，包括转氨酶和血浆脂质的适度增加——人类NASH的主要标志物(Fujii M等人，“非酒精性脂肪性肝炎的小鼠模型——显示糖尿病与肝细胞癌之间关联的证据”(Amurine model for non-alcoholic steatohepatitis showing evidence ofassociation between diabetes and hepatocellular carcinoma)，Med Mol Morphol,46(3):141-52(2013))。
本发明提供了通常研究为用于其他病理的潜在疗法的现存药物的新用途，用于治疗和/或缓解NAFLD和NASH。
发明内容
在一个实施方式中，本发明提供了千金藤碱(Cepharanthine)在治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病中的用途和方法。
在另一个实施方式中，本发明提供了瑞吡司特(Repirinast)在治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病中的用途和方法。
在另一个实施方式中，本发明提供了半酒石酸艾芬地尔(IfenprodilHemitartrate)在治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病中的用途和方法。
在另一个实施方式中，本发明提供了布罗曼坦(Bromantane)在治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病中的用途和方法。
在另一个实施方式中，本发明提供了甲磺司特(Suplatast Tosylate)在治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病中的用途和方法。
在另一个实施方式中，本发明提供了阿克他利(Actarit)在治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病中的用途和方法。
在另一个实施方式中，本发明提供了氯苯扎利(Lobenzarit)在治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病中的用途和方法。
在另一个实施方式中，本发明提供了伊索拉定(Irsogladine)在治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病中的用途和方法。
在另一个实施方式中，本发明提供了伊曲茶碱(Istradefylline)在治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病中的用途和方法。
在另一个实施方式中，本发明提供了瑞帕地(Trapadil)在治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病中的用途和方法。
在另一个实施方式中，本发明提供了贝米特尔(Bemithyl)在治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病中的用途和方法。
在另一个实施方式中，本发明提供了西科维洛(Cenicriviroc)在治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病中的用途和方法。
在另外的方面中，非酒精性脂肪肝疾病是非酒精性脂肪性肝炎。
在本发明的实施方式中，非酒精性脂肪肝疾病是非酒精性脂肪性肝炎衍生的肝细胞癌。
附图说明
示例性实施方式显示于附图的参考图中。旨在将本文公开的实施方式和附图视为说明性的，而非限制性的。
图1显示了对C57BL/6小鼠的第一项研究中12个研究组(由“载剂”对照组和包括阳性对照治疗组替米沙坦(Telmisartan)的11个治疗组所组成)中各研究组进行由血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)构成的肝功能和疾病进展的评估(以单位/L表示)。平均值表示为±SD，使用Bonferroni多重比较检验确定。
图2a、2b、2c和2d显示了在C57BL/6小鼠的12个研究组(由“载剂”对照组和包括阳性对照治疗组替米沙坦(Telmisartan)的11个治疗组所组成)中各研究组的HE染色肝切片的代表性显微照片。上部图片的放大倍数为x50。下部图片的放大倍数为x200。各研究组的类别在每对图片的上部图片的上方列出。
图3显示了C57BL/6小鼠的12个研究组(由“载剂”对照组和包括阳性对照治疗组替米沙坦(Telmisartan)的11个治疗组所组成)中各研究组的NAFLD活性评分。平均值表示为±SD，使用Bonferroni多重比较检验确定。
图4显示了C57BL/6小鼠的12个研究组(由“载剂”对照组和包括阳性对照治疗组替米沙坦(Telmisartan)的11个治疗组所组成)中各研究组的脂肪变性评分。平均值表示为±SD，使用Bonferroni多重比较检验确定。
图5显示了C57BL/6小鼠的12个研究组(由“载剂”对照组和包括阳性对照治疗组替米沙坦(Telmisartan)的11个治疗组所组成)中各研究组的小叶炎症评分。平均值表示为±SD，使用Bonferroni多重比较检验确定。
图6显示了C57BL/6小鼠的12个研究组(由“载剂”对照组和包括阳性对照治疗组替米沙坦(Telmisartan)的11个治疗组所组成)中各研究组的肝细胞气球样变性(hepatocellular ballooning)评分。平均值表示为±SD，使用Bonferroni多重比较检验确定。
图7显示了C57BL/6小鼠的研究组(由“载剂”对照组和包括阳性对照治疗组替米沙坦(Telmisartan)的布罗曼坦和伊曲茶碱治疗组所组成)中各研究组的天狼猩红染色肝切片的代表性显微照片。图片的放大倍数为x200。各研究组的类别在每对图片的上部图片上方列出。
图8显示了C57BL/6小鼠的研究组(由“载剂”对照组和包括阳性对照治疗组替米沙坦(Telmisartan)的布罗曼坦和伊曲茶碱治疗组所组成)中各研究组的天狼猩红阳性区域(Sirius red-positive area)。平均值表示为±SD，使用Bonferroni多重比较检验确定。
图9显示了对C57BL/6小鼠的第二项研究中7个研究组(由正常(无NASH)组、“载剂”对照组和包括阳性对照治疗组替米沙坦(Telmisartan)的5个治疗组所组成)中各研究组进行由血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)构成的肝功能和疾病进展的评估(以单位/L表示)。平均值表示为±SD，使用Bonferroni多重比较检验确定。
图10a、10b和10c显示了在C57BL/6小鼠的7个研究组(由正常(无NASH)组、“载剂”对照组和包括阳性对照治疗组替米沙坦(Telmisartan)的5个治疗组所组成)中各研究组的HE染色肝切片的代表性显微照片。上部图片的放大倍数为x50。下部图片的放大倍数为x200。各研究组的类别在每对图片的上部图片的上方列出。
图11显示了C57BL/6小鼠的7个研究组(由正常(无NASH)组、“载剂”对照组和包括阳性对照治疗组替米沙坦(Telmisartan)的5个治疗组所组成)中各研究组的NAFLD活性评分。平均值表示为±SD，使用Bonferroni多重比较检验确定。
图12显示了C57BL/6小鼠的7个研究组(由正常(无NASH)组、“载剂”对照组和包括阳性对照治疗组替米沙坦(Telmisartan)的5个治疗组所组成)中各研究组的脂肪变性评分。平均值表示为±SD，使用Bonferroni多重比较检验确定。
图13显示了C57BL/6小鼠的7个研究组(由正常(无NASH)组、“载剂”对照组和包括阳性对照治疗组替米沙坦(Telmisartan)的5个治疗组所组成)中各研究组的小叶炎症评分。平均值表示为±SD，使用Bonferroni多重比较检验确定。
图14显示了C57BL/6小鼠的7个研究组(由正常(无NASH)组、“载剂”对照组和包括阳性对照治疗组替米沙坦(Telmisartan)的5个治疗组所组成)中各研究组的肝细胞气球样变性评分。平均值表示为±SD，使用Bonferroni多重比较检验确定。
图15a和15b显示了C57BL/6小鼠的7个研究组(由正常(无NASH)组、“载剂”对照组和包括阳性对照治疗组替米沙坦(Telmisartan)的5个治疗组所组成)中各研究组的天狼猩红染色肝切片的代表性显微照片。图片的放大倍数为x200。各研究组的类别在每对图片的上部图片上方列出。
图16显示了以百分比，对C57BL/6小鼠的7个研究组(由正常(无NASH)组、“载剂”对照组和包括阳性对照治疗组替米沙坦(Telmisartan)的5个治疗组所组成)进行由纤维化区域(即，天狼猩红阳性区域)构成的肝功能和疾病进展的评估。平均值表示为±SD，使用Bonferroni多重比较检验确定。
具体实施方式
发明人发现，许多批准用于其他病理学的药物化合物可用作抑制或缓解肝脂肪变性、小叶炎症和肝细胞气球样变性的活性成分，并且可用于预防和/或治疗NASH。在一些实施方式中，发现在NASH-HCC的小鼠STAMTM模型中，肝脂肪变性、小叶发炎和肝细胞气球样变性的水平被抑制或缓解。基于本文所述的实验结果，显示出在某些实施方式中，本文所述的化合物将用于预防和/或治疗NASH和/或NASH衍生的HCC。
下文的示例和数据显示了在两项研究中抑制或缓解肝脂肪变性、小叶炎症和肝细胞气球样变性的作用。在第一项研究中，给予治疗有效量的10种药物化合物。在第二项研究中，给予治疗有效量的5种药物化合物。药物化合物(下文中称为“测试试剂”)被批准用于其他病状，并与药学上可接受的载剂一起配制以用于递送和吸收。
目前提议的用于治疗NAFLD和NASH的疗法是给予药物化合物替米沙坦(Gitto等人，《成人非酒精性脂肪性肝炎的治疗：现在和将来》，肠胃学疾病研究实践(GastroenterolRes Pract)，2015：732870(2015)；Paschos P和Tziomalos K，《非酒精性脂肪肝疾病和肾 素-血管紧张素体系：治疗的意义》(Nonalcoholic fatty liver disease and the renin- angiotensinsystem:Implications for treatment)，世界肝病杂志(World J Hepatol)，4(12)：327-31(2012)；Musso G等人，《治疗非酒精性脂肪肝疾病的随机试验的荟萃分析》(Ameta-analysis of randomized trials for the treatment of nonalcoholic fattyliver disease)，肝脏病学(Hepatology)，52(1)：79-104(2010)；Georgescu EF等人，《血管紧张素受体阻断剂作为轻度至中度高血压相关的非酒精性脂肪性肝炎的疗法》(Angiotensin-receptor blockers as therapy for mild-to-moderate hypertension-associated non-alcoholic steatohepatitis)，World J Gastroenterol，15(8)：942-54(2009))，替米沙坦在本文所述的实验示例中用作阳性对照。
替米沙坦(2-(4-{[4-甲基-6-(1-甲基-1H-1,3-苯并二唑-2-基)-2-丙基-1H-1,3-苯并二唑-1-基]甲基}苯基)苯甲酸)是本领域已知用于治疗高血压的血管紧张素受体阻断剂。替米沙坦的化学结构为：
在本文所述的NASH-HCC的动物模型中，治疗有效量通常可以计算为人最大每日剂量的动物等效每日剂量。
千金藤碱的使用
千金藤碱((14S,27R)-22,33-二甲氧基-13,28-二甲基-2,5,7,20-四氧杂-13,28-二氮杂八环[25.6.2.216,19.13,10.121,25.04,8.014,39.031,35]三十九基(nonatriaconta)-1(33),3,8,10(39),16,18,21(36),22,24,31,34,37-十二烯(dodecaene))在本领域中已知为抗炎和抗肿瘤化合物，用于治疗辐射诱发的白细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、斑秃和糠秕性脱发、口干燥症、结节病，难治性贫血和各种癌症相关病状。千金藤碱的化学结构为：
在一个方面中，本发明提供了用千金藤碱(Cepharanthine)或其药学上可接受的变体治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病的用途和方法。非酒精性脂肪肝疾病可以是NASH或NASH-HCC。
在一个实施方式中，所用千金藤碱的量为0.5至10mg/kg对象。在优选实施方式中，所用千金藤碱的量为1至4mg/kg对象。在其它优选实施方式中，所用千金藤碱的量为约2.25mg/kg对象。在其它优选实施方式中，所用千金藤碱的量为约2.5mg/kg对象。
千金藤碱或其药学上可接受的变体可以口服、静脉内或以本领域已知方式给予对象。千金藤碱或其药学上可接受的变体还可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起给予。
瑞吡司特的使用
瑞吡司特(7,8-二甲基-4,5-二氧-5,6-二氢-4H-吡喃并[3,2-c]喹啉-2-羧酸3-甲基丁基酯)在本领域中已知为抗组胺剂。瑞吡司特的化学结构为：
在一个方面中，本发明提供了用瑞吡司特(Repirinast)或其药学上可接受的变体治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病的用途和方法。非酒精性脂肪肝疾病可以是NASH或NASH-HCC。
在实施方式中，所用瑞吡司特的量为2至50mg/kg对象/天。在优选实施方式中，所用瑞吡司特的量为5至10mg/kg对象/天。在其它优选实施方式中，所用瑞吡司特的量为约10mg/kg对象/天。
瑞吡司特或其药学上可接受的变体可以口服、静脉内或以本领域已知方式给予对象。瑞吡司特或其药学上可接受的变体还可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起给予。
艾芬地尔(Ifenprodil)的使用
艾芬地尔(4-[2-(4-苄基哌啶-1-基)-1-羟丙基]苯酚)在本领域中已知为选择性NMDA受体(谷氨酸)拮抗剂。化学结构为：
在本文实施例中所测试的一些实施方式中，使用具有以下结构的半酒石酸艾芬地尔(Ifenprodil Hemitartrate)(4-[2-(4-苄基哌啶-1-鎓-1-基)-1-羟丙基]苯酚；2,3,4-三羟基-4-氧代丁酸酯)
在一个方面中，本发明提供了用半酒石酸艾芬地尔(Ifenprodil Hemitartrate)或其药学上可接受的变体治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病的用途和方法。非酒精性脂肪肝疾病可以是NASH或NASH-HCC。
在实施方式中，所用艾芬地尔的量为0.1至5mg/kg对象/天。在优选实施方式中，所用艾芬地尔的量为0.5至3mg/kg对象/天。在其它优选实施方式中，所用艾芬地尔的量为约1mg/kg对象/天。
半酒石酸艾芬地尔或其药学上可接受的变体可以口服、静脉内或以本领域已知方式给予对象。半酒石酸艾芬地尔或其药学上可接受的变体还可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起给予。
布罗曼坦的使用
布罗曼坦(N-(4-溴苯基)金刚烷-2-胺)是神经衰弱治疗领域中已知的金刚烷(adamantine)家族的非典型精神刺激药和抗焦虑药。布罗曼坦的化学结构为：
在一个方面中，本发明提供了用布罗曼坦(Bromantane)或其药学上可接受的变体治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病的用途和方法。非酒精性脂肪肝疾病可以是NASH或NASH-HCC。
在实施方式中，所用布罗曼坦的量为0.8至5mg/kg对象/天。在优选实施方式中，所用布罗曼坦的量为1.7至3.3mg/kg对象/天。在其它优选实施方式中，所用布罗曼坦的量为约1.7mg/kg对象/天。
布罗曼坦或其药学上可接受的变体可以口服、静脉内或以本领域已知方式给予对象。布罗曼坦或其药学上可接受的变体还可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起给予。
甲磺司特(Suplatast Tosylate)的使用
甲磺司特((3-{[4-(乙氧基-2-羟基丙氧基)苯基]氨基}-3-氧丙基)(二甲基)锍4-甲基苯磺酸盐)是本领域中已知用作抗过敏剂的Th2细胞因子抑制剂。甲磺司特的化学结构为：
在一个方面中，本发明提供了用甲磺司特(Suplatast Tosylate)或其药学上可接受的盐治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病的用途和方法。非酒精性脂肪肝疾病可以是NASH或NASH-HCC。
在实施方式中，所用甲磺司特的量为1至10mg/kg对象/天。在优选实施方式中，所用甲磺司特的量为2至8mg/kg对象/天。在另一优选实施方式中，所用甲磺司特的量为4.5至5.4mg/kg对象/天。在其它优选实施方式中，所用甲磺司特的量为约5mg/kg对象/天。
甲磺司特或其药学上可接受的盐可以口服、静脉内或以本领域已知方式给予对象。甲磺司特或其药学上可接受的盐还可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起给予。
阿克他利的使用
阿克他利((4-乙酰胺基苯基)乙酸)是本领域用于治疗类风湿关节炎的已知的缓解疾病的抗风湿药。阿克他利的化学结构为：
在一个方面中，本发明提供了用阿克他利(Actarit)或其药学上可接受的变体治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病的用途和方法。非酒精性脂肪肝疾病可以是NASH或NASH-HCC。
在实施方式中，所用阿克他利的量为3.75至6.25mg/kg对象/天。在优选实施方式中，所用阿克他利的量为4.16至5.83mg/kg对象/天。在另一优选实施方式中，所用阿克他利的量为4.58至5.42mg/kg对象/天。在其它优选实施方式中，所用阿克他利的量为约5mg/kg对象/天。
阿克他利或其药学上可接受的变体可以口服、静脉内或以本领域已知方式给予对象。阿克他利或其药学上可接受的变体还可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起给予。
氯苯扎利的使用
氯苯扎利(2-[(2-羧苯基)氨基]-4-氯苯甲酸)是本领域的用于治疗关节炎的已知免疫调节剂。氯苯扎利的化学结构为：
在一个方面中，本发明提供了用氯苯扎利(Lobenzarit)或其药学上可接受的变体治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病的用途和方法。非酒精性脂肪肝疾病可以是NASH或NASH-HCC。
在实施方式中，所用氯苯扎利的量为1至10mg/kg对象/天。在优选实施方式中，所用氯苯扎利的量为2至7mg/kg对象/天。在另一优选实施方式中，所用氯苯扎利的量为3至5mg/kg对象/天。在其它优选实施方式中，所用氯苯扎利的量为约4mg/kg对象/天。
氯苯扎利或其药学上可接受的变体可以口服、静脉内或以本领域已知方式给予对象。氯苯扎利或其药学上可接受的变体还可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起给予。
伊索拉定的使用
伊索拉定(6-(2,5-二氯苯基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺)是本领域中已知用作粘膜保护药的磷酸二酯酶抑制剂，用于治疗消化性溃疡病和急性胃炎。伊索拉定的化学结构为：
在一个方面中，本发明提供了用伊索拉定(Irsogladine)或其药学上可接受的变体治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病的用途和方法。非酒精性脂肪肝疾病可以是NASH或NASH-HCC。
在实施方式中，所用伊索拉定的量为0.0416至0.125mg/kg对象/天。在优选实施方式中，所用伊索拉定的量为0.066至0.1mg/kg对象/天。在其它优选实施方式中，所用伊索拉定的量为约0.08mg/kg对象/天。在其它优选实施方式中，所用伊索拉定的量为约0.07mg/kg对象/天。
伊索拉定或其药学上可接受的变体可以口服、静脉内或以本领域已知方式给予对象。伊索拉定或其药学上可接受的变体还可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起给予。
伊曲茶碱的使用
伊曲茶碱(8-[(E)-2-(3,4-二甲氧基苯基)乙烯基]-1,3-二乙基-7-甲基-3,7-二氢-1H-嘌呤-2,6-二酮)是本领域已知的选择性A2A受体拮抗剂，用于治疗帕金森氏病的运动障碍。伊曲茶碱的化学结构为：
在一个方面中，本发明提供了用伊曲茶碱(Istradefylline)或其药学上可接受的变体治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病的用途和方法。非酒精性脂肪肝疾病可以是NASH或NASH-HCC。
在实施方式中，所用伊曲茶碱的量为0.1至5mg/kg对象/天。在优选实施方式中，所用伊曲茶碱的量为0.3至1.3mg/kg对象/天。在其它优选实施方式中，所用伊曲茶碱的量为约1.3mg/kg对象/天。
伊曲茶碱或其药学上可接受的变体可以口服、静脉内或以本领域已知方式给予对象。伊曲茶碱或其药学上可接受的变体还可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起给予。
瑞帕地的使用
瑞帕地(N,N-二乙基-5-甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺)在本领域中已知用作血管扩张剂、抗血小板药和血小板衍生生长因子拮抗剂。瑞帕地的化学结构为：
在一个方面中，本发明提供了用瑞帕地(Trapidil)或其药学上可接受的变体治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病的用途和方法。非酒精性脂肪肝疾病可以是NASH或NASH-HCC。
在实施方式中，所用瑞帕地的量为4.16至5.83mg/kg对象/天。在优选实施方式中，所用瑞帕地的量为4.58至5.41mg/kg对象/天。在其它优选实施方式中，所用瑞帕地的量为约5mg/kg对象/天。在另一实施方式中，在对对象使用5mg/kg的瑞帕地之前，对对象使用单剂量的10mg/kg瑞帕地。
瑞帕地或其药学上可接受的变体可以口服、静脉内或以本领域已知方式给予对象。瑞帕地或其药学上可接受的变体还可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起给予。
贝米特尔的使用
贝米特尔(2-乙基磺酰基-1H-苯并咪唑)是在本领域已知的合成的活性保护剂(actoprotector)、抗氧化剂和抗诱变剂，并且经常用于提高身体机能。贝米特尔的化学结构为：
在一个方面中，本发明提供了用贝米特尔(Bemithyl)或其药学上可接受的变体治疗或预防对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病的用途和方法。非酒精性脂肪肝疾病可以是NASH或NASH-HCC。
在实施方式中，所用贝米特尔的量为0.5至30mg/kg对象/天。在优选实施方式中，所用贝米特尔的量为1至25mg/kg对象/天。在其它优选实施方式中，所用贝米特尔的量为5至20mg/kg对象/天。在其它优选实施方式中，所用贝米特尔的量为约8mg/kg对象/天。在其它优选实施方式中，所用贝米特尔的量为约17mg/kg对象/天。
贝米特尔或其药学上可接受的变体可以口服、静脉内或以本领域已知方式给予对象。贝米特尔或其药学上可接受的变体还可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起给予。
组合使用
在另一方面中，本发明提供了组合使用千金藤碱(Cepharanthine)、瑞吡司特(Repirinast)、半酒石酸艾芬地尔(Ifenprodil Hemitartrate)、布罗曼坦(Bromantane)、甲磺司特(Suplatast Tosylate)、阿克他利(Actarit)、氯苯扎利(Lobenzarit)、伊索拉定(Irsogladine)、伊曲茶碱(Istradefylline)和瑞帕地(Trapadil)中一种或多种治疗或预防对象的NASH或NASH-HCC的用途和方法。在另一方面中，本发明提供了组合使用如下物质治疗或预防对象的NASH或NASH-HCC的用途和方法：千金藤碱(Cepharanthine)、瑞吡司特(Repirinast)、半酒石酸艾芬地尔(Ifenprodil Hemitartrate)、布罗曼坦(Bromantane)、甲磺司特(Suplatast Tosylate)、阿克他利(Actarit)、氯苯扎利(Lobenzarit)、伊索拉定(Irsogladine)、伊曲茶碱(Istradefylline)和瑞帕地(Trapadil)中的一种或多种，以及降胆固醇药物、糖尿病药物、降压药或维生素E中的一种或多种。
组合使用的降胆固醇药物的示例包括：阿托伐他汀(立普妥(Lipitor))、氟伐他汀(来适可(Lescol))、洛伐他汀、匹伐他汀(力清之(Livalo))、普伐他汀(普拉固(Pravachol))、瑞舒伐他汀钙(可定(Crestor))、辛伐他汀(舒降之(Zocor))和烟酸、阿利库单抗(Alirocumab)(普伦特(Praluent))、依洛尤单抗(Evolocumab)(瑞百安(Repatha))、阿利库单抗(普伦特)和依洛尤单抗(瑞百安)。组合使用的糖尿病药物的示例包括胰岛素。组合使用的降压药的示例包括：抗压药、钙通道阻断剂、ACEI抑制剂，血管紧张素II受体阻断剂、利尿剂和β阻断剂。已知的血管紧张素II受体拮抗剂的示例包括：血管紧张素I受体亚型拮抗剂和血管紧张素II受体亚型拮抗剂。合适的血管紧张素II受体拮抗剂包括：洛沙坦(losartan)和缬沙坦(valsartan)。合适的钙通道阻断剂包括：例如，维拉帕米、地尔硫尼卡地平、硝苯地平、氨氯地平、非洛地平、尼莫地平和苄普地尔(bepridil)。利尿剂包括：例如，呋塞米(furosemide)、氯噻嗪(diuril)、阿米洛利、和双氢氯噻嗪(hydrodiuril)。洛沙坦、坎地沙坦(candesartan)、替米沙坦、缬沙坦、奥美沙坦(olmesartan)、厄贝沙坦(irbesartan)等可以用作降压剂。
本文所用的术语“有效量”是指足以在所治疗对象中赋予所需预防或治疗作用的活性成分的量。在一个方面中，用于抑制或缓解肝脂肪变性、小叶炎症、肝细胞气球样变性或NASH衍生的HCC的量改善或减轻了其一种或多种症状、病状或进展。在一些实施方式中，使用测量各种疾病进展相关指标的本领域已知方法来确定并评估症状、病状或进展，例如通过免疫组织化学染色来分析肝切片。
在一些实施方式中，有效量由本领域技术人员确定，例如，评估接受药物化合物的对象的给药途径和频率、体重和种类。在一些实施方式中，有效量的药物化合物与药学上可接受的载剂一起配置，并且给予对象。
本文所用的术语“药学上可接受的”是指载剂是本领域中已知的，与药物化合物相容，同时对于接受治疗的对象也是安全的。在一些实施方式中，药学上可接受的载剂由本领域技术人员确定，例如，评估药物化合物在所述载剂中的溶解度。
参考以下实施例进一步描述本发明的示例性实施方式，这些实施例旨本质上是说明性的而不是限制。在第一项研究中，给予治疗有效量的10种药物化合物。在第二项研究中，给予治疗有效量的5种药物化合物。
实施例1
材料和方法
使用雄性新生C57BL/6小鼠。在研究开始之前，所有小鼠均来自从日本SLC公司(Japan SLC,Inc.)(日本滨松)获得的无病原体的14天怀孕小鼠。
根据先前描述的本领域已知方法进行NASH-HCC的鼠STAMTM模型(Takakura等人，非酒精性脂肪性肝炎的特征(Characterization of non-alcoholic steatohepatitis)，Anticancer Res，34(9)：4849-55(2014)；Fujii等人(2013))。在雄性小鼠出生后2天时单次皮下注射200μg链脲佐菌素(STZ，西格玛公司(Sigma)，美国密苏里州)，并用连续喂养随意提供的高脂饮食(CLEA日本公司(CLEA Japan Inc)，日本东京)4周龄(第28±2天)后，雄性小鼠被诱发NASH。
诱发NASH后，根据治疗开始前一天的体重，将小鼠随机分为12个单独的研究组，每组8只6周龄(42±2天)小鼠。
随机分组后一天，从6周龄加上一日(第43±2天，治疗第1天)至9周龄(下文称为“治疗期”)，给予小鼠每天一次口服治疗。12个研究组(以下称为“治疗组”)中11个研究组中的小鼠单独由与药学上可接受的载剂一起配制的独特药物化合物进行治疗。这11个研究组中各组接受的药物化合物为10种测试试剂中的1种或作为阳性对照的替米沙坦。所有组中的药学上可接受的载剂是0.5％的羧甲基纤维素(CMC)。剩余研究组(以下称为“载剂对照组”)中的小鼠单独用不含活性成分的相同药学上可接受的载剂进行治疗。在治疗期间每天对个体体重进行测量。还每天监测小鼠的存活、临床迹象和行为。
表1
组 每天一次口服剂量mg/kg
1 正常(无NASH) 无
2 替米沙坦(+) 10
3 载剂(-) N/A
4 千金藤碱 12
5 瑞吡司特 60
6 半酒石酸艾芬地尔 30
7 布罗曼坦 20
8 甲磺司特 60
9 阿克他利 60
10 氯苯扎利 48
11 伊索拉定 1
12 伊曲茶碱 18
13 瑞帕地 60
在各情况下，从6周龄至9周龄口服给予10mL/kg的0.5％CMC(含有或不含如表1所示活性成分)直至处死。一个例外是瑞帕地，在第0天以120mg/kg的剂量口服给予，然后从治疗的第1天开始以60mg/kg的每日剂量口服给予。随后所有小鼠在9个月大时处死。从所有小鼠采集血液样本，并取出各小鼠的肝脏进行分析。
选择的用于动物研究的剂量通过以下方式确定：取已知的最大人每日剂量除以成人平均体重(约60-70kg)以得出人的mg/kg剂量。然后将该数字乘以12，即可基于常规剂量表将其转换为小鼠剂量。参见，Nair和Jacob，J Basic Clin Pharm，2016年3月-2016年5月，7(2):27-31。
对各小鼠进行以下测量和评估。
体重：在整个治疗期间，每天测量所有小鼠的体重。
血液样本采集和生化分析：从所有处死的小鼠采集血液并冷冻以用于进一步分析或运输。
血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)：通过FUJI DRI CHEM(日本富士薄膜公司(Fujifilm))分析各血液样本的血浆中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)，作为肝功能和疾病进展的指标。
肝脏样本采集、生化分析和组织学分析：从所有处死的小鼠取出肝脏并冷冻以用于进一步分析或运输。
肝脏重量：取出后，以克为单位，对所有被处死小鼠的肝脏进行称重。
肝脏组织病理学：将取出的肝脏固定在福尔马林中，并包埋在石蜡中，然后制备横切面(4μm)。
脂肪性肝炎的评估：使用标准技术对肝脏横切面进行苏木精和曙红(H&E)染色，以进行肝脂肪变性、小叶炎症和肝细胞气球样变性的组织学评估。各肝脏横切面的脂肪性肝炎严重程度以如下的NAFLD活性评分表示：在3个随机选择的H&E染色肝脏横切面区域中，0(正常)、1-2(NAFLD)、3-4(临界)或至少5(NASH)，脂肪变性评估以50倍的放大倍数进行，炎症和气球样变性评估以200倍的放大倍数进行。NAFLD活性评分是以下各项的未加权总和：1)肝脂肪变性评分(0-3)；2)小叶炎症评分(0-2)；3)肝细胞气球样变性评分(0-2)。
使用标准技术对载剂组以及布罗曼坦、伊曲茶碱和替米沙坦治疗组的肝脏横切面也进行了天狼猩红染色，用于纤维化区域百分比的组织学估算。为了纤维化区域的定量分析，使用数码相机(DFC295；德国莱卡公司(Leica))以200倍的放大倍率捕获中央静脉周围的天狼猩红染色切片的明场图像，并使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)测量5个视野/切片中的阳性区域。
统计学分析
值是算数平均值。使用了双尾异方差(双样本不相等方差)斯氏T检验比较研究组与阳性对照组。在对多个组(Bonferroni多重比较检验)进行Bonferroni事后统计校正分析(Bonferroni post-hoc statistical correction analysis)后，<0.05的P值被认为具有统计学显著性。在该情况下，校正因子为12，对应于研究组的数量。按照常规惯例，所选的P值分类和统计学显著性水平以及其相应分类评分显示在表2中。
表2：P值分类:统计学显著性水平
P值 统计描述 分类评分
P≥0.05 不显著 NS
0.01≤P<0.05 显著 *
0.001≤P<0.01 0.01 非常显著 **
P<0.001 极其显著 ***
结果
肝功能评估：如先前所述，通过血浆ALT评估肝功能和疾病进展。结果总结于图1。
脂肪性肝炎评估：如先前所述，通过肝横切面H&E-染色来评估脂肪性肝炎和疾病进展。12个研究组中各组的HE-染色的肝切片的代表性显微照片显示于图2a-2d中。
各研究组的NAFLD活性评分由各研究组中所有小鼠的NAFLD活性评分平均值组成。根据各动物的脂肪变性评分、小叶炎症评分和肝细胞气球样变性评分来确定评分。结果总结于图3-6。
如先前所述，还通过肝横切面的天狼猩红染色来评估脂肪性肝炎和疾病进展。载剂、布罗曼坦、伊曲茶碱和替米沙坦研究组的天狼猩红染色的肝切片的代表性显微照片显示于图7中。结果示于图8。
观察到相对于载剂对照，布罗曼坦和伊曲茶碱治疗组以及替米沙坦阳性对照的NAFLD活性评分在统计学上显著降低。观察到相对于载剂对照，布罗曼坦、伊索拉定和伊曲茶碱治疗组的肝细胞气球样变性评分在统计学上显著降低。
与载剂组相比，布罗曼坦和伊曲茶碱组显示出纤维化区域(天狼猩红阳性区域)显著减少。与载剂组相比，替米沙坦组的纤维化区域倾向于减少。载剂组的肝切片显示出在肝小叶中央周围区域中胶原沉积增加。
NAFLD活性评分的统计学显著和临床相关的复合降低(尤其是布罗曼坦和伊曲茶碱)表明这些化合物可用于预防和/或治疗NASH及其后遗症。
实施例2
材料和方法
如前所述，使用雄性新生C57BL/6小鼠。在研究开始之前，所有小鼠均来自从日本SLC公司(Japan SLC,Inc.)(日本滨松)获得的无病原体的14天怀孕小鼠。
根据先前描述的本领域已知方法进行NASH-HCC的鼠STAMTM模型(Takakura等人，非酒精性脂肪性肝炎的特征(Characterization of non-alcoholic steatohepatitis)，抗癌研究(Anticancer Res)，34(9)：4849-55(2014)；Fujii等人(2013))。在雄性小鼠出生后2天时单次皮下注射200μg链脲佐菌素(STZ，西格玛公司(Sigma)，美国密苏里州)，并用连续喂养随意提供的高脂饮食(CLEA日本公司(CLEA Japan Inc)，日本东京)4周龄(第28±2天)后，雄性小鼠被诱发NASH。
诱发NASH后，根据治疗开始前一天的小鼠体重，将小鼠随机分为7个单独的研究组，每组8只6周龄(42±2天)小鼠。
随机分组后一天，从6周龄加上一日(第43±2天，治疗第1天)至9周龄，给予小鼠每天一次口服治疗。7个研究组中6个研究组中的小鼠单独由治疗量的与药学上可接受的载剂一起配制的药物化合物进行治疗。这6个研究组中各组接受的药物化合物为4种测试试剂中的1种或作为阳性对照的替米沙坦。所有组中的药学上可接受的载剂是0.5％CMC。剩余的研究组(载剂对照组)中的小鼠单独用不含活性成分的相同药学上可接受的载剂进行治疗。在治疗期间每天对个体体重进行测量。还每天监测小鼠的存活、临床迹象和行为。
表3
组 每天一次口服剂量mg/kg
1 正常(无NASH) 无
2 替米沙坦(+) 10
3 载剂(-) 无
4 布罗曼坦 20
5 布罗曼坦 40
6 贝米特尔 200
7 西科维洛 30
在各情况下，从6周龄至9周龄口服给予10mL/kg的0.5％CMC(含有或不含如表3所示活性成分)。随后所有小鼠在9个月大时处死。从所有小鼠采集血液样本，并取出各小鼠的肝脏进行分析。
选择的用于动物研究的剂量通过以下方式确定：将已知的最大人每日剂量除以成人平均体重(约60-70kg)以得出人的mg/kg剂量。然后将该数字乘以12，即可基于常规剂量表将其转换为小鼠剂量。参见，Nair和Jacob，J Basic Clin Pharm，2016年3月-2016年5月，7(2):27-31。
对各小鼠进行以下测量和评估。
体重：在整个治疗期间，每天测量所有小鼠的体重。
血液样本采集和生化分析：从所有处死的小鼠采集血液并冷冻以用于进一步分析或运输。
血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)：通过FUJI DRI CHEM(日本富士薄膜公司)分析各血液样本的血浆中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)，作为肝功能和疾病进展的指标。
肝脏样本采集、生化分析和组织学分析：从所有处死的小鼠取出肝脏并冷冻以用于进一步分析或运输。取出后，以克为单位，对所有被处死小鼠的肝脏进行称重。
肝脏组织病理学：将取出的肝脏固定在福尔马林中，并包埋在石蜡中，然后制备横切面(4μm)。
脂肪性肝炎的评估：使用标准技术对肝脏横切面进行苏木精和曙红(H&E)染色，以进行肝脂肪变性、小叶炎症和肝细胞气球样变性的组织学评估。各肝脏横切面的脂肪性肝炎严重程度以如下的NAFLD活性评分表示：在3个随机选择的H&E染色肝脏横切面区域中，0(正常)、1-2(NAFLD)、3-4(临界)或至少5(NASH)，脂肪变性评估以50倍的放大倍数进行，炎症和气球样变性评估以200倍的放大倍数进行。NAFLD活性评分是以下各项的未加权总和：1)肝脂肪变性评分(0-3)；2)小叶炎症评分(0-2)；3)肝细胞气球样变性评分(0-2)。
使用标准技术对治疗组的肝脏横切面也进行了天狼猩红染色，用于纤维化区域百分比的组织学估算。为了纤维化区域的定量分析，使用数码相机(DFC295；德国莱卡公司(Leica))以200倍的放大倍率捕获中央静脉周围的天狼猩红染色切片的明场图像，并使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)测量5个视野/切片中的阳性区域。
统计学分析
值是算数平均值。使用了双尾异方差(双样本不相等方差)斯氏T检验比较研究组与阳性对照组。在对多个组(Bonferroni多重比较检验)进行Bonferroni事后统计校正分析(Bonferroni post-hoc statistical correction analysis)后，<0.05的P值被认为具有统计学显著性。在该情况下，校正因子为7，对应于研究组的数量。按照常规惯例，所选的P值分类和统计学显著性水平以及其相应分类评分显示在表2(在上文中)中。
结果
肝功能评估：如先前所述，通过血浆ALT评估肝功能和疾病进展。结果总结于图9。
脂肪性肝炎评估：如先前所述，通过肝横切面H&E-染色来评估脂肪性肝炎和疾病进展。7个研究组中各组的HE-染色的肝切片的代表性显微照片显示于图10a-10c中。
各研究组的NAFLD活性评分由各研究组中所有小鼠的NAFLD活性评分平均值组成。根据各动物的脂肪变性评分、小叶炎症评分和肝细胞气球样变性评分来确定评分。结果总结于图11-14。
观察到相对于载剂对照，高布罗曼坦和西科维洛治疗组以及替米沙坦阳性对照的NAFLD活性评分在统计学上显著降低。观察到相对于载剂对照，布罗曼坦高治疗组以及替米沙坦阳性对照的脂肪变性评分在统计学上显著降低。
显然，与载剂组相比，所有研究组(包括低布罗曼坦、高布罗曼坦、贝米特尔和西科维洛组)显示出纤维化区域(天狼猩红阳性区域)显著减少。贝米特尔组在纤维化区域方面显示出统计学上的显著下降。与载剂组相比，替米沙坦组的纤维化区域也倾向于减少。
NAFLD活性评分的统计学显著的和临床相关的复合降低(尤其是高布罗曼坦、贝米特尔和西科维洛)表明这些化合物可用于预防和/或治疗NASH及其后遗症。
结论
总而言之，给予许多批准用于其他病理学的药物化合物测试试剂(尤其是布罗曼坦、伊曲茶碱和西科维洛)显示出在降低NAFLD活性评分、肝脂肪变性、小叶炎症和肝细胞气球样变性的改善，并且可用于预防和/或治疗NASH。特别是，40mg/kg的布罗曼坦和18mg/kg的伊曲茶碱、然后是30mg/kg的西科维洛进行治疗的组改善得更好。
与载剂组相比，口服替米沙坦10mg/kg也显示出NAFLD活性评分、肝脂肪变性、小叶炎症和肝细胞气球样变性的改善。
在整个说明书中，阐述了具体细节以便为本领域技术人员提供更透彻的理解。然而，可能没有显示或详细描述众所周知的元素，以避免不必要地模糊本公开。因此，认为说明书和附图道理上是说明性而不是限制性的。
尽管上文已经讨论了许多示例性方面和实施方式，但是本领域技术人员将认识到其某些修改、排列、添加和子组合。因此，旨在将所附权利要求和后续引用的权利要求解释为总体上包括与本说明书的最宽泛解释一致的所有修改、排列、添加和子组合。

Claims (4)

1.瑞吡司特在制备用于治疗对象的小叶炎症或非酒精性脂肪肝疾病的药物中的用途，其中，所述非酒精性脂肪肝疾病为非酒精性脂肪性肝炎或非酒精性脂肪性肝炎衍生的肝细胞癌。
2.如权利要求1所述的用途，其中，瑞吡司特的量为1-20mg/kg对象。
3.如权利要求2所述的用途，其中，瑞吡司特的量为3-10mg/kg对象。
4.如权利要求3所述的用途，其中，瑞吡司特的量为10mg/kg对象。
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