DE102013110608A1

DE102013110608A1 - Substanz zur Hemmung von Gewebskalzifizierung, Gewebsfibrosierung und altersassoziierten Erkrankungen

Info

Publication number: DE102013110608A1
Application number: DE102013110608.0A
Authority: DE
Inventors: Anmelder Gleich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-09-26
Filing date: 2013-09-26
Publication date: 2015-03-26
Also published as: WO2015044180A1; CN105939711A; US20160346320A1; EP3049080A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Substanz zur Minderung von Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung, zur Verzögerung des Eintretens altersassoziierter Erkrankungen eines Lebewesens und damit im Zusammenhang stehende Verfahren.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Substanz zur Minderung von Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung und zur Verzögerung des Eintretens altersassoziierter Erkrankungen und damit im Zusammenhang stehende Verfahren.
Der Alterungsprozess eines Lebewesens ist typischerweise gekennzeichnet durch das vermehrte Auftreten von Erkrankungen und organischen Funktionsstörungen. Solche sog. altersassoziierten Krankheiten oder Alterssyndrome münden schließlich im Versterben des Lebewesens. Beim Alterungsprozess spielen Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung eine entscheidende Rolle.
Die Gewebskalzifizierung spielt vor allem beim beschleunigten Altern von Patienten mit Niereninsuffizienz eine entscheidende Rolle. Der Untergang von funktionierendem Organgewebe bei Ersatz durch Bindegewebe (Fibrosierung) spielt bei Niereninsuffizienz, Leberszirrhose, Morbus Crohn, fibrosierender Pankreatitis, Lungenfibrose, Herzinsuffizienz und Narbenbildung eine zentrale Rolle. Ferner führt Gewebsfibrosierung zur Beeinträchtigung der Wirksamkeit von Peritonealdialyse.
Gewebskalzifizierung und Fibrosierung werden beide durch den „transforming growth factor“ TGFß1 stimuliert, der auch zur Entstehung der Alzheimer´schen Erkrankung beiträgt. Bei der Signaltransduktion von Gewebskalzifizierung ist ferner eine Aktivierung der alkalischen Phosphatase und die gesteigerte Expression des Transkriptionsfaktors Runx2 beteiligt.
Exzessive Gewebskalzifizierung, frühes Auftreten von altersassoziierten Erkrankungen und verkürzte Lebensspanne werden bei Klotho-defizienten Mäusen (klotho^hm) beobachtet. Hemmung der Gewebskalzifizierung sowie Verlängerung der Lebensdauer nach Verabreichung eines Agens an diese Mäuse erlaubt daher den Rückschluß, dass dieses Agens Gewebskalzifizierung und Altern verzögert.
Im Stand der Technik finden sich unzählige Hinweise auf vermeintliche Substanzen zur Minderung von Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung und zur Verzögerung des Eintretens altersassoziierter Erkrankungen. Über die Wirksamkeit dieser Substanzen fehlt jedoch in den meisten Fällen jeglicher wissenschaftlicher Beleg.
Vor diesem Hintergrund liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Substanz zur Minderung von Gewebskalzifizierung und Organfibrosierung sowie altersassoziierten Erkrankungen bei einem Lebewesen zu finden.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung von Ammoniumsulphat, Ammoniumzitrat, Ammoniumlaktat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid (NH₄Cl), Chloroquin und dem Karboanhydrasehemmer Acetazolamid gelöst.
Diese Erkenntnis der Erfinder ist überraschend.
Ammoniumsulphat ist das Salz von Ammoniak und Schwefelsäure. In der Lebensmitteltechnologie wird Ammoniumsulphat als Zusatzstoff zur Regulation der Säure verwendet und gilt bei der U.S. Food and Drug Administration allgemein als sicher (generally recognized as safe [GRAS]). In der Europäischen Union trägt es die Nummer E517.
Ammoniumzitrat ist das Salz von Ammoniak und Zitronensäure und ist in der Europäischen Union unter der Nummer E380 zugelassen.
Ammoniumlaktat ist das Salz von Ammoniak und Milchsäure und wird in der Europäischen Union unter der Nummer E328 als Säureregulator geführt.
Ammoniumnitrat wird als Düngemittel und in Sprengstoffen eingesetzt.
Ammoniumchlorid mit der Summenformel NH₄Cl, das auch als Ammoniummuriat, Ammoniaksalz oder Salmiak bezeichnet wird und die CAS-Nr. 12125/02/9 aufweist, ist das Ammoniumsalz der Salzsäure. Es ist ein farbloser, kristalliner Feststoff. Ammoniumchlorid wird in der Lebensmitteltechnologie als Zusatzstoff verwendet und trägt dort die Nr. E 510. In der Medizin kommt Ammoniumchlorid als Expektorans, d.h. als Hustenlöser, zum Einsatz.
Chloroquin [(RS)-N'-(7-chloroquinolin-4-yl)-N,N-diethyl-pentane-1,4-diamine] alkalinisiert Lysosomen und wird gegen Malaria, zur Immunsuppression, zur Behandlung viraler Erkrankungen und gegen Tumoren eingesetzt.
Der Karboanhydrasehemmer Acetazolamid hemmt die enzymatische Umwandlung von Bikarbonat zu Kohlendioxid und kann daher den lokalen pH beeinflussen. Er wird als Diuretikum eingesetzt.
Bekannt ist, dass eine Azidose, wie sie durch Ammoniumchlorid (NH₄Cl) ausgelöst werden kann, die Gewebskalzifizierung hemmen kann. Ferner ist bekannt, dass Azetazolamid die Phosphatkonzentration senken kann, wodurch die Gewebskalzifizierung herabgesetzt werden würde. In den Experimenten an der klotho^hm Maus wurde die die Gewebskalzifizierung durch Ammoniumchlorid jedoch ohne Verschärfung der Azidose und durch Azetazolamid ohne Senkung der Plasmaphosphatkonzentration gehemmt (s.u.).
Die Verwendung von Ammoniumsulphat, Ammoniumzitrat, Ammoniumlaktat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid (NH₄Cl), Chloroquin oder Acetazolamid zur Hemmung der Signaltransduktion, welche zu Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung führt und das Eintreten von altersassoziierten Erkrankungen verzögert, ist im Stand der Technik nicht beschrieben.
Die Erfinder konnten an einem etablierten Zellmodell belegen, dass Ammoniumsulphat, Ammoniumzitrat, Ammoniumlaktat, Ammoniumnitrat und Ammoniumchlorid (NH₄Cl) die Bildung von TGFß1, einem Schlüsselmolekül in der Regulation von Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung, hemmen. Ferner konnten die Erfinder nachweisen, dass Ammoniumsulphat, Ammoniumnitrat und Ammoniumchlorid die Expression des Transkriptionsfaktors Runx2 hemmen und dass Ammoniumsulphat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid und Chloroquin die Expression der alkalischen Phosphatase herabsetzen, die beide bekannte Stimulatoren der Gewebsverkalkung sind. Schließlich konnten die Erfinder in einem etablierten Tiermodell zeigen, dass die Verabreichung von Ammoniumchlorid und Acetazolamid zu einer deutlichen Lebensverlängerung führt und Gewebe- und Gefäßkalzifizierung, vermindern bzw. verhindern.
Erfindungsgemäß wird unter "Verwendung" verstanden, dass zumindest eine der genannten Substanzen die beanspruchte Wirkung induziert. Dabei kann erfindungsgemäß die Verwendung der genannten Substanzen im Rahmen von Monotherapien erfolgen, bei der Ammoniumsulphat, Ammoniumzitrat, Ammoniumlaktat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid (NH₄Cl), Chloroquin und Acetazolamid als Wirkstoff bzw. alleiniger Wirkstoff eingesetzt wird. Es sind jedoch auch Kombinationstherapien möglich, bei denen zwei oder mehrere dieser Wirkstoffe gleichzeitig eingesetzt werden.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.
Nach einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung sind altersassoziierten Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Arteriosklerose, Lungenemphysem, Hautatrophie, Muskelschwäche, Immunabwehrschwäche, Infertilität, Kyphose, gestörter CaPO₄-Metabolismus, Osteoporose, Immunschwäche (Thymusrückbildung), und Neurodegeneration.
Nach einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung basiert die Gewebsfibrosierung auf einer Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Leberszirrhose, Morbus Crohn, fibrosierende Pankreatitis, Lungenfibrose, Herzinsuffizienz, Narbenbildung, Fibrosierung bei Peridonealdialyse, Alzheimer´sche Erkrankung.
Die Maßnahme hat den Vorteil, dass Substanzen bereitgestellt werden, mit denen wichtige fibrosierenden Erkrankungen prophylaktisch und therapeutisch behandelt werden können.
Bei Ammoniumsulphat, Ammoniumzitrat, Ammoniumlaktat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid (NH₄Cl), Chloroquin und Acetazolamid kann es sich um Wirkstoffe in einer pharmazeutischen Zusammensetzung handeln, die vorzugsweise für eine orale, rektale, parenterale, intraperitoneale, lokale oder transdermale Applikation ausgebildet ist. Ferner kann die pharmazeutische Zusammensetzung vorzugsweise als Pulver, Tablette, Saft, Tropfen, Dialyseflüssigkeit, Kapsel, Zäpfchen, Lösung, Injektionslösung, Aerosol, Salbe, Spülung, Pflaster, Pellet, Dragee oder modifiziert freisetzende Darreichungsform ausgebildet sein.
Die Absolutmenge des Ammoniumsulphat, Ammoniumzitrat, Ammoniumlaktat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid (NH₄Cl), Chloroquin und Acetazolamid in einer Dosierungseinheit der pharmazeutischen Zusammensetzung bestimmt der Fachmann nach den Bedürfnissen des Einzelfalls. Zusammensetzungen für die Verabreichung beim erwachsenen Menschen können Tageseinheiten von ca. 25 g Ammoniumsulphat, 25 g Ammoniumzitrat, 35 g Ammoniumlaktat, 25 g Ammoniumnitrat, 20 g Ammoniumchlorid (NH₄Cl), 900 mg Chloroquin und 800 mg Acetazolamid vorsehen. Der Fachmann kann jedoch auch hiervon abweichende andere Absolutmengen vorsehen.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass der Wirkstoff in einer Absolutmenge bereitgestellt wird, die die gewünschten Wirkungen erzielt.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ggf. weitere Zusätze enthalten, die im Stand der Technik allgemein bekannt sind. Sie werden bspw. in der Abhandlung von Kibbe A., Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press 2000, beschrieben. Zusätze umfassen jedwede Verbindung oder Zusammensetzung, die für die erfindungsgemäße Verwendung der Zusammensetzung vorteilhaft sind, worunter Salze, Bindemittel, Lösungsmittel, Dispersionsmittel, und weitere im Zusammenhang mit der Formulierung von Arzneimitteln üblicherweise verwendete Stoffe fallen.
Erfindungsgemäß kann/können Ammoniumsulphat, Ammoniumzitrat, Ammoniumlaktat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid (NH₄Cl), Chloroquin und Acetazolamid als Zusatzstoff(e) in einem Lebensmittelprodukt eingesetzt werden.
Diese Maßnahme macht sich den Vorteil zunutze, dass die Substanzen z.T. bereits in der Lebensmitteltechnologie Einsatz finden und sich durch Verträglichkeit und weitgehende Geschmacklosigkeit auszeichnen. Jedes beliebige Lebensmittelprodukt kommt erfindungsgemäß infrage, insbesondere Getränke aber auch feste Lebensmittel.
Die bevorzugte Konzentration des Wirkstoffes lässt sich mittels dem Fachmann bekannter Verfahren, beispielsweise über Titrationsexperimente, in denen verschiedene Konzentrationen eingesetzt werden, ohne weiteres ermitteln. Die wirksame Menge kann individuell festgelegt werden. Im Falle einer therapeutischen Verwendung richtet sich die Konzentration nach der konkret zu therapierenden Alters-assoziierten Erkrankung, dem Verlauf, dem Schweregrad, dem zu behandelnden Patienten, insbesondere nach dessen immunologischem Zustand, Geschlecht, Alter, Vorerkrankungen, etc. Bei einer Verwendung in Getränken kann die Konzentration bei ca. 25 g Ammoniumsulphat, 25 g Ammoniumzitrat, 35 g Ammoniumlaktat, 25 g Ammoniumnitrat, 20 g Ammoniumchlorid (NH₄Cl), 800 mg Chloroquin oder 800 mg Acetazolamid liegen. Der Fachmann kann jedoch auch hiervon abweichende andere Konzentrationen vorsehen.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass der Wirkstoff bzw. der Zusatzstoff bereits in einer solchen Konzentration bereitgestellt wird, der die gewünschten Wirkungen gewährleistet.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Minderung von Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung sowie zur Verzögerung des Eintretens von altersassoziierten Erkrankungen, das folgende Schritte aufweist:

1. Bereitstellung eines Wirkstoffes, und
2. Formulierung des Wirkstoffes in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger zum Erhalt der pharmazeutischen Zusammensetzung,

₄

Ferner betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Lebensmittelproduktes zur Minderung von Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung sowie zur Verzögerung des Eintretens von altersassoziierten Erkrankungen, das folgende Schritte aufweist:

1. Bereitstellung eines Zusatzstoffes, und
2. Einbringen des Zusatzstoffes in ein Lebensmittel zum Erhalt des Lebensmittelproduktes,

₄

Schließlich betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Minderung von Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung sowie zur Verzögerung des Eintretens von altersassoziierten Erkrankungen, das die Verabreichung einer Substanz an das Lebewesen umfasst, wobei die Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Ammoniumsulphat, Ammoniumzitrat, Ammoniumlaktat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid (NH₄Cl), Chloroquin und Acetazolamid.
Die Eigenschaften, Merkmale und Vorteile der erfindungsgemäßen Verwendung gelten für die erfindungsgemäßen Verfahren entsprechend. So können die Substanzen einzeln als alleinige Wirk- bzw. Zusatzstoffe oder aber in Kombination eingesetzt werden.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Eigenschaften und Vorteile ergeben. Die Ausführungsbeispiele sind rein illustrativ und schränken die Reichweite der Erfindung nicht ein. Dabei wird Bezug genommen auf die beigefügten Abbildungen.
In den beigefügten Figuren ist Folgendes dargestellt:
1 zeigt die Expression von TGFß1 mRNA in humanen glatten Aortenmuskelzellen (HAoSMCs = human aortic smooth muscle cells) bei normaler Phosphatkonzentration (weiße Säule) und nach Steigerung der Phosphatkonzentration durch Zugabe von 2mM β-Glycerophosphat zur Stimulation von osteogener Signaltransduktion in der Abwesenheit (graue Säule) und Anwesenheit (schwarze Säulen) von verschiedenen Ammoniumsalzen (jeweils 0,5 mM). *** (p < 0.001) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu normaler Phosphatkonzentration; # (p < 0.05), ## (p < 0.01) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu gesteigerter Phosphatkonzentration in Abwesenheit von Ammoniumsalzen (Student’s t-test, n = 4).
2 zeigt die Expression von Runx2 mRNA in humanen glatten Aortenmuskelzellen (HAoSMCs = human aortic smooth muscle cells) bei normaler Phosphatkonzentration (weiße Säule) und nach Steigerung der Phosphatkonzentration durch Zugabe von 2mM β-Glycerophosphat zur Stimulation von osteogener Signaltransduktion in der Abwesenheit (graue Säule) und Anwesenheit (schwarze Säulen) von verschiedenen Ammoniumsalzen (jeweils 0,5 mM). ** (p < 0.01) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu normaler Phosphatkonzentration; # (p < 0.05), ## (p < 0.01) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu gesteigerter Phosphatkonzentration in Abwesenheit von Ammoniumsalzen (Student’s t-test, n = 6).
3 zeigt die Expression von alkalischer Phosphatase mRNA in humanen glatten Aortenmuskelzellen (HAoSMCs = human aortic smooth muscle cells) bei normaler Phosphatkonzentration (weiße Säule) und nach Steigerung der Phosphatkonzentration durch Zugabe von 2mM β-Glycerophosphat zur Stimulation von osteogener Signaltransduktion in der Abwesenheit (graue Säule) und Anwesenheit (schwarze Säulen) von verschiedenen Ammoniumsalzen ( ) (jeweils 0,5 mM) sowie nach Zugabe von Chloroquin (100 µM) ( ). * (p < 0,05), ** (p < 0,01), *** (p < 0.001) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu normaler Phosphatkonzentration; # (p < 0.05), ## (p < 0.01), ### (p < 0,001) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu gesteigerter Phosphatkonzentration in Abwesenheit von Ammoniumsalzen bzw. Chloroquin (Student’s t-test, n = 8).
4 zeigt den Phänotyp von klotho^+/+- und klotho^hm-Mäusen, sowie das Kör pergewicht von klotho^+/+-(helle Balken) und klotho^hm-Mäusen (dunkle Balken), jeweils ohne (Kontrolle) und mit NH₄Cl-Behandlung (C), n = 5–7; *** (p < 0,001) indiziert einen signifikanten Unterschied zu klotho^+/+-Mäusen; ### (p < 0,001) zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied zu unbehandelten klotho^hm-Mäusen (ANOVA).
5 zeigt den Phänotyp von klotho^+/+- und klotho^hm-Mäusen, sowie das Kör pergewicht von klotho^+/+-(helle Balken) und klotho^hm-Mäusen (dunkle Balken), jeweils ohne (Kontrolle) und mit Azetazolamid-Behandlung (C), n = 4–6; * (p < 0,05), *** (p < 0,001) indiziert einen signifikanten Unterschied zu klotho^+/+-Mäusen; ### (p < 0,001) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu unbehandelten klotho^hm-Mäusen (ANOVA).
6 zeigt die Ammoniak-(A) (n = 8), Phosphat-(B) (n = 7), Ca^+/+-(C) (n = 7), 1,25(OH)₂D₃ (D) (n = 6), FGF23 (E) (n = 5) und Parathormon (F) (n = 5) Konzentration im Plasma von klotho^+/+-(helle Balken) und klotho^hm-Mäusen (dunkle Balken) ohne (Kontrolle) und mit NH₄Cl. * (p < 0,05), ** (p < 0,01), *** (p < 0,001) indiziert einen signifikanten Unterschied zu klotho^+/+-Mäusen; # (p < 0,05), ## (p < 0,01), ### (p < 0,001) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu unbehandelten klotho^hm-Mäusen; § (p < 0,05), §§ (p < 0,01), §§§ (p < 0,001) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu behandelten klotho^hm-Mäusen (ANOVA).
7 zeigt die Phosphat-(A) (n = 5–6), Ca^+/+-(B) (n = 5–6) und 1,25(OH)₂D₃ (C) (n = 5) Konzentration im Plasma von klotho^+/+-(helle Balken) und klotho^hm-Mäusen (dunkle Balken) ohne (Kontrolle) und mit Azetazolamid. ** (p < 0,01), *** (p < 0,001) zeigt einen signifikanten Unterschied zu klotho^+/+-Mäusen; ## (p < 0,01), ### (p < 0,001) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu unbehandelten klotho^hm-Mäusen; §§§ (p < 0,001) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu behandelten klotho^hm-Mäusen (ANOVA).
8 zeigt die Histologie von Trachea, Lunge, Niere, Magen und Gefäßen aus klotho^hm-Mäusen ohne (Untreated) oder mit (Treated) NH₄Cl-Behandlung.
9 zeigt die Histologie von Trachea, Lunge, Niere, Magen und Gefäßen aus klotho^hm-Mäusen ohne (Untreated) oder mit (Treated) Azetazolamid-Behandlung.
10 zeigt das Überleben von klotho^hm-Mäusen ohne (jeweils schwarze Kreise) oder mit (jeweils weiße Kreise) Behandung mit NH₄Cl (A) (n = 14–16) und Azetazolamid (B) (n = 8–10). (p < 0,001; Wilcoxon, Log-Rang)
Material und Methoden
Folgende experimentelle Arbeiten wurden durchgeführt: Primäre humane glatte Muskelzellen von Aorten (HAoSMCs, Invitrogen) wurden in Waymouth’s MB 752/1 Medium und Ham’s F-12 nutrient mixture (1:1, Gibco, Life Technologies) mit Zugabe von 10% FBS (Gibco, Life Technologies) und 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin (Gibco, Life Technologies) kultiviert. In allen Experimenten wurden konfluente HAoSMCs, Passagen 4 bis 11 verwendet. Die Zellen wurden 24 Stunden mit 2 mM β-Glycerophosphat (Sigma-Aldrich) mit oder ohne gleichzeitige Zugabe von 0,5 mM Ammoniumsalzen oder 100 µM Chloroquindiphosphat behandelt (Sigma-Aldrich). Quantitative RTPCR (real time polymerase chain reaction) wurde, wie früher beschrieben (Voelkl J, Alesutan I, Leibrock CB, Quintanilla-Martinez L, Kuhn V, Feger M, Mia S, Ahmed MS, Rosenblatt KP, Kuro O, Lang F: Spironolactone ameliorates PIT1-dependent vascular osteoinduction in klotho-hypomorphic mice. J Clin Invest 2013; Feb 1; 123(2): 812–22), durchgeführt. Dazu wurden HAoSMCs gewaschen und totale RNA mit Hilfe von Trifast Reagent (Peqlab) nach den Herstellerangaben isoliert. Reverse Transcription von 2 µg RNA wurde mit oligo(dT)_12-18 Primern (Invitrogen) und SuperScriptIII Reverse Transcriptase (Invitrogen) durchgeführt. Quantitative real-time PCR wurde mit einem iCycler iQ^TM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories) und iQ^TM Sybr Green Supermix (Bio-Rad Laboratories) nach Herstellerangaben durchgeführt. Die folgenden Primer wurden verwendet (5’ → 3’ Orientierung):
Die Spezifität der PCR Produkte wurde durch Schmelzkurvenanalyse und Agarose Gel Elektrophorese überprüft. Alle PCRs wurden jeweils zweimal durchgeführt und die Vielfachen der mRNA Menge durch die 2^–ΔΔCt Methode mit GAPDH als interne Referenz errechnet.
Sämtliche Tierexperimente wurden nach den Vorgaben des deutschen Tierschutzgesetzes durchgeführt und waren von den lokalen Behörden genehmigt.
Männliche und weibliche hypomorphe klotho-Mäuse (klotho^hm) wurden mit männlichen und weiblichen Wildtypmäusen (klotho^+/+) verglichen. Der Ursprung der Mäuse, die Züchtung und die Genotypisierung sind im Stand der Technik beschrieben; vgl. Kuro-o et al. (1997), Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing, Nature 390: 45–51. Durch wiederholte Rückkreuzungen (> 9 Generationen) mit Tieren des 129/Sv-Inzuchtstammes wurden kongene Stämme der klotho^hm-Mäuse hergestellt und in dieser Studie verwendet. Die Mäuse hatten beliebigen Zugang zu Wasser, einer wässrigen NH₄Cl-Lösung (0,28M) oder einer wässrigen Acetazolamid-Lösung (800mg/l) und wurden mit Kontrollfutter (Sniff, Soest, Deutschland) gefüttert. Die Behandlungen mit NH₄Cl (0,28M) oder Acetazolamid (800mg/l) begannen mit der Paarung der parentalen Generation und wurden über die Schwangerschaft bis zur Tötung der Nachkommen fortgeführt.
1.2 Blutchemie
Zur Blutentnahme wurden die Mäuse mit Diethylether (Roth, Karlsruhe, Deutschland) anästhesiert und durch Punktieren des retro-orbitalen Plexus wurden Blutproben von 50 bis 200 µl in Kapillaren, die Heparin enthielten, entnommen. Die Phosphat- und Calciumkonzentrationen im Plasma wurden unter Verwendung einer photometrischen Methode (FUJI FDC 3500i, Sysmex, Nordstedt, Deutschland) bestimmt. Die FGF23- und PTH-Konzentrationen im Plasma wurden unter Verwendung kommerzieller ELISA-Kits (FGF23: ImmunDiagnostics, Boston, USA; PTH: Immunotopics, San Clemente, USA) bestimmt. Die Messung der Konzentration von Calcitriol [1,25(OH)-Vitamin D₃] im Plasma erfolgte ebenfalls unter Verwendung eines kommerziellen ELISA-Kits (IDS, Boldon, Vereinigtes Königreich). Die Ammoniakkonzentration wurde enzymatisch mit Hilfe von Glutamatdehydrogenase mit NADPH als Kofaktor gemessen. Die Auswertung erfolgte ebenfalls mit einer photometrischen Methode (ADVIA 1650 analyser, Siemens, Fernwald, Germany).
1.3 Histologie
Zur Untersuchung der Trachea, Lunge, Niere, des Magens und der Gefäße wurden entsprechende Gewebe aus männlichen klotho^+/+-Mäusen (Alter: 8 Wochen) und männlichen klotho^hm-Mäusen (Alter: 8 Wochen) ohne und mit NH₄Cl-(15 g/l Trinkwasser), oder in weiblichen Tieren ohne und mit Acetazolamid-Behandlung (800 mg/l in Trinkwasser) in Paraffin eingebettet, in Scheiben von 2 bis 3 µm geschnitten und mit H & E und von Kossa gefärbt; vgl. Mossbrugger et al. (2007), Standardized morphological phenotyping of mouse models of human diseases within the German Mouse Clinic, Verh. Dtsch. Ges. Pathol. 91:98–103.
1.4 Statistik
Die Daten werden als Mittelwerte ± SEM angegeben, wobei n die Anzahl von unabhängigen Experimenten darstellt. Sämtliche Daten wurden auf Signifikanz unter Verwendung von ANOVA oder des gepaarten oder ungepaarten Student t-Tests untersucht. Für die Experimente zur Lebensdauer wurde SAS Jmp Version 8.0.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, Vereinigte Staaten von Amerika) verwendet. Ausschließlich Ergebnisse mit p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.
a. Ergebnisse
klotho ist ein Transmembranprotein, das verwandt ist mit der β-Glucuronidase. Eine verminderte Produktion dieses Proteins wurde in Patienten mit chronischem Nierenversagen beobachtet, was häufig mit degenerativen Prozessen wie der Arteriosklerose, Osteoporose und Hautatrophie einhergeht. Mutationen in diesem Protein konnten mit Altersprozessen in Zusammenhang gebracht werden.
Im untersuchten Mausmodell ist die klotho-Expression durch einen Defekt im klotho-Gen massiv herabgesetzt. Betroffene Mäuse werden als hypomorphe Mäuse bezeichnet. Der Mangel an klotho führt zu einem Syndrom, das dem menschlichen Altern ähnelt. Im Einzelnen wird bei diesen Tieren (beschleunigtes) Auftreten von Gewebe- und/oder Gefäßkalzifizierung, Arteriosklerose, Lungenemphysem, Hautatrophie, Muskelschwäche, Immunabwehrschwäche, Infertilität, Kyphose, gestörter CaPO₄-Metabolismus, Osteoporose, Immunschwäche (Thymus-Rückbildung), Hörverlust und Neurodegeneration beobachtet. Die betroffenen Tiere haben ferner eine deutlich verminderte Lebenserwartung und sind unfruchtbar.
In der 1 ist die Expression von TGFß1 mRNA in humanen glatten Aortenmuskelzellen (HAoSMCs = human aortic smooth muscle cells) dargestellt. Die Zellen wurden mit 2mM β-Glycerophosphat behandelt, um die osteogene Signaltransduktion zu stimulieren. Die erhöhte Phosphatkonzentration führte zu einem signifikanten Anstieg der TGFß1 mRNA Expression. Dieser Anstieg konnte durch den Zusatz verschiedener Ammoniumsalze (0,5 mM) abgeschwächt (Ammoniumlaktat, Ammoniumzitrat, Ammoniumsulfat) oder sogar verhindert werden (Ammniumchlorid, Ammoniumnitrat).
In der 2 ist die Expression von Runx2 mRNA in humanen glatten Aortenmuskelzellen (HAoSMCs = human aortic smooth muscle cells) gezeigt. Auch hier führte eine Steigerung der Phosphatkonzentration durch Zugabe von 2mM β-Glycerophosphat zu einer erhöhten Expression des Transkriptionsfaktors, die wiederum durch Zugabe von Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat sowie Ammoniumsulfat unterdrückt werden konnte,
Des weiteren wurde die Expression der alkalischen Phosphatase (ALP) in humanen glatten Aortenmuskelzellen (HAoSMCs = human aortic smooth muscle cells) untersucht (3). Die Zugabe von 2mM β-Glycerophosphat führte wiederum zu erhöhter ALP mRNA Expression. 3A zeigt die Unterdrückung des Expressionsanstiegs durch Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat und Ammoniumsulfat. 3B zeigt die Unterdrückung des ALP mRNA Expressionsanstiegs durch Chloroquin (100µM).
In der 4 sind die deutlichen Wachstumsdefizite unbehandelter hypomorpher klotho-Mäuse (klotho^hm) im Vergleich zu ihren Wildtypwurfgeschwistern (klotho^+/+) dargestellt. Das Wachstumsdefizit der klotho^hm-Mäuse konnte durch eine Behandlung mit NH₄Cl nahezu vollständig aufgehoben werden (klotho^hm NH₄Cl). Wildtypmäuse zeigten auf ein Behandlung mit NH₄Cl keine Wachstumsstimulation (klotho^+/+ NH₄Cl). Wie aus 4 ersichtlich, ist das Körpergewicht von unbehandelten klotho^hm-Mäusen (Kontrolle) signifikant niedriger als das von unbehandelten klotho^+/+-Mäusen. In mit NH₄Cl behandelten klotho^hm-Mäusen konnte die Gewichtsdefizienz nahezu vollständig aufgehoben werden (B).
Wie in der nachfolgenden Tabelle dargestellt, war der pH-Wert des Blutes von unbehandelten klotho^hm-Mäusen signifkant niedriger als von unbehandelten klotho^+/+-Mäusen. In klotho^+/+-Mäusen führte die Verabreichung von NH₄Cl tendenziell zu einer Abnahme des pH-Wertes im Blut, die jedoch keine statistische Signifikanz erreichte. Dementsprechend führte auch eine Behandlung von klotho^hm-Mäusen mit NH₄Cl zu keiner signifikanten Verstärkung der Azidose (Tab. 1).

Mäuse Trinkflüssigkeit pH-Wert

klotho^+/+ Wasser 7,42 ± 0,03

klotho^+/+ NH₄Cl 7,39 ± 0,04

klotho^hm Wasser 7,33 ± 0,02*

klotho^hm NH₄Cl 7,32 ± 0,3*

Tabelle 1: pH-Wert im Blut von Wildtypmäusen (klotho^+/+) und hypomorphen klotho-Mäusen (klotho^hm), denen entweder Wasser oder wässrige NH₄Cl-Lösung (15 g/l) verabreicht wurde (arithmetische Mittel ± SEM, n = 4, * p < 0,05 indiziert statistisch signifikante Unterschiede zu wassertrinkenden klotho^+/+-Tieren).
Die Behandlung von klotho^hm-Mäusen mit Azetazolamid führte ebenfalls zu einer Zunahme von Gewicht und Größe der Tiere. Wie aus 5A ersichtlich ist, konnte das Wachstumsdefizit durch die Behandlung nicht vollständig ausgeglichen werden. Das Körpergewicht, dargestellt in 5B konnte zwar ebenfalls durch Azetazolamid gesteigert werden, jedoch waren die Tiere nach wie vor signifikant kleiner als klotho^+/+-Mäuse.
Wie in 5A dargestellt, führte die Behandlung der Mäuse mit Ammo niumchlorid sowohl bei klotho^hm-Mäusen als auch bei klotho^+/+-Mäusen zu einer signifikanten Erhöhung der Plasmakonzentrationen von Ammoniak. 5B zeigt die Plasmaphos phatspiegel der Tiere, die bei klotho^hm-Mäusen signifikant höher als bei klotho^+/+-Mäusen waren. Eine Behandlung mit NH₄Cl veränderte weder die Plasmaphosphatspiegel von klotho^+/+- noch die von klotho^hm-Mäusen. Wie in 5C gezeigt, waren die Plasmakon zentrationen von Ca⁺⁺ in unbehandelten klotho^hm-Mäusen signifikant höher als in klotho^+/+-Mäusen. Die NH₄Cl-Behandlung führte tendenziell zu einer Abnahme der Ca⁺⁺-Konzentrationen im Plasma von klotho^hm-Mäusen, die jedoch keine statistische Signifikanz erreichte. Ebenfalls in 5 sind die Plasmakonzentrationen von 1,25 (OH)₂D₃ (Calcitriol), FGF23 und Parathormon dargestellt. Die Konzentrationen von 1,25 (OH)₂D₃ und FGF23 waren signifikant höher, die von Parathormon signifikant niedriger in klotho^hm- Mäusen als in klotho^+/+-Mäusen. Die Behandlung von klotho^hm-Mäusen mit NH₄Cl führte zu keiner signifikanten Änderung der Hormonkonzentrationen (5D–F). Dementsprechend verblieben die Plasmakonzentrationen von Calcitriol bzw. 1,25 (OH)₂D₃ und von FGF23 auch nach NH₄Cl-Behandlung signifikant höher in klotho^hm-Mäusen als in klotho+/+-Mäusen.
In 7 sind die Plasmakonzentrationen von Ca⁺⁺, Phosphat und 1,25 (OH)₂D₃ von klotho^+/+-Mäusen und klotho^hm-Mäusen jeweils mit und ohne Behandlung mit Azetazolamid dargestellt. Dabei wurde weder die Konzentration von 1,25 (OH)₂D₃ noch die von Phosphat durch die Behandlung beeinflusst. Auch der Calciumspiegel der behandelten klotho^hm-Mäuse war nach wie vor leicht erhöht, zeigte jedoch weder zu den unbe handelten klotho^hm-Mäusen noch zu den klotho^+/+-Mäusen einen signifikanten Unterschied.
Wie in 8 gezeigt, werden in klotho^hm-Mäusen mit einem Alter von 8 Wochen starke Kalzifizierungen in sämtlichen analysierten Geweben beobachtet, wie bspw. in der Trachea, Lunge, Niere, dem Magen und den Gefäßgeweben. Die Kalzifizierung in klotho^hm-Mäusen konnte durch eine Behandlung mit NH₄Cl stark reduziert werden.
Die 9 zeigt ebenfalls histologische Schnitte ausgewählter Organe von klotho^hm-Mäusen. Die Behandlung der Tiere mit Acetazolamid führte ebenfalls zu einer deutlichen Reduktion der Kalzifizierungen in den analysierten Geweben,
Wie in der 10 dargestellt, führt die Behandlung von klotho^hm-Mäusen mit NH₄Cl oder Azetazolamid zu einer drastischen Verlängerung der Lebensspanne. Während im ersten Ansatz sämtliche unbehandelten klotho^hm-Mäuse (n = 16) nach 110 Tagen starben, überlebten bis zu diesem Zeitpunkt sämtliche der mit NH₄Cl behandelten Mäuse (n = 14) (10A). Unbehandelte klotho^hm-Mäuse (n = 10) hatten hingegen eine durchschnittliche Lebensdauer von 78 Tagen. Auch Azetazolamid zeigte einen starken Einfluss auf die Lebensdauer der Tiere (10B), wenngleich auch nicht so ausgeprägt wie die Behandlung mit NH₄Cl. Die durchschnittliche Lebenserwartung der mit Azetazolamid behandelten Tiere lag bei 220 Tagen. Die Tiere der Kontrollgruppe (n = 10) waren hier nach 90 Tagen verstorben. Zu diesem Zeitpunkt waren noch alle mit Azetazolamid behandelten Tiere am Leben.
3. Fazit
Die Erfinder stellen mit Ammoniumsulphat, Ammoniumnitrat, Ammoniumzitrat, Ammoniumlaktat, Ammoniumchlorid (NH₄Cl), Chloroquin und Acetazolamid Substanzen bereit, die geeignet sind, um Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung zu verhindern und das Eintreten von altersassoziierten Erkrankungen zu verzögern und damit die Lebensdauer eines Lebewesens zu verlängern. Dies wird zum einen durch den Einfluss auf die Expression von Kalzifizierungs- und Fibrosierungsmarkern in der Zellkultur, zum anderen durch die beeindruckenden Effekte von Ammoniumchlorid und Acetazolamid auf ein etabliertes Tiermodell demonstriert. Die entsprechend behandelten Tiere zeigen deutlich verminderte Alterssyndrome, eindrucksvoll veranschaulicht an der Gewebe- und Gefäßkalzifizierung, und leben deutlich länger als unbehandelte Tiere.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Voelkl J, Alesutan I, Leibrock CB, Quintanilla-Martinez L, Kuhn V, Feger M, Mia S, Ahmed MS, Rosenblatt KP, Kuro O, Lang F: Spironolactone ameliorates PIT1-dependent vascular osteoinduction in klotho-hypomorphic mice. J Clin Invest 2013; Feb 1; 123(2): 812–22 [0050]
Kuro-o et al. (1997), Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing, Nature 390: 45–51 [0052]
H & E und von Kossa gefärbt; vgl. Mossbrugger et al. (2007), Standardized morphological phenotyping of mouse models of human diseases within the German Mouse Clinic, Verh. Dtsch. Ges. Pathol. 91:98–103 [0054]

Claims

Verwendung einer Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Ammoniumsulphat, Ammoniumzitrat, Ammoniumlaktat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid, Chloroquin und Acetazolamid, zur Minderung von Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung sowie zur Verzögerung des Eintretens altersassoziierter Erkrankungen bei einem Lebewesen.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die altersassoziierte Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Arteriosklerose, Lungenemphysem, Hautatrophie, Muskelschwäche, Immunabwehrschwäche, Infertilität, Kyphose, gestörter CaPO₄-Metabolismus, Osteoporose, Immunschwäche (Thymusrückbildung), Neurodegeneration.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebsfibrosierung auf einer Erkrankung basiert, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Niereninsuffizienz, Leberzirrhose, Morbus Crohn, fibrosierende Pankreatitis, Lungenfibrose, Herzinsuffizienz, Narbenbildung, Fibrosierung bei Peritonealdialyse, Alzheimer´sche Erkrankung.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz als Wirkstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung eingesetzt wird.
Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung für eine Applikation ausgebildet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: oral, rektal, parenteral, intraperitoneal, lokal, transdermal.
Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung in einer Form ausgebildet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Pulver, Tablette, Saft, Tropfen, Dialyseflüssigkeit, Kapsel, Zäpfchen, Lösung, Injektionslösung, Aerosol, Salbe, Spülung, Pflaster, Pellet, Dragee, modifiziert freisetzende Darreichungsform.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz als Zusatzstoff in einem Lebensmittelprodukt eingesetzt wird/werden.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Minderung von Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung, zur Verzögerung des Eintretens altersassoziierter Erkrankungen eines Lebewesens, das folgende Schritte aufweist: 1. Bereitstellung eines Wirkstoffes, und 2. Formulierung des Wirkstoffes in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger zum Erhalt der pharmazeutischen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Ammoniumsulphat, Ammoniumnitrat, Ammoniumzitrat, Ammoniumlaktat, Ammoniumchlorid, Chloroquin oder Acetazolamid.
Verfahren zur Herstellung eines Lebensmittelproduktes zur Minderung von Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung, zur Verzögerung des Eintretens altersassoziierter Erkrankungen eines Lebewesens, das folgende Schritte aufweist: 1. Bereitstellung eines Zusatzstoffes, und 2. Einbringen des Zusatzstoffes in ein Lebensmittel zum Erhalt des Lebensmittelproduktes, dadurch gekennzeichnet, dass der Zusatzstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Ammoniumsulphat, Ammoniumnitrat, Ammoniumzitrat, Ammoniumlaktat, Ammoniumchlorid, Chloroquin oder Acetazolamid.
Verfahren zur Minderung von Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung, zur Verzögerung des Eintretens mehrerer altersassoziierter Erkrankungen eines Lebewesens, das die Verabreichung einer Substanz an das Lebewesen umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Ammoniumsulphat, Ammoniumnitrat, Ammoniumzitrat, Ammoniumlaktat, Ammoniumchlorid, Chloroquin oder Acetazolamid.