DE102012103096A1

DE102012103096A1 - Prophylaxe und Behandlung einer Gefäßkalzifizierung

Info

Publication number: DE102012103096A1
Application number: DE201210103096
Authority: DE
Inventors: Prof. Dr. Lang Florian
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Priority date: 2012-04-11
Filing date: 2012-04-11
Publication date: 2013-10-17

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Substanz zur Prophylaxe und Behandlung einer Gefäßkalzifizierung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Substanz zur Prophylaxe und Behandlung einer Gefäßkalzifizierung.
Unter einer Gefäßkalzifizierung wird der Vorgang verstanden, bei dem sich Kalziumsalze in erhöhtem Maße in den Arterien und Venen ablagern. Dies führt zu einer Verhärtung und Reduzierung des Lumens der betroffenen Gefäße. Dies kann zu Durchblutungsstörungen führen, die schwere Erkrankungen nach sich ziehen. Eine Gefäßkalzifizierung ist hochgradig mit der Mortalität aufgrund von kardiovaskulären Erkrankungen korreliert, insbesondere in Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz oder Diabetes. Die Gefäßkalzifizierung ist ferner assoziiert mit dem kongestiven Herzversagen, Hypertension, myokardialer Ischämie und Koronarinsuffizienz. Ferner erhöht sich das Risiko einer koronaren Herzerkrankung sowohl bei Männern als auch Frauen mit zunehmender Kalzifizierung des Aortenbogens, so dass es darüber hinaus zu einer Erhöhung des Risikos eines Schlaganfalls kommt, insbesondere bei post-menopausalen Frauen.
Die genauen Ursachen für eine Gefäßkalzifizierung sind derzeit Gegenstand intensiver Forschung. Danach scheinen sowohl genetisch bedingte als auch ernährungsphysiologische Faktoren eine Rolle zu spielen.
Die Behandlung der Gefäßkalzifizierung ist bislang nicht zufriedenstellend gelöst.
Vor diesem Hintergrund liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Substanz bereitzustellen, mit der wirksam einer Gefäßkalzifizierung vorgebeugt bzw. diese behandelt werden kann.
Diese Aufgabe wir durch die Bereitstellung von Lithium zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer Gefäßkalzifizierung gelöst.
Die Erfinder konnten in einem Tiermodell nachweisen, dass die Verabreichung von Lithium einer Gefäßkalzifizierung entgegenwirkt.
Diese Erkenntnis der Erfinder war überraschend und so nicht zu erwarten.
Lithium (Li; CAS-Nr.: 7439-93-2) ist ein chemisches Element.
Lithium wird seit vielen Jahren als Psychopharmakon zur Behandlung von Depressionen eingesetzt.
Vor Kurzem wurde ferner ein Zusammenhang zwischen der Lithiumaufnahme und einer erhöhten Lebenserwartung festgestellt; vgl. Zarse et al. (2011), Low-dose lithium uptake promotes long gravity in humans and metazoans, Eur. J. Nutr. 50, Seiten 387 bis 389.
Ein positiver Einfluss von Lithium auf die Gefäßkalzifizierung ist bislang im Stand der Technik nicht beschrieben.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.
Niedrige Konzentrationen des Fibroblastenwachstumsfaktors 23 (FGF23) im Blutserum und eine niedrige renale Expression des Klothoproteins können mit einer Gefäßkalzifizierung einhergehen; vgl. Memon et al. (2008), Does Fgf23-klotho activity influence vascular and soft tissue calcification through regulating mineral ion metabolism?, Kidney Int. 74, Seiten 566 bis 570. Die Erfinder konnten überraschenderweise feststellen, dass eine Lithiumbehandlung bei einem Lebewesen zu einer signifikanten Erhöhung des FGF23 im Blutserum und zu einer Erhöhung der renalen Expression des Klothoproteins führt.
Ferner können erhöhte Konzentrationen von 1,25(OH)₂D₃, Kalzium und Phosphat im Blutserum die Entstehung von Gefäßkalzifizierung begünstigen; vgl. Memon et al. (2008; a.a.O.). Die Erfinder konnten überraschenderweise feststellen, dass die Verabreichung von Lithium in ein Lebewesen auch zu einer signifikanten Erniedrigung der Konzentrationen dieser Substanzen führt.
Die Erfinder konnten demnach schlussfolgern, dass Lithium einer Gefäßkalzifizierung entgegenwirkt.
Erfindungsgemäß wird und ”Verwendung” verstanden, dass Lithium die beanspruchte Wirkung induziert. Dabei kann die Verwendung von Lithium im Rahmen einer Monotherapie erfolgen, bei der Lithium als alleiniger Wirkstoff eingesetzt wird.
Nach einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung wird das Lithium in Form von Lithiumchlorid bereitgestellt.
Lithiumchlorid (LiCl; CAS-Nr.: 7447-41-8) ist eine bewährte Verbindung zur Bereitstellung von Lithium. Es lässt sich sehr gut in Arzneimittelzusammensetzungen formulieren. Aufgrund seiner guten Wasserlöslichkeit eignet es sich auch als Zusatz in einem Lebensmittelprodukt.
Erfindungsgemäß kann es sich bei dem Lithium bevorzugt um einen Wirkstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung handeln, die weiter bevorzugt für eine orale, rektale, parenterale, lokale oder transdermale Applikation ausgebildet ist. Ferner kann die pharmazeutische Zusammensetzung weiter bevorzugt als Pulver, Tablette, Saft, Tropfen, Kapsel, Zäpfchen, Lösung, Injektionslösung, Aerosol, Salbe, Spülung, Pflaster, Pellet, Dragee oder modifiziert freisetzende Darreichungsform ausgebildet sein.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ggf. weitere Zusätze enthalten, die im Stand der Technik allgemein bekannt sind. Sie werden beispielsweise in der Abhandlung von Kibbe A. Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Auflage, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press 2000, beschrieben. Zusätze umfassen jedwede Verbindung oder Zusammensetzung, die für die erfindungsgemäße Verwendung der Zusammensetzung vorteilhaft sind, worunter Salze, Bindemittel, Lösungsmittel, Dispersionsmittel und weitere im Zusammenhang mit der Formulierung von Arzneimitteln üblicher Weise verwendete Stoffe fallen.
Erfindungsgemäß kann das Lithium als Zusatzstoff in einem Lebensmittelprodukt eingesetzt werden.
Diese Maßnahme macht sich den Vorteil zunutze, dass Lithium zum Teil bereits in der Lebensmitteltechnologie Einsatz findet und sich in niedrigen Konzentrationen durch Verträglichkeit und weitgehende Geschmackslosigkeit auszeichnet. Jedes beliebige Lebensmittelprodukt kommt erfindungsgemäß in Frage, insbesondere Getränke, aber auch feste Lebensmittel.
Die bevorzugte Konzentration des Lithiums lässt sich mittels dem Fachmann bekannter Verfahren, beispielsweise über Titrationsexperimente, in denen verschiedene Konzentrationen eingesetzt werden, ohne weiteres ermitteln. Die wirksame Menge kann individuell festgelegt werden. Im Falle einer therapeutischen Verwendung richtet sich die Konzentration nach dem Verlauf und dem Schweregrad der Gefäßkalzifizierung, dem zu behandelnden Patienten, insbesondere dessen immunologischem Zustand, Geschlecht, Alter, Vorerkrankungen, etc. Im Hinblick auf die Erkenntnisse von Zarse et al. (a.a.O.) liegen besonders bevorzugte Konzentrationen bei ca. 0,1 μmol bis ca. 100 μmol, vorzugsweise bei ca. 1 μmol bis ca. 100 μmol, weiter bevorzugt bei ca. 10 μmol.
Der Fachmann kann jedoch auch hiervon abweichende andere Konzentrationen vorsehen.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass der Wirkstoff bzw. Zusatzstoff bereits in einer solchen Konzentration bereitgestellt wird, der die gewünschte Wirkung gewährleistet.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Gefäßkalzifizierung, das folgende Schritte aufweist: 1. Bereitstellung von Lithium, und 2. Formulierung des Lithiums in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger zum Erhalt einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
Ferner betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Lebensmittelproduktes zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Gefäßkalzifizierung, das folgende Schritte aufweist: 1. Bereitstellung von Lithium, und 2. Einbringen des Lithiums in ein Lebensmittel zum Erhalt des Lebensmittelproduktes.
Schließlich betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Gefäßkalzifizierung bei einem Lebewesen, das die Verabreichung von Lithium an das Lebewesen umfasst.
Die Eigenschaften, Merkmale, Weiterbildungen und Vorteile der erfindungsgemäßen Verwendung gelten für die erfindungsgemäßen Verfahren entsprechend.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Eigenschaften und Vorteile ergeben. Die Ausführungsbeispiele sind rein illustrativ und schränken die Reichweite der Erfindung nicht ein. Dabei wird Bezug genommen auf die beigefügten Figuren.
In den beigefügten Figuren ist Folgendes dargestellt:
1 zeigt die Serumspiegel von FGF23 in unbehandelten und mit Lithium behandelten Mäusen; arithmetische Mittel ± SEM (n = 4-5/Gruppe) der Serumspiegel von FGF23 in unbehandelten (weißer Balken) und mit Lithium behandelten (schwarzer Balken) Wildtyp-Mäusen; *p < 0,05 zeigt einen signifikanten Unterschied gegenüber unbehandelten Mäusen an;
2 zeigt die renale Expression von Klotho in unbehandelten und mit Lithium behandelten Mäusen; arithmetische Mittel ± SEM (n = 4/Gruppe) des Verhältnisses der Mengen des Klotho- gegenüber dem GAPDH-Protein in Nierengewebe aus unbehandelten (weißer Balken) und mit Lithium behandelten (schwarzer Balken) Wildtyp-Mäusen. *p = 0,05 zeigt einen signifikanten Unterschied gegenüber unbehandelten Mäusen an;
3 zeigt die Serumspiegel von 1,25(OH)₂D₃ in unbehandelten und mit Lithium behandelten Mäusen; arithmetische Mittel ± SEM (n = 4-5/Gruppe) der Serumkonzentrationen von 1,25(OH)₂D₃ in unbehandelten (weißer Balken) und mit Lithium behandelten (schwarzer Balken) Wildtyp-Mäusen; *p < 0,05 zeigt einen signifikanten Unterschied gegenüber unbehandelten Mäusen an;
4 zeigt die Serumkonzentrationen von Ca⁺⁺ in unbehandelten und mit Lithium behandelten Mäusen; arithmetische Mittel ± SEM (n = 4-4/Gruppe) der Serumkonzentration von Ca⁺⁺ in unbehandelten (weißer Balken) und mit Lithium behandelten (schwarzer Balken) Wildtyp-Mäusen; *p < 0,05 zeigt einen signifikanten Unterschied gegenüber unbehandelten Mäusen an;
5 stellt die Serumkonzentrationen von Phosphat in unbehandelten und lithiumbehandelten Mäuse dar; arithmetische Mittel ± SEM (n = 4/5/Gruppe) der Serumkonzentration von Phosphat in unbehandelten (weißer Balken) und mit Lithium behandelten (schwarzer Balken) Wildtyp-Mäusen; *p < 0,05 zeigt einen signifikanten Unterschied gegenüber unbehandelten Mäusen an.
Ausführungsbeispiele
1. Material und Methoden
1.1 Mäuse
Sämtliche Tierexperimente wurden nach den Vorgaben des deutschen Tierschutzgesetzes durchgeführt und waren von den lokalen Behörden genehmigt.
Die Experimente wurden mit weiblichen Mäusen (n = 4-5/Gruppe) im Alter von 10 Wochen durchgeführt. Die Mäuse hatten freien Zugang zu Wasser und Kontrollfutter (Altromin 1310). In den behandelten Gruppen wurde LiCl in isotonischer Kochsalzlösung gelöst und subkutan bei einer Dosis von 200 mg/kg/Tag für 14 Tage verabreicht.
1.2 Bestimmung der Serumkonzentrationen
Zur Blutentnahme wurden die Mäuse mit Diethylether (Roth, Karlsruhe, Deutschland) leicht anästhesiert und durch Punktieren des retro-orbitalen Plexus wurden Blutproben von 50 bis 200 μl in Kapilaren, die Heparin enthielten, entnommen. Die Konzentration von FGF23 im Blutserum wurde mittels ELISA gemessen (Immutopics International, Kalifornien, Vereinigte Staaten von America). Die Serumkonzentrationen von Phosphat und Ca⁺⁺ wurden mittels einer photometrischen Methode bestimmt (FUJI FDC 3500i, Sysmex, Norsted, Deutschland). Die Bestimmung der Serumkonzentrationen von 1,25(OH)-Vitamin D3 erfolgte mittels eines ELISA-Kits (IDS Boldon, Vereinigtes Königreich).
1.3 Western Blotting
Zur Bestimmung der Mengen von Klothoprotein wurden die Nieren entfernt und unmittelbar in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Nierengewebe wurden in RITA-Lysepuffer (Cell Signalling Technology, Danvers, Vereinigte Staaten von Amerika) homogenisiert, der 20 mM Tris-HCL, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM Na₂EDTA, 1 mM Natriumorthovanadat, 1 mM EGTA, 2,5 mM Natriumpyrophosphate, 1 mM Beta-Glycerophosphate, 1% Natriumdeoxycholat, 1% NP-40, 1 μg/ml Leupeptin, 1 mM PMSF (frisch hinzugegeben) und eine Proteininhibitorcocktailtablette (Complete mini, Roche, Mannheim, Deutschland) für jede 10 ml Lysepuffer (frisch hinzugegeben) enthielt. Die Homogenate wurden für 20 min. auf Eis inkubiert und anschließend bei 11.000 g, 4°C für 20 min. zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und für das Western Blotting verwendet. Das Proteinlysat aus den HEK293-Zellen wurde unter Verwendung von RIPA-Lysepuffer und einer anschließenden Zentrifugation erhalten. Das Gesamtprotein (90 μg wurde durch SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend auf Nitrozellulosemembranen (Whatman) transferiert, in 5%iger fettfreier Milch/Tris-gepufferter Kochsalzlösung Tween-20 (TEST) bei Raumtemperatur für eine Stunde blockiert. Die Membranen wurden über Nacht bei 4°C mit polyklonalen Antikörpern gegen Klotho inkubiert (1000-fach verdünnt; Akiko Saito von Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd., Japan) oder gegen GAPDH inkubiert (1000-fach verdünnt, Cell Signalling, Danvers, MA, Vereinigte Staaten von Amerika), gefolgt von einer Inkubation mit einem Sekundärantikörper, der mit einer Meerrettichperoxidase gekoppelt war (1:5000, Cell Signalling), oder sekundären Anti-Ratten-Antikörpern (1:2000, Cell Signalling), und zwar für eine Stunde bei Raumtemperatur. Die Banden wurden über verstärkte Chemilumineszenz (Amersham, Piscataway, Vereinigte Staaten von America) gemäß den Angaben des Herstellers visualisiert. Die densitometrische Analyse von Klotho und GHAPDH erfolgte unter Verwendung der Quantity One Software (Bio-Rad).
1.4 Statistik
Die Daten werden als Mittelwerte ± SEM angegeben, wobei n die Anzahl von unabhängigen Experimenten darstellt. Sämtliche Daten wurden unter Verwendung des ungepaarten Student-t-Tests auf Signifikanz untersucht. Nur Ergebnisse mit p < 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet.
2. Ergebnisse
10 Wochen alte weibliche Mäuse wurden mit in Kochsalzlösung gelöstem Lithiumchlorid behandelt (subkutan 200 mg/kg/Tag für 14 Tage). Anschließend wurde mittels ELISA die Serumkonzentration von FGF23 bestimmt. Dabei zeigte sich, dass die Lithiumbehandlung zu einer starken, statistisch signifikanten Erhöhung der Serumkonzentration von FGF23 führt; vgl. 1.
Da die Aktivität von FGF23 von Klotho abhängt, wurde anschließend ein Western Blot durchgeführt, um festzustellen, ob die Lithiumbehandlung die renale Klotho-Expression modifiziert. Wie in 2 dargestellt, führte die Lithiumbehandlung auch zu einer geringen, jedoch statistisch signifikanten Erhöhung des Verhältnisses des Klotho- gegenüber GAPDH-Proteins.
Da FGF23 und Klotho gemeinsam die Aktivität der 1α-Hydroxylase (Cyp27b1) herunterregulieren, dem Schlüsselenenzym in der Produktion von 1,25(OH)₂D₃, wurde ein ELISA durchgeführt, um die Auswirkung der Lithiumbehandlung auf die 1,25(OH)₂D₃-Serumkonzentrationen zu ermitteln. Wie in 3 dargestellt, führt die Lithiumbehandlung in der Tat zu einer Abnahme der Serumkonzentration von 1,25(OH)₂D₃.
Die Auswirkungen von 1,25(OH)₂D₃ umfassen die Stimulation des intestinalen und renalen Kalzium- und Phosphattransports, was zu einer Erhöhung der Serumkonzentrationen von sowohl Kalzium als auch Phosphat führt. Dementsprechend wurden die Konzentrationen von Kalzium und Phosphat in unbehandelten und mit Lithium behandelten Tieren unter Verwendung photometrischer Methoden bestimmt. Wie in den 4 und 5 illustriert, führt die Lithiumbehandlung in der Tat zu einer signifikanten Abnahme sowohl des Kalziums (4) als auch des Phosphates (5) im Blutserum.
Die an Mäusen gewonnenen Erkenntnisse konnten von den Erfindern auch in einer Humanstudie verifiziert werden (Daten nicht gezeigt).
3. Fazit
Die Erfinder konnten auf beeindruckende Art und Weise demonstrieren, dass die Verabreichung von Lithium zu einer signifikanten Zunahme der FGF23 und Klothokonzentration im Serum führt. Gleichzeitig sinken die Konzentrationen von 1,25(OH)₂D₃, Ca⁺⁺ und von Phosphat. Da niedrigen Serumkonzentrationen von FGF23 und Klotho und hohen Serumkonzentrationen von 1,25(OH)₂D₃, Ca⁺⁺ und Phosphat mit einer Gefäßkalzifizierung korrelieren, konnten die Erfinder schlussfolgern, dass die Verabreichung von Lithium ein wirksames Instrument zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer Gefäßkalzifizierung darstellt.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Zarse et al. (2011), Low-dose lithium uptake promotes long gravity in humans and metazoans, Eur. J. Nutr. 50, Seiten 387 bis 389 [0011]
Memon et al. (2008), Does Fgf23-klotho activity influence vascular and soft tissue calcification through regulating mineral ion metabolism?, Kidney Int. 74, Seiten 566 bis 570 [0014]
Memon et al. (2008; a.a.O.) [0015]
Kibbe A. Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Auflage, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press 2000 [0021]
Zarse et al. (a.a.O.) [0024]

Claims

Verwendung von Lithium zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Gefäßkalzifizierung.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Lithium in Form von Lithiumchlorid bereitgestellt wird.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Lithium als Wirkstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereitgestellt wird.
Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung für eine Applikation ausgebildet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: oral, rektal, parenteral, lokal, transdermal.
Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung in einer Form ausgebildet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Pulver, Tablette, Saft, Tropfen, Kapsel, Zäpfchen, Lösung, Injektionslösung, Aerosol, Salbe, Spülung, Pflaster, Pellet, Dragee, modifiziert freisetzende Darreichungsform.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Lithium als Zusatzstoff in einem Lebensmittelprodukt bereitgestellt wird.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lithium in einer Konzentration bereit gestellt wird, die bei ca. 0,1 μM bis ca. 1000 μM, vorzugsweise bei ca. 1 μM bis ca. 100 μM, weiter bevorzugt bei ca. 10 μM liegt.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Gefäßkalzifizierung, das folgende Schritte aufweist: 1. Bereitstellung von Lithium, und 2. Formulierung des Lithiums in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger zum Erhalt der pharmazeutischen Zusammensetzung.
Verfahren zur Herstellung eines Lebensmittelproduktes zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Gefäßkalzifizierung, das folgende Schritte aufweist: 1. Bereitstellung von Lithium, und 2. Einbringen des Lithiums in ein Lebensmittel zum Erhalt des Lebensmittelproduktes.
Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Gefäßkalzifizierung bei einem Lebewesen, das die Verabreichung von Lithium an das Lebewesen umfasst.