EP3049080A1 - Substanz zur hemmung von gewebskalzifizierung, gewebsfibrosierung und altersassoziierten erkrankungen - Google Patents

Substanz zur hemmung von gewebskalzifizierung, gewebsfibrosierung und altersassoziierten erkrankungen

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EP3049080A1
EP3049080A1 EP14777548.0A EP14777548A EP3049080A1 EP 3049080 A1 EP3049080 A1 EP 3049080A1 EP 14777548 A EP14777548 A EP 14777548A EP 3049080 A1 EP3049080 A1 EP 3049080A1
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EP
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ammonium
mice
tissue
age
group
Prior art date
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Withdrawn
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EP14777548.0A
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Florian Lang
Christina LEIBROCK
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Individual
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Definitions

  • the present invention relates to the use of a substance for reducing tissue calcification and tissue fibrosis and delaying the onset of age-associated diseases and related methods.
  • the aging process of a living being is typically characterized by the increased occurrence of diseases and organic dysfunctions. Such so-called age-associated diseases or age syndromes eventually lead to the death of the living being.
  • tissue calcification and tissue fibrosis play a crucial role.
  • Tissue calcification plays a crucial role, especially in the accelerated aging of patients with renal insufficiency.
  • the demise of functioning organ tissue when replaced by connective tissue (fibrosis) plays a central role in renal insufficiency, cirrhosis, Crohn's disease, fibrosing pancreatitis, pulmonary fibrosis, heart failure and scarring.
  • tissue fibrosis leads to impairment of the efficacy of peritoneal dialysis.
  • Tissue calcification and fibrosis are both stimulated by the transforming growth factor TGF ⁇ 1, which also contributes to the development of Alzheimer 's disease, and signal transduction by tissue calcification also involves activation of alkaline phosphatase and increased expression of the transcription factor Runx2 involved.
  • the invention has for its object to find a substance for the reduction of tissue calcification and Organfibrostechnik and age-associated diseases in a living being.
  • ammonium sulphate ammonium chloride (NH 4 Cl)
  • ammonium chloride NH 4 Cl
  • the carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide chloroquine
  • ammonium nitrate ammonium citrate or ammonium lactate.
  • Ammonium sulphate is the salt of ammonia and sulfuric acid. In food technology, ammonium sulphate is used as an additive to regulate acidity and applies to U.S. Pat. Food and Drug Administration generally considered safe (generally recognized as safe [GRAS]). In the European Union it bears the number E517.
  • Ammonium citrate is the salt of ammonia and citric acid and is approved in the European Union under number E380.
  • Ammonium lactate is the salt of ammonia and lactic acid and is listed in the European Union under number E328 as an acidity regulator.
  • Ammonium nitrate is used as fertilizer and in explosives.
  • Ammonium chloride with the empirical formula NH 4 Cl which is also referred to as ammonium ummuriate, ammonia salt or sal ammonia, and the CAS no. 12125/02/9, the ammonium salt is hydrochloric acid. It is a colorless, crystalline solid.
  • Ammonium chloride is used as an additive in food technology where it bears the number E 510. In medicine, ammonium chloride is used as an expectorant, ie as a cough remover.
  • Chloroquine [(RS) -N '- (7-chloroquinolin-4-yl) -N, N-diethyl-pentane-1, 4-diamine] alkalinizes lysosomes and is used against malaria, for immunosuppression, for the treatment of viral diseases and used against tumors.
  • the Karboanhydrasehemmer acetazolamide inhibits the enzymatic conversion of bicarbonate to carbon dioxide and therefore can affect the local pH. He is used as a diuretic.
  • ammonium sulphate ammonium citrate, ammonium lactate, ammonium nitrate, ammonium chloride (NH 4 Cl), chloroquine or acetazolamide to inhibit signal transduction leading to tissue calcification and tissue fibrosis delaying the onset of age-associated diseases is well known in the art not described.
  • the inventors were able to prove on an established cell model that ammonium sulphate, ammonium citrate, ammonium lactate, ammonium nitrate and ammonium chloride (NH 4 Cl) promote the formation of TGF ⁇ 1, a key molecule in the regulation of Tissue calcification and tissue fibrosis inhibiting ( Figure 1). Further, the inventors were able to demonstrate that ammonium sulphate, ammonium nitrate and ammonium chloride inhibit expression of the transcription factor Runx2 ( Figure 2) and that ammonium sulphate, ammonium nitrate, ammonium chloride and chloroquine reduce expression of alkaline phosphatase (Figure 3), both known stimulants of tissue calcification are. Finally, in an established animal model, the inventors were able to demonstrate that the administration of ammonium chloride and acetazolamide resulted in a marked prolongation of life ( Figure 19) and decreased or prevented tissue and vessel calcification ( Figures 12-18).
  • use is understood to mean that at least one of the substances mentioned induces the claimed action.
  • use of said substances in the context of monotherapies can be carried out using ammonium sulphate, ammonium citrate, ammonium lactate, ammonium nitrate, ammonium chloride (NH 4 Cl), chloroquine and acetazolamide as active ingredient or sole active ingredient.
  • combination therapies are also possible in which two or more of these agents are used simultaneously.
  • age-associated diseases are selected from the group consisting of atherosclerosis, pulmonary emphysema, skin atrophy, muscle weakness, immune deficiency weakness, infertility, kyphosis, disturbed CaP0 4 metabolism, osteoporosis, immunodeficiency (thymus regeneration), and neurodegeneration ,
  • tissue fibrosis is based on a disease selected from the group consisting of cirrhosis of the liver, Crohn's disease, fibrosing pancreatitis, pulmonary fibrosis, cardiac insufficiency, scarring, fibrosis in peridone dialysis, Alzheimer 's disease.
  • the measure has the advantage that substances are provided with which important fibrosing diseases can be treated prophylactically and therapeutically.
  • Ammonium sulphate, ammonium citrate, ammonium lactate, ammonium nitrate, ammonium chloride (NH 4 Cl), chloroquine and acetazolamide can be active substances in a pharmaceutical composition, which are preferably designed for oral, rectal, parenteral, intraperitoneal, local or transdermal administration is.
  • the pharmaceutical composition may preferably be in the form of a powder, tablet, juice, drops, dialysis fluid, capsule, suppository, solution, injection solution, aerosol, ointment, rinse, patch, pellet, dragee or modified release dosage form.
  • compositions for adult human administration may provide daily units of about 25 g ammonium sulphate, 25 g ammonium citrate, 35 g ammonium lactate, 25 g ammonium nitrate, 20 g ammonium chloride (NH 4 Cl), 900 mg chloroquine and 800 mg acetazolamide.
  • the person skilled in the art can also provide deviating other absolute amounts. This measure has the advantage that the active ingredient is provided in an absolute amount that achieves the desired effects.
  • the pharmaceutical composition may contain a pharmaceutically acceptable carrier and optionally other additives well known in the art. They are described, for example, in the paper by Kibbe A., Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press 2000. Additives include any compound or composition which is advantageous for the inventive use of the composition, including salts, binders, solvents, dispersants, and other substances commonly used in the formulation of medicaments.
  • ammonium sulphate, ammonium citrate, ammonium lactate, ammonium nitrate, ammonium chloride (NH 4 Cl), chloroquine and acetoazamide can be used as additive (e) in a food product.
  • the preferred concentration of the active ingredient can be readily determined by methods known to those skilled in the art, for example by titration experiments in which various concentrations are used.
  • the effective amount can be determined individually.
  • the concentration depends on the specific age-associated disease to be treated, the course, the severity, the patient to be treated, in particular on its immunological condition, gender, age, pre-existing conditions, etc.
  • concentration When used in drinks the concentration of about 25 g of ammonium sulphate, 25 g of ammonium citrate, 35 g of ammonium lactate, 25 g of ammonium nitrate, 20 g of ammonium sulphate, chloride (NH 4 Cl), chloroquine 800 mg or acetazolamide 800 mg.
  • NH 4 Cl ammonium sulphate
  • This measure has the advantage that the active ingredient or the additive is already provided in a concentration which ensures the desired effects.
  • Another object of the invention relates to a process for the preparation of a pharmaceutical composition for reducing tissue calcification and Gewebsfibrostechnik and for delaying the onset of age-associated diseases, comprising the following steps:
  • the active ingredient is selected from the group consisting of: ammonium sulphate, ammonium chloride (NH 4 Cl), acetazolamide, chloroquine, ammonium nitrate, ammonium citrate and ammonium lactate.
  • Another object of the present invention relates to a method for producing a food product for reducing tissue calcification and Gewebsfibrostechnik and for delaying the onset of age-associated diseases, comprising the following steps:
  • the additive is selected from the group consisting of: ammonium sulphate, ammonium chloride (NH 4 Cl), acetazolamide, chloroquine, ammonium nitrate, ammonium citrate and ammonium lactate.
  • Another object of the present invention relates to a method for reducing tissue calcification and Gewebsfibrostechnik and for delaying the onset of age-associated diseases, which comprises the administration of a substance to the subject, wherein the substance is selected from the group consisting of: ammonium sulphate , Ammonium chloride (NH 4 Cl), acetazolamide, chloroquine, ammonium nitrate, ammonium citrate and ammonium lactate.
  • a substance selected from the group consisting of: ammonium sulphate , Ammonium chloride (NH 4 Cl), acetazolamide, chloroquine, ammonium nitrate, ammonium citrate and ammonium lactate.
  • the substances can be used individually as sole active ingredients or additives or in combination.
  • TGF ⁇ 1 mRNA shows the expression of TGF ⁇ 1 mRNA in human smooth aortic smooth muscle cells (HAoSMCs) at normal phosphate concentration (white column) and after increasing the phosphate concentration by addition of 2 mM ⁇ -glycerophosphate to the stimulus mulation of osteogenic signal transduction in the absence (gray column) and presence (black columns) of different ammonium salts (0.5 mM each).
  • *** (p ⁇ 0.001) shows statistically significant difference to normal phosphate concentration; # (p ⁇ 0.05), ##
  • Fig. 3 shows the expression of alkaline phosphatase mRNA in human smooth aortic smooth muscle cells (HAoSMCs) at normal phosphate concentration (white column) and after increasing the phosphate concentration by adding 2 mM ⁇ -glycerophosphate to stimulate osteogenic signal transduction in the absence (gray column) and presence (black columns) of various ammonium salts (Figure 3A) (0.5 mM each) and chloroquine (100 ⁇ ) ( Figure 3B).
  • Fig. 4 shows the expression of NFAT5 (Nuclear factor of activated T-cells 5) in aortas of klot o + l + - (light bars) and / / oi / o hm mice (dark bars), either without (control)? and with NH 4 Cl treatment.
  • NFAT5 Nuclear factor of activated T-cells 5
  • Fig. 5 shows the expression of NFAT5 (A) and SOX9 (B) in human smooth
  • Aortic smooth muscle cells at normal phosphate concentration (white columns) and after increasing the phosphate concentration by adding 2mM ⁇ -glycerophosphate to stimulate osteogenic signal transduction in the absence (black columns) and presence (gray columns) of ammonium chloride ( 500 ⁇ ).
  • (n 6-8) ** (p ⁇ 0.01) shows statistically significant difference to normal phosphate concentration; # (p ⁇ 0.05), shows statistically significant difference to increased phosphate concentration in the absence of ammonium chloride (ANOVA).
  • Fig. 6 shows the expression of NFAT5 (A), SOX9 (B), CBFA1 / RUNX2 (C) and
  • HASMCs human smooth aortic smooth muscle cells
  • TGF-beta 10 ng / ml
  • TGFB1 normal phosphate concentration
  • Fig. 12 shows the histology of trachea, lung, kidney, stomach and vessels
  • mice without (untreated) or with (treated) (NH 4 ) 2 S0 - treatment.
  • Fig. 13 shows the histology of vessels from / c / of / 70 hm mice without (untreated) treatment, with (treated) (NH 4 ) 2 S0 4 - or with NH 4 N0 3 treatment.
  • Fig. 14 shows the histology of trachea, lung, kidney, stomach and vessels
  • mice without (untreated) or with (treated) NH 4 N0 3 - treatment.
  • Fig. 15 shows the histology of hearts from / / of / 70 hm mice without (untreated) treatment and with NH N0 3 treatment
  • Fig. 16 shows the histology of trachea, lung, kidney, stomach and vessels
  • FIG. 17 shows the histology of the trachea, lung, kidney, stomach and blood vessels from / / oi /? O hm mice without (untreated) or with (treated) Aze- tazolamid treatment.
  • Fig. 18 shows the histology of trachea, lung, kidney, stomach and vessels
  • mice without (untreated) or with (treated) chloroquine diphosphate treatment.
  • (p ⁇ 0.05, Wilcoxon, log rank) (p ⁇ 0.05, Wilcoxon, log rank).
  • HASMCs human primary smooth muscle cells
  • Invitrogen Aortic human primary smooth muscle cells
  • Waymouth's MB 752/1 medium and Ham's F-12 nutrient mixture (1: 1, Gibco, Life Technologies) with 10% FBS added (Gibco , Life Technologies) and 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin (Gibco, Life Technologies).
  • FBS FBS-containing bovine serum
  • the cells were treated with 2 mM ⁇ -glycerophosphate (Sigma-Aldrich) for 24 hours with or without the simultaneous addition of 0.5 mM ammonium salts or 100 ⁇ M chloroquine diphosphate (Sigma-Aldrich).
  • RT-PCR Quantitative real-time polymerase chain reaction
  • RNA samples were used for the reverse transcription of the RNA with oligo (dT) 12- i8 primers (Invitrogen) and SuperScriptIII reverse transcriptase (Invitrogen).
  • Quantitative real-time PCR was performed using an iCycler iQ TM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories) and iQ TM Sybr Green Supermix (Bio-Rad Laboratories) according to the manufacturer's instructions. The following primers were used (5'-> 3 'orientation):
  • TN alkaline phosphatase fw G G GACTG GTACTC AG ACAACG (SEQ ID NO: 1);
  • TN alkaline phosphatase rev GTAGGCGATGTCCTTACAGCC (SEQ ID NO: 2);
  • RUNX2 fw GGAAGGGCTTGATTGACGTG (SEQ ID NO: 3);
  • RUNX2 rev CAGAACCAAACATAGCACTGACT (SEQ ID NO: 4);
  • TGFB1 fw CAATTCCTGGCGATACCTCAG (SEQ ID NO: 5);
  • TGFB1 rev GCACAACTCCGGTGACATCAA (SEQ ID NO: 6).
  • GAPDH fw GAGTCAACGGATTTGGTCGT (SEQ ID NO: 7);
  • GAPDH rev GACAAGCTTCCCGTTCTCAG (SEQ ID NO: 8);
  • NFAT5 rev GTCCGTGGTAAGCTGAGAAAG (SEQ ID NO: 10);
  • SOX9 fw: AGCGAACGCACATCAAGAC (SEQ ID NO: 1 1);
  • SOX9 rev CTGTAGGCGATCTGTTGGGG (SEQ ID NO: 12).
  • Nfat51w CTGTAGGCGATCTGTTGGGG (SEQ ID NO: 13);
  • Nfat5 rev CTG GTG CTCATGTTACTG AAGTT (SEQ ID NO: 14);
  • Gapdh lw AGGTCGGTGTGAACGGATTTG (SEQ ID NO: 15);
  • Gapdh rev TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA (SEQ ID NO: 16).
  • the specificity of the PCR products was checked by melting curve analysis and agarose gel electrophoresis. All PCRs were carried out twice and the multiples of the mRNA quantity were calculated by the 2 _ ⁇ method with GAPDH as internal reference.
  • mice Male and female hypomorphic / oi / o mice (klotho m ) were compared with male and female wild type mice (klotho + / + ).
  • the origin of the mice, breeding and genotyping are described in the prior art; see. Kuro-o et al. (1997), Mutation of the mouse gene leads to a syndrome reminding aging, Nature 390: 45-51.
  • backcrossings > 9 generations
  • congenic strains of the / o / o hm mice were prepared and used in this study.
  • mice had random access to water or an aqueous solution of (NH 4 ) 2 SO 4 (0.14M), NH 4 Cl (0.28M), NH 4 NO 3 (0.28M), acetazolamide (800 mg / l) and chloroquine diphosphate (0.288 mg / ml) and were fed with control diet (Sniff, Soest, Germany).
  • the treatments with NH 4 Cl (0.28 M) or acetazolamide (800 mg / L) began with parental generation and continued throughout pregnancy until the offspring were killed.
  • mice were anesthetized with diethyl ether (Roth, Düsseldorf, Germany) and by puncturing the retro-orbital plexus blood samples were taken from 50 to 200 ⁇ in capillaries containing heparin.
  • the phosphate and calcium concentrations in the plasma were determined using a photometric method (FUJI FDC 3500i, Sysmex, Nordstedt, Germany).
  • Plasma FGF23 and PTH levels were determined using commercial ELISA kits (FGF23: Immunodiagnostics, Boston, USA, PTH: Immunotopics, San Diego, USA, MPG: Cloud-Clone Corporation, Houston, USA).
  • the measurement of the concentration of Caicitriol [1, 25 (OH) -Vitamin D 3 ] in the plasma was also under Using a commercial ELISA kit (IDS, Boldon, United Kingdom).
  • the ammonia concentration was measured enzymatically using glutamate dehydrogenase with NADPH as cofactor.
  • the evaluation was also carried out with a photometric method (ADVIA 1650 analyzer, Siemens, Fernwald, Germany).
  • mice were male and / / oi / o + / + mice (aged 8 weeks) were male and / / oi / o hm Mice (age: 8 weeks), with and without treatment of aqueous solutions of (NH 4 ) 2 SO 4 (0.14M), NH 4 Cl (0.28M), NH 4 NO 3 (0.28M) and chloroquine ( 0.288 mg / ml), or embedded in paraffin in female animals without and with acetazeolamide treatment (800 mg / l in drinking water), cut into slices of 2 to 3 ⁇ and stained with H & E and Kossa; see. Mossbrugger et al.
  • Klotho is a transmembrane protein related to the ⁇ -glucuronidase. Decreased production of this protein has been observed in patients with chronic renal failure, often associated with degenerative processes such as atherosclerosis, osteoporosis and skin atrophy. Mutations in this protein could be linked to aging processes.
  • hypomorphic mice In the investigated mouse model, the / / o /? O expression is massively reduced by a defect in the klotho gene. Affected mice are referred to as hypomorphic mice.
  • the lack of klotho leads to a syndrome that resembles human aging. More specifically, in these animals, accelerated appearance of tissue and / or vascular calcification, arteriosclerosis, pulmonary emphysema, skin atrophy, muscle weakness, immune deficiency, infertility, kyphosis, impaired CaP0 4 metabolism, osteoporosis, immune deficiency (thymic regression), hearing loss and neurodegeneration observed.
  • the affected animals also have a significantly reduced life expectancy and are infertile.
  • FIG. 1 shows the expression of TGF ⁇ 1 mRNA in human smooth aortic muscle cells (HAoSMCs).
  • HOSMCs human smooth aortic muscle cells
  • the cells were treated with 2 mM ⁇ -glycerophosphate to stimulate osteogenic signal transduction.
  • the increased phosphate concentration resulted in a significant increase in TGF ⁇ 1 mRNA expression.
  • This increase was mitigated by the addition of various ammonium salts (0.5 mM) (ammonium lactate, ammonium citrate, ammonium sulfate) or even prevented (ammonium chloride, ammonium nitrate).
  • FIG. 2 shows the expression of Runx2 mRNA in human smooth aortic smooth muscle cells (HAoSMCs).
  • HOSMCs human smooth aortic smooth muscle cells
  • ALP alkaline phosphatase
  • HOSMCs human aortic smooth muscle cells
  • Fig. 3A shows the suppression of the expression increase by Ammonium chloride, ammonium nitrate and ammonium sulfate.
  • Fig. 3B shows the suppression of ALP mRNA expression increase by chloroquine (100 ⁇ ).
  • FIG. 4 shows that the expression of the transcription factor NFAT5 in aortas of klotho hm mice is markedly increased compared to the klotho + / + mice.
  • Treatment with NH 4 Cl (0.28 M) leads to a normalization of transcription levels.
  • Fig. 5 shows the transcription levels of NFAT5 and SOX9 in human smooth aortic smooth muscle cells (HAoSMCs). Stimulation with 2 mM ⁇ -glycerophosphate increased transcription levels, while concomitant treatment with NH 4 Cl reduced expression again.
  • Fig. 6 shows the transcription levels of NFAT5, SOX9, Runx2 and ALP in human aortic smooth muscle cells after transfection with NFAT5.
  • concurrent treatment with NH4CI reduced the expression of the respective genes of the cells transfected with empty vector back to a normal level, the expression in the NFAT5 transfected cells remained high.
  • Fig. 7 shows the increase of the transcription level of NFAT5 in human aortic smooth muscle cells under treatment with TGF beta as well as 2mM ⁇ -glycerophosphate. While treatment of the cells with NH 4 Cl could reverse the increase in NFAT5 transcription triggered by the treatment with 2 mM ⁇ -glycerophosphate, the expression was still significantly increased with simultaneous treatment with TGF beta.
  • FIG. 8 shows the significant growth deficits of untreated hypomorphic (klotho m ) mice in comparison to their wildtype throwing siblings (klotho + / + ).
  • the growth deficit of the / / offrc ⁇ mice could be almost completely abolished by treatment with NH 4 Cl (klotho m NH 4 Cl).
  • Wild type mice showed no growth stimulation on treatment with NH 4 Cl (klotho + / + NH 4 Cl).
  • the body weight of untreated klotho mice (control) is significantly lower than that of untreated / oi / o + / + mice.
  • the portionsdefz was almost completely abolished (B).
  • FIG. 10A shows the plasma phosphate levels of the animals, which were significantly higher than / / oi /? O + were with / / oi /? O hm mice + / mice.
  • Treatment with NH 4 Cl did not alter the plasma metabolism.
  • the plasma concentrations of Ca ++ in untreated / / oi /? O hm mice were significantly higher than in / / oi /? O + / + mice.
  • the NH 4 Cl treatment resulted tend to a decrease in Ca ++ concentrations in the plasma of / / oi /? O hm mice, but did not reach statistical significance.
  • Also shown in Fig. 10 are the plasma concentrations of 1, 25 (OH) 2 D 3 (Caicitriol), FGF23 and parathyroid hormone.
  • the levels of 1, 25 (OH) 2 D 3 and FGF23 were significantly higher, those of parathyroid hormone were significantly lower in / / of / 70 hm mice than in / / oi /?
  • Fig. 1 the plasma concentrations of Ca ++ , phosphate and 1, 25 (OH) 2 D 3 of / oi / o + / + mice and / oi / o hm mice are respectively presented with and without treatment with acetazolamide. Neither the concentration of 1, 25 (OH) 2 D 3 nor that of phosphate was affected by the treatment. Also, the calcium levels of the treated / / oi /? O hm mice was slightly increased as before, but showed neither the untreated / / oi /? O hm mice nor to the / / oi /? O + / + mice a significant difference. The levels of matrix Gla protein (MGP) in the animals' plasma could also be completely normalized by treatment with acetazolamide.
  • MGP matrix Gla protein
  • mice observed in / / oi / with an age of 8 weeks strong calcifications in all tissues analyzed, such as. In the trachea, lung, kidney, Stomach and the vascular tissues.
  • the calcification in / m o / hm mice could be achieved by treatment with (NH 4 ) 2 S0 4 (FIGS. 12, 13), NH 4 N0 3 (FIGS. 13, 14, 15) and NH 4 Cl (FIG. Fig. 16) are greatly reduced.
  • FIG. 17 also shows histological sections of selected organs / / oi /? O hm mice.
  • the treatment of the animals with acetazolamide also led to a significant reduction of calcifications in the analyzed tissues.
  • Fig. 18 shows histological sections of selected organs of / / / o hm mice and / or? O hm mice under treatment with chloroquine diphosphate.
  • the treatment of the animals with the chloroquine salt also led to a significant reduction of calcifications in the analyzed tissues.
  • the inventors provide with ammonium sulphate, ammonium chloride (NH 4 Cl), acetazolamide, chloroquine, ammonium nitrate, ammonium citrate and ammonium lactate, substances which are suitable for preventing tissue calcification and tissue fibrosis and delaying the onset of age-associated diseases and thus the Extend the life of a living being. This is partly due to the Influence on the expression of calcification and fibrosis markers in cell culture and the impressive effects of ammonium chloride and acetazolamide on an established animal model. The correspondingly treated animals show markedly reduced age syndromes, impressively illustrated by tissue and vessel calcification, and live significantly longer than untreated animals.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Substanzzur Minderung von Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung, zur Verzögerung des Eintretens altersassoziierter Erkrankungen eines Lebewesensund damit im Zusammenhang stehende Verfahren.

Description

Substanz zur Hemmung von Gewebskalzifizierung, Gewebsfibrosierung
und altersassoziierten Erkrankungen
[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Substanz zur Minderung von Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung und zur Verzögerung des Eintretens altersassoziierter Erkrankungen und damit im Zusammenhang stehende Verfahren.
[0002] Der Alterungsprozess eines Lebewesens ist typischerweise gekennzeichnet durch das vermehrte Auftreten von Erkrankungen und organischen Funktionsstörungen. Solche sog. altersassoziierten Krankheiten oder Alterssyndrome münden schließlich im Versterben des Lebewesens. Beim Alterungsprozess spielen Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung eine entscheidende Rolle.
[0003] Die Gewebskalzifizierung spielt vor allem beim beschleunigten Altern von Patienten mit Niereninsuffizienz eine entscheidende Rolle. Der Untergang von funktionierendem Organgewebe bei Ersatz durch Bindegewebe (Fibrosierung) spielt bei Niereninsuffizienz, Leberzirrhose, Morbus Crohn, fibrosierender Pankreatitis, Lungenfibrose, Herzinsuffizienz und Narbenbildung eine zentrale Rolle. Ferner führt Gewebsfibrosierung zur Beeinträchtigung der Wirksamkeit von Peritonealdialyse.
[0004] Gewebskalzifizierung und Fibrosierung werden beide durch den„trans- forming growth factor" TGFßl stimuliert, der auch zur Entstehung der Alzheimer'schen Erkrankung beiträgt. Bei der Signaltransduktion von Gewebskalzifizierung ist ferner eine Aktivierung der alkalischen Phosphatase und die gesteigerte Expression des Transkriptionsfaktors Runx2 beteiligt.
[0005] Exzessive Gewebskalzifizierung, frühes Auftreten von altersassoziierten Erkrankungen und verkürzte Lebensspanne werden bei Klotho-defizienten Mäusen (klothohm) beobachtet. Hemmung der Gewebskalzifizierung sowie Verlängerung der Lebensdauer nach Verabreichung eines Agens an diese Mäuse erlaubt daher den Rückschluß, dass dieses Agens Gewebskalzifizierung und Altern verzögert.
[0006] Im Stand der Technik finden sich unzählige Hinweise auf vermeintliche Substanzen zur Minderung von Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung und zur Verzögerung des Eintretens altersassoziierter Erkrankungen. Über die Wirksamkeit dieser Substanzen fehlt jedoch in den meisten Fällen jeglicher wissenschaftlicher Beleg.
[0007] Vor diesem Hintergrund liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Substanz zur Minderung von Gewebskalzifizierung und Organfibrosierung sowie altersassoziierten Erkrankungen bei einem Lebewesen zu finden.
[0008] Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung von Ammoniumsulphat, Ammoniumchlorid (NH4CI), dem Karboanhydrasehemmer Acetazolamid, Chloroquin, Ammoniumnitrat, Ammoniumzitrat oder Ammoniumlaktat, gelöst.
[0009] Diese Erkenntnis der Erfinder ist überraschend.
[0010] Ammoniumsulphat ist das Salz von Ammoniak und Schwefelsäure. In der Lebensmitteltechnologie wird Ammoniumsulphat als Zusatzstoff zur Regulation der Säure verwendet und gilt bei der U.S. Food and Drug Administration allgemein als sicher (generally recognized as safe [GRAS]). In der Europäischen Union trägt es die Nummer E517.
[0011] Ammoniumzitrat ist das Salz von Ammoniak und Zitronensäure und ist in der Europäischen Union unter der Nummer E380 zugelassen.
[0012] Ammoniumlaktat ist das Salz von Ammoniak und Milchsäure und wird in der Europäischen Union unter der Nummer E328 als Säureregulator geführt.
[0013] Ammoniumnitrat wird als Düngemittel und in Sprengstoffen eingesetzt. [0014] Ammoniumchlorid mit der Summenformel NH4CI, das auch als Ammoni- ummuriat, Ammoniaksalz oder Salmiak bezeichnet wird und die CAS-Nr. 12125/02/9 aufweist, ist das Ammoniumsalz der Salzsäure. Es ist ein farbloser, kristalliner Feststoff. Ammoniumchlorid wird in der Lebensmitteltechnologie als Zusatzstoff verwendet und trägt dort die Nr. E 510. In der Medizin kommt Ammoniumchlorid als Expektorans, d.h. als Hustenlöser, zum Einsatz.
[0015] Chloroquin [(RS)-N'-(7-chloroquinolin-4-yl)-N,N-diethyl-pentane-1 ,4- diamine] alkalinisiert Lysosomen und wird gegen Malaria, zur Immunsuppression, zur Behandlung viraler Erkrankungen und gegen Tumoren eingesetzt.
[0016] Der Karboanhydrasehemmer Acetazolamid hemmt die enzymatische Umwandlung von Bikarbonat zu Kohlendioxid und kann daher den lokalen pH beeinflussen. Er wird als Diuretikum eingesetzt.
[0017] Bekannt ist, dass eine Azidose, wie sie durch Ammoniumchlorid (NH4CI) ausgelöst werden kann, die Gewebskalzifizierung hemmen kann. Ferner ist bekannt, dass Azetazolamid die Phosphatkonzentration senken kann, wodurch die Gewebskalzifizierung herabgesetzt werden würde. In den Experimenten an der klothohm Maus wurde die Gewebskalzifizierung durch Ammoniumchlorid jedoch ohne Verschärfung der Azidose und durch Azetazolamid ohne Senkung der Plasmaphosphatkonzentration gehemmt (s.u.).
[0018] Die Verwendung von Ammoniumsulphat, Ammoniumzitrat, Ammoniumlaktat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid (NH4CI), Chloroquin oder Acetazolamid zur Hemmung der Signaltransduktion, welche zu Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosie- rung führt und das Eintreten von altersassoziierten Erkrankungen verzögert, ist im Stand der Technik nicht beschrieben.
[0019] Die Erfinder konnten an einem etablierten Zellmodell belegen, dass Ammoniumsulphat, Ammoniumzitrat, Ammoniumlaktat, Ammoniumnitrat und Ammoniumchlorid (NH4CI) die Bildung von TGFßl , einem Schlüsselmolekül in der Regulation von Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung, hemmen (Fig. 1 ). Ferner konnten die Erfinder nachweisen, dass Ammoniumsulphat, Ammoniumnitrat und Ammoniumchlorid die Expression des Transkriptionsfaktors Runx2 (Fig. 2) hemmen und dass Ammoniumsulphat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid und Chloroquin die Expression der alkalischen Phosphatase herabsetzen (Fig. 3), die beide bekannte Stimulatoren der Gewebsverkalkung sind. Schließlich konnten die Erfinder in einem etablierten Tiermodell zeigen, dass die Verabreichung von Ammoniumchlorid und Acetazolamid zu einer deutlichen Lebensverlängerung führt (Fig. 19) und Gewebe- und Gefäßkalzifizierung, vermindern bzw. verhindern (Fig. 12-18).
[0020] Weitergehende Untersuchungen verschafften Einblick in die beteiligten zellulären Mechanismen: Es konnte gezeigt werden, dass Aorten von Klotho-defizienten Tieren eine massive Expression des Transkriptionsfaktors NFAT5 aufweisen (Fig. 4). Die Expression des Transkriptionsfaktors konnte in Zellen durch erhöhte extrazelluläre Phosphatkonzentrationen gesteigert werden (Fig. 5A). Gleichzeitig stieg die Expression von SOX9, ebenfalls einem Protein welches zur osteogenen Signaltransduktion beiträgt (Fig. 5B). Transfektion der Zellen mit NFAT5 steigerte unabhängig von Phosphat die Expression von SOX9, CBFA1/RUNX2 und ALP und verhinderte die Wirkung von NH4CI auf die Expression von SOX9, CBFA1/RUNX2 und ALP (Fig. 6). Behandlung der Zellen mit Tumor growth factor TGFß steigerte wiederum unabhängig von Phosphat die Expression von NFAT5 und verhinderte die Wirkung von NH4CI auf die Expression von NFAT5 (Fig. 7).
[0021] Erfindungsgemäß wird unter "Verwendung" verstanden, dass zumindest eine der genannten Substanzen die beanspruchte Wirkung induziert. Dabei kann erfindungsgemäß die Verwendung der genannten Substanzen im Rahmen von Monotherapien erfolgen, bei der Ammoniumsulphat, Ammoniumzitrat, Ammoniumlaktat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid (NH4CI), Chloroquin und Acetazolamid als Wirkstoff bzw. alleiniger Wirkstoff eingesetzt wird. Es sind jedoch auch Kombinationstherapien möglich, bei denen zwei oder mehrere dieser Wirkstoffe gleichzeitig eingesetzt werden.
[0022] Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst. [0023] Nach einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung sind altersassoziierten Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Arteriosklerose, Lungenemphysem, Hautatrophie, Muskelschwäche, Immunabwehrschwäche, Infertilität, Kyphose, gestörter CaP04-Metabolismus, Osteoporose, Immunschwäche (Thymusrück- bildung), und Neurodegeneration.
[0024] Nach einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung basiert die Ge- websfibrosierung auf einer Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Leberzirrhose, Morbus Crohn, fibrosierende Pankreatitis, Lungenfibrose, Herzinsuffizienz, Narbenbildung, Fibrosierung bei Peridonealdialyse, Alzheimer'sche Erkrankung.
[0025] Die Maßnahme hat den Vorteil, dass Substanzen bereitgestellt werden, mit denen wichtige fibrosierenden Erkrankungen prophylaktisch und therapeutisch behandelt werden können.
[0026] Bei Ammoniumsulphat, Ammoniumzitrat, Ammoniumlaktat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid (NH4CI), Chloroquin und Acetazolamid kann es sich um Wirkstoffe in einer pharmazeutischen Zusammensetzung handeln, die vorzugsweise für eine orale, rektale, parenterale, intraperitoneale, lokale oder transdermale Applikation ausgebildet ist. Ferner kann die pharmazeutische Zusammensetzung vorzugsweise als Pulver, Tablette, Saft, Tropfen, Dialyseflüssigkeit, Kapsel, Zäpfchen, Lösung, Injektionslösung, Aerosol, Salbe, Spülung, Pflaster, Pellet, Dragee oder modifiziert freisetzende Darreichungsform ausgebildet sein.
[0027] Die Absolutmenge des Ammoniumsulphat, Ammoniumzitrat, Ammoniumlaktat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid (NH4CI), Chloroquin und Acetazolamid in einer Dosierungseinheit der pharmazeutischen Zusammensetzung bestimmt der Fachmann nach den Bedürfnissen des Einzelfalls. Zusammensetzungen für die Verabreichung beim erwachsenen Menschen können Tageseinheiten von ca. 25 g Ammoniumsulphat, 25 g Ammoniumzitrat, 35 g Ammoniumlaktat, 25 g Ammoniumnitrat, 20 g Ammoniumchlorid (NH4CI), 900 mg Chloroquin und 800 mg Acetazolamid vorsehen. Der Fachmann kann jedoch auch hiervon abweichende andere Absolutmengen vorsehen. [0028] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass der Wirkstoff in einer Absolutmenge bereitgestellt wird, die die gewünschten Wirkungen erzielt.
[0029] Die pharmazeutische Zusammensetzung kann einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ggf. weitere Zusätze enthalten, die im Stand der Technik allgemein bekannt sind. Sie werden bspw. in der Abhandlung von Kibbe A., Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press 2000, beschrieben. Zusätze umfassen jedwede Verbindung oder Zusammensetzung, die für die erfindungsgemäße Verwendung der Zusammensetzung vorteilhaft sind, worunter Salze, Bindemittel, Lösungsmittel, Dispersionsmittel, und weitere im Zusammenhang mit der Formulierung von Arzneimitteln üblicherweise verwendete Stoffe fallen.
[0030] Erfindungsgemäß kann/können Ammoniumsulphat, Ammoniumzitrat, Ammoniumlaktat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid (NH4CI), Chloroquin und Ace- tazolamid als Zusatzstoff(e) in einem Lebensmittelprodukt eingesetzt werden.
[0031] Diese Maßnahme macht sich den Vorteil zunutze, dass die Substanzen z.T. bereits in der Lebensmitteltechnologie Einsatz finden und sich durch Verträglichkeit und weitgehende Geschmacklosigkeit auszeichnen. Jedes beliebige Lebensmittelprodukt kommt erfindungsgemäß infrage, insbesondere Getränke aber auch feste Lebensmittel.
[0032] Die bevorzugte Konzentration des Wirkstoffes lässt sich mittels dem Fachmann bekannter Verfahren, beispielsweise über Titrationsexperimente, in denen verschiedene Konzentrationen eingesetzt werden, ohne weiteres ermitteln. Die wirksame Menge kann individuell festgelegt werden. Im Falle einer therapeutischen Verwendung richtet sich die Konzentration nach der konkret zu therapierenden Alters-assoziierten Erkrankung, dem Verlauf, dem Schweregrad, dem zu behandelnden Patienten, insbesondere nach dessen immunologischem Zustand, Geschlecht, Alter, Vorerkrankungen, etc. Bei einer Verwendung in Getränken kann die Konzentration bei ca. 25 g Ammoniumsulphat, 25 g Ammoniumzitrat, 35 g Ammoniumlaktat, 25 g Ammoniumnitrat, 20 g Ammoni- umchlorid (NH4CI), 800 mg Chloroquin oder 800 mg Acetazolamid liegen. Der Fachmann kann jedoch auch hiervon abweichende andere Konzentrationen vorsehen.
[0033] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass der Wirkstoff bzw. der Zusatzstoff bereits in einer solchen Konzentration bereitgestellt wird, der die gewünschten Wirkungen gewährleistet.
[0034] Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Minderung von Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung sowie zur Verzögerung des Eintretens von altersassoziierten Erkrankungen, das folgende Schritte aufweist:
1 . Bereitstellung eines Wirkstoffes, und
2. Formulierung des Wirkstoffes in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger zum Erhalt der pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei der Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Ammoniumsul- phat, Ammoniumchlorid (NH4CI), Acetazolamid, Chloroquin, Ammoniumnitrat, Ammoniumzitrat und Ammoniumlaktat.
[0035] Ferner betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Lebensmittelproduktes zur Minderung von Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung sowie zur Verzögerung des Eintretens von altersassoziierten Erkrankungen, das folgende Schritte aufweist:
1 . Bereitstellung eines Zusatzstoffes, und
2. Einbringen des Zusatzstoffes in ein Lebensmittel zum Erhalt des Lebensmittelproduktes, wobei der Zusatzstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Ammonium- sulphat, Ammoniumchlorid (NH4CI), Acetazolamid, Chloroquin, Ammoniumnitrat, Ammoniumzitrat und Ammoniumlaktat.
[0036] Schließlich betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Minderung von Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung sowie zur Verzögerung des Eintretens von altersassoziierten Erkrankungen, das die Verabreichung einer Substanz an das Lebewesen umfasst, wobei die Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Ammoniumsulphat, Ammoniumchlorid (NH4CI), Acetazolamid, Chloroquin, Ammoniumnitrat, Ammoniumzitrat und Ammoniumlaktat.
[0037] Die Eigenschaften, Merkmale und Vorteile der erfindungsgemäßen Verwendung gelten für die erfindungsgemäßen Verfahren entsprechend. So können die Substanzen einzeln als alleinige Wirk- bzw. Zusatzstoffe oder aber in Kombination eingesetzt werden.
[0038] Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
[0039] Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Eigenschaften und Vorteile ergeben. Die Ausführungsbeispiele sind rein illustrativ und schränken die Reichweite der Erfindung nicht ein. Dabei wird Bezug genommen auf die beigefügten Abbildungen.
[0040] In den beigefügten Figuren ist Folgendes dargestellt:
Fig. 1 zeigt die Expression von TGFßl mRNA in humanen glatten Aortenmus- kelzellen (HAoSMCs = human aortic smooth muscle cells) bei normaler Phosphatkonzentration (weiße Säule) und nach Steigerung der Phosphatkonzentration durch Zugabe von 2mM ß-Glycerophosphat zur Sti- mulation von osteogener Signaltransduktion in der Abwesenheit (graue Säule) und Anwesenheit (schwarze Säulen) von verschiedenen Ammoniumsalzen (jeweils 0,5 mM). ***(p<0.001 ) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu normaler Phosphatkonzentration; #(p<0.05), ##(p<0.01 ) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu gesteigerter Phosphatkonzentration in Abwesenheit von Ammoniumsalzen (Student's t-test, n=4).
Fig. 2 zeigt die Expression von Runx2 mRNA in humanen glatten Aortenmus- kelzellen (HAoSMCs = human aortic smooth muscle cells) bei normaler Phosphatkonzentration (weiße Säule) und nach Steigerung der Phosphatkonzentration durch Zugabe von 2mM ß-Glycerophosphat zur Stimulation von osteogener Signaltransduktion in der Abwesenheit (graue Säule) und Anwesenheit (schwarze Säulen) von verschiedenen Ammoniumsalzen (jeweils 0,5 mM). **(p<0.01 ) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu normaler Phosphatkonzentration; #(p<0.05), ##(p<0.01 ) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu gesteigerter Phosphatkonzentration in Abwesenheit von Ammoniumsalzen (Student's t-test, n=6).
Fig. 3 zeigt die Expression von alkalischer Phosphatase mRNA in humanen glatten Aortenmuskelzellen (HAoSMCs = human aortic smooth muscle cells) bei normaler Phosphatkonzentration (weiße Säule) und nach Steigerung der Phosphatkonzentration durch Zugabe von 2mM ß- Glycerophosphat zur Stimulation von osteogener Signaltransduktion in der Abwesenheit (graue Säule) und Anwesenheit (schwarze Säulen) von verschiedenen Ammoniumsalzen (Abb. 3A) (jeweils 0,5 mM) sowie nach Zugabe von Chloroquin (100 μΜ) (Abb. 3B). *(p<0,05), **(p<0,01 ), ***(p<0.001 ) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu normaler Phosphatkonzentration; #(p<0.05), ##(p<0.01 ), ###(p<0,001 ) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu gesteigerter Phosphatkonzentration in Abwesenheit von Ammoniumsalzen bzw. Chloroquin (Student's t-test, n=8). Fig. 4 zeigt die Expression von NFAT5 (Nuclear factor of activated T-cells 5) in Aorten von klot o+l+- (helle Balken) und / /oi/?ohm-Mäusen (dunkle Balken), jeweils ohne (Kontrolle) und mit NH4CI- Behandlung. (n=10) ** (p<0.01 ) zeigt einen signifikanten Unterschied zu / /oi/?o+/+-Mäusen; ### (p<0.001 ) zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied zu unbehandelten / /of/70hm-Mäusen (ANOVA).
Fig. 5 zeigt die Expression von NFAT5 (A) und SOX9 (B) in humanen glatten
Aortenmuskelzellen (HAoSMCs = human aortic smooth muscle cells) bei normaler Phosphatkonzentration (weiße Säulen) und nach Steigerung der Phosphatkonzentration durch Zugabe von 2mM ß-Glycerophosphat zur Stimulation von osteogener Signaltransduktion in der Abwesenheit (schwarze Säulen) und Anwesenheit (graue Säulen) von Ammoniumchlorid (500 μΜ). (n=6-8) **(p<0.01 ) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu normaler Phosphatkonzentration; #(p<0.05), zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu gesteigerter Phosphatkonzentration in Abwesenheit von Ammoniumchlorid (ANOVA).
Fig. 6 zeigt die Expression von NFAT5 (A), SOX9 (B), CBFA1/RUNX2 (C) und
ALPL (D) in humanen glatten Aortenmuskelzellen (HAoSMCs = human aortic smooth muscle cells) bei normaler Phosphatkonzentration (Con- trol) und nach Steigerung der Phosphatkonzentration durch Zugabe von 2 mM ß-Glycerophosphat zur Stimulation von osteogener Signaltransduktion in der Abwesenheit (Pi) und Anwesenheit (Pi+NH4CI) von Ammoniumchlorid (500 μΜ) nach Kontrolltransfektion (weiße Säulen) und Transfektion mit einem Konstrukt codierend für NFAT5 (schwarze Säulen). (n=6) *(p<0.01 ), **(p<0.01 ), ***(p<0.001 ) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu normaler Phosphatkonzentration mit Kontrolltransfektion (ANOVA). #(p<0.05), ##(p<0.01 ), ###(p<0.001 ) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu gesteigerter Phosphatkonzentration in Abwesenheit von Ammoniumchlorid mit Kontrolltransfektion (ANOVA). $(p<0.05), $$(p<0.01 ), $$$(p<0.001 ) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu Kontroll-transfizierten HAoSMCs (t-test). Fig. 7 zeigt die Expression von NFAT5 in humanen glatten Aortenmuskelzel- len (HAoSMCs = human aortic smooth muscle cells) bei normaler Phosphatkonzentration (Control), bei Anwesenheit von TGF-beta (10 ng/ml; TGFB1 ), nach Steigerung der Phosphatkonzentration durch Zugabe von 2 mM ß-Glycerophosphat zur Stimulation von osteogener Signaltrans- duktion in der Abwesenheit (Pi) und Anwesenheit (Pi+NH4CI) von Ammoniumchlorid (500 μΜ), sowie bei Anwesenheit von erhöhter Phosphatkonzentration gemeinsam mit Tgf-beta und Ammoniumchlorid (Pi+NH4CI+TGFB1 ) . (n=6) *(p<0.05), ***(p<0.001 ) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu normaler Phosphatkonzentration; #(p<0.05), ###(p<0.001 ) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu gesteigerter Phosphatkonzentration in Abwesenheit von Ammoniumchlorid (ANOVA).
Fig. 8 zeigt den Phänotyp von klotho+l+- und / /oi/?ohm-Mäusen, sowie das Körpergewicht von klotho+l+- (helle Balken) und / /oi/?ohm-Mäusen (dunkle Balken), jeweils ohne (Kontrolle) und mit NH4CI- Behandlung (C), n= 5- 7; *** (p<0,001 ) indiziert einen signifikanten Unterschied zu klotho+l+- Mäusen; ### (p<0,001 ) zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied zu unbehandelten / /oi/?ohm-Mäusen (ANOVA).
Fig. 9 zeigt den Phänotyp von klotho+l+- und / /oi/?ohm-Mäusen, sowie das Körpergewicht von klotho+l+- (helle Balken) und / /oi/?ohm-Mäusen (dunkle Balken), jeweils ohne (Kontrolle) und mit Azetazolamid- Behandlung (C), n= 4-6; * (p<0,05), *** (p<0,001 ) indiziert einen signifikanten Unterschied zu / /oi/?o+/+-Mäusen; ### (p<0,001 ) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu unbehandelten / /oi/?ohm-Mäusen (ANOVA).
Fig. 10 zeigt die Ammoniak- (A) (n=8), Phosphat- (B) (n=7), Ca+/+-(C) (n=7),
1 ,25(OH)2D3 (D) (n=6), FGF23 (E) (n=5) und Parathormon (F) (n=5) und Matrix Gla Protein (MGP) (G) (n=6) Konzentration im Plasma von klotho+l+- (helle Balken) und / /oi/?ohm-Mäusen (dunkle Balken) ohne (Kontrolle) und mit NH4CI. * (p<0,05), **(p<0,01 ), *** (p<0,001 ) indiziert einen signifikanten Unterschied zu / /oi/?o+/+-Mäusen; # (p<0,05), ## (p<0,01 ), ### (p<0,001 ) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu unbehandelten / /ofr?ohnn-Mäusen; § (p<0,05), §§ (p<0,01 ), §§§ (p<0,001) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu behandelten klot ohm- Mäusen (ANOVA).
Fig. 1 1 zeigt die Phosphat- (A) (n=5-6), Ca -(B) (n=5-6) und 1 ,25(OH)2D3 (C)
(n=5) und Matrix Gla Protein (MGP) (D) (n=6) Konzentration im Plasma von klotho+,+- (helle Balken) und / /otf?ohm-Mäusen (dunkle Balken) ohne (Kontrolle) und mit Azetazolamid. **(p<0,01), *** (p<0,001 ) zeigt einen signifikanten Unterschied zu /c/of/?o+ +-Mäusen; ## (p<0,01 ), ### (p<0,001 ) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu unbehandelten /c/offrohm-Mäusen; §§§ (p<0,001 ) zeigt statistisch signifikanten Unterschied zu behandelten Wotf?ohm-Mäusen (ANOVA).
Fig. 12 zeigt die Histologie von Trachea, Lunge, Niere, Magen und Gefäßen aus
/ /of/70hm-Mäusen ohne (unbehandelt) oder mit (behandelt) (NH4)2S0 - Behandlung.
Fig. 13 zeigt die Histologie von Gefäßen aus /c/of/70hm-Mäusen ohne (unbehandelt) Behandlung, mit (behandelt) (NH4)2S04- oder mit NH4N03- Behandlung.
Fig. 14 zeigt die Histologie von Trachea, Lunge, Niere, Magen und Gefäßen aus
/ /o/ 70hm-Mäusen ohne (unbehandelt) oder mit (behandelt) NH4N03- Behandlung.
Fig. 15 zeigt die Histologie von Herzen aus / /of/70hm-Mäusen ohne (unbehandelt) Behandlung und mit NH N03-Behandlung
Fig. 16 zeigt die Histologie von Trachea, Lunge, Niere, Magen und Gefäßen aus
/ /otf?ohm-Mäusen ohne (unbehandelt) oder mit (behandelt) NH4CI- Behandlung. Fig. 17 zeigt die Histologie von Trachea, Lunge, Niere, Magen und Gefäßen aus / /oi/?ohm-Mäusen ohne (unbehandelt) oder mit (behandelt) Aze- tazolamid-Behandlung.
Fig. 18 zeigt die Histologie von Trachea, Lunge, Niere, Magen und Gefäßen aus
/ /oi/?ohm-Mäusen ohne (unbehandelt) oder mit (behandelt) Chloroquin- diphosphat-Behandlung.
Fig. 19 zeigt das Überleben von klothohm -Mäusen ohne (jeweils schwarze Kreise) oder (A) unter Behandlung mit (NH4)2S04 (weiße Kreise) oder mit NH4N03 (weiße Quadrate) (n=9-14). (p<0,001 ; Wilcoxon, Log-Rang), (B) unter Behandlung mit NH4CI (weiße Kreise) (n=14-16). (p<0,001 ; Wilcoxon, Log-Rang), (C) unter Behandlung mit Acetazolamid (weiße Kreise)(n=8-10). (p<0,001 ; Wilcoxon, Log-Rang), (D) unter Behandlung mit Chloroquindiphosphat (weiße Kreise) (n=8-12). (p<0,05; Wilcoxon, Log-Rang).
Material und Methoden
Folgende experimentelle Arbeiten wurden durchgeführt: Primäre humane glatte Muskelzellen von Aorten (HAoSMCs, Invitrogen) wurden in Waymouth's MB 752/1 Medium und Ham's F-12 nutrient mixture (1 :1 , Gibco, Life Technologies) mit Zugabe von 10% FBS (Gibco, Life Technologies) und 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (Gibco, Life Technologies) kultiviert. In allen Experimenten wurden konfluente HAoSMCs, Passagen 4 bis 1 1 verwendet. Die Zellen wurden 24 Stunden mit 2 mM ß-Glycerophosphat (Sigma-Aldrich) mit oder ohne gleichzeitige Zugabe von 0,5 mM Ammoniumsalzen oder 100 μΜ Chloroquindiphosphat behandelt (Sigma-Aldrich). Quantitative RT-PCR (real time Polymerase chain reaction) wurde, wie früher beschrieben (Voelkl J, Alesutan I, Leibrock CB, Quintanilla-Martinez L, Kuhn V, Feger M, Mia S, Ahmed MS, Rosenblatt KP, Kuro O, Lang F: Spironolactone ameliorates PIT1 -dependent vascular osteoinduction in klotho- hypomorphic mice. J Clin Invest 2013; Feb 1 ;123(2):812-22), durchgeführt. Dazu wurden HAoSMCs gewaschen und totale RNA mit Hilfe von Trifast Reagent (Peqlab) nach den Herstellerangaben isoliert. Für die in vivo Experimente wurden Aorten von lotho - Mäusen und / /oi/?ohm-Mäusen jeweils mit und ohne Behandlung mit NH4CI entnommen und schockgefroren. Die totale RNA wurde ebenfalls mit Trifast Reagent (Peqlab) entsprechend der Anweisung des Herstellers isoliert. Jeweils 2 μg RNA der humanen sowie der murinen Proben wurden für die Reverse Transkription der RNA mit oligo(dT)12-i8 Primern (Invitrogen) und SuperScriptlll Reverse Transcriptase (Invitrogen) eingesetzt. Quantitative real-time PCR wurde mit einem iCycler iQ™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories) und iQ™ Sybr Green Supermix (Bio-Rad Laboratories) nach Herstellerangaben durchgeführt. Die folgenden Primer wurden verwendet (5'— >3' Orientierung):
Humane Primer:
TN alkaline Phosphatase fw: G G GACTG GTACTC AG ACAACG (SEQ ID Nr. 1 );
TN alkaline Phosphatase rev: GTAGGCGATGTCCTTACAGCC (SEQ ID Nr. 2);
RUNX2 fw: GGAAGGGCTTGATTGACGTG (SEQ ID Nr. 3);
RUNX2 rev: CAGAACCAAACATAGCACTGACT (SEQ ID Nr. 4);
TGFB1 fw: CAATTCCTGGCGATACCTCAG (SEQ ID Nr. 5);
TGFB1 rev: GCACAACTCCGGTGACATCAA (SEQ ID Nr. 6).
GAPDH fw: GAGTCAACGGATTTGGTCGT (SEQ ID Nr. 7);
GAPDH rev: GACAAGCTTCCCGTTCTCAG (SEQ ID Nr. 8);
NFA 75 fw: GGGTCAAACGACGAGATTGTG (SEQ ID Nr. 9);
NFAT5 rev: GTCCGTGGTAAGCTGAGAAAG (SEQ ID Nr. 10);
SOX9 fw: AGCGAACGCACATCAAGAC (SEQ ID Nr. 1 1 );
SOX9 rev: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG (SEQ ID Nr. 12).
Murine Primer:
Nfat51w: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG (SEQ ID Nr. 13);
Nfat5 rev: CTG GTG CTCATGTTACTG AAGTT (SEQ ID Nr. 14);
Gapdh lw AGGTCGGTGTGAACGGATTTG (SEQ ID Nr. 15);
Gapdh rev: TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA (SEQ ID Nr. 16). [0041] Die Spezifität der PCR Produkte wurde durch Schmelzkurvenanalyse und Agarose Gel Elektrophorese überprüft. Alle PCRs wurden jeweils zweimal durchgeführt und die Vielfachen der mRNA Menge durch die 2_ΔΔα Methode mit GAPDH als interne Referenz errechnet.
[0042] Sämtliche Tierexperimente wurden nach den Vorgaben des deutschen Tierschutzgesetzes durchgeführt und waren von den lokalen Behörden genehmigt.
[0043] Männliche und weibliche hypomorphe / /oi/?o-Mäuse (klotho m) wurden mit männlichen und weiblichen Wildtypmäusen (klotho+/+) verglichen. Der Ursprung der Mäuse, die Züchtung und die Genotypisierung sind im Stand der Technik beschrieben; vgl. Kuro-o et al. (1997), Mutation of the mouse klotho gene leads to a Syndrome resem- bling ageing, Nature 390:45-51. Durch wiederholte Rückkreuzungen (> 9 Generationen) mit Tieren des 129/Sv-lnzuchtstammes wurden kongene Stämme der / /oi/?ohm-Mäuse hergestellt und in dieser Studie verwendet. Die Mäuse hatten beliebigen Zugang zu Wasser oder einer wässrigen Lösung von (NH4)2S04 (0,14M), NH4CI (0,28M), NH4N03 (0,28M), Acetazolamid (800mg/l) und Chloroquindiphosphat (0,288mg/ml) und wurden mit Kontrollfutter (Sniff, Soest, Deutschland) gefüttert. Die Behandlungen mit NH4CI (0,28M) oder Acetazolamid (800mg/l) begannen mit der Paarung der parentalen Generation und wurden über die Schwangerschaft bis zur Tötung der Nachkommen fortgeführt.
1 .2 Blutchemie
[0044] Zur Blutentnahme wurden die Mäuse mit Diethylether (Roth, Karlsruhe, Deutschland) anästhesiert und durch Punktieren des retro-orbitalen Plexus wurden Blutproben von 50 bis 200 μΙ in Kapillaren, die Heparin enthielten, entnommen. Die Phosphat- und Calciumkonzentrationen im Plasma wurden unter Verwendung einer photometrischen Methode (FUJI FDC 3500i, Sysmex, Nordstedt, Deutschland) bestimmt. Die FGF23- und PTH-Konzentrationen im Plasma wurden unter Verwendung kommerzieller ELISA-Kits (FGF23: ImmunDiagnostics, Boston, USA; PTH: Immunotopics, San demente, USA, MPG: Cloud-Clone Corporation, Houston, USA) bestimmt. Die Messung der Konzentration von Caicitriol [1 ,25(OH)-Vitamin D3] im Plasma erfolgte ebenfalls unter Verwendung eines kommerziellen ELISA-Kits (IDS, Boldon, Vereinigtes Königreich). Die Ammoniakkonzentration wurde enzymatisch mit Hilfe von Glutamatdehydrogenase mit NADPH als Kofaktor gemessen. Die Auswertung erfolgte ebenfalls mit einer photometrischen Methode (ADVIA 1650 analyser, Siemens, Fernwald, Germany).
1 .3 Histologie
[0045] Zur Untersuchung der Trachea, Lunge, Niere, Herz, des Magens und der Gefäße wurden entsprechende Gewebe aus männlichen / /oi/?o+/+-Mäusen (Alter: 8 Wochen) und männlichen / /oi/?ohm-Mäusen (Alter: 8 Wochen) entnommen, ohne und mit Behandlung wässriger Lösungen aus (NH4)2S04 (0.14M), NH4CI (0,28M), NH4N03 (0,28M) und Chloroquin (0,288mg/ml), oder in weiblichen Tieren ohne und mit Ace- tazolamid-Behandlung (800 mg/l in Trinkwasser) in Paraffin eingebettet, in Scheiben von 2 bis 3 μηη geschnitten und mit H&E und von Kossa gefärbt; vgl. Mossbrugger et al.
(2007), Standardized morphological phenotyping of mouse models of human diseases within the German Mouse Clinic, Verh. Dtsch. Ges. Pathol. 91 :98-103.
1 .4 Statistik
[0046] Die Daten werden als Mittelwerte ± SEM angegeben, wobei n die Anzahl von unabhängigen Experimenten darstellt. Sämtliche Daten wurden auf Signifikanz unter Verwendung von ANOVA oder des gepaarten oder ungepaarten Student t-Tests untersucht. Für die Experimente zur Lebensdauer wurde SAS Jmp Version 8.0.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, Vereinigte Staaten von Amerika) verwendet. Ausschließlich Ergebnisse mit p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. a. Ergebnisse
[0047] klotho ist ein Transmembranprotein, das verwandt ist mit der ß- Glucuronidase. Eine verminderte Produktion dieses Proteins wurde in Patienten mit chronischem Nierenversagen beobachtet, was häufig mit degenerativen Prozessen wie der Arteriosklerose, Osteoporose und Hautatrophie einhergeht. Mutationen in diesem Protein konnten mit Altersprozessen in Zusammenhang gebracht werden.
[0048] Im untersuchten Mausmodell ist die / /oi/?o-Expression durch einen Defekt im klotho-Gen massiv herabgesetzt. Betroffene Mäuse werden als hypomorphe Mäuse bezeichnet. Der Mangel an klotho führt zu einem Syndrom, das dem menschlichen Altern ähnelt. Im Einzelnen wird bei diesen Tieren (beschleunigtes) Auftreten von Gewebe- und/oder Gefäßkalzifizierung, Arteriosklerose, Lungenemphysem, Hautatrophie, Muskelschwäche, Immunabwehrschwäche, Infertilität, Kyphose, gestörter CaP04- Metabolismus, Osteoporose, Immunschwäche (Thymus-Rückbildung), Hörverlust und Neurodegeneration beobachtet. Die betroffenen Tiere haben ferner eine deutlich verminderte Lebenserwartung und sind unfruchtbar.
[0049] In der Fig. 1 ist die Expression von TGFßl mRNA in humanen glatten Aortenmuskelzellen (HAoSMCs = human aortic smooth muscle cells) dargestellt. Die Zellen wurden mit 2 mM ß-Glycerophosphat behandelt, um die osteogene Signaltransduk- tion zu stimulieren. Die erhöhte Phosphatkonzentration führte zu einem signifikanten Anstieg der TGFßl mRNA Expression. Dieser Anstieg konnte durch den Zusatz verschiedener Ammoniumsalze (0,5 mM) abgeschwächt (Ammoniumlaktat, Ammoniumzitrat, Ammoniumsulfat) oder sogar verhindert werden (Ammniumchlorid, Ammoniumnitrat).
[0050] In der Fig. 2 ist die Expression von Runx2 mRNA in humanen glatten Aortenmuskelzellen (HAoSMCs = human aortic smooth muscle cells) gezeigt. Auch hier führte eine Steigerung der Phosphatkonzentration durch Zugabe von 2mM ß- Glycerophosphat zu einer erhöhten Expression des Transkriptionsfaktors, die wiederum durch Zugabe von Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat sowie Ammoniumsulfat unterdrückt werden konnte,
[0051] Des Weiteren wurde die Expression der alkalischen Phosphatase (ALP) in humanen glatten Aortenmuskelzellen (HAoSMCs = human aortic smooth muscle cells) untersucht (Fig. 3). Die Zugabe von 2mM ß-Glycerophosphat führte wiederum zu erhöhter ALP mRNA Expression. Fig. 3A zeigt die Unterdrückung des Expressionsanstiegs durch Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat und Ammoniumsulfat. Fig. 3B zeigt die Unterdrückung des ALP mRNA Expressionsanstiegs durch Chloroquin (100μΜ).
[0052] In der Fig. 4 wird gezeigt, dass die Expression des Transkriptionsfaktors NFAT5 in Aorten von klothohm-Mäusen deutlich erhöht ist gegenüber den klotho+/+- Mäusen. Behandlung mit NH4CI (0,28M) führt zu einer Normalisierung der Transkriptionslevel.
[0053] Fig. 5 zeigt die Transkriptionslevel von NFAT5 und SOX9 in humanen glatten Aortenmuskelzellen (HAoSMCs = human aortic smooth muscle cells). Stimulation mit 2 mM ß-Glycerophosphat erhöhte die Transkriptionslevel, während gleichzeitige Behandlung mit NH4CI die Expression wieder reduzierte.
[0054] Fig. 6 zeigt die Transkriptionslevel von NFAT5, SOX9, Runx2 und ALP in humanen glatten Aortenmuskelzellen nach Transfektion mit NFAT5. Die Stimulation der Zellen mit 2 mM ß-Glycerophosphat führte abermals zu einer Erhöhung der jeweiligen Transkriptionslevel. Während eine gleichzeitige Behandlung mit NH4CI die Expression der jeweiligen Gene der mit leerem Vektor transfizierten Zellen wieder auf ein normales Niveau sinken ließ, blieb die Expression in den mit NFAT5 transfizierten Zellen hoch.
[0055] Fig. 7 zeigt den Anstieg der Transkriptionslevel von NFAT5 in humanen glatten Aortenmuskelzellen unter Behandlung mit TGF beta sowie 2mM ß- Glycerophosphat. Während eine Behandlung der Zellen mit NH4CI den durch die Behandlung mit 2 mM ß-Glycerophosphat ausgelösten Anstieg der NFAT5 Transkription rückgängig machen konnte war die Expression bei gleichzeitiger Behandlung mit TGF beta nach wie vor signifikant erhöht.
[0056] In der Fig. 8 sind die deutlichen Wachstumsdefizite unbehandelter hy- pomorpher / /oi/?o-Mäuse (klotho m) im Vergleich zu ihren Wildtypwurfgeschwistern (klotho+/+) dargestellt. Das Wachstumsdefizit der / /offrc ^-Mäuse konnte durch eine Behandlung mit NH4CI nahezu vollständig aufgehoben werden (klotho m NH4CI). Wildtypmäuse zeigten auf ein Behandlung mit NH4CI keine Wachstumsstimulation (klotho+/+ NH4CI). Wie aus Fig. 8 ersichtlich, ist das Körpergewicht von unbehandelten klotho - Mäusen (Kontrolle) signifikant niedriger als das von unbehandelten / /oi/?o+/+-Mäusen. In mit NH4CI behandelten / /oi/?ohm-Mäusen konnte die Gewichtsdefizienz nahezu vollständig aufgehoben werden (B).
[0057] Wie in der nachfolgenden Tabelle dargestellt, war der pH-Wert des Blutes von unbehandelten / /oi/?ohm-Mäusen signifkant niedriger als von unbehandelten / /oi/?o+/+-Mäusen. In / /oi/?o+/+-Mäusen führte die Verabreichung von NH4CI tendenziell zu einer Abnahme des pH-Wertes im Blut, die jedoch keine statistische Signifikanz erreichte. Dementsprechend führte auch eine Behandlung von / /oi/?ohm-Mäusen mit NH4CI zu keiner signifikanten Verstärkung der Azidose (Tab. 1 ).
Tabelle 1 : pH-Wert im Blut von Wildtypmäusen (klotho ) und hypomorphen / /ofho-Mäusen (klotho m), denen entweder Wasser oder wässrige NhUCI-Lösung (15 g/l) verabreicht wurde (arithmetische Mittel + SEM, n = 4, * p < 0,05 indiziert statistisch signifikante Unterschiede zu wassertrinkenden / /of 70+/+-Tieren).
[0058] Die Behandlung von klotho -Mäusen mit Azetazolamid führte ebenfalls zu einer Zunahme von Gewicht und Größe der Tiere. Wie aus Fig. 9A ersichtlich ist, konnte das Wachstumsdefizit durch die Behandlung nicht vollständig ausgeglichen werden. Das Körpergewicht, dargestellt in Fig. 9B konnte zwar ebenfalls durch Azetazolamid gesteigert werden, jedoch waren die Tiere nach wie vor signifikant kleiner als / /of/70+/+-Mäuse.
[0059] Wie in Fig. 10A dargestellt, führte die Behandlung der Mäuse mit Ammoniumchlorid sowohl bei / /oi/?ohm-Mäusen als auch bei / /oi/?o+/+-Mäusen zu einer signifikanten Erhöhung der Plasmakonzentrationen von Ammoniak. Fig. 10B zeigt die Plasmaphosphatspiegel der Tiere, die bei / /oi/?ohm-Mäusen signifikant höher als bei / /oi/?o+/+-Mäusen waren. Eine Behandlung mit NH4CI veränderte weder die Plasmaphos- phatspiegel von klotho+/+- noch die von / /oi/?ohm-Mäusen. Wie in Fig. 10C gezeigt, waren die Plasmakonzentrationen von Ca++ in unbehandelten / /oi/?ohm-Mäusen signifikant höher als in / /oi/?o+/+-Mäusen. Die NH4CI-Behandlung führte tendenziell zu einer Abnahme der Ca++-Konzentrationen im Plasma von / /oi/?ohm-Mäusen, die jedoch keine statistische Signifikanz erreichte. Ebenfalls in Fig. 10 sind die Plasmakonzentrationen von 1 ,25 (OH)2D3 (Caicitriol), FGF23 und Parathormon dargestellt. Die Konzentrationen von 1 ,25 (OH)2D3 und FGF23 waren signifikant höher, die von Parathormon signifikant niedriger in / /of/70hm-Mäusen als in / /oi/?o+/+-Mäusen. Die Behandlung von / /oi/?ohm-Mäusen mit NH4CI führte zu keiner signifikanten Änderung der Hormonkonzentrationen (Fig. 10D-F). Dementsprechend verblieben die Plasmakonzentrationen von Caicitriol bzw. 1 ,25 (OH)2D3 und von FGF23 auch nach NH4CI-Behandlung signifikant höher in / /oi/?ohm-Mäusen als in / /oi/?o+/+-Mäusen. Zudem weisen / /oi/?ohm-Mäuse eine signifikant niedrigere Konzentration von Matrix Gla Protein (MGP) im Plasma auf die durch die Behandlung mit NH4CI normalisiert werden konnte (Fig. 10G).
[0060] In Fig. 1 1 sind die Plasmakonzentrationen von Ca++, Phosphat und 1 ,25 (OH)2D3 von / /oi/?o+/+-Mäusen und / /oi/?ohm-Mäusen jeweils mit und ohne Behandlung mit Azetazolamid dargestellt. Dabei wurde weder die Konzentration von 1 ,25 (OH)2D3 noch die von Phosphat durch die Behandlung beeinflusst. Auch der Calciumspiegel der behandelten / /oi/?ohm-Mäuse war nach wie vor leicht erhöht, zeigte jedoch weder zu den unbehandelten / /oi/?ohm-Mäusen noch zu den / /oi/?o+/+-Mäusen einen signifikanten Unterschied. Die Konzentrationen von Matrix Gla Protein (MGP) im Plasma der Tiere konnten auch durch die Behandlung mit Acetazolamid vollständig normalisiert werden.
[0061] Wie in den Fig. 12-18 gezeigt, werden in / /oi/?ohm-Mäusen mit einem Alter von 8 Wochen starke Kalzifizierungen in sämtlichen analysierten Geweben beobachtet, wie bspw. in der Trachea, Lunge, Niere, dem Magen und den Gefäßgeweben. Die Kalzifizierung in / /oi/?ohm-Mäusen konnte durch eine Behandlung mit (NH4)2S04 (Fig. 12, 13), NH4N03 (Fig. 13, 14, 15) und NH4CI (Fig. 16) stark reduziert werden.
[0062] Die Fig. 17 zeigt ebenfalls histologische Schnitte ausgewählter Organe von / /oi/?ohm-Mäusen. Die Behandlung der Tiere mit Acetazolamid führte ebenfalls zu einer deutlichen Reduktion der Kalzifizierungen in den analysierten Geweben. [0063] Die Fig. 18 zeigt histologische Schnitte ausgewählter Organe von / /oi/?ohm-Mäusen und / /oi/?ohm-Mäusen unter Behandlung mit Chloroquindiphosphat. Die Behandlung der Tiere mit dem Chloroquinsalz führte ebenfalls zu einer deutlichen Reduktion der Kalzifizierungen in den analysierten Geweben.
[0064] Wie in der Fig. 19 dargestellt, führt die Behandlung von / /oi/?ohm-Mäusen mit (NH4)2S04, NH4CI, NH4NO3, Azetazolamid oder Chloroquin zu einer drastischen Verlängerung der Lebensspanne. Im Vergleich von unbehandelten / /oi/?ohm-Mäusen, die im Durchschnitt im Alter von 66 Tagen verstarben, konnte die Behandlung der Tiere mit (NH4)2S04 die durchschnittliche Lebenserwartung auf 129 Tage verlängern, die Behandlung mit NH4NO3 auf durchschnittlich 1 12 Tage (Fig. 19A) (n=9-14). Auch die Behandlung mit NH4CI konnte in einem weiteren Experiment die Lebensdauer der Tiere deutlich verlängern. Während alle klothohm-Mäuse (n = 16) nach 1 10 Tagen starben, überlebten bis zu diesem Zeitpunkt sämtliche der mit NH4CI behandelten Mäuse (n = 14) (Fig. 19A). Unbehandelte klothohm-Mäuse (n = 10) hatten in diesem Experiment hingegen eine durchschnittliche Lebensdauer von 78 Tagen. Auch Azetazolamid zeigte einen starken Einfluss auf die Lebensdauer der Tiere (Fig. 19B), wenngleich auch nicht so ausgeprägt wie die Behandlung mit NH4CI. Die durchschnittliche Lebenserwartung der mit Azetazolamid behandelten Tiere lag bei 220 Tagen. Die Tiere der Kontrollgruppe (n= 10) waren hier nach 90 Tagen verstorben. Zu diesem Zeitpunkt waren noch alle mit Azetazolamid behandelten Tiere am Leben. Es wurde des Weiteren der Einfluss von Chloroquin auf die Lebensspanne von / /oi/?ohm-Mäusen untersucht. Die durchschnittliche Lebenserwartung der klothohm-Mäuse lag hier bei 69 Tagen, während die durchschnittliche Lebenserwartung der klothohm-Mäuse unter Chloroquindiphosphat-Behandlung auf 90 Tage anstieg (Fig. 19D).
3. Fazit
[0065] Die Erfinder stellen mit Ammoniumsulphat, Ammoniumchlorid (NH4CI), Acetazolamid, Chloroquin, Ammoniumnitrat, Ammoniumzitrat und Ammoniumlaktat, Substanzen bereit, die geeignet sind, um Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung zu verhindern und das Eintreten von altersassoziierten Erkrankungen zu verzögern und damit die Lebensdauer eines Lebewesens zu verlängern. Dies wird zum einen durch den Einfluss auf die Expression von Kalzifizierungs- und Fibrosierungsmarkern in der Zellkultur, zum anderen durch die beeindruckenden Effekte von Ammoniumchlorid und Ace- tazolamid auf ein etabliertes Tiermodell demonstriert. Die entsprechend behandelten Tiere zeigen deutlich verminderte Alterssyndrome, eindrucksvoll veranschaulicht an der Gewebe- und Gefäßkalzifizierung, und leben deutlich länger als unbehandelte Tiere.

Claims

Patentansprüche
1 . Verwendung einer Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Ammo- niumsulphat, Ammoniumchlorid, Acetazolamid, Chloroquin, Ammoniumnitrat, Am- moniumzitrat und Ammoniumlaktat zur Minderung von Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung sowie zur Verzögerung des Eintretens altersassoziierter Erkrankungen bei einem Lebewesen.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die altersassoziierte Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Arteriosklerose, Lungenemphysem, Hautatrophie, Muskelschwäche, Immunabwehrschwäche, Infertilität, Kyphose, gestörter CaP04-Metabolismus, Osteoporose, Immunschwäche (Thymus- rückbildung), Neurodegeneration.
3. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebsfibrosierung auf einer Erkrankung basiert, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Niereninsuffizienz, Leberzirrhose, Morbus Crohn, fibrosierende Pankreatitis, Lungenfibrose, Herzinsuffizienz, Narbenbildung, Fibrosierung bei Peritonealdialyse, Alzheimer'sche Erkrankung.
4. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz als Wirkstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung eingesetzt wird.
5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung für eine Applikation ausgebildet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: oral, rektal, parenteral, intraperitoneal, lokal, transdermal.
6. Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung in einer Form ausgebildet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Pulver, Tablette, Saft, Tropfen, Dialyseflüssigkeit, Kap- sei, Zäpfchen, Lösung, Injektionslösung, Aerosol, Salbe, Spülung, Pflaster, Pellet, Dragee, modifiziert freisetzende Darreichungsform.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz als Zusatzstoff in einem Lebensmittelprodukt eingesetzt wird/werden.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Minderung von Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung, zur Verzögerung des Eintretens altersassoziierter Erkrankungen eines Lebewesens, das folgende Schritte aufweist:
1 . Bereitstellung eines Wirkstoffes, und
2. Formulierung des Wirkstoffes in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger zum Erhalt der pharmazeutischen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Ammoniumsulphat, Ammoniumchlorid, Acetazolamid, Chloroquin, Ammoniumnitrat, Ammoniumzitratund Ammoniumlaktat.
Verfahren zur Herstellung eines Lebensmittelproduktes zur Minderung von Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung, zur Verzögerung des Eintretens altersassoziierter Erkrankungen eines Lebewesens, das folgende Schritte aufweist:
1 . Bereitstellung eines Zusatzstoffes, und
2. Einbringen des Zusatzstoffes in ein Lebensmittel zum Erhalt des Lebensmittelproduktes, dadurch gekennzeichnet, dass der Zusatzstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Ammoniumsulphat, Ammoniumchlorid, Acetazolamid, Chloroquin, Ammoniumnitrat, Ammoniumzitratund Ammoniumlaktat, ,.
10. Verfahren zur Minderung von Gewebskalzifizierung und Gewebsfibrosierung, zur Verzögerung des Eintretens mehrerer altersassoziierter Erkrankungen eines Lebewesens, das die Verabreichung einer Substanz an das Lebewesen umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Ammoniumsulphat, Ammoniumchlorid, Acetazolamid, Chloroquin, Ammoniumnitrat, Ammoniumzitrat und Ammoniumlaktat.
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