DE69715449T2

DE69715449T2 - Druckvermittelte, intrazellulaere verabreichung von molekuelen oder mikropartikeln

Info

Publication number: DE69715449T2
Application number: DE69715449T
Authority: DE
Inventors: J. Dzau; H. Gibbons; J. Mann
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1996-11-07
Filing date: 1997-11-07
Publication date: 2003-07-31
Anticipated expiration: 2017-11-08
Also published as: EP0944715B1; KR20000053164A; CA2271244C; HK1022711A1; IL129808A; CN1244213A; PT944715E; EP1279412A3; JP2001505419A; CN1109749C; DK0944715T3; BR9713334A; EP0944715A1; JP2008054681A; JP2008237221A; CA2271244A1; EP1279412A2; US5922687A; WO1998020109A1; DE69715449D1

Description

Hinterrund der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die erleichterte Aufnahme von extrazellulären Substanzen durch lebende Zellen.
Die Untersuchung der zellulären und molekularen Biologie hat die Existenz einer komplexen physikalischen und biochemischen Umwelt innerhalb der Membranen von lebenden Zellen aufgeklärt. Diese Membrane stellen eine ausgeklügelte, halbdurchlässige Barriere dar, die spezialisierte Funktionen in unterschiedlichen Zelltypen ausführt; die Membranen aller lebenden Zellen bestehen aus Lipid-Doppelschichten, die dazu dienen, mikroskopische, wässrige. Räume zu separieren, in denen das Leben abläuft. Alle Zellen regulieren die molekulare Zusammensetzung der Intrazellularräume, entweder durch passiven Ausschluss von großen und/oder lipophoben Substanzen, die die Lipid-Doppelschicht der Zellbegrenzung nicht durchdringen können oder durch aktiv kontrollierte, bidirektionale Bewegung von Molekülen oder Partikeln über die Zellmembran durch spezialisierte Proteine. Einige dieser Proteine können sich zusammenlagern, um Poren oder Kanäle zu bilden, um entweder den allgemeinen Durchtritt in die Zelle bereit zu stellen, oder den Eintritt nur spezifischen Elementen zu erlauben.
WO 96/34967 ist ein Dokument aus dem Stand der Technik nach Art. 54(3) und (4) EPÜ und offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verabreichung von Nukleotiden in lebende Zellen.
Die Einführung von Atomen, Molekülen und mikroskopischen Partikeln in Zellen ist ein unverzichtbares Werkzeug von Biologen und Medizinern geworden und bereitet die Grundlage für ihre Fähigkeit, zelluläre Lebensvorgänge auseinander zu nehmen und pharmakologische Strategien anzuraten, um Krankheiten zu verhindern, zu diagnostizieren oder zu besiegen. Die sorgfältige funktionelle Natur der Zellmembran stellt häufig eine große Herausforderung zur Verabreichung von geladenen oder großen Molekülen dar und hat somit die potentiellen Verwendungen solcher Materialien in intrazellulären Applikationen beschränkt. Zusätzlich können viele komplexe Substanzen von Zellen nur durch einen Prozess der Zellmembraneinstülpung, wie Endozytose oder Pinozytose, aufgenommen werden. In den meisten Fällen fusionieren dann die so gebildeten endozytotischen Vesikel, die die vorher extrazelluläre Substanz enthalten, mit Lysosomen, die scharfe, enzymatische Umgebungen enthalten, was in der Verdauung der eingeschlossenen Substanz resultiert.

Zusammenfassung der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft die Verabreichung einer Substanz in die extrazelluläre Umgebung einer lebenden Zelle oder Zellen, die Erzeugung eines abgeschlossenen Raums um die Zelle oder Zellen und die Aufrechterhaltung eines erhöhten Inkubationsdrucks innerhalb des abgeschlossenen Raums, der ausreicht, um die Aufnähme der Substanz durch die Zelle oder Zellen zu verstärken. Die Substanz kann in einem Größenbereich von einem kleinen Molekül bis zu einem Mikropartikel liegen und kann eine Reihe von Wirkungen auf oder in eine Reihe von Funktionen in den Zellen ausüben, von denen es aufgenommen wird. Zum Beispiel kann die Substanz ein kleines Molekül (z. B. ein Medikament), ein Zucker, eine Fettsäure oder ein Fettsäurederivat sein oder ein Protein (z. B. ein Antikörper, ein Enzym oder ein Hormon). Die Zellen können in vitro existieren, in Gewebe- oder Organkultur.
Entsprechend ist ein Zweck dieser Erfindung, ein größeres Ausmaß der intrazellulären Aufnahme von mikroskopischen oder molekularen Spezies zu induzieren, als sonst innerhalb einer Zielzelle oder Zellpopulation erwartet oder verwirklicht werden könnte. Dieses Verfahren kann somit verwendet werden, um die intrazelluläre Verabreichung von größeren Mengen einer Substanz zu erleichtern, die normalerweise von den Zellen nur in kleineren Mengen aufgenommen werden würde, oder die Aufnahme von einer Substanz durch eine Zelle zu erlauben, die sonst durch die Zellmembran in der extrazellulären Umgebung ausgeschlossen bleiben würde. Diese Erfindung kann auch eine wirksamere Aufnahme durch einen größeren prozentualen Anteil von Zellen in der Zielpopulation ergeben und es erlauben, auf spezifische Organe oder Gewebe abzuzielen. Die intrazelluläre Verabreichung, die unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgeführt wird, ist auch vorteilhaft, da sie keine Gewebeschädigung (z. B. Aufblähung) oder ein Trauma verursacht und potentiell nicht toxisch für die Zellen ist. Weiterhin bietet in vielen Fällen das erfindungsgemäße intrazelluläre Verabreichungsverfahren ein Mittel zur Verabreichung an das Zellzytoplasma, ohne dass es die lysosomale Kompartimentierung mit sich bringt, und bietet dabei einen Schutz vor dem Abbau der verabreichten Substanz durch lysosomale Enzyme. Dieses Verfahren kann auch die Bewegung von Substanzen über intrazelluläre Barrieren verstärken, in Räume, wie den Zellnukleus.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden offensichtlich von der detaillierten Beschreibung, den Abbildungen und den Ansprüchen werden.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1-A stellt ein Verabreichungssystem der vorliegenden Erfindung dar. Abb. 1-B zeigt das System von Abb. 1-A angeschlossen an ein freies Ende eines Blutgefäßes vor der Verabreichung einer Lösung; die eine Substanz enthält, die in das Blutgefäß verabreicht werden soll, Abb. 1-C zeigt das System und Blutgefäß von Abb. 1-B während der Verabreichung einer Lösung, die eine Substanz enthält; die in das Endothelium des Blutgefäßes verabreicht werden soll. Abb. 1-C' zeigt das System und Blutgefäß von Abb. 1-B während der Verabreichung einer Lösung, die eine Substanz enthält, die in das Endothelium und an die äußere Oberfläche des Blutgefäßes verabreicht werden soll.
Abb. 2 zeigt die Verabreichung an einen Teil eines Blutgefäßes, das einen Teil der Begrenzung des unter Druck stehenden, abgeschlossenen Raums festlegt.
Abb. 3A zeigt ein alternatives Verfahren des intrazellulären Verabreichens an ein Blutgefäß. Abb. 3-B zeigt das Blutgefäß von Abb. 3-A, wobei das Blutgefäß mechanisch unter Druck gesetzt wird.
Abb. 4-A zeigt einen Katheter mit zwei Ballons, der dazu angepasst ist, eine Lösung zu verabreichen, die eine Substanz enthält, die in ein Blutgefäß verabreicht werden soll. Abb. 4-B zeigt den Katheter von Abb. 4-A mit den Ballons in aufgeblähtem Zustand. Abb. 4-C zeigt ein Kathetersystem, das einen Ballon und innere Kanäle besitzt, zur Verabreichung einer Lösung, die eine Substanz enthält, die an die Wände eines Blutgefäßes verabreicht werden soll.
Abb. 5-A illustriert die Verabreichung an Blutgefäße in einem Organ. Abb. 5-B zeigt die Verwendung von Ballonkathetern, um ein Organ unter Druck zu setzen.
Abb. 6 zeigt ein Verabreichungssystem, das aus einer Druckkammer besteht.
Abb. 7-A zeigt die Transfektionseffizienz als eine Funktion des verwendeten Drucks für die humane Vena saphena, die entsprechend der vorliegenden Erfindung transfiziert wurde. Abb. 7-B zeigt die Wirkung einer Hülle, die das Aufblähen verhindert, auf die Transfektionseffizienz für FITC-ODN-transfizierte humane Vena saphena. Abb. 7-C zeigt die Hemmung der IL-6-Proteinherstellung nachfolgend der Transfektion von IL-6-Antisense- ODN in die humane Vena saphena.
Abb. 8-A zeigt die Hemmung der IL-6-mRNA-Herstellung nachfolgend der Transfektion von IL-6-Antisense-ODN in die humane Vena saphena eines ersten Subjekts. Abb. 8-B ist ein Diagramm ähnlich zu dem in Abb. 8-A für ein zweites Subjekt. Abb. 8- C ist ein Diagramm ähnlich zu dem in Abb. 8-A für ein drittes Subjekt.
Abb. 9-A zeigt die Transfektionseffizienz für die In-vivo-Transfektion der Halsschlagader von Kaninchen, gemessen durch Fluoreszenzmikroskopie. Abb. 9-B zeigt die Luziferaseaktivität für Kontroll-, gesunde und atherosklerotische Zellen nachfolgend der In-vitro- Transfektion der Halsschlagader von Kaninchen mit DNA, die für Leuchtkäfer-Luziferase kodiert.
Abb. 10 zeigt die Transfektionseffizienzen für die glatten Gefäßmuskelzellen von Ratten, die in vitro entsprechend einem Verfahren der vorliegenden Erfindung transfiziert wurden.
Abb. 11 zeigt die Luziferaseaktivitäten für Rattennieren, die mit einer Plasmid-DNA durchspült wurden, die das Gen enthält, das für Leuchtkäfer-Luziferase kodiert.
Abb. 12-A zeigt die Wirkung des Druckes auf die Transfektionseffizienz für Aortazellen von Ratten. Abb. 12-B zeigt die Ischämie-induzierte PCNA-Expression in transplantierten Rattenaorten mit und ohne druckvermittelter Transfektion von Antisense-PCNA- ODN. Abb. 12-C zeigt die Ischämie-induzierte cdc2-Kinaseexpression in transplantierten Rattenaorten mit und ohne druckvermittelter Transfektion von Antisense-cdc2-Kinase- ODN. Abb. 12-D zeigt die Verminderung der luminalen Verengung von isotransplantierten, ischämisch-bedingt geschädigten Rattenaorten, die aus der druckvermittelten Transfektion mit Antisense-ODN gegen sowohl PCNA als auch cdc2-Kinase resultiert.
Abb. 13-A zeigt die Transfektionseffizienzen für Rattenherzen, die ex vivo mit FITC- ODN mit und ohne Druck transfiziert wurden. Abb. 13-B zeigt ICAM-1-Expression in transplantierten Rattenherzen mit und ohne druckvermittelter Transfektion von Antisense ICAM-1-ODN. Abb. 13-C zeigt die Induktion von Langzeit-Transplantatakzeptanz durch druckvermittelte Transfektion von transplantierten Rattenherzen mit Antisense-ODN gegen ICAM-1.
Abb. 14-A zeigt die Wanddicken nach 6 Wochen und 6 Monaten nach der Transplantation für unbehandelte Transplantate (Kontrolle) und Transplantate, die entweder mit reversen Antisense-ODN (Kontrolle) oder mit Antisense-ODN gegen sowohl PCNA als auch cdc2- Kinase transfiziert wurden. Abb. 14-B zeigt Ergebnisse ähnlich zu jenen in Abb. 14-A für Venen, die mit einem E2F-Antisense-ODN transfiziert wurden, verglichen zu unbehandelten Transplantaten und Kontrolltransplantaten, die mit einem zufälligen ODN transfiziert wurden.

Detaillierte Beschreibung

Die Substanzarten, die mit dieser Erfindung verwendet werden können, schließen (1) geladene Atome oder Ionen, (2) neutrale oder geladene kleine Moleküle (z. B. Moleküle mit einem Molekulargewicht von ≤1.000), mit der Ausnahme kleiner Nukleinsäuren, (3) große Moleküle (z. B. Moleküle mit einem Molekulargewicht von 1.000), im Speziellen Proteine und Peptide mit der Ausnahme von Nukleinsäuren, (4) Polymere und Filamente (im Allgemeinen ≤10 um in der größten Ausdehnung), (5) anorganische Atome und Moleküle und (6) mikroskopische Partikel (im Allgemeinen < 10 um in der größten Ausdehnung) ein. Diese Substanzen können in die extrazelluläre Umgebung der Zelle verabreicht werden in einem großen Konzentrationsbereich, vorzugsweise, aber nicht beschränkt, von 1 nM bis 1 mM, abhängig vom Typ der Substanz und seiner beabsichtigten Verwendung. Die zu verwendenden exakten Konzentrationen in jeder Anwendung der Erfindung können vom Benutzer bestimmt werden, basierend auf seiner oder ihrer Kenntnis der Chemie, Biochemie oder funktionellen Eigenschaften der zu verabreichenden Substanz. Die Substanz kann in Lösung in der extrazellulären Umgebung existieren oder sie kann eine Suspension oder ein Kolloid umfassen.
Ein versiegelter, abgeschlossener Raum, der das Gewebe und die extrazelluläre Umgebung enthält, wird festgelegt und ein Inkubationsdruck wird innerhalb des versiegelten, abgeschlossenen Raums aufgebaut. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Begrenzung des abgeschlossenen Raums im Wesentlichen durch eine abschließende Vorrichtung festgelegt, so dass das Zielgewebe (Gewebe, das die Zielzelle umfasst) unter isotropem Druck gehalten wird und sich nicht aufbläht oder ein Trauma erleidet. In einer anderen Ausführungsform wird ein Teil der Begrenzung des abgeschlossenen Raums durch ein Gewebe festgelegt. Eine Schutzvorrichtung, wie eine unelastische Hülle, wird anschließend um das Gewebe gelegt, um Aufblähung und Trauma im Gewebe zu verhindern.
Insbesondere in einem Blutgefäß wird ein versiegelter, abgeschlossener Raum vorzugsweise festgelegt zwischen Okklusionen, die durch aufblasbare Ballons oder Abschlussbänder gebildet werden. Eine Lösung, die eine Substanz enthält, die verabreicht werden soll, wird in den abgeschlossenen Raum durch einen Katheter verabreicht, der einen Verabreichungsauslass zwischen den Okklusionen besitzt. Ganz allgemein wird ein abgeschlossener Raum innerhalb eines Organs durch den Aufbau von Okklusionen innerhalb der Kanäle des Organs (z. B. Blutgefäßen) festgelegt, so dass ein Raum innerhalb des Organs unter Druck gesetzt werden kann.
Der verwendete Inkubationsdruck, um die zelluläre Aufnahme zu erleichtern, wird vorzugsweise aufrecht erhalten auf einem vorbestimmten Niveau für eine vorbestimmte Inkubationsdauer. Der Inkubationsdruck hängt von der Verwendung, einschließlich Parametern wie der Inkubationsdauer, dem Gewebetyp und dem zu verabreichenden Molekül ab. Der verwendete Inkubationsdruck kann von z. B. 50 mm Hg bis 5 Atmosphären über dem Umgebungsdruck, z. B. von 300 mm Hg bis 1.500 mm Hg über dem Umgebungsdruck oder von 0 bis 2 Atmosphären über dem Umgebungsdruck reichen; höhere oder niedrigere Drücke können auch verwendet werden, unter der Voraussetzung, dass eine wirksame Verabreichung erzielt wird und dass die Zielzelle oder Zellen keinen dagegen gerichteten unbemerkten Schaden erleidet.
Die verwendete Inkubationsdauer kann variieren, um die zelluläre Aufnahme zu erleichtern, abhängig von Parametern, wie dem Inkubationsdruck, dem Zielgewebetyp, dem zu verabreichenden Molekül und der, erwünschten Dosierung. Die Dauer des Inkubationsdruckes kann reichen z. B. von ungefähr 1 Sekunde bis 4 Stunden. Vorzugsweise ist die Druckdauer zwischen 20 Sekunden und 30 Minuten, bevorzugter zwischen 60 Sekunden und 10 Minuten.
Geeignete Zielgewebe von Säugern schließen Blutgefäßgewebe (insbesondere Venen, die als Implantate in Arterien verwendet werden), Herz, Knochenmark, Bindegewebe, Leber, Niere, Gewebe des Urogenitalsystems, Knochen, Muskeln, Gastrointestinalorgane und endokrine und exokrine Organe ein. Die In-vitro-Verfahren der vorliegenden Erfindung können verwendet werden für Teile eines Organs, für ein gesamtes Organ (z. B. ein Herz). Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung eines Reservoirs und eines Katheters in der Herstellung eines Verabreichungssystems für ein Atom, ein Molekül oder ein Partikel mit der maximalen Ausdehnung von < 10 um in eine lebende Zelle in ein Gewebe in vivo.
Anwendungen der vorliegenden Erfindung schließen auch die Behandlung von Homotransplantaten (Transplantaten, die von einem anderen Subjekt als dem Transplantationspatienten stammen) und Autotransplantaten (Transplantaten, die von dem Transplantationspatienten stammen) ein.
Die Bedingungen für jede Anwendung der Erfindung können bestimmt werden durch Markierung der Substanz mit einer radioaktiven, fluoreszenten oder chemischen Markierung und dem anschließenden Beobachten der Substanz, Beobachten der druckverstärkten Verabreichung über die Markierung. Alternativ kann eine Messung der biologischen Aktivität ausgeführt werden. Auf ähnliche Art und Weise kann die Optimierung der Verabreichungsbedingungen erreicht werden durch die Quantifizierung der Verabreichung eines leicht markierbaren Materials, das chemisch und/oder physikalisch ähnlich zu der erwünschten Substanz ist.
Wie vorstehend diskutiert, ist ein System zur Verabreichung eines Moleküls in eine Zelle unter der Verwendung der In-vitro-Verfahren der Erfindung eine Abschlussvorrichtung zur Festlegung von mindestens einem Teil einer Begrenzung eines versiegelten, abgeschlossenen Raumes und schließt eine Druckvorrichtung zum Aufbau eines Inkubationsdrucks innerhalb des abgeschlossenen Raums ein. Der abgeschlossene Raum enthält die Zielzelle und eine extrazelluläre Umgebung der Zelle. Ein Verabreichungsmittel, wie ein Katheter oder eine Spritze, wird verwendet, um das Molekül in die extrazelluläre Umgebung direkt oder indirekt (z. B. durch intravenöse Injektion) zu verabreichen.
Die Begrenzung des abgeschlossenen Raums wird festgelegt durch das Abschlussmittel und möglicherweise durch das Gewebe. Geeignete Abschlussmittel schließen, abhängig von der Ausführungsform, eine Druckkammer, eine undurchlässige Hülle oder Tasche und eine Verschlussmittel, um einen Durchlass in einem Gewebe zu verschließen, ein. Eine Druckkammer ist besonders geeignet für die Behandlung von Transplantaten oder ganzen Organen, während andere Vorrichtungen gut geeignet sind für die intraoperative Behandlung von Geweben.
In einer Ausführungsform wird die Begrenzung des abgeschlossenen Raums festgelegt durch das Abschlussmittel. Druck wird anschließend gleichförmig von allen Richtungen an das Zielgewebe angelegt und das Zielgewebe wird keinem Risiko, ein Trauma zu erleiden, ausgesetzt. In einer anderen Ausführungsform wird ein Teil der Begrenzung durch ein Gewebe festgelegt (z. B. das Zielgewebe). Das Gewebe, das einen Teil der Begrenzung des abgeschlossenen Raums bildet, wird von nur einer Seite einem Druck unterzogen und kann aufgebläht werden. Eine Schutzvorrichtung, wie eine unelastische Hülle, wird um das Gewebe platziert, um Aufblähung und Trauma im Gewebe zu verhindern. Verfahren und Verabreichungssysteme der Erfindung werden in größerem Detail wie folgt illustriert.
Abb. 1-A bis 1-C' zeigen Verfahren zur unter Druck stehenden Verabreichung von Molekülen an Zellen eines Blutgefäßes. Abb. 1 A ist eine seitliche Ansicht eines Verabreichungssystems 11 gemäß der vorliegenden Erfindung. Das System 11 umfasst ein Reservoir 10, um eine Lösung 40 aufzunehmen, die die zu verabreichende Substanz enthält, und eine Verabreichungsvorrichtung, um die Lösung 40 aus dem Reservoir 10 auszustoßen. Die Verabreichungsvorrichtung umfasst einen Stöpsel 12 und einen Verabreichungsschlauch 14. Gegenüber dem Stöpsel 12 öffnet sich das Reservoir 10 in den Schlauch 14. An den Schlauch 14 sind angebracht, aufgezählt in der Reihenfolge der Nähe zum Reservoir 10, ein Absperrhahn 16, ein Druckmesser 18, eine zurückgezogene Hülle 20 und eine Nut 22. Die Hülle 20 ist vorzugsweise undurchlässig und unelastisch. Die Nut 22 ist neben einem distalen, offenen Ende 30 des Schlauches 14. Der Absperrhahn 16 ist ursprünglich in einer geschlossenen Position, um zu verhindern, dass Lösung 40 aus dem Reservoir 10 in den Schlauch 14 läuft.
Abb. 1-B zeigt ein Blutgefäß 24, das an das System 11 angeschlossen ist. Das offene Ende 30 ist in ein proximales Ende des Blutgefäßes 24 gesteckt. Die Nut 22 passt in das proximale Ende des Gewebes 24. Die Hülle 20 wird herabgezogen, um das Gewebe 24 zu umhüllen. Ein Band oder ein Ligaturfaden 26A wird um die Hülle 20 und das Gewebe 24 an dem Punkt geschlungen, wo sie am Schlauch 14 angebracht sind, um zu verhindern, dass das Gewebe 24 aus dem offenen Ende 30 rutscht. Wenn der Absperrhahn 16 in eine offene Stellung gedreht wird, tritt die Lösung 40 in den Schlauch 14 und die Hülle 20 ein, treibt alle vorhandenen Gase und Flüssigkeiten durch das offene Ende 28 der Hülle 20 aus. Nach dem Austreiben wird ein Abschlussband 26B über das distale offene Ende 28 der Hülle 20 gesetzt, um eine wasserdichte Versiegelung zu bilden, wie gezeigt in den Abb. 1-C und 1-C'. Abb. 1-C zeigt die Verabreichung, die auf das Endothelium des Blutgefäßes 24 gerichtet ist, während Abb. 1-C' die Verabreichung an das Endothelium und die äußere Oberfläche des Blutgefäßes 24 zeigt.
In Abb. 1-C wird ein Abschlussband 26B um die Hülle 20 und das Gewebe 24 gelegt. Das Absperrband 26B verschließt das Blutgefäß 24. Der Absperrhahn 16 wird in seine offene Stellung gedreht und der Stöpsel 12 wird gedrückt, so dass die Lösung 40 in das Gefäß 24 unter einem Verabreichungsdruck verabreicht wird. Der Verabreichungsdruck darf ansteigen, bis ein Inkubationsdruck erreicht wird, und der Absperrhahn wird geschlossen. Das Blutgefäß 24 darf für eine Inkubationsdauer inkubieren, nach der das Abschlussband 26B abgenommen wird, um den Druck zu entlassen (nicht gezeigt).
Die Abgrenzung eines versiegelten, abgeschlossenen Raums wird festgelegt durch die Wände des Gefäßes 24 und durch eine Abschlussvorrichtung. Der versiegelte, abgeschlossene Raum enthält die Ziel-(Endothel)-Zellen des Blutgefäßes 24 und ihre extrazelluläre Umgebung. Wenn der Absperrhahn 16 in einer geschlossenen Stellung ist, umfasst die Abschlussvorrichtung den Schlauch 14, Absperrhahn 16 und den Ligaturfaden 26B. Wenn der Absperrhahn 16 in einer offenen Stellung ist, umfasst die Abschlussvorrichtung den Ligaturfaden 26B, Schlauch 14, Stöpsel 12 und Teile der Wände des Reservoirs 10. Die Abschlussvorrichtung legt mindestens einen Teil der Begrenzung des abgeschlossenen Raums fest.
In der in Abb. 1-C gezeigten Ausführungsform wird ein Teil der Begrenzung des abgeschlossenen Raums durch das Blutgefäß 24 festgelegt. Das Anwenden von Druck nur auf der Innenseite des Blutgefäßes 24 könnte verursachen, dass sich das Blutgefäß 24 aufbläht und ein Trauma erleidet. Die Hülle 20 wirkt als Schutzvorrichtung, verhindert, dass das Blutgefäß 24 sich aufbläht. In einer Anordnung wie jener in Abb. 1-C ist es somit wichtig, dass die Hülle 20 unelastisch ist.
Es ist auch möglich, das Abschlussband 26B nur um die Hülle 20 zu binden, wie gezeigt in Abb. 1-C'. In diesem Fall wird der versiegelte, abgeschlossene Raum, der die Zielzellen des Blutgefäßes 24 und ihre extrazelluläre Umgebung enthält, im Wesentlichen durch eine Abschlussvorrichtung festgelegt. Wenn der Absperrhahn 16 in einer geschlossenen Stellung ist, umfasst die Abschlussvorrichtung die Hülle 20, Schlauch 14, Absperrhahn 16 und Ligaturfaden 26B'. Wenn der Absperrhahn 16 in einer offenen Stellung ist, umfasst die Abschlussvorrichtung die Hülle 20, Schlauch 14, Ligaturfaden 26B', Stöpsel 12 und Teile der Wände des Reservoirs 10.
In der in Abb. 1-C' gezeigten Ausführungsform wird die Begrenzung des abgeschlossenen Raums im Wesentlichen durch eine Abschlussvorrichtung festgelegt. Der Druck um das Blutgefäß 24 ist gleichförmig und somit erleidet das Blutgefäß 24 kein Trauma. Da die Hülle 20 als ein Teil der Abschlussvorrichtung fungiert, ist es wichtig, dass die Hülle 20 undurchlässig ist. Die Hülle 20 braucht jedoch nicht unelastisch sein in der Anordnung von Abb. 1-C', da die Verwendung einer elastischen Hülle nicht zu einem Trauma im Blutgefäß 24 führen würde.
Abb. 2 zeigt die Verabreichung von Molekülen an ein Blutgefäß. Der Schlauch 14 ist in das Lumen eines Gefäßes 224 eingeführt. Eine Hülle 220 umhüllt das Gefäß 224 und ein Verschluss 228 (z. B. eine Hitzeversiegelung) hält die beiden Klappen der Hülle 220 zusammen, um einen Schlauch zu bilden. Die Hülle 220 fungiert als Schutzmittel, die das Aufblähen des Gefäßes 224 verhindert. Zwei Abschlussbänder 226A und 226B sind um die Hülle 220 gebunden. Die Abschlussbänder 226A und 226B wirken als Verschlussmittel, die das Gefäß 224 verschließen. Die Verschlüsse 226A und 226B und die Wände des Gefäßes 224 zwischen den Verschlüssen 226A und 226B legen einen versiegelten, abgeschlossenen Räum 230 fest, der die Zielzellen des Gefäßes 224 und ihre extrazelluäre Umgebung enthält. Die Lösung 40 wird in den versiegelten, abgeschlossenen Raum injiziert und das Segment 230 darf für eine Inkubationsdauer inkubiert werden. Nach der Inkubationsdauer werden die Verschlüsse 226A und 226B entfernt und Blut darf durch das Gefäß 224 fließen.
Abb. 3-A und 3-B zeigen ein Verabreichungssystem, das unterschiedliche Verabreichungs- und Druckelemente besitzt, das verwendet wird, um Moleküle in das Blutgefäß, das in Abb. 2 gezeigt ist, zu verabreichen. Eine starre, schlauchförmige Schutzhülle 250 wird um die Hülle 220 gelegt, und eine Schraubzwinge 252 wird um die Schutzhülle 250 gelegt, wie in Abb. 3-B gezeigt ist. Die Schutzhülle 250 ist im Umfang flexibel, so dass der Durchmesser des Schlauchs, den sie formt, variabel ist, aber sie ist in Längsrichtung starr, so dass, selbst wenn ihr Durchmesser sich verändert, sie noch immer im Wesentlichen schlauchförmig bleibt. Eine Feststellschraube 254 verengt die Schraubzwinge 252, zieht die Schutzhülle 250 eng und erzeugt einen Druck innerhalb des Gefäßes 224. Dieser Druck wird für eine Inkubationsdauer aufrecht erhalten, nach der die Schraube 254 aufgeschraubt wird.
Abb. 4-A bis 4-D zeigen ein Verfahren zur Verabreichung einer Lösung, die eine zu verabreichende Substanz enthält, in das Lumen eines Blutgefäßes 324 durch einen Katheter 314. Der Katheter 314 wird in das Gefäß 324 eingeführt. Der Katheter 314 ist an seinem Ende 316 geschlossen. Katheter 314 hat zwei Ballons 332A und 332B und einen Verabreichungsausgang 330 zwischen den Ballons 332A und 332B. Anfangs sind die Ballons 332A und 332B schlaff, wie in Abb. 4-A gezeigt ist. Nachdem der Katheter 314 in das Gefäß 324 eingeführt ist, werden die Ballons 332A und 332B aufgepumpt, wie in Abb. 3-B gezeigt. Die Ballons 332A und 332B verschließen das Gefäß 324 und erzeugen einen versiegelten, abgeschlossenen Raum 334 innerhalb des Gefäßes 324. Eine Lösung 340, die eine zu verabreichende Substanz enthält, wird verabreicht in den abgeschlossenen Raum 334 durch den Ausgang 330. Die Lösung 340 wird unter Druck verabreicht, so dass der abgeschlossenen Raum 334 unter Druck gesetzt wird. Nach einer Inkubationsdauer wird die Luft aus den Ballons 332A und 332B abgelassen und der abgeschlossenen Zielraum 334 verliert an Druck.
Abb. 4-C zeigt ein alternatives Verabreichungssystem der vorliegenden Erfindung, in dem ein Ballon, der auf einem Katheter platziert ist, Miniaturkanäle besitzt zur Verabreichung einer Lösung, die eine an die Wände des Gefäßes zu verabreichende Substanz enthält. Ein Ballon 432 hat Kanäle 450, die direkt mit Löchern 452 im Segment des Katheters 314 innerhalb des Ballons 432 verbunden sind. Wenn eine unter Druck stehende Lösung 440 durch den Katheter 314 verabreicht wird, tritt die Lösung 440 durch die Löcher 452 aus, wandert durch die Kanäle 450 und erreicht die Wände des Gefäßes 324.
Abb. 5-A zeigt die Verwendung des Systems 11 zur Verabreichung an Blutleitungen (Gefäße und/oder Vorhöfe und Ventrikel) eines Organs 124, wie ein Herz. Eine Schutzhülle 120 wird um das Organ I24 gewunden. Das Organ 124 hat eine Arterie 112, die Blut hineinführt, und eine Vene 114, die Blut wegführt. Der Schlauch 14 wird in das Lumen der Arterie 112 eingeführt, und die Hülle 120 wird um die Arterie 112 und die Vene 114 gewunden. Ein Abschlussband 126A wird fest um die Hülle 120 an der Arterie 112 gezogen und das Abschlussband 126B wird fest um die Hülle 120 an der Vene 114 gezogen, um das Auslaufen von Flüssigkeit aus dem Organ 124 zu verhindern. Abschlussband 126A erlaubt es, dass der Schlauch 14 in die Arterie eingeführt werden kann, verschließt jedoch fest genug, um die Arterie 112 gegen ein Auslaufen zu versiegeln. Eine Lösung 40, die eine zu verabreichende Substanz enthält, wird injiziert und das Organ 124 darf inkubieren. Nach der Inkubationsdauer werden die Abschlussbänder 126A und 126B entfernt und Blut darf wieder durch das Organ fließen.
Abb. 5-B zeigt die Verwendung von Ballonkathetern zum Versiegeln eines Einlasses und eines Auslasses des Organs (z. B. eines Gastrointestinalorgans). Ein Katheter 550 mit einem Ballon 552 wird in eine erste Organzuleitung 5I2, die mit dem Organ 524 in Verbindung steht, eingeführt, und ein anderer Katheter 560 mit einem Ballon 562 wird in eine zweite Organzuführung 514, die vom Organ 524 wegführt, eingeführt. Am Anfang sind die Ballons 552 und 562 schlaff (nicht gezeigt). Sobald die Katheter 550, 560 in ihren entsprechenden Blutgefäßen eingeführt sind, werden die Ballons 552, 562 aufgepumpt und bilden Verschlüsse in den Zuleitungen 512 bzw. 514. Eine Lösung 540, die eine zu verabreichende Substanz enthält, wird in das Organ 524 unter einem Verabreichungsdruck verabreicht.
Abb. 6 zeigt die Verwendung einer Druckkammer, um die Verabreichung von Substanzen an Zellen zu erleichtern. Eine Halterung, wie eine Schale 610 enthält ein Gewebe 624, das Zielzellen enthält. Eine Lösung 640, die die Substanz enthält, wird in der Schale 610 platziert. Die Schale 610 wird in einer Druckkammer 650 platziert. Die Kammer 650 wird verschlossen und versiegelt und ein unter Druck stehendes Gas (z. B. CO&sub2;) wird in die Kammer 650 durch einen Kanal 660 eingeführt. Die Lösung 640 und das Gewebe 624 werden für eine Inkubationsdauer unter einem Inkubationsdruck gehalten. Das Gewebe 624 kann ein gesamtes Organ umfassen.
Eine Druckkammer wird in Abb. 6 gezeigt.
Es gibt mehrere mögliche Mechanismen, die der erhöhten Durchlässigkeit von Zellmembranen gegenüber Molekülen unter Druck zugrunde liegen. Die Erhöhung der Membrandurchlässigkeit erfordert einen erhöhten Druck innerhalb der Zelle/oder der extrazellulären Umgebung, aber nicht notwendigerweise einen Druckgradienten über die Zellmembran. Es ist möglich, dass Proteine, die Transmembrankanäle bilden, ihre Konformation bei hohem Druck ändern und somit den Durchlass von Molekülen durch die Kanäle und in das Zytoplasma erlauben.
Die verwendeten genauen Drücke, Inkubationszeiten und Konzentrationen hängen vom Zielgewebetyp ab. Zum Beispiel, wie weiter unten beschrieben ist, ist eine Inkubationsdauer von etwa 5 Minuten bei niedrigem Druck (ungefähr 0,5 atm) ausreichend, um eine fast maximale Transfektionseffzienz in der humanen Vena saphena zu erreichen, während eine Inkubationsdauer von über einer Stunde bei hohem Druck (~2 atm) benötigt wird, um eine Transfektionseffizienz von 80-90% in Rattenaorten zu erreichen. Für Rattenherzen ist eine Inkubationsdauer von 30 bis 45 Minuten bei 2 atm notwendig für eine Transfektionseffizienz von über 50%. Im Allgemeinen variiert die Inkubationsdauer, die notwendig ist, um eine gegebene Transfektionseffizienz in verschiedenen Gewebetypen zu erreichen, von Minuten bis Stunden bei Inkubationsdrücken in der Größenordnung von Atmosphären. Geeignete Inkubationszeiten und -drücke für einen gegebenen Gewebetyp können leicht vom Fachmann bestimmt werden.
In der Abwesenheit von Beschränkungen, die durch chirurgische Verfahren auferlegt werden, wird es im Allgemeinen bevorzugt, dass die Wände des unter Druck stehenden abgeschlossenen Raums nicht lebendes Gewebe einschließen, da das Gewebe, das Teile der Wand des abgeschlossenen Raums bildet, mechanischem Stress ausgesetzt wird. Einige chirurgische Verfahren, wie die Behandlung von Blutgefäßen, die während des Verfahren an das Kreislaufsystem angeschlossen sind (vgl. Abb. 3-A und 3-B), erfordern, dass zumindest Teile der Wand des abgeschlossenen Raums durch das Gewebe festgelegt werden. In einem solchen Fall ist es wichtig, dass eine Schutzvorrichtung verwendet wird, um die Aufblähung des Gewebes zu verhindern. Ex vivo behandelte Transplantate sind im Allgemeinen bevorzugt durch die Inkubation in einer Druckkammer oder einem äquivalenten unter Druck stehenden abgeschlossenen Raum zu behandeln.
Die In-vitro-Verfahren der Erfindung sind weiterhin nachstehend in Experimenten gezeigt, die die intrazelluläre Verabreichung von Nukleinsäuremolekülen zeigen. Die Transfektionseffizienzen der Verfahren der vorliegenden Erfindung wurden für verschiedene Inkubationsdrücke, Inkubationszeiten und Gewebetypen bewertet. Einige der in der folgenden Diskussion verwendeten Abkürzungen sind: CTRL, Kontrolle; ELISA, "enzyme-linked immunisorbent assay"; FITC, Fluoreszeinisothiocyanat; FITC-ODN, FITC-markiertes Oligodesoxyribonukleotid; IL-6, Interleukin-6; ODN, Oligodesoxyribonukleotid; PCR, Polymerase-Kettenreaktion; VSMC, glatte Gefäßmuskelzelle. Der Buchstabe "n" bezieht sich auf die Anzahl von Subjekten, die für jeden Datenpunkt bewertet wurden. Die angegebenen Drücke sind die Nettodrücke, die auf die Proben ausgeübt wurden, oberhalb des Umgebungs-(atmosphärischen)-Drucks. Die Beispiele sind nur für illustrative Zwecke angegeben.

Beispiel 1

Die humane Vena saphena wurde mit FITC-ODN transfiziert, entsprechend einem Verfahren, ähnlich zu dem, das in Abb. 1-C gezeigt ist. Abb. 7-A zeigt die Transfektionseffizienz als eine Funktion des verabreichten Drucks für verschiedene ODN-Konzentrationen. Die Effizienz wurde gemessen als prozentualer Anzahl der gesamten durch Fluoreszenzmikroskopie aufgefundenen Zellen der Intima und Media, die eine nukleäre Lokalisation von FITC-ODN besitzen. Die Drücke reichten von 50 bis 760 mm Hg, und ODN-Konzentrationen in physiologischer Salinelösung reichten von 5 bis 100 uM. n = 6.
Die Wirkung einer die Aufblähung verhindernden Hülle auf die Transfektionseffizienz wurde bestimmt unter Verwendung eines Verfahrens ähnlich zu dem in Abb. 1-C gezeigten, bei einer ODN-Konzentration von 20 uM und bei Drücken, die von 50 bis 760 mm Hg reichten. Abb. 7-B zeigt die Ergebnisse des Experiments. n = 6.
Die Transfektionseffizienz eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung wurde in vitro untersucht durch die Messung der Hemmung der IL-6-Erzeugung durch Antisense-ODN in Kulturen von gesamtem Organ. Venensegmente wurden in Wachstumsmedium für 24 Stunden nach der Transfektion inkubiert. Transfektionen wurden durchgeführt bei 5 mM, 10 mM und 100 mM für 10 Minuten, entsprechend einem Verfahren ähnlich dem in Abb. 1-C dargestellten. Abb. 7-C zeigt die Verminderung des IL-6-Proteins, das durch ELISA im Wachstumsmedium von Antisense-transfizierten Kulturen nachgewiesen werden kann. Die gezeigten Reduktionsspiegel sind relativ zu den Spiegeln, die in Kontrollkulturen von untransfizierten und nicht spezifisch ODN-transfizierten Venen gefunden werden. n = 6.

Beispiel 2

Quantitative Reverse-Transkriptions-PCR wurde verwendet, um die Verminderung in der IL- 6-mRNA zu messen, die aus der Antisense-ODN-Transfektion resultierte, die entsprechend der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde. Drei Proben der humanen Vena saphena wurden transfiziert, wie in Abb. 1-C gezeigt, und die mRNA-Spiegel in den Antisense- transfizierten Venensegmenten wurden verglichen mit Spiegeln in unbehandelten und reversen Antisense-ODN-transfizierten (Kontrolle) Segmenten. Die Ergebnisse für die drei Proben sind in den Abb. 8-A, 8-B bzw. 8-C gezeigt. Die Verminderung in den mRNA-Spiegeln deutet auf eine sequenzspezifische Wirksamkeit der Antisense-ODN-Behandlung hin.

Beispiel 3

Die Halsschlagadern von Kaninchen wurden in vivo transfiziert mit FITC-ODN, entsprechend einem Verfahren, ähnlich zu dem in Abb. 2 gezeigten. Die Transfektionseffizienz wurde gemessen nach 4 Stunden, 4 Tagen und 7 Tagen nach der Transfektion. Die prozentualen Anteile von FITC-positiven Kernen als eine Funktion der Zeit sind in Abb. 9-A gezeigt. n = 2-3. Die Expression des Gens für Leuchtkäfer-Luziferase wurde gemessen nach der In- vivo-Transfektion der Halsschlagader von Kaninchen mit einem Plasmid-DNA-Konstrukt, das das Luziferasegen enthält. Gesunde Arterien (normal) und atherosklerotische Gefäße (CHOL/inj) wurden unter Druck transfiziert, wie in Abb. 2 gezeigt. Die Kontrollarterie (CTRL) war dem Plasmid, das das Luziferasegen enthält, in der Abwesenheit von Druck ausgesetzt. Die Arterien wurden am Tag 5 geerntet und Gewebehomogenate wurden auf Luziferaseaktivität untersucht. Die Untersuchungsergebnisse sind in Abb. 9-B gezeigt. n = 2-4.

Beispiel 4

Glatte Gefäßmuskelzellen (VSMC) von Ratten wurden in vitro transfiziert mit FITC-ODN, wie in Abb. 6 gezeigt. Die Zellen wurden entweder atmosphärischem Druck (0 atm Nettodruck) oder 2 atm für 45 Minuten ausgesetzt. Abb. 10 zeigt die Transfektionseffizienzen für FITC-ODN-Konzentrationen von 1 mM und 80 mM. n = 4.

Beispiel 5

Abb. 11 zeigt die Wirkung des Druckes auf die Transfektionseffizienz für Nierenzellen von Ratten, die in vivo mit Plasmid-DNA durchspült wurden, die das Gen für Leuchtkäfer- Luziferase enthält, wie in Abb. 6 gezeigt. Die Ratten wurden atmosphärischem Druck (0 atm) oder 2 atm für 30 Minuten nach der Nierenspülung ausgesetzt. Die Nieren wurden drei Tage nach der Transfektion geerntet und Gewebehomogenate wurden auf Luziferaseaktivität untersucht. n = 7.

Beispiel 6

Abb. 12-A zeigt die Wirkung des Druckes auf die Transfektionseffizienz für Rattenaortazellen. Die Aorten wurden geerntet aus den Spenderratten und inkubiert bei 4ºC für 24 Stunden in physiologischer Lösung, um ischämische Schädigung zu induzieren, in einer Weise ähnlich zu jener, die in Abb. 1-C' gezeigt ist. Die Inkubationslösungen enthielten 40 uM FITC-ODN. Inkubationen wurden ausgeführt bei 0 atm und 2 atm über Druck. Nachfolgend der Inkubation wurde das Gewebe in Rattenaorten isotransplantiert und 24 Stunden nach der Transplantation geerntet. Die nukleäre Lokalisierung von FITC wurde durch Fluoreszenzmikroskopie von Schnitten untersucht, die zusammen mit einem fluoreszenten DNA- Interkalationsfarbstoff gefärbt wurden. Die Transfektionseffizienz wird ausgedrückt als prozentualer Anteil der Zellen, die eine nukleäre Lokalisierung von FITC-ODN zeigen, bezogen auf die gesamte Zahl der Zellen. n = 3, p < 0,005.
Abb. 12-B zeigt die Ischämie-induzierte PCNA-Expression in transplantierten Rattenaorten mit und ohne der druckvermittelten Transfektion von Antisense-PCNA-ODN. Das Transfektionsverfahren war ähnlich zu jenem, das in Abb. 1-C' gezeigt ist. Ischämische Schädigungen wurden induziert durch 24-stündige Inkubationen bei 4ºC entweder in Saline- Lösung (Kontrolle) oder in Salinelösung, die 40 uM ODN enthält. Ein Druck von 2 atm über dem atmosphärischen Druck wurde während der Inkubation sowohl an die Kontrolle als auch an die ODN-behandelten Proben angelegt: Das Gewebe wurde 6 Tage nach der Isotransplantation geerntet und die PCNA-Proteinspiegel in Gewebehomogenaten wurden durch ELISA gemessen. n = 7, p = 0,02.
Abb. 12-C zeigt die Ischämie-induzierte cdc2-Kinase-Expression in transplantierten Rattenaorten mit und ohne der druckvermittelten Transfektion von Antisense-cdc2-Kinase- ODN. Die Transfektion, Transplantation und Ernteverfahren waren ähnlich zu jenen, die vorstehend in Bezug auf Abb. 12-B beschrieben wurden. Proteinspiegel für cdc2-Kinase wurden durch ELISA gemessen.
Abb. 12-D zeigt die Verminderung der luminalen Verengung von isotransplantierten, ischämisch geschädigten Rattenaorten, die aus der druckvermittelten Transfektion mit Antisense-ODN gegen sowohl PCNA als auch cdc2-Kinase resultiert. Die ischämische Schädigung wurde induziert durch 24-stündige Inkubation bei 4ºC entweder in Salinelösung (Kontrolle) oder in Antisense-PCNA/Antisense-cdc2-Kinase ODN-Lösung (jeweils 40 uM). Ein Druck von 2 atm über dem Umgebungsdruck wurde an alle Gewebe (einschließlich der Kontrolle) angelegt. Eine Blockade der Expression dieser zwei regulatorischen Zellzyklusgene verminderte die neointimale Hyperplasie und die luminale Verengung ischämisch geschädigter Isotransplantate, wie durch Computer-Bildanalyse gemessen wurde. n = 12, p = 0,03.

Beispiel 7

Abb. 13-A zeigt die Transfektionseffizienzen für Rattenherzen, die ex vivo mit FITC- ODN mit und ohne Druck transfiziert wurden. Eine FITC-ODN-Lösung (80 uM) wurde in die Herzkranzarterien der Spenderherzen nach dem Abklemmen der Aorten gespült. Die Herzen wurden in FITC-ODN-Lösung getaucht und entweder bei 0 atm oder 2 atm über dem Umgebungsdruck für 45 Minuten bei 4ºC ausgesetzt, wie in Abb. 6 gezeigt. Die Herzen wurden anschließend heterotopisch in die Bauchaorta und die Hohlvene von Empfängerratten transplantiert. Die nukleäre Lokalisierung von FITC wurde 24 Stunden nach der Transplantation durch Fluoreszenzmikroskopie von Schnitten untersucht, die zusammen mit einem fluoreszenten DNA-Interkalationsfarbstoff gefärbt wurden. Die Transfektionseffizienz wird ausgedrückt als prozentualer Anteil der Zellen, die eine nukleäre Lokalisierung von FITC-ODN zeigen, in Bezug auf die Gesamtzellen, n = 3, p < 0,005.
Abb. 13-B zeigt ICAM-1-Expression in transplantierten Rattenherzen mit und ohne der druckvermittelten Transfektion von Antisense-ICAM-1 ODN. Entweder Saline (Kontrolle) oder Antisense-ICAM-1-ODN-Lösung (80uM) wurde in die Herzkranzarterien von Spenderherzen des PVG-Stammes nach dem Abklemmen der Aorten gespült. Die Herzen wurden anschließend in FITC-ODN-Lösung getaucht und bei 2 atm über dem Umgebungsdruck für 45 Minuten bei 4ºC ausgesetzt, wie in Abb. 6 gezeigt. Das Gewebe wurde 3 Tage nach heterotopischer Transplantation in ACI-Empfänger geerntet. Eine ICAM-1-positive Region wurde durch Bildanalyse von Schnitten gemessen, die immunhistochemisch auf ICAM-1 gefärbt wurden. n = 3-6, p = 0,04.
Abb. 13-C zeigt die Induktion der Langzeit-Transplantationsakzeptanz durch die druckvermittelte Transfektion von transplantierten Rattenherzen mit Antisense-ODN gegen ICAM- 1. Rattenherzen des PVG-Stammes wurden geerntet und ex vivo mit entweder Antisense- ICAM-1-ODN-Lösung (80uM) oder mit Salinelösung (Kontrolle) transfiziert, wie vorstehend in Bezug auf Abb. 13-B beschrieben. Die Herzen wurden dann heterotopisch in Empfänger des ACI-Stammes transplantiert. Allen Tieren wurde systemisch Anti-LFA-1-Antikörper für 6 Tage nachfolgend der Transplantation verabreicht, um den Liganden für ICAM-1 zu blockieren. Keine weitere Immunsuppression wurde verabreicht. Die Toleranz wird als prozentualer Anteil der behandelten Tiere dargestellt, bei denen eine Langzeitakzeptanz ihrer Homotransplantate gefunden wurde. Die Transplantatakzeptanz wurde festgelegt durch das Vorhandensein von Herzschlag im Transplantat für > 100 Tage. Kontrolle n = 12, Antisensebehandelt n = 27, p = 0,003.

Beispiel 8

Abb. 14-A und 14-B zeigen die Hemmung der neointimalen Hyperplasie in Drosselvenen von Kaninchen, die in die Halsschlagadern transplantiert wurden, nachfolgend der druckvermittelten Transfektion mit ODN, die entworfen waren, um die Hochregulation von regulatorischen Zellzyklusgenen zu blockieren.
Abb. 14-A zeigt die Wandstärke nach 6 Wochen und 6 Monaten nach der Transplantation von unbehandelten (Kontroll-) Transplantaten und Transplantaten, die entweder mit reversen Antisense- (Kontroll-) ODN oder mit Antisense-ODN gegen sowohl gegen PCNA als auch cdc2-Kinase transfiziert wurden. Eine Neointimabildung wurde gehemmt bis zu 6 Monaten, während eine mediale Hypertrophie die angepasste Wandverstärkung erlaubte, um den Wandstress in der Hochdruckumgebung der Arterie zu vermindern. Abb. 14-B zeigt Ergebnisse ähnlich zu jenen in Abb. 14-A für Venen, die mit E2F-Antisense-ODN transfiziert wurden, verglichen zu unbehandelten Transplantaten und Kontrolltransplantaten, die mit durcheinander gewürfelten ODN transfiziert wurden. n = b, p < 0,005.
Obwohl die vorstehenden Beschreibungen viele Besonderheiten enthalten, sollen diese nicht als Beschränkung für den Rahmen der Erfindung angesehen werden, sondern vielmehr als Illustrationen besonderer Ausführungen davon. Zum Beispiel kann im Allgemeinen ein zeitveränderlicher Inkubationsdruck verwendet werden. Viele mögliche Ausführungen für die Abschlussvorrichtung, Schutzvorrichtung und/oder Verschlussvorrichtung können von einem Fachmann leicht erdacht werden abhängig von der Anwendung. Verschiedene Inkubationsdrücke, Zeiten und Dosierungen des aktiven Agens, die zu erwünschten oder nahe maximalen Transfektionseffizienzen führen, können leicht für verschiedene Gewebetypen bestimmt werden.

Claims

1. Ein in vitro Verfahren zur Steigerung der Aufnahme eines Atoms, eines Moleküls, mit der Ausnahme von Nukleinsäuren, oder eines Partikels mit einer maximalen Dimension von < 10 um durch eine Zelle, wobei das Verfahren umfasst

In-Kontakt-Bringen der Zelle und eines flüssigen Mediums, welches das Atom, Molekül oder Partikel umfasst,

Aufrechterhalten der Zelle und des flüssigen Mediums in einem eingeschlossenen Raum, und

Unterziehen der eingeschlossenen Zelle und des flüssigen Mediums eines Inkubationsdrucks, der ausreicht, die Aufnahme des Atoms, Moleküls oder Partikels durch die Zelle zu steigern, wobei ein am menschlichen oder tierischen Körper ausgeübtes Verfahren ausgeschlossen ist:

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Zelle innerhalb eines Säuger-Blutgefässes enthalten ist, das an zwei Stellen versiegelt ist, um den eingeschlossenen Raum bereitzustellen.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Molekül ein therapeutisches, geladenes organisches Molekül mit einem Molekulargewicht von weniger als 1000 ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei da Molekül ein Protein oder ein Peptid mit einem Molekulargewicht von mehr als 1000 ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Inkubationsdruck zwischen 50 mm Hg und 5 Atmosphären über Umgebungsdruck liegt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei der Inkubationsdruck zwischen 200 mm Hg und 2,5 Atmosphären über Umgebungsdruck liegt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Zelle in einem Blutgefäß oder Organ vom Säuger enthalten ist, und der Inkubationsdruck äquilibriert zwischen dem Äußeren und Inneren des Gefäßes oder des Organs, so dass zwischen dem Äußeren und Inneren im wesentlichen kein Druckgradient vorliegt.

8. Verwendung eines Reservoirs und eines Katheters zur Herstellung eines Systems zum Transport eines Atoms, eines Moleküls oder eines Partikels mit einer maximalen Dimension von < 10 um in eine lebende Zelle in ein Gewebe in vivo, wobei:

das Reservoir zum Halten einer Lösung, die das Atom, Molekül oder Partikel enthält, geeignet ist;

das System zum Transport des Atoms, Moleküls oder Partikels in die extrazelluläre Umgebung der lebenden Zelle des Gewebes und zur Anwendung von Druck auf diese Zelle wund Umgebung geeignet ist, wodurch die Aufnahme des Atoms, Moleküls oder Partikels durch diese lebende Zelle erleichtert wird; und wobei

das Atom, Molekül oder Partikel kein Nukleotid ist.

9. Verwendung eines Systems zum Transport eines Atoms, eines Moleküls oder eines Partikels mit einer maximalen Dimension von < 10 um in vitro in eine lebende Zelle, wobei das Atom, Molekül oder Partikel kein Nukleotid ist, wobei das System umfasst:

ein Mittel zum Einschließen zur Definition wenigstens eines Teils einer Begrenzung einer versiegelten Einschließung, wobei die versiegelte Einschließung die Zelle und eine extrazelluläre Umgebung der Zelle enthält; und

ein Mittel zur Druckregelung zur Etablierung eines Inkubationsdrucks oberhalb des Luftdrucks in der versiegelten Einschließung, wodurch die Aufnahme des Atoms, Moleküls oder Partikels durch die lebende Zelle erleichtert wird, wobei die Verwendung des Systems in einem Verfahren, das am menschlichen oder tierischen Körper ausgeübt wird, ausgeschlossen ist.

10. Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei das Mittel zum Einschließen eine Druckregelungskammer umfasst.

11. Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei ein Mittel zur Halterung in die Druckregelungskammer eingesetzt wird, um ein Gewebe, das Zielzellen enthält und eine Lösung, die das Atom, Molekül oder Partikel enthält, zu halten.

12. Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei die Zelle innerhalb eines Säuger-Blutgefässes enthalten ist, das an zwei Stellen versiegelt ist, um den eingeschlossenen Raum bereitzustellen.

13. Verwendung gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei das Molekül ein therapeutisches, geladenes organisches Molekül mit einem Molekulargewicht von weniger als 1000 ist.

14. Verwendung gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei das Molekül ein Protein oder ein Peptid mit einem Molekulargewicht von mehr als 1000 ist.

15. Verwendung gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei der Inkubationsdruck zwischen 50 mm Hg und 5 Atmosphären über Umgebungsdruck liegt.

16. Verwendung gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei der Inkubationsdruck zwischen 200 mm Hg und 2,5 Atmosphären über Umgebungsdruck liegt.

17. Verwendung gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei die Zelle in einem Blutgefäß oder Organ vom Säuger enthalten ist, und der Inkubationsdruck äquilibriert zwischen dem Äußeren und Inneren des Gefäßes oder des Organs, so dass zwischen dem Äußeren und Inneren im wesentlichen kein Druckgradient vorliegt.

18. Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei das Mittel zum Einschließen eine undurchlässige Ummantelung umfasst.

19. Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei das Mittel zum Einschließen ein Mittel zur Verstopfung zur Verstopfung einer Passage in einem Gewebe umfasst.

20. Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei die Begrenzung im wesentlichen durch das Mittel zum Einschließen definiert wird.

21. Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei Teil der Begrenzung durch ein Gewebe definiert wird.

22. Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei das System weiter ein Mittel zum Schutz umfasst, das dazu geeignet ist, um das Gewebe herum platziert zu werden, um einem Trauma in diesem Gewebe vorzubeugen.

23. Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei das Mittel zum Schutz eine unelastische Ummantelung umfasst.