DE10211589A1

DE10211589A1 - In vitro-Transfektion und Langzeitkultivierung von isolierten Organen

Info

Publication number: DE10211589A1
Application number: DE2002111589
Authority: DE
Inventors: Steffen-Sebastian Bolz
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-03-15
Filing date: 2002-03-15
Publication date: 2003-10-02
Also published as: AU2003209738A1; WO2003078606A3; AU2003209738A8; WO2003078606A2

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Transfektion von Zielzellen in einem Organ, isolierte in vitro-transfizierte Organe und deren Verwendung zur genetischen und/oder pharmakologischen Untersuchung von Krankheiten. Des weiteren betrifft die Erfindung Verfahren zur in vitro-Langzeitkultivierung von isolierten Organen, ein Kulturmedium und eine transportable Vorrichtung zur in vitro-Langzeitkultivierung sowie die isolierten langzeitkultivierten Organe selbst.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Transfektion von Zielzellen in einem Organ, isolierte in vitro-transfizierte Organe und deren Verwendung zur genetischen und/oder pharmakologischen Untersuchung von Krankheiten. Desweiteren betrifft die Erfindung Verfahren zur in vitro- Langzeitkultivierung von isolierten Organen, ein Kulturmedium und eine transportable Vorrichtung zur in vitro-Langzeitkultivierung sowie die isolierten langzeitkultivierten Organe selbst.
Die effiziente und spezifische Einbringung von Molekülen, wie beispielsweise Nukleinsäuren und/oder Pharmaka, in Zellen intakter Organe ist eine wesentliche Voraussetzung für die Aufklärung der Funktionsweise von Genen und deren Wirkung auf die Organfunktion. Verschiedene Verfahren zur Einbringung von Molekülen in Zellen intakter Organe wurden bereits beschrieben.
Ein weit verbreitetes Verfahren zur Einbringung von DNA in Zellen basiert auf dem Inkontaktbringen der zu transfizierenden Zellen unter Zellkulturbedingungen mit nackter DNA. Dieses Verfahren resultiert jedoch nur in sehr geringen Transfektionsraten von kleiner 40% (Kaiser et al., J. Vasc. Res. 38 (2): 133-143, 2001; Huang et al., J. Biol. Chem. 274 (49): 35095-35098, 1999; Maasch et al., FASEB J. 14 (11): 1653-1663, 2000 und Wolff et al., Science 247: 1465-1468, 1990). So beschreiben beispielsweise Wolff et al. die Transformation eines Skelettmuskels aus Maus mit nackter DNA oder RNA, die für ein Reportermolekül kodiert, durch direkte Injektion der zu transfizierenden Nukleinsäuremoleküle in den Skelettmuskel. Jedoch zeigten nur etwa 10-30% der Skelettmuskelzellen innerhalb des Injektionsbereichs des Skelettmuskels eine Expression der Reportermoleküle. Neben der geringen Transfektionsrate weist das von Wolff et al. beschriebene Transfektionsverfahren weitere Nachteile auf. So liefert das Verfahren beispielsweise bei der Transfektion anderer Organe, wie z. B. Leber, Haut, Lunge, Gehirn und Blut, noch geringere Transfektionsraten als bei der Transfektion von Skelettmuskel. Des Weiteren dient das durch Wolff et al. beschriebene Verfahren lediglich zur Transfektion von räumlich stark begrenzten Bereichen eines Organs, d. h. im Bereich der Injektionsstelle.
Höhere Transfektionsraten können beispielsweise mittels Verfahren erreicht werden, die auf einer Kopplung der zu transfizierenden Nukleinsäuremoleküle an Transportvesikel, wie z. B. Liposomen oder Virenkapside, beruhen. Ein solches, bei Nabel et al. (Science 249: 1285-1288, 1990) beschriebenes Verfahren ermöglicht zwar eine effiziente Einbringung von Nukleinsäuremolekülen in Gefäßwandzellen von Blutgefäßen, weist jedoch gavierende Nachteile auf, welche den Einsatz des Verfahrens stark einschränken. Die verwendeten Nukleinsäure- Transportvesikel sind potenziell toxisch für die zu transfizierenden Zellen und können immunologische Reaktionen hervorrufen. Des Weiteren können die verwendeten Nukleinsäure-Transportvesikel Mutationen auszulösen und eine Zellentartung induzieren (Onkogenese).
Weitere Verfahren zur Einbringung von Molekülen in Zellen intakter Organe umfassen beispielsweise die Einbringung von Nukleinsäuremolekülen in Zellen eines Organs unter Verwendung von Druck (US-Patent Nr. 5,922,687) und über das Gefäßsystem (US-Patent-Anmeldungen Nrs. US 2001/0007861 A1, US 2001/0019723 A1 und US 2002/0001574 A1). Diese Verfahren weisen lediglich mäßige Transfektionsraten auf. Zudem ermöglicht keines dieser Verfahren eine kontrollierte, spezifische und hocheffiziente Transfektion von Zielzellen in einem Organ bei gleichzeitiger kontrollierter Analyse der Wirkung der transfizierten Moleküle auf die Organfunktion.
Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Transfektion eines Organs bereitzustellen, das die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweist und eine spezifische und hocheffiziente Tranfektion von Zielzellen in dem Organ sowie eine nachfolgende Untersuchung der Wirkung der tranfizierten Moleküle auf die Organfunktion ermöglicht.
Diese Aufgabe wurde erfindungsgemäß durch Bereitstellung eines Verfahrens zur Transfektion von Zielzellen in einem Organ gelöst, umfassend die Schritte:

a) Langzeitkultivieren des isolierten Organs in vitro und
b) Inkontaktbringen des isolierten Organs während der Langzeitkultivierung mit einem Transfektionsmittel unter derartigen Bedingungen, dass eine Transfektion von wenigstens 80% der Zielzellen in dem Organ erfolgt.

Durch den erfindungsgemäßen Einsatz eines neuartigen Langzeitkultivierungsprotokolls für isolierte Organe in Verbindung mit innovativer Gerätetechnik, verlängerten Transfektionszeiten und geeigneten Transfektionsmitteln wird erstmals ein Verfahren zur in vitro-Transfektion von Zielzellen in einem Organ bereitgestellt, das eine spezifische Transfektion von wenigstens 80% der Zielzellen in dem isolierten Organ unter in vivo-nahen, für das entsprechende Organ optimierten Bedingungen ermöglicht. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können die isolierten, in vitro-transfizierten Organe für eine Dauer von wenigstens 50 Stunden unter Beibehaltung ihrer vollständigen in vivo-Funktionsfähigkeit kultiviert werden, so dass eine kontinuierliche Untersuchung der Wirkung der transfizierten Moleküle auf die Organfunktion über mehrere Stunden bis Tage ermöglicht wird. Durch die Verwendung nicht-liposomaler und nicht- viraler Transfektionsmittel verhindert das erfindungsgemäße Verfahren weiterhin die Entstehung von Gewebeschäden in dem in vitro-transfizierten Organ, wodurch eine anschließende Reimplantation des Organs in einen Patienten möglich wird. Aufgrund des geringen technischen Aufwands des erfindungsgemäßen Verfahrens kann es überdies in jedem herkömmlichen Standardlabor eingesetzt werden, um jede Art von Zielzellen in jedem zur Transfektion fähigen Organ zu transfizieren.
Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens basiert auf einer in vitro- Langzeitkultivierung des zu transfizierenden isolierten Organs. Die Bezeichnung " in vitro-Langzeitkultivierung", wie hierin verwendet, umfasst die Kultivierung eines isolierten Organs in vitro für eine Dauer von wenigstens 50 Stunden, vorzugsweise wenigstens 70 Stunden, wobei die in vivo-Funktion des isolierten Organs über die Dauer der in vitro- Kultivierung vollständig erhalten bleibt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die in vitro-Langzeitkultivierung des isolierten Organs aus Schritt (i) zunächst das Bereitstellen des zu transfizierenden isolierten Organs. Die Präparation des Organs aus einem geeigneten Spenderorganismus, wie beispielsweise einem Tier (Hamster, Ratte, Maus) oder Menschen, kann erfindungsgemäß nach herkömmlichen, dem Fachmann bekannten Verfahren durchgeführt werden. Des Weiteren umfasst die in vitro-Langzeitkultivierung aus Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens das Überführen des isolierten Organs nach erfolgter Präparation in eine für die in vitro-Langzeitkultivierung geeignete Vorrichtung, umfassend wenigstens ein Organbad mit Kulturmedium. Vorzugsweise erfolgt das in vitro-Langzeitkultivieren aus Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens bei einer Temperatur zwischen 3 und 45°C und/oder einem pH-Wert zwischen 4 und 9.
Das für die in vitro-Langzeitkultivierung aus Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Kulturmedium umfasst vorzugsweise wenigstens eines der anorganischen Salze, ausgewählt aus wasserfreiem CaCl₂, KCl, KH₂PO₄, wasserfreiem MgCl₂, wasserfreiem MgSO₄, NaCl und Na₂HPO₄, wenigstens eine der zusätzlichen Komponenten, ausgewählt aus D(+)-Galaktose, Phenolrot, Natrium-Pyruvat und Glutathion, wenigstens eines der Vitamine, ausgewählt aus D-Ca- Pantothenat, Cholinchlorid, Folsäure, i-Inositol, Nicotinamid, Pyridoxal, Flavin-Mononukleotid und Thiaminmonophoshat, und wenigstens eine der Aminosäuren, ausgewählt aus D,L-Alanin, L-Arginin, L-Asparagin, L- Cystein, L-Glutamin, Glycin, L-Histidin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Lysin, D,L- Methionin, D,L-Phenylalanin, L-Serin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Thyrosin und L-Valin. Als weitere Bestandteile kann das Kulturmedium zusätzlich hitzeinaktiviertes Kälberserum und/oder wenigstens ein Antibiotikum, um eine bakterielle Kontamination des isolierten Organs während der in vitro- Langzeitkultivierung zu verhindern, enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das isolierte Organ während des in vitro-Langzeitkultivierens aus Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Kulturmedium superfundiert. Vorzugsweise erfolgt die Superfusion des isolierten Organs mit Kulturmedium bei einem Fluss von 0,1 ml/h bis 300 l/h.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das isolierte Organ während des in vitro-Langzeitkultivierens aus Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens perfundiert. Die Perfusion des isolierten Organs erfolgt vorzugsweise bei einem Fluss von 0,1 ml/l bis 300 l/h und/oder einem Druck von 1-300 mmHg. Als Perfusionsmedium eignet sich beispielsweise reines Kulturmedium, Kulturmedium, das mit Transfektionsmittel und zu transfizierenden Molekülen versetzt ist als auch ein physiologischer Puffer. Vorzugsweise erfolgt die Perfusion des isolierten Organs über das Organlumen. Dabei wird beispielsweise das Organlumen des isolierten Organs durch eine Kanülierung für eine Perfusion des Lumens während des in vitro-Langzeitkultivierens vorbereitet. Verfahren zur Kanülierung des Organlumens isolierter Organe sind dem Fachmann hinreichend bekannt. Desweiteren kann die Perfusion des isolierten Organs vorzugsweise auch über wenigstens eine kanülierte Arterie oder Vene oder wenigstens ein kanüliertes Kapillargefäß des isolierten Organs erfolgen. Die Kanülierung wenigstens einer Arterie oder Vene oder wenigstens eines Kapillargefäßes des isolierten Organs kann dabei nach herkömmlichen, dem Fachmann bekannten Verfahren erfolgen.
Schritt (ii) des erfindungsgemäßen Verfahrens basiert auf dem Inkontaktbringen des isolierten Organs während der in vitro- Langzeitkultivierung mit einem Transfektionsmittel unter derartigen Bedingungen, dass eine Transfektion von wenigstens 80% der Zielzellen in dem isolierten Organ erfolgt. Vorzugsweise sind die von der vorliegenden Erfindung erfassten Transfektionsmittel potenziell ungefährlich für die zu transfizierenden Zielzellen in dem Organ, d. h. sie wirken nicht cytotoxisch auf die Zielzellen, lösen keine Mutationen aus und rufen keine immunologischen Reaktionen hervor. Besonders bevorzugt ist das in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Transfektionsmittel eine nicht- lipsomale Lipidformulierung, wie beispielsweise das Transfektionsmittel Effectene® (Qiagen, Deutschland).
Vorzugsweise erfolgt das Inkontaktbringen des isolierten Organs in Schritt (ii) des erfindungsgemäßen Verfahrens während der in vitro- Langzeitkultivierung mit dem Transfektionsmittel für eine Dauer von 10 Minuten bis 50 Stunden. Die für die Transfektion der Zielzellen eines Organs benötigte Transfektionsdauer hängt dabei von mehreren Faktoren ab, wie z. B. der Art des Organs, der Art der zu transfizierenden Zielzellen in dem Organ, die Anzahl der zu transfizierenden Zielzellen, etc. und kann ohne Weiteres von einem Fachmann unter Berücksichtigung der oben genannten Faktoren bestimmt werden. Besonders bevorzugt beträgt die Transfektionsdauer jedoch 10-22 Stunden.
Die Bezeichnung "Transfektion", wie hierin verwendet, umfasst jede mögliche Art der Einbringung von Molekülen in Zielzellen des zu transfizierenden Organs. Vorzugsweise sind die zu transfizierenden Moleküle ausgewählt aus Nukleinsäuren, Polypeptiden, Pharmaka, synthetischen Stoffen, Zuckern, Fettsäuren, Derivaten und/oder Komplexen davon. Die zu transfizierenden Nukleinsäuren können in einzelsträngiger oder doppelsträngiger Form, z. B. als RNA, DNA, PNA oder RNA-, DNA-, PNA-Analoga, vorliegen. Vorzugsweise sind die zu transfizierenden Nukleinsäuren doppelsträngige DNA, einzelsträngige RNA oder Antisense- Oligonukleotide. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung liegen die zu transfizierenden Nukleinsäuren in operativer Verknüpfung mit einer heterologen Expressionskontrollsequenz vor, so dass sie nach Transfektion in die Zielzellen des Organs transkribiert bzw. translatiert werden können. Geeignete Expressionskontrollsequenzen umfassen üblicherweise einen Promotor und gegebenenfalls regulatorische Sequenzen, wie Operatoren oder Enhancer. Weiterhin können auch Translationsinitiationssequenzen vorhanden sein. Ensprechend geeignete Expressionskontrollsequenzen für eukaryontische Wirtszellen sind dem Fachmann gut bekannt (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press). In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kodierend die zu transfizierenden Nukleinsäuren für Polypeptide, d. h. Proteine bzw. funktionelle Fragmente davon. Vorzugsweise kodieren die zu transfizierenden Nukleinsäuren für Polypeptide, die mit Krankheiten, welche das entsprechende Organ betreffen, in Zusammenhang stehen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Transfektion von Zielzellen in einem Organ ermöglicht eine hocheffiziente und spezifische Transfektion von Zielzellen jedes möglichen zur Transfektion fähigen Organs, wie beispielsweise eines endokrinen Organs, eines exokrinen Organs, eines Skelettmuskels, eines glatten Muskels, eines gastrointestinalen Organs, eines Urogenitalorgans, von Lunge, Bronchialbaum, Herz, Niere, Leber, Milz, Magen, einer Arterie, einer Vene und eines Kapillargefäßes. Die zu transfizierenden Zielzellen umfassen erfindungsgemäß alle in dem Organ vorkommenden Zelltypen, wie beispielsweise Parenchymzellen, Epithelzellen, Muskelzellen, Nervenzellen, Bindegewebszellen und Fettzellen. Vorzugsweise sind die zu transfizierenden Zielzellen jedoch funktionelle Zellen des Organs. Beispiele für geeignete Zielzellen und die dazu gehörenden Organe sind beispielsweise Endothelzellen, glatte Muskelzellen und Adventitialzellen der Blutgefäße; Hepatocyten, Kupffer- Zellen und Epithelzellen der Leber; Retikulumzellen oder Blutzellen, wie Lymphocyten, Monocyten, Plasmazellen und Makrophagen der Milz, Thymusdrüse, Lymphdrüse und des Knochenmarks; Epithelzellen, Becherzellen, Schleimzellen und Alveolarzellen der Lunge sowie Adipocyten des Fettgewebes.
Neben der Transfektion von vollständigen Organen ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren auch die Transfektion von Organteilen bzw. -fragmenten.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung dient das erfindungsgemäße Verfahren zur hocheffizienten und spezifischen Transfektion von glatten Muskelzellen in Blutgefäßen, wie Arterien, Venen oder Kapillargefäßen, wobei wenigstens 80% der glatten Muskelzellen mit dem zu transfizierenden Molekül transfiziert sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein isoliertes, in vitro-transfiziertes Organ, wobei wenigstens 80% der Zielzellen des Organs transfiziert sind. Die Bezeichnung "in vitro-transfiziert", wie hierin verwendet, umfasst jede mögliche Art der Einbringung von Molekülen in Zielzellen des Organs unter in vitro-Bedingungen. Das erfindungsgemäße isolierte, in vitro-transfizierte Organ kann mit jedem zur Transfektion fähigen Molekül transfiziert sein. Vorzugsweise ist das isolierte, in vitro- transfizierte Organ mit einem bereits zuvor genannten Molekül, wie beispielsweise einer Nukleinsäure, einem Polypeptid, einem Pharmazeutikum, einem synthetischen Stoff, einem Zucker, einer Fettsäure oder einem Derivate und/oder Komplex davon, transfiziert.
Das erfindungsgemäße isolierte, in vitro-transfizierte Organ kann jedes geeignete Organ sein. Vorzugsweise ist das isolierte, in vitro-transfizierte Organ ein endokrines Organ, ein exokrines Organ, ein Skelettmuskel, ein glatter Muskel, ein gastrointestinales Organ, ein Urogenitalorgan, Lunge, Herz, Niere, Leber, Milz, Magen, Bronchialbaum, eine Arterie, eine Vene oder ein Kapillargefäß.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das isolierte, in vitro-transfizierte Organ ein langzeitkultiviertes Organ.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfingung ist das isolierte, in vitro-transfizierte Organ durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Transfektion von Zielzellen in einem Organ erhältlich.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Transfektion von Zielzellen in einem Organ oder eines erfindungsgemäßen isolierten, in vitro- transfizierten Organs zur Untersuchung von Krankheiten, die das Organ betreffen. Beispielsweise können mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens glatte Muskelzellen bzw. Endothelzellen in Arterien oder Kapillargefäßen transfiziert werden, um Krankeiten, die mit erhöhtem oder erniedrigtem Blutdruck verbunden sind, zu untersuchen.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Transfektion von Zielzellen in einem Organ oder eines erfindungsgemäßen isolierten, in vitro-transfizierten Organs zur Identifizierung von Wirksubstanzen zur Prävention und/oder Behandlung von Krankheiten, die das Organ betreffen. Beispielsweise können glatte Muskelzellen und Endothelzellen von Arterien oder Kapillargefäßen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Wirksubstanzen transfiziert werden, um deren Wirkung zur Prävention und/oder Behandlung von Krankheiten, die mit erhöhtem und/oder erniedrigtem Blutdruck verbunden sind, zu untersuchen.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Transfektion von Zielzellen in einem Organ oder eines erfindungsgemäßen isolierten, in vitro-transfizierten Organs zur Identifizierung neuer Targets für innovative therapeutische Strategien.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft außerdem die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Transfektion von Zielzellen in einem Organ oder eines erfindungsgemäßen isolierten, in vitro-transfizierten Organs zur Identifizierung der Wirkung von therapeutischen Maßnahmen auf das Organ bzw. auf die das Organ betreffenden Krankheiten. Vorzugsweise umfassen die therapeutischen Maßnahmen eine Gentherapie.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft überdies die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Transfektion von Zielzellen in einem Organ oder eines erfindungsgemäßen isolierten, in vitro- transfizierten Organs zur Entwicklung innovativer pharmakologischer Strategien zur Prävention und/oder Behandlung von Krankheiten, die das Organ betreffen.
Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur in vitro- Langzeitkultivierung eines isolierten Organs, umfassend das Kultivieren des isolierten Organs unter derartigen Bedingungen, dass die Kultivierungsdauer wenigstens 50 Stunden beträgt. Vorzugsweise kann das isolierte Organ mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens zur in vitro-Langzeitkultivierung für eine Kultivierungsdauer von wenigstens 70 Stunden kultiviert werden. Die Kultivierungsbedingungen werden dabei so gewählt, dass die Funktionsfähigkeit des isolierten Organs während der in vitro- Langzeitkultivierung vollständig erhalten bleibt. Vorzugsweise erfolgt die in vitro-Langzeitkultivierung des isolierten Organs in einer Vorrichtung, die wenigstens ein Organbad enthält.
Vorzugsweise erfolgt die in vitro-Langzeitkultivierung jedoch bei einer Temperatur zwischen 3 und 45°C und/oder einem pH-Wert zwischen 4 und 9.
Das zur in vitro-Langzeitkultivierung des isolierten Organs verwendete Kulturmedium umfasst wenigstens ein anorganisches Salz, wenigstens eine zusätzliche Komponente ausgewählt aus D(+)-Galaktose, Phenolrot, Na- Pyruvat und Glutathion, wenigstens ein Vitamin und wenigstens eine Aminosäure. Die anorganischen Salze, Vitamine und Aminosäuren sind dabei vorzugsweise ausgewählt aus den bereits zuvor genannten anorganischen Salzen, Vitaminen und Aminosäuren. Desweiteren kann das Kulturmedium als weitere Bestandteile hitzeinaktiviertes Kälberserum und wenigstens ein Antibiotikum, um eine Kontamination des isolierten Organs durch Bakterien zu verhindern, enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das isolierte Organ, wie bereits zuvor beschrieben, während der in vitro-Langzeitkultivierung mit Kulturmedium superfundiert. Die Superfusion erfolgt vorzugsweise mit Kulturmedium bei einem Fluss von 0,1 ml/h bis 300 l/h.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das isolierte Organ während der in vitro-Langzeitkultivierung perfundiert. Die Perfusion des Organs erfolgt vorzugsweise bei einem Fluss von 0,1 ml/h bis 300 l/h und/oder einem Druck von 0-300 mmHg. Die Perfusion des isolierten Organs während der erfindungsgemäßen in vitro- Langzeitkultivierung kann, wie bereits zuvor beschrieben, durchgeführt werden.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann jedes beliebige Organ, welches für eine in vitro-Langzeitkultivierung geeignet ist, kultiviert werden. Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Verfahren jedoch die in vitro- Langzeitkultivierung eines isolierten Organs, ausgewählt aus endokrinen Organen, exokrinen Organen, Skelettmuskel, glattem Muskel, gastrointestinalen Organen, Urogenitalorganen, Lunge, Herz, Niere, Leber, Milz, Magen, Bronchialbaum, Arterien, Venen und Kapillargefäßen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem ein isoliertes, in vitro-langzeitkultiviertes Organ, das für eine Dauer von wenigstens 50 Stunden kultiviert ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das isolierte, in vitro-langzeitkultivierte Organ für eine Dauer von wenigstens 70 Stunden kultiviert. Vorzugsweise ist das isolierte, in vitro-langzeitkultivierte Organ erhältlich durch das erfindungsgemäße Verfahren zur in vitro-Kultivierung eines isolierten Organs.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft außerdem ein Kulturmedium zur in vitro-Langzeitkultivierung eines isolierten Organs, umfassend wenigstens ein anorganisches Salz, wenigstens eine der zusätzlichen Komponenten D(+)-Galaktose, Phenolrot, Natriumpyruvat und Glutathion, wenigstens ein Vitamin und wenigstens eine Animosäure, welches eine Kultivierung von isolierten Organen für eine Dauer von wenigstens 50 Stunden ermöglicht. Die anorganischen Salze, Vitamine und Aminosäuren sind dabei vorzugsweise aus den bereits zuvor genannten anorganischen Salzen, Vitaminen und Aminosäuren ausgewählt. Vorzugsweise enthält das erfindungsgemäße Kulturmedium weiterhin hitzeinaktiviertes Kälberserum und wenigstens ein Antibiotikum, um eine Kontamination des in vitro-kultivierten Organs durch Bakterien zu verhindern.
Vorzugsweise beträgt die Gesamtkonzentration der anorganischen Salze des erfindungsgemäßen Kulturmediums zwischen 250 und 20.000 mg/l, die Gesamtkonzentration der zusätzlichen Komponenten zwischen 300 und 2.000 mg/l, die Gesamtkonzentration der Aminosäuren zwischen 1.000 und 9.000 mg/l, die Gesamtkonzentration der Vitamine zwischen 3 und 30 mg/l, die Konzentration des hitzeinaktivierten Kälberserums zwischen 7,5 und 30 Gew.-% und die Antibiotikakonzentration zwischen 19 und 300 mg/l.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist das Kulturmedium die folgende Zusammensetzung auf:

Anorganische Salze

CaCl₂ (anhydr)	140,00 mg/l
KCl	400,00 mg/l
KH₂PO₄	60,00 mg/l
MgCl₂ (anhydr)	93,68 mg/l
MgSO₄ (anhydr)	97,67 mg/l
NaCl	8.000,00 mg/l
Na₂HPO₄	190,12 mg/l

Zusätzliche Komponenten

(+)-Galaktose	900,00 mg/l
Phenolrot	10,00 mg/l
Na-Pyruvat	550,00 mg/l
Glutathion	1-3 mmol/l

Aminosäuren

D,L-Alanin	225,00 mg/l
L-Arginin (freie Base)	500,00 mg/l
L-Asparagin	250,00 mg/l
L-Cystein (freie Base)	120,00 mg/l
L-Glutamin	300,00 mg/l
Glycin	20000 mg/l
L-Histidin (freie Base)	250,00 mg/l
L-Isoleucin	250,00 mg/l
L-Leucin	125,00 mg/l
L-Lysin (freie Base)	75,00 mg/l
D,L-Methionin	150,00 mg/l
D,L-Phenylalanin	250,00 mg/l
L-Serin	200,00 mg/l
L-Threonin	300,00 mg/l
L-Tryptophan	20,00 mg/l
L-Thyrosin	300,00 mg/l
L-Valin	100,00 mg/l

Vitamine

D-Ca-Pantothenat	1,00 mg/l
Cholinchlorid	1,00 mg/l
Folsäure	1,00 mg/l
i-Inositol	2,00 mg/l
Nikotinamid	1,00 mg/l
Pyridoxa*HCl	1,00 mg/l
Flavin-Mononukleotid	0,10 mg/l
Thiaminmonophosphat HCl	1,00 mg/l

Zusätzliche Bestandteile

Hitzeinaktiviertes Kälberserum	15 Gew.-%
Antibiotikum	100,00 mg/l

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist überdies eine transportable Vorrichtung zur in vitro-Langzeitkultivierung eines isolierten Organs, umfassend

a) ein Organbad zur Kultivierung des isolierten Organs,
b) wenigstens eine Zu- und Ableitung zu bzw. aus dem Organbad zur Superfusion des isolierten Organs und
c) wenigstens zwei Kapillaren zur Perfusion des isolierten Organs, die in wenigstens einer Ebene des Raumes stufenlos verstellbar sind, wobei sie an jeweils einem Ende eine Zu- bzw. Ableitung aufweisen und das jeweils andere Ende zur Kanülierung des Organvolumens dient.

Die nachfolgenden Figuren und das nachfolgende Beispiel sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Figuren

Fig. 1

Expression des Fremdproteins GFP in glatten Muskelzellen von Widerstandsgefäßen der Arteria femoralis profunda aus Hamster (b-e). Die glatten Muskelzellen der isolierten Widerstandsgefäße wurden mit Hilfe des erfindungsgemäßen in vitro-Transfektionsverfahrens mit einem GFP- kodierenden Plasmid transfiziert und danach konfokal abgetastet. Glatte Muskelzellen von isolierten, nicht transfizierten Widerstandsgefäßen zeigten keine Fluoreszenz (a), während isolierte, in vitro-transfizierte Widerstandsgefäße im Bereich des Cytosols der glatten Muskelzellen eine homogene GFP-vermittelte Fluoreszenz zeigten, wobei im Intrazellulärraum keine Fluoreszenz beobachtet werden konnte ((b): Gesamtübersicht; (c): 3.4x-Zoom). (d) zeigt eine 3D-Projektion, die aus 51 einzelnen konfokalen Lagen aufgebaut wurde. Eine kontinuierliche Anregung einer ausgewählten Region der Widerstandsgefäße bei 488 nm verursachte eine Fluoreszenzbleichung (e). (f) zeigt deformierte glatte Muskelzellen in Widerstandsgefäßen nach einer Transfektionsdauer von 25 h.

Fig. 2

Sphingosin-1-phosphat (S1P)-induzierte RhoA-vermittelte Konstriktionen der Widerstandsgefäße wurden durch Transfektion mit einem Plasmid, welches für die bakterielle C3-Transferase kodierte, verhindert. S1P- induzierte Konstriktionen, welche durch S1P-Konzentrationen im Bereich von 0,003-0,3 µmol/l verursacht wurden, können vollständig durch die exogen verabreichte RhoA-inhibierende Substanz C3-Transferase oder durch den Rho-Kinase-Inhibitor Y27632 verhindert werden. Die Wirkung einer in vitro-Transfektion der glatten Muskelzellen der Widerstandsgefäße mit einem C3-Transferase-kodierenden Plasmid war dieselbe, wie diejenige, die für exogen verabreichte C3-Transferase oder für Y27632 beobachtet werden konnte.

Fig. 3

Ansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur in vitro-Kultivierung von isolierten Organen.

Beispiel

Transfektion von glatten Muskelzellen in Widerstandsgefäßen der Arteria femoralis profunda aus Hamster

I. Einleitung

Um die Pathogenese von kardiovaskulären Erkrankungen besser verstehen zu können, werden neue Verfahren zur Analyse der vaskulären Genfunktion benötigt. Die folgende Studie zeigt, dass Nukleinsäuren hocheffektiv und spezifisch in Zielzellen von isolierten Widerstandsgefäßen einbracht werden können, wobei die Gefäßfunktion der Widerstandsgefäße unverändert erhalten bleibt.
Die Studie umfasst die in vitro-Transfektion von arteriellen glatten Muskelzellen von Widerstandsgefäßen der Arteria femoralis profunda aus Hamster mit Plasmid-DNA, welche unter anderem für das bakterielle Enzym C3-Transferase, das durch Sphingosin-1-phosphat (S1P) hervorgerufene, RhoA-abhängige Vasokonstriktionen hemmt, kodiert. Isolierte, perfundierte Widerstandsarterien wurden unter erfindungsgemäßen in vitro- Langzeitkultivierungsbedingungen für eine Transfektionsdauer von ca. 20 Stunden mittels des Transfektionsmittels Effectene® (Qiagen, Deutschland) mit einem C3-Transferase-kodierenden Plasmid transfiziert. In diesen Widerstandsarterien wurden die Antworten auf S1P, jedoch nicht die Antworten auf den Vasokonstriktor Norepinephrin, blockiert, was auch für die isolierten, nicht transfizierten Kontrollwiderstandsgefäße, welche mit exogener C3-Transferase oder dem Rho-Kinase-Inhibitor Y27632 behandelt wurden, gezeigt werden konnte.
Die erfindungsgemäße in vitro-Transfektion eines GFP-kodierenden Plasmids erzeugte weiterhin eine homogene GFP-Expression in nahezu allen glatten Muskelzellen der Arterienwand der Widerstandsgefäße bei vollständig erhaltener vaskulärer Funktion.

II. Durchführung

1. Präparation der Widerstandsgefäße der Arteria femoralis profunda aus Hamster

Die Widerstandsgefäße der Arteria femoralis profunda wurden aus dem Musculus gracilis eines Hamsters präpariert. Das Tier wurde dabei zunächst durch eine intraperitoneale Injektion von 50 mg/kg Körpergewicht Pentobarbital-Natrium anästhesiert und schließlich durch eine letale Dosis des Anästhetikums getötet. Zur Präparation wurde das Tier auf dem Rücken gelagert und die vorher rasierten Hinterläufe in Abduktionsstellung mit Bindfäden fixiert. Anschließend wurde die Haut und das subkutane Fettgewebe an einer der Oberschenkelinnenseiten unter kontinuierlicher Superfusion mit vorgekühlter (4°C) Standard-MOPS-Pufferlösung entfernt. Unter Zuhilfenahme eines Operationsmikroskops wurde mit einer Irisschere und mikrochirurgischen Pinzetten der Musculus gracilis durchtrennt und Gefäßaufzweigungen der ersten und zweiten Generation (Außendurchmesser 200-260 µm, Länge 1-2 mm) der Arteria femoralis profunda von adventitiellem Binde- und Fettgewebe befreit. Anschließend wurden die Gefäße exzidiert und entweder sofort zur Kanülierung in ein Organbad eingebracht oder aber bei 4°C bis zu 24 h in Standard-MOPS- Pufferlösung aufgewahrt, was die vasomototischen Gefäßeigenschaften der Präparate nicht beeinflusste.

2. Kanülierung der präparierten Widerstandsgefäße der Arteria femoralis profunda aus Hamster

Zur Kanülierung der präparierten Widerstandsgefäße dienten mit einem Mikropipettenpuller auf ca. 30 µm spitz ausgezogene Borsilikatglaskapillaren. Diese wurden an zwei gegenüber liegenden Auslegern der erfindungsgemäßen transportablen Vorrichtung zur in vitro- Langzeitkultivierung eines isolierten Organs befestigt, welche durch Mikromanipulatoren auf der einen Seite in der Höhe und auf der gegenüber liegenden Seite auf allen drei Ebenen des Raumes stufenlos verstellbar waren. Die Pipetten ragten in einem Winkel von ca. 45° in das kreisrunde, aus Edelstahl gefertigte Organbad, dessen Boden eine 50 µm dicke Quarzglasscheibe bildete. Nach Anbringen eines mit einem Dreiwegehahn- System versehenen Silikonschlauchs an das distale Ende beider Pipetten, wurden diese blasenfrei mit Standard-MOPS-Pufferlösung gefüllt. Danach wurde eine Heidelberger Verlängerung an einem 50 cm hohen Stativ befestigt und über einen der beiden Dreiwegehähne an eine der Kanülierungspipetten angeschlossen. Jetzt wurde die angeschlossene Leitung blasenfrei mit Standard-MOPS-Pufferlösung gefüllt. Durch den schwachen hydrostatischen Druck entstand nach Öffnen des Dreiwegehahns ein Fluss, der zum einen das Kanülieren der Gefäße erleichterte und zum anderen das Kollabieren des Gefäßlumens und damit einen möglichen Endothelschaden verhinderte. Anschließend wurde das Gefäß unter maximaler Vergrößerung (40fach) des OP-Mikroskops vorsichtig mit einer Mikropinzette an einem Ende unter Erhaltung des Lumens gefasst, auf eine der Pipettenspitzen bis zu einem Fünftel der Gesamtlänge aufgezogen und mit 11/O-Faden durch doppelten Knoten befestigt. Die zweite Pipette wurde mit Hilfe der Mikromanipulatoren unmittelbar am anderen Gefäßende positioniert und es wurde analog, wie oben beschrieben, verfahren. Danach wurde das kanülierte Gefäß auf Leckagen durch undichte Knoten oder kleine Gefäßabgänge überprüft. Konnte die Ursache von eventuellen Undichtheiten nicht behoben werden, wurde das Gefäß verworfen. Wies das kanülierte Gefäß hingegen keine Leckagen auf, so wurde es mit Hilfe der Mikromanipulatoren in der Mitte des Organbades bis auf ca. 1 mm über den Boden des Organbads abgesenkt und auf in vivo-Länge gespannt.

3. In vitro-Langzeitkultivierung der präparierten, kanülierten Widerstandsgefäße der Arteria femoralis profunda aus Hamster

Zur in vitro-Langzeitkultivierung der präparierten und kanülierten Widerstandsgefäße wurde die in dem Organbad befindliche Standard- MOPS-Pufferlösung entfernt und gegen das erfindungsgemäße Kulturmedium ausgetauscht. Des Weiteren wurden die Widerstandsgefäße kontinuierlich mit dem erfindungsgemäßen Kulturmedium perfundiert (Fluss 1 ml/h) und zugleich mit dem erfindungsgemäßen Kulturmedium superfundiert (Fluss 1 ml/h). Um eine optimale in vitro-Langzeitkultivierung der Widerstandsgefäße zu ermöglichen, enthielt das erfindungsgemäße Kulturmedium 20.000 U/l Penicillin und 20 mg/l, Streptomycin. Die Perfusionsrate wurde so gewählt, dass eine physiologische, konstante Scherbeanspruchung innerhalb des Bereich von 15-20 N/m² auf die Lumenoberfläche der Widerstandsgefäße einwirkte. So ermöglichte die Kombination aus innovativer Gerätetechnik und Entwicklung eines neuartigen Kulturmediums die in vitro-Langzeitkultivierung der isolierten Widerstandsgefäße der Arteria femoralis profunda aus Hamster über einen Zeitraum von wenigstens 72 h unter Beibehaltung der vollständigen Funktionsfähigkeit der Widerstandsgefäße.

4. Transfektion von glatten Muskelzellen der isolierten, in vitro- langzeitkultivierten Widerstandsgefäßes der Arteria femoralis profunda aus Hamster

Für eine selektive Transfektion der glatten Muskelzellen der Widerstandsgefäße wurde das erfindungsgemäße Kulturmedium in dem Organbad der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur in vitro-Kultivierung von isolierten Organen gegen erfindungsgemäßes Kulturmedium ausgetauscht, welches 60 µl eines nicht-liposomalen Lipidtransfektionsmittels (Effectene®, Qiagen, Deutschland) und 5 µg der zu transfizierenden Nukleinsäure, nämlich des Plasmids pEFmyc, welches entweder für GFP (green fluorescence protein) oder für die bakterielle C3-Transferase kodierte, ausgetauscht. Die Transfektion der zu transfizierenden Nukleinsäure in glatte Muskelzellen der Widerstandsgefäße erfolgte erfindungsgemäß unter in vitro-Langzeitkultivierungsbedingungen für eine Dauer von 19-22 h.

5. Funktionelle Untersuchung der isolierten, in vitro-transfizierten Widerstandsgefäße der Arteria femoralis profunda aus Hamster

Nach einer Transfektionsdauer von 19-22 h wurden die Widerstandsgefäße mit Standard-MOPS-Pufferlösung gewaschen, für 2 h mit dem Farbstoff Fura-2 inkubiert und mit dem Vasokonstriktor Norepinephrin (NE; 0,1, 0,3 und 1 µmol/l) und dem endothelabhängigen Vasodilator Acetylcholin (ACh; 1 µl/l) stimuliert. Die gleichzeitige Messung der intrazellulären Calcium- Konzentration der glatten Muskelzellen ([Ca²⁺]_i ) und des Durchmessers der Widerstandsgefäße wurde, wie von Bolz et al. in Br. J. Pharmacol. 128 (1): 124-134, 1999 beschrieben, durchgeführt. Für die Untersuchung der funktionellen Parameter wurden nur solche isolierten, in vitro-tranfizierten Widerstandsgefäße verwendet, die einen spontanen Tonus zeigten. Die isolierten, in vitro-transfizierten Widerstandsgefäße, die mit dem GFP- kodierenden Plasmid transfiziert wurden, wurden unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops untersucht, um die Gegenwart und die Verteilung der GFP-vermittelten Fluoreszenz innerhalb der Gefäßwand der Widerstandsgefäße zu bestimmen (Anregung bei 488 nm, Emission bei 535 nm). Um die Transfektionseffizienz der isolierten, in vitro-transfizierten Widerstandsgefäße zu untersuchen, welche mit dem für die bakterielle C3- Transferase kodierenden Plasmid transfiziert wurden, wurden die Widerstandsgefäße auf ihre kontraktile Antwort gegenüber dem RhoA- Aktivator S1P (0,003-3 µmol/l) hin untersucht. Die so mit den in vitro- transfizierten Widerstandsgefäßen erhaltenen Ergebnisse wurden mit Ergebnissen verglichen, die durch Inkubation von isolierten, nicht- transfizierten Widerstandsgefäßen mit exogen verabreichter bakterieller C3- Transferase oder mit dem Rho-Kinase-Inhibitor Y27632 und nachfolgender Stimulation mit 0,003-3 µmol/l S1P erhalten wurden. Die isolierten, in vitro- transfizierten Widerstandsgefäße, die mit dem GFP-kodierenden Plasmid transfiziert wurden, wurden wiederholt mit S1P stimuliert, um Zeit- und transfektionsabhängige, unspezifische Effekte zu untersuchen.
Eine statistische Analyse der so erhaltenen Ergebnisse erfolgte wie folgt: Konstriktionen als Antwort auf Norepinephrin oder S1P wurden als "Prozent des maximalen Durchmessers" = ((dia_vc - dia_max)/dia_max) × 100 ausgedrückt, wobei dia_vc den Gleichgewichtsaußendurchmesser 2 min nach der Stimulierung mit der entsprechenden Dosis der vasokonstriktorischen Substanz darstellt und dia_max den maximalen Durchmesser darstellt, der in Ca²⁺-freiem MOPS-Puffer, der 1 µmol/l EGTA enthielt, erhalten wird. Alle Durchmesser beziehen sich auf einen transmuralen Druck von 45 mmHg. Alle im folgenden dargestellten Ergebnisse stellen Mittelwerte aus den Experimenten dar, wobei n die Anzahl der untersuchten Widerstandsgefäße der Arteria femoralis profunda aus Hamster darstellt.

III. Ergebnisse

1. GFP-vermittelte Fluoreszenz innerhalb der Gefäßwände der Widerstandsgefäße der Arteria femoralis profunda aus Hamster

Die Anzahl der Schichten, bestehend aus glatten Muskelzellen, der Gefäßwände der Widerstandsgefäße wurden mittels konfokaler Mikroskopie auf 3-4 Schichten bestimmt.
Wurden isolierte, nicht-transfizierte Widerstandsgefäße der Arteria femoralis profunda bei 488 nm angeregt, emittierten die glatten Muskelzellen der Widerstandsgefäße keine Fluoreszenz (Fig. 1(a)). Im Gegensatz dazu zeigten die glatten Muskelzellen der isolierten, in vitro- transfizierten Widerstandsgefäße, welche für eine Transfektionsdauer von 19-22 h mit dem GFP-kodierenden Plasmid transfiziert wurden, eine maximale und homogene Fluoreszenzemission über alle glatten Muskelzellen der verschiedenen Schichten der Widerstansgefäße, bestehend aus glatten Muskelzellen (Fig. 1 (b-d)) sowie entlang der Längsachse der Gefäßwand der untersuchten Widerstandsgefäße hinweg (Fig. 1(e)). Die emittierte Fluoreszenz bezog sich ausschließlich auf das Cytosol der glatten Muskelzellen der Widerstandsgefäße. Auch durch stärkere Vergrößerung konnte mittels konfokaler Mikroskopie gezeigt werden, dass keine Fluoreszenz innerhalb des Extrazellulärraums beobachtet werden konnte (Fig. 1(d)). Eine kontinuierliche Anregung bei 488 nm verursachte ein Ausbleichen der GFP-vermittelten Fluoreszenz (Fig. 1(e)), beeinflusste jedoch nicht die Hintergrundfluoreszenz, welche beispielsweise durch Matrixkomponenten emittiert wurde (Fig. 1(a)).
Die funktionelle Untersuchung der isolierten, in vitro-transfizierten Widerstandsgefäße ergab eine intakte Kontraktilität, induziert durch NE, und eine Zunahme des transmuralen Druckes (Bayliss-Effekt). Die zuletzt genannten myogenen Konstriktionen der glatten Muskelzellen der Gefäßwand der Widerstandsgefäße kehrten druckinduzierte Ausdehnungen zu 55 ± 7% innerhalb von 8 min um, wobei diese sich nicht erheblich von denjenigen unterschieden, die für isolierte, nicht-transfizierte Arterien (49 ± 40% in frisch isolierten und 51 ± 16% in kultivierten Widerstandsgefäßen der Arteria femoralis profunda) beobachtet wurden. Alle isolierten, in vitro-transfizierten Widerstandsgefäße dilatierten vollständig nach Stimulation mit 1 µmol/l des endothelabhängigen Vasodilators ACh, was darauf hinweist, dass die Transfektion der glatten Muskelzellen der Widerstandsgefäße die Endothelfunktion nicht beeinflusst.
Die vaskulären Antworten nahmen mit der Zeit zunehmend ab, wenn die Widerstandsgefäße länger als 22 h dem zu transfizierenden Plasmid und dem Transfektionsmittel ausgesetzt wurden. Isolierte, in vitro-transfizierte Widerstandsgefäße, welche für eine Dauer von 24 h oder länger transfiziert wurden, zeigten keine kontraktilen Antworten gegenüber Noradrenalin mehr und die myogenen Antworten als auch die Dilatationen, induziert durch Acetylcholin, waren aufgehoben. Endsprechend konnte durch konfokales Abtasten eine auffallende Veränderung der Form der Zellen beobachtet werden (Fig. 1(f)).

2. S1P-induzierte Konstriktionen der isolierten, in vitro-transfizierten Widerstandsgefäße der Arteria femoralis profunda aus Hamster

S1P (0,003-3 mMol) induzierte konzentrationsabhängige Konstriktionen in isolierten, GFP-in vitro-transfizierten Widerstandsgefäßen. Die durch S1P- induzierten Konstriktionen waren jedoch vollständig irreversibel, nachdem S1P durch Waschen der Widerstandsgefäße entfernt wurde bzw. waren unverändert nach wiederholten Stimulationen. Die Konstiktionen als Antwort auf 0,003, 0,03 und 0,3 µmol/l S1P waren streng abhängig von RhoA und Rho-Kinase, da sie durch das exogen verabreichte RhoA- inhibierende bakterielle Toxin C3-Transferase als durch den Rho-Kinase- Inhibitor Y27632 unterdrückt wurden (Fig. 2). Die Transfektion der isolierten Widerstansgefäße mit dem für die bakterielle C3-Transferase kodierenden Plasmid verhinderte S1P-induzierte Konstriktionen auf eine ähnliche Art und Weise, wie die herkömmlichen Verfahren (exogene C3- Transferase und Y27623, Fig. 2).

IV. Diskussion

Diese Studie beschreibt ein neues Transfektionsverfahren, welches eine hocheffiziente Transfektion von glatten Muskelzellen von intakten, isolierten Widerstandsgefäßen der Arteria femoralis profunda aus Hamster mit Plasmid-DNA ermöglicht. Funktionelle Untersuchungen nach der Transfektion der glatten Muskelzellen der Widerstandsgefäße mit einem Plasmid, welches für GFP kodierte und die Regulation der Gefäßfunktion der Widerstandsgefäße nicht stören sollte, zeigten, dass das erfindungsgemäße Transfektionsverfahren per se die vaskulären Antworten auf die verschiedenen vasokonstriktorischen und vasodilatorischen Stimuli nicht beeinflusst. Die Transfektion der isolierten Widerstandsgefäße mit einem weiteren Plasmid, welches für ein Protein mit bekannten RhoA- inhibierenden Eigenschaften, nämlich der bakteriellen C3-Transferase, kodierte, verhinderte Sphingosin-1-phosphat (S1P)-induzierte RhoA- vermittelte Konstriktionen. Dieses neue Transfektionsverfahren stellt somit erstmals ein Mittel zur ausreichenden genetischen Manipulation von glatten Muskelzellen in intakten, isolierten Widerstandsgefäßen bereit, das weiterhin auch die funktionelle Untersuchung von Änderungen, die durch die Proteinprodukte der transfizierten DNA-Plasmide vermittelt werden, ermöglicht.
Glatte Muskelzellen von isolierten, nicht -transfizierten Widerstandsgefäßen zeigten keine Fluoreszenz nach Anregung bei 488 nm. Eine Transfektionsdauer von 19-22 h für eine Transfektion der isolierten Widerstandsgefäße mit dem GFP-kodierenden Plasmid, lieferte eine homogene Expression von GFP, was durch die charakteristische GFP- vermittelte Fluoreszenz entlang der Widerstandsgefäße und durch die verschiedenen Schichten der glatten Muskelzellen der Gefäßwand hinweg nachgewiesen werden konnte. Im Gegensatz zur Autofluoreszenz der Matrixkomponenten, welche durch kontinuierliche Anregung bei 488 nm nicht ausbleichte, war die GFP-vermittelte cytosolische Fluoreszenz empfindlich gegenüber einer Ausbleichung. Dies unterstreicht weiterhin die Annahme, dass die cytosolische Fluoreszenz der glatten Muskelzellen der isolierten, in vitro-transfizierten Widerstandsgefäße, welche in isolierten, nicht transfizierten Widerstandgefäßen nicht beobachtet werden konnte, durch das in den glatten Muskelzellen der Widerstandsgefäße exprimierte GFP verursacht wurde. Die äußeren und Subendothel-Schichten aus glatten Muskelzellen der Widerstandsgefäßwand zeigten eine einheitliche GFP- vermittelte Fluoreszenz, was darauf hindeutet, dass die verschiedenen Schichten aus glatten Muskelzellen einheitlich mit dem GFP-kodierenden Plasmid transfiziert wurden. Jedoch scheint die Basalmembran zwischen den glatten Muskelzellen und den Endothelzellen der Widerstandsgefäßwände eine undurchlässige Barriere für die zu transfizierenden Nukleinsäuren darzustellen, da keine der Endothelzellen GFP exprimierte.
Die Inhibierung von RhoA durch C3-Transferase, welche nach Transfektion mit dem C3-Transferase-kodierenden Plasmid in den glatten Muskelzellen der Widerstandsgefäße synthetisiert wurde, entsprach der RhoA- Inhibierung, welche für exogen verabreichte C3-Transferase oder für Y27632 beobachtet werden konnte. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Inhibierung der S1P-induzierten, RhoA-vermittelten kontraktilen Antworten homogen entlang des kanülierten Widerstandsgefäßes war. Nachdem das 25 kD-große Enzym C3-Transferase zu groß ist, um Gap- junctions zu Durchqueren und eindeutig aus der Transfektion der glatten Muskelzellen der Widerstandsgefäße resultiert, konnten diese Experimente zeigen, dass alle glatten Muskelzellen innerhalb der Gefäßwand der Widerstandsgefäße mit dem Plasmid transfiziert wurden, da eine homogene Inaktivierung von RhoA die Expression der C3-Transferase in allen glatten Muskelzellen der Widerstandsgefäße erfordert.
Für optimale in vitro-Transfektionsergebnisse sollte die Dauer der in vitro- Transfektion der Widerstandsgefäße zwischen 19 und 22 h betragen. Der Grund für eine zunehmende Abnahme der Gefäßreaktivität nach einer Transfektionsdauer von größer 22 h könnte sein, dass die Transkription des transfizierten Plasmids üblicherweise durch starke virale Promotoren gesteuert wird, wodurch große Teile des Biosytheseapparats der transfizierten glatten Muskelzellen damit beschäftigt sind, das Fremdprotein zu synthetisieren. Diese Promotoren können aufgrund ihrer viralen Natur nicht durch die Wirtszelle reguliert werden, was in kurzer Zeit zu großen Mengen des Plasmid-kodierten Fremdproteins führt. Um nur begrenzt vorhandene zelluläre Ressourcen einzusparen, nimmt die permanente, notwendige Regenerierung der zellulären Proteine ab. Dies resultiert in einem Nettoverlust an strukturellen und funktionellen zellulären Proteinen, wie z. B. Actin und Myosin, und ist womöglich der Grund für den vollständigen Verlust der Kontraktilität in Verbindung mit den beobachteten Zelldeformationen, wenn die Transfektionsdauer der Widerstandsgefäße 22 h übersteigt.
Zusammenfassend kann also festgestellt werden, dass die vorliegende Erfindung eine neues Verfahren zur Untersuchung der funktionellen Eigenschaften von Gefäß-relevanten Genen bereitstellt. Zudem stellt das erfindungsgemäße Verfahren zur in vitro-Transfektion von isolierten Organen ein neues Mittel bereit, um den genetischen Hintergrund der mikrovasculären Physiologie zu untersuchen und ermöglicht die Identifikation und Charakterisierung neuer Targets für innovative therapeutische Strategien.

Claims

1. Verfahren zur Transfektion von Zielzellen in einem Organ, umfassend die Schritte:

a) Langzeitkultivieren des isolierten Organs in vitro und

b) Inkontaktbringen des isolierten Organs während der Langzeitkultivierung mit einem Transfektionsmittel unter derartigen Bedingungen, dass eine Transfektion von wenigstens 80% der Zielzellen in dem Organ erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dass die Transfektion der Zielzellen in dem Organ mit einem Molekül, ausgewählt aus Nukleinsäuren, Polypeptiden, Pharmaka, synthetischen Stoffen, Zuckern, Fettsäuren, Derivaten und/oder Komplexen davon, erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren in einzelsträngiger oder doppelsträngiger Form vorliegen.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren ausgewählt sind aus DNA, RNA, PNA und Analoga davon.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren in operativer Verknüpfung mit einer heterologen Expressionskontrollsequenz vorliegen.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren für ein Polypeptid kodieren.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das isolierte Organ ein vollständiges Organ oder ein Fragment davon ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das isolierte Organ während des Langzeitkultivierens perfundiert oder superfundiert wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Perfusion oder Superfusion mit Kulturmedium erfolgt.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Superfusion bei einem Fluss von 0,1 ml/h bis 300 l/h bzw. die Perfusion bei einem Fluss von 0,1 ml/h bis 300 l/h und/oder einem Druck von 0-300 mmHg erfolgt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Perfusion über wenigstens eine Arterie oder Vene oder wenigstens ein Kapillargefäß des isolierten Organs erfolgt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das isolierte Organ ausgewählt ist aus Arterien, Venen, Kapillargefäßen, endokrinen Organen, exokrinen Organen, Skelettmuskel, glattem Muskel, gastrointestinalen Organen, Urogenitalorganen, Lunge, Herz, Niere, Leber, Milz, Magen und Bronchialbaum.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielzellen in dem Organ funktionelle Zellen des Organs sind.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Langzeitkultivieren für wenigstens 50 Stunden erfolgt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Langzeitkultivieren für wenigstens 70 Stunden erfolgt.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Transfektionsdauer 10 Minuten bis 50 Stunden beträgt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Transfektionsdauer vorzugsweise 10 bis 22 Stunden beträgt.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Organ eine Arterie, Vene oder ein Kapillargefäß ist und die Zielzellen in dem Organ glatte Muskelzellen, Endothelzellen oder adventitielle Zellen sind.

19. Isoliertes, in vitro-transfiziertes Organ, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18.

20. Isoliertes, in vitro-transfiziertes Organ, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens 80% der Zielzellen des Organs transfiziert sind.

21. Isoliertes, in vitro-transfiziertes Organ nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielzellen des Organs mit einem Molekül, ausgewählt aus Nukleinsäuren, Polypeptiden, Pharmaka, synthetischen Stoffen, Zuckern, Fettsäuren, Derivaten und/oder Komplexen davon, transfiziert sind.

22. Isoliertes, in vitro-transfiziertes Organ nach einem der Ansprüche 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass es aus Arterien, Venen, Kapillargefäßen, endokrinen Organen, exokrinen Organen, Skelettmuskel, glattem Muskel, gastrointestinalen Organen, Urogenitalorganen, Lunge, Herz, Niere, Leber, Milz, Magen und Bronchialbaum ausgewählt ist.

23. Isoliertes, in vitro-transfiziertes Organ nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass es ein langzeitkultiviertes Organ ist.

24. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18 oder eines isolierten, in vitro-transfizierten Organs nach einem der Ansprüche 19 bis 23 zur Untersuchung von Krankheiten, die das Organ betreffen.

25. Verwendung nach Anspruch 24 zur Untersuchung von Krankheiten, die mit erhöhtem oder erniedrigtem Blutdruck verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, dass das Organ eine Arterie oder ein Kapillargefäß ist.

26. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18 oder eines isolierten, in vitro-transfizierten Organs nach einem der Ansprüche 19 bis 23 zur Identifizierung von Wirksubstanzen zur Prävention und/oder Behandlung von Krankheiten, die das Organ betreffen.

27. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18 oder eines isolierten, in vitro-transfizierten Organs nach einem der Ansprüche 19 bis 23 zur Identifizierung neuer Targets.

28. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18 oder eines isolierten, in vitro-transfizierten Organs nach einem der Ansprüche 19 bis 23 zur Identifizierung der Wirkung von therapeutischen Maßnahmen auf das Organ bzw. auf die das Organ betreffenden Krankheiten.

29. Verwendung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die therapeutischen Maßnahmen eine Gentherapie umfassen.

30. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18 oder eines isolierten, in vitro-transfizierten Organs nach einem der Ansprüche 19 bis 23 zur Entwicklung innovativer pharmakologischer Strategien zur Prävention und/oder Behandlung von Krankheiten, die das Organ betreffen.

31. Verfahren zur in vitro-Langzeitkultivierung eines isolierten Organs, umfassend das Kultivieren des isolierten Organs unter derartigen Bedingungen, dass die Kultivierungsdauer wenigstens 50 h beträgt.

32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierungsdauer wenigstens 70 h beträgt.

33. Verfahren nach Anspruch 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, dass das isolierte Organ während des Kultivierens perfundiert oder superperfundiert wird.

34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Perfusion oder Superperfusion mit Kulturmedium erfolgt.

35. Verfahren nach Anspruch 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, dass die Superfusion bei einem Fluss von 0,1 ml/h bis 300 l/h bzw. die Perfusion bei einem Fluss von 0,1 ml/h bis 300 l/h und/oder einem Druck von 0-300 mmHg erfolgt.

36. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Perfusion über wenigstens eine Arterie oder Vene oder wenigstens ein Kapillargefäß des isolierten Organs erfolgt.

37. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass das isolierte Organ ausgewählt ist aus Arterien, Venen, Kapillargefäßen, endokrinen Organen, exokrinen Organen, Skelettmuskel, glattem Muskel, gastrointestinalen Organen, Urogenitalorganen, Lunge, Herz, Niere, Leber, Milz, Magen und Bronchialbaum.

38. Isoliertes, in vitro-langzeitkultiviertes Organ erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 37.

39. Isoliertes, in vitro-langzeitkultiviertes Organ, dadurch gekennzeichnet, dass es für eine Dauer von wenigstens 50 h kultiviert ist.

40. Isoliertes, in vitro-langzeitkultiviertes Organ nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass es vorzugsweise für eine Dauer von wenigstens 70 h kultiviert ist.

41. Kulturmedium zur in vitro-Langzeitkultivierung eines isolierten Organs, umfassend wenigstens ein anorganisches Salz, wenigstens eine zusätzliche Komponente, ausgewählt aus D(+)-Galaktose, Phenolrot, Na-Pyruvat und Glutathion, wenigstens eine Aminosäure und wenigstens ein Vitamin, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Kultivierung von isolierten Organen für eine Dauer von wenigstens 50 Stunden ermöglicht.

42. Kulturmedium nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass die anorganischen Salze ausgewählt sind aus wasserfreiem CaCl₂, KCl, Kh₂PO₄, wasserfreiem MgCl₂, wasserfreiem MgSO₄, NaCl, Na₂hPO₄.

43. Kulturmedium nach Anspruch 41 oder 42, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuren ausgewählt sind aus D,L-Alanin, L-Arginin, L- Asparagin, L-Cystein, L-Glutamin, Glycin, L-Histidin, L-Isoleucin, L- Leucin, L-Lysin, D,L-Methionin, D,L-Phenylalanin, L-Serin, L- Threonin, L-Tryptophan, L-Thyrosin, L-Valin.

44. Kulturmedium nach einem der Ansprüche 41 bis 43, dadurch gekennzeichnet, dass die Vitamine ausgewählt sind aus D-Ca-Pantothenat, Cholinchlorid, Folsäure, i-Inositol, Nikotinamid, Pyridoxal, Flavin- Mononukleotid und Thiaminmonophosphat.

45. Transportable Vorrichtung zur in vitro-Langzeitkultivierung eines isolierten Organs, umfassend

a) ein Organbad zur Kultivierung des isolierten Organs,

b) wenigstens eine Zu- und Ableitung zu bzw. aus dem Organbad zur Superfusion des isolierten Organs und

c) wenigstens zwei Kapillaren zur Perfusion des isolierten Organs, die in wenigstens einer Ebene des Raumes stufenlos verstellbar sind, wobei sie an jeweils einem Ende eine Zu- bzw. Ableitung aufweisen und das jeweils andere Ende zur Kanüllierung des Organvolumens dient.