WO2003078606A2 - In vitro transfektion und langzeitkultivierung von isolierten organen - Google Patents

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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the invention relates to isolated organs with functional smooth muscle cells transfected in v / fro, their production and their use for the genetic and / or pharmacological examination of diseases. Furthermore, the invention relates to a culture medium and a transportable device for in-v / yro long-term cultivation of organs.
  • a widely used method for introducing DNA into cells is based on bringing the cells to be transfected into contact with naked DNA under cell culture conditions.
  • this method only results in very low transfection rates of less than 40% (Kaiser et al., J. Vase. Res. 38 (2): 1 33-1 43, 2001; Huang et al., J. Biol. Chem. 274 (49): 35095-35098, 1 999; Maasch et al., FASEB J. 1 4 (1 1): 1 653-1 663, 2000 and Wolff et al., Science 247: 1 465-1468, 1 990) ,
  • Nucleic acid molecules on transport vesicles e.g. Liposomes or
  • nucleic acid molecules into vascular wall cells of blood vessels, however, has gaveling disadvantages which severely restrict the use of the method.
  • the nucleic acid used has gaveling disadvantages which severely restrict the use of the method.
  • Transport vesicles are potentially toxic to the cells to be transfected and can cause immunological reactions. Furthermore, the nucleic acid transport vesicles used can trigger mutations and induce cell degeneration (oncogenesis).
  • the present invention was therefore based on the object of providing a method for transfecting an isolated organ which does not have the disadvantages of the prior art and a specific and highly efficient transfection of target cells in the organ, in particular smooth muscle cells, and a subsequent investigation of the effect of the transfected molecules on organ function, in particular on contractility.
  • a first subject of the invention is therefore an isolated in vitro transfected organ which contains smooth muscle cells, at least 80%, preferably at least 90% and particularly preferably at least 95% of the smooth muscle cells in the isolated organ being transfected.
  • smooth muscle cells in addition to smooth muscle cells, other cells of the organ, for example adventitial cells and / or endothelial cells with the same or different molecules, can be transfected.
  • selective transfection of smooth muscle cells may be desirable.
  • Another aspect of the invention is a method for transfecting smooth muscle cells in an organ, comprising the steps of: (i) culturing an isolated organ containing smooth muscle cells in vitro and
  • a cultivation protocol according to the invention in particular a long-term cultivation protocol for isolated organs, preferably in conjunction with innovative device technology, extended transfection times and suitable transfection agents, for the first time provides a method for in-v / tro-transfection of smooth muscle cells in an organ, which requires a specific transfection of at least 80% of the smooth muscle cells in the isolated organ under conditions close to where they were optimized for the corresponding organ.
  • the isolated organs transfected in v / fro can be cultivated for a period of at least 50 hours while maintaining their full v / Vo functionality, so that a continuous investigation of the effect of the transfected molecules on organ function is possible several hours to days.
  • the method according to the invention further prevents the development of tissue damage in the organ transfected in v / yro, as a result of which a subsequent reimplantation of the organ into a patient is possible. Because of the low technical complexity of the method according to the invention, it can also be used in any conventional standard laboratory to transfect smooth muscle cells in any organ capable of transfection.
  • Step (i) of the method according to the invention is based on in vitro cultivation, preferably long-term cultivation, of the isolated organ to be transfected.
  • in vitro long-term cultivation encompasses culturing an isolated organ in vitro for a period of at least 50 hours, preferably at least 70 hours, the in V ⁇ function of isolated organ over the duration of being fully preserved in ' fro cultivation.
  • the in 'tro-culturing the isolated organ from step (i) involves first providing the isolated organ to be transfected.
  • the preparation of the organ from a suitable donor organism such as an animal (hamster,
  • the cultivation comprises transferring the isolated organ after preparation to one that is suitable for long-term cultivation
  • Device comprising at least one organ bath with culture medium.
  • the cultivation from step (i) of the process according to the invention is particularly preferably carried out at a temperature between 3 and 45 ° C. and / or a pH between 4 and 9.
  • the culture medium used for step (i) preferably comprises at least one inorganic salt selected from CaCI 2 , KCI, KH 2 P0 4 , MgCl 2 , MgS0 4 , NaCI and Na 2 HP0 4 , at least one of the additional components selected from D (+ ) -Galactose, phenol red, sodium pyruvate and glutathione, at least one of the vitamins selected from D-ca-pantothenate, choline chloride, folic acid, i-inositol, nicotinamide, pyridoxal, flavin mononucleotide and thiamine monophoshate, and at least one of the amino acids from D, L-alanine, L-arginine, L-asparagine, L-cysteine, L-glutamine, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, D, L-methionine, D,
  • the culture medium may additionally contain heat-inactivated calf serum and / or at least one antibiotic as further constituents in order to prevent bacterial contamination of the isolated organ during in vitro long-term cultivation.
  • the isolated organ is superfused with culture medium during the cultivation according to step (i).
  • the isolated organ is preferably superfused with culture medium at a flow of 0.1 ml / h to 300 l / h.
  • the isolated organ is perfused during the cultivation according to step (i).
  • the isolated organ is preferably perfused at a flow of 0.1 ml / l to 300 l / h and / or a pressure of 1-300 mmHg.
  • a perfusion medium for example, pure culture medium, culture medium which is mixed with transfection agent and molecules to be transfected as well as a physiological buffer is suitable.
  • the isolated organ is preferably perfused via the organ lumen.
  • the organ lumen of the isolated organ is cannulated for perfusion of the lumen during the cultivation. Methods for cannulating the organ lumen of isolated organs are well known to those skilled in the art.
  • the perfusion of the isolated organ can preferably also take place via at least one cannulated artery or vein or at least one cannulated capillary vessel of the isolated organ.
  • the cannulation of at least one artery or vein or at least one capillary of the isolated organ can be carried out according to conventional methods known to those skilled in the art.
  • Step (ii) of the method according to the invention is based on bringing the isolated organ into contact during the in vitro long-term cultivation with a suitable transfection agent under conditions such that a transfection of at least 80% of the smooth muscle cells takes place in the isolated organ.
  • the transfection efficiency can be quantified as described in the examples.
  • the transfection agents covered by the present invention are preferably harmless to the target cells to be transfected in the organ, ie they do not have a cytotoxic effect on the target cells and do not dissolve any Mutations and do not cause immunological reactions.
  • the transfection agent used in the present process is a non-liposomal lipid formulation, such as transfection Effectene 0 or Superfect ® (Qiagen, Germany).
  • the cytotoxicity of transfection agents can be determined as described in the examples.
  • the contacting of the isolated organ in step (ii) of the method according to the invention preferably takes place during the cultivation with the transfection agent for a period of from 10 minutes to 50 hours.
  • the transfection time required to transfect an organ depends on several factors, such as the type of organ, the type of target cells to be transfected in the organ, the number of target cells to be transfected, etc. and can easily be determined by a person skilled in the art taking into account the factors mentioned above. However, the transfection time is particularly preferably 1 0-22 hours.
  • transfection encompasses any possible way of introducing molecules into target cells of the organ to be transfected.
  • the molecules to be transfected are preferably selected from nucleic acids, polypeptides, pharmaceuticals, synthetic substances, sugars, fatty acids, derivatives and / or complexes thereof.
  • the nucleic acids to be transfected can be in single-stranded or double-stranded form, for example as RNA, DNA or nucleic acid analogs, such as PNA.
  • the nucleic acids to be transfected are operatively linked to an expression control sequence, so that after transfection they can be transcribed or translated in the target cells of the organ.
  • Suitable expression control sequences usually comprise a promoter and optionally regulatory sequences, such as operators or enhancers. Translation initiation sequences may also be present.
  • Appropriately suitable expression control sequences for Eukaryotic host cells are well known to those skilled in the art (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1,989), Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • the transfection can be carried out with a nucleic acid which codes for a functional gene which is expressed in the transfected cells and is particularly preferably overexpressed.
  • the nucleic acid can thus code for a polypeptide, ie a protein or a functional fragment thereof.
  • the nucleic acid to be transfected preferably codes for a polypeptide which is associated with diseases which affect the corresponding organ.
  • the polypeptide overexpressed in the target cell can be an endogenous polypeptide, ie a polypeptide which corresponds to a polypeptide naturally occurring in the target cell, or an exogenous polypeptide, eg a polypeptide from another organism or a polypeptide modified by recombinant techniques.
  • oligonucleotides e.g. Antisense molecules, ribozymes or RNAi molecules are carried out in order to specifically inhibit the expression of an endogenous gene present in the target cell.
  • the method according to the invention for the transfection of target cells in an organ enables highly efficient and specific transfection of target cells from organs with smooth muscle cells, such as, for example, an endocrine organ, an exocrine organ, a skeletal muscle, a smooth muscle, a gastrointestinal organ, an urogenital organ, from the lungs , Bronchial tree, heart, kidney, liver, spleen, stomach, an artery, a vein and a capillary.
  • smooth muscle cells such as, for example, an endocrine organ, an exocrine organ, a skeletal muscle, a smooth muscle, a gastrointestinal organ, an urogenital organ, from the lungs , Bronchial tree, heart, kidney, liver, spleen, stomach, an artery, a vein and a capillary.
  • the target cells to be transfected include smooth muscle cells and possibly other cell types occurring in the organ, such as, for example, parenchyma cells, epithelial cells, nerve cells, connective tissue cells, fat cells, endothelial cells, adventitial cells of the blood vessels; Hepatocytes, Kupffer cells and epithelial cells of the liver; Reticular cells or blood cells such as lymphocytes Monocytes, plasma cells and macrophages of the spleen, thymus, lymph gland and bone marrow; Epithelial cells, goblet cells, mucous cells and alv.eolar cell cells of the lungs and adipocytes of the adipose tissue.
  • the organ is preferably a mammalian organ, particularly preferably a human organ.
  • the method according to the invention also enables the transfection of organ parts or fragments.
  • the method according to the invention is used for the highly efficient and specific transfection of smooth muscle cells in blood vessels, such as arteries, veins or capillary vessels, at least 80%, preferably at least 90% and particularly preferably at least 95% of the smooth muscle cells being transfected.
  • the term "in v / yro-transfected" as used herein encompasses any possible manner of introducing molecules into target cells of the organ under in Y / O conditions.
  • the isolated organ transfected in v / Yr ⁇ according to the invention can be transfected with any molecule capable of transfection.
  • the isolated organ which has been transfected in v / yro is preferably transfected with a molecule already mentioned above, such as, for example, a nucleic acid, a polypeptide, a pharmaceutical, a synthetic substance, a sugar, a fatty acid or a derivative and / or complex thereof.
  • the isolated, yro-transfected organ is a long-term cultivated organ.
  • the organ according to the invention preferably contains transfected smooth muscle cells which are functional.
  • the transfected smooth muscle cells have the ability to contract.
  • Yet another object of the present invention is the use of an isolated, in v / yro-transfected organ, wherein at least 80%, particularly preferably at least 90% and most preferably at least 95% of target cells, in particular smooth muscle cells of the organ with one for one Nucleic acid molecules encoding the polypeptide are transfected, the polypeptide being expressed (over) in the target cells to determine whether the polypeptide expressed (over) in the target cells modulates the functionality of the target cells or the isolated organ, if appropriate in the presence of active substances.
  • the function of a polypeptide is preferably examined with regard to contractility-modulating properties in an organ with smooth muscle cells.
  • the vascular function of a polypeptide is particularly preferably examined.
  • Yet another object of the present invention is the use of an isolated, yro-transfected organ according to the invention for the investigation of diseases affecting the organ.
  • smooth muscle cells and optionally endothelial cells can be transfected in arteries or capillary vessels with the aid of the method according to the invention, in order to investigate diseases which are associated with increased or decreased blood pressure.
  • Yet another object of the invention is the use of the method according to the invention for the transfection of target cells in an organ or of an isolated organ according to the invention transfected in Yr ⁇ for the identification of active substances for the prevention and / or treatment of diseases which affect the organ.
  • active substances for the prevention and / or treatment of diseases which affect the organ.
  • smooth muscle cells and possibly endothelial cells from arteries or capillary vessels can be transfected with active substances with the aid of the method according to the invention in order to investigate their effect for the prevention and / or treatment of diseases which are associated with increased and / or reduced blood pressure.
  • Yet another object of the invention is the use of the method according to the invention for the transfection of target cells in an organ or an isolated organ according to the invention, transfected in yro, for the identification of new targets for innovative therapeutic strategies.
  • the invention relates to the use of the method according to the invention for the transfection of target cells in an organ or an isolated organ in v / yro transfected according to the invention for identifying the effect of therapeutic measures on the organ or on the diseases affecting the organ.
  • the therapeutic measures preferably include gene therapy.
  • Yet another object of the invention is also the use of the method according to the invention for the transfection of target cells in an organ or of an isolated organ in v / yro transfected according to the invention for the development of innovative pharmacological strategies for the prevention and / or treatment of diseases which affect the organ ,
  • the present invention relates to a method for the in vitro long-term cultivation of an isolated organ, comprising culturing the isolated organ under conditions such that the cultivation time is at least 50 hours.
  • the isolated organ can preferably be cultivated with the aid of the method according to the invention for in v / yro long-term cultivation for a cultivation period of at least 70 hours.
  • the cultivation conditions are chosen so that the functionality of the isolated organ during in vitro Long-term cultivation remains intact.
  • Long-term cultivation of the isolated organ is preferably carried out in a device which contains at least one organ bath.
  • the long-term cultivation in wYr ⁇ is preferably carried out at a temperature between 3 and 45 ° C. and / or a pH between 4 and 9.
  • the culture medium used for in v / tro long-term cultivation of the isolated organ comprises at least one inorganic salt, at least one additional component selected from D (+) galactose, phenol red, Na pyruvate and glutathione, at least one vitamin and at least one amino acid.
  • the inorganic salts, vitamins and amino acids are preferably selected from the aforementioned inorganic salts, vitamins and amino acids.
  • the culture medium may contain heat-inactivated calf serum and at least one antibiotic as further components in order to prevent contamination of the isolated organ by bacteria.
  • the isolated organ as already described above, is superfused with culture medium during the long-term in v / yro cultivation.
  • the superfusion is preferably carried out with culture medium at a flow of 0.1 ml / h to 300 l / h.
  • the isolated organ is perfused during long-term in v / yro cultivation.
  • the organ is preferably perfused at a flow of 0.1 ml / h to 300 l / h and / or a pressure of 0-300 mmHg.
  • Perfusion of the isolated organ during the in vitro long-term cultivation according to the invention can be carried out as already described above. With the aid of the method according to the invention, any organ which is suitable for long-term in v / yro cultivation can be cultivated.
  • the method according to the invention preferably comprises the in vitro long-term cultivation of an isolated organ, selected from endocrine organs, exocrine organs, skeletal muscle, smooth muscle, gastrointestinal organs, urogenital organs, lungs, heart, kidney, liver, spleen, stomach, bronchial tree, arteries, veins and capillaries.
  • an isolated organ selected from endocrine organs, exocrine organs, skeletal muscle, smooth muscle, gastrointestinal organs, urogenital organs, lungs, heart, kidney, liver, spleen, stomach, bronchial tree, arteries, veins and capillaries.
  • Another object of the present invention is also an isolated, in yro long-term organ that has been cultured for at least 50 hours.
  • the isolated organ which has been cultured in v / yro for a long time is cultured for at least 70 hours.
  • the isolated yro long-term organ is obtainable by the yro cultivation method as previously described.
  • Another object of the present invention also relates to a culture medium for in v / yro long-term cultivation of an isolated organ, comprising at least one inorganic salt, at least one of the additional components D (+) -galactose, phenol red, sodium pyruvate and glutathione, at least one vitamin and at least an animo acid, which enables cultivation of isolated organs for a period of at least 50 hours.
  • the inorganic salts, vitamins and amino acids are preferably selected from the aforementioned inorganic salts, vitamins and amino acids.
  • the culture medium according to the invention preferably further contains heat-inactivated calf serum and at least one antibiotic in order to prevent contamination of the organ cultivated in v / yro by bacteria.
  • the total concentration of the inorganic salts of the culture medium according to the invention is preferably between 250 and 20,000 mg / l, the total concentration of the additional components between 300 and 2,000 mg / l, the total concentration of amino acids between 1,000 and 9,000 mg / l, the total concentration of vitamins between 3 and 30 mg / l, the concentration of the heat-inactivated calf serum between 7.5 and 30 % By weight and the antibiotic concentration between 19 and 300 mg / l.
  • the culture medium has the following composition:
  • L-asparagine 250.00 mg / l
  • L-cysteine (free base) 1 20.00 mg / l
  • D-Ca pantothenate 1.00 mg / l choline chloride 1.00 mg / l
  • Heat-inactivated calf serum 1 5% by weight antibiotic 100.00 mg / l
  • the invention furthermore relates to a transportable device for in-v / yro long-term cultivation of an isolated organ, comprising
  • an organ bath for culturing the isolated organ (i) an organ bath for culturing the isolated organ, (ii) at least one supply and discharge to or from the organ bath for
  • Figure 1 Expression of the foreign protein GFP in smooth muscle cells of resistance vessels of the Arteria femoralis profunda from Hamster (be).
  • the smooth muscle cells of the isolated resistance vessels were transfected with the aid of the v / yro transfection method according to the invention with a GFP-encoding plasmid and then scanned confocally.
  • Smooth muscle cells from isolated, non-transfected resistance vessels showed no fluorescence (a)
  • isolated resistance vessels transfected into yro showed a homogeneous GFP-mediated fluorescence in the area of the cytosol of the smooth muscle cells, with no fluorescence being observed in the intracellular space ((b): Complete overview; (c): 3.4x zoom).
  • Sphingosine-1-phosphate (S1 P) -induced RhoA-mediated constrictions of the resistance vessels were prevented by transfection with a plasmid which encoded the bacterial C3 transferase.
  • S1 P-induced constrictions which were caused by S1 P concentrations in the range of 0.003-0.3 ⁇ mol / l, can be completely prevented by the exogenously administered RhoA-inhibiting substance C3 transferase or by the Rho-kinase inhibitor Y27632 .
  • the effect of in v / Yr ⁇ transfection of the smooth muscle cells of the resistance vessels with a plasmid encoding C3rtransferase was the same as that observed for exogenously administered C3 transferase or for Y27632.
  • Figure 3 View of a device according to the invention for in v / yro cultivation of isolated organs.
  • FIG. 1 Schematic view of a cross section through a vessel (diameter e.g. 1 50-200 whose walls are made of smooth muscle cells and are lined with endothelial cells on the inside.
  • Smooth muscle cells can be transfected by introducing the transfection reagent from the outside of the vessel.
  • Endothelial cells can be transfected by introducing the transfection reagent from the inside to the vessel.
  • nucleic acids can be introduced very effectively and specifically into target cells of isolated resistance vessels, while the vascular function of the resistance vessels remains unchanged.
  • the study includes the RhoA in wYro-transfection of arterial smooth muscle cells from resistance vessels of the arteria femoralis profunda from hamsters with plasmid DNA, which is used, among other things, for the bacterial enzyme C3 transferase, which is caused by sphingosine-1-phosphate (S1 P) -inhibits dependent vasoconstrictions, encodes.
  • Isolated, perfused resistance arteries were transfected according to the invention in vitro long-term culture conditions for a transfection time of about 20 hours by means of transfection Effectene ® (Qiagen, Germany) with a C3-transferase-encoding plasmid.
  • the yro-transfection of a GFP-encoding plasmid according to the invention furthermore produced homogeneous GFP expression in almost all smooth muscle cells of the artery wall of the resistance vessels with fully preserved vascular function.
  • the resistance vessels of the femoral artery profunda were prepared from the gracilis muscle of a hamster.
  • the animal was first anesthetized by an intraperitoneal injection of 50 mg / kg body weight pentobarbital sodium and finally killed by a lethal dose of the anesthetic.
  • the animal was placed on its back and the previously shaved hind legs were fixed in the abduction position with twine.
  • the skin and subcutaneous adipose tissue on one of the inner thighs was then removed with continuous superfusion with pre-cooled (4 ° C) standard MOPS buffer solution.
  • the iris scissors and microsurgical forceps were used to cut the gracilis muscle and the vascular branches and the first and second generations (outer diameter 200-260 ⁇ m, length 1-2 mm) of the arteria femoralis profunda free adventitious connective and fatty tissue.
  • the vessels were then excised and either immediately placed in an organ bath for cannulation or kept at 4 ° C. for up to 24 hours in standard MOPS buffer solution, which did not affect the vasomototic vascular properties of the preparations.
  • a micro pipette puller to approx. 30 ⁇ m pointedly drawn out borosilicate glass capillaries. These were attached to two opposite arms of the portable device according to the invention for in vitro long-term cultivation of an isolated organ, which by Micromanipulators on one side in height and on the opposite side on all three levels of the room were infinitely adjustable.
  • the pipettes protruded at an angle of approx. 45 ° into the circular organ bath made of stainless steel, the bottom of which formed a 50 ⁇ m thick quartz glass pane. After attaching a silicone tube with a three-way valve system to the distal end of both pipettes, they were filled with standard MOPS buffer solution without bubbles.
  • a Heidelberg extension was then attached to a 50 cm tripod and connected to one of the cannulation pipettes using one of the two three-way cocks. Now the connected line was filled with standard MOPS buffer solution without bubbles. Due to the weak hydrostatic pressure, a flow developed after opening the three-way valve, which on the one hand facilitated the cannulation of the vessels and on the other hand prevented the collapse of the vessel lumen and thus possible endothelial damage.
  • the vessel was then carefully grasped with a micro tweezer at one end while maintaining the lumen, with maximum magnification (40-fold) of the surgical microscope, drawn onto one of the pipette tips up to a fifth of the total length and doubled with 1 1/0-thread Knot attached.
  • the second pipette was positioned directly at the other end of the vessel using the micromanipulators and the procedure was analogous to that described above.
  • the cannulated vessel was then checked for leaks due to leaky knots or small vessel outlets. If the cause of any leaks could not be eliminated, the vessel was discarded. If, on the other hand, the cannulated vessel had no leaks, it was lowered using the micromanipulators in the middle of the organ bath to about 1 mm above the bottom of the organ bath and stretched to a v / Vo length. 3.
  • cannulated resistance vessels of the arteria femoralis profunda from hamsters In yro long-term cultivation of the prepared, cannulated resistance vessels of the arteria femoralis profunda from hamsters
  • the standard MOPS buffer solution in the organ bath was removed and replaced with the culture medium according to the invention. Furthermore, the resistance vessels were perfused continuously with the culture medium according to the invention (flow 1 ml / h) and at the same time superfused with the culture medium according to the invention (flow 1 ml / h).
  • the culture medium according to the invention contained 20,000 U / l penicillin and 20 mg / l streptomycin. The perfusion rate was chosen so that a physiological, constant shear stress within the range of 15-20 N / m 2 acted on the lumen surface of the resistance vessels.
  • the resistance vessels were washed with standard MOPS buffer solution, incubated for 2 h with the dye Fura-2 and with the vasoconstrictor norepinephrine (NE; 0, 1, 0.3 and 1 ⁇ mol / l ) and the endothelium-dependent vasodilator acetylcholine (ACh; 1 ⁇ l / l).
  • the simultaneous measurement of the intracellular calcium concentration of the smooth muscle cells ([Ca 2 "1" ],) and the diameter of the resistance vessels was carried out as described by Bolz et al. in Br. J. Pharmacol. 1 28 (1): 1 24-1 34, 1 999 described.
  • the resistance vessels were compared to the RhoA activator S1 P (0.003-3 ⁇ mol / l) for their contractile response. examined.
  • the results thus obtained with the in vitro transfected resistance vessels were compared with results obtained by incubating isolated, non-transfected resistance vessels with exogenously administered bacterial C3- Transferase or with the Rho kinase inhibitor Y27632 and subsequent stimulation with 0.003-3 ⁇ mol / l S1 P were obtained.
  • the isolated, in vitro transfected resistance vessels, which were transfected with the GFP-encoding plasmid were repeatedly stimulated with S1 P in order to investigate non-specific effects dependent on time and transfection.
  • the resistance arteries were first transfected with GFP as described, before being examined confocally after 20 h.
  • the cell nuclei were stained selectively with propidium iodide.
  • the resistance arteries were mixed with a mixture of each Transfection reagent and a promoterless, non-replicating plasmid (pGL2, Promega, Mannheim) incubated for 25-27 h.
  • the resting tone, the noradrenaline-induced restrictions, the myogenic responses and the dilations induced by acetylcholine were then determined. If these parameters were not different from untreated, cultured or GFP-transfected ( ⁇ 21 h) arteries, a cytotoxic effect could be excluded.
  • the number of layers, consisting of smooth muscle cells, of the vascular walls of the resistance vessels were determined on 3-4 layers using confocal microscopy.
  • a transfection efficiency of 96.5 ⁇ 1% was determined for smooth muscle cells.
  • the transfection of the isolated resistance vessels with a further plasmid which encoded a protein with known RhoA-inhibiting properties, namely the bacterial C3 transferase, prevented sphingosine-1-phosphate (S ⁇ P) -induced RhoA-mediated constrictions.
  • This new transfection method thus provides for the first time a means for sufficient genetic manipulation of smooth muscle cells in intact, isolated resistance vessels, which also enables the functional analysis of changes mediated by the protein products of the transfected DNA plasmids.
  • Smooth muscle cells from isolated, non-transfected resistance vessels showed no fluorescence after excitation at 488 nm.
  • a transfection time of 19-22 h for a transfection of the isolated resistance vessels with the GFP-coding plasmid provided homogeneous expression of GFP, which is characterized by the characteristic GFP-mediated fluorescence along the resistance vessels and through the various layers of the smooth muscle cells along the vessel wall could be detected.
  • the GFP-mediated cytosolic fluorescence was sensitive to fading.
  • RhoA inhibition which could be observed for exogenously administered C3 transferase or for Y27632. Furthermore it could be shown that the inhibition of the S1 P-induced, RhoA-mediated contractile responses was homogeneous along the cannulated resistance vessel.
  • the duration of the in vitro transfection of the resistance vessels should be between 19 and 22 hours.
  • the reason for an increasing decrease in the vascular reactivity after a transfection duration of more than 22 h could be that the transcription of the transfected plasmid is usually controlled by strong viral promoters, whereby large parts of the biosythesis apparatus of the transfected smooth muscle cells are busy to synthesize the foreign protein. Because of their viral nature, these promoters cannot be regulated by the host cell, which leads to large amounts of the plasmid-encoded foreign protein in a short time. In order to save only limited cellular resources, the permanent, necessary regeneration of the cellular proteins. This results in a net loss of structural and functional cellular proteins, such as actin and myosin, and may be the reason for the complete loss of contractility associated with the observed cell deformation when the transfection time of the resistance vessels exceeds 22 h.
  • the present invention provides a new method for examining the functional properties of genes relevant to vessels.
  • the method according to the invention for in wYr ⁇ transfection of isolated organs provides a new means of investigating the genetic background of microvascular physiology and enables the identification and characterization of new targets for innovative therapeutic strategies.

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Abstract

Die Erfindung betrifft isolierte Organe mit in vitro-transfizierten funktionellen glatten Muskelzellen, deren Herstellung sowie Verwendung zur genetischen und/oder pharmakologischen Untersuchung von Krankheiten. Des Weiteren betrifft die Erfindung ein Kulturmedium und eine transportable Vorrichtung zur in vitro-Langzeitkultivierung von Organen.

Description

In vitro-Transfektion und Langzeitkultivierung von isolierten Organen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft isolierte Organe mit in v/fro-transfizierten funktioneilen glatten Muskelzellen, deren Herstellung sowie deren Verwendung zur genetischen und/oder pharmakologischen Untersuchung von Krankheiten. Des Weiteren betrifft die Erfindung ein Kulturmedium und eine transportable Vorrichtung zur in v/Yro-Langzeitkultivierung von Organen.
Die effiziente und spezifische Einbringung von Molekülen, wie beispielsweise Nukleinsäuren und/oder Pharmaka, in Zellen intakter Organe ist eine wesentliche Voraussetzung für die Aufklärung der Funktionsweise von Genen und deren Wirkung auf die Organfunktion. Verschiedene Verfahren zur Einbringung von Molekülen in Zellen intakter Organe wurden bereits beschrieben.
Ein weit verbreitetes Verfahren zur Einbringung von DNA in Zellen basiert auf dem Inkontaktbringen der zu transfizierenden Zellen unter Zellkulturbedingungen mit nackter DNA. Dieses Verfahren resultiert jedoch nur in sehr geringen Transfektionsraten von kleiner 40 % (Kaiser et al., J. Vase. Res. 38 (2): 1 33-1 43, 2001 ; Huang et al., J. Biol. Chem. 274 (49) : 35095-35098, 1 999; Maasch et al., FASEB J. 1 4 ( 1 1 ): 1 653-1 663, 2000 und Wolff et al., Science 247: 1 465-1468, 1 990) . So beschreiben beispielsweise Wolff et al. die Transformation eines Skelettmuskels aus Maus mit nackter DNA oder RNA, die für ein Reportermolekül kodiert, durch direkte Injektion der zu transfizierenden Nukleinsäuremoleküle in den Skelettmuskel. Jedoch zeigten nur etwa 10-30 % der Skelettmuskelzellen innerhalb des Injektionsbereichs des Skelettmuskels eine Expression der Reportermoleküle. Neben der geringen Transfektionsrate weist das von Wolff et al. beschriebene Transfektionsverfahren weitere Nachteile auf. So liefert das Verfahren beispielsweise bei der Transfektion anderer Organe, wie z.B. Leber, Haut, Lunge, Gehirn und Blut, noch geringere Transfektionsraten als bei der Transfektion von Skelettmuskel. Des Weiteren dient das durch Wolff et al. beschriebene Verfahren lediglich zur Transfektion von räumlich stark begrenzten Bereichen eines Organs, d.h. im Bereich der Injektionsstelle.
Höhere Transfektionsraten können beispielsweise mittels Verfahren erreicht werden, dje auf einer Kopplung der zu transfizierenden
Nukleinsäuremoleküle an Transportvesikel, wie z.B. Liposomen oder
Virenkapside, beruhen. Ein solches, bei Nabel et al. (Science 249: 1 285-
1 288, 1 990) beschriebenes Verfahren ermöglicht zwar eine effiziente
Einbringung von Nukleinsäuremolekülen in Gefäßwandzellen von Blutgefäßen, weist jedoch gavierende Nachteile auf, welche den Einsatz des Verfahrens stark einschränken. Die verwendeten Nukleinsäure-
Transportvesikel sind potenziell toxisch für die zu transfizierenden Zellen und können immunologische Reaktionen hervorrufen. Des Weiteren können die verwendeten Nukleinsäure-Transportvesikel Mutationen auszulösen und eine Zellentartung induzieren (Onkogenese) .
Weitere Verfahren zur Einbringung von Molekülen in Zellen intakter Organe umfassen beispielsweise die Einbringung von Nukleinsäuremolekülen in Zellen eines Organs unter Verwendung von Druck (US-Patent Nr. 5,922,687) und über das Gefäßsystem (US-Patent-Anmeldungen Nrs. US 2001 /0007861 A1 , US 2001 /001 9723 A1 und US 2002/0001 574 A1 ) . Diese Verfahren weisen lediglich mäßige Transfektionsraten auf. Zudem ermöglicht keines dieser Verfahren eine kontrollierte, spezifische und hocheffiziente Transfektion von Zielzellen in einem Organ bei gleichzeitiger kontrollierter Analyse der Wirkung der transfizierten Moleküle auf die Organfunktion. Bolz et al. (Am. J. Physio. Heart Cir. Physiol. 279 (2000), H 1434-H 1 439) beschreiben, dass isolierte Arterien nach 48 Stunden in v/fro-Kultivierung noch intakte Endothel- und glatte Muskelfunktionen aufweisen. Bolz et al. (FASEB J. 14 (2000), 255-260) beschreiben eine Transfektion von Endothelzellen in isolierten Arterien mit Antisense-Oligonukleotiden gegen Cytochrom P450 2C8. Eine Transfektion von glatten Muskelzellen wird nicht beschrieben.
Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Transfektion eines isolierten Organs bereitzustellen, das die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweist und eine spezifische und hocheffiziente Transfektion von Zielzellen in dem Organ, insbesondere von glatten Muskelzellen, sowie eine nachfolgende Untersuchug der Wirkung der transfizierten Moleküle auf die Organfunktion, insbesondere auf die Kontraktilität, ermöglicht.
Ein erster Gegenstand der Erfindung ist somit ein isoliertes in vitro- transfiziertes Organ, das glatte Muskelzellen enthält, wobei wenigstens 80 %, vorzugsweise wenigstens 90 % und besonders bevorzugt wenigstens 95 % der glatten Muskelzellen in dem isolierten Organ transfiziert sind. Neben glatten Muskelzellen können noch weitere Zellen des Organs, beispielsweise adventitielle Zellen und/oder Endothelzellen mit gleichen oder unterschiedlichen Molekülen, transfiziert sein. In bestimmten Ausführungsformen kann jedoch eine selektive Transfektion von glatten Muskelzellen wünschenswert sein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Transfektion von glatten Muskelzellen in einem Organ, umfassend die Schritte: (i) Kultivieren eines isolierten Organs, das glatte Muskelzellen enthält, in vitro und
(ii) Inkontaktbringen des isolierten Organs während der Kultivierung mit einem Transfektionsmittel unter derartigen Bedingungen, dass eine Transfektion von wenigstens 80 % der glatten Muskelzellen in dem Organ erfolgt.
Durch den erfindungsgemäßen Einsatz eines Kultivierungsprotokolls, insbesondere eines Langzeitkultivierungsprotokolls für isolierte Organe vorzugsweise in Verbindung mit innovativer Gerätetechnik, verlängerten Transfektionszeiten und geeigneten Transfektionsmitteln wird erstmals ein Verfahren zur in v/tro-Transfektion von glatten Muskelzellen in einem Organ bereitgestellt, das eine spezifische Transfektion von wenigstens 80 % der glatten Muskelzellen in dem isolierten Organ unter in wVo-nahen, für das entsprechende Organ optimierten Bedingungen ermöglicht. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können die isolierten, in v/fro-transfizierten Organe für eine Dauer von wenigstens 50 Stunden unter Beibehaltung ihrer vollständigen in v/Vo-Funktionsfähigkeit kultiviert werden, so dass eine kontinuierliche Untersuchung der Wirkung der transfizierten Moleküle auf die Organfunktion über mehrere Stunden bis Tage ermöglicht wird. Durch die bevorzugte Verwendung nicht-liposomaler und nicht-viraler Transfektionsmittel verhindert das erfindungsgemäße Verfahren weiterhin die Entstehung von Gewebeschäden in dem in v/Yro-transfizierten Organ, wodurch eine anschließende Reimplantation des Organs in einen Patienten möglich wird. Aufgrund des geringen technischen Aufwands des erfindungsgemäßen Verfahrens kann es überdies in jedem herkömmlichen Standardlabor eingesetzt werden, um glatte Muskelzellen in jedem zur Transfektion fähigen Organ zu transfizieren.
Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens basiert auf einer in vitro- Kultivierung, vorzugsweise einer Langzeitkultivierung, des zu transfizierenden isolierten Organs. Die Bezeichnung " in vitro- Langzeitkultivierung", wie hierin verwendet, umfasst die Kultivierung eines isolierten Organs in vitro für eine Dauer von wenigstens 50 Stunden, vorzugsweise wenigstens 70 Stunden, wobei die in Vσ-Funktion des isolierten Organs über die Dauer der in 'fro-Kultivierung vollständig erhalten bleibt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die in 'tro-Kultivierung des isolierten Organs aus Schritt (i) zunächst das Bereitstellen des zu transfizierenden isolierten Organs. Die Präparation des Organs aus einem geeigneten Spenderorganismus, wie beispielsweise einem Tier (Hamster,
Ratte, Maus) oder Menschen, kann erfindungsgemäß nach herkömmlichen, dem Fachmann bekannten Verfahren durchgeführt werden. Vorzugsweise umfasst die - Kultivierung das Überführen des isolierten Organs nach erfolgter Präparation in eine für eine in ro-Langzeitkultivierung geeignete
Vorrichtung, umfassend wenigstens ein Organbad mit Kulturmedium.
Besonders bevorzugt erfolgt das Kultivieren aus Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens bei einer Temperatur zwischen 3 und 45 °C und/oder einem pH-Wert zwischen 4 und 9.
Das für Schritt (i) verwendete Kulturmedium umfasst vorzugsweise wenigstens ein anorganisches Salz, ausgewählt aus CaCI2, KCI, KH2P04, MgCI2, MgS04, NaCI und Na2HP04, wenigstens eine der zusätzlichen Komponenten, ausgewähltaus D( + )-Galaktose, Phenolrot, Natrium-Pyruvat und Glutathion, wenigstens eines der Vitamine, ausgewählt aus D-Ca- Pantothenat, Cholinchlorid, Folsäure, i-lnositol, Nicotinamid, Pyridoxal, Flavin-Mononukleotid und Thiaminmonophoshat, und wenigstens eine der Aminosäuren, ausgewählt aus D,L-Alanin, L-Arginin, L-Asparagin, L- Cystein, L-Glutamin, Glycin, L-Histidin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Lysin, D,L- Methionin, D,L-Phenylalanin, L-Serin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Thyrosin und L-Valin. Als weitere Bestandteile kann das Kulturmedium zusätzlich hitzeinaktiviertes Kälberserum und/oder wenigstens ein Antibiotikum, um eine bakterielle Kontamination des isolierten Organs während der in vitro- Langzeitkultivierung zu verhindern, enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das isolierte Organ während des Kultivierens gemäß Schritt (i) mit Kulturmedium superfundiert. Vorzugsweise erfolgt die Superfusion des isolierten Organs mit Kulturmedium bei einem Fluss von 0, 1 ml/h bis 300 l/h.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das isolierte Organ während des Kultivierens gemäß Schritt (i) perfundiert. Die Perfusion des isolierten Organs erfolgt vorzugsweise bei einem Fluss von 0, 1 ml/l bis 300 l/h und/oder einem Druck von 1 -300 mmHg. Als Perfusionsmedium eignet sich beispielsweise reines Kulturmedium, Kulturmedium, das mit Transfektionsmittel und zu transfizierenden Molekülen versetzt ist als auch ein physiologischer Puffer. Vorzugsweise erfolgt die Perfusion des isolierten Organs über das Organlumen. Dabei wird beispielsweise das Organlumen des isolierten Organs durch eine Kanülierung für eine Perfusion des Lumens während der Kultivierung vorbereitet. Verfahren zur Kanülierung des Organlumens isolierter Organe sind dem Fachmann hinreichend bekannt. Desweiteren kann die Perfusion des isolierten Organs vorzugsweise auch über wenigstens eine kanülierte Arterie oder Vene oder wenigstens ein kanüliertes Kapillargefäß des isolierten Organs erfolgen. Die Kanülierung wenigstens einer Arterie oder Vene oder wenigstens eines Kapillargefäßes des isolierten Organs kann dabei nach herkömmlichen, dem Fachmann bekannten Verfahren erfolgen.
Schritt (ii) des erfindungsgemäßen Verfahrens basiert auf dem Inkontaktbringen des isolierten Organs während der in vitro- Langzeitkultivierung mit einem geeigneten Transfektionsmittel unter derartigen Bedingungen, dass eine Transfektion von wenigstens 80 % der glatten Muskelzellen in dem isolierten Organ erfolgt. Die Quantifizierung der Transfektionseffizienz kann, wie in den Beispielen beschrieben, erfolgen. Vorzugsweise sind die von der vorliegenden Erfindung erfassten Transfektionsmittel ungefährlich für die zu transfizierenden Zielzellen in dem Organ, d.h. sie wirken nicht cytotoxisch auf die Zielzellen, lösen keine Mutationen aus und rufen keine immunologischen Reaktionen hervor. Besonders bevorzugt ist das in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Transfektionsmittel eine nicht-lipsomale Lipidformulierung, wie beispielsweise die Transfektionsmittel Effectene0 oder Superfect® (Qiagen, Deutschland). Die Bestimmung der Cytotoxizität von Transfektionsmitteln kann, wie in den Beispielen beschrieben, erfolgen.
Vorzugsweise erfolgt das Inkontaktbringen des isolierten Organs in Schritt (ii) des erfindungsgemäßen Verfahrens während der Kultivierung mit dem Transfektionsmittel für eine Dauer von 1 0 Minuten bis 50 Stunden. Die für die Transfektion eines Organs benötigte Transfektionsdauer hängt dabei von mehreren Faktoren ab, wie z.B. der Art des Organs, der Art der zu transfizierenden Zielzellen in dem Organ, die Anzahl der zu transfizierenden Zielzellen, etc. und kann ohne Weiteres von einem Fachmann unter Berücksichtigung der oben genannten Faktoren bestimmt werden. Besonders bevorzugt beträgtdie Transfektionsdauer jedoch 1 0-22 Stunden.
Die Bezeichnung "Transfektion", wie hierin verwendet, umfasst jede mögliche Art der Einbringung von Molekülen in Zielzellen des zu transfizierenden Organs. Vorzugsweise sind die zu transfizierenden Moleküle ausgewählt aus Nukleinsäuren, Polypeptiden, Pharmaka, synthetischen Stoffen, Zuckern, Fettsäuren, Derivaten und/oder Komplexen davon. Die zu transfizierenden Nukleinsäuren können in einzelsträngiger oder doppelsträngiger Form, z.B. als RNA, DNA oder Nukleinsäureanaloga, wie PNA, vorliegen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegen die zu transfizierenden Nukleinsäuren in operativer Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz vor, so dass sie nach Transfektion in den Zielzellen des Organs transkribiert bzw. translatiert werden können. Geeignete Expressionskontrollsequenzen umfassen üblicherweise einen Promotor und gegebenenfalls regulatorische Sequenzen, wie Operatoren oder Enhancer. Weiterhin können auch Translationsinitiationssequenzen vorhanden sein. Ensprechend geeignete Expressionskontrollsequenzen für eukaryontische Wirtszellen sind dem Fachmann gut bekannt (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual ( 1 989), Cold Spring Harbour Laboratory Press) . Beispielsweise kann die Transfektion mit einer Nukleinsäure erfolgen, die für ein funktionelles Gen kodiert, welches in der transfizierten Zellen exprimiert und besonders bevorzugt über überexprimiert wird. So kann die Nukleinsäure für ein Polypeptid, d.h. ein Proteine bzw. ein funktionelles Fragment davon, kodieren. Vorzugsweise kodiert die zu transfizierende Nukleinsäure für ein Polypeptid, das mit Krankheiten, welche das entsprechende Organ betreffen, in Zusammenhang steht. Das in der Zielzelle überexprimierte Polypeptid kann ein endogenes Polypeptid, d.h. ein Polypeptid, das einem in der Zielzelle natürlich vorkommenden Polypeptid entspricht, oder ein exogenes Polypeptid sein, z.B. ein Polypeptid aus einem anderen Organismus oder ein durch rekombinante Techniken modifiziertes Polypeptid.
Alternativ kann auch eine Transfektion mit Oligonukleotiden, z.B. Antisense-Molekülen, Ribozymen oder RNAi-Molekülen, erfolgen, um eine spezifische Hemmung der Expression eines in der Zielzelle vorhandenen endogenen Gens zu erreichen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Transfektion von Zielzellen in einem Organ ermöglicht eine hocheffiziente und spezifische Transfektion von Zielzellen von Organen mit glatten Muskelzellen, wie beispielsweise eines endokrinen Organs, eines exokrinen Organs, eines Skelettmuskels, eines glatten Muskels, eines gastrointestinalen Organs, eines Urogenitalorgans, von Lunge, Bronchialbaum, Herz, Niere, Leber, Milz, Magen, einer Arterie, einer Vene und eines Kapillargefäßes. Die zu transfizierenden Zielzellen umfassen glatte Muskelzellen sowie gegebenenfalls weitere in dem Organ vorkommenden Zelltypen, wie beispielsweise Parenchymzellen, Epithelzellen, Nervenzellen, Bindegewebszellen, Fettzellen, Endothelzellen, Adventitialzellen der Blutgefäße; Hepatocyten, Kupffer-Zellen und Epithelzellen der Leber; Retikulumzellen oder Blutzellen, wie Lymphocyten, Monocyten, Plasmazellen und Makrophagen der Milz, Thymusdrüse, Lymphdrüse und des Knochenmarks; Epithelzellen, Becherzellen, Schleimzellen und Alv.eolarzellen der Lunge sowie Adipocyten des Fettgewebes. Das Organ ist vorzugsweise ein Säugerorgan, besonders bevorzugt ein humanes Organ.
Neben der Transfektion von vollständigen Organen ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren auch die Transfektion von Organteilen bzw. -fragmenten.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung dient das erfindungsgemäße Verfahren zur hocheffizienten und spezifischen Transfektion von glatten Muskelzellen in Blutgefäßen, wie Arterien, Venen oder Kapillargefäßen, wobei wenigstens 80 %, vorzugsweise wenigstens 90 % und besonders bevorzugt wenigstens 95 % der glatten Muskelzellen transfiziert sind.
Die Bezeichnung "in v/Yro-transfiziert", wie hierin verwendet, umfasst jede mögliche Art der Einbringung von Molekülen in Zielzellen des Organs unter in Y/O-Bedingungen. Das erfindungsgemäße isolierte, in v/Yrσ-transfizierte Organ kann mit jedem zur Transfektion fähigen Molekül transfiziert sein. Vorzugsweise ist das isolierte, in v/Yro-transfizierte Organ mit einem bereits zuvor genannten Molekül, wie beispielsweise einer Nukleinsäure, einem Polypeptid, einem Pharmazeutikum, einem synthetischen Stoff, einem Zucker, einer Fettsäure oder einem Derivate und/oder Komplex davon, transfiziert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das isolierte, in Yro-transfizierte Organ ein langzeitkultiviertes Organ. Vorzugsweise enthält das erfindungsgmäße Organ transfizierte glatte Muskelzellen, die funktionell sind. Insbesondere besitzen die transfizierten glatten Muskelzellen die Fähigkeit zur Kontraktilität.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines isolierten, in v/Yro-transfizierten Organs, wobei wenigstens 80 %, besonders bevorzugt wenigstens 90 % und am meisten bevorzugt wenigsten 95 % von Zielzellen, insbesondere glatten Muskelzellen des Organs mit einem für ein Polypeptid kodierenden Nukleinsäuremolekül transfiziert sind, wobei das Polypeptid in den Zielzellen (über)exprimiert wird, zur Bestimmung, ob das in den Zielzellen (über)exprimierte Polypeptid die Funktionalität der Zielzellen bzw. des isolierten Organs, gegebenenfalls in Gegenwart von Wirksubstanzen, moduliert. Vorzugsweise erfolgt eine Untersuchung der Funktion eines Polypeptids hinsichtlich Kontraktilitäts-modulierender Eigenschaften in einem Organ mit glatten Muskelzellen. Besonders bevorzugt erfolgt eine Untersuchung der vaskulären Funktion eines Polypeptids.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen isolierten, in Yro-transfi zierten Organs zur Untersuchung von Krankheiten, die das Organ betreffen. Beispielsweise können mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens glatte Muskelzellen und gegebenenfalls Endothelzellen in Arterien oder Kapillargefäßen transfiziert werden, um Krankeiten, die mit erhöhtem oder erniedrigtem Blutdruck verbunden sind, zu untersuchen.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Transfektion von Zielzellen in einem Organ oder eines erfindungsgemäßen isolierten, in Yrσ-transfizierten Organs zur Identifizierung von Wirksubstanzen zur Prävention und/oder Behandlung von Krankheiten, die das Organ betreffen. Beispielsweise können glatte Muskelzellen und gegebenenfalls Endothelzellen von Arterien oder Kapillargefäßen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Wirksubstanzen transfiziert werden, um deren Wirkung zur Prävention und/oder Behandlung von Krankheiten, die mit erhöhtem und/oder erniedrigtem Blutdruck verbunden sind, zu untersuchen.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Transfektion von Zielzellen in einem Organ oder eines erfindungsgemäßen isolierten, in Yro-transfizierten Organs zur Identifizierung neuer Targets für innovative therapeutische Strategien. .
Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Transfektion von Zielzellen in einem Organ oder eines erfindungsgemäßen isolierten, in v/Yro-transfizierten Organs zur Identifizierung der Wirkung von therapeutischen Maßnahmen auf das Organ bzw. auf die das Organ betreffenden Krankheiten. Vorzugsweise umfassen die therapeutischen Maßnahmen eine Gentherapie.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist überdies die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Transfektion von Zielzellen in einem Organ oder eines erfindungsgemäßen isolierten, in v/Yro-transfizierten Organs zur Entwicklung innovativer pharmakologischer Strategien zur Prävention und/oder Behandlung von Krankheiten, die das Organ betreffen.
Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur in vitro- Langzeitkultivierung eines isolierten Organs, umfassend das Kultivieren des isolierten Organs unter derartigen Bedingungen, dass die Kultivierungsdauer wenigstens 50 Stunden beträgt. Vorzugsweise kann das isolierte Organ mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens zur in v/Yro-Langzeitkultivierung für eine Kultivierungsdauer von wenigstens 70 Stunden kultiviert werden. Die Kultivierungsbedingungen werden dabei so gewählt, dass die Funktionsfähigkeit des isolierten Organs während der in vitro- Langzeitkultivierung vollständig erhalten bleibt. Vorzugsweise erfolgt die in Yro-Langzeitkultivierung des isolierten Organs in einer Vorrichtung, die wenigstens ein Organbad enthält.
Vorzugsweise erfolgt die in wYrσ-Langzeitkultivierung jedoch bei einer Temperatur zwischen 3 und 45 °C und/oder einem pH-Wert zwischen 4 und 9.
Das zur in v/tro-Langzeitkultivierung des isolierten Organs verwendete Kulturmedium umfasst wenigstens ein anorganisches Salz, wenigstens eine zusätzliche Komponente ausgewählt aus D( + )-Galaktose, Phenolrot, Na- Pyruvat und Glutathion, wenigstens ein Vitamin und wenigstens eine Aminosäure. Die anorganischen Salze, Vitamine und Aminosäuren sind dabei vorzugsweise ausgewählt aus den bereits zuvor genannten anorganischen Salzen, Vitaminen und Aminosäuren. Desweiteren kann das Kulturmedium als weitere Bestandteile hitzeinaktiviertes Kälberserum und wenigstens ein Antibiotikum, um eine Kontamination des isolierten Organs durch Bakterien zu verhindern, enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das isolierte Organ, wie bereits zuvor beschrieben, während der in v/Yro-Langzeitkultivierung mit Kulturmedium superfundiert. Die Superfusion erfolgt vorzugsweise mit Kulturmedium bei einem Fluss von 0, 1 ml/h bis 300 l/h.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das isolierte Organ während der in v/Yro-Langzeitkultivierung perfundiert. Die Perfusion des Organs erfolgt vorzugsweise bei einem Fluss von 0, 1 ml/h bis 300 l/h und/oder einem Druck von 0-300 mmHg. Die Perfusion des isolierten Organs während der erfindungsgemäßen in vitro- Langzeitkultivierung kann, wie bereits zuvor beschrieben, durchgeführt werden. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann jedes beliebige Organ, welches für eine in v/Yro-Langzeitkultivierung geeignet ist, kultiviert werden. Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Verfahren jedoch die in vitro- Langzeitkultivierung eines isolierten Organs, ausgewählt aus endokrinen Organen, exokrinen Organen, Skelettmuskel, glattem Muskel, gastrointestinalen Organen, Urogenitalorganen, Lunge, Herz, Niere, Leber, Milz, Magen, Bronchialbaum, Arterien, Venen und Kapillargefäßen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem ein isoliertes, in- Yro-langzeitkultiviertes Organ, das für eine Dauer von wenigstens 50 Stunden kultiviert ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das isolierte, in v/Yro-langzeitkultivierte Organ für eine Dauer von wenigstens 70 Stunden kultiviert. Vorzugsweise ist das isolierte, in Yro-langzeitkultivierte Organ erhältlich durch das Verfahren zur in Yro-Kultivierung wie zuvor beschrieben.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft außerdem ein Kulturmedium zur in v/Yro-Langzeitkultivierung eines isolierten Organs, umfassend wenigstens ein anorganisches Salz, wenigstens eine der zusätzlichen Komponenten D( + )-Galaktose, Phenolrot, Natriumpyruvat und Glutathion, wenigstens ein Vitamin und wenigstens eine Animosäure, welches eine Kultivierung von isolierten Organen für eine Dauer von wenigstens 50 Stunden ermöglicht. Die anorganischen Salze, Vitamine und Aminosäuren sind dabei vorzugsweise aus den bereits zuvor genannten anorganischen Salzen, Vitaminen und Aminosäuren ausgewählt. Vorzugsweise enthält das erfindungsgemäße Kulturmedium weiterhin hitzeinaktiviertes Kälberserum und wenigstens ein Antibiotikum, um eine Kontamination des in v/Yro-kultivierten Organs durch Bakterien zu verhindern.
Vorzugsweise beträgt die Gesamtkonzentration der anorganischen Salze des erfindungsgemäßen Kulturmediums zwischen 250 und 20.000 mg/l, die Gesamtkonzentration der zusätzlichen Komponenten zwischen 300 und 2.000 mg/l, die Gesamtkonzentration der Aminosäuren zwischen 1 .000 und 9.000 mg/l, die Gesamtkonzentration der Vitamine zwischen 3 und 30 mg/l, die Konzentration des hitzeinaktivierten Kälberserums zwischen 7,5 und 30 Gew.-% und die Antibiotikakonzentration zwischen 1 9 und 300 mg/l.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist das Kulturmedium die folgende Zusammensetzung auf:
Anorganische Salze
CaCI2 (anhydr) 1 40,00 mg/l
KCI 400,00 mg/l
KH2P04 60,00 mg/l MgCI2 (anhydr) 93,68 mg/l
MgS04 (anhydr) 97,67 mg/l
NaCI 8.000,00 mg/l
Na2HP04 1 90, 1 2 mg/l
Zusätzliche Komponenten
( + )-Galaktose 900,00 mg/l
Phenolrot 10,00 mg/l
Na-Pyruvat 550,00 mg/l
Glutathion 1 -3 mmol/l
Aminosäuren
D,L-Alanin 225,00 mg/l
L-Arginin (freie Base) 500,00 mg/l
L-Asparagin 250,00 mg/l L-Cystein (freie Base) 1 20,00 mg/l
L-Glutamin 300,00 mg/l
Glycin 200,00 mg/l L-Histidin (freie Base) 250,00 mg/
L-Isoleucin 250,00 mg/
L-Leucin 1 25,00 mg/:
L-Lysin (freie Base) 75,00 mg/
D,L-Methionin 1 50,00 mg/
D,L-Phenylalanin 250,00 mg/.
L-Serin 200,00 mg/
L-Threonin 300,00 mg/
L-Tryptophan 20,00 mg/!
L-Thyrosin 300,00 mg/
L-Valin 1 00,00 mg/
Vitamine
D-Ca-Pantothenat 1 ,00 mg/l Cholinchlorid 1 ,00 mg/l
Folsäure 1 ,00 mg/l i-lnositol 2,00 mg/l
Nikotinamid 1 ,00 mg/l
PyridoxafHCI 1 ,00 mg/l Flavin-Mononukleotid 0, 1 0 mg/l
Thiaminmonophosphat HCI 1 ,00 mg/l
Zusätzliche Bestandteile
Hitzeinaktiviertes Kälberserum 1 5 Gew.-% Antibiotikum 100,00 mg/l
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist überdies eine transportable Vorrichtung zur in v/Yro-Langzeitkultivierung eines isolierten Organs, umfassend
(i) ein Organbad zur Kultivierung des isolierten Organs, (ii) wenigstens eine Zu- und Ableitung zu bzw. aus dem Organbad zur
Superfusion des isolierten Organs und (iii) wenigstens zwei Kapillaren zur Perfusion des isolierten Organs, die in wenigstens einer Ebene des Raumes stufenlos verstellbar sind, wobei sie an jeweils einem Ende eine Zu- bzw. Ableitung aufweisen und das jeweils andere Ende zur Kanülierung des Organvolumens dient.
Die nachfolgenden Figuren und das nachfolgende Beispiel sollen die Erfindung näher veranschaulichen.
Figuren
Figur 1 : Expression des Fremdproteins GFP in glatten Muskelzellen von Widerstandsgefäßen der Arteria femoralis profunda aus Hamster (b-e) . Die glatten Muskelzellen der isolierten Widerstandsgefäße wurden mit Hilfe des erfindungsgemäßen in v/Yro-Transfektionsverfahrens mit einem GFP- kodierenden Plasmid transfiziert und danach konfokal abgetastet. Glatte Muskelzellen von isolierten, nichttransfizierten Widerstandsgefäßen zeigten keine Fluoreszenz (a), während isolierte, in Yro-transfizierte Widerstandsgefäße im Bereich des Cytosols der glatten Muskelzellen eine homogene GFP-vermittelte Fluoreszenz zeigten, wobei im Intrazellulärraum keine Fluoreszenz beobachtet werden konnte ((b): Gesamtübersicht; (c) : 3.4x-Zoom) . (d) zeigt eine 3D-Projektion, die aus 51 einzelnen konfokalen Lagen aufgebaut wurde. Eine kontinuierliche Anregung einer ausgewählten Region der Widerstandsgefäße bei 488 nm verursachte eine Fluoreszenzbleichung (e) . (f) zeigt deformierte glatte Muskelzellen in Widerstandsgefäßen nach einer Transfektionsdauer von 25 h. Figur 2:
Sphingosin-1 -phosphat (S1 P)-induzierte RhoA-vermittelte Konstriktionen der Widerstandsgefäße wurden durch Transfektion mit einem Plasmid, welches für die bakterielle C3-Transferase kodierte, verhindert. S1 P- induzierte Konstriktionen, welche durch S1 P-Konzentrationen im Bereich von 0,003-0,3 μmol/l verursacht wurden, können vollständig durch die exogen verabreichte RhoA-inhibierende Substanz C3-Transferase oder durch den Rho-Kinase-Inhibitor Y27632 verhindert werden. Die Wirkung einer in v/Yrσ-Transfektion der glatten Muskelzellen der Widerstandsgefäße mit einem C3rTransferase-kodierenden Plasmid war dieselbe, wie diejenige, die für exogen verabreichte C3-Transferase oder für Y27632 beobachtet werden konnte.
Figur 3: Ansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur in v/Yro-Kultivierung von isolierten Organen.
Figur 4:
Schematische Ansicht eines Querschnitts durch ein Gefäß (Durchmesser z. B. 1 50-200
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dessen Wände aus glatten Muskelzellen bestehen und innen mit Endothelzellen ausgekleidet ist. Eine Transfektion von glatten Muskelzellen kann dadurch erfolgen, dass das Transfektionsreagenz von außen an das Gefäß herangeführt wird. Eine Transfektion von Endothelzellen kann dadurch erfolgen, dass das Transfektionsreagenz von innen an das Gefäß herangeführt wird. Beispiel: Transfektion von glatten Muskelzellen in Widerstandsgefäßen der Arteria femoralis profunda aus Hamster
I. Einleitung
Um die Pathogenese von kardiovaskulären Erkrankungen besser verstehen zu können, werden neue Verfahren zur Analyse der vaskulären Genfunktion benötigt. Die folgende Studie zeigt, dass Nukleinsäuren hocheffektiv und spezifisch in Zielzellen von isolierten Widerstandsgefäßen einbracht werden können, wobei die Gefäßfunktion der Widerstandsgefäße unverändert erhalten bleibt.
Die Studie umfasst die in wYro-Transfektion von arteriellen glatten Muskelzellen von Widerstandsgefäßen der Arteria femoralis profunda aus Hamster mit Plasmid-DNA, welche unter anderem für das bakterielle Enzym C3-Transferase, das durch Sphingosin-1 -phosphat (S1 P) hervorgerufene, RhoA-abhängige Vasokonstriktionen hemmt, kodiert. Isolierte, perfundierte Widerstandsarterien wurden unter erfindungsgemäßen in vitro- Langzeitkultivierungsbedingungen für eine Transfektionsdauer von ca. 20 Stunden mittels des Transfektionsmittels Effectene® (Qiagen, Deutschland) mit einem C3-Transferase-kodierenden Plasmid transfiziert. In diesen Widerstandsarterien wurden die Antworten auf S1 P, jedoch nicht die Antworten auf den Vasokonstriktor Norepinephrin, blockiert, was auch für die isolierten, nicht transfizierten Kontrollwiderstandsgefäße, welche mit exogener C3-Transferase oder dem Rho-Kinase-Inhibitor Y27632 behandelt wurden, gezeigt werden konnte.
Die erfindungsgemäße in Yro-Transfektion eines GFP-kodierenden Plasmids erzeugte weiterhin eine homogene GFP-Expression in nahezu allen glatten Muskelzellen der Arterienwand der Widerstandsgefäße bei vollständig erhaltener vaskulärer Funktion. II. Durchführung
1 . Präparation der Widerstandsgefäße der Arteria femoralis profunda aus Hamster
Die Widerstandsgefäße der Arteria femoralis profunda wurden aus dem Musculus gracilis eines Hamsters präpariert. Das Tier wurde dabei zunächst durch eine intraperitoneale Injektion von 50 mg/kg Körpergewicht Pentobarbital-Natrium anästhesiert und schließlich durch eine letale Dosis des Anästhetikums getötet. Zur Präparation wurde das Tier auf dem Rücken gelagert und die vorher rasierten Hinterläufe in Abduktionsstellung mit Bindfäden fixiert. Anschließend wurde die Haut und das subkutane Fettgewebe an einer der Oberschenkelinnenseiten unter kontinuierlicher Superfusion mit vorgekühlter (4 °C) Standard-MOPS-Pufferlösung entfernt. Unter Zuhilfenahme eines Operationsmikroskops wurde mit einer Irisschere und mikrochirurgischen Pinzetten der Musculus gracilis durchtrennt und G efäßa ufzweig un g en d er ersten und zweite n G en eratio n (Außendurchmesser 200-260 μm, Länge 1 -2 mm) der Arteria femoralis profunda von adventitiellem Binde- und Fettgewebe befreit. Anschließend wurden die Gefäße exzidiert und entweder sofort zur Kanülierung in ein Organbad eingebracht oder aber bei 4 °C bis zu 24 h in Standard-MOPS- Pufferlösung aufgewahrt, was die vasomototischen Gefäßeigenschaften der Präparate nicht beeinflusste.
2. Kanülierung der präparierten Widerstandsgefäße der Arteria femoralis profunda aus Hamster
Zur Kanülierung der präparierten Widerstandsgefäße dienten mit einem M i kro p i petten p u l l er auf ca . 30 μm spitz ausg ezog en e Borsilikatglaskapillaren. Diese wurden an zwei gegenüber liegenden Auslegern der erfindungsgemäßen transportablen Vorrichtung zur in vitro- Langzeitkultivierung eines isolierten Organs befestigt, welche durch Mikromanipulatoren auf der einen Seite in der Höhe und auf der gegenüber liegenden Seite auf allen drei Ebenen des Raumes stufenlos verstellbar waren. Die Pipetten ragten in einem Winkel von ca. 45 ° in das kreisrunde, aus Edelstahl gefertigte Organbad, dessen Boden eine 50 μm dicke Quarzglasscheibe bildete. Nach Anbringen eines mit einem Dreiwegehahn- System versehenen Silikonschlauchs an das distale Ende beider Pipetten, wurden diese blasenfrei mit Standard-MOPS-Pufferlösung gefüllt. Danach wurde eine Heidelberger Verlängerung an einem 50 cm hohen Stativ befestigt und über einen der beiden Dreiwegehähne an eine der Kanülierungspipetten angeschlossen. Jetzt wurde die angeschlossene Leitung blasenfrei mit Standard-MOPS-Pufferlösung gefüllt. Durch den schwachen hydrostatischen Druck entstand nach Öffnen des Dreiwegehahns ein Fluss, der zum einen das Kanülieren der Gefäße erleichterte und zum anderen das Kollabieren des Gefäßlumens und damit einen möglichen Endothelschaden verhinderte. Anschließend wurde das Gefäß unter maximaler Vergrößerung (40-fach) des OP-Mikroskops vorsichtig mit einer Mikropinzette an einem Ende unter Erhaltung des Lumens gefasst, auf eine der Pipettenspitzen bis zu einem Fünftel der Gesamtlänge aufgezogen und mit 1 1 /0-Faden durch doppelten Knoten befestigt. Die zweite Pipette wurde mit Hilfe der Mikromanipulatoren unmittelbar am anderen Gefäßende positioniert und es wurde analog, wie oben beschrieben, verfahren. Danach wurde das kanülierte Gefäß auf Leckagen durch undichte Knoten oder kleine Gefäßabgänge überprüft. Konnte die Ursache von eventuellen Undichtheiten nicht behoben werden, wurde das Gefäß verworfen. Wies das kanülierte Gefäß hingegen keine Leckagen auf, so wurde es mit Hilfe der Mikromanipulatoren in der Mitte des Organbades bis auf ca. 1 mm über den Boden des Organbads abgesenkt und auf in v/Vo-Länge gespannt. 3. In Yro-Langzeitkultivierung der präparierten, kanülierten Widerstandsgefäße der Arteria femoralis profunda aus Hamster
Zur in Yro-Langzeitkultivierung der präparierten und kanülierten Widerstandsgefäße wurde die in dem Organbad befindliche Standard- MOPS-Pufferlösung entfernt und gegen das erfindungsgemäße Kulturmedium ausgetauscht. Des Weiteren wurden die Widerstandsgefäße kontinuierlich mit dem erfindungsgemäßen Kulturmedium perfundiert (Fluss 1 ml/h) und zugleich mit dem erfindungsgemäßen Kulturmedium superfundiert (Fluss 1 ml/h) . Um eine optimale in wYro-Langzeitkultivierung der Widerstandsgefäße zu ermöglichen, enthielt das erfindungsgemäße Kulturmedium 20.000 U/l Penicillin und 20 mg/l Streptomycin. Die Perfusionsrate wurde so gewählt, dass eine physiologische, konstante Scherbeanspruchung innerhalb des Bereich von 1 5-20 N/m2 auf die Lumenoberfläche der Widerstandsgefäße einwirkte. So ermöglichte die Kombination aus innovativer Gerätetechnik und Entwicklung eines neuartigen Kulturmediums die in wYro-Langzeitkultivierung der isolierten Widerstandsgefäße der Arteria femoralis profunda aus Hamster über einen Zeitraum von wenigstens 72 h unter Beibehaltung der vollständigen Funktionsfähigkeit der Widerstandsgefäße.
4. Transfektion von glatten Muskelzellen der isolierten, in vitro- langzeitkultivierten Widerstandsgefäßes der Arteria femoralis profunda aus Hamster
Für eine selektive Transfektion der glatten Muskelzellen der Widerstandsgefäße wurde das erfindungsgemäße Kulturmedium in dem Organbad der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur in Yro-Kultivierung von isolierten Organen gegen erfindungsgemäßes Kulturmedium ausgetauscht, welches 60μl eines nicht-liposomalen Lipidtransfektionsmittels (Effectene®, Qiagen, Deutschland) und 5 μg der zu transfizierenden Nukleinsäure, nämlich des Plasmids pEFmyc, welches entweder für GFP (green fluorescence protein) oder für die bakterielle C3-Transferase kodierte, ausgetauscht. Die Transfektion der zu transfizierenden Nukleinsäure in glatte Muskelzellen der Widerstandsgefäße erfolgte erfindungsgemäß unter in v/Yrσ-Langzeitkultivierungsbedingungen für eine Dauer von 1 9-22 h.
5. Funktionelle Untersuchung der isolierten, in v/Yro-transfizierten Widerstandsgefäße der Arteria femoralis profunda aus einem Hamster
Nach einer Transfektionsdauer von 1 9-22 h wurden die Widerstandsgefäße mit Standard-MOPS-Pufferlösung gewaschen, für 2 h mit dem Farbstoff Fura-2 inkubiert und mit dem Vasokonstriktor Norepinephrin (NE; 0, 1 , 0,3 und 1 μmol/l) und dem endothelabhängigen Vasodilator Acetylcholin (ACh; 1 μl/l) stimuliert. Die gleichzeitige Messung der intrazellulären Calcium- Konzentration der glatten Muskelzellen ([Ca2 "1"],) und des Durchmessers der Widerstandsgefäße wurde, wie von Bolz et al. in Br. J. Pharmacol. 1 28 ( 1 ) : 1 24-1 34, 1 999 beschrieben, durchgeführt. Für die Untersuchung der funktionellen Parameter wurden nur solche isolierten, in /Yro-tranfizierten Widerstandsgefäße verwendet, die einen spontanen Tonus zeigten. Die isolierten, in wYro-transfizierten Widerstandsgefäße, die mit dem GFP- kodierenden Plasmid transfiziert wurden, wurden unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops untersucht, um die Gegenwart und die Verteilung der GFP-vermittelten Fluoreszenz innerhalb der Gefäßwand der Widerstandsgefäße zu bestimmen (Anregung bei 488 nm, Emission bei 535 nm) . Um die Transfektionseffizienz der isolierten, in Yrσ-transfizierten Widerstandsgefäße zu untersuchen, welche mit dem für die bakterielle C3- Transferase kodierenden Plasmid transfiziert wurden, wurden die Widerstandsgefäße auf ihre kontraktile Antwort gegenüber dem RhoA- Aktivator S1 P (0,003-3 μmol/l) hin untersucht. Die so mit den in vitro- transfizierten Widerstandsgefäßen erhaltenen Ergebnisse wurden mit Ergebnissen verglichen, die durch Inkubation von isolierten, nicht- transfizierten Widerstandsgefäßen mit exogen verabreichter bakterieller C3- Transferase oder mit dem Rho-Kinase-Inhibitor Y27632 und nachfolgender Stimulation mit 0,003-3 μmol/l S1 P erhalten wurden. Die isolierten, in vitro- transfizierten Widerstandsgefäße, die mit dem GFP-kodierenden Plasmid transfiziert wurden, wurden wiederholt mit S1 P stimuliert, um zeit- und transfektionsabhängige, unspezifische Effekte zu untersuchen.
Eine statistische Analyse der so erhaltenen Ergebnisse erfolgte wie folgt: Konstriktionen als Antwort auf Norepinephrin oder S1 P wurden als "Prozent des maximalen Durchmessers" = ((diavc - diamax)/diamax) x 1 00 ausgedrückt,, wobei diavc den Gleichgewichtsaußendurchmesser 2 min nach der Stimulierung mit der entsprechenden Dosis der vasokonstriktorischen Substanz darstellt und diamax den maximalen Durchmesser darstellt, der in Ca2 +-freiem MOPS-Puffer, der 1 μmol/l EGTA enthielt, erhalten wird. Alle Durchmesser beziehen sich auf einen transmuralen Druck von 45 mmHg. Alle im folgenden dargestellten Ergebnisse stellen Mittelwerte aus den Experimenten dar, wobei n die Anzahl der untersuchten Widerstandsgefäße der Arteria femoralis profunda aus Hamster darstellt.
6. Quantifizierung der Transfektionseffizienz
Zur Quantifizierung der Transfektionseffizienz wurden d ie Widerstandsarterien zunächst wie beschrieben mit GFP transfiziert, um dann nach 20 h konfokal untersucht zu werden. Dabei wurden die Zellkerne selektiv mit Propidiumiodid angefärbt.
Untersucht wurde dann, ob jedem so dargestellten Zellkern eine GFP- abhängige cytosolische Fluoreszenz zugeordnet werden konnte.
7. Cytotoxizität
Um cytotoxische Effekte von Transfektionsmitteln zu bestimmen, wurden die Widerstandsarterien mit einer Mischung aus dem jeweiligen Transfektionsreagenz und einem promoterlosen, nicht replizierenden Plasmid (pGL2, Promega, Mannheim) über 25-27 h inkubiert. Es wurden dann der Ruhetonus, die Noradrenalin-induzierten Kostriktionen, die myogenen Antworten und die durch Acetylcholin induzierten Dilatationen bestimmt. Wenn diese Parameter nicht verschieden von unbehandeltem, kultivierten oder GFP-transfizierten ( < 21 h) Arterien waren, konnte ein cytotoxischer Effekt ausgeschlossen werden.
Bei den Transfektionsmitteln Effectene® und Superfect® waren der Ruhetonus (9 ± 2 %), die Noradrenalin (0,3 μmol/l)-induzierten Konstriktionen (48 + 4 %), die myogenen Antworten (60 + 1 2 %) und die durch Acetylcholin (1 μmol/l) induzierten Dilatationen (84 ± 7 %) dieser Arterien (n = 4) im normalen Bereich, so dass ein cytotoxischer Effekt ausgeschlossen werden konnte.
III. Ergebnisse
1 . GFP-vermittelte Fluoreszenz innerhalb der Gefäßwände der Widerstandsgefäße der Arteria femoralis profunda aus Hamster
Die Anzahl der Schichten, bestehend aus glatten Muskelzellen, der Gefäßwände der Widerstandsgefäße wurden mittels konfokaler Mikroskopie auf 3-4 Schichten bestimmt.
Wurden isolierte, nicht-transfizierte Widerstandsgefäße der Arteria femoralis profunda bei 488 nm angeregt, emittierten die glatten Muskelzellen der Widerstandsgefäße keine Fluoreszenz (Figur 1 (a)) . Im Gegensatz dazu zeigten die glatten Muskelzellen der isolierten, in vitro- transfizierten Widerstandsgefäße, welche für eine Transfektionsdauer von 1 9-22 h mit dem GFP-kodierenden Plasmid transfiziert wurden, eine maximale und homogene Fluoreszenzemission über alle glatten Muskelzellen der verschiedenen Schichten der Widerstansgefäße, bestehend aus glatten Muskelzellen (Figur 1 (b-d)) sowie entlang der Längsachse der Gefäßwand der untersuchten Widerstandsgefäße hinweg (Figur 1 (e)) . Die emittierte Fluoreszenz bezog sich ausschließlich auf das Cytosol der glatten Muskelzellen der Widerstandsgefäße. Auch durch stärkere Vergrößerung konnte mittels konfokaler Mikroskopie gezeigt werden, dass keine Fluoreszenz innerhalb des Extrazellulärraums beobachtet werden konnte (Figur 1 (d)). Eine kontinuierliche Anregung bei 488 nm verursachte ein Ausbleichen der GFP-vermittelten Fluoreszenz (Figur 1 (e)), beeinflusste jedoch nicht die Hintergrundfluoreszenz, welche beispielsweise durch Matrixkomponenten emittiert wurde (Figur 1 (a)) .
Die funktioneile Untersuchung der isolierten, in v/Yro-transfizierten Widerstandsgefäße ergab eine intakte Kontraktilität, induziert durch NE, und eine Zunahme des transmuralen Druckes (Bayliss-Effekt) . Die zuletzt genannten myogenen Konstriktionen der glatten Muskelzellen der Gefäßwand der Widerstandsgefäße kehrten druckinduzierte Ausdehnungen zu 55 + 7 % innerhalb von 8 min um, wobei diese sich nicht erheblich von denjenigen unterschieden, die für isolierte, nicht-transfizierte Arterien (49 ± 40 % in frisch isolierten und 51 ± 1 6 % in kultivierten Widerstandsgefäßen der Arteria femoralis profunda) beobachtet wurden. Alle isolierten, in wYro-transfizierten Widerstandsgefäße dilatierten vollständig nach Stimulation mit 1 μmol/l des endothelabhängigen Vasodilators ACh, was darauf hinweist, dass die Transfektion der glatten Muskelzellen der Widerstandsgefäße die Endothelfunktion nicht beeinflusst.
Die vaskulären Antworten nahmen mit der Zeit zunehmend ab, wenn die Widerstandsgefäße länger als 22 h dem zu transfizierenden Plasmid und dem Transfektionsmittel ausgesetzt wurden. Isolierte, in Y/O-transfizierte Widerstandsgefäße, welche für eine Dauer von 24 h oder länger transfiziert wurden, zeigten keine kontraktilen Antworten gegenüber Noradrenalin mehr und die myogenen Antworten als auch die Dilatationen, induziert durch Acetylcholin, waren aufgehoben. Endsprechend konnte durch konfokales Abtasten eine auffallende Veränderung der Form der Zellen beobachtet werden (Figur 1 (f)).
Es wurde eine Transfektionseffizienz von 96,5 ± 1 % bei glatten Muskelzellen bestimmt.
2. S1 P-induzierte Konstriktionen der isolierten, in Yro-transfizierten Widerstandsgefäße der Arteria femoralis profunda aus Hamster
S1 P (0,003-3 mMol) induzierte konzentrationsabhängige Konstriktionen in isolierten, GFP-//7 v/tro-transfizierten Widerstandsgefäßen. Die durch S1 P- induzierten Konstriktionen waren jedoch vollständig irreversibel, nachdem S1 P durch Waschen der Widerstandsgefäße entfernt wurde bzw. waren unverändert nach wiederholten Stimulationen. Die Konstiktionen als Antwort auf 0,003, 0,03 und 0,3 μmol/l S1 P waren streng abhängig von RhoA und Rho-Kinase, da sie durch das exogen verabreichte RhoA- inhibierende bakterielle Toxin C3-Transferase als durch den Rho-Kinase- Inhibitor Y27632 unterdrückt wurden (Figur 2). Die Transfektion der isolierten Widerstansgefäße mit dem für die bakterielle C3-Transferase kodierenden Plasmid verhinderte S1 P-induzierte Konstriktionen auf eine ähnliche Art und Weise, wie die herkömmlichen Verfahren (exogene C3- Transferase und Y27623, Figur 2) .
IV. Diskussion
Diese Studie beschreibt ein neues Transfektionsverfahren, welches eine hocheffiziente Transfektion von glatten Muskelzellen von intakten, isolierten Widerstandsgefäßen der Arteria femoralis profunda aus Hamster mit Plasmid-DNA ermöglicht. Funktionelle Untersuchungen nach der Transfektion der glatten Muskelzellen der Widerstandsgefäße mit einem Plasmid, welches für GFP kodierte und die Regulation der Gefäßfunktion der Widerstandsgefäße nicht stören sollte, zeigten, dass das erfindungsgemäße Transfektionsverfahren per se die vaskulären Antworten auf die verschiedenen vasokonstriktorischen und vasodilatorischen Stimuli nicht beeinflusst. Die Transfektion der isolierten Widerstandsgefäße mit einem weiteren Plasmid, welches für ein Protein mit bekannten RhoA- inhibierenden Eigenschaften, nämlich der bakteriellen C3-Transferase, kodierte, verhinderte Sphingosin-1 -phosphat (SΙ P)-induzierte RhoA- vermittelte Konstriktionen. Dieses neue Transfektionsverfahren stellt somit erstmals ein Mittel zur ausreichenden genetischen Manipulation von glatten Muskelzellen in intakten, isolierten Widerstandsgefäßen bereit, das weiterhin auch die funktionelle Untersuchung von Änderungen, die durch die Proteinprodukte der transfizierten DNA-Plasmide vermittelt werden, ermöglicht.
Glatte Muskelzellen von isolierten, nicht-transfizierten Widerstandsgefäßen zeigten keine Fluoreszenz nach Anregung bei 488 nm. Eine Transfektionsdauer von 1 9-22 h für eine Transfektion der isolierten Widerstandsgefäße mit dem GFP-kodierenden Plasmid, lieferte eine homogene Expression von GFP, was durch die charakteristische GFP- vermittelte Fluoreszenz entlang der Widerstandsgefäße und durch die verschiedenen Schichten der glatten Muskelzellen der Gefäßwand hinweg nachgewiesen werden konnte. Im Gegensatz zur Autofluoreszenz der Matrixkomponenten, welche durch kontinuierliche Anregung bei 488 nm nicht ausbleichte, war die GFP-vermittelte cytosolische Fluoreszenz empfindlich gegenüber einer Ausbleichung. Dies unterstreicht weiterhin die Annahme, dass die cytosolische Fluoreszenz der glatten Muskelzellen der isolierten, in wYrσ-transfizierten Widerstandsgefäße, welche in isolierten, nicht transfizierten Widerstandgefäßen nicht beobachtet werden konnte, durch das in den glatten Muskelzellen der Widerstandsgefäße exprimierte GFP verursacht wurde. Die äußeren und Subendothel-Schichten aus glatten Muskelzellen der Widerstandsgefäßwand zeigten eine einheitliche GFP- vermittelte Fluoreszenz, was darauf hindeutet, dass die verschiedenen Schichten aus glatten Muskelzellen einheitlich mit dem GFP-kodierenden Plasmid transfiziert wurden. Jedoch scheint die Basalmembran zwischen d e n g l atte n M u s ke lze l l e n u n d d e n E n d oth e l ze l l e n d e r Widerstandsgefäßwände eine undurchlässige Barriere für die zu transfizierenden Nukleinsäuren darzustellen, da keine der Endothelzellen GFP exprimierte.
Die Inhibierung von RhoA durch C3-Transferase, welche nach Transfektion mit dem C3-Transferase-kodierenden Plasmid in den glatten Muskelzellen der Widerstandsgefäße synthetisiert wurde, entsprach der RhoA- Inhibierung, welche für exogen verabreichte C3-Transferase oder für Y27632 beobachtet werden konnte. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Inhibierung der S1 P-induzierten, RhoA-vermittelten kontraktilen Antworten homogen entlang des kanülierten Widerstandsgefäßes war. Nachdem das 25 kD-große Enzym C3-Transferase zu groß ist, um Gap- junctions zu Durchqueren und eindeutig aus der Transfektion der glatten Muskelzeilen der Widerstandsgefäße resultiert, konnten diese Experimente zeigen, dass alle glatten Muskelzellen innerhalb der Gefäßwand der Widerstandsgefäße mit dem Plasmid transfiziert wurden, da eine homogene Inaktivierung von RhoA die Expression der C3-Transferase in allen glatten Muskelzellen der Widerstandsgefäße erfordert.
Für optimale in v/Yrσ-Transfektionsergebnisse sollte die Dauer der in vitro- Transfektion der Widerstandsgefäße zwischen 1 9 und 22 h betragen. Der Grund für eine zunehmende Abnahme der Gefäßreaktivität nach einer Transfektionsdauer von größer 22 h könnte sein, dass die Transkription des transfizierten Plasmids üblicherweise durch starke virale Promotoren gesteuert wird, wodurch große Teile des Biosytheseapparats der transfizierten glatten Muskelzellen damit beschäftigt sind, das Fremdprotein zu synthetisieren. Diese Promotoren können aufgrund ihrer viralen Natur nicht durch die Wirtszelle reguliert werden, was in kurzer Zeit zu großen Mengen des Plasmid-kodierten Fremdproteins führt. Um nur begrenzt vorhandene zelluläre Ressourcen einzusparen, nimmt die permanente, notwendige Regenerierung der zellulären Proteine ab. Dies resultiert in einem Nettoverlust an strukturellen und funktioneilen zellulären Proteinen, wie z.B. Actin und Myosin, und ist womöglich der Grund für den vollständigen Verlust der Kontraktilität in Verbindung mit den beobachteten Zelldeformationen, wenn die Transfektionsdauer der Widerstandsgefäße 22 h übersteigt.
Zusammenfassend kann also festgestellt werden, dass die vorliegende Erfindung eine neues Verfahren zur Untersuchung der funktionellen Eigenschaften von Gefäß-relevanten Genen bereitstellt. Zudem stellt das erfindungsgemäße Verfahren zur in wYrσ-Transfektion von isolierten Organen ein neues Mittel bereit, um den genetischen Hintergrund der mikrovasculären Physiologie zu untersuchen und ermöglicht die Identifikation und Charakterisierung neuer Targets für innovative therapeutische Strategien.

Claims

Ansprüche
1 . Isoliertes, in v/Yrσ-transfiziertes Organ mit glatten Muskelzellen, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens 80 % der glatten Muskelzellen des Organs transfiziert sind.
2. Organ nach Anspruch 1 0, dadurch gekennzeichnet, dass die glatten Muskelzellen des Organs mit einem Molekül, ausgewählt aus Nukleinsäuren, Polypeptiden, Pharmaka, synthetischen Stoffen, Zuckern, Fettsäuren, Derivaten und/oder Komplexen davon, transfiziert sind.
3. Organ nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es aus Arterien, Venen, Kapillargefäßen, endokrinen Organen, exo kri nen O rg ane n , Skelettmuskel , g l atte m M uske l , gastrointestinalen Organen, Urogenitalorganen, Lunge, Herz, Niere,
Leber, Milz, Magen und Bronchialbaum ausgewählt ist.
4. Organ nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es ein langzeitkultiviertes Organ ist.
5. Verfahren zur Transfektion von glatten Muskelzellen in einem Organ, umfassend die Schritte:
(i) Kultivieren eines isolierten Organs, das glatte Muskelzellen enthält, in vitro und
(ii) Inkontaktbringen des isolierten Organs während der Kultivierung mit einem Transfektionsmittel unter derartigen Bedingungen, dass eine Transfektion von wenigstens 80 % der glatten Muskelzellen in dem Organ erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Transfektion mit einem Molekül, ausgewählt aus Nukleinsäuren, Polypeptiden, Pharmaka, synthetischen Stoffen, Zuckern, Fettsäuren, Derivaten und/oder Komplexen davon, erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren in einzelsträngiger oder doppelsträngiger Form vorliegen.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren ausgewählt werden aus DNA, RNA, PNA und Analoga davon.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren in operativer Verknüpfung mit einer heterologen Expressionskontrollsequenz vorliegen.
1 0. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren für ein Polypeptid kodieren.
1 1 . Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 1 0, dadurch gekennzeichnet, dass das isolierte Organ ein vollständiges Organ oder ein Fragment davon ist.
2. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das isolierte Organ während des Kultivierens perfundiert oder superfundiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Perfusion oder Superfusion mit Kulturmedium erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 2 oder 1 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Superfusion bei einem Fluss von 0, 1 ml/h bis 300 l/h bzw. die Perfusion bei einem Fluss von 0, 1 ml/h bis 300 l/h und/oder einem Druck von 0-300 mmHg erfolgt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 2 bis 1 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Perfusion über wenigstens eine Arterie oder Vene oder wenigstens ein Kapillargefäß des isolierten Organs erfolgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 1 5, dadurch gekennzeichnet, dass das isolierte Organ ausgewählt wird aus Arterien, Venen, Kapillargefäßen, endokrinen Organen, exokrinen Organen, Skelettmuskel, glattem Muskel, gastrointestinalen Organen,
Urogenitalorganen, Lunge, Herz, Niere, Leber, Milz, Magen und Bronchialbaum.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 1 6, dadurch gekennzeichnet, dass die transfizierten glatten Muskelzellen funktionell bleiben.
1 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 1 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Kultivieren für wenigstens 50 Stunden erfolgt.
1 9. Verfahren nach Anspruch 1 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Kultivieren für wenigstens 70 Stunden erfolgt.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 1 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Transfektionsdauer 1 0 Minuten bis 50 Stunden beträgt.
21 . Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Transfektionsdauer 1 0 bis 22 Stunden beträgt.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass das Organ eine Arterie, Vene oder ein Kapillargefäß ist und die Zielzellen in dem Organ glatte Muskelzellen und gegebenenfalls
Endothelzellen und/oder adventitielle Zellen sind .
23. Isoliertes, in wYro-transfiziertes Organ, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 22.
24. Verwendung eines Organs nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 23 zur Identifizierung und/oder Charakterisierung von Polypeptiden und anderen Wirksubstanzen, welche die Funktionalität von glatten Muskelzellen modulieren.
25. Verwendung eines Organs nach Anspruch 23 zur Identifizierung und/oder Charakterisierung von Polypeptiden und anderen Wirksubstanzen, welche die Kontraktilität von glatten Muskelzellen modulieren.
26. Verwendung eines Organs nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 23 zur Untersuchung von Krankheiten, die das Organ betreffen.
27. Verwendung nach Anspruch 26 zur Untersuchung von Krankheiten, die mit erhöhtem oder erniedrigtem Blutdruck verbunden sind, wobei dass das Organ eine Arterie oder ein Kapillargefäß ist.
28. Verwendung eines Organs nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 23 zur Identifizierung von Wirksubstanzen zur Prävention und/oder Behandlung von Krankheiten, die das Organ betreffen.
29. Verwendung eines Organs nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 23 zur Identifizierung neuer Targets.
30. Verwendung eines Organs nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 23 zur Identifizierung der Wirkung von therapeutischen Maßnahmen auf das Organ bzw. auf die das Organ betreffenden Krankheiten.
31 . Verwendung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die therapeutischen Maßnahmen eine Gentherapie umfassen.
32. Verwendung eines Organs nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 23 zur Entwicklung pharmakologischer Strategien zur Prävention und/oder Behandlung von Krankheiten, die das Organ betreffen .
33. Verwendung eines isolierten, in wYra-transfizierten Organs, wobei wenigstens 80 % von Zielzellen des Organs mit einem für ein Polypeptid kodierenden Nukleinsäuremolekül transfiziert sind, wobei das Polypeptid in den Zielzellen exprimiert wird, zur Bestimmung, ob das in den Zielzellen exprimierte Polypeptid die Funktionalität des
Organs moduliert.
34. Verwendung nach Anspruch 33 zur Bestimmung Kontraktilitäts- modulierender Eigenschaften eines Polypeptids in einem Organ mit glatten Muskelzellen.
35. Verwendung nach Anspruch 33 oder 34 zur Bestimmung der vaskulären Funktion eines Polypeptids.
36. Kulturmedium zur in v/Yro-Langzeitkultivierung eines isolierten Organs, umfassend wenigstens ein anorganisches Salz, wenigstens eine zusätzliche Komponente, ausgewählt aus D( + )-Galaktose, Phenolrot, Na-Pyruvat und Glutathion, wenigstens eine Aminosäure und wenigstens ein Vitamin, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Kultivierung von isolierten Organen für eine Dauer von wenigstens 50 Stunden ermöglicht.
37. Kulturmedium nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass die anorganischen Salze ausgewählt sind aus CaCI2, KCI, Kh2P04, MgCI2, MgSO4, NaCI, Na2hP04.
38. Kulturmedium nach Anspruch 36 oder 37, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuren ausgewählt sind aus D,L-Alanin, L-Arginin, L- Asparagin, L-Cystein, L-Glutamin, Glycin, L-Histidin, L-Isoleucin, L- Leucin, L-Lysin, D,L-Methionin, D,L-Phenylalanin, L-Serin, L- Threonin, L-Tryptophan, L-Thyrosin, L-Valin.
39. Kulturmedium nach einem der Ansprüche 36 bis 38, dadurch gekennzeichnet, dass die Vitamine ausgewählt sind aus D-Ca-Pantothenat, Cholinchlorid, Folsäure, i-lnositol, Nikotinamid, Pyridoxal, Flavin- Mononukleotid und Thiaminmonophosphat.
40. Transportable Vorrichtung zur in v/Yrσ-Langzeitkultivierung eines isolierten Organs, umfassend
(i) ein Organbad zur Kultivierung des isolierten Organs, (ii) wenigstens eine Zu- und Ableitung zu bzw. aus dem Organbad zur Superfusion des isolierten Organs und (iii) wenigstens zwei Kapillaren zur Perfusion des isolierten
Organs, die in wenigstens einer Ebene des Raumes stufenlos verstellbar sind, wobei sie an jeweils einem Ende eine Zu- bzw. Ableitung aufweisen und das jeweils andere Ende zur Kanüllierung des Organvolumens dient.
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