KR20000053164A - 미소입자의 압력-매개 세포내 전달 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포에 의한 원자, 분자, 또는 <10㎛의 입자의 흡수를 향상시키는방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 (a) 세포를 원자, 분자, 또는 입자를 포함하는 액상 매질과 접촉시키는 단계, (b) 세포 및 액상 매질을 밀폐된 공간에서 유지시키는 단계 및 (c) 밀폐된 세포 및 액상 매질에 세포에 의한 원자, 분자, 또는 입자의 흡수를 향상시키기에 충분한 인큐베이션 압력을 가하는 단계를 포함함다.

Description

미소입자의 압력-매개 세포내 전달{PRESSURE-MEDIATED INTRACELLULAR DELIVERY OF MOLECULES OR MICORPARTICLES}
세포 및 분자 생물학 연구는 생존 세포의 막내의 복잡한 물리적 및 생화학적 환경의 존재를 밝혀왔다. 이러한 막들은 여러 유형의 세포에서 특수한 기능을 수행하는 복잡한 반투과성 장벽을 제공한다; 모든 생존한 세포의 막들은 생명활동이 일어나는 현미경적인 수성 공간(microscopic aqueous space)을 분리시키는 역할을 담당하는 지질 이중층으로 구성된다. 모든 세포들은 세포 경계의 지질이중층을 투과할 수 없는 크고/거나 소유성(lipophobic)인 물질들의 수동적인 배출(passive exclusion)에 의해 또는 특수한 단백질에 의해 세포막을 투과하여 통과할 수 있는 분자 또는 입자들의 능동적으로 조절된, 양방향성 이동(active controlled, bi-directional movement)에 의해, 자신들의 세포내 공간의 분자적 구성을 조절한다. 이들 분자들중 일부는 결합되어 보편화된 세포내로의 통로를 제공하거나 특수한 요소만을 통과시키는 구멍 또는 채널을 형성할 수 있다.
원자, 분자 및 미소입자들의 세포내로의 도입은 생물학자 또는 외과의사들의 기본적인 연구수단이 되어 왔고 이들에게 생명체의 세포내 과정을 분석하는 능력 및 예방, 진단 또는 질병 퇴치를 위한 약리학적 방법을 고안하기 위한 기초를 제공한다. 세포막의 정교한 기능적 특성 때문에 하전되거나 큰 분자들의 전달은 매우 어려운 과정이 되어 왔으며, 이 때문에 이러한 물질들을 세포내에 적용하는 것이 매우 곤란하였다. 또한, 다수의 복잡한 물질들은 세포내 이입(endocytosis) 또는 세포흡수과정(pinocytosis)과 같은 세포막 함입 과정(membrane invagination)을 통해서만 세포내로 흡수될 수 있다. 대부분의 경우에 있어서, 이와 같이 해서 형성된 이전에 세포외 물질이었던 물질들을 포함하는 세포내 이입 소포들은 가혹한 효소적 환경을 포함하는 라이소좀과 융합된 후, 삼킨 물질을 소화과정에 의해 파괴시킬 수 있다.
[발명의 요약]
본 발명의 방법은 물질을 생존한 세포 또는 세포들의 세포외 환경에 전달하는 과정, 그 세포 또는 세포들을 둘러싼 밀폐된 공간을 형성하는 과정, 및 그 밀폐된 공간내에 세포 또는 세포들에 의한 물질의 흡수를 향상시키는데 충분한 높은 인큐베이션 압력을 걸어주는 과정을 포함한다. 본 발명에서 상기 물질은 작은 분자 부터 미소입자까지 크기가 다양할 수 있고 그러한 물질을 흡수하는 세포에서 기능에 일정한 영향을 미치거나 심각한 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 상기 물질은 작은 분자(예컨대, 약물), 당, 지방산, 또는 지방산 유도체, 또는 단백질(예컨대, 항체, 효소, 또는 호르몬)일 수 있다. 세포들은 시험관내, 조직 또는 기관 배양체(tissue or organ culture)내에 존재할 수 있고, 살아있는 유기체의 일부분일 수 있다.
따라서 본 발명의 목적은 세포의 표적 세포 또는 집단내에서 예상되거나 실제로 이루어지는 훨씬 높은 정도의 현미경적 종들 또는 분자종의 세포내 흡수를 유발하는 것이다. 따라서, 이러한 방법은 정상적으로는 세포에 의해 소량밖에 흡수되지 않는 물질을 대량으로 세포내로 전달하거나 그렇게 하지 않으면 세포막에 의해 세포외 환경에 축출된 채로 남아있게 될 물질들을 흡수시키는데 이용될 수 있다. 본 발명은 표적 집단(target population)에서의 세포의 흡수를 더 높은 비율로 증가시켜 특정 조직 또는 기관을 표적화하는 더욱 효과적인 흡수를 제공할 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하여 수행되는 세포내 전달(intracelluar delivery)은 조직의 손상(예컨대, 확장) 또는 외상을 초래하지 않기 때문에 세포에 해를 미칠 가능성이 없다. 더욱이, 많은 경우에 있어서, 본 발명의 세포내 전달 방법은 라이소자임 구획화(lysozyme compartmentalization)를 수반하지 않고 세포의 세포질로 전달할 수 있는 수단을 제공하여 전달될 물질이 라이소자임 효소에 의해 파괴되지 않도록 보호하는 기능도 제공한다. 본 발명의 방법은 세포내 장벽을 통과하는 세포 핵과 같은 공간내로의 물질의 이동을 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 다른 특징 및 이점들은 이하의 상세한 설명, 도면 및 청구범위로부터 자명해질 것이다.
본 발명은 생존 세포에 의한 세포외 물질의 흡수를 촉진하는데 관계한다.
도 1a는 본 발명의 전달 시스템을 도시한 것이다. 도 1b는 혈관내로 전달될 물질을 포함하는 용액의 전달 이전에 혈관의 유리된 말단에 부착된 도 1a의 시스템을 도시한 것이다. 도 1c는 혈관내로 전달될 물질을 포함하는 용액을 혈관의 내피로 전달하는 과정중의 도 1b의 시스템 및 혈관을 도시한 것이다. 도 1d는 혈관내로 전달될 물질을 포함하는 용액을 혈관의 내피로 전달하는 과정중의 도 1b의 시스템 및 혈관과 혈관의 외표면을 도시한 것이다.
도 2는 가압된 인클로져의 경계의 일부분을 한정하는 혈관의 일부분에 대한 전달을 도시한 것이다.
도 3a는 혈관내로의 세포내 전달의 다른 방법을 도시한 것이다. 도 3b는 혈관이 기계적으로 가압된 도 3a의 혈관을 도시한 것이다.
도 4a는 혈관내로 전달될 물질을 포함하는 용액을 전달하도록 개조된 투-벌룬 카테터(two-balloon catheter)를 도시한 것이다. 도 4b는 벌룬이 팽창된 상태의 도 4a의 투-벌룬 카테터(two-balloon catheter)를 도시한 것이다. 도 4c는 혈관의 벽에 전달될 물질을 포함하는 용액을 전달하는 벌룬과 내부 세관들을 갖는 카테터 시스템을 도시한 것이다.
도 5a는 기관내 혈관으로의 전달을 도시한 것이다. 도 5b는 기관을 가압하여 이용하기 위한 벌룬-카테터의 이용을 도시한 것이다.
도 6은 가압 쳄버를 포함하는 전달 시스템을 도시한 것이다.
도 7a는 본 발명에 따라 사람의 트랙스펙션된 복재 정맥(sephenous vein)에서의 트랜스펙션 효율(transfection efficiency)을 적용된 압력에 대한 함수로 나타낸 그래프도이다. 도 7b는 사람의 FITC-ODN 트랜스펙션된 복재 정맥에서의 트랜스펙션 효율에 대한 확장-억제 쉬스(distension-preventing sheath)의 영향을 도시한 것이다. 도 7c는 IL-6 안티센스 ODN의 사람 복재 정맥내로의 트랜스펙션 이후의 IL-6 단백질 생산의 억제를 도시한 것이다.
도 8a는 개체 A의 IL-6 안티센스 ODN의 사람 복재 정맥내로의 트랜스펙션 이후의 IL-6 mRNA 생산의 억제를 도시한 것이다. 도 8b는 도 8a와 유사한 것으로, 개체 B에 대한 것이다. 도 8c는 개체 C에 대한 도 8a와 유사한 그래프도이다.
도 9a는 형광 현미경으로 측정한 토끼 경동맥의 생체내 트랙스펙션에 대한 트랜스펙션 효율을 도시한 것이다. 도 9b는 개똥벌레 루시페라제를 코드화하는 DNA를 갖는 토끼 경동맥의 생체내 트랜스펙션 이후의 대조군(control), 건강한 세포 및 아테롬성경화증 세포에서의 루시페라제 활성을 도시한 것이다.
도 10은 본 발명의 방법에 따라 시험관내 트랜스펙션된 쥐 혈관 평활근 세포들의 트랜스펙션 효율을 도시한 것이다.
도 11은 개똥벌레 루시페라제를 코드화하는 유전자를 포함하는 플라스미스 DNA에 의해 관류된 쥐 신장의 루시페라제 활성을 도시한 것이다.
도 12a는 쥐 대동맥 세포의 트랜스펙션 효율에 대한 압력의 영향을 도시한 것이다. 도 12b는 안티센스-PCNA ODN의 압력-매개 트랜스펙션에 의한 허혈성-유도 PCNA 발현 및 안티센스-PCNA ODN의 압력-매개 트랜스펙션에 의하지 않은 허혈성-유도 PCNA 발현을 도시한 것이다. 도 12c는 안티센스-cdc2 키나제 ODN의 압력-매개 트랜스펙션에 의한 허혈성-유도 cdc2 키나제 발현 및 안티센스-cdc2 키나제 ODN의 압력-매개 트랜스펙션에 의하지 않은 허혈성-유도 cdc2 키나제 발현을 도시한 것이다. 도 12d는 동종조직이식된, 허혈성-손상 쥐 대동맥의 루멘이 좁아지는 현상이 PCNA 및 cdc2 키나제 양자에 대한 안티센스 ODN의 압력-매개 트랜스펙션에 의해 감소되는 것을 도시한 것이다.
도 13a는 각각 압력에 의해 및 압력에 의하지 않고 FITC-ODN에 의해 생체외 트랜스펙션된 쥐 심장에서의 트랜스펙션 효율을 도시한 것이다. 도 13b는 안티센스-ICAM-1 ODN의 압력-매개 트랜스펙션에 의한 및 압력을 가하지 않고 이식된 쥐 심장에서의 ICAM-1의 발현을 도시한 것이다. 도 13c는 ICAM-1에 대한 안티센스 ODN 이식된 쥐의 압력-매개 트랜스펙션에 의한 장기 이식편 수용(long-term graft acceptance)의 유도를 도시한 것이다.
도 14는 비처리(대조군) 이식편, 및 PCNA 및 cdc2 키나제 양자에 대한 역방향 안티센스(대조군) ODN 또는 안티센스 ODN으로 트랙스펙션된 이식편들의 6주후 및 6개월후의 벽 두께를 도시한 것이다. 도 14B는 E2F 디코이 ODN에 의해 트랜스펙션된 정맥에서 수득한 도 14a에서와 같은 결과를 비처리 이식편 및 스크램블드 ODN에 의해 트랜스펙션된 대조군 이식편에 대한 결과와 비교하여 도시한 것이다.
본 발명에 의해 이용될 수 있는 물질의 유형은 (1) 하전 원자 또는 이온들, (2) 소형 핵산을 제외한 중성 또는 하전된 소형 분자(예컨대, 분자량 1,000 미만의 분자들), (3) 핵산을 제외한 대형 분자들(예컨대, 분자량 1,000 초과의 분자들), 특히 단백질, 펩타이드, (4) 폴리머 및 필라멘트(일반적으로 최대직경 10㎛ 미만), (5) 무기 원자 및 분자들 및 (6) 극미립자(microscopic particles)(일반적으로 최대직경 10㎛ 미만). 이들 물질들은 광범위한 농도, 반드시 제한되는 것은 아니나, 바람직하게 물질의 유형 및 그 물질의 사용용도에 따라 1 nM 내지 1mM 농도로 세포의 세포외 환경(extracellular environment)에 전달될 수 있다. 본 발명의 각각의 응용에서 이용될 정확한 농도는 이용자의 화학, 생화학적 지식 또는 전달될 물질의 기능적 특성에 기초하여 결정될 수 있다. 상기 물질은 세포외 환경에서 용액으로 존재하거나 현탁액 또는 콜로이드를 구성할 수 있다.
조직 및 세포외 환경을 포함하는 밀폐된 인클로져(enclosure)가 한정되고 인큐베이션 압력은 상기 밀폐된 인클로져내에서 형성된다. 바람직한 구현예에 있어서, 인클로져의 경계는 실질적으로 인클로징 수단(enclosing means)에 의해 한정되므로, 표적 조직(표적 세포를 포함하는 조직)은 고른 압력을 받아 확장되거나 외상을 입지 않게 된다. 다른 구현예에 있어서, 인클로져의 경계의 일부는 조직에 의해 한정된다. 이어서 비탄성 쉬스(inelastic sheath)와 같은 보호 수단이 조직 주위에 배치되어 조직을 확장 및 외상으로부터 보호한다.
특히, 혈관내에서, 밀봉된 인클로져는 바람직하게 팽창가능한 벌룬 또는 타이 랩(tie wraps)에 의해 형성된 폐쇄(occlusions) 공간 사이에 경계가 정해진다. 전달될 물질을 포함하는 용액은 폐쇄 공간 사이에 있는 전달 출구(dilivery outlet)를 갖는 카테터를 통해서 인클로져에 전달된다. 더욱 보편적으로, 인클로져는 기관내의 공간이 가입될 수 있도록, 기관 도관(예컨대, 혈관)을 폐쇄시킴으로써 기관내에서 경계가 정해진다.
세포 흡수를 촉진시키기 위해 이용되는 인큐베이션 압력은 바람직하게 소정의 인큐베이션 기간 동안 소정의 레벨로 유지된다. 인큐베이션 압력은 인큐베이션 기간, 조직 유형 및 전달 분자와 같은 파라미터들을 포함하는 응용에 의존한다. 이용가능한 인큐베이션 압력의 범위는 예를 들어, 주위 압력 보다 50 mmHg 내지 5 기압 높은 정도이거나 또는 주위 압력보다 300 mmHg 내지 1500 mmHg 높은 압력 또는 주위 압력보다 0 내지 2 기압 높은 압력의 범위이거나; 효과적인 전달이 이루어질 수 있고 표적 세포 또는 세포들이 외상을 받지 않는다면 이 보다 더 높거나 낮은 압력이 이용될 수 있다.
세포 흡수를 촉진하기 위해 이용되는 인큐베이션 압력은 인큐베이션 압력, 표적세포 유형, 전달될 분자, 및 목적 용량 등의 여러 가지 파라미터에 의존하여 달라질 수 있다. 인큐베이션 압력의 지속기간은 예를들어, 1 초 내지 4시간의 범위일 수 있다. 바람직하게, 압력 지속기간은 20초와 30분 사이이고, 더욱 바람직하게는 60초와 10분 사이이다.
적합한 포유동물 표적 세포들은 혈관조직(특히, 동맥에서 이식편으로 이용되는 정맥), 심장, 골수, 결합조직, 간, 신장, 비뇨생식기 조직, 뼈, 근육, 위장관 기관, 및 내분비 및 외분비 기관을 포함한다. 본 발명의 방법들은 기관의 일부분, 기관 전체(예컨대, 심장) 또는 전체 유기체에 적용될 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, 전달될 물질을 포함하는 용액은 환자의 표적 부위(예컨대, 신장)내에 관류되고, 환자는 가압쳄버내에서 가압된다. 본 발명의 응용들은 동종이식편(이식 환자와 다른 개체로부터 유래된 이식편) 및 동계이식편(이식 환자로부터 유래된 이식편)을 또한 포함한다.
본 발명의 각각의 응용예에서의 조건은 물질을 방사성동위원소, 형광물질, 또는 화학약품 택(tag)으로 표지하고나서 물질을 추적하여 라벨에 의해 압력-향상 투여(pressure-enhanced administration)함으로써 결정할 수 있다. 그렇지 않으면, 생물학적 활성을 측정할 수도 있다. 마찬가지로, 전달 조건의 최적화는 목적으로 하는 물질과 화학적으로 및/또는 물리적으로 유사한 쉽게-표지되는 물질의 전달을 정량함으로써 달성할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 분자를 세포내로 배송하는 시스템은 밀봉된 인클로져의 적어도 일부분의 경계를 정하는 인클로징 수단, 인클로져 내에 인큐베이션 압력을 가하는 가압 수단을 구비한다. 카테터 또는 주사기와 같은 전달 수단들은 분자를 직접 또는 간접으로(예컨대, 정맥내 주사) 세포외 환경으로 전달하는데 이용된다.
인클로져의 경계는 인클로징 수단에 의해 정해지는데 조직(tissue)이 될 수 있다. 적당한 인클로징 수단은 구현예에 따라 가압 쳄버, 투과성 쉬스 또는 백(bag), 및 조직내에서의 통과를 차단하는 폐쇄 수단(occlusion means)을 포함한다. 가압 쳄버는 특히 이식편 또는 전체 유기체의 치료에 적합한 반면에, 다른 장치들은 조직의 수술후 처리에 매우 적합하다.
하나의 구현예에 있어서, 인클로져 경계는 실질상 인클로징 수단에 의해 정해진다. 그 다음으로 압력은 표적 조직에 대해 고르게 모든 방향으로 가해지고 표적 조직은 외상을 입을 염려가 없게 된다. 다른 구현예에 있어서, 경계의 일부는 조직(예컨대, 표적 조직)에 의해 정해진다. 인클로져 경계의 조직 형성 부분은 한쪽으로만 압력을 받고 팽창할 수 있다. 비탄성 쉬스와 같은 보호수단은 조직주위에 배치되어 조직의 확장 또는 외상을 예방한다. 본 발명의 방법 및 전달 시스템을 이하에서 더 자세히 설명한다.
도 1a 내지 1d는 분자를 혈관 세포내로 가압 전달하는 방법을 설명한 도면이다. 도 1a는 본 발명의 전달 시스템 11의 측면도이다. 시스템(11)은 전달 물질을 포함하는 용액(40)을 저장하는 저장소(10), 및 저장소(10)로부터 용액(40)을 배출시키는 전달 수단을 구비한다. 전달 수단은 플런저(12)와 전달 튜브(14)를 포함한다. 대향하는 플런저(12), 저장소(10)는 튜브(14)쪽으로 열린다. 튜브(14)에 연결된 것은, 저장소(10)로부터 가까운 순서대로 열거하면, 스톱코크(16), 압력 게이지(18), 수축되는 쉬스(20), 노치(22)이다. 쉬스(20)는 바람직하게 불투과성이고 비탄성이다. 노치(22)는 튜브(14)의 원위 말단(30) 다음에 있다. 스톱코크(16)은 초기에는 용액(40)이 저장소(10)로부터 튜브(14)로 흘러가지 않도록 닫힌 상태이다.
도 1b는 시스템 11에 연결된 혈관(24)을 도시한 것이다. 개방 말단(30)은 혈관(24)의 근위 말단(proximal end)내에 위치된다. 노치(22)는 조직(24)의 근위말단내에 맞게 된다. 쉬스(20)는 조직(24)을 덮기 위해 당겨진다. 조직(24)이 개방 말단(30)으로부터 미끄러지지 않도록, 타이 또는 결찰사(26A)가 쉬스(20) 및 조직(24) 주위에 이들이 튜브(14)에 부착된 지점에 감겨진다. 스톱코크(16)가 개방 위치로 돌려지면, 용액(40)은 튜브(14) 및 쉬스(20) 안으로 들어가고, 쉬스(20)의 개방 말단(28)을 통해서 모든 기체 및 액체를 밖으로 분출시킨다. 분출후, 타이 랩(26B)을 쉬스(20)의 원위 개방 말단(28)의 위에 씌워 도 1c 및 도 1d와 같이 물이 새지 않도록 밀봉한다. 도 1c는 혈관(24)의 내피를 표적으로 한 경우의 전달을 도시한 것인 반면에, 도 1d는 혈관의 내피 및 외표면에 대한 전달을 도시한 것이다.
도 1c에서, 타이 랩(26B)은 쉬스(20) 및 조직(24) 둘레를 묶는다. 타이 랩(26B)은 혈관(24)을 막는다. 스톱코크(16)는 개방 위치로 돌려지고 플런져(12)가 밀려서 용액(40)이 전달압력하에서 혈관(24) 안으로 전달된다. 전달 압력은 인큐베이션 압력에 도달할 때까지 상승되고 스톱코크(16)는 닫힌다. 혈관(24)은 인큐베이션 기간 동안 인큐베이션되고 그 후 압력을 줄이기 위해 타이 랩(26B)이 풀린다 (도시하지는 않았음).
밀봉된 인클로져의 경계는 혈관(24)의 벽 및 인클로징 수단에 의해 정해진다. 밀봉된 인클로져는 혈관(24)의 표적(내피) 세포들 및 그들의 세포외 환경을 포함한다. 만약 스톱코크(16)가 닫힐 경우, 인클로징 수단은 튜브(14), 스톱코크(16), 및 결찰사(26B)를 포함한다. 스톱코크(16)가 열리는 경우에는, 인클로징 수단은 결찰사(26B), 튜브(14), 플런져(12) 및 저장소(10)의 벽의 일부를 포함한다. 인클로징 수단은 인클로져의 적어도 일부분의 경계를 한정한다.
도 1c에 도시한 구현예에서, 인클로져의 경계의 일부분은 혈관(24)에 의해 정해진다. 혈관(24)의 내벽에만 적용되는 압력은 혈관(24)을 확장시키거나 외상을 입힐 수 있다. 쉬스(20)는 혈관(24)이 확장되지 않도록 방지하는 보호수단을 역할을 한다. 따라서 도 1c에 도시된 것과 같은 구조에서, 쉬스는 비탄성인 것이 중요하다.
도 1d에서와 같이, 타이 랩(26B)을 쉬스(20) 둘레에만 묶는 것도 가능하다. 이 경우에, 밀봉된 인클로져는 혈관(24)의 표적 세포를 포함하고 이들의 세포외 환경은 실질적으로 인클로징 수단에 의해 정해진다. 스톱코크(16)가 닫히면, 인클로징 수단은 쉬스(20), 튜브(14), 스톱코크(16), 및 결찰사(26B')를 포함한다. 스톱코크(16)가 열리는 경우에는, 인클로징 수단은 쉬스(20), 튜브(14), 결찰사(26B'), 플런져(12) 및 저장소(10) 벽의 일부를 포함한다.
도 1d에 도시된 구현예에서, 인클로져의 경계는 사실상 인클로징 수단에 의해 정해진다. 혈관(24) 주위의 압력은 균일하여, 혈관(24)는 외상을 입지 않는다. 쉬스(20)는 인클로징 수단의 일부로 기능하므로, 쉬스(20)는 불투과성인 것이 중요하다. 도 1d의 구조에서는 탄성 쉬스의 이용이 혈관(24)에 외상을 초래하지 않을 것이므로 쉬스(20)는 반드시 비탄성일 필요는 없다.
도 2는 환자의 순환계에 연결된 혈관에 대한 분자의 생체내 전달(in vivo delivery)을 설명한 도면이다. 튜브(14)는 여전히 살아있는 동물의 신체에 연결된 혈관(224)의 루멘내에 삽입된다. 쉬스(220)는 혈관(224) 주위를 감싸고 패스너(228 ; 예컨대, 심장 실)는 쉬스(220)의 두 개의 플랩들을 튜브를 형성하도록 부착시킨다. 쉬스(220)는 혈관(224)이 확장되지 않도록 방지하는 보호수단의 역할을 한다. 두 개의 타이 랩(226A 및 226B)이 쉬스(220) 둘레에 감긴다. 타이 랩 226A 및 226B는 혈관(224)을 막는 폐쇄 수단(occluding means)으로 기능한다. 폐쇄수단 226A 및 226B와 226A 및 226B 사이의 혈관(224)의 벽들은 혈관(224)의 표적 세포를 포함하는 밀봉된 인클로져(230)와 그들의 세포외 환경의 경계를 한정한다. 용액(40)은 밀봉된 인클로져 안으로 분사되고, 세그멘트(230)는 인큐베이션 기간동안 인큐베이션된다. 인큐베이션 기간이 경과한 후, 폐쇄수단 226A 및 226B는 제거되고 혈액은 혈관(224)을 통해 흐르도록 허용된다.
도 3a 및 도 3b는 도 2에 도시된 혈관으로 분자를 전달하는데 이용된 상이한 전달 및 가압 복재(pressurization elements)를 갖는 전달 시스템을 도시한 것이다. 도 3b에 도시된 바와 같이, 견고한 튜브상 랩(250)은 쉬스(220) 주위에 설치되고 바이스(252)는 랩(250) 둘레에 설치된다. 랩(250)은 원주방향으로 가요성이어서, 그것을 형성하는 튜브의 직경은 가변적이나, 그것은 축방향으로는 견고하여 직경이 변하는 경우에도 여전히 튜브 형태를 유지한다. 조임 나사(254)는 바이스(252)를 조이고, 랩(250)을 타이트하게 당겨서 혈관(224)내에 압력을 형성한다. 이러한 압력은 인큐베이션 기간 동안 유지되고 그 후 나사(254)를 푼다.
도 4a 내지 도 4d는 카테터(314)를 통해서 혈관(324)의 루멘에 전달될 물질을 전달하는 방법을 설명하는 도면이다. 카테터(314)는 혈관(324)내에 삽입된다. 카테터(314)는 그 말단(316)이 닫힌다. 카테터(314)는 두 개의 벌룬(332A 및 332B) 및 두 개의 벌룬들 332A 및 332B 사이의 전달 포트(330)를 갖는다. 처음에 벌룬들 332A 및 332B는 도 4a에 도시한 바와 같이 수축된 상태이다. 카테터(314)가 혈관(324)내에 삽입된 후, 벌룬들 332A 및 332B는 도 4b에 도시된 바와 같이 팽창한다. 벌룬들 332A 및 332B는 혈관(324)을 막아 혈관내에 밀봉된 인클로져(334)를 형성한다. 전달될 물질을 포함하는 용액(340)은 포트(330)를 통해서 인클로져(334)에 전달된다. 용액(340)은 압력이 가해지는 상태하에서 전달되므로, 인클로져(334)는 가압된다. 인큐베이션 기간후, 벌룬들 332A 및 332B는 다시 수축되고 표적 인클로져(334)는 감압된다.
도 4c는 본 발명의 다른 전달 시스템을 도시한 것으로, 이 시스템에서 카테터에 안착된 벌룬은 전달될 물질을 포함하는 용액을 혈관의 벽에 전달하는 축소된 세관(miniature tubules)들을 갖는다. 벌룬(432)은 벌룬(432)내의 카테터(314)의 세그멘트내의 구멍들(452)에 직접 연결된 세관(450)들을 갖는다. 가압 용액(440)이 카테터(314)를 통해 전달될 때, 용액(440)은 구멍(452)을 빠져나가 세관(450)을 통해 이동하여 혈관(324)의 벽에 다다른다.
도 5a는 심장과 같은 기관(124)의 혈관(도관 및/또는 동맥 및 정맥)에 대한 시스템 11의 이용을 도시한 도면이다. 보호 쉬스(120)는 기관 124 둘레에 감긴다. 기관(124)은 혈액을 그 안으로 운반하는 동맥(112)과 혈액을 밖으로 배출시키는 정맥(114)를 갖는다. 튜브(14)는 동맥(112)의 루멘내에 삽입되고 쉬스(120)는 동맥(112) 및 정맥(114) 둘레에 감긴다. 기관(124)의 외부로 유체가 누설되는 것을 방지하기 위해, 타이 랩 126A은 동맥(112)에서 쉬스(120) 둘레에 고정되고 타이 랩 126B는 정맥(114)에서 쉬스(120) 둘레에 고정된다. 타이 랩 126A는 튜브(14)가 동맥(112)로 들어가게 하면서도 동맥(112)이 세지 않도록 충분히 타이트하게 감는다. 전달될 물질을 포함하는 용액(40)은 주사되고 기관(124)은 인큐베이션된다. 인큐베이션 기간후, 타이 랩 126A 및 126B는 제거되고 혈액을 다시 한번 기관(124)를 통해 흐르도록 허용된다.
도 5b는 기관(예컨대, 위장관 기관)의 입구 및 출구를 밀봉하는 벌룬-카테터의 이용을 도시한 것이다. 벌룬(552)을 갖는 하나의 카테터(550)는 우선 기관과 도통하는 기관 도관(512)내에 삽입되고, 벌룬(562)을 갖는 다른 하나의 카테터(560)는 기관(524)으로부터 나가는 제 2의 기관 도관(514)내에 삽입된다. 초기에 벌룬 552와 562는 수축된 상태이다(도시하지는 않았음). 일단 카테터 550, 560이 그들 각각의 혈관내에 삽입되면, 벌룬 552, 562는 팽창되어 각각 도관 512, 514의 폐쇄물이 된다. 전달될 물질을 포함하는 용액(540)은 전달압력하에서 기관(524)에 전달된다.
도 6은 세포로의 물질의 전달을 촉진하기 위한 가압 쳄버의 이용을 도시한 것이다. 접시(610)와 같은 홀딩 수단은 표적세포를 포함하는 조직(624)을 포함한다. 물질을 포함하는 용액(640)은 접시(610)에 놓인다. 접시(610)는 가압 쳄버(650)안에 놓인다. 쳄버(650)가 닫히고 밀봉된 후 가압 기체(예컨대, CO2)가 덕트(660)를 통해 쳄버(650)내에 도입된다. 용액(640) 및 조직(624)은 인큐베이션 기간동안 인큐베이션 압력하에서 유지된다. 조직(624)은 전체 기관일 수도 있다.
도 6에 도시된 하나와 같은 가압 쳄버는 전체 유기체가 가압되는 전달방법에서 특히 유용하다. 이러한 방법에서, 전달될 물질을 포함하는 용액은 바람직하게 환자의 혈관 및/또는 기관(예컨대, 신장)내로 관류된다. 환자는 가압 쳄버 안에 위치된다. 이어서 가압 쳄버는 인큐베이션 압력하에서 인큐베이션 기간 동안 유지된다.
가압하에서 세포막을 통한 분자의 투과를 향상시키는 몇가지 가능한 메카니즘들이 있다. 막 투과의 증가는 세포 및/또는 세포외 환경내의 높은 압력을 필요로 하지만, 반드시 세포막을 통한 압력 경사를 필요로 하는 것은 아니다. 막간 채널(transmembrane channel)을 형성하는 단백질들이 고압에서 구조를 변화시켜 분자들이 채널을 통과하여 세포질내로 들어가게 할 수 있다.
정확한 압력, 인큐베이션 기간 및 이용 농도는 표적 세포의 유형에 의존한다. 예를 들어, 후술하는 바와 같이, 사람 복재 정맥(sephenous vein)에서는 낮은 압력(약 0.5 기압)에서 약 5분의 인큐베이션 기간이 근사-최대 트랜스펙션 효율을 달성하는데 충분한 반면에, 쥐 대동맥에서는 고압(약 2 기압)에서 1시간 이상의 인큐베이션 기간이 80-90%의 트랜스펙션 효율을 달성하는데 요구된다. 쥐 심장의 경우에, 2기압에서의 30 내지 45분의 인큐베이션 기간이 50% 이상의 트랜스펙션을 달성하는데 요구된다. 일반적으로, 서로 다른 조직 유형에서 일정한 트랜스펙션 효율을 달성하는데 필요한 인큐베이션 기간은 기압 단위의 인큐베이션 압력에서 수분에서 수시간 까지 달라진다. 주어진 세포 유형에서 적당한 인큐베이션 기간 및 압력은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
외과적 수술에 의해 부과되는 제한이 없다면, 일반적으로 가압 인클로져의 벽들은 살아있는 조직을 포함하지 않는 것이 바람직한데, 이것은 인클로져의 조직 형성 부분들은 기계적인 스트레스를 받기 때문이다. 수술과정중에 순환계에 연결된 혈관의 치료와 같은 일부 외과수술(도 3a 및 도 3b)에서는 인클로져 벽의 적어도 일부분이 조직인 것이 필요하다. 이 경우에, 조직의 확장을 방지하기 위해 보호수단을 이용하는 것이 중요하다. 생체외에서 처리된 이식편들은 일반적으로, 가압 쳄버 또는 동등 압력 인클로져내에서의 인큐베이션에 의해 처리되는 것이 바람직하다.
이하에서 본 발명의 방법을 핵산 분자의 세포내 전달을 보여주는 실험을 들어 더욱 상세히 설명한다. 본 발명의 방법의 트랜스펙션 효율을 다양한 인큐베이션 압력, 인큐베이션 기간 및 세포 유형에 대해서 측정하였다. 이하의 설명에서 다음과 같은 약어를 사용하였다: CTRL, 대조군; ELISA, 효소결합 면역흡착 분석법; FITC, 플루오레세인 이소티오시아네이트; FITC-ODN, FITC-표지된 올리고데옥시리보뉴클레오타이드; IL-6, 인터루킨-6; ODN, 올리고데옥시뉴클레오타이드; PCR, 폴리메라제 연쇄반응법; VSMC, 혈관 평활근 세포. 문자 "n"은 각각의 데이터 포인트에서 평가된 개체의 수를 의미한다. 주어진 압력은 주위(대기) 압력 이상의 샘플에 가해진 순압력이다.
실시예 1
도 1c에 도시된 것과 유사한 방법에 따라 사람 복재 정맥을 FITC-ODN으로 트랙스펙션시켰다. 도 7a는 몇몇 ODN 농도에서의, 트랜스펙션 효율을 가해진 압력의 함수로 도시한 것이다. 효율은 형광현미경에 의해 FITC-ODN의 핵 국부화를 갖는 것으로 발견된 총 혈관내막 및 중앙 세포의 백분율로 측정하였다. 압력은 50 내지 760 mmHg 범위이었고 생리적 식염수내의 ODN의 농도는 5 내지 100μM 범위이었다. n=6.
20μM의 ODN 농도 및 50 내지 760mmHg의 압력에서 트랜스펙션 효율에 대한 확장-방지 쉬스의 영향을 도 1c에 도시된 것과 유사한 방법을 이용하여 평가하였다. 도 7b는 이 실험의 결과를 도시한 것이다. n=6.
본 발명의 방법의 트랜스펙션 효율은 전체 기관 컬처(whole organ culture)에서 안티센스 ODN에 의한 IL-6 생산의 억제를 측정함으로써 생체외에서 조사하였다. 정맥 분절을 트랜스펙션후 24시간 동안 배양배지에서 인큐베이션하였다. 트랜스펙션은 도 1c에 도시된 것과 유사한 방법을 이용하여 5mM, 10 mM, 및 100mM에서 10분간 행하였다. 도 7c는 안티센스-트랜스펙션된 컬처의 배양배지내에서 ELISA에 의해 검출된 IL-6 단백질의 감소를 도시한 것이다. 도시된 감소는 트랜스펙션되지 않은 비-특이적 ODN-트랜스펙션된 정맥의 대조군 컬처에서 측정된 레벨에 대한 상대적인 값이다. n=6.
실시예 2
정량 역전사 PCR을 이용하여 본 발명에 따라 수행된 안티센스-ODN 트랜스펙션으로부터 결과된 IL-6 mRNA의 감소를 측정하였다. 사람 복재 정맥 표본 3개를 도 1c에 도시된 바와 같이 트랜스펙션시키고 안티센스-트랜스펙션된 정맥 분절내의 mRNA 농도를 비처리된 역방향 안티센스(대조군) ODN-트랜스펙션된 분절들에서의 농도와 비교하였다. 3 표본에 대한 결과를 각각 도 8a, 8b 및 8c에 도시하였다. mRNA 농도의 감소는 안티센스-ODN 처리의 서열-특이적 효능을 시사한다.
실시예 3
토끼 경동맥을 생체내에서 도 2에 도시된 것과 유사한 방법에 따라 FITC-ODN으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 효율을 트랜스펙션후 4시간, 제 4일, 및 제 7일에 측정하였다. FITC-양성 핵의 퍼센트를 시간의 함수로 도 9a에 도시하였다. n=2-3. 개똥벌레 루시페라제에 대한 유전자의 발현을 토끼 경동맥을 루시페라제 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA 구조물로 생체내 트랜스펙션시키고나서 측정하였다. 건강한 동맥(정상) 및 아테롬성경화성 혈관(CHOL/inj)들을 가압하에서 도 2에 도시된 것과 같이 트랜스펙션시켰다. 대조군(CTRL) 동맥을 압력을 가하지 않은 상태에서 루시페라제 유전자를 갖고 있는 플라스미드에 노출시켰다. 제 5일에 동맥을 회수하여 조직 균질화물을 루시페라제 활성에 대해 분석하였다. 분석 결과는 도 9b에 도시하였다. n=2-4.
실시예 4
쥐 혈관 평활근 세포(VSMC: Vascular Smooth Muscle Cells)를 도 6에 도시된 바와 같이 FITC-ODN에 의해 시험관내에서 트랜스펙션시켰다. 세포들을 대기압(0 순기압) 또는 2기압에 45분간 노출시켰다. 도 10은 1 mM 및 80mM 농도의 FITC-ODN에서의 트랜스펙션 효율을 보여준다. n=4.
실시예 5
도 11은 도 6에 도시된 바와 같이, 개똥벌레 루시페라제 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA에 의해 생체내에서 관류된 쥐 신장세포들의 트랜스펙션 효율에 대한 압력의 영향을 도시한 것이다. 쥐들을 신장 관류후 대기압(0 순기압) 또는 2기압에 30분간 노출시켰다. 트랜스펙션후 3일 후에 신장을 회수하여 조직 균질화물을 루시페라제 활성에 대해 분석하였다. n=7.
실시예 6
도 12a는 쥐 대동맥 세포에서 트랜스펙션 효율에 대한 압력의 영향을 도시한 것이다. 대동맥을 공여 쥐로부터 회수하여 허혈성 손상이 유도되도록 생리적 용액에서 4℃에서 24시간 동안 도 1d에 설명된 방법과 유사한 방법으로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 용액은 40㎛의 FITC-ODN을 포함하였다. 인큐베이션을 0기압 및 2기압하에서 행하였다. 인큐베이션후, 조직을 쥐 대동맥에 이식하고 이식후 24시간이 지나 회수하였다. FITC의 핵 국부화(nuclear localization)를 형광 DNA-삽입 염료로 동시에 염색된 섹션의 형광현미경 관찰에 의해 분석하였다. 트랜스펙션 효율은 총 세포 퍼센트에 대한 FITC-ODN의 핵 국부화를 시현하는 세포의 수로 표현하였다. n=3, p<0.005.
도 12b는 안티센스-PCNA-ODN의 압력-매개 트랜스펙션에 의해 또는 압력을 가하지 않고 이식된 쥐 대동맥에서의 허혈성-유도 PCNA 발현을 도시한 것이다. 트랜스펙션 과정은 도 1d에 도시한 것과 유사하게 하였다. 허혈성 손상은 염수(대조군) 또는 40μM의 ODN을 포함하는 염수내에서 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션함으로써 유도하였다. 대기압 보다 높은 2기압은 대조군 및 ODN-처리 샘플에 인큐베이션중에 가하였다. 등장이식후 6일 후에 조직을 회수하여 조직 균질화물내의 PCNA 단백질의 농도를 ELISA로 측정하였다. n=7, p=0.02.
도 12c는 안티센스-cdc2 키나제 ODN의 압력-매개 트랜스펙션에 의해 또는 압력을 가하지 않고 이식된 쥐 대동맥에서의 허혈성-유도 cdc2 키나제 발현을 도시한 것이다. 트랜스펙션, 이식, 및 회수과정은 도 12b와 관련하여 설명한 것과 유사하게 실시하였다. cdc2 키나제의 단백질 농도는 ELISA에 의해 측정하였다.
도 12d는 등장이식된, PCNA 및 cdc2 키나제 양자에 대한 안티센스 ODN에 의한 압력-매개 트랜스펙션에 의해 허혈성-손상 쥐 대동맥의 루멘이 좁아지는 현상이 감소되는 것을 보여준다. 허혈성 손상은 염수(대조군) 또는 안티센스-PCNA/안티센스 cdc2 키나제 ODN 용액(각각 40μM)내에서 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션함으로써 유도하였다. 대기압 보다 높은 2기압을 대조군을 포함하는 모든 조직에 대해 적용하였다. 두 가지 세포 사이클 조절유전자들의 발현의 봉쇄는 컴퓨터에 의한 영상 분석에 의해 측정할 때, 허혈성 손상 동종이식편에서 신생내막 비후 현상 및 루멘이 좁아지는 현상을 감소시켰다. n=12, p=0.03.
실시예 7
도 13a는 압력에 의해 또는 압력을 가하지 않고 FITC-ODN 생체외(ex vivo) 트랙스펙션된 쥐 심장에서의 트랜스펙션 효율을 도시한 것이다. FITC-ODN 용액(80 μM)을 대동맥 교차클램핑후 공여 심장의 관상동맥내로 관류시켰다. 심장을 FITC-ODN 용액에 담가서 도 6에 도시된 바와 같이, 4℃에서 45분간 0기압 또는 주위 압력보다 높은 2기압에서 노출시켰다. 이어서 상기 심장을 이식 받는 쥐의 복부 대동맥 및 대정맥내에 심장을 변위이식하였다. FITC의 핵 국부화를 형광-DNA-삽입 염료에 의해 동시에 염색된 섹션들의 형광현미경 관찰에 의해 이식후 24시간 후에 평가하였다. 트랙스펙션 효율은 총 세포에 대한 FITC-ODN의 핵 국부화를 시현하는 세포들의 퍼센트로 표현하였다. n=3, p<0.005.
도 13b는 안티센스-ICAM-1 ODN의 압력에 의한 및 압력에 의하지 않은 트랜스펙션에 의해 이식된 쥐 심장에서의 ICAM-1의 발현을 도시한 것이다. 염수(대조군) 또는 안티센스-ICAM-1-ODN 용액(80μM)중 하나를 대동맥 크로스클램핑후 공여 PVG 균주 심장의 관상동맥내로 관류시켰다. 이어서 심장들을 FITC-ODN 용액에 담가서 도 6에 도시된 바와 같이, 4℃에서 45분간 주위 압력보다 높은 2기압에서 노출시켰다. ACI 수체(recipient)에 변위이식한 후 3일 경과후에 조직을 회수하였다. ICAM-1 양성 지역을 ICAM-1에 대해 면역조직화학적으로 염색한 섹션들을 영상 분석하여 측정하였다. n=3-6, p=0.04.
도 13c는 ICAM-1에 대한 안티센스 ODN에 의해 이식된 쥐 심장의 압력-매개 트랜스펙션에 의한 장기 이식편 수용(long-term graft acceptance)의 유도를 설명한 도면이다. PVG 계통 쥐 심장들을 회수하여 도 13b에 도시된 바와 같이, 안티센스-ICAM-1 ODN 용액(80μM) 또는 염수(대조군)중 하나에 의해 생체외 트랙스펙션시켰다. 이어서 심장들을 ACI 계통 수체에 변위이식하였다. 모든 동물들에게 이식후 6일간 항-LFA-1 항체를 전신 투여하여 ICAM-1에 대한 리간드를 블록하였다. 더 이상의 면역억제는 가하지 않았다. 관용(tolerance)을 각자의 이종이식편들을 장기간 수용하는 것으로 확인된 처리 동물들의 퍼센트로 기술하였다. 이식편의 수용은 >100일간 이식편내에서의 심장박동의 존재에 의해 규명하였다. 대조군 n=12, 안티센스-처리 n=27, p=0.003.
실시예 8
도 14a 및 도 14b는 세포 사이클 조절 유전자의 조절을 차단하도록 설계된 ODN의 압력-매개 트랜스펙션 이후에 나타나는 경동맥내에 이식된 토끼 경정맥에서의 신생내막 비후현상의 억제를 도시한 것이다.
도 14a는 비처리(대조군) 이식편, 및 PCNA 및 cdc2 키나제에 대한 역방향 안티센스(대조군) ODN 또는 안티센스 ODN 중 하나에 의해 트랜스펙션된 이식편들의 이식후 6주 및 6개월 후의 벽 두께를 도시한 것이다. 신생내막 형성은 6개월까지 억제되었던 반면에, 내측 비대(medial hypertropy)는 고압 동맥 환경에서 벽 응력(wall stress)을 감소시키는데 적합한 벽 두께를 허용한다. 도 14b는 E2F 디코이 ODN에 의해 트랜스펙션된 정맥에서의 도 14a에서와 유사한 결과를 비처리 이식편 및 스크램블드 ODN에 의해 트랙스펙션된 대조군 이식편들과 비교하여 도시한 것이다. n=6, p<0.005.
상술한 설명이 많은 세부사항을 포함한다고 해도, 이러한 설명들은 본 발명의 구체적인 구현예를 설명하기 위한 것이며 본 발명의 청구범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 시변 인큐베이션 압력(time-varying)을 이용할 수도 있다. 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가들은 본원에 기초하여 인클로징 수단, 보호수단, 및/또는 폐쇄 수단을 다양하게 설계할 수 있을 것이다. 다양한 인큐베이션 압력, 기간, 및 목적으로 하는 효율 또는 근사-최대 트랜스펙션 효율을 초래하는 활성약제의 용량은 상이한 세포 유형에 따라 결정될 수 있다.

Claims (16)

  1. 세포에 의한 원자, 분자, 또는 최대 직경 10㎛ 미만의 입자들의 흡수를 향상시키는 방법으로서, 상기 방법이
    상기 세포들을 상기 원자, 분자 또는 입자들을 포함하는 액상 매질(liquid medium)과 접촉시키는 단계;
    상기 세포 및 상기 액상 매질을 밀폐된 공간(enclosed space)내에서 유지하는 단계;
    상기 밀폐된 세포 및 액상 매질에 상기 세포에 의한 상기 원자, 분자 또는 입자의 흡수를 증가시키는데 충분한 인큐베이션 압력을 가하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 세포가 상기 밀폐된 공간을 제공하기 위해 2 위치에서 밀봉되는 포유동물의 혈관내에 포함되는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 분자가 분자량이 1,000 미만인 치료용 하전 유기분자(therapeutic, charged organic molecule)인 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 분자가 분자량이 1000을 초과하는 단백질 또는 펩타이드인 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 인큐베이션 압력이 50 mmHg와 주위 기압보다 높은 5기압 사이인 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 인큐베이션 압력이 200 mmHg와 주위 기압보다 높은 2.5기압 사이인 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 세포가 포유동물 혈관 또는 기관내에 포함되고, 인큐베이션 압력이 혈관 또는 기관 내외부 사이에 실질적으로 압력 경사가 존재하지 않도록 혈관 또는 기관 내부 및 외부의 압력을 동등하게 하는 방법.
  8. 세포내로 물질을 전달하는 시스템으로서, 상기 시스템이
    상기 세포와 상기 세포의 세포외 환경을 포함하는 밀봉된 인클로져의 경계의 적어도 일부분을 한정하는 인클로징 수단으로, 상기 세포외 환경이 상기 물질을 포함하는 인클로징 수단;
    상기 인클로져 안에 인큐베이션 압력이 형성되도록 하는 가압 수단(pressurization)을 포함하여 상기 인큐베이션 압력의 형성이 상기 세포에 의한 상기 물질의 흡수를 촉진하는 시스템.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 시스템이 상기 물질을 상기 세포외 환경으로 전달하는 전달 수단을 추가로 포함하는 시스템.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 인클로징 수단이 불투과성 쉬스를 포함하는 시스템.
  11. 제 8항에 있어서, 상기 인클로징 수단이 조직내에서의 통과를 차단하는 폐쇄 수단(occlusion)을 포함하는 시스템.
  12. 제 8항에 있어서, 상기 인클로징 수단이 가압 쳄버(pressurization chamber)를 포함하는 시스템.
  13. 제 8항에 있어서, 상기 경계가 상기 인클로징 수단(enclosing means)에 의해 실질적으로 정해지는 시스템.
  14. 제 8항에 있어서, 상기 경계의 일부분이 조직(tissue)에 의해 정해지는 시스템.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 시스템이 상기 조직을 외상으로부터 보호하기 위하여 상기 조직 주위에 배치된 보호 수단을 추가로 포함하는 시스템.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 보호수단이 비탄성 쉬스(inelastic sheath)를 포함하는 시스템.
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