DE69531146T2

DE69531146T2 - Verfahren zur gewinnung von apolaren und polaren extrakten von kurkuma und ihre anwendungen

Info

Publication number: DE69531146T2
Application number: DE69531146T
Authority: DE
Inventors: Eliseo Quintanilla Almagro; Joaquin Diaz Alperi
Original assignee: A C PHARMACEUTICAL INTERNATION; ASAC Pharmaceutical International AIE
Current assignee: A C PHARMACEUTICAL INTERNATION; ASAC Pharmaceutical International AIE
Priority date: 1994-08-03
Filing date: 1995-08-03
Publication date: 2004-06-03
Anticipated expiration: 2015-08-04
Also published as: ES2197203T3; DE69531146D1; EP0726074A1; EP0726074B1; US6440468B1; PT726074E; JP3048642B2; WO1996003999A1; DK0726074T3; JPH09503528A

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf dem technischen Gebiet der Gewinnung von Pflanzenextrakten mit verschiedenen medizinischen Anwendungen anzusiedeln.
Genauer gesagt, die vorliegende Erfindung liefert Methoden zur Gewinnung apolarer oder polarer Kurkumaextrakte, die wichtige Anwendungen als Abfänger von freien Radikalen oder als Wirkstoff zur Verzögerung des Alterungsprozesses haben.
TECHNISCHER STAND VOR DER ERFINDUNG
Das Kurkumin und andere Kurkuminoide wie die aus den Pflanzenextrakten der Kurkuma und, im Allgemeinen, der Familie der Zingiberaceae gewonnenen ätherischen Öle sind für Behandlung und Prophylaxe von verschiedenen Krankheiten anwendbar. Zum Beispiel können wir zitieren: Dokument EP 568.001 (antivirale Wirkstoffe), Dokument EP 440.885 (entzündungshemmende Wirkstoffe), Dokument EP 319.058 (gegen Haarausfall), Dokument EP 256.353 (Behandlung der Syndrome von schlechter Absorption), die Dokumente US 5.108.750 , US 4.906.471 , US 4.842.859 (Thrombozytenaggregationshemmer und Cholesterin senkende Wirkstoffe) Dokument WO88/05304 (gegen Hepatitis B und AIDS), Dokument WO88/08713 (Behandlung von neurologischen Störungen), Dokument US 4.568.546 (entgiftender Wirkstoff). Auch die antioxidierenden und färbenden Eigenschaften des Kurkumin und seiner Derivate sind bekannt, weshalb es in der Ernährung- und Kosmetikindustrie häufig als natürlicher Konservierungsstoff verwendet wird (Dokument US 5.266.344 , KK KOBE SEIKO SHO).
Andererseits weiß man, dass der Überfluss an reaktivem Sauerstoff und freien Radikalen im Gewebe Veränderungen verursacht, die zu einer frühzeitigen Alterung der Zellen führen und verschiedene Krankheiten auslösen kann. Angesichts der zunehmenden Besorgnis über dieses Phänomen überrascht es nicht, dass zahlreiche Dokumente über die Zubereitung von Pflanzenextrakten mit antioxidierender Wirkung und Abfänger von freien Radikalen existieren, die folglich nützlich für die Vorbeugung des Alterungsprozesses der Zellen sind. Dennoch ist im spezifischen Fall der Extrakte der Curcuma longa die Zahl der vorhandenen Dokumente nicht besonders groß und in den meisten Fällen handelt es sich nicht um Patentbibliographien.
Unter den interessantesten bibliographischen Referenzen der Patente, die in den Datenbanken zu finden sind, befindet sich der Antrag FR 2.655.054 (PACIFIC CHEMICAL) in Bezug auf Wirkstoffe zum Schutz von Zellen, die in Kurkuminoiden (Kurkumin, 4-Hydroxicinamoil(Feruloli)methan, Bis(-Hydroxicinamoil)methan, etc.) enthalten sind und aus Curcuma longa, Askorbinsäure und/oder Hyperoxid-Dismutase (SOD) gewonnen werden. Die Kurkuminoide sind für ihre antioxidierende Wirkung bekannt, ebenso wie die Askorbinsäure und das SOD, welche eine synergistische Wirkung haben.
Andererseits kann die entzündungshemmende Wirkung der Kurkuminoide auch durch ihre antioxidierende Eigenschaft bedingt sein. In diesem Sinne beschreibt der Antrag EP 550.807 (STEIGERWALD ARZNEIMITTELWERK) die Curcuma longa – Präparate als nützlich für die Behandlung von Entzündungskrankheiten in Zusammenhang mit einer Überproduktion von Leukotrienen und Prostaglandin (Crohnsche Krankheit, Bronchialasthma, Psoriasis, etc.) Laut diesem Dokument entfaltet das Kurkumin seine entzündungshemmende Wirkung zum einen durch seine Beteiligung an den Reaktionen zur Eliminierung des aktiven Sauerstoffs und der freien Radikalen und zum anderen, indem es die Zyklooxygenase und die Lipoxygenase hemmt. Diese Enzyme sind für die Synthese von Prostaglandin bzw. Leukotrienen verantwortlich. Die positiven Wirkungen der Verabreichung von Kurkumaextrakten werden auch in Srivastana et al, Biomedical Reviews, 1993, Bd. 2, S. 15–29; Srinivas et al, Archives of Biochemistry and Biophysics, Feb. 1992, Bd. 292, 2, S. 617–623 und in Shalini et al., Mol. And Cell. Biochem., 1987, Bd. 77, S. 3–10 behandelt.
Im Zusammenhang mit den Methoden zur Extraktion der polaren und apolaren Teile der Rizhome der Curcuma longa gibt es konventionelle Methoden, die die üblichen Lösungsmittel (Flüssigkeiten unter normalen Bedingungen) benutzen oder, falls nicht, mit CO₂ oder NO₂ – Flüssigkeiten bzw. unter superkritischen Bedingungen arbeiten, was bei der Extraktion von Aromen und ätherischen Ölen aus Pflanzen, "Carbon dioxide extracted ingredients for fragances" ("mit Kohlendioxid für Aromen entzogene Bestandteile"), Flavours & Fragrances O-5M385P, North Albert Road, Reigate, Surrey RH2 9ER, England) ebenfalls üblich ist. In Dokument JP-A-6009479 werden zusätzliche Methoden zur Gewinnung von Extrakten aus Kurkuma beschrieben.
Dennoch handelt sich um ein äußerst interessantes Gebiet, auf dem die Gewinnung reiner Extrakte weiterhin wünschenswert ist, um neue mögliche Anwendungen derselben im medizinisch – pahrmazeutischen Bereich, für Kosmetik, Ernährungslehre etc. zu entdecken.
In diesem Zusammenhang liefert die vorliegende Erfindung apolare und polare Extrakte der Curcuma longa mit wichtigen Eigenschaften wie als Abfänger der freien Radikalen und folglich als Mittel zur Verzögerung des Alterungsprozesses der Zellen. Desgleichen haben diese Extrakte ihre Fähigkeit zur Reduzierung der Plasmakonzentrationen der Lipidperoxide bei Menschen unter Beweis gestellt.
Andererseits ist aus den bibliographischen Daten bekannt, dass die in den Zellen gebildeten sauerstoffhaltigen Radikalen durch das Abwehrsystem der Zelle unter Kontrolle gehalten werden. Die Überproduktion dieser Radikalen kann die Kapazität des Abwehrsystems überfordern und zur Oxidierung der Bestandteile von Zelle, Proteinen, Lipiden und DNS führen. Diese Oxydationsprozesse spielen bei der Entstehung von Krankheiten wie Arteriosklerose oder Gelenkrheumatismus eine wichtige Rolle.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Methoden zur Gewinnung von apolaren oder polaren Kurkuma-Extrakten und auf die Anwendungen dieser Extrakte.
Die Curcuma – Pflanzen, insbesondere die Curcuma longa, sind seit dem Altertum bekannte tropische Pflanzen, die der Familie der Zingiberaceae angehören und aus Asien stammen. Die trockenen Rizhome der Kurkuma werden in Asien noch heute als Gewürz und als Textilfarbe genutzt, ebenso wie in der Naturmedizin zur Behandlung von Magenerkrankungen.
In den letzten Jahren sind in der wissenschaftlichen Literatur neue pharmakologische Anwendungen erschienen: Antibakterielle und entzündungshemmende Wirkung, die Fähigkeit zur Lipidperoxidation sowie antihepatotoxische und antitumorigene Eigenschaften.
Die Kurkumaextrakte sind gelbe Pigmente, so genannte Kurkuminoide, die hauptsächlich aus Kurkumin (Diferulolmethan), Demetoxikurkumin (Hydroxcinamoilferuloilmethan) und Bisdesoxikurkumin (Dihydroxicinamoilmethan) bestehen.
Die Methode der vorliegenden Erfindung zur Gewinnung des apolaren Extrakts der Curcuma longa ist durch die folgenden Operationen gekennzeichnet:

a) Die zuvor zerschnittenen, getrockneten und zu Pulver verarbeiteten Kurkumarhizome werden einem 48 Stunden dauernden Extraktionsprozess unterzogen, wobei ein organisches Lösungsmittel in einem Rhizom : Lösungsmittel – Verhältnis von 1 : 7 (Gewicht/Volumen) benutzt wird. Dieser Prozess vollzieht sich in einem stationären System, um Verluste des Lösungsmittels zu vermeiden, wobei die Temperatur des Extraktionskessels einzustellen ist.
b) Die in Phase (a) gewonnene Extraktionsmischung wird gefiltert und das Lösungsmittel des unter geringem Druck gewonnenen Filterprodukts wird zur Gewinnung eines trockenen Residuums, dem charakteristischen braunen Oleoresin, verdampft.
c) Das in Phase (b) gewonnene Oleoresin wird in erhitztem Äthylazetat (im Verhältnis von 50% Gew./Gew.) aufgelöst und man lässt die Lösung danach ca. 24 Stunden auf Raumtemperatur abkühlen. Dabei setzt sich ein orangefarbener Stoff vom Filterprodukt ab.
d) Man lässt das in der vorherigen Phase gewonnene Filterprodukt zur Gewinnung eines zweiten, noch dunkleren Oleoresins, dessen Kurkuminoidgehalt zwischen 20 und 25% liegt, trocknen.
e) Das so gewonnene Sediment wird zur Gewinnung eines Feststoffs mit Kurkuminoidreinheit von über 90% in Äthylazetat zu 50% (Gew./Gew.) rekristallisiert.

Die Methode der vorliegenden Erfindung zur Gewinnung eines polaren Extrakts der Curcuma longa ist durch die folgenden Operationen gekennzeichnet:

a) Die zuvor zerschnittenen, getrockneten und zu Pulver verarbeiteten Rhizome der Curcuma longa werden bei einer Temperatur zwischen 50 und 70°C einem Extraktionsprozess mit Wasser unterzogen, wobei sie 24 Stunden lang in Mazeration gehalten werden.
b) Die in Phase (a) gewonnene Extraktionsmischung wird gefiltert und das Wasser des unter geringem Druck gewonnenen Filterprodukts wird zur Gewinnung eines Residuums, eines wasserabweisenden Feststoffs, der dem polaren Extrakt der Curcuma longa entspricht, verdampft.

Auch zur Gewinnung des apolaren Extrakts wird die Methode der vorliegenden Erfindung mittels superkritischer Extraktion angewendet, wozu das zuvor zerschnittene, getrocknete und zu Pulver verarbeitete Kurkumarhizom zur Gewinnung des entsprechenden apolaren Extrakts mit einer Kurkuminoidreinheit von 90% mit CO₂ – Äthanol unter einem Druck von zirka 260 Bar extraiert wird. Das so gewonnene apolare Extrakt ist identisch mit dem durch die Extraktion mit Lösungsmitteln gewonnenen, wie die spektralskopischen und chromatographischen Daten derselben zeigen.
Die Gewinnung des zuvor genannten apolaren Extrakts mittels superkritischer Extraktion wird vorzugsweise unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:

– Die zerschnittene Curcuma longa wird bei einer Temperatur von 50°C getrocknet.
– Das Rhizom wird gemahlen, bis man Partikel von zwischen 0,1 bis 1 mm Größe erhält.
– Das Rhizom der Curcuma longa wird bei 250 Bar und 50°C mit Hilfe von mit einer kleinen Menge CO₂ modifiziertem Äthanol als Lösungsmittel extraiert.
– Das im Oleoresin enthaltene Äthanol wird bei 280 Bar und 50°C mit CO₂ extraiert.

Die so gewonnenen apolaren und polaren Kurkumextrakte haben die Fähigkeit, freie Radikale abzufangen, speziell Hydroxylradikale (OH^•) und Superoxidradikale (O₂ ^•), wie weiter unten im vorliegenden Dokument anhand der dazu von den Erfindern durchgeführten Studien nachgewiesen wird. Außerdem, wie weiter unten im vorliegenden Dokument nachgewiesen wird, haben diese Extrakte die Fähigkeit zur Reduzierung der Plasmakonzentrationen der Lipidperoxide im Menschen. Folglich haben sie positive Wirkung bei Pathologien in Zusammenhang mit Zelloxidation wie Arteriosklerose oder Gelenkrheumatismus.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet gemäß der Patentansprüche auch den Gebrauch von Zusammensetzungen und Präparaten mit der Fähigkeit, freie Radikale abzufangen, den Alterungsprozess wirksam zu bremsen, genetisch Materiel wirksam zu schützen, und weisen antimutagene Wirkungen und die Fähigkeit auf, die Plasmakonzentrationen von Lipidperoxiden reduzieren.
Die erwähnten Zusammensetzungen oder Präparate enthalten neben den pharmazeutischen Trägerstoffen für die orale Verabreichung als Hauptwirkstoffe die mittels der Methoden der Erfindung gewonnenen polaren und apolaren Extrakte des Rhizoms der Curcuma longa.
Diese oralen Präparate können in fester Form (Pulver, Tabletten, Dragees, Kapseln etc.) oder in flüssiger Form (Säfte oder Zäpfchen) verabreicht werden.
In Übereinstimmung mit dem zuvor Gesagten weisen die Erfinder einen Schutzwirkstoff gegen freie Radikale bzw. einen Abfänger derselben nach, neben dem apolaren Extrakt der Curcuma longa, in dem Kurkuminoide enthalten sind, und dem wässrigen oder polaren Extrakt der Curcuma longa, in dem weder Kurkumin noch Kurkuminoide enthalten sind. Außerdem weisen die von den Erfindern durchgeführten Studien nach, dass der wässrige Extrakt der Curcuma longa selbst ein potenter Abfänger der freien Radikalen ist, besonders des Superoxidradikalen (O₂ ^•).
Ihre Anwendung zur Reduzierung der Plasmakonzentrationen der Lipidperoxide basiert vor allem auf der Fähigkeit der genannten Extrakte zum Abfangen freier Radikaler.
Innerhalb des Studienfeldes des Alterungsprozesses sind verschiedene Variablen festzulegen, die in den Bereich der Physiologie, der Biochemie und der Psychologie gehören. Die Studien bezüglich der vorbeugenden Gerontologie haben zur Schaffung des Profils des biologischen Alters und des Lebensstils geführt, dass so strikt und einfach wie möglich als Werkzeug zur Festlegung der empfindlichsten Parameter in Bezug auf die Lebensgewohnheiten dienen soll, wie: Pharmakologische Behandlung, Tabak- und Alkoholkonsum, körperliche Betätigung, Schlafgewohnheiten, Wahrnehmung der eigenen Gesundheit und Stress.
Neben dem Lebensstil der Bevölkerung im Allgemeinen gibt es biochemische Parameter wie den Gesamtcholesterinwert und die Werte für Triglyzeride, Glukose, Harnsäure und HDL-Cholesterin, die als wichtig für die Festlegung des Grades des Alterungsprozesses angesehen werden.
In diesem Sinne ist aufgrund der enormen Informationsmenge, die er liefert, interessant, in das Profil des biologischen Alters einen biochemischen Parameter einzuschließen, der recht einfach im periphären Blut gemessen werden kann: Die Lipidperoxide, die aus der Oxidierung durch Sauerstoffderivate, den freien Radikalen, den mehrfach gesättigten Fettsäuren, die in den Phospholipiden der Membranen enthalten sind, entstehen.
Dieser Oxidierungsprozess überschreitet normalerweise die homöostatische Kapazität der Zelle und es kann ein Prozess anormaler und unkontrollierter Oxidierung mit massiver Zerstörung der Zellmembrane ausgelöst werden. Es ist bekannt, dass an der Homöostase der Peroxidierung Antioxidanten wie Betacarotine und Tocopherole beteiligt sind. Folglich kann man davon ausgehen, dass die exogene Verabreichung von Antioxidanten nützlich für die Wiederherstellung des zellulären Gleichgewichts sein kann.
Die gegenwärtigen Erfinder haben die antioxidierende Eigenschaft von aus polaren und apolaren Extrakten der Curcuma longa bestehenden pharmazeutischen Zusammensetzungen im Hinblick auf ihre Wirkung auf den Serumspiegel des Malonaldehyds (MDA) beim Menschen und als Indikador ihrer Fähigkeit, die Aktion der freien Radikalen in der Zellmembran zu blockieren, untersucht. Die auf Grundlage dieser Studie gewonnenen Schlussfolgerungen sind die folgenden:

1. Die Curcuma longa ist ein natürlicher Extrakt, der die Plasmakonzentrationen der Lipidperoxide verringert, was einen Schutzmechanismus der Zellmembran impliziert.
2. Sie ist absolut ungiftig: Die Rufnahme von Curcuma longa über 105 Tage hatte keinen Einfluss auf die Blutanalysen an Leber und Niere.
3. Die Wirkung auf die Konzentration der Lipidperoxide ist rasch: Noch 45 Tage später wurde praktisch bei allen Altergruppen und bei beiden Geschlechtern eine Verringerung derselben festgestellt.
4. Die Hemmung der Lipidperoxide und die Blockierung der freien Radikalen, grundlegende Eigenschaften der Curcuma longa, bilden das Fundament, auf das sich die Theorien über den Alterungsprozess stützen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1: Konzentrationswerte der Lipidperoxide der untersuchten Männer.
2: Konzentrationswerte der Lipidperoxide der untersuchten Frauen.
DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird zusätzlich mit den folgenden Beispielen illustriert.
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel illustriert die Gewinnung des apolaren Kurkumaextrakts der vorliegenden Erfindung.
13–14 kg getrocknetes und gemahlenes Kurkumarhizom wurde unter Einsatz von 70 Litern Dichlormethan einer kontinuierlichen Extraktion unterzogen. Die Temperatur des Kessels wurde so lange angepasst, bis man ein stationäres System erhielt.
Nach 48 Stunden war der Extraktionsprozess abgeschlossen.
Der Extrakt wurde gefiltert und das Lösungsmittel bei geringem Druck (0,5 Torr) verdampft, bis es völlig eliminiert war.
Der Oleoresingewinn schwankte bei Anwendung dieser Methode zwischen 12 und 15% des ursprünglichen Gewichts des trockenen Rhizoms.
Das so gewonnene Oleoresin wurde in erhitztem Äthylazetat aufgelöst (50% des Gewichts) und für 24 Stunden bei Raumtemperatur belassen. In dieser Zeit setzte sich allmählich ein orangefarbenes Sediment ab (Kurkuminoide), das durch Filtern getrennt wurde.
Das Filtrat wurde bei geringem Druck getrocknet, bis ein zweites, dunkleres Oleoresin gewonnen wurde, dessen Kurkuminoidgehalt zwischen 20 und 25% schwankte. Das Sediment wurde nach den zuvor beschriebenen Phasen in Äthylazetat (50% des Gewichts) rekristallisiert und so Kurkuminoide von einer Reinheit von über 90% gewonnen.
BEISPIEL 2
Dieses Beispiel illustriert die Gewinnung des polaren Kurkumaextrakts der vorliegenden Erfindung.
30 kg gemahlene Rhizome der Curcuma longa wurden durch Mazeration in 300 Litern Wasser bei 70°C während 24 Stunden extraiert. Die Lösung wurde durch eine Filterplatte gefiltert und das Lösungsmittel bei geringem Druck (0,5 Bar) verdampft und 240 g wasserabweisender Feststoff gewonnen, was einem Ergebnis von 8% entspricht.
BEISPIEL 3
Dieses Beispiel zeigt, wie der Extraktionsprozess durch den Einsatz von Flüssigkeiten in superkritischem Zustand optimiert werden kann, indem die folgenden Parameter untersucht werden:

– Thermische Stabilität der Kurkuminoide
– Studie der Extraktionstemperatur
– Studie des Versorgungsdrucks
– Studie der Partikelgröße
– Studie der Feuchtigkeit der Ausgangsmatrix
– Studie des Fließverhaltens der superkritischen Flüssigkeit
– Studie des Gebrauchs von Äthanol als Co-Lösungsmittel
– Extraktion mittels kombinierter Techniken Die Kosten wurden auf Grundlage der experimentellen Ergebnisse festgestellt. Die beste Methode beinhaltet die folgenden Phasen:
– Trocknen der geschnittenen Curcuma longa bei einer Temperatur von 50°C.
– Mahlen des Rhizoms bis zum Erhalt von Partikeln zwischen 0,1 und 1 mm;
– Extraktion des Rhizoms der Curcuma longa bei 250 Bar und 50°C, unter Einsatz von mit einer geringen Menge von CO₂ modifiziertem Äthanol als Lösungsmittel.
– Extraktion des im Oleoresin vorhandenen Äthanols mit CO₂ bei 280 Bar und 50°C.

Das Neuartige an dieser Technik liegt im Gebrauch von mit CO₂ modifiziertem Äthanol zur Extraktion der Curcuma longa. Zum anderen verringert diese Methode die Kosten zur Extraktion von Kurkumin im Vergleich zu konventionellen Techniken wie der Extraktion mit Lösungsmitteln und/oder der superkritischen Extraktion mit Kohlendioxid.
Diese Extraktionsmethode erhöht die Trennschärfe der Extraktion von Kurkumin im Vergleich zu anderen Kurkuminoiden.
- Stabilität des Kurkumins
Das im polaren Teil vorkommende Kurkumin weist im Laufe der Zeit eine thermische Degradation auf.
Die Ergebnisse weisen auf einen Verlust an Kurkuminoiden gemäß der Erhöhung der Temperatur hin, vor allem, wenn sie 50°C übersteigt.
Zunächst stellt man eine größere Degradation fest, die sich ab 24–48 Stunden der Behandlung stabilisiert. Die Degradation stabilisiert sich auf 2% bei Temperaturen unter 50°C und auf 4% bei 80°C.
- Studie der Extraktionstemperatur Man hat die Extraktionsmenge bei 250 Bar, einem CO₂ _Fluss von 3 kg/h und einer Partikelgröße zwischen 0,1 und 1 mm bei 35°C, 40°C, 50°C und 55°C untersucht. Die besten Resultate wurden bei 55°C erzielt.
- Studie der Druckversorgung
Man hat die Extraktionsmenge bei verschiedenen Temperaturen (30°C, 40°C, 50°C) und bei unterschiedlichen Drücken (100 Bar, 150 Bar, 200 Bar, 250 Bar) mit einem CO₂ _ Fluss von 3 kg/h und einer Partikelgröße zwischen 0,1 und 1 mm untersucht. Von allen untersuchten Temperaturen erhielt man die besten Resultate bei einem Druck von 250 Bar.
- Studie der Partikelgröße
Man hat die Extraktionsmenge bei 50°C, 250 Bar und einem CO₂ _ Fluss von 3 kg/h für verschiedene Partikelgrößen untersucht. Die besten Resultate wurden bei Partikelgrößen zwischen 0,1 und 1 mm erzielt.
- Studie der Feuchtigkeit der Ausgangsmatrix
Man hat die Extraktionsmenge anhand von verschiedenen Kurkumarhizomproben mit unterschiedlichem Feuchtigkeitsgrad (80%, 50%, 8%) untersucht. Der höchste Kurkuminertrag wurde bei der Arbeit mit einem Feuchtigkeitsgehalt der Ausgangsmatrix von 8% erzielt, folglich führt man den Extraktionsprozess zur Gewinnung des apolaren Teils mit dem deshydrierten System durch.
- Studie des Flusses der superkritischen Flüssigkeit
Man hat festgestellt, dass je nach Verringerung des Lösungsmittelflusses das Einsetzen des Diffusionseffektes verzögert wird, was die Löslichkeit und den Ertrag der Extraktion erhöht. Andererseits erhöht ein zu großer oder zu kleiner Durchfluss die Extraktionszeit.
- Extraktion mit Äthanol und superkritischem Kohlendioxid
Man hat die Extraktionsmenge von Kurkuminoiden bei der Extraktion von Kurkuma mit unterschiedlichen Anteilen des Co-Lösungsmittels (Äthanol) im CO₂ untersucht.
Die besten Oleoresin – Resultate wurden bei Gebrauch von 96% Äthanol mit 4% CO₂ erzielt, wobei der Oleoresinanteil 11,42% betrug (mit 43% Kurkuminoiden), was 98% der Gesamtmenge an Oleoresin im Anfangsprodukt und einen Ertrag von 100% der gesamten Kurkuminoide darstellt.
- Extraktion mittels kombinierter Techniken
Bei den superkritischen Extraktionen auf Grundlage der Curcuma longa wurde das Oleoresin mittels Extraktion mit einem Lösungsmittel gewonnen. Man hat festgestellt, dass die Extraktion zunächst sehr schnell vor sich ging, dann aber wegen der Verfestigung des Oleoresins begann, sich mit der Zeit zu verlangsamen. Dieser Festkörper wies kompaktes Aussehen auf und bestand aus sehr feinen Partikeln.
Das Extrakt wies als Hauptbestandteil das bei der Extraktion verwendete Lösungsmittel auf.
Bei diesem Versuch hat man das Vorhandensein einer großen mitauflösenden Wirkung festgestellt, da der gewonnene Extrakt erneut in die Apparatur eingeführt wurde um herauszufinden, ob man ihn weiter trennen konnte und man hat festgestellt, dass er in superkritischem CO₂ nicht gut löslich war.
Man hat Oleoresin mit Äthanol und CO₂ (96 : 4) bei 250 Bar und bei 50°C gewonnen und dieses Oleoresin dann bei 280 Bar, 50°C und unter Benutzung eines CO₂ _ Flusses von 3 kg/h extraiert.
Das gewonnene feste Oleoresin wies ähliche Ergebnisse auf wie das mittels konventioneller Methoden gewonnene, aber die Trennschärfe der Extraktion des Oleoresins erhöhte sich bei der Extraktion mit Äthanol, im Vergleich zu der Extraktion mit organischen Lösungsmitteln. Die Ergebnisse werden im Folgenden im vorliegenden Dokument dargestellt.
- Kostenberechnung
Auf Grundlage der zuvor beschriebenen Studien sind die Kosten berechnet worden, wobei man die verschiedenen möglichen Fälle in Betracht gezogen hat. Berechnet wurden die Kosten pro kg Kurkumin. Die verschiedenen Möglichkeiten sind:

a.- Ausgehend von der Curcuma longa und Extraktion des Oleoresins mit CO₂ in superkritischem Zustand.
1.- Durchfluss von 3 kg/h und augenscheinliche Dichte der Kurkuma von 0,413 kg/l. Möglichkeit 1.1.
2.- Durchfluss von 3 kg/h und augenscheinliche Dichte der Kurkuma von 0,573 kg/l. Möglichkeit 1.2.
3.- Durchfluss von 1 kg/h und augenscheinliche Dichte der Kurkuma von 0,413 kg/l. Möglichkeit 1.3.
b.- Verwendung der Curcuma longa als Rohstoff und Extraktion des Oleoresins mittels eines Serienprozesses unter Verwendung einer Mischung aus Äthanol/Kohlendioxid unter hohem Druck als Lösungsmittel. Möglichkeit 2.
c.- Ausgehend vom mit organischen Lösungsmitteln mittels konventioneller Methoden extraierten Oleoresins und Extraktion der vorhandenen Lösungsmittel mit COz in superkritischem Zustand. Auf diese Art wird ein festes Harz gewonnen, dass eine höhere Kurkuminkonzentration aufweist. Möglichkeit 3.
d.- Ausgehend von einem mit Äthanol/CO₂ unter hohem Druck extraierten Oleoresin und Extraktion des vorhandenen Äthanols mit CO₂ in superkritischem Zustand. Auf diese Art wird ein festes Oleoresin gewonnen, dass sogar noch kurkuminhaltiger als die vorherige Konzentration ist. Möglichkeit 4.
e.- Ausgehend von Curcuma longa und Extraktion des Oleoresin mit CO₂ SCX, modifiziert mit Äthanol.
1.- Anteil an Äthanol im Lösungsmittel: 17%. Möglichkeit 6.1.
2.- Anteil an Äthanol im Lösungsmittel: 34%. Möglichkeit 6.2.

Die Operation
Bei Durchführung der Kostenberechnung wurde eine Effizienz von 90% des Gesamtvolumens der Operation zugrunde gelegt.
Man sieht, dass die günstigste Möglichkeit die Möglichkeit Nummer 4 ist, bei der das Rhizom der Curcuma longa unter Druck mit Äthanol extraiert und dann das Oleoresin mittels Extraktion durch CO₂ veredelt wird.
Die Anlage
Zur Durchführung der Gewinnung des Kurkumins auf Grundlage von Oleoresin sind zwei Extraktor- und zwei Trenngeräte erforderlich, die von außen mit Heizgeräten ausgestattet sind.
Die Anlage muss mit einer Pumpe mit interner Kühlung ausgestattet sein, die einen Druck von 300 Bar liefern kann. Außerdem braucht man eine Kühlvorrichtung zum Ausseigern des CO₂, das aus dem zweiten Trenngerät kommt, um so das CO₂ in den Zyklus zurückführen zu können, was die Kosten der Operation senkt.
Es werden zwei Extraktoren gebraucht, um einen halb kontinuierlichen Extraktionsprozess durchführen zu können, da während der inoperativen Zeiten von Bestückung und Entnahme und der Druckbeaufschlagung der Einheit der Prozess mit dem anderen Extraktor fortgeführt werden kann.
Die Anlage muss mit einem System zur Kontrolle von Druck und Temperatur im Extraktor- und im Trenngerät sowie des Durchflusses und der Temperatur der Kühlvorrichtung ausgestattet sein. Außerdem, muss ein Alarmsystem für Druck und Temperatur in den Extraktorund Trenngeräten und den Außenheizungen sowie in der Kühlvorrichtung vorhanden sein, um jedwedem Unfall vorzubeugen.
BEISPIEL 4
Dieses Beispiel illustriert eine Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, die oral in Form von Tabletten mit den folgenden Bestandteilen verabreicht wird:

Kurkuminoide 15 mg

Wässriger Kurkumaextrakt 175 mg

Avicel pH 102 489 mg

Stärke 45 mg

Magnesiumstereat 8 mg

Primogel 3 mg

EM compress 15 mg
BEISPIEL 5
Dieses Beispiel illustriert eine flüssige Zusammensetzung gemäß vorliegender Erfindung, die oral als Emulsion mit den folgenden Bestandteilen verabreicht wird:

Kurkuminoide 20 mg

Wässriger Kurkumaextrakt 200 mg

zusammen mit variablen Mengen von Süßstoffen (zum Beispiel Saccharose oder Fruchtzucker) und Aromastoffen (zum Beispiel Minz- oder Erdbeeröl) und in ausreichender Menge für 100 ml Emulsion.
Die folgenden Beispiele illustrieren die mit den Extrakten der Erfindung durchgeführten Untersuchungen, bei denen die Fähigkeit derselben zum Abfangen der freien Radikalen sowie die Fähigkeit derselben zur Verringerung der Lipidperoxide festgestellt und definiert werden sollten.
BEISPIEL 6
Studie der Fähigkeit zum Abfangen des Superoxid-Radikal (O₂ ^•) mit Hilfe der Pyrogallol - Methode
Untersucht wurde über 2 Minuten die Autooxidierung des Pyrogallols nach einer Induktionsdauer von 20 Sekunden. In dieser Zeit liegt die Zunahme der Absorption linear bei 420 nm. Die Hemmung der Autooxidierung des Pyrogallols durch die Kurkumaextrakte dient der Definition der Fähigkeit zum Abfangen des Radikalen O₂ ^•.
Das Experiment wurde bei 25°C durchgeführt. Als Pyrogallol wurde Chlorwasserstoff 10 mM verwendet. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Puffers Tris-Cacodylsäure, luftgesättigt und mit einem pH – Wert von 8,2, der 1 nM DTPA-Pyrogallol enthielt, ausgelöst. Zur Eliminierung möglicher Interferenzen durch Ionen wie Eisen, Kupfer oder Mangan wird als Sequestrierungsmittel DTPA (Diethylentriaminpentaessigsäure) verwendet.
Für die apolaren Kurkumaextrakte wurde ein Hemmanteil von 40, 92% ± 0, 002 (p < 0,01) bei einer Konzentration von 16, 129 μg/ml Kurkuminoiden festgestellt, während die Hemmung des DSOD 95% beträgt.
BEISPIEL 7
Studie der Fähigkeit zum Abfangen des Hydroxylradikals (OH^•) mit Hilfe der DMSO - Methode (Dimethyli sulfoxidum)
Fähigkeit zum Abfangen des Hydroxylradikals mit Hilfe der DMSO – Probe.
Untersucht wurde durch Messen des während der Oxidierung des DMSO – durch das System Askorbinsäure/Fe+^s ein potenter Abfänger Hydroxylradikalen – erzeugten Formaldehyds die Fähigkeit zum Abfangen der freien Hydroxylradikalen (OH^•). Die Oxidierung wird durch das Askorbat ausgelöst und durch das Fe⁺³ bei 37°C katalysiert. Die Reaktionsmischung besteht aus EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) (0,1 mM), dem Komplex EDTA-Fe⁺⁺⁺ (/1 : 2) (167 μM) DMSO (33 mM), Problemextrakt und Phophatpuffer 50 mM pH 7,4 in einem Endvolumen von 3 ml.
Die Askorbinsäure (2 mM) wurde hinzugefügt und nach 30 Minuten der Inkubation bei 37°C stoppte die Reaktion mit 1 ml Trichloressigsäure zu 17,5% (Gew./Vol.). Es wurde spektralphotometrisch eine Aliquote von 1,5 ml gemessen.
Die Konkurrenz zwischen dem Problemextrakt und dem DMSO durch den aus dem Ascorbin/Eisensystem geschaffenen Hydroxylradikalen (OH^•) wird zur Berechnung der Hemmaktivität in Bezug auf den Hydroxylradikalen (OH') der Problemsubstanz herangezogen, welche als Prozentsatz der Hemmung der Formaldehydproduktion ausgedrückt wird.
Dabei entstand das folgende Protokoll:

Tc: Zielkontrolle
C: Kontrolle
Tp: Zielproblem
P: Problem

Für das bei der vorstehenden Aktion produzierte Formaldehyd wird mittels Hinzufügen von 2 ml einer reaktiven Mischung aus Ammoniumacetat und Azetylaceton in einen Phophatpuffer 50 mM pH 7,4 eine Aliquote von 1,5 ml gemessen. Die Mischung wurde 5 Minuten lang bei 58°C inkubiert und danach wurden die Proben in ein Eisbad getaucht und man maß 412 nm gebildetes 3,5-Diacetyl-1,4-dihydroluteum.
Man erhielt folgende Ergebnisse: Für den apolaren Extrakt eine Mischung aus Kurkuminoiden 95,13 ± 2,46% (P< 0,01, n = 6), die Konzentration der Probe: 16,129 μg/ml.
BEISPIEL 8
Studie der Fähigkeit zum Abfangen des Superoxid-Radikalen (O₂ ^•) des NADH (Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Hydroeen)- Phenazinmethosulfat (PMS)-O₂-Nitrotetrazolium-Blau (NBT)
Untersucht wird die Fähigkeit zum Abfangen des Superoxid-Radikalen durch Hemmung der Bildung von Diphormaran, einer höchst farbigen Verbindung, deren maximale Absorption bei 560 nm liegt. Die Reaktionsmischung besteht aus dem Phophatpuffer 19 mM pH 7,4, NADH (90 μM), NBT (43 μM), dem Extrakt, mit dem das Experiment durchgeführt wird (Zielträgerstoff) und pH 5 (2,7 μM), mit einem Gesamtvolumen von 3,1 ml. Die Reduzierungsreaktion des NBT wird durch Hinzufügen von PMS ausgelöst und spektralphotometrisch verfolgt. Für die Berechnung der Absorption in (ΔA/min) wird 2 Minuten lang eine Absorption von 560 nm bei 20°C gemessen. Dabei entstand das folgende Protokoll:

Tc: Zielkontrolle
C: Kontrolle
Tp: Zielproblem
P: Problem

Man erhielt einen Hemmanteil des polaren Extrakts von Smilax Lundeli für 5 Proben bei einer Konzentration von 500 μg/ml, d. h. 99,6 ± 0,01 für p < 0,1.
BEISPIEL 9
Studie der Fähigkeit zum Abfangen des Superoxid-Radikalen (O₂ ^•) mit Hilfe der Xanthin-Xanthin-Methode
Man hat die Fähigkeit zum Abfangen des Superoxid-Radikalen des polaren Teiles der Curcuma longa mit Hilfe der Xanthin-Xanthin-Oxidasen-Methode untersucht und eine Hemmung von 77,95$ bei einer Endkonzentration von 1,25 μg/ml in den Kurkuminoiden festgestellt. Man hat nachgewiesen, dass das Extrakt nicht die Enzyme hemmt, was darauf hinweist, dass dieses Extrakt ein potenter Abfänger der Superoxid-Radikalen ist.
BEISPIEL 10
Studie der Wirkungen der Extrakte der Curcuma longa auf die Lipidperoxidkonzentration im menschlichen Blut
Dieses Beispiel illustriert die Wirkung auf die Plasmakonzentrationen von Lipidperoxiden, einer pharmazeutischen Verbindung aus polaren und apolaren Extrakten der Curcuma longa, wenn diese oral in Form von zwei Tabletten pro Tag verabreicht wird. Sie enthalten zwischen 7 und 14 mg Kurkumin pro Tablette und zwischen 150 und 175 mg des wässrigen Extrakts der Curcuma longa und wurden einer Gruppe von gesunden Personen beiderlei Geschlechts über einen Zeitraum von zweieinhalb Monaten verabreicht. ZUSAMMENSETZUNG DER TABLETTEN DES VORLIEGENDEN BEISPIELS

mg/Tablette

Apolarer Extrakt der Curcuma longa 60

Polarer Extrakt der Curcuma longa 175

Avicel pH 102 489

Maisstärke 45

Magnesiumstereat 8

Primogel 3

EM Compress 15
DIE METHODE
Die Studie wurde an 19 Männern und 12 Frauen im Alter zwischen 27 und 74 Jahren durchgeführt, wie die folgende Tabelle 1 zeigt: Tabelle 1: Anzahl der Versuchspersonen nach Alter und Geschlecht gegliedert

Männer

Alter Häufigkeit

25–30 3

31–40 3

41–50 4

51–60 7

60–70 2

Frauen

Alter Häufigkeit

30–40 3

41–50 4

51–75 6
Den Versuchspersonon wurde periphäres Blut zur Erstellung eines vollständigen Blutbildes mit den Bewertungsparametern der Leber- und Nierenfunktionen abgenommen; desgleichen wurde die Konzentration der Lipide und Lipidperoxide in dem Serum festgestellt.
Nachdem man die Ergebnisse kannte, begann die Behandlung, die in der Verabreichung von zwei Tabletten der Curcuma longa pro Tag bestand, mit dem folgenden Protokoll: Zweite Blutabnahme 15 Tage nach der Verabreichung, mit Festlegung der zuvor genannten Parameter. Das Prozessprotokoll wurde fortgesetzt, die Blutanalyse 45 und 75 Tage nach Beginn der Studie wiederholt. Nach Vervollständigung dieses Protokolls gab es eine Pause von 30 Tagen. In diesem Zeitraum wurde keine Tablette verabreicht und danach wurden die zuvor genannten Parameter erneut festgestellt.
ANALYSEMETHODEN
Das Blutbild wurde mit dem Analysegerät Technicon H-1 (USA) erstellt.
Die biochemischen Parameter wurden mit Standard-Reagenzien von Boehringer-Mannheim (Deutschland) und, mit dem Selbstanalysegerät Hitachi 717 (Japan) durchgeführt.
Die Lipidperoxide wurden mit Malonaldehyd (MDA) nach der Methode von Ohkama, Ohishi und Yagi (Analytical Biochem. 95 351–358 (1979)), modifiziert für das Serum, festgestellt.
ERGEBNISSE
Während der Protokollzeit meldeten die Patienten keinerlei der folgenden Symptome: Schluckstörung, Magenbrennen, Übelkeit, Erbrechen, Durchfall oder Verstopfung.
Bei keinem der Versuchsteilnehmer wurden Veränderungen am Blutbild oder bei den biochemischen Parametern festgestellt, unabhängig von Geschlecht und Alter. Man hat festgestellt, dass die Enzyme, welche als Indikatoren der Giftigkeit des Produkts und der direkten und indirekten Gesamtbilirubin die Nierenfunktion anzeigen (GOT, GPT, GGT, Alkaliphosphatase), während des Prozesses nicht beeinflusst wurden, wie die folgende Tabelle 3 zeigt, auf der die Anfangs- und Endwerte von GOT, GPT und Alkaliphosphatase geordnet in Gruppen nach Alter, und Geschlecht angegeben sind. Sie zeigen den Durchschnitt und die Standardabweichung (DE) an. Die Einheiten der Tabelle sind die folgenden:

(a) Beginn = Zeit 0
(b) Ende = 105 Tage nach Beginn
(c) Referenzwerte für die angegebne Methode (RW):

Tabelle 3
Wie 1 zeigt, hat man bei den Männern nach 15 Behandlungstagen eine Verringerung von ca. 8% Lipidperoxide festgestellt, während 45 Tage nach Beginn der Behandlung die Verringerung einen Mittelwert von 34% erreichte, eine Änderung bezüglich der Situation nach 15 Tagen von 59% für alle an der Studie beteiligten Männer. Bei den Frauen hat man nach 15 Tagen eine Erhöhung der Lipidperoxidkonzentration (26%) festgestellt (Abbildung 2); dennoch ist nach 45 Tagen bei fast allen Teilnehmerinnen eine deutliche Abnahme der Peroxidkonzentration (ein Durchschnitt von 11%) festzustellen. Diese Ergebnisse implizieren bei allen an der Studie beteiligten Frauen nach 45 Tagen eine durchschnittliche Verringerung bezüglich der Situation nach 15 Tagen um 80%.

Claims

Verfahren zur Gewinnung eines apolaren Extrakts auf Grundlage des Rhizoms der Curcuma longa, der als Wirkstoff zum Abfangen freier Radikaler im menschlichen Blut dient, einschließlich des Verfahrens, dass das Rhizom der Curcuma longa einem Extraktionsprozess unterzieht, der die folgenden Phasen umfasst: (a) Ein Rhizompulver aus Rhizomen der Curcuma longa wird 48 Stunden lang in einem stationären System einem kontinuierlichen Extraktionsprozess mit einem organischen Lösungsmittel im Verhältnis von Rhizompulver : organisches Lösungsmittel von 1 : 7 (Gewicht/Volumen) unterzogen, bis man als Reaktionsmischung das Extrakt erhält, (b) Die Reaktionsmischung wird zur Gewinnung eines ersten Filtrats gefiltert, das organische Lösungsmittel des ersten Filtrats bei geringem Druck verdampft, bis man erste trockene Rückstände in Form eines ersten Oleoresins von brauner Farbe erhält, (c) Dieses Oleoresin wird in erhitztem Äthylazetat im Verhältnis von 50% Gew./Gew. aufgelöst und man lässt die Lösung während ca. 24 Stunden auf Raumtemperatur abkühlen, bis sich ein orangefarbener Stoff vom Filterprodukt absetzt, (d) Dieser Stoff wird durch Filtern zur Gewinnung eines zweiten Filtrats getrennt und bei geringem Druck getrocknet, bis man ein zweites Residuum erhält, das aus einem zweiten, noch dunkelbrauneren Oleoresin als das erste besteht und einem Kurkuminoidgehalt zwischen 20 und 25%; (e) Der so gewonnene Stoff wird in Äthylazetat zu 50% Gew./Gew, zur Gewinnung eines festen apolaren Extrakts mit einer Kurkuminoidreinheit von über 90% rekristallisiert, wodurch man ein apolares Extrakt auf Grundlage des Rhizoms der Curcuma longa erhält.
Verfahren zur Gewinnung eines polaren Extrakts auf Grundlage des Rhizoms der Curcuma longa, der als Wirkstoff zum Abfangen freier Radikaler im menschlichen Blut dient, einschließlich des Verfahrens, dass das Rhizom der Curcuma longa einem Extraktionsprozess unterzieht, der die folgenden Phasen umfasst: (a) Ein Rhizompulver aus Rhizomen der Curcuma longa wird zur Gewinnung einer Extraktionsmischung 24 Stunden lang bei einer Temperatur zwischen 50 und 70°C einem Extraktionsprozess mit Wasser unterzogen; (b) Diese Extraktionsmischung wird zur Gewinnung eines Filtrats gefiltert und das Wasser des Filterprodukts wird zur Gewinnung des polaren Extrakts in Form eines Residuums, eines wasserabweisenden Feststoffs, der frei von Kurkumin und Kurkuminoiden ist, verdampft.
Verfahren zur Gewinnung eines apolaren Extrakts auf Grundlage des Rhizoms der Curcuma longa, der als Wirkstoff zum Abfangen freier Radikaler im menschlichen Blut dient, einschließlich des Verfahrens, das das Rhizom der Curcuma longa einem Extraktionsprozess unterzieht, der die folgenden Phasen umfasst: (a) Die gemahlenen Rhizome der Curcuma longa, deren Partikelgröße 0,1 bis 1 mm beträgt, werden zur Gewinnung eines Oleoresins bei einem Druck von 100 Bar, 150 Bar, 200 Bar oder 250 Bar und bei einer Temperatur von 35°C, 40°C, 50°C oder 55°C einer superkritischen Extraktion mit einem Lösungsmittel aus mit CO₂ modifiziertem Äthanol unterzogen, und (b) Das Äthanol wird zur Gewinnung eines apolaren Feststoffextrakts, dessen Kurkuminoidanteil 90% beträgt, aus dem Oleoresin mit CO₂ extraiert.
Verfahren gemäß Patentanspruch 3, bei dem die superkritische Extraktion bei 50°C und 250 Bar durchgeführt wird. Das Lösungsmittel ist mit 4% CO₂ modifiziertes Äthanol.
Verfahren gemäß Patentanspruch 3, bei dem das Äthanol bei einem Druck von 280 Bar und einer Temperatur von 50°C aus dem Oleoresin extraiert wird.
Verfahren gemäß Patentanspruch 3, bei dem das Lösungsmittel mit 4% CO₂ modifiziertes Äthanol ist.
Gebrauch mindestens eines aus dem apolarem Extrakt ausgewählten Rhizomextrakts der Curcuma longa, der mittels des Verfahrens jedwedes der Patentansprüche 1 und 3 bis 6 gewonnen werden kann, und des polaren Extrakts, der mittels des Verfahrens des Patentanspruchs 2 gewonnen werden kann, zur Herstellung eines Medikaments zur kombinierten Verabreichung der genannten polaren und apolaren Extrakte zur Vorbeugung oder Behandlung von Störungen im Zusammenhang mit dem Vorkommen freier Radikaler im Blut.
Gebrauch gemäß Patentanspruch 7, bei dem das Medikament ein Wirkstoff gegen den Alterungsprozess der Zellen ist.
Gebrauch eines Extrakts gemäß Patentanspruch 7, bei dem die freien Radikalen, die die Störungen auslösen, Superoxid-Radikale sind.
Gebrauch mindestens eines aus dem apolarem Extrakt ausgewählten Rhizomextrakts der Curcuma longa, der mittels des Verfahrens jedwedes der Patentansprüche 1 und 3 bis 6 gewonnen werden kann, und des polaren Extrakts, der mittels des Verfahrens des Patentanspruchs 2 gewonnen werden kann, zur Herstellung eines Medikaments zur kombinierten Verabreichung der genannten polaren und apolaren Extrakte zur Reduzierung der Plasmakonzentrationen von Lipidperoxiden im Menschen.
Gebrauch mindestens eines aus dem apolarem Extrakt ausgewählten Rhizomextrakts der Curcuma longa, der mittels des Verfahrens jedwedes der Patentansprüche 1 und 3 bis 6 gewonnen werden kann, und des polaren Extrakts, der mittels des Verfahrens des Patentanspruchs 2 gewonnen werden kann, zur Herstellung eines Medikaments zur kombinierten Verabreichung der genannten polaren und apolaren Extrakte zur Vorbeugung oder Behandlung von Pathologien im Zusammenhang mit der Oxidierung der Zellen.
Gebrauch gemäß Patentanspruch 11, bei dem die Pathologien Arteriosklerose oder Gelenkrheumatismus sind.