DE10128266B4

DE10128266B4 - Verfahren zur Herstellung eines Extrakts aus Zingiber officinale

Info

Publication number: DE10128266B4
Application number: DE10128266A
Authority: DE
Inventors: Tian-Shung Wu; Sheng-Chu Kuo; Che-Ming Teng; Feng-Nien Hsi Chi Cheng Ko
Original assignee: Medical and Pharmaceutical Industry Technology and Development Center
Current assignee: Medical and Pharmaceutical Industry Technology and Development Center
Priority date: 2000-07-12
Filing date: 2001-06-12
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2021-06-13
Also published as: GB2366565B; JP4052819B2; TWI290469B; GB0114693D0; GB2366565A; JP2002047195A; CH692272A5; DE10128266A1; FR2811573B1; FR2811573A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines Extrakts aus den Rhizomen (Wurzelstöcken) von Zingiber officinale, das die folgenden Stufen umfasst:
a) Herstellung einer rohen Flüssigkeit aus den Rhizomen von Zingiber officinale;
b) Einführung der rohen Flüssigkeit in eine Umkehrphasen-Chromatographie-Kolonne und Eluieren der Kolonne nacheinander mit Wasser, einem ersten Eluierungsmittel und einem zweiten Eluierungsmittel, wobei das genannte zweite Eluierungsmittel eine Polarität aufweist, die schwächer ist als diejenige des ersten Eluierungsmittels, jedoch stärker ist als diejenige von Chloroform, so daß ein erstes Eluat beim Eluieren mit dem ersten Eluierungsmittel und ein zweites Eluat beim Eluieren mit dem zweiten Eluierungsmittel erhalten werden;
c) Entfernung des ersten Eluierungsmittels aus dem ersten Eluat durch Verdampfen, so daß ein erstes konzentriertes Eluat erhalten wird; und
d) Entfernen des zweiten Eluierungsmittels aus dem zweiten Eluat durch Verdampfen, so daß ein zweites konzentriertes Eluat erhalten wird;
wobei die Stufe (a) die Stufen (i) bis (iv) oder...

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Extrakts aus Zingiber officinale.
Hintergrund der Erfindung
Chinesische Roharzneimittel oder -gewürze, z.B. Zingiber officinale, Eugenia caryophyllata, Allium sativum, werden in der Medizin und zum Würzen von Nahrungsmitteln verwendet. Roher Ingwer wird als Antiemetikum und Expektorans, als Antitussivum und Verdauungsbeschleuniger verwendet. Halbgetrockneter alter roher Ingwer wird auch gegen Magenschmerzen, Brustschmerzen, Rückenschmerzen im unteren Bereich, Husten, gewöhnliche Erkältung und als Heilmittel für eine Form eines Ödems, die als "Wasserstau" bezeichnet wird, verwendet. Zingeron ist die Hauptkomponente, die für die Würzungs-Eigenschaften von Ingwer verantwortlich ist; Gingerol und Shogaol sind weitere scharte Komponenten im Ingwer. Gingerol weist eine cardiotonische Wirkung auf, unterdrückt die Kontraktion von isolierten Portalvenen bei Mäusen und moduliert die durch Eicosanoid induzierte Kontraktion der Blutgefäße bei Mäusen und Ratten. Shogaol weist eine den Blutdruck erhöhende Wirkung auf. Sowohl Gingerol als auch Shogaol sind mutagen, während Zinger und Zingeron, wie gefunden wurde, eine antimutagene Aktivität aufweisen. Shogaol weist eine Inhibitor-Aktivität gegenüber dem durch Carrageenin induzierten Pfotenödem und gegenüber Blutplättchenaggregation auf [US-Patent Nr. 5 804 603, "Hintergrund der Erfindung"].

Bisher haben viele Veröffentlichungen gezeigt, dass Zingiber officinale verschiedene physiologische Aktivitäten aufweist. Zu typischen Beispielen gehören ein die Krebsmetastase unterdrückendes Agens, beschrieben in der japanischen Patentpublikation Nr. 7-258104; ein Synthese-Promotor für den neurotropen Faktor, der wirksam ist bei Nervenschädigungs-Erkrankungen wie der Alzheimer-Dementia oder der Parkinsonschen Krankheit, wie in der japanischen Patentpublikation Nr. 7-25777 beschrieben; ein Antirheumamittel, wie es in der japanischen Patentpublikation Nr. 6-293 653 und in den US-Patenten Nr. 5 494 668 und 5 683 698 beschrieben ist; eine Antimikroben-Zusammensetzung, wie sie in der japanischen Patentpublikation Nr. 6-227 931 beschrieben ist; und eine analgetische Zusammensetzung, wie sie in der japanischen Patentpublikation Nr. 6-107 556 beschrieben ist. Ingwer enthält 1 bis 4 ätherisches Öl (Ölharz).

Während der letzten 45 Jahre wurden viele chemische Untersuchungen bezüglich der Bestandteile des ätherischen Öls durchgeführt. Insgesamt wurden mehr als 200 unterschiedliche flüchtige Materialien in dem ätherischen Öl identifiziert, dessen pharmakologische Aktivität begrenzt ist. Das ätherische Öl enthält ein Gemisch von verschiedenen Terpenen sowie einige andere Nicht-Terpenoid-Verbindungen. Obgleich dies höchst spekulativ ist, lassen die experimentellen Daten und Beobachtungen vermuten, dass Ingwer sowohl die Cyclooxygenase- als auch die Lipoxygenase-Produkte hemmt, d.h. ein dualer Inhibitor der Eicosanoid-Synthese sein kann. Insgesamt 56 Patienten (28 mit Rheumatoider Arthritis, 18 mit Osteoarthritis und 10 mit Muskelbeschwerden) verwendeten gepulverten Ingwer gegen ihre Beschwerden. Unter den Arthritis-Patienten wurden bei mehr als drei vierteln in unterschiedlichem Grade die Schmerzen und die Schwellung gelindert. Bei allen Patienten mit Muskelbeschwerden trat eine Linderung der Schmerzen ein. Keiner der Patienten berichtete über nachteilige Wirkungen während der Dauer der Ingwer-Einnahme, die in dem Bereich von 3 Monaten bis 2,5 Jahren lag (Srivastava und Mustafa, "Medical Hypotheses" 1992; 39, 342–348).

Die nicht-steroidalen antiinflammatorischen (entzündungshemmenden) Arzneimittel weisen drei Hauptwirkungen auf, die alle in Beziehung stehen zur Cyclooxygenase-Hemmung, die zu einer verminderten Bildung von Prostanoiden führt. Erstens wird eine antiinflammatorische Wirkung erzielt durch die verminderte Bildung von Vasodilator-Prostaglandinen (PGE₂, PGI₂), die zu einer geringeren Gefäßerweiterung und indirekt zu einem geringeren Ödem führt. Zweitens wird ein analgetischer Effekt erzielt durch eine verminderte Prostaglandin-Bildung (eine geringere Sensibilisierung der nozizeptiven Nervenenden gegenüber den inflammatorischen Mediatoren Bradykinin und 5-Hydroxytryptamin). Drittens ist ein antipyretischer Effekt wahrscheinlich zurückzuführen auf eine Abnahme des Mediators PGE₂, der als Antwort auf inflammatorische Pyrogene gebildet wird, so wie Interleukin-1. Da Ingwer die Prostanoid-Synthese hemmt und auch 5-Lipoxygenase bildet, könnten seine Besserungseffekte bei Arthritis und Muskelbeschwerden in Beziehung stehen zu einer verminderten Bildung von Prostanoiden und Leukotrienen. Wegen dieser Möglichkeit wurde eine Abnahme der durch Carrageenan-induzierten Ödem-Bildung an der Rattenpfote nach Verabreichung von 3 g Ingwerextrakt nachgewiesen und die Wirksamkeit des Extrakt in einem akuten Inflammationstest scheint vergleichbar zu sein mit derjenigen, die Acetylsalicylsäure in der gleichen Studie aufwies (N. Mascolo et al., "Journal of Ethnopharmocology" 1989, 27, 129–140).

Dermatophyten, insbesondere Trichophyton rubrum und Trichophyton mentagrophytes, sind die üblichen Pathogene der Onychomycose und Tinea pedis [DT. Roberts, "British Journal of Dermatology", 141. Ergänzung 56:1–4, Nov. 1999; YB. Roldan et al., "Mycoses", 43(5):181–183, 2000]. Pityrosporum ovale (Malassezia furfur) ist das ethiologische Agens von Pityriasis vesicolor, Pityrosporum folliculitis und Malassezia intertrigo. Mehrere Untersuchungen weisen auf einen starken Zusammenhang von Pityrosporum ovale mit seborrhoischer Dermatitis und Schuppenbildung, einer milderen Form der seborrhoischen Dermatitis hin [P. Nenoff et al., "Dermatology", 191(4): 311–314, 1995; A.C. Bulmer et al., "Mycopathologia", 147(2): 63–65, 1999].

Weitere Untersuchungen von getrocknetem Ingwer zur Blutblättchenaggregation werden in A. B. Lumb, „Thrombosis and Haemostasis", 71(1): 110–111, 1994 und A. Bordia et al., „Prostaglandins Leukotrienes and Essential Fatty Acids", 56(5): 379–384, 1997 beschrieben.

Einzelne Verbindungen, wie Gingerole, Paradole und Shoagole wurden hinsichtlich ihrer Wirksamkeit gegenüber Mikroorganismen, wie Eschericia coli, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica etc. sowie Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes, Aspergillus niger, Botryodiplodia theobromae und Cladosporium cladosporioides untersucht. Die Ergebnisse sind in J. K. Oloke et al., „Fitoterapia", 0(5): 384–388, 1988 beschrieben.

WO 99/35116 A1 beschreibt einen Extrakt oder ein Konzentrat aus Curcuma amada zur Herstellung eines Medikamentes zur Immunmodulation, wobei der Extrakt oder das Konzentrat durch Destillation und/oder Extraktion von frischen oder getrockneten Curcuma amada gewonnen wird.

Die fungizide Aktivität von Extrakten aus Curcuma amada wurde von S. B. Ghosh in „Indian Journal of Experimental Biology", 18(2): 174–176, 1980 untersucht.

Zubereitungen und Arzneiformen auf pflanzlicher Basis zur Bekämpfung von Heliobacter pylori-Infektionen sind in DE 197 16 660 A1 beschrieben. Die Zubereitungen können unter anderem Shogaole und Gingerole enthalten.

DE 198 59 499 A1 beschreibt stabile Ingwerextraktzubereitungen, welche neben einem Ingwerextrakt mindestens einen stabilisierenden galenischen Hilfsstoff ausgewählt aus Ölen, halbfesten Triglyceriden, Fettsäuren und Fettalkoholen enthält.

EP 0 347 493 A1 betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines die wasserdampfflüchtigen und andere lipophile Inhaltsstoffe enthaltenden Teilextraktes aus Heil- und/oder Gewürzpflanzen, wie Zingiberis officinale Roscoe.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Extrakte aus Ingwer-Rhizomen (-Wurzelstöcken), die eine Aktivität in einem in vitro-Antiblutplättchen-Aggregationstest, eine inhibierende Wirkung auf das durch Carrageenin induzierte Pfotenödem und eine Antifungi-Aktivität gegenüber Trichophyton mentagrophytes und Pityrosporum ovale aufweisen. Die Extrakte werden hergestellt durch Extrahieren von Ingwer-Rhizomen bzw. -Wurzelstöcken mit einem organischen Lösungsmittel (z.B. Ethylether, Aceton, Methanol und Ethanol) oder überkritischem CO₂ oder durch Wasserdampf-Destillation von Ingwer-Rhizomen, wobei man eine rohe Flüssigkeit erhält, und Durchführung einer Umkehrphasen-Chromatographie mit der genannten rohen Flüssigkeit, wobei man die Extrakte erhält, die Shogaole, Gingerole und/oder Dehydrogingerdion enthalten.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Wie in dem "Hintergrund der Erfindung" angegeben, wird Ingwer gegen Entzündung und zur Schmerzlinderung verwendet.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein wirksames Verfahren zur Herstellung eines Extrakts mit einer starken Antiinflammations-, Antiblutplättchen-Aggregations- und Antifungi-Aktivität aus Ingwer-Rhizomen (-Wurzelstöcken). Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte stark wirksame Ex trakt hat eine im wesentlichen konstante Zusammensetzung, so daß seine pharmakologischen Effekte festgelegt sind.

Das wirksame Verfahren zur Herstellung eines Extrakts mit einer hohen Antiinflammations-, Antiblutplättchen-Aggregations- und Antifungi-Aktivität aus Ingwer-Rhizomen (-Wurzelstöcken) gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Stufen:

a) Herstellung einer rohen Flüssigkeit aus Ingwer-Rhizomen;
b) Einführung der rohen Flüssigkeit in eine Umkehrphasen-Chromatographie-Kolonne und Eluieren der Kolonne nacheinander mit Wasser, einem ersten Eluierungsmittel und einem zweiten Eluierungsmittel, wobei das genannte zweite Eluierungsmittel eine Polarität aufweist, die schwächer ist als diejenige des ersten Eluierungsmittels, jedoch stärker ist als diejenige von Chloroform, so daß ein erstes Eluat beim Eluieren mit dem ersten Eluierungsmittel und ein zweites Eluat beim Eluieren mit dem zweiten Eluierungsmittel erhalten werden;
c) Entfernung des ersten Eluierungsmittels aus dem ersten Eluat durch Verdampfen, so daß ein erstes konzentriertes Eluat erhalten wird, das als stark wirksames (potentes) Produkt verwendet werden kann; und
d) Entfernen des zweiten Eluierungsmittels aus dem zweiten Eluat durch Verdampfen, so daß ein zweites konzentriertes Eluat erhalten wird, das als stark wirksames (potentes) Produkt verwendet werden kann;

wobei die Stufe (a) die Stufen (i) bis (iv) oder die Stufe (I), die Stufe (I') oder die Stufe (I'') umfasst, wobei die genannten Stufen (i) bis (iv) die folgenden sind:

(i) das Zerkleinern von frischen Ingwer-Rhizomen und das Filtrieren der resultierenden Mischung unter Bildung eines Filtrats und eines Rückstandes;
(ii) das Extrahieren des Filtrats mit einem ersten organischen Lösungsmittel, die Abtrennung der resultierenden Extraktionslösung des ersten organischen Lösungsmittels und das Verdampfen des ersten organischen Lösungsmittels aus der Extraktions-Lösung unter Bildung einer ersten konzentrierten Extraktions-Lösung;
(iii) das Extrahieren des Rückstandes mit einem zweiten organischen Lösungsmittel, das Abtrennen der resultierenden Extraktionslösung des zweiten organischen Lösungsmittels und das Verdampfen des zweiten organischen Lösungsmittels aus der Extraktionslösung unter Bildung einer zweiten konzentrierten Extraktionslösung; und
(iv) das Kombinieren der ersten konzentrierten Extraktionslösung mit der zweiten konzentrierten Extraktionslösung unter Bildung der rohen Flüssigkeit;

wobei es sich bei der genannten Stufe (I) handelt um:

(I) das Extrahieren eines Pulvers aus getrockneten Ingwer-Rhizomen mit dem zweiten organischen Lösungsmittel, das Abtrennen der resultierenden Extraktionslösung des zweiten organischen Lösungsmittels und das Verdampfen des zweiten organischen Lösungsmittels aus der Extraktionslösung unter Bildung der rohen Flüssigkeit;

wobei es sich bei der genannten Stufe (I') handelt um:

(i') das Wasserdampf-Destillieren eines Pulvers aus getrockneten Ingwer-Rhizomen und das Einengen des resultierenden Destillats durch Verdampfen unter Bildung der rohen Flüssigkeit; und

wobei es sich bei der genannten Stufe (I'') handelt um:

(I'') das Extrahieren eines Pulvers aus getrockneten Ingwer-Rhizomen mit überkritischem CO₂, das Abtrennen der resultierenden Extraktionslösung des überkritischen CO₂ und das Verdampfen des CO₂ aus der Extraktionslösung,

wobei man die rohe Flüssigkeit ehält.

Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Extrakt mit einer hohen Antiinflammations-, Antiblutplättchenaggregations- und Antifungi-Aktivität umfasst vorzugsweise 0 bis 10 mg 6-Shogaol pro g Extrakt, 1 bis 150 mg 6-Gingerol pro g Extrakt und 0 bis 40 mg 6-Dehydrogingerdion pro g Extrakt.

Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Extrakt wird bevorzugt in einer pharmazeutische Zusammensetzung, die eine starke Antiinflammations-, Antiblutplättchenaggregations- oder Antifungi-Aktivität aufweist, ver wendet, die eine therapeutisch wirksame Menge der genannten, in der Stufe (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen rohen Flüssigkeit als Wirkstoff (aktiven Bestandteil) im Gemisch mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel für den Wirkstoff enthält.

Außerdem ist eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einer starken Antiinflammations-, Antiblutplättchenaggregations- oder Antifungi-Aktivität bevorzugt, die eine therapeutisch wirksame Menge des genannten Extraks, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden ist, als Wirkstoff (aktiven Bestandteil) im Gemisch mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel für den Wirkstoff enthält. Vorzugsweise ist der genannte Extrakt, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden ist, das in der Stufe (c) hergestellte erste konzentrierte Eluat. Alternativ ist der genannte Extrakt, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden ist, das in der Stufe (d) hergestellte zweite konzentrierte Eluat.

Vorzugsweise ist das genannte erste Eluierungsmittel Methanol und das genannte zweite Eluierungsmittel ist vorzugsweise Aceton.

Vorzugsweise umfasst die Stufe (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens die Stufen (i) bis (iv).

Vorzugsweise ist das genannte erste organische Lösungsmittel Ethylether.

Vorzugsweise ist das genannte zweite organische Lösungsmittel Aceton, Methanol, Ethanol oder eine Kombination davon. Als zweites organisches Lösungsmittel besonders bevorzugt ist Aceton.

Vorzugsweise umfasst die Stufe (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens die Stufe (I).

Vorzugsweise umfasst die Stufe (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens die Stufe (I').

Vorzugsweise umfasst die Stufe (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens die Stufe (I'').

Eine geeignete Umkehrphasen-Chromatographie-Kolonne für die Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren umfasst (ohne dass die Erfindung darauf beschränkt ist), eine Umkehrphasen-Chromatographie-Kolonne, die mit einem porösen Harz, beispielsweise Diaion HP-20 (Mitsubishi Co.), Sephadex LH-20 (Pharmicia Co.) und RP-18 (Nacalei tesque Co.), gefüllt ist.

Die pharmazeutische Zusammensetzung mit einer starken Antifungi-Aktivität wird vorzugsweise topisch aufgebracht, beispielsweise als Shampoo, Badgel, Seife, Körperlotion, Körpercreme und Detergens. Vorzugsweise wird die pharmazeutische Zusammensetzung mit starker Antifungi-Aktivität für die Behandlung von Erkrankungen verwendet, die im Zusammenhang stehen mit Trichophyton mentagrophytes oder Pityrosporum ovale, wie z.B., ohne dass die Erfindung darauf beschränkt ist, Tinea pedis, Tinea capitis, Tinea cruris, Tinea glabrosa, Onychomycosis, Pityriasis capitis, Pityriasis vesicolor, Pityrosporum folliculitis, seborrhoischer Dermatitis und Schuppenbildung. Insbesondere liegt die pharmazeutische Antifungi-Zusammensetzung in Form eines Shampoos für die Verwendung zur Behandlung der Schuppenbildung vor.

Es wird angenommen, dass mit der vorstehenden Beschreibung die vorliegende Erfindung in einer ausreichend nacharbeitbaren Weise offenbart worden ist. Die folgenden spezifischen Beispiele dienen daher lediglich ihrer Erläuterung und stellen keinerlei Beschränkungen auf den Rest der Beschreibung dar.

Bestimmung der Wirkstoffe (aktiven Komponenten)

In den folgenden Beispielen wurde eine Hochleistungs-Flüssigchromatographie (abgekürzt als HPLC bezeichnet) zur Bestimmung der Wirkstoffe (aktiven Komponenten) der darin hergestellten Produkte angewendet. Die HPLC-Spektren wurden auf einem HPLC-Instrument (HPLC Shimadzu LC-10AT, Japan) unter Verwendung einer Cosmosil 5C-18-Kolonne (250 mm × 4,6 mm, gefüllt mit Teilchen mit einem Durchmesser von 5 μm) unter Anwendung eines Elutionsverfahrens aufgezeichnet. Es wurde eine HPLC-Probe hergestellt durch Verdünnen einer geeigneten Menge eines Produkts mit einer Lösung mit mobiler Phase (Volumenverhältnis Cyanwasserstoff : Wasser = 65 : 35) auf 25 ml und durch eine 0,25 μm-Membran filtriert. Das Filtrat wurde in die HPLC-Kolonne eingeführt und mit der Lösung mit mobiler Phase eluiert. Zur Bestimmung der Absorption des Eluats bei 230 nm wurde ein UV-Detektor (Shimadzu SPD-6AV, Japan) verwendet.

Beispiel 1
2100 g frische Ingwer-Rhizome wurden zerkleinert und filtriert, wobei man ein Filtrat und einem Rückstand erhielt. 500 ml des Filtrats wurden mit 500 ml Ethylether dreimal extrahiert, die organischen Phasen-Schichten wurden von den wässrigen Phasen-Schichten abgetrennt und miteinander vereinigt. Der Ethylether wurde aus der vereinigten Extraktionslösung im Vakuum verdampft, wobei man ein konzentriertes Ethylether-Extraktionsprodukt (I-OE) erhielt. Der Ingwer-Rückstand wurde mit 3000 ml Aceton dreimal extrahiert, die Extraktionslösungen wurden durch Filtrieren abgetrennt und miteinander vereinigt. Aus der vereinigten Extraktionslösung wurde im Vakuum das Aceton verdampft, wobei man ein konzentriertes Aceton-Extraktionsprodukt (I-O) (14,5 g) erhielt.
7 g einer Mischung aus dem konzentrierten Ethylether-Extraktionsprodukt (I-O) und dem konzentrierten Aceton-Extraktionsprodukt (I-O) wurden in eine Umkehrphasenchromatographie-Kolonne (300 mm × 30 mm), die mit 180 g Diaion HP-20-Harz mit einem Teilchendurchmesser von 500 bis 800 μm gefüllt worden war, injiziert. Zur Durchführung der Elution wurden 1500 ml Wasser, 2500 ml Methanol, 2000 ml Aceton und 2000 ml Chloroform verwendet. Das Wassereluat, das Methanolelulat, das Acetoneluat und das Chloroformeluat wurden getrennt gesammelt und im Vakuum eingeengt, wobei man 0,27 g konzentriertes Wassereluat (I-OW), 1,45 g konzentriertes Methanoleluat (I-OM), 2,68 g konzentriertes Acetonelulat (I-OA) und 0,83 g konzentriertes Chloroformeluat (I-OC) erhielt. Die durch HPLC bestimmten Mengen (mg) an 6-Shogaol, 6-Gingerol und 6-Dehydrogingerdion pro g I-O, I-OM und I-OA sind in der Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
Beispiel 2
500 g im Schatten getrocknete Ingwer-Rhizome wurden pulverisiert und das resultierende Pulver wurde mit 30 L Aceton dreimal eluiert (jeweils mit 10 L). Die drei Extraktionslösungen wurden nach dem Filtrieren miteinander vereinigt und dann im Vakuum eingeengt, wobei man 24 g konzentriertes Aceton-Extraktionsprodukt (II-O) erhielt. 20 g des konzentrierten Aceton-Extraktionsprodukts (II-O) wurden in eine Umkehrphasen-Chromatographie-Kolonne, die mit 600 g Diaion HP-20-Harz gefüllt war, injiziert, die dann nacheinander mit 4 L Wasser, 6,5 L Methanol, 15 L Aceton und 5 L Chloroform eluiert wurde. Das Wassereluat, das Methanoleluat, das Acetoneluat und das Chloroformeluat wurden getrennt gesammelt und im Vakuum eingeengt, wobei man 2,5 g konzentriertes Wassereluat (II-OW), 7,1 g konzentriertes Methanolelulat (II-OM), 6,9 g kon zentriertes Acetonelulat (II-OA) und 3,5 g konzentriertes Chloroformeluat (II-OC) erhielt. Die durch HPLC bestimmten Mengen (mg) an 6-Shogaol, 6-Gingerol und 6-Dehydrogingerdion pro g II-O, II-OM und II-OA sind in der Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 2
Beispiel 3
10 kg im Schatten getrocknete Ingwer-Rhizome wurden pulverisiert und das resultierende Pulver wurde 5 h lang einer Wasserdampf-Destillation unterworfen. Das Destillat wurde im Vakuum eingeengt, wobei man 410 g konzentriertes Destillat (III-O) erhielt. 20 g des konzentrierten Destillats (III-O) wurden in eine Umkehrphasen-Chromatographie-Kolonne, die mit 600 g Diaion HP-20-Harz gefüllt war, injiziert und dann nacheinander mit 4,5 L Wasser, 4,5 L Methanol, 3 L Aceton und 5 L Chloroform eluiert. Das Wasserelulat, das Methanolelulat, das Acetoneluat und das Chloroformelulat wurden getrennt gesammelt und im Vakuum eingeengt, wobei man 0,03 g konzentriertes Wassereluat (III-OW), 14,5 g konzentriertes Methanolelulat (III-OM), 0,85 g konzentriertes Acetoneluat (III-OA) und 0,2 g konzentriertes Chloroformeluat (III-OC) erhielt. Das konzentrierte Destillat (III-O) enthielt kein 6-Shogaol, 6-Gingerol und 6-Dehydrogingerdion, wie durch HPLC bestimmt wurde.
Beispiel 4
10 g eines Pulvers aus im Schatten getrockneten Ingwer-Rhizomen wurden mit 1000 ml Aceton von 50°C 2 h lang extrahiert. Die Extraktionslösung wurde abgetrennt und im Vakuum (40°C, 75 mmHg) eingeengt, wobei man ein konzentriertes Aceton-Extraktionsprodukt (IV-O) erhielt. Die Farbe und die Viskosität des Produkts (IV-O) sind zusammen mit seiner Ausbeute in der Tabelle 3 angegeben.
Beispiel 5
10 g eines Pulvers aus im Schatten getrockneten Ingwer-Rhizomen wurden einer Wasserdampf-Destillation unterworfen und das ölige Destillat wurde nach dem Abtrennen von dem wässrigen Destillat gefriergetrocknet, wobei man einen öligen Extrakt (V-O) erhielt. Die Farbe und die Viskosität des öligen Extrakts (V-O) sind zusammen mit seiner Ausbeute in der Tabelle 3 angegeben.
Beispiel 6
In 10 g eines Pulvers aus im Schatten getrockneten Ingwer-Rhizomen wurde in einer 250 ml-Extraktionskammer CO₂ mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 45 L/min eingeleitet, wobei der Kammerdruck mit einer Hochdruckpumpe (Modell Nr. EK-1, LEWA Co., USA) auf 2500 bis 4000 psia eingestellt wurde und die Kammertemperatur mit einem Wärmeaustauscher (Modell Nr. H-2410, HOTEC Co., USA) und einem äußeren Zirkulationssystem bei 35 bis 60°C gehalten wurde. Die Extraktion wurde gestoppt, wenn das eingeleitete CO₂-Volumen 300 L erreicht hatte, und nach dem Verdampfen des CO₂ wurde ein überkritisches CO₂-Extraktionsprodukt (VI-O) erhalten. Die Farbe und die Viskosität des Produkts (VI-O) sind zusammen mit seiner Ausbeute in der Tabelle 3 angegeben. Die durch HPLC bestimmten Gehalte an stechenden (scharten) Komponenten sind in der Tabelle 4 angegeben. Tabelle 3

*: die Werte von L, A und B wurden bestimmt unter Verwendung eines Σ90-Farbmess-Systems (Nippon Denshoku Inc. Co., Ltd., Japan), worin L die Helligkeit, A die Rot/Grün-Differenz und B die Gelb/Blau-Differenz darstellen.

Tabelle 4
Beispiel 7: Anti-Blutplättchen-Assay
Blut, das aus der äußeren Ohrvene von Kaninchen gesammelt worden war, wurde mit EDTA (100 mM) in einem Volumenverhältnis von 14:1 gemischt und 10 min lang bei Raumtemperatur mit 90 g zentrifugiert, wobei man ein an Blutplättchen reiches Plasma erhielt. Letzteres wurde 10 min lang mit 500 g weiter zentrifugiert, die obere, an Plasma reiche Schicht wurde daraus entfernt und die zurückbleibende Bodenschicht wurde mit einer Tyrode-Lösung, die 2 mM EDTA, jedoch kein Calcium enthielt, suspendiert. Diese Suspension wurde weitere 10 min lang mit 500 g zentrifugiert und die Blutplättchen wurden mit einer Tyrode-Lösung ohne EDTA suspendiert. Nach dem Zentrifugieren unter den gleichen Bedingungen wurden die Blutplättchen mit einer Tyrode-Lösung mit der nachstehend angegebenen Zusammensetzung (mM) suspendiert: NaCl (136,8), KCl (2,8), NaNCO₃ (11,9), MgCl₂ (1,1), NaH₂PO₄ (0,33), CaCl₂ (1,0), Glucose (11,2) und Rinderserumalbumin (0,35 %). Die Anzahl der Blutplättchen wurde mit einem Coulter Counter (Modell ZM) bestimmt und auf 4,5 × 10⁸ Blutplättchen/ml eingestellt. Tabelle 5 Inhibitor-Effekte von Ingwer-Extrakten auf die durch Arachidonsäure und Collagen induzierte Blutplättchenaggregation^a)

^a) die Blutplättchen wurden mit Ingwer-Extrakten oder 0,5 % DMSO (Kontrolle) 3 min lang bei 37°C inkubiert, dann wurden Arachidonsäure (100 μM) oder Collagen (10 μg/ml) zugegeben, um die Aggregation auszulösen. Aspirin und Indomethacin sind positive Kontrollmittel. Der Prozentsatz des Inhibitoreffekts wird wie folgt errechnet: {[(Grad der Inhibierung der Kontrolle) – (Grad der Inhibierung des Ingwer-Extrakts)]/(Grad der Inhibierung der Kontrolle)} × 100 %die Werte sind angegeben als Mittelwert ± S.E., n = 3 – 6
^b) hergestellt in den Beispielen 1 und 2.

Beispiel 8: Bewertung der Inhibitor-Aktivität auf das durch Carrageenin induzierte Pfotenödem
Der Test zur Bestimmung der Inhibitor-Aktivität auf das durch Carrageenin induzierte Pfotenödem wurde nach dem von C.A. Winter et al. beschriebenen Verfahren durchgeführt (C.A. Winter et al., "Proc. Soc. Exper. Biol. Med." 111: 544–547, 1962). Männlichen Wistar-Mäuse mit einem Gewicht von 150 ± 20 g, die eine Nacht lang nicht gefüttert wurden, wurden in die linken hinteren Pfoten 0,1 ml einer 1 % Carrageenin-Suspension injiziert, dann wurden Rubbing-Testproben oder ein Vehiculum als Kontrolle in die linken hinteren Pfoten gleichmäßig injiziert (10 mg/Pfote). 3 h später wurden die Volumina der hinteren Pfoten unter Verwendung eines Volumen-Scanners (Cat. #7150, UGO Basil, Italien) bestimmt und die Differenz zwischen der linken hinteren Pfote und der rechten hinteren Pfote wurde als Index für das durch Carrageenin induzierte Pfotenödem verwendet. Tabelle 6 Inhibitor-Aktivität von Ingwer-Extrakten ^a) auf das durch Carrageenin induzierte Pfotenödem

^a) Die Inhibitor-Aktivität auf das durch Carrageenin induzierte Pfotenödem (%) wurde wie folgt errechnet: [(durchschnittlicher Grad des Ödems bei Mäusen in der Kontrollgruppe) – (durchschnittlicher Grad des Ödems bei Mäusen in der Testgruppe)]/(durchschnittlicher Grad des Ödems bei Mäusen in der Kontrollgruppe)] × 100 %die Werte sind angegeben als Mittelwert ± S.E., n = 3 – 6.
^b) hergestellt in den Beispielen 1, 2 und 3.

Beispiel 9: Bewertung der Inhibitor-Aktivität gegenüber Trichophyton mentagrophytes oder Pityrospsorum ovale
Anti-Trichophyton mentagrophytes-Assay
Die minimale Inhibitor-Konzentration (MIC) eines Ingwer-Extrakts wurde bestimmt und der Versuch wurde nach dem früher beschriebenen Verfahren von J.R. Edwards et al. durchgeführt (J.R. Edwards et al., "Antimicrobial Agents Chemotherypy" 33: 215–222, 1989).
Die Testsubstanz wurde in einem Lösungsmittel (100 % DMSO) gelöst und in einer Verdünnungsreihe auf die gewünschten Ausgangslösungs-Konzentrationen gebracht. Für jede getestete Konzentration wurde ein 0,01 ml-Aliquot in eine Vertiefung einer Tüpfelplatte mit 48 Vertiefungen gegeben, die 0,99 ml einer Kartoffel-Dextrosebrühe (DIFCO, USA) mit 10³–10⁴ CFU/ml Trichophyton mentagrophytes (ATCC 9533) enthielt. Die Platten wurden 72 h lang bei 28°C inkubiert und dann visuell geprüft und bewertet. Die Vehiculum-Kontrolle wurde als Blindkontrolle angewendet. Jede Konzentration wurde doppelt bewertet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 angegeben.
Anti-Pityrosporum ovale-Assay
Die minimale Inhibitor-Konzentration (MIC) eines Ingwer-Extrakts wurde bestimmt und der Versuch wurde nach dem oben genannten Verfahren durchgeführt (J.R. Edwards et al., "Antimicrobial Agens Chemotherapy" 33: 215–222, 1989). Die Testsubstanz wurde in einem Lösungsmittel (100 % DMSO) gelöst und in einer Verdünnungsreihe auf die gewünschten Ausgangslösungs-Konzentrationen gebracht. Für jede getestete Konzentration wurde ein 0,01 ml-Aliquot in eine Vertiefung einer Tüpfelplatte mit 48 Vertiefungen gegeben, die 0,99 ml flüssiges Sabouraud Medium (DIFCO, USA) mit 10³–10⁴ CFU/ml Pityrosporum ovale (ATCC 38593) enthielt. Die Platten wurden 48 h lang bei 37°C inkubiert und dann visuell geprüft und bewertet. Als Blindkontrolle wurde eine Vehiculum-Kontrolle verwendet. Jede Konzentration wurde doppelt bewertet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 angegeben. Tabelle 7 Inhibitoreffekte von Ingwer-Extrakten auf Pityrosporum ovale (Po) und Trichophyton mentagrophytes (Tm)

^a) hergestellt in den Beispielen 1, 2 und 3
^b) es wurde kein Inhibitor-Effekt beim Wachstum festgestellt

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Extrakts aus den Rhizomen (Wurzelstöcken) von Zingiber officinale, das die folgenden Stufen umfasst: a) Herstellung einer rohen Flüssigkeit aus den Rhizomen von Zingiber officinale; b) Einführung der rohen Flüssigkeit in eine Umkehrphasen-Chromatographie-Kolonne und Eluieren der Kolonne nacheinander mit Wasser, einem ersten Eluierungsmittel und einem zweiten Eluierungsmittel, wobei das genannte zweite Eluierungsmittel eine Polarität aufweist, die schwächer ist als diejenige des ersten Eluierungsmittels, jedoch stärker ist als diejenige von Chloroform, so daß ein erstes Eluat beim Eluieren mit dem ersten Eluierungsmittel und ein zweites Eluat beim Eluieren mit dem zweiten Eluierungsmittel erhalten werden; c) Entfernung des ersten Eluierungsmittels aus dem ersten Eluat durch Verdampfen, so daß ein erstes konzentriertes Eluat erhalten wird; und d) Entfernen des zweiten Eluierungsmittels aus dem zweiten Eluat durch Verdampfen, so daß ein zweites konzentriertes Eluat erhalten wird; wobei die Stufe (a) die Stufen (i) bis (iv) oder die Stufe (I), die Stufe (I') oder die Stufe (I'') umfasst, wobei die genannten Stufen (i) bis (iv) die folgenden sind: (i) das Zerkleinern von frischen Rhizomen von Zingiber officinale und das Filtrieren der resultierenden Mischung unter Bildung eines Filtrats und eines Rückstandes; (ii) das Extrahieren des Filtrats mit einem ersten organischen Lösungsmittel, die Abtrennung der resultierenden Extraktionslösung des ersten organischen Lösungsmittels und das Verdampfen des ersten organischen Lösungsmittels aus der Extraktionslösung unter Bildung einer ersten konzentrierten Extraktionslösung; (iii) das Extrahieren des Rückstandes mit einem zweiten organischen Lösungsmittel, das Abtrennen der resultierenden Extraktionslösung des zweiten organischen Lösungsmittels und das Verdampfen des zweiten organischen Lösungsmittels aus der Extraktionslösung unter Bildung einer zweiten konzentrierten Extraktionslösung; und (iv) das Kombinieren der ersten konzentrierten Extraktionslösung mit der zweiten konzentrierten Extraktionslösung unter Bildung der rohen Flüssigkeit; wobei es sich bei der genannten Stufe (I) handelt um: (I) das Extrahieren eines Pulvers aus getrockneten Rhizomen von Zingiber officinale mit dem zweiten organischen Lösungsmittel, das Abtrennen der resultierenden Extraktionslösung des zweiten organischen Lösungsmittels und das Verdampfen des zweiten organischen Lösungsmittels aus der Extraktionslösung unter Bildung der rohen Flüssigkeit; wobei es sich bei der genannten Stufe (I') handelt um: (I') das Wasserdampf-Destillieren eines Pulvers aus getrockneten Rhizomen von Zingiber officinale und das Einengen des resultierenden Destillats durch Verdampfen unter Bildung der rohen Flüssigkeit; und wobei es sich bei der genannten Stufe (I'') handelt um: (I'') das Extrahieren eines Pulvers aus getrockneten Rhizomen (Wurzelstöcken) von Zingiber officinale mit überkritischem CO₂, das Abtrennen der resultierenden Extraktionslösung des überkritischen CO₂ und das Verdampfen des CO₂ aus der Extraktionslösung, wobei man die rohe Flüssigkeit erhält.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Extrakt 0 bis 10 mg 6-Shogaol pro g Extrakt, 1 bis 150 mg 6-Gingerol pro g Extrakt und 0 bis 40 mg 6-Dehydrogingerdion pro g Extrakt enthält.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das erste Eluierungsmittel Methanol ist und das genannte zweite Eluierungsmittel Aceton ist.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin die Stufe (a) die Stufen (i) bis (iv) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das erste organische Lösungsmittel Ethylether ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das zweite organische Lösungsmittel Aceton, Methanol, Ethanol oder eine Kombination davon ist.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das zweite organische Lösungsmittel Aceton ist.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin die Stufe (a) die Stufe (I) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, worin das zweite organische Lösungsmittel Aceton, Methanol, Ethanol oder eine Kombination davon ist.
Verfahren nach Anspruch 9, worin das zweite organische Lösungsmittel Aceton ist.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin die Stufe (a) die Stufe (I') umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin die Stufe (a) die Stufe (I'') umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Phasenumkehr-Chromatographie-Kolonne mit einem porösen Harz gefüllt ist.