DE69509483T2

DE69509483T2 - Getrocknetes pflanzliches Material von Gewürzpflanzen mit einem hohen Gehalt an Antioxydanten und essentiellen Ölen

Info

Publication number: DE69509483T2
Application number: DE69509483T
Authority: DE
Inventors: Robert Aeschbach; Bernard Masseret
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 1994-12-20
Filing date: 1995-12-13
Publication date: 1999-11-18
Anticipated expiration: 2015-12-14
Also published as: IL116449A; ES2103683B1; FR2728138B1; FR2728138A1; TR199501596A2; ES2132583T3; EP0717925B1; IL116449A0; GR3030325T3; MA23748A1; TNSN95130A1; DZ1953A1; EP0717925A1; DE69509483D1; ATE179566T1; ES2103683A1; YU78195A

Description

Die Erfindung betrifft ein getrocknetes pflanzliches Material aus Gewürzpflanzen, insbesondere Salbei oder Rosmann, das gleichzeitig einen hohen Gehalt an Antioxidantien und an etherischem Öl besitzt, und seine Verwendung als Rohstoff zur Herstellung von Antioxidantien insbesondere als Nahrungsmittelzusätze sowie auch als Quelle für ein etherisches Öl für die Parfümherstellung.
Die Kenntnis und die Verwendung von Gewürzen geht in die Anfänge unserer Zivilisation zurück, und zwar nicht nur ihre Verwendung als Aromamittel und Würzmittel oder wegen ihrer pharmazeutischen Eigenschaften, sondern auch in ihrer bedeutenden Funktion für die Konservierung von Nahrungsmitteln. Diese Wirkung ergibt sich nicht nur aus einer Maskierung der durch das Schlechtwerden des Nahrungsmittels entstehenden Gerüche, sondern vor allem aus einer antioxidierenden Schutzwirkung und insbesondere durch einen bakteriziden und bakteriostatischen Effekt, der die Beschädigung von Nahrungsmitteln durch Mikroorganismen verzögert. Dieser Effekt wurde von Pruthi (1980) (1) und Shelef (1983) (2) beschrieben.
Die in Klammern gesetzten Zahlen verweisen auf die Bibliographie am Ende der Beschreibung.
Der Nachweis der Schutzeigenschaften mancher Gewürze gegen Sauerstoffeinwirkung wurde vor etwa 40 Jahren erbracht, als JR Chipault (1952, 1955, 1956)(3, 4,5) diese Gewürze untersuchte. Die Arbeiten von Chipault wurden vor etwa 20 Jahren wieder interessant, als (später bestätigte) Zweifel an der Unschädlichkeit von Butyl-Hydroxy-Toluol (BHT) wach wurden, einem sehr leistungsfähigen Syntheseantioxidanz, das in großem Umfang mit Butyl-Hydroxy-Anisol (BHA) zum Schutz von Nahrungsmitteln verwendet wurde. Das Interesse an der anti oxidierenden Wirkung mancher Gewürze hat sich seit kurzem in Zusammenhang mit der Vorliebe der westlichen Verbraucher für natürliche Nahrungsmittelprodukte verstärkt, und heute werden auf dem Markt mehrere Oleoresine von Gewürzen, insbesondere Rosmann, zur Verhütung der Oxidation von Nahrungsmitteln angeboten.
Von diesen Gewürzen und aromatischen Kräutern mit einer antioxidierenden Wirkung gehören Salbei und Rosmann zu den interessantesten. Das antioxidierende Vermögen ist auf das Vorhandensein von Verbindungen wie Carnosinsäure und Rosmarinsäure in diesen Pflanzen zurückzuführen, die nach komplexen Mechanismen, die noch nicht vollständig erhellt wurden, mit einer Gruppe von Flavonoiden synergisch wirken.
Während der letzten 15 Jahre wurden mehrere Typen von Oleoresinen von Rosmann hergestellte, auf dem Markt angeboten und von der Nahrungsmittelindustrie verwendet. Ihre Wirkung gegen den Einfluß von Sauerstoff in Fetten und Nahrungsmittelprodukten wurde nachgewiesen. Diese Oleoresine werden im allgemeinen in einer Dosierung von nahe 500 ppm, bezogen auf das Fett der Nahrungsmittel, verwendet, eine Dosierung, die der der natürlichen aromatisierenden Substanzen kommt, die zur Verbesserung des Geschmacks von Nahrungsmittelprodukten verwendet werden.
Es wurden verschiedene Verfahren zur Extraktion von Oleoresin aus den Gewürzen und insbesondere aus Rosmann vorgeschlagen. Die Extraktion kann in mehreren Schritten unter Verwendung von polaren oder nicht polaren Lösungsmittel sowie ihrer Mischungen durchgeführt werden: pflanzliches oder tierisches Fett (6), Hexan, Benzol, Ethylether, Chloroform, Ethylendichlorid, Dioxan oder Methanol (7, 8), Ethanol oder Benzol (9), Hexan oder Ethanol (10,11), überkritisches CO&sub2; (12, 13, 14); ferner sind das Patent EP 307 626 und die Patentanmeldung EP 507 064 zu nennen. Auf den gesamten, in diesen Patentanmeldungen und in den oben erwähnten Artikeln beschriebene Stand der Technik wird hier verwiesen, und zwar insbesondere hinsichtlich der Verfahren zur Extraktion der Antioxidantien aus den Pflanzen, Verfahren, die auch auf die Pflanzen der Erfindung angewandt werden können.
Die Extraktion ist oft von einer Desodorierung und/oder einer Entfärbung des Oleoresins begleitet; manche Behandlungen gestatten die Behandlung des Oleoresins zur Entfernung der unlöslichen Bestandteile in den Fetten (US-Patent 4.877.635, Patent EP 0.009.661 und Veröffentlichungen 14, 15, 16).
Aeschbach (Europäische Patente 0.307.626 und 0.507.064) hat Verfahren entwickelt, um Antioxidantienextrakte von Rosmarin oder Salbei in Form von Pulver oder durchscheinender Flüssigkeit zu erhalten. Diese Extrakte sind reich an Antioxidantien, und zwar insbesondere an Carnosinsäure und Carnosol, den beiden Hauptantioxidantien von Rosmann und Salbei. Die Carnosinsäure wurde von Aeschbach und Philippossian isoliert und identifiziert (Europäische Patentanmeldung EP 0.480.077). Die Oxidation von Carnosinsäure führt zu Carnosol, das seinerseits antioxidierende Eigenschaften besitzt. Das Vorliegen einer Isopropylgruppe in diesen beiden Verbindungen spielt eine große Rolle bei der Stabilisierung der während der Oxidation gebildeten Radikale.
Aeschbach (17) hat das Vorhandensein von 13 Heterosiden im Rosmann nachgewiesen, die in geringerer Weise (Synergismus) wie Rosmarinsäure zum antioxidierenden Effekt beitragen.
Mehrere Arbeiten wurden über die antioxidative Wirkung der Oleoresine von Rosmann in Nahrungsmitteln veröffentlicht (8, 14, 15). In diesen drei Fällen üben die benutzten Oleoresine, obwohl sie verschiedenen Ursprungs sind, in den untersuchten Systemen eine Schutzwirkung aus, die der von BHT allein oder in Mischung mit BHA und Propylgallat nahe kommt, wobei diese jedoch in einer kleineren Dosis verwendet wurden. Die Qualität der erhaltenen Oleoresine und ins besondere ihre antioxidierende Wirkung hängt nicht nur von den Extraktionsparametern (Lösungsmitteltyp, Temperatur, Dauer), sondern auch von der Beschaffenheit der verwendeten Pflanze, ihrem Ursprung, den klimatischen Bedingungen, den Anbau- und Erntebedingungen ab, wie in der Untersuchung von Granger (18) an Rosmarinessenz angegeben wird. In diesem Zusammenhang ist die Anwendung der gewöhnlich verwendeten Rosmann- oder Salbeipflanzen auf die Extraktion der etherischen Öle ausgerichtet.
Auch haben die erhaltenen pflanzlichen Materialien, die sich nach einer wässrigen Destillation zur Bildung des etherischen Öls ergeben, eine sehr stark variierende Zusammensetzung an Antioxidantien, was sie für eine industrielle Verwendung als Rohstoff zur Herstellung von Antioxidantien oder Gewürzen, die als Nahrungsmittelzusätze verwendbar sind, ungeeignet macht, und wurden immer weggeworfen.

Zusammenfassung der Erfindung

Der Erfindung liegt die Entdeckung zugrunde, daß es möglich ist, aus gewissen Gewürzen ein pflanzliches Material zu erhalten, das gleichzeitig hohe und stabile Gehalte an Antioxidantien und an etherischen Ölen besitzt.
Die Herstellung von Pflanzen von diesen Gewürzen und von aus diesen Pflanzen erhaltenem pflanzlichen Material bietet eine neue wirtschaftliche Möglichkeit, nämlich ihre Verwertung gleichzeitig in der Agrar- und Lebensmittelindustrie und in der Parfümherstellung.
Es wurde nie eine Selektion von Gewürzen hinsichtlich ihres Gehalts an Antioxidantien vorgenommen, und die natürlichen Populationen von Pflanzen, die diese enthalten, besitzen eine große Variabilität hinsichtlich dieses Gehalts und der damit verbundenen antioxidativen Wirkung.
Für die Herstellung von Pflanzen, die das Merkmal eines hohen Gehalts an Antioxidanz besitzen, war es zunächst wichtig, zu wissen, ob ein solches Merkmal mit ihrem Gehalt an etherischem Öl zusammenhing oder nicht.
Zum Screenen von Rosmarinpflanzen mit den erforderlichen Merkmalen mußte zunächst eine Methodologie erstellt werden. Diese besteht zunächst darin, daß eine Sammlung von Rosmarinpflanzen mit verschiedenen Genotypen selektiert wird und dann eine vegetative Vermehrung jeder der gesammelten Pflanzen vorgenommen wird, und zwar feldmäßig in fünf Replikationen von fünf Pflanzen pro Genotyp, d. h. 25 Pflanzen pro Genotyp. Im vorliegenden Text werden die Begriffe Genotyp und Klon ohne Unterschied benutzt, um genetisch identische und vegetativ vermehrte Einzelpflanzen zu bezeichnen. Unter "Pflanze" wird die selektierte Pflanze vor ihrem Einsetzen in die Erde verstanden, mit anderen Worten, eine bestimmte Pflanze entspricht notwendigerweise einem bestimmten Klon; dagegen können einem Klon mehrere Pflanzen entsprechen; diese Einheit von genetisch identischen Pflanzen wird als Kultivar bezeichnet.
Unter pflanzlichem Material ist jeder Rohstoff zu verstehen, der aus einer Pflanze oder einem Kultivar stammt, die bzw. der dazu bestimmt ist, transformiert zu werden, um eine Substanz daraus zu extrahieren; im Fall der Erfindung kann es sich um die ganze trockene Pflanze oder um getrocknete Blätter handeln.
In der Methodologie des Screenens der den gewählten Kriterien entsprechenden Klone war es erforderlich, mehrere Feldversuchsstandorte mit derselben ursprünglich selektierten Sammlung zu verwenden, wobei die Analysen der gesammelten Proben anschließend parallel und blind vor sich gingen.
Der andere wesentliche Parameter der Screeningmethodologie ist die Definierung eines Extraktions- oder Reinigungsver fahrens, das allen am Projekt arbeitenden Labors und den einzelnen Feldversuchsstandorten gemeinsam ist.
Ein dritter wesentlicher Parameter in der vorliegenden Methodologie ist die Erstellung von gemeinsamen analytischen Verfahren und die Bestimmung der Standardabweichung, die bei der Ernte der 25 Pflanzen der betreffenden Klone erhalten wurde. Die Methodologie beinhaltet schließlich die Feststellung eventueller physiologischer Modifikationen in Abhängigkeit entweder vom Tagesrhythmus oder vom Monatsrhythmus. Es versteht sich, daß der jahreszeitliche Rhythmus zu Änderungen insbesondere im Gehalt an etherischem Öl führt, wobei die Produktion in den (warmen) Sommermonaten größer ist als in den Wintermonaten.
Nach Berechnung der Standardabweichung der Parameter (und zwar Gehalt an etherischem Öl nach Dekantation oder nach Extraktion, Induktionszeit des ethanolischen Extrakts, gemessen mit dem Rancimattest (19, 20), Gehalt an Carnosol, an Carnosinsäure, an Verbenon sowie ihre jeweilige Extraktionsausbeute) wurde jeder Parameter gemessen, und dann wurden die einzelnen Kultivare, die von einer Sammlung von 44 Klonen von Kulturen stammen, die an zwei verschiedenen Standorten, in Frankreich (Francereco) oder in Spanien (Hispareco), durchgeführt wurden, hinsichtlich dieser verschiedenen Parameter einem Screening unterzogen. Man erhielt folgende Ergebnisse:
a) die tageszeitlichen Änderungen des Gehalts an etherischem Öl sowie an Carnosol + Carnosinsäure (Antioxidantien) sind unabhängig vom Kulturort unsignifikant. Trotzdem wurden alle Ernten aus Gründen der Homogenisierung zu Beginn des Nachmittags vorgenommen;
b) hinsichtlich der zweimonatlichen Änderungen bezüglich etherischem Öl und Carnosinsäure + Carnosol (Antioxidantien) wurde eine gute Stabilität zwischen August und Oktober in Frankreich und zwischen Juli und September in Spanien festgestellt. Im nachstehenden werden Beispiele und detaillierte Kurven vorgelegt, aus denen man schließen kann, daß die beste Erntezeit in Spanien der Monat August und in Frankreich der Monat September oder Oktober ist.
Fig. 1 ist ein Schema des Verfahrens zur Destillation von Rosmarinklonen mit Wasserdampf, um einerseits das etherische Öl und andererseits die Rosmarinrückstände zu erhalten.
Die nach wässriger Destillation des pflanzlichen Materials erhaltenen Rückstände werden "Treber" genannt; sie werden anschließend verwendet, um daraus die Antioxidantien zu extrahieren, wie in Fig. 2 schematisch dargestellt ist.
Das gesamte Verfahren zur Selektion von Rosmarinkultivars mit der oben beschriebenen Methodologie sowie die einzelnen Schritte dieses Verfahrens sind Teil der Erfindung, wobei es das Ziel der eingangs erwähnten Arbeit ist, einen Rohstoff zu erhalten, der industriell verwertbar ist und die Extraktion von insbesondere in der Agrar- und Lebensmittelindustrie verwendbaren Antioxidantien gestattet. Wenn außerdem der Gehalt an etherischem Öl in diesem relativ hoch ist, könnte derselbe Rohstoff hierbei durch eine Art "crakking" gleichzeitig in der Parfümherstellung und in der Agrar- und Lebensmittelindustrie verwendet werden.
Dank der verschiedenen Parameter, die auf die oben beschriebene Weise eingestellt wurden, war es möglich, Gewürzpflanzen zu selektieren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß das aus ihnen erhaltene pflanzliche Material gleichzeitig einen hohen Gehalt an Antioxidantien und an etherischem Öl besitzt. Dieses pflanzliche Material, das Gegenstand der Erfindung ist, ist außerdem durch seinen Gehalt an Antioxidantien gekennzeichnet, der mehr als 1 Gew.- % der frischen Pflanzen oder mehr als 3,5 Gew.-% der Trockenmasse beträgt, sowie durch den Gehalt an etherischem Öl, der mehr als 0,3 Gew.-% der frischen Pflanze oder mehr als 1,5 Gew.-% der Trockenmasse beträgt. Die Gewürzpflanzen mit diesen Merkmalen sind Teil der Erfindung. Rosmann und Salbei sind zwei Gewürze, die für die Herstellung des erfindungsgemäßen pflanzlichen Materials besonders günstig sind. Aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung geht hervor, daß zwei Rosmarinklone in dieser Hinsicht besonders interessant sind: die Klone 28 und 39.
Die Gehalte an etherischem Öl (EO) und an Antioxidantien (AO) in dem pflanzlichen Material gestatten die Errechnung der Gesamtmenge von EO und AO, die pro Pflanze erhalten werden kann (EOP und AOP), und zwar das Produkt aus Gehalt (in %) x Trockenmasse (Gramm pro Pflanze). Die Gewürz- und insbesondere Rosmarinanpflanzungen ergeben einen äußerst variablen Hektarertrag, und zwar insbesondere hinsichtlich des Ertrags an Gewicht der getrockneten Blätter, einer Quelle sowohl für Antioxidantien als auch für etherisches Öl. Die erfindungsgemäßen Rosmarinpflanzen, die mit der erfindungsgemäßen Methodologie selektiert wurden, haben den Vorteil, daß man bei ihnen einen Hektarertrag von über 7000 kg/ha erreicht, so daß man einen Hektarertrag von Antioxidantien von mindestens 270 kg/ha und einen Hektarertrag von etherischem Öl von mindestens 120 kg/ha erhalten kann.
Die erfindungsgemäßen Rosmarinpflanzen, die mit der oben beschriebenen Methodologie selektiert wurden, zeigen eine tägliche oder zweimonatliche Änderung ihres Gehalts an Antioxidantien und/oder an etherischen Ölen von weniger als 20%.
Die auf diese Weise selektierten Klone können auf molekularer Ebene durch einen molekularen finger print charakterisiert werden, wobei die in (22) und im nachstehenden im Beispiel für die molekularen finger prints beschriebene Technik verwendet wird.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung des getrockneten pflanzlichen Materials der Gewürzpflanzen gemäß Anspruch 4. Die Verwendung dieser Rosmarinpflanzen gestattet außerdem durch eine wässrige Destillation der getrockneten Blätter die Herstellung von etherischem Öl, das auf sehr vorteilhafte Weise in der Parfümherstellung verwendbar ist, da sein Gehalt gleich dem der gewöhnlich zur Parfümherstellung verwendeten wilden Pflanzen ist oder darüber liegt. Die herangezogene Methodologie wurde systematisch auf Rosmarinpflanzen angewandt und wird im nachstehenden beschrieben. Ihre Übertragung auf andere Gewürzarten, insbesondere Salbei, Thymian, Oregano oder Gewürznelken ist für den Fachmann, dem die einzelnen verwendbaren Extraktionsverfahren (6 bis 13) bekannt sind, leicht vorzunehmen.
Das Verfahren zur Selektion der neuen Rosmarinpflanzen gemäß dem oben definierten Kriterium der antioxidierenden Aktivität gestattet außerdem die Erzeugung von Pflanzen mit einem DHS (Differenz, Homogenität, Stabilität), das durch vegetative Vermehrung die Erzeugung eines konstanten und damit zu industriellen Zwecken einsetzbaren Rohstoffs gestattet. In der vorliegenden Beschreibung werden die Methodologie für die Selektion der Klone von Gewürzen mit den gewünschten Merkmalen und die auf dieser Methodologie beruhenden Beispiele für den Fall von Rosmarinpflanzen vorgelegt. Wenn man Gewürze anstrebt, die gleichzeitig die Merkmale besitzen, ein Rohstoff für Zusatznährstoffe und für die Erzeugung von in der Parfümherstellung verwendbaren etherischen Ölen zu sein, kann die angewandte und im nachstehenden ausführlicher beschriebene Methodologie auf die Herstellung von neuen Klonen mit diesen Merkmalen übertragen werden. Alles, was im Text auf Rosmann Bezug nimmt, kann auch auf andere Arten von aromatischen Pflanzen angewandt werden.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Aus der nachstehenden ausführlichen Beschreibung und den ihr beigefügten Figuren gehen die Methodologie, die im Selek- tionsverfahren von Klonen mit einem hohen Gehalt an etherischem Öl und gleichzeitig an Antioxidantien verwendet wird, und die Merkmale dieser selektierten Pflanzen selbst hervor. Zunächst werden Details der einzelnen Schritte des Verfahrens behandelt, und zwar insbesondere: die Screeningmethodologie, die Durchführung der Feldversuche, die Destillationsmethode, die analytischen Verfahren, die Ergebnisse der quantitativen Bestimmung des etherischen Öls bei den selektierten Klonen sowie der quantitativen Bestimmung der Antioxidantien, und schließlich werden die Hektarerträge sowohl hinsichtlich des etherischen Öls als auch der Antioxidantien berechnet.

Beschreibung der Figuren:

Fig. 1 ist ein Schema, das als Beispiel das "cracking" oder die Destillation von Rosmann zeigt, das bzw. die zur Herstellung einerseits von etherischem Öl durch wässrige Destillation und andererseits von Treber genannten Rosmarinrückständen führt.
Fig. 2 ist eine Darstellung des Verfahrens zur Herstellung eines Antioxidaritienextrakts ausgehend vom Treber. RE-S bedeutet Trockenextrakt.
Fig. 3 zeigt die täglichen Änderungen des Gehalts an EO und AO von zwei zufällig genommenen Klonen: den Klonen 28 und 30.
HE = etherische Öle (Äquivalent von EO)
AO = Antioxidantien.
Fig. 4 zeigt die zweimonatlichen Änderungen von EO (HE) und AO in Abhängigkeit vom Erntezeitpunkt; hierbei bringt Fig. 4a die in Frankreich erhaltene Ergebnisse (Francereco) und Fig. 4b die in Spanien erhaltenen Ergebnisse (Hispareco).
Fig. 5 zeigt den Gehalt an etherischem Öl der 44 Klone ausgedrückt in Gew.-% (in g pro 100 gr) Trockenmasse in Spanien (EOH) und in Frankreich (EOF).
Fig. 6 zeigt den Gehalt an Antioxidantien in g pro 100 gr Trockenmasse, in Frankreich (AOF) und in Spanien (AOH) bei den 44 analysierten Klonen.
Fig. 7 zeigt die Bestimmung des Gehalts an etherischem Öl von 44 getesteten Klonen, ausgedrückt in % der Trockenmasse bzw. in Gramm pro Pflanze.
Fig. 8 zeigt die Bestimmung des Gehalts an Antioxidantien derselben Klone, ausgedrückt in % der Trockenmasse bzw. in Gramm pro Pflanze.

1) METHODEN UND VERFAHREN

1.1 Screeningmethodologie

Bisher wurden Rosmarinpflanzen noch nie hinsichtlich ihrer antioxidierenden Aktivität untersucht. Das bedeutet, daß dieses Kriterium in der natürlichen Population äußerst variabel ist; daher bestand die benutzte Methodologie auch darin:
- eine botanische Erkundung vorzunehmen,
- eine vegetative Vermehrung jeder der gesammelten Pflanzen vorzunehmen,
- ein Screenen der Sammlung von Klonen durch einen randomisierten Versuch an zwei verschiedenen Stellen vorzunehmen. Vor diesen Versuchen war es erforderlich, ein für alle Teststandorte gemeinsames Destillations- und Extraktionsverfahren zu definieren und dann die Standardabweichung der entwickelten analytischen Verfahren zu ermitteln und, so sie besteht, eine mögliche Wirkung der Ernteperiode entweder in einem bestimmten Tag oder in einem bestimmten Monat zu ermitteln und schließlich eine mögliche Wirkung des Erntezeitpunkts während der Jahreszeit des aktiven Wachstums festzustellen.
Zur Begrenzung der Anzahl von Analysen wurde eine Probe von jedem der replizierten Klone innerhalb eines Kultivars geerntet und diese wurden vor der Analyse gemischt. Dies ermöglicht es, die Anzahl von Analysen pro Klon auf 1/5 zu verringern. Dies gestattet es, im folgenden Jahr jede Replikation von jedem besseren selektierten Klon und fünf von den schlechteren zu beobachten, wie sie während des vorhergehenden Jahrs bestimmt wurden.

1.2 Feldversuche

Es wurde eine Sammlung von etwa 100 Rosmarinpflanzen hergestellt; es wurde eine erste Gruppe von 44 Genotypen zusammengestellt.
Jeder dieser Genotypen wurde anschließend feldmäßig vermehrt; die randomisierten Feldversuche beinhalten fünf Replikationen von fünf Pflanzen pro Genotyp, was 25 Pflanzen pro Klon ergibt, wobei diese 25 Pflanzen zusammen einen Kultivar bilden.

1.3 Destillations- und Extraktionsverfahren

Fig. 1 und 2 sind ein Beispiel eines Verfahrens für die Herstellung von etherischem Öl und Antioxidantien.
In Fig. 2 werden die Rosmarinrückstände zweimal mit Hexan extrahiert (in einem Anteil 1 : 4), worauf zwei Extraktionen mit Ethanol folgen (1 : 4). Der Hexanextrakt wird mit 80%igem Ethanol (Gew./Gew.) gegengewaschen und die ethanolische Phase wird dem Ethanolextrakt beigefügt. Dieser Extrakt wird anschließend mit 3% Aktivkohle entfärbt, konzentriert, in Wasser ausgefällt und dann gefiltert und getrocknet. Das verwendete Verfahren ist ausführlich im Patent EP 307 626 beschrieben sowie, wenn man einen flüssigen Antioxidan tienextrakt erhalten möchte, in der Patentanmeldung EP 507 064.
Andere Varianten der Extraktion von Antioxidantien werden auch in der Patentanmeldung EP 480 077 beschrieben, auf die ausdrücklich verwiesen wird.
Die an den einzelnen Feldversuchsstandorten verwendeten Verfahren sind von Standort zu Standort dieselben. Die Rückstände, die man nach Destillation des Rosmarinpulvers erhielt, wurden mit Diethylen nachextrahiert. Später wurde diese zweite Extraktion weggelassen, da sie unnötig war: durch die Destillation mit Diethylen wurden sehr wenig etherische Öle erhalten, und die Klassifizierung der Klone war dieselbe, ob nur eine einfache Destillation stattfand oder zwei aufeinanderfolgende Destillationen, so daß diese zweite Destillation einfach aus Gründen der Verbesserung der Ausbeute weggelassen wurde.
Die etherischen Öle werden durch Zermahlen der getrockneten Stengelendteile und dann durch Extraktion durch Wasserdestillation mit 15 ml/gr Pulver erhalten, und dann wird das etherische Öl mit Ether extrahiert und nach Abkühlung gefiltert und mit 50 ml Wasser gespült, worauf zwei Extraktionen in wässriger Phase volumensgleich mit Diethylether folgen.

1.4 Analytische Verfahren

a) Ermittlung der antioxidierenden Aktivität

Die Konzentration der an der antioxidierenden Aktivität beteiligten Verbindungen wird durch Analysen ermittelt, die an einem ethanolischen Extrakt des Rosmarinrohpulvers vorgenommen werden.
Die antioxidierende Aktivität ergibt sich im wesentlichen aus der Carnosinsäure und aus Carnosol. Die Menge jedes dieser beiden Substanzen im Extrakt wird durch HPLC ermittelt (21).
Die antioxidierende Aktivität des Extrakts wird mit der Rancimat-Methode (19, 20) auf einem Hühnerfett gemessen.

Rancimat-Test

Der Rancimat-Text wurde bei 100ºC nach den in Woestenburg (20) veröffentlichten Methoden verwendet. Eine Extraktteilmenge, die 500 ppm Trockenmasse entspricht, wurde einem desodorierten Hühnerfett beigegeben, und man bestimmte die Induktionszeit dieses "stabilisierten" Fettes. Das desodorierte Hühnerfett wurde in einer veröffentlichten Methode (19) hergestellt. Es wurde nachgewiesen, daß das in das Fett während der Herstellung der Proben eingeführte Ethanol die erhaltenen Ergebnisse nicht beeinflußt.
Die an den 36 getesteten Klonen erhaltenen Rancimat- Messungen sind in der nachstehenden Tabelle 1 zusammengefaßt, die außerdem die erhaltenen Werte für den Gehalt an Carnosinsäure plus Carnosol, ausgedrückt in % der Trockenmasse, angibt. Tabelle 1
Diese Tabelle zeigt deutlich eine Korrelation zwischen der Menge an dekantiertem etherischem Öl und dem Rancimat-Wert, selbst wenn Schwankungen bestehen.
SD bedeutet "Standardabweichung".
Ermittlung von Carnosol und Carosinsäure durch HPLC.
Diese Technik ist dem Fachmann wohlbekannt. Ein Ausführungsbeispiel wird in (21) beschrieben, und die erhaltenen Ergebnisse sind in der vorstehenden Tabelle 1 angeführt.

b) Standardabweichungsanalyse der einzelnen Parameter

Die Standardabweichung wurde durch die folgenden Parameter ermittelt:
- Trockenmassegehalt des Pulver,
- Volumen und Gewicht der durch Dampfdestillation extrahierten etherischen Öle,
- Gewicht von aus einem Diethyl-Ether-Rückstand extrahierten etherischen Ölen,
- Rancimat-Test
- Konzentration von einigen der an den antioxidierenden Aktivitäten beteiligten Verbindungen.
Die nachstehende Tabelle 2 gibt die bei den einzelnen Parametern erhaltenen Mittelwerte, die Standardabweichung und den Prozentsatz der Standardabweichung vom Mittelwert an, und zwar für: Prozentsatz der Trockenmasse, dekantierte etherische Öle, ausgedrückt in ml pro 100 gr Trockenmasse, die extrahierten etherischen Öle, ausgedrückt in mg pro 100 g Trockenmasse, der in Spanien durchgeführte Rancimat-Test, der in Frankreich durchgeführte Rancimat-Test, und bei den Extrakten mit antioxidativer Aktivität wurde gemessen: der Gehalt an Carnosol, der Gehalt an Carnosinsäure, die Summe beider, das Verbenon und die Ausbeute (ebenfalls in Prozent); was die antioxidative Aktivität anlangt, so bedeutet Es die bei den Versuchen in Spanien erhaltenen Werte und (FR) bedeutet die bei den Versuchen in Frankreich erhaltenen Ergebnisse. Tabelle 2
Der höchste Variationskoeffizient wird bei der Ermittlung des Rancimat festgestellt, bei der er 25% erreicht. Dagegen ergeben die analytischen Messungen an einem Rohextrakt oder an einer definierten Verbindung immer einen Variationskoeffizient unter 9%, mit Ausnahme des auf 100 g Trockenmasse erhaltenen Volumens des etherischen Öls, wo er 11,8% beträgt. Dieser letztgenannte Parameter ist wahrscheinlich aufgrund der Schwierigkeiten bei Messungen an einem kleinen Volumen nicht so zuverlässig wie die anderen. Auch ist die Messung von Gewicht/Gewicht viel zuverlässiger als die von Volumen/Gewicht, so daß man sich für diese entscheiden muß. Diese Ergebnisse zeigen also, daß die gemessenen Parameter und die verwendeten Verfahren zuverlässig sind und für eine Verwendung in einem Verfahren zur Selektierung von Klonen mit hohem Gehalt an EO und an AO geeignet sind.

1.5 Klimatische Schwankungen

Abgesehen von den den analytischen Verfahren innewohnenden Schwankungen war es erforderlich, die Tagesschwankungen einerseits und die zweiwöchentlichen Schwankungen andererseits zu untersuchen.

a) Ermittlung der Tagesschwankungen

Zwei zufällig gewählte Klone (28 und 30) wurden alle zwei Stunden zwischen 6 Uhr und 18 Uhr in Frankreich und in Spanien geerntet. Die analysierten Parameter waren der Gehalt an destilliertem oder extrahiertem etherischem Öl einerseits und an Carnosol plus Carnosinsäure andererseits. Fig. 3 zeigt die erhaltenen Ergebnisse und läßt erkennen, daß die Tagesschwankungen nicht signifikant sind, und zwar für keinen der gemessenen Parameter.

b) Ermittlung der zweiwöchentlichen Schwankungen

Dieselben Klone wurden alle zwei Wochen zwischen Mitte Juni und Ende Oktober (in Frankreich) und zwischen Mitte Juli und Ende Oktober in Spanien geerntet. Dieselben Parameter wurden zur Ermittlung einer eventuellen Schwankung verwendet. Die Fig. 4a und 4b zeigen diese zweiwöchentlichen Schwankungen. Es zeigen sich starke Schwankungen im Gehalt an etherischem Öl je nach der Erntezeit, und zwar ist dieser Gehalt relativ stabil von Ende August bis Ende Oktober in Frankreich und von Ende Juli bis Ende August in Spanien. Dies ist angesichts der klimatischen Unterschiede zwischen Frankreich und Spanien vollkommen logisch. Der Gehalt an Antioxidantien ist in dem verwendeten Zeitraum stabil. Diese Ergebnisse zeigen, daß die optimale Ernteperiode in Spanien August und in Frankreich September oder Oktober ist.

2) SIEBUNG DER KLONE

Nach Einstellung aller dieser Parameter konnte das Screenen der Klone unter den 44 untersuchten Pflanzen an allen Genotypen vorgenommen werden.
Fig. 5 gibt den in Spanien (EOH) und in Frankreich (EOF) erhaltenen Gehalt an etherischem Öl der 44 Klone an, ausgedrückt in Gewichtsprozent (der Trockenmasse).
Fig. 6 zeigt den Gehalt an Antioxidantien in g pro 100 gr Trockenmasse in Frankreich (AOF) und in Spanien (AOH) bei den 44 analysierten Klonen.
Fig. 7 zeigt den Gehalt an etherischem Öl und die pro Pflanze erhaltene Menge an etherischem Öl (EOP). Parallel hierzu zeigt Fig. 8 den Gehalt an Antioxidantien (in Prozent) und die Menge an Antioxidantien pro Pflanze (AOP). Aus diesen Figuren ergibt sich klar, daß die beiden Parameter nicht korreliert sind und daß manche Pflanzen einen hohen Gehalt an Antioxidantien in Prozent der Trockenmasse haben können (Fig. 8) und dagegen eine relativ niedrige Menge pro Pflanze (beispielsweise Fall der Klone Nr. 1, 23 oder 37). Dagegen sind die im Rahmen der Erfindung interessanten Klone diejenigen, die gleichzeitig einen hohen Gehalt an Antioxidantien in Prozent der Trockenmasse und eine große Menge pro Pflanze haben, was bei den Klonen 28 und 39 der Fall ist.
Ebenso stellt man fest, daß es kaum eine Korrelation zwischen dem Gehalt an etherischem Öl in Prozent der Trockenmasse und der Menge pro Pflanze besteht. Die Klone 11, 19, 27, 28, 34 und 39 sind hinsichtlich des Werts der beiden vereinigten Kriterien besonders interessant.
Die Betrachtung der Fig. 5 bis 8 ergibt folgendes:
Eine starke Streuung wird in der Sammlung von 44 Klonen insofern festgestellt, als der Gehalt an etherischem Öl zwischen 253 bis 3130 mg pro 100 gr Trockenmasse bei einer Ernte in Frankreich im Monat August schwankt. Diese Streuung ist in der nachstehenden Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3: Analyse der Streuung
Aus den Fig. 7 und 8 sowie aus der vorstehenden Tabelle 1 geht klar hervor, daß die Klone 28 und 39 den günstigsten Gehalt an EO und an AO besitzen. Deshalb wurden diese beiden Klone hinsichtlich ihres Gehalts an etherischen Ölen, an Antioxidantien und hinsichtlich des Hektarertrags beider viel ausführlicher untersucht.

3) GEHALT AN ETHERISCHEN ÖLEN DER KLONE 28 und 39

1660 kg des Klons Nr. 28 und 312 kg des Klons Nr. 39 wurden unter Verwendung der gebräuchlichen Extraktionstechniken destilliert. Der Ansatz beträgt etwa 300 kg frische Pflanzen (etwa 50% Feuchtigkeit), dem man 200 l Wasser beigibt. Die Erhitzung wird durch direkten Dampf (Einführung über den Boden der Vorrichtung) und Kokillenkreislauf vorgenommen. Es ist wichtig, daß vor JEDEM Arbeitsgang der Dampfkreis vollständig entleert wird, um die Eisenpartikel, die sich in der Leitung befinden, zu entfernen.
Die Erhitzung dauert etwa 30 min. um zum Beginn des Gusses zu kommen.
Die Destillation dauert von Beginn des Gusses an 2 h 30 min. und dann wird das Wasser über die Öffnung des Bodenventils der Vorrichtung entleert. Die Einheit wird anschließend durch Evakuierung der Vorrichtung und Erhitzung mittels des Kokillenkreises getrocknet. Die Dauer dieser Arbeitsgänge der Entleerung, Trocknung und Erhitzung beträgt 45 min bis 1 h und der Prozeß wird beendet, wenn kein Wasser mehr destilliert wird. Die Vorrichtung wird anschließend durch Öffnung der Bodenklappe entleert. Die Zweige werden auf einer Betonfläche getrocknet, indem sie mit einer Höhe von etwa 10 cm ausgebreitet werden und häufig gewendet werden. Durch manuelles Sortieren trennt man anschließend die Rosmarinbüschel von den Zweigen. Die Ergebnisse der Destillationen bei den Klonen 28 und 39 sind in den nachstehenden Tabellen 4a und 4b angeführt. Ergebnisse der Destillationen: 1) Tabelle 4a: Klon Nr. 28 2) Tabelle 4b: Klon Nr. 39
Die etherischen Öle wurden anschließend hinsichtlich ihrer olfaktorischen Eigenschaft einerseits und ihrer Bestandteile andererseits bewertet.
Die etherischen Öle wurden an frisch getränkten und dann "getrockneten" Dips im Vergleich mit einer handelsüblichen Standardprobe spanischen Ursprungs bewertet.
Die Bestandteile der etherischen Öle der Klone 28 und 39 wurden durch Gasphasenchromatographie bestimmt. Das aus dem Klon 28 hervorgehende etherische Öl besitzt eine Zusammensetzung, die der des experimentellen etherischen Öls sehr nahe kommt. Der Kampfergehalt beträgt hierbei jedoch nur 28% anstelle von 43,4%. Die Terpengehalte (α- und β-Pinen und Camphen) sind dagegen höher (etwa 22% gegenüber 6% bei der experimentellen Probe).
Das etherische Öl des Klons 39 ist durch einen hohen Gehalt an Cineol gekennzeichnet (22%), der mit dem der experimentellen Francereco-Probe fast identisch ist.

3.1 Messungen der Antioxidantien in den Klonen 28 und 39.

Nach der Dampfdestillation, mit der die etherischen Öle auf die oben beschriebene Weise erhalten werden können, werden die Rückstände der Destillation (die Treber) in einem Reaktor mit 200 l Ethanol während 4 h bei 25º extrahiert. Das Ergebnis dieser Extraktion, AR-Extrakt genannt (für "Rosmarin-Antioxidanz"), wird anschließend gefiltert und konzentriert, um ein braungrünes Produkt zu ergeben, das einer quantitativen Bestimmung unterzogen wird. Die Ergebnisse der Messungen des Gehalts an Antioxidanz sind in der nachstehenden Tabelle 5 dargestellt. Es zeigt sich, daß sowohl der Antioxidanzgehalt des Rohstoffs als auch des Extrakts mindestens zweimal größer als der der gebräuchlichen Extrakte ist. Tabelle 5: AR-Extrakt: Vergleich zwischen den Rohextrakten und den experimentellen Tests
(*) Carnosinsäure + Carnosol
In einem anderen Test wurden verschiedene Proben von Rosmarinblättern durch HPLC analysiert. Hierbei handelt es sich um zwei herkömmliche Proben: Murcia und Nogales, die Klone 28 und 39 und den Klon 28 nach Wasserdestillation. Tabelle 6: Gehalt an Antioxidantien
Gehalte in Gew.-%
* Summe von Carnosinsäure + Carnosol
Die vorstehende Tabelle 6 zeigt, daß der durch die Summe von Carnosinsäure und Carnosol gemessene Antioxidantiengehalt zwei bis dreimal größer als in den gewöhnlichen Proben ist, wobei dieser Gehalt nach Wasserdestillation etwas ab nimmt, jedoch weit über dem Normalwert bleibt. Die Analyse des Gehalts an Carnosol und Carnosinsäure durch HPLC der Blätter zeigt, daß die Wasserdestillation mit direktem Dampf hinsichtlich der Antioxidantien sehr schonend ist. Die thermische Behandlung (3 h Destillation) mit darauffolgender Trocknung zerstört ein Drittel der Antioxidantien. Der Vergleich von Klonen von wildem Rosmann und selektiertem Rosmann, die auf dieselbe Weise behandelt und sortiert wurden, zeigt, daß die Klone hinsichtlich des AO-Gehalts wesentlich leistungsfähiger sind.
In einem späteren Test wurde der Antioxidantiengehalt von sechs verschiedenen Rosmarinproben noch einmal durch HPLC an getrockneten Blättern nach Soxtec-Extraktion untersucht. Abgesehen vom Gehalt an Carnosol und an Carnosinsäure wurde der Gehalt an Rosmarinsäure, einem wasserlöslichem Antioxidanz des Rosmarins, gemessen.
Die nachstehende Tabelle 7 zeigt die Ergebnisse bei den Klonen 28 und 39. Tabelle 7
Die Bezeichnungen H 28 und H 39 verweisen darauf, daß die Klone auf einem Hispareco-Gelände kultiviert wurden. Die anderen Proben sind Klone, die auf mehreren Hektaren an an deren Standorten AM und cm kultiviert wurden. Die Probe AM 28.1 stammt von einer kleinen Gruppe, die einen Monat nach den Klonen mit dem Code AM 28 geerntet wurden.

3.2 Ausbeute der Kultivare 28 und 39.

Die Kultivare 28 und 39 von Rosmann besitzen 2 bis 2,5 mal mehr antioxidierende Aktivität im Vergleich mit den wilden Stämmen.
Diese Erhöhung des Gehalts an diesen Verbindungen mit antioxidierender Wirkung ist von einer Erhöhung des Gehalts an etherischem Öl begleitet (vergleiche Tabelle 1).
Es wurden zwei Feldversuche in Spanien auf zweimal 2500 m² mit jedem der Klone 28 und 39 durchgeführt. Die Ausbeuten dieser Klone betrugen 5,6 t getrockneter Rosmarinblätter pro Hektar, deren Gehalt an Bestandteilen mit antioxidierender Wirkung 4% von der Trockenmasse betrug.
Die nachstehende Tabelle 8 enthält die mit den Klonen 28 und 39 erhaltenen Ergebnisse im Vergleich zu den wilden Klonen (Nogales und Murcia), ausgedrückt als Ausbeute an etherischen Ölen und A. R. (aus den Trebern erhaltene Antioxidantienextrakte). Tabelle 8(1) INDUSTRIEVERSUCH ROSMARIN Tabelle 8(2) INDUSTRIEVERSUCH ROSMARIN

4. MOLEKULARE FINGER. PRINTS

Molekulare finger prints wurden unter einer Population von 50 Rosmarinklonen durchgeführt, die insbesondere die Klone 28 und 39 enthielt. Die Ergebnisse zeigen, daß es möglich ist, die Klone 28 und 39 eindeutig zu differenzieren.
Die verwendete Methode ist die AFLP-Technik (Abkürzung des engl. "Amplified Fragment Length Polymorphism"), die in EP 534 858 (Keygene) beschrieben wird. Das Prinzip der Methode beruht auf der selektiven Verstärkung von Restriktionsfrag menten mit Hilfe von spezifischen Nukleotidprimern. Für jede Kombination "Restriktionsenzym und Primer" (EA) wird ein spezifischer Polymorphismus in Acrylamidgel entwickelt. Eine einzige EA-Kombination gestattet die Lesung von mehreren zehn Banden, deren jede mit einem Allel gleichgesetzt werden kann.

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Claims

1. Getrocknetes pflanzliches Material aus Gewürzpflanzen, das nach dem Ernten einer Gewürzpflanzensorte und dem Trocknen dieser Sorte erhalten werden kann, dadurch gekennzeichnet, daß sein Gehalt an Antioxidantien mehr als 3,5 Gew.-% der Trockenmasse beträgt und daß sein Gehalt an etherischen Ölen mehr als 1,5 Gew.-% der Trockenmasse beträgt.

2. Pflanzliches Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Antioxidantien wenigstens Carnosol und Carnosinsäure enthalten.

3. Pflanzliches Material nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Rosmarinpflanzen erhalten wurde.

4. Verwendung eines getrockneten pflanzlichen Materials aus Gewürzpflanzen, dessen Gehalt an Antioxidiantien mehr als 3,5 Gew.-% der Trockenmasse beträgt und dessen Gehalt an etherischen Ölen mehr als 1,5 Gew.-% der Trockenmasse beträgt, zum Extrahieren von etherischen Ölen und Antioxidantien, die gleichzeitig in der Agrar- und Lebensmittelindustrie und in der Parfümerie verwertbar sind.